Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пептидэргическая модуляция синаптической передачи в гиппокампе

ВАК РФ 03.03.06, Нейробиология

Автореферат диссертации по теме "Пептидэргическая модуляция синаптической передачи в гиппокампе"

На правах рукописи

Поваров Игорь Сергеевич

ПЕПТИДЭРГИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ В

ГИППОКАМПЕ

03.03.06. - Нейробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1с МАР 2015

Москва — 2015

005560854

005560854

Работа выполнена в лаборатории функциональной синаптологии отдела исследований мозга федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр неврологии».

Научный руководитель: Скребицкнй Владимир Георгиевич

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией функциональной синаптологии федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр неврологии».

Официальные оппоненты: Романова Галина Александровна

доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории общей патологии нервной системы, федерального государственного бюджетного научного учреждения НИИ общей патологии и патофизиологии.

Захаров Игорь Сергеевич

доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории нейроонтогенеза федерального госудаственного бюджетного научного учреждения Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, заведующий лабораторией сравнительной физиологии федерального госудаственного бюджетного научного учреждения Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино.

Защита диссертации состоится Об апреля 2015 года в 15:30 на заседании диссертационного ученого совета Д.501.001.93 при биологическом факультете МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу :119991, Москва, Воробьевы горы, д. 1,стр. 12, ауд.М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и на сайте ЬНр;/Л*т^.Ыо.т8и.ш/.

Автореферат разослан 6 марта 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Умарова Б. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Эндогенные пептиды и их синтетические аналоги и производные способны оказывать сильное воздействие на деятельность нейронной сети. Изменения в центральной нервной системе (ЦНС), вызываемые системным введением тех или иных пептидых веществ на поведенческом уровне могут проявляться в виде тревожных состояний (Данилова и др., 2004). В то же время некоторые нейропептиды через специфические рецепторы могут давать анксиолитический эффект (Karlsson et al.,2008; Kajbaf et al., 2012). В основе как анксиогенного, так и анксиолитического эффектов лежат механизмы модуляции синаптической передачи в структурах лимбической системы, в частности в гиппокампе (Boden PR Hill RG 1988; Miller et al., 2002; Deng et al., 2006).

Клинические и экспериментальные данные доказывают участие регуляторных пептидов в управлении процессами обучения и памяти (Гудашева и др., 1988; Chepkova et al., 1995; Braszko et al., 2002; Kim et al., 2009; Gard et al., 2012; Paris et al., 2013; Kovalev et al„ 2013). В связи с нарастающим ростом патологии мнестических функций в последнее Еремя было проведено немало работ по изучению возможностей пептидергической коррекции нарушении памяти (Белозерцев и др., 2009). Также было показано, что подобные же белковые структуры обладают и анксиолитическими свойствами (Gudasheva et al., 2001; Vasil'eva et al., 2012), выявлены положительные результы их применения при терапии генерализованного тревожного расстройства и неврастении (Зозуля и др., 2008).

Однако, до сих пор проведено слишком мало исследований действий соединений данного класса на уровне нейронных сетей и отдельных клеток. Важность таких исследований заключается в предоставлении сведений, необходимых для синтеза более селективных лекарств, для синтеза препаратов, обладающих более мощным и пролонгированным ноотропным и анксиолитическим действием. Накопление данных по действию различных препаратов на нейронном и нейросетевом уровнях позволит в дальнейшем провести параллели между конкретными поведенческими и физиологическими особенностями действия препаратов.

Наиболее подходящим объектом для исследования сетевых эффектов веществ и их влияния на физиологические параметры отдельных клеток являются срезы гиппокампа. Гиппокамп является одной из ключевых структур, задействованных в процессах обучения и памяти, также, являясь составляющим элементом лимбического круга, он принимает активное участие в эмоциогенных процессах мозга (Bertoglio et al., 2006; Carvalho et al., 2008). Таким образом, нейронная сеть гиппокампа может являться центральной мишенью ноотропного и анксиолитического действия препаратами данного типа.

Цель работы - исследование влияния пептидных ноотропных препаратов на синаптическую передачу в поле CAI срезов гиппокампа мозга крыс.

Оснопные задачи исследования:

1. Получить и идентифицировать спонтанную и вызванную стимуляцией постсинаптическую активность в пирамидных нейронах поля CAI срезов гиппокампа крыс.

2. Изучить влияние ноотропных препаратов Ноопепт, Селанк и Семакс на спонтанные постсинаптические токи в пирамидных нейронах поля CAI гиппокампа крыс.

3. Изучить влияние ноотропного препарата Ноопепт на вызванные стимуляцией коллатералей Шаффера постсинаптические токи в пирамидных нейронах поля CAI гиппокампа крыс.

4. Зарегистрировать активность интернейронов поля CAI гиппокампа и изучить влияние на них Ноопепта.

Научная новизна работы. Показано действие препаратов Ноопепта и Селанка, оказывающих ноотропный и анксиолитический эффект на синаптическую передачу в гиппокампе.

Впервые выявлено увеличение амплитуды и частоты спонтанных тормозных постсинаптических токов под действием Ноопепта, совпадающее по временному ходу с увеличением частоты разрядов тормозных интернейронов. Впервые выявлено фазное действие Селанка на тормозные постсинаптические токи.

Практическая значимость.

Полученные данные о влиянии ноотропных препаратов Ноопепт и Селанк на синаптическую передачу в гиппокампе важны для понимания механизмов действия ноотропных препаратов. Эти результаты могут быть включены в курс лекций по нейрофизиологии, а так же могут быть использованы при разработке новых лекарственных средств.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ноопепт усиливает спонтанную тормозную активность в пирамидах поля CAI гиппокампа и усиливает частоту разрядов тормозных интернейронов. Оба эффекта имеют аналогичный временной ход.

