Роль функциональных межмолекулярных взаимодействий в нейрональной синаптической пластичности

Проскура, Анна Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль функциональных межмолекулярных взаимодействий в нейрональной синаптической пластичности
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль функциональных межмолекулярных взаимодействий в нейрональной синаптической пластичности"

На правах рукописи

ПРОСКУРА Анна Леонидовна

РОЛЬ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В НЕЙРОНАЛЬНОЙ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ

03.03.01-физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 1 оя 2013

Новосибирск 2013

005539246

Работа выполнена в лаборатории биомедицинской информатики ФГБУН Конструкторско технологического института вычислительной техники СО РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Ратушняк Александр Савельевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Зав. лабораторией Гнлннский Михаил Абрамович, , ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение

диссертационного совета Д001.014.01 при ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН (630017, г. Новосибирск, ул. ак. Тимакова, 4, тел. 8(383) 335 97 54, email: dissovet@nhvsiol.ru')

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН

кандидат биологических наук,

вед. н.с.. Старостина Марина Владиславовна

ФГБУ "НИИМББ" СО РАМН, г. Новосибирск

науки Институт Цитологии и Генетики Сибирского отделения Российской академии наук (ФГБУН ИЦиГ СО РАН) — г. Новосибирск

Защита состоится

декабря

2013 г. на заседании

Автореферат разослан «.

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Бузуева И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Растущие потребности создания инновационных методов и аппаратно-программных средств диагностики, профилактики и коррекции нейропатологий, скрининга фармакологически перспективных соединений, разработки новых поколений информационных устройств усилили актуальность исследований в области нейронаук. Происходит стремительное расширение нейробиологических исследований и накопление значительных объемов экспериментальных данных о структуре, функции, эволюции мозга и нервной системы на различных уровнях их иерархической организации (Hanse, Gustafsson, 1992; Попов и др., 2004; Балабан, Гуляева, 2006; Newpher, Ehlers, 2008; Балабан, Коршунова, 2011; Kandel, 2012). Представление о нейроне как о простом передатчике сигналов уже не кажется убедительным. Поэтому ключевой задачей современной нейробиологии является выявление свойств нервных клеток, лежащих в основе обучения, памяти и других процессов, являющихся базой когнитивности. Как именно достигается сочетание высокой пластичности межнейронных связей со стабильным хранением воспоминаний остается еще одной важнейшей нерешенной проблемой. Несмотря на огромный объем аналитических данных, практически, отсутствуют реальные концептуальные модели нейрона и, в частности, синапса, способные объединить накопленный эмпирический материал в систему знаний.

Нейрональную пластичность можно определить как фундаментальное свойство центральной нервной системы (ЦНС), связанное с изменением возбудимости нейрона. Основу этих изменений, индуцируемых процессами обучения, составляют сложные и недостаточно изученные межмолекулярные взаимодействия, приводящие к долгосрочным изменениям синапсов и опирающиеся на экспрессию генов (Анохин, 1998; Greer, Greenberg, 2008). Синапсы являются местами контактов между нейронами или с клетками других типов (Smrt, Zhao, 2010). По существующим представлениям именно синаптические межклеточные контакты являются одним из основных элементов, обеспечивающих пластичность нервной системы, а молекулярные механизмы изменения эффективности синаптической передачи лежат в основе процессов обучения и памяти (Martin et al., 2000; Smrt, Zhao, 2010; Nalloor et al., 2012).

Наиболее разработанной клеточной моделью для изучения синаптической пластичности in vitro является долговременная потенциация (ДВП) - длительное увеличение амплитуды популяционных ответов нейронов на тестирующий стимул, возникающее после интенсивного и непродолжительного выброса нейротрансмиттера, например, в результате высокочастотной стимуляции афферентных входов (Bliss, Lomo, 1973). По продолжительности возникновения и существования различают две основные стадии ДВП: раннюю - фазу, длящуюся обычно менее получаса, и позднюю -продолжающуюся до нескольких часов. Ранняя фаза ДВП обуславливается модификациями уже существующих синаптических белков (в основном, процессами фосфорилирования/дефосфорилирования), поздняя - коррелирует с увеличением белкового синтеза и генетической экспрессии (Steward, Schuman, 2001).