2. Ноопепт модулирует суммарный отБет, вызванный стимуляцией коллатералей Шаффера, путем увеличения амплитуды его тормозной составляющей, не затрагивая при этом возбуждающую составляющую.

3. Ноопепт не оказывает влияния на свойства волокон и синаптических окончаний терминален тормозных интернейронов.

4. Селанк оказывает сложное действие, выражающееся в наличии фаз спада и увеличения параметров тормозных постсинаптических токов.

Апробация работы

Основные результаты исследования доложены на

- III съезде физиологов СНГ, Ялта, Украина. 1-6 октября 2011.

- 41-th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, Washington, November 11-16, 2011.

Всероссийской конференции: «Функциональная межполушарная асимметрия и пластичность мозга», Москва, 2012.

- Х-м Всероссийском съезде неврологов, Нижний Новгород. 2012.

- 22nd Neuropharmacology Conference. 11-12 October 2012, New Orleans, USA.

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 7 работ: 3 статьи и 4 тезиса. Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из 4 глав и включает Введение, Обзор литературы, Методику исследования, Результаты собственных исследований. Обсуждение, Заключение и Список литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 51 рисунок. Список литературы включает 183 источника, в том числе 169 иностранных.

Работа выполнена при под держке РФФИ (грант № 11-04-0890 и № 14-04-00391).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для экспериментов использовались крысята линии Wistar в возрасте от 14 до 17 дней. После декапитации животных извлекался мозг, который переносился в камеру для приготовления срезов, содержащую охлажденный прокачанный карбогеном инкубационный раствор состава (мМ): СаС12—2,5; MgSOi—1,3; KCl—2,5; NaCl—419; NaH2P04—1; NaHC03—26,2; D-глюкоза—11. С каждого полушария готовились содержащие гиппокампальную ткань срезы толщиной 300 мкм, которые инкубировались при комнатной температуре в течение двух часов с момента приготовления.

По прошествии двух часов срезы загружались в камеру для регистрации электрофизиологических показателей методом patch clamp. Раствор, использовавшийся в установке по составу был аналогичен инкубационному.

В экспериментах по регистрации спонтанной активности проводили 5-и минутную запись контроля, затем производили аппликацию исследуемых веществ как в чистом виде, так и на фоне действия различных блокаторов. Время отмыва равнялось удвоенному времени аппликации. Время аппликации веществ варьировало от 5 до 10 минут. Регистрацию спонтанных постсинаптических токов пирамидных нейронов проводили в режиме фиксации потенциала (voltage clamp), генерацию спонтанных потенциалов действия тормозных интернейронов регистрировали в режиме фиксации тока (current clamp). Пирамидные нейроны поля CAI гиппокампа выявлялись визуально под микроскопом. Для регистрации спонтанной активности пирамидных нейронов и интернейронов использовался раствор с большим содержанием хлора следующего состава: КС1-130; СаС12-0.5; MgC12-2; EGTA-10; HEPES-10; QX314-5. После приготовления доводили уровень pH до 7.2.

При проведении экспериментов по регистрации вызванной активности в пирамидных нейронах поля CAI стимулирующий электрод помещался в слой str.radiatum области перехода поля СА2 в CAI. При этом выбор пирамидного нейрона для patch-clamp регистрации производился в слое str.pyramidale поля CAI на расстоянии около 1.5 мм от стимулирующего электрода. Для стимуляции использовали биполярные стеклянные электроды, заполненные перфузионным раствором. Электроды изготовляли вручную, путём вытягивания двойных капиллярных трубок над пламенем спиртовой горелки. Заполнение осуществляли самопроизвольным насасыванием раствора через кончик. Стимулирующий импульс подавался на них от стимулятора фирмы «Nihon Kohden» (Япония) через изолирующую радиочастотную приставку. Синхронизационный вход стимулятора соединялся с выходом цифро-аналогового преобразователя компьютера. Запуск стимулятора

осуществлялся программно с частотой 1 раз в 15 сек. Длительность импульса составляла 0.1 мс, амплитуда 2-50 В, что при сопротивлении электродов около 1 мОм соответствовало токам 2-50 мкА. Сила тока подбиралась в каждом эксперименте так, чтобы получить вызванный ток на мембране пирамидного нейрона амплитудой не меньше половины от максимального значения.

В эксперименте использовались пирамидные нейроны не разряжавшиеся спонтанно, обладавшие собственным мембранным потенциалом не ниже -55 мВ, с сопротивлением доступа, не превышающим 30 мОм. Нейроны, сопротивление доступа которых менялось во время экспериментов более чем на 30% не учитывались. Регистрация ионных токов, протекающих через мембрану пирамидных нейронов осуществлялась в конфигурации whole-cell микропипеткой из борсиликатного стекла, заполненной раствором состава (мМ): СаС12— 1; MgC12—2; K-gluconate—130; EGTA—10; HEPES H—10; NaCl-5. Сопротивление микроэлектродов составляло 2-5 мОм. Мембранный потенциал фиксировался на уровне -65 мВ. Протоколы аппликации веществ были сходными как и при регистрации спонтанной активности, описанной выше.

Электрофизиологические данные, поступающие с усилителя, оцифровывались с помощью АЦП под управлением персонального компьютера, сохранялись в виде отдельных файлов (контроль, эксперимент, отмыв). Выявление и вычисление параметров спонтанных ПСТ осуществлялось с помощью программы MiniAnalysis компании Synaptosoft. Статистический анализ амплитуды ПСТ производился с помощью статистических подпрограмм пакета Microsoft Office. Данные регистрировали и обрабатывали с помощью программ WinWCP (University of Strathclyde) и MiniAnalysis (Synaptosoft). Статистическую обработку проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Поставщик реактивов — фирма Sigma. Использовались блокаторы ионной проводимости NBQX, габазин, пикротоксин и тетродотоксин. Препараты Селанк и Семакс были любезно предоставлены нам академиком Н. Ф. Мясоедовым, Препарат Ноопепт был любезно предоставлен нам профессором Р. У. Островской.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Регистрация спонтанных постсинаптических токов пирамидных нейронов поля СА1

В ходе экспериментов с пирамидными нейронами поля СА1 гиппокампа посредством patch-damp отведения (рис. 1.) были заригистрированы спонтанные постсинаптические токи (ПСТ).

, ¡! , Рис. 1. Pach-clamp отведение от

}■ , 'г » пирамидного нейрона поля СА1

, - „ I гиппокампа.

При мембранном потенциале -70 мВ. амплитуда этих спонтанных токов варьировала в широких пределах: от10-15 пА до 200-300 пА (рис. 2).

I— дТ ■ f (Hz)=1000/ л Tims.)

j If»/

Рис. 2. Фрагмент записи спонтанных пост-синаптических токов с формулой определения их частоты.

Имела место зависимость параметров ПСТ от мембранного потенциала, проявлявшаяся в падении амплитуды при сдвиге потенциала фиксации по направлению к 0 мВ. В условиях симметричной концентрации ионов СГ токи реверсировали при значении потенциала 0 мВ. Аппликация специфического блокатора ГАМКа рецепторов-габазина в концентрации 10 мкМ почти полностью блокировала эти токи (рис. 3).

Рис. 3. Спонтанные ПСТ, усредненные за 5-и минутные интервалы в контроле, аппликации габазина и во время отмыва.

Все это дает основание считать регистрируемые в данных условиях токи результатом выделения ГАМК из окончаний тормозных интернейронов т.е. ТПСТ.

Применение блокатора натриевой проводимости тетродотоксина (ТТХ) значительно уменьшило среднюю амплитуду ТПСТ, а их число снизилось более чем в два раза, а амплитуда оставшихся токов составила 47.07±2.70 пА (п=10). Каких либо изменений во время отмыва не наблюдалось (рис 4).

<п=177)

Рис. 4. Спонтанные ТПСТ, усредненные за 5-и минутные интервалы в | [ контроле, аппликации

ТТХ и отмыве.

контроль 111=399) ТТХ(п=170) отмыв

Построение амплитудной гистограммы вывявило двухкомпонентный состав ТПСТ. Так в результате действия ТТХ уменьшение средней апплитуды произошло за счет блокирования высокоамплитудных ТПСТ, что говорит о том, что двухкомпонентный состав обсуловлен наличием миниатюрных ТПСТ (мТПСТ) возникающих вследствие спонтанного выброса медиатора в синаптичскую щель и спайкзависимого компонента, связанного с большим выбросом медиатора вследствие прихода по терминалям потенциалов действия от тормозных интернейронов (рис. 5).

Рис. 5. Гистограмма распределения амплитуд в контроле и под действием ТГХ

>Т-1-1 ■ "Г-1--!--1

О V) КЮ 150 2К1 3*0 400

пА

Для выявления различий уровня достоверности по критерию Колмагорова-Смирнова между контрольными и экспериментальными данными нами были построены кривые кумулятивной вероятности. Контроль достоверно отличается от ТТХ (р<0.01) (рис 6).

2. Действие Ноопепта на спонтанные тормозные постсинантические токи

Для первичной оценки действия ноопепта на спонтанную активность представлялось удобным сравнивать усредненные ТПСТ каждого пирамидного нейрона в контроле, при аппликации вещества и во время отмыва. На рис 7 приведен пример полученных таким образом усредненных ТПСТ. Хорошо видно, что амплитуда усредненных ответов значительно увеличивается под действием Ноопепта.

Контроль(п=231| Ноопепт(п=зог) 0тмыв(п*г15) рис. 7. Спонтанные ТПСТ,

Такое увеличение амплитуды присуще всем исследованным нейронам (п=13). Аппликация Ноопепта в концентрации 1 мкМ на срезы гиппокампа приводила к значительному увеличению амплитуды спонтанных посгсинаптических токов (ПСТ) во всех

Рис. 6. Кумулятивная вероятность распределения амплитуды ТПСТ в контроле, под действием ТТХ и в отмыве.

О 25 50 75 100 125 150 175 200 ПА

усредненные за период 5 мин перед (Контроль), во время действия (Ноопепт) и после (Отмыв) действия вещества.

зарегистрированных пирамидных нейронах (п=13).

Средняя амплитуда ТТТСТ, зарегистрированных в пирамидных нейронах поля CAI, варьировала от 40.81 до 72.75 пА (п=21) (включая нейроны из группы экспериментов с ТТХ). Под действием Ноопепта она достоверно увеличивалась, что хорошо видно на графике распределения кумулятивной вероятности (рис. 8; р< 0,01, тест Колмогорова-Смирнова).

Рис. 8. Кумулятивная вероятность распределения амплитуды ТПСТ в контроле, во время действия Ноопепта и в период отмывания.

Средняя групповая амплитуда ТПСТ также увеличивалась до 82.63±11.65 пА (рис. 9).