Установлено, что развитие ДВП сопровождается преобразованием морфологии дендритных шипиков - небольших выростов мембраны дендрита, богатых актином и образующих синаптические контакты (Yuste, Bonhoeffer, 2001; Honkura et al., 2008). Эти структуры были описаны более ста лет назад, но их роль в процессах нейрональной синаптической пластичности до конца не ясна (Yuste, Bonhoeffer, 2004).

В настоящее время не достаточно изучены механизмы, определяющие скорость и временную динамику развития ДВП. Преобладающее большинство нейрофизиологических

исследований направлено на изучение электрогенной активности. При этом их взаимосвязь с молекулярными процессами остается недостаточно изученной. Не в полной мере определены процессы, обеспечивающие переход на долговременное поддержание более высокого уровня синаптической передачи. Для интерпретации и синтеза многочисленных данных о ДВП эффективно использование информационных технологий, таких как, например, технология GeneNet (Kolpakov, Ananko, 1999; Ananko et al., 2005; Колчанов и др., 2005). Они позволяют осуществить комплексный анализ межмолекулярных взаимодействий, сопоставить обширные гетерогенные экспериментальные данные, реконструировать внутриклеточные взаимосвязи и создать концептуальную модель развития ДВП.

Этому направлению исследований и посвящена данная работа. Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось определение роли межмолекулярных взаимодействий в функциональной пластичности нейронов и в изменениях эффективности синаптической передачи в поле CAI гиппокампа.

На основе поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Проанализировать в экспериментах in vitro временную динамику амплитуды ответов нейронов поля CAI срезов гиппокампа мыши в первые минуты после высокочастотной стимуляции.

2. Оценить влияние периодической стимуляции на длительное поддержание нового уровня нейропередачи.

3. Построить и проанализировать схемы межмолекулярных взаимодействий ионотропных глутаматных рецепторов, обеспечивающих изменение синаптической эффективности в поле CAI гиппокампа.

4. Исследовать в экспериментах in vitro влияние активации цАМФ-зависимой и кальций-зависимой систем на функциональную нейрональную пластичность.

5. Провести экспериментальную оценку и теоретический анализ влияния блокады формирования везикул, переносящих вновь синтезированные белки, на временную динамику развития и поддержания нейротрансмиссии в поле CAI срезов гиппокампа мыши.

Научная новизна

• Выявлены достоверные отличия в характере динамики подъема амплитуды популяционных ответов нервных клеток. Уточнен временной диапазон развития и фиксации нового уровня нейропередачи нейронов поля CAI гиппокампа после высокочастотной стимуляции.

• Впервые реконструированы межмолекулярные взаимодействия в комплексах ионотропных глутаматных рецепторов.

• Впервые построены интерактивные схемы, молекулярных процессов, лежащих в основе функциональной пластичности и долговременного поддержания эффективности синаптической передачи.

• Впервые показано, что кратковременная блокада доставки вновь синтезированных белков из сомы не снижает базовую активность нейронов, не нарушает индукцию ДВП, но препятствует долговременному сохранению нового уровня синаптической эффективности.

молекулярно-клеточных механизмах изменения синаптической эффективности. Результаты могут быть использованы при планировании экспериментов, а также в учебных курсах по нейробиологии и нейроинформатике. Полученные теоретические и экспериментальные данные могут лечь в основу разработки моделей исследования фармакологически перспективных соединений, инновационных методов и аппаратно-программных средств диагностики, профилактики и коррекции нейропатологий.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Состояние молекулярных систем нейрона обуславливает его реакцию на внешний сигнал. Структура межмолекулярных взаимодействий различных функциональных систем клетки зависит от предшествующих информационных процессов и определяет динамику синаптической пластичности.

2. Кратковременное нарушение процессов посттрансляционных модификаций вновь синтезированных белков в соме не оказывает влияния на фазы индукции и развития долговременной потенциации в поле CAI гиппокампа мыши.