Рис. 9. Изменение амплитуды ТПСТ под действием Ноопепта вовсех зарегистрированных нейронах (п=13).

i

Контроль Ноопепт Отмыв

Типичный пример показывает, что средняя амплитуда ТПСТ увеличивается, тогда как кинетические параметры (время нарастания и спада) остаются неизмененными (рис. 7). Амплитудная гистограмма (рис. 10) четко демонстрирует, что увеличение средней групповой амплитуды ТПСТ происходит, главным образом, за счет появления небольшого числа высокоамплитудных (100-350 пА) ТПСТ, тогда как число низкоамплитудных ТПСТ (около 50 пА) существенно не меняется. Поскольку кинетические параметры ТПСТ не меняются под действием пептида, предположение о его возможности непосредственно воздействовать на ГАМКа рецепторы было нами отвергнуто. Этот вывод находится в соответствии с данными, полученными нашими сотрудниками на изолированных нейронах, свидетельствующими о том, что Ноопепт не влияет на ответы на быструю аппликацию ГАМК и глутамата.

- Контроль

---- Ноолепт

Рис. 10. Гистограмма распределения амплитуд в контроле и под действием Ноопепта.

0 50 100 150 200 250 300 Э50 400 пА

Средняя частота ТПСТ также сильно варьировала между пирамидными нейронами (0.49 - 1.75 Гц; средняя., 1.03±0.10 Гц: п=16). Аппликация Ноопепта вызывала существенное увеличение (в 1.3-2.5 раза) частоты в шести из семи клеток (рис. 11, кривая 1).

N

1---НН'-Н:

1 рМ Ноопепт

Щ (2)

Рис. 11. Временной ход изменения частоты ТПСТ в контроле, под действием Ноопепта и в отмыве — кривая (1) и изменения частоты мини ТПСТ (полученных применением ТТХ) — кривая (2).

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 МИН

При пятиминутной аппликации Ноопепта наиболее выраженный эффект регистрировался через 2.5 мин, когда частота возрастала примерно в два с половиной раза и достигала 1.40± .35 Нъ. Эффект Ноопепта полностью отмывался через 10 мин после окончания его аппликации.

Блокада генерации потенциалов действия посредством аппликации блокатора натриевой проводимости ТТХ привела к тому, что высокоамплитудные ТПСТ исчезли и амплитуда оставшихся токов была 47.07±2.70 пА (п=10) (рис. 12).

Рис. 12. Спонтанные ТПСТ

Контроль (п=407)

ТТХ (11=244)

ТТХ+ Ноопепт (11-332)

10 пЯ

20 мс

усредненые за 5-и минутные интервалы в контроле, при действии ТТХ и совместном действии ТТХ и Ноопепта.

Аппликация Ноопепта на фоне действия ТТХ не влияла ни на амплитуду, ни на частоту ТПСТ. Иллюстрирующий это график представлен на рис.11, кривая (2), рис. 12. Суммарный результат по всем исследуемым нейронам представлен на рис. 13. 100п

Рис. 13. Изменение амплитуды ТПСТ под действием ТТХ и при совместном действии ТТХ и Ноопепта.

Контроль ТТХ ТТХН-Ноопепт

Ноопепт не оказывает влияния на спайк-независимые мТПСТ, выделенные посредством аппликации ТТХ. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что первичной мишенью действия пептида являются интернейроны, отдающие проекции на пирамидные нейроны.

3. Действие Ноопепта на спонтанноактивные тормозные интернейроны гиппокампа:

-Действие на интернейроны дальнего радиатума

Было зарегистрировано 6 спонтанно активных интернейронов, локализованных в дальнем радиальном слое—на границе str radiatum и str molecularis. Эти клетки отличались от пирамидных нейронов по форме и электрофизиологическим параметрам. Частота их спонтанных разрядов колебалась от 2.76 до 9.98 Гц; среднее значение 7.29±1.57 Гц. Фотография типичного нейрона этой группы предлставлена на рис. 14.

Рис. 14 Сома спонтанноактивного интеренейрона, зарегистрированного в sti radiatum, на границе со str lacunosum-moleculare.

Было обнаружено, что перфузия Ноопепта вызывает быстрое (латентный период 11.5 мин) обратимое увеличение частоты спонтанных потенциалов действия на 269+39% во всех зарегистрированных клетках (рис 15, 16). Увеличение частоты разрядов было связано с небольшой (3-5 мВ) деполяризацией мембраны.

г

Hi,

Рис. 15. Временной ход влияния Ноопепта на усредненную частоту разрядов (±5ЕМ) пяти клеток.

-ti

10 11 12- '15 14 15

Контроль

Рис. 16. Типичный пример действия Ноопепта на частоту разрядов интернейрона.

Как видно из рис. 17., аппликация Ноопепта наряду с увеличением частоты приводила к изменению формы самих потенциалов действия, которое заключалось в практически полном исчезновении следовой гиперполяризации и уширении спайка. В течение отмыва первоначальная форма спайка, как и частота потенциалов действия, практически полностью восстанавливалась. Мембранный потенциал составлял -55 мВ в контроле, -50 мВ во время аппликации Ноопепта, -54 во время отмыва.

Контроль

Ноопепт

Отмыв

20 мВ |_

100 мс

Рис.17. Изменение формы потенциалов действия интернейронов "дальнего" радиатума под действием Ноопепта. Регистрация произведена в current clamp в конфигурации whole cell.

Усиление спонтанной активности тормозных интернейронов поля CAI гиппокампа было ранее обнаружено для двух других нейропептидов: холецистокинина (Miller et al., 2002)

и тиролиберина (Deng et al., 2004). В обоих исследованиях было показано, что в основе эффекта лежит блок калиевых каналов утечки, результатом чего является деполяризация мембраны и увеличение частоты разрядов клеток. - Действие на интернейроны ближнего радиатума

В «ближнем радиатуме», примерно в 50 мкм от границы пирамидного слоя были обнаружены спонтанноактивные интернейроны, также реагирующие на аппликацию Ноопепта. Эти нейроны обладали большой сомой, отличавшейся по форме от сомы интернейронов дальнего радиатума (рис.18.)