3. Блокада формирования везикул, переносящих вновь синтезированные белки из сомы нейрона, необратимо нарушает процессы перехода к поддержанию нового уровня нейрональной синаптической эффективности.

4. Сеть межмолекулярных взаимодействий образует регуляторные контуры, интегрирующие и синхронизирующие возбуждение в дендритной сети в процессах нейрональной синаптической пластичности.

Апробация материалов диссертации

Основные положения диссертации доложены на следующих международных и всероссийских конференциях:

VI, VII Сибирский съезд физиологов (Барнаул 2008, Красноярск 2012); IX, X региональные конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных (Simpler Nervous Systems, 2009, Simpler Nervous Systems, 2012, Санкт-Петербург 2009, 2012);

Международные конференции по биоинформатике геномной регуляции и структуры

(BGRS\SB'2010, BGRS\SB'2012, Новосибирск 2010, 2012);

XXI съезд физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010);

13я, 14я, 15я всероссийские научно-технические конференции (Нейроинформатика 2011,

Нейроинформатика-2012, Нейроинформатика-2013, Москва 2011, 2012, 2013);

7, 9 международный междисциплинарный конгресс (Судак, Украина, 2011, 2013);

Вторая и третья Всероссийская конференция «Нелинейная динамика в когнитивных

исследованиях» (Нижний Новгород, 2011 2013;

5я международная конференция по когнитивной науке (Калининград, 2012); XVI Международная конференция по нейрокибернетике (Ростов-на-Дону, 2012); II Всероссийская конференция с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология» (Пущино, 2012)

Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2013).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 21 работа, из них 3 в реферируемых научных журналах, включенных в список ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа объемом 130 страниц состоит из введения, обзора

литературы, описания объекта и методов исследования, главы результатов исследования, обсуждения, выводов и указателя цитируемой литературы (328 источников). Диссертация иллюстрирована 30 рисунками, содержит 7 таблиц, 3 приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

Обзор литературы начинается с общей характеристики синаптической пластичности, выражающейся в изменении эффективности синаптической передачи в ответ на различные воздействия. Дано четкое обоснование выбора основного объекта исследования -глутаматных синапсов пирамидных нейронов CAI поля гиппокампа. Исчерпывающе описаны рецепторы этого отдела мозга, приведена их современная классификация, строение и функциональные особенности. Рассмотрена структурная и микродоменная организация дендритных шипиков. В общих чертах охарактеризована вакуолярная система дендритов нейронов. Оценен вклад фосфоинозитидов и белков семейства малых ГТФаз в процессы регулирования структурно-функциональной синаптической пластичности. Описаны особенности биосинтеза, посттрансляционных модификаций и транспортировки АМПА рецепторов в зависимости от их субьединичного состава. Отдельное внимание уделено особенностям регулирования перемещения этих рецепторов после активирования синапса.

Глава 2. Объект и методы исследования

Исследования in vitro

Подготовка срезов. Эксперименты проведены на двухмесячных мышах линии ICR с соблюдением «Правил работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Министерства здравоохранения № 755 от 12.08.1977). Использовался срез медиальной части левого гиппокампа одного из животных. Извлеченный после декапитации мозг переносили в охлажденный до 4 С физиологический раствор с добавлением choline chloride — 110 мМ, пируват натрия — 3 мМ, L-аскорбат натрия — 11,5 мМ. Через одну минуту выделяли гиппокамп и с помощью механического микротома делали поперечные срезы толщиной 300-350 мкм. Срезы помещали в камеру с аэрируемым карбогеном (95% 02, 5% С02) физиологическим раствором следующего состава (в мМ): NaCl - 128,5; КС1 - 2,25; СаС12 - 2,4; MgS04 - 2,56; NaHC03 - 26; KH2P04 - 1,24; глюкоза - 10; рН 7,6 - 7,8. В течение двух часов срезы инкубировались для стабилизации электрической активности. Температура в камере в течение первых 60 минут инкубации медленно повышалась до 32°С.

Электрическая стимуляция и запись ответов нейронов CAI поля гиппокампа.

Внеклеточная регистрация вызванных электрической стимуляцией популяционных спайков (п-спайков) выполнялась в пирамидном слое поля CAI с помощью стеклянного микроэлектрода, заполненного физиологическим раствором. Для эфферентной электрической стимуляции пирамидных клеток поля CAI два стеклянных микроэлектрода, заполненных физиологическим раствором, позиционировали в коммисуральном пути коллатералей Шаффера (около сочленения CAI и СА2 полей гиппокампа). Перед началом основного эксперимента для каждого среза определяли пороговую силу стимула и зависимость амплитуды ответа от величины стимула. В ходе основного эксперимента использовали интенсивность тестирующего стимула, при которой амплитуда п-спайков не превышала 50% от максимально возможной амплитуды. Внеклеточные сигналы записывались и усиливались с помощью усилителя (Nihon Kohden.mez-8201, Япония). Регистрацию данных проводили с помощью аналого-цифрового преобразователя (L-CARD, Россия).

Выделение одиночных клеток. Изолированные нейроны выделялись из окологлоточных ганглиев прудовика Lymnaea stagnalis в стерильных условиях (в культуральном боксе) (Костенко, 1972). Всего в работе было задействовано 115 нейронов. Ганглии помещались в физиологический раствор, содержащий 0,3-0,5% проназы (Pronase, MERK, Germany) или протеазы (Protease type XIV, Sigma, USA). Инкубация ганглиев в солевом растворе, содержащем протеолитические ферменты, проводилась в течение 20-40 минут при комнатной температуре или 12-18 часов при температуре +4°С. После ферментативной обработки ганглии подвергались механическому разделению, позволяющему выделить одиночные нейроны из клеточных агрегатов (Костенко, 1972). Извлеченные клетки культивировались в чашках Петри (объемом 5 мл) с солевым раствором следующего состава (в мМ): NaCl - 30, KCl - 1.6, СаС12 - 4, MgCl2 - 1.5, NaHC03 - 10, pH - 7.6-7.8. Культивирование проводилось при температуре +6-12°С в течение 16-18 часов. Запись мембранного потенциала одиночных нейронов Lymnaea stagnalis. Для записи мембранного потенциала (МП) одиночных клеток применялась обычная микроэлектродная техника исследований. Микроэлектроды заполнялись 2.5 М KCl и имели сопротивление 715 мОм. Для регистрации использовался аналого-цифровой преобразователь («L-CARD»), За 100% принималось значение МП до аппликации лидокаина в физиологических концентрациях (7мМ), при этом пиковая амплитуда изменений МП выражалась как процент от этого значения.

Исследование влияния целостности везикулярного пути на процессы развития и поддержания ДВП проводились с использованием в экспериментах блокаторов везикулярного транспорта - Брефельдина A (BFA) и Ехо 1.

В экспериментах с BFA срезы (п=30) были разделены на три группы: контроль (п=9) и две экспериментальные (п=11, п=10). Внеклеточную стимуляцию осуществляли прямоугольными импульсами длительностью 200-300 мкс, подаваемыми с интервалом в 2 мин. Протокол эксперимента включал четыре периода. Период 1: проверка стабильности ответов; перфузия физиологическим раствором (10 мин). Период 2: инкубация; перфузия физиологическим раствором, содержащим Брефельдин A (Sigma) (60 мин). Период 3: тетанизация коллатералей Шаффера (электрическая стимуляция в течение 1с/100 Гц). Период 4: развитие и сохранение нового уровня нейротрансмиссии; перфузия физиологическим раствором (50 мин), регистрация вызванных ответов. BFA (Sigma) растворяли в диметилсульфоксиде в концентрации 10 мкг/мл, далее маточный раствор BFA хранился при -18 С до эксперимента. За 5 минут до инкубации пробирка с необходимым объемом маточного раствора размораживалась, маточный раствор смешивался с 20 мл физраствора и через 5 минут вводили в протоку. Концентрация BFA в рабочем растворе составляла 3.5 мкМ. Максимальная концентрация диметилсульфоксида (ДМСО) в конечном растворе не превышала 0.05%.