I- V 4 * Рис. 18. Сома спонтанноактивного

/ интеренейрона, зарегистрированного в str

\У JäSi radiatum, прилегающем к str pyramidale.

||1Я®Ув:

При аппликации Ноопепта средняя частота спонтанно генерировавшихся спайков таких нейронов выросла с 3.93 ± 0.07 до 4.82 + 0.06 Гц, однако относительно равномерное распределение спайков по времени уступило место пачечной активности, частота спайков в пачках в среднем составляла 26.84+ 0.19 Гц. Эффект полностью отмылся (рис. 19.).

Контроль

Отмыв

шшш

Рис.19. Увеличение частоты потенциалов действия спонтанноактивного интернейрона, расположенного в ближнем к пирамидному радиальном слое поля СА1 в ответ на аппликацию 2 мкМ Ноопепта. Потенциалы действия зарегистрированы в current clamp е конфигурации cell attached.

Таким образом, увеличение амплитуды спонтанных ТПСТ на пирамидных нейронах может бьпъ представлено как результат суммации одиночных спайк-зависимых ТПСТ, частота которых возрастает вместе с частотой разряда тормозных интернейронов. Даже при

сравнительно высокой частоте генерации потенциалов действия постисинаптические ТПСТ суммируются лишь частично, каждый последующий ТПСТ вырастает из фазы спада предыдущего (Pawelzik et al., 2002). Однако, появление цельных высокоамплитудных ТПСТ может происходить вследствие совпадения тормозных влияний, приходящих от разных нейронов. Данное предположение представляется довольно убедительным ввиду высокого уровня конвергенции перисомашчески ориентированных интернейронов на пирамидные клетки (Freund, 2003), а также их склонностью к синхронизации активности за счет наличия электрических контактов друг с другом (Hormuzdi et al., 2001).

Согласно многочисленным данным, полученным при исследовании физиологии и состава нейронной сети гиппокампа в перисоматичеком торможнении задействовано 3 группы интернейронов: быстро спайкующие корзинчатые интернейроны (FS), аксо-аксональные клетки (или клетки-канделябры) и регулярно спайкующие (RS) корзинчатые интернейроны (Buzsaki, 1996; Freund, Katona 2007; Klausberger, Somogyi, 2008). Подавляющее большинство спонтанных ТПСТ, регистрируемых при отведении от сомы пирамидных нейронов гиппокампа возникает при выделении медиатора из синаптических окончаний, локализованных в перисоматической области. Данные ТПСТ характеризуются быстрой кинетикой нарастания и спада в противоположность ТПСТ дендритного происхождения (Реагсе, 1993). По этому признаку свыше 95% зарегистрированных нами ТПСТ были отнесены к быстрым перисоматически генерирующимся ТПСТ. Количество медленных ТПСТ было мало и в ходе экспериментов существенно не изменялось.

Таким образом, проявившееся на пирамидных нейронах действие Ноопепта очевидно обусловлено разрядами популяций FS или RS-корзинчатых интернейронов, функционально сосредоточенных на перисоматическом торможении пирамидных нейронов. Расположение одной из субпопуляций RS-корзинчатых нейронов соответствует расположению большинства зарегистрированных нами спонтанноактивных интернейронов (Pawelzik et al., 2002; Klausberger, Somogyi, 2008) в дальнем радиальном слое недалеко от границы с молекулярным слоем. При этом один из нейронов, показавший сходную реакцию на аппликацию Ноопепта был обнаружен в радиальном слое неподалеку от пирамидного слоя. Согласно литературным данным некоторое количество FS-корзинчатых нейронов содержится в этой области (Kosaka et al., 1987; Pawelzik et al., 2002). Также обращает на себя внимание относительно большой размер сомы зарегистрированного интернейрона, что может являться дополнительным признаком, позволяющим отнести его к FS-корзинчатым интернейронам (Kosaka et al., 1987).

4. Вольтамперная характеристика ответа пирамидного нейрона па стимуляцию коллатералей Шаффера

Данные и нижеследующие результаты по Ноопепту были получены с применением глюконат-содержащего пипеточного раствора. В пирамидных нейронах поля CAI срезов гиппокампа стимуляция коллатералей Шаффера вызывала появление негативно направленного тока, состоящего преимущественно из возбуждающего компонента, т. к. потенциал фиксации был приблизительно на уровне потенциала реверсии для ионов С1-. (-65 мВ) в данных условиях.

Перед тем как приступить к исследованию действия Ноопепта на вызванную передачу е гиппокампе была произведена оценка изменения параметров вызванного стимуляцией коллатералей Шаффера ответа при смещении потенциала фиксации с -65 по 45 мВ со ступенью 10 мВ. По итогу этих экспериментов потенциал реверсии вызванного тока составил -65 мВ (рис.21).

-7О нЬ^"

-00 мВ'

■90 нВ///

Рис.21. Вольтамперная характеристика пирамидного нейрона поля CAI в ответ на стимуляцию коллатералей Шаффера в присутствии блокатора возбуждающей передачи NBQX.

5. Действие Ноопепта на вызванную стимуляцией коллатералей Шаффера активность в пирамидах.

Аппликация в проточную жидкость пикротоксина (20 мкМ), блокирующего тормозной ток, приводила к небольшому увеличению суммарного ответа, что свидетельствует о том, что возбуждающий и тормозной токи имели разную направленность (рис. 22).

Рис. 22. Увеличение амплитуды и длительности суммарного ответа на стимуляцию коллатералей Шаффера, сопровождающееся подавлением его позднего компонента во время аппликации 20 мкМ пикротоксина (2) по сравнению с контролем (1).