В экспериментах с Exol срезы (п=15) были поделены на три группы: две экспериментальные (п=5, п=5) и контрольную (п=5). Приготовление маточного раствора: 0.27 мг Exol (Sigma) растворяли в 50 мкл спирта, затем добавляли 3 мкл концентрированной HCl. Необходимый объем маточного раствора разводили в 20 мл физраствора при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Раствор имел pH 7,6 (для нейтрализации использовали трис). Конечная доля Exol в растворе составляла 40 мкМ.

На графиках данные представлены в виде средней величины (М) ± стандартная ошибка среднего (т). Для оценки достоверности отличий с контрольной группой использовали U-критерий Манна-Уитни для каждой временной точки. Реконструкция сети межмолекулярных взаимодействий дендритного шипика проводили с использованием технологии GeneNet (РОСПАТЕНТ № 990006 от 15/02/1999; (Ananko, 2005)). Интерфейс ввода GeneNet Input автоматически транслирует введенную

информацию в формат базы данных GeneNet. GeneNet viewer позволяет представлять формализованные данные в виде графической диаграммы (схемы), которая визуализирует межмолекулярные взаимодействия описываемой сети. Все объекты и связи между ними снабжены ссылками на опубликованные литературные данные.

Глава 3. Результаты и обсуждение исследований

Анализ динамики изменения амплитуды ответов нейронов поля CAI гиппокампа после высокочастотной стимуляции

Приведенное в обзоре литературы описание компартментной организации дендритных шипиков позволяет выдвинуть предположение о высокой скорости развития процессов, обеспечивающих синаптическую пластичность. Была поставлена задача проанализировать динамику изменения амплитуды ответов при экстраклеточном отведении (п-спайк) от тел нейронов поля CAI гиппокампа в первые минуты после высокочастотной стимуляции (ВЧС). Это позволяет оценить число, амплитуду и степень синхронизации потенциалов действия отдельных клеток и служит мерой возбудимости нейронов в течение развития долговременной потенциации (ДВП).

Анализировали характер динамики изменения амплитуды популяционного спайка нейронов CAI поля гиппокампа мыши в первые секунды после ВЧС и влияние многократной тестирующей стимуляции на поддержание нового уровня нейротрансмиссии нейронов поля CAI гиппокампа.

Экспериментальная оценка временной динамики амплитуды ответов нейронов поля CAI гиппокампа мыши в первые минуты после высокочастотной стимуляции

Протокол эксперимента включал три периода. Период 1: проверка стабильности ответов. Период 2: тетанизация коллатералей Шаффера (электрическая стимуляция в течение 1 с/100 Гц пресинаптических волокон). Период 3: тестирующая стимуляция, регистрация вызванных ответов.

В экспериментах варьировали временные интервалы подачи тестирующих стимулов. Основная задача состояла в анализе характера изменения амплитуды ответов нейронов, вызванных ВЧС.

На рисунке 1 приведены данные, отражающие временную динамику амплитуды ответов в серии экспериментов (п=20). Установлено, что уже через Юс в ряде срезов был зарегистрирован максимальный подъем амплитуды п-спайка (рис. 1).

Г S

ч—

S -

э о о о о р ш о « J

Время, с

ф со о сч * г г Н (4 N

Рис. 1. Изменение амплитуды п-спайка в экспериментах in vitro после потенциации, вызванной высокочастотной стимуляцией в поле CAI гиппокампа мыши.

За 100% принята амплитуда до потенциации. t=0 - окончание высокочастотной стимуляции

Серые квадраты - группа 1, в которой наблюдалось плавное повышение амплитуды ответов

Черные кружки - группа 2, в которой регистрировали максимальную амплитуду ответов через 10 с после потенциации

Анализ амплитуды п-спайков позволил выделить две группы по скорости изменения ответов после ВЧС. Статистический анализ подтвердил разделение срезов на две группы (рис. 1). В первой группе (п=11) (группа 1, красные точки рис. 1) наблюдалось постепенное нарастание амплитуды популяционных ответов нейронов. Через 50-60с после ВЧС амплитуда достигала своего максимума. Далее наблюдалось ее постепенное снижение и выход на стационарный уровень. Во второй группе (п=9) (группа 2, синие точки рис. 1) наблюдался максимальный подъем через 10-20 с, а затем - спад амплитуды ответов в течение следующих 20-30 секунд и выход на плато в интервале 2-4 мин.