Аппликация Ноопепта в концентрациях 2, 4, 6 мкМ вызывала дозо-зависимое достоверное снижение относительной амплитуды, которая составила 90.29±2.08% (р<0.05, По+п2 >200), 84.31±1.79% (р<0.01, п»+ п4 >200) и 70.10±2.11% (р<0.001, п0+ п6 >200) соответственно во всех зарегистрированных пирамидных нейронах (п=6). Действие Ноопепта было полностью обратимо и на протяжении времени отмыва, равного удвоенному времени аппликации, амплитуда тока практически полностью возвращалась к контрольному уровню и составляла 97.82+1.96% (рис 23, 24).

1 2 3 4 5

50 мс

Рис. 23. Ответ на стимуляцию коллатералей Шаффера в контроле (1), при аппликации Ноопепта в ряду концентраций 2 мкМ (2), 4 мкМ (3), 6 мкМ (4), во время отмыва (5) при потенциале фиксации -65 мВ. Изменение позднего компонента началось еще при применении 2 мкМ Ноопепта, падение амплитуды раннего компонента выявилось при увеличении концентрации вещества до 6 мкМ.

В части зарегистрированных пирамидных нейронов при концентрациях Ноопепта 2, 4 мкМ было отчетливо видно только увеличение тормозного компонента, при аппликации 6 мкМ наряду с дальнейшим увеличением тормозного компонента происходило падение амплитуды возбуждающего компонента. Таким образом, можно предположить зависимое от концентрации увеличение возбудимости двух типов перисоматически ориентированных тормозных интернейронов. Вероятно, чувствительность к меньшей концентрации Ноопепта присуща ЯЙ интернейронам, активация которых происходит во время фазы спада суммарного ответа пирамидных нейронов на стимуляцию коллатералей Шаффера.

Известно, что вклад Р5-корзинчатых нейронов в иннервацию перисоматической области пирамидных нейронов значительно больше, чем ЯЗ-корзинчатых нейронов (Такасз е! а!., 2014). Возбуждающий постсинатический потенциал в ответ на стимуляцию коллатералей Шаффера в ЯБ-корзинчатых нейронах хотя и значителен по амплитуде, но сильно уступает ВПСП РБ-корзинчатых нейронов, которые являются наиболее возбудимой клеточной популяцией гиппокампа (ОПскГеЫ, Зсапххаш, 2006). Сила стимула в наших экспериментах подбиралась из расчета получить ответ на пирамидных нейронах амплитудой половины от максимального. В совокупности со сравнительно слабой возбудимостью ЯЭ

нейронов это дает основание полагать, что FS-корзинчатые нейроны, вероятно, задействованы в генерации тормозной составляющей ответа в гораздо большей степени, чем RS-корзинчатые нейроны. Известно, что FS-корзинчатые клетки активно вовлекаются в прямой ответ при стимуляции коллатералей Шаффера. Т. е. самая ранняя фаза тормозного компонента ответа, перекрывающаяся с фазой нарастания его возбуждающей составляющей является следствием активации FS-нейронов (и в гораздо меньшей степени RS). В то же время RS нейроны способны интегрировать возбуждение от последовательно активируемых входов, в частности, возбуждения, получаемые от коллатералей Шаффера и от пирамидных нейронов поля CAI, активированных коллатералями Шаффера (Glickfeld, Scanziani, 2006). Поэтому RS нейроны вовлекаются в ответ позже FS нейронов и регулируют фазу спада ВПСТ, но не его амплитуду.

Рис. 24. Изменение амплитуды суммарного ответа по всем зарегистрованным нейронам (п=5).

Аппликация Ноопепта в ряду концентраций 2, 4, 6, 10 мкМ (п=5) в присутствии 20 мкМ пикротоксина не выявила какого-либо изменения суммарного тока, что говорит о том, что Ноопепт не действует на возбуждающий ток.

Применение блокатора АМРА рецепторов КВС)Х в концентрации 1 мкМ приводило к сильному падению вызванного ответа, ввиду подавления его возбуждающего компонента. Во время действия блокатора оставался только небольшой тормозный ток, являющийся следствием прямой стимуляции волокон тормозных интернейронов. Регистрация этого низкоамплитудного тока велась при потенциале фиксации -45 мВ. Аппликация Ноопепта в ряду концентраций 2, 4, 6, 10 мкМ на фоне действия ЫВСУС не вызывала никаких изменений в параметрах этого тока во всех зарегистрированных нейронах (п=5). (рис. 25). Эти данные свидетельствуют о том, что Ноопепт действует не на выделение тормозного медиатора из терминалей, а на возбудимость тормозных интернейронов.

NBQX -45

-ОТМЫВ

NBQX - 45 + Ноопепт

Рис. 25. Усредненные ответы пирамидного нейрона (по 20 ответов на каждую кривую) на стимуляцию коллатералей Шаффера при МП -65 мВ в контроле (1), во время апплиации ЫВОХ при МП -65 мВ (2), во время апплиации МВ(}Х при МП -45 мВ (3), во время аппликации Ноопепта на фоне действия КВСгХ (4).

6. Действие Ноопепта на вероятность генерации потенциала действия пирамидным нейроном при пороговом раздражении коллатералей Шаффера.

Были проведены эксперименты со стимуляцией коллатералей Шаффера в current clamp. Обнаружено, что аппликация Ноопепта на срез при пороговом значении силы стимула приводит к падению вероятности генерации потенциала действия (рис. 26) во всех зарегистрированных нейронов (п=5). На том же рисунке видно, что перфузия Ноопепта приводит к обратимому изменению поздней фазы ответа. Аплитуда ТПСП возрастает. Временной ход этих изменений показан на рис. 27.

I Рис.26. Усредненный типичный ответ

1 | на стимуляцию колчатералей

Шаффера при пороговом значении силы стимула в контроле, при аппликации Ноопепта и во время отмыва (current clamp). Рис.27 Изменение (относительно среднего контрольного значения) амплитуды тормозного компонента ответа на стимуляцию коллатералей Шаффера во время аппликации Ноопепта и отмыва в одном из зарегистрированных нейронов.

Контроль

2 мкМ, Ноопепт

Время, мин

7. Действие Селанка na спонтанную тормозную активность пирамидных нейронов гиппокампа

Были получены записи спонтанных ПСТ 20 пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа в контроле и при аппликации раствора препарата Селаик. В 4 сериях экспериментов (п=5) протестированы 5 концентраций препрарата: 1, 2, 4, 6, 8 мкМ. Независимо от концентрации препарата в большинстве экспериментов наблюдалось увеличение амплитуды и частоты ПСТ (рис. 28). В нескольких нейронах (п=5) данному эффекту предшествовало кратковременное (1-1,5 мин) падение амплитуды и чатоты ПСТ (рис 29, 32, 33). Действие Селанка проявлялось в среднем на шестой минуте с момента его поступления в перфузионный раствор.

ffpHPT''1'^ 5"ин г""""!1-'"-''"1

Селаик ¡j «MI

"Л

Рис.28. Увеличение амплитуды и частоты ТПСТ в пирамидном нейроне поля CAI гиппокампа под действием Селанка.

Были построены усредненные ПСТ для контроля, начала аппликации, обеих фаз действия раствора Селанка (рис 40).

контроль (п=13?) фаза 0 (п=69) фаэа 1 (п=79) фи»2(п=124) РиС 29. Усредненные ПСТ

у ,,-"" (усреднение относительно пика)

для контроля, начала

* аппликации Селанка (фаза 0), _

sí первой и второй фазы действия.

На рис 30, 31 приведены диаграммы, отражающие относительные изменения частоты и амплитуды ПСТ (по отношению к контролю) во время обеих фаз действия Селанка (п=5). Во время первой фазы действия препарата частота ПСТ снижается на 25%, амплитуда —на 10%. Во второй фазе происходит увеличение как частоты (на 20%), так и амплитуды (на 10%) ПСТ. По критерию знаков эти изменения достоверны (р<0,05).

140.00 120.00 100.00 50.00 60.00 40.00

да.оо 0(10

*

*

Рис. 30. Относительные изменения средней частоты ПСТ по сравнению с контролем (100%) при аппликации Селанка.

контроль

фаза 1

фаза 2

(20.М

Рис.31. Относительные изменения средней амплитуды ПСТ по сравнению с контролем (100%) при аппликации Селанка.

контроль

фаза 1

фй5а 2

В ходе анализа изменения частоты ПСТ по двенадцатисекундным интервалам было выявлено, что в части зарегистрированных нейронов (п=5) Селанк оказывает двухфазное действие на ПСТ (рис. 32). Во время первой фазы происходит снижение частоты ПСТ, ео второй фазе имеет место увеличение частоты ПСТ по сравнению с первой фазой действия вещества, а в некоторых случаях и по сравнению с контролем.

Первая фаза действия для всех клеток наступала по истечении небольшого промежутка времени после начала аппликации. Однако, вторая фаза не обнаружила четкой привязки ко времени. Хотя у некоторых клеток она наступала на шестой минуте аппликации препарата.

Рис 32. Средняя частота ПСТ за 12 секундные интервалы в контроле, при аппликации Селанка и во время отмыва. Пунктирной линией отмечен временной интервал аппликации Селанка, сплошной линией омечена первая фаза действия Селанка

Выявлено достоверное отличие амплитуды ПСТ как во время первой, так и во время второй фазы действия Селанка от амплитуды ПСТ в контроле (рис.33.).

Рис. 33. Средняя амплитуда ПСТ за 12 секундные интервалы в контроле, при аппликации 2 мкМ Селанка и во время отмыва. Пунктирной линией отмечен временной интервал аппликации Селанка, сплошной линией омечена первая фаза действия Селанка

Первая фаза действия для всех клеток наступала по истечении небольшого промежутка времени после начала аппликации. Однако, вторая фаза не обнаружила четкой привязки ко времени. Хотя у некоторых клеток она наступала на шестой минуте аппликации препарата.

Были построены амплитудные гистограммы (ниже приведена амплитудная гистограмма, сделанная по одной клетке) для контрольной записи и двух фаз действий вещества (рис 34). Для выявления уровня достоверности по критерию Колмогорова-Смирнова построены кривые кумулятивной вероятности (рис 35). По ним видно, что вероятность совпадения трех рассмотренных случаев мала, следовательно отличия можно

Рис 34. Снижение доли высокоамплитудных ПСТ во время первой фазы действия Селанка, увеличение доли среднеамплитудных ПСТ во время второй фазы действия Селанка.

О ¿5 50 ?5 100 к:5 150 17& ¿00

ПА

считать достоверными (р<0.01).

Контроль

2 фаза

1 On

0 5-

1 фаза

X

контр

2 фазз

Рис. 35. Кривые кумулятивной вероятности для контроля, во время первой и второй фаз действия Селанка.

50

200

250

100 150 рА

Также было рассмотрено влияние Селанка на кинетику ПСТ, для чего были получены усредненные (усреднение относительно времени нарастания) ПСТ по двум амплитудным диапазонам (<50 пА, >50 пА) для контроля и обеих фаз действия препарата (рис 36). Сколь-либо заметного изменения формы усредненных ПСТ не обнаружено.

8. Действие Селанка в присутствии ТТХ на спонтанные ТПСТ

Аппликация Селанка в ряду концентраций 2, 4, 6 мкМ (п=10) на срезы гиппокампа во время действия блокатора натриевых токов ТТХ не привела к каким-либо достоверным изменениям средней амплитуды спонтанных ТПСТ пирамидных нейронов (рис 36). Средняя в 30-и секундных интервалах частота также не изменялась в течение аппликации Селанка на фоне тетродотоксина.

Рис 37. Усредненная амплитуда ПСТ в контроле, во время аппликации ТТХ, во время аппликации Селанка.

контроль

селанк+ТТХ

L_

Средние значения частоты ПСТ после применения ТТХ слабо изменялись друг относительно друга. Аппликация Селанка не внесла ощутимых изменений в эту картину (рис 38).

Рис 38. Средняя частота ПСТ за 30-ти секундные интервалы в контроле, при аппликации ТТХ, при аппликации Селанка

5.0 4.0

Гц 3:0 2,0 1.0 о.о

л л

/ V

7,5 мин

18-3 на фоне действия ТТХ.

На основании отсутствия достоверных изменений как частоты, так и амплитуды ПСТ во всех зарегистрированных клетках при аппликации Селанка на фоне действия ТТХ можно предположить, что действие Селаика на пирамидные нейроны поля CAI носит главным образом опосредованный характер. Возможно, в ходе обеих фаз изменяется частота спайк-зависимых ТПСТ (тормозных постсинаптических токов), а основной мишенью Селанка являются ГАМК-зргические интернейроны поля CAI. 9. Семакс

В условиях нашей экспериментальной модели было проведено первичное исследование пептидного препарата Семакс, сходного с Селанком по структуре и поведенческому эффекту. На срезах гиппокампа было получено 5 записей спонтанных ТПСТ во время аппликации Семакса, 5 записей вызванных стимуляцией коллатералей Шаффера ответов во время аппликации Семакса. Также было проведено несколько экспериментов с коаппликацией Семакса и блокаторов возбуждающей и тормозной передачи. Ни в одном исследованном нейроне достоверных изменений зафиксировано не было. Проверка действия Семакса на кратковременную пластичность в условиях экспериментов выработки парной фасилитации также не дала результатов.

ВЫВОДЫ

1. Ноотропный препарат Ноопепт вызывает увеличение частоты и амплитуды спонтанных тормозных постсинаптических токов, зарегистрированных в пирамидных нейронах поля CAI срезов гиппокампа.

2. Усиление спонтанной синаптической активности пирамид гиппокампа под влиянием Ноопепта обусловлено его действием на тормозные интернейроны, приводящим к их деполяризации и увеличению частоты разрядов.

3. Ноопепт модулирует суммарный ионный ток в пирамидах поля CAI, вызванный стимуляцией коллатералей Шаффера за счет увеличения амплитуды его тормозной составляющей.

4. Ноопепт не оказывает влияния на вызванную глутаматергическую передачу.

5. Усиление спонтанного и вызванного торможения пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа соответствует анксиолитическому эффекту Ноопепта на организм. Мнемотропный эффект может быть опосредован вторичным торможением тормозных интернейронов в синаптических сетях гиппокампа.

6. Действие селективного анксиолитика Селанка, также как и Ноопепта, обусловлено торможением спонтанной активности пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа, характеризующимся отставленным и двухфазным характером.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ

1. Скребицкий В.Г., Кондратенко Р.В. Поваров И.С., Деревягин В.И. Пептидегическая модуляция синаптической активности нейронов гиппокампа // Российский Физиол. Журнал, 2011, т. 97, №>11, с. 1169-1178.

2. ПоЕаров И.С., Кондратенко Р.В., Деревягин В.И., Островская Р.У, Скребицкий В.Г., Дипептид Ноопепт усиливает вызванную тормозную передачу в гиппокампе. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014, том 158, №9, с.336-338.

Статьи в других изданиях

1. Деревягин В.И., Кондратенко Р.В., Поваров И.С., Скребицкий В.Г. Действие селанка на постсинаптические токи пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа крыс. Оптимальный нейромедбиометрический анализ // Материалы Всероссийской конференции: «Функциональная межполушарная асимметрия и пластичность мозга», 2012, с. 272-274.

Тезисы конференций

1. Скребицкий В.Г., Кондратенко Р.В. Поваров И.С., Деревягин В.И. Пептидегическая модуляция синаптической активности нейронов гиппокампа // Научные труды III съезда физиологов СНГ, Ялта, Украина. 1-6 октября 2011, с. 25.

2. Skrebitsky V.G., Kondratenko R.V. Povarov I.S., Derevyagin V.I. Peptidergic modulation of inhibitory synaptic transmission in CAlarea of rat hippocampus. // Abstracts of the 41-th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, Washington, November 11-16, 2011, www.sfn.org

3. Скребицкий В.Г., Буканова Ю.В., Деревягин В.И., Кондратенко Р.В., Поваров И.С., Шаронова И.Н. Нейрофизиологические механизмы действия пептидов с ноотропными и анксиолитическими свойствами // Материалы X Всероссийского съезда неврологов, Нижний Новгород. 2012, с. 685-686.

4. Skrebitsky V.G., Kondratenko R.V., Derevyagin V.I., Povarov I.S., Bukanova J.V, Sharonova I.N. Effects of newly synthesized memory-enhancing and anxiolytic drugs on inhibitory transmission in CA1 pyramidal cells and activity of inhibitory interneurons // Cognitive Enhancers: 22nd Neuropharmacology Conference. 11-12 October 2012, New Orleans, USA.

Напечатано с готового оригинал-макета

Подписано в печать 06.02.2015 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 026.

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 527 к. Тел. 8(495)939-3890/91. Тел./факс 8(495)939-3891.