Таким образом, выявлено, что при развитии ДВП у разных срезов наблюдается в течение первой минуты значительный рост ответов нейронов, небольшой спад и стабилизация амплитуды п-спайков (рис.1). По характеру амплитуды п-спайка срезы достоверно разделились на две группы, отличающиеся по скорости выхода на максимальный уровень нейротрансмиссии после ВЧС. При этом обе группы срезов демонстрировали качественное сходство этого процесса - нарастание амплитуды п-спайка в первые 10-50 секунд после ВЧС, затем небольшой спад амплитуды и ее выход на плато в интервале 2-4 минут после начала тестирования (рис. 1).

Оценка влияния частоты стимуляции на длительное поддержание нового уровня

нейротрансмиссии

Была поставлена задача оценить возможное влияние входа ионов в дендритные шипики, вызванное регулярной тестирующей стимуляцией, на поддержание амплитуды п-спайка, регистрируемого от тел нейронов поля CAI гиппокампа.

Анализ амплитуды п-спайка в первые минуты после ВЧС выявил, что ко второй минуте исчезают достоверные отличия в характере динамики ответов различных срезов (рис. 1). Таким образом, 2 минуты являются оптимальным интервалом, позволяющим оценить изменение и поддержание нового уровня синаптической эффективности для пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа после ВЧС.

Проведено две серии экспериментов. В первой серии (п=6) тестовые стимулы подавались через каждые 2 минуты после ВЧС. Запись проводилась в течение 50 минут (темные точки на рис. 2). Во второй серии экспериментов (п=11) тестовые стимулы подавались через в 30 и 50 минут после ВЧС (светлые точки на рис. 2). На рис. 2 видно, что достоверных отличий в изменении амплитуды после ВЧС не обнаружено.

Рис. 2. Изменение амплитуды п-спайка в экспериментах in vitro после потенциации, вызванной высокочастотной стимуляцией в поле CAI гиппокампа мыши.

За 100% принята амплитуда до потенциации; t=0 - окончание высокочастотной стимуляции; стрелка - момент ВЧС

Í} ifi'iiiüH íiH \ии\

о о t

О 10 20 30 40 50

Время,мин

Отсутствие отличий свидетельствует о том, что изменение синаптической эффективности и длительное поддержание нового уровня нейротрансмиссии определяется только внутренними процессами, которые запускаются ВЧС, и не нуждаются в дополнительных стимулирующих воздействиях извне.

Итак, в первые 10-50с после ВЧС происходит стремительное нарастание амплитуды популяционных ответов нейронов поля CAI гиппокампа. По скорости достижения

максимального уровня ответов срезы достоверно разделились на две группы. Нейроны одной группы демонстрировали плавный подъем и спад п-спайка. Амплитуда ответов нейронов второй группы уже через 10-20с достигала своего максимального значения, после чего наблюдалось ее стремительное падение с выходом на новый стабильный уровень.

Таким образом, первые 10-50с после ВЧС характеризуются вариабельностью амплитуды п-спайка. К 2 минутам происходит стабилизация ответов и выход на новый уровень нейротрансмиссии, поддержание которого зависит только от внутренних, запускаемых ВЧС, процессов.

Теоретический анализ межбелковых взаимодействий в комплексах ионотропных глутаматныхрецепторов поля СА1 гиппокампа

Для анализа данных о разном характере ответов нейронов в первые секунды после ВЧС была использована технология GeneNet (Ананько, 2005). Общее описание белок-белковой сети «Промежуточная фаза долговременной потенциации» («Intermediate long-term potentiation» («Intermediate-LTP»)) приведено в обзоре литературы (http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/gnw/genenet/viewer/AMPA.html) (Приложение 2).

В «Intermediate-LTP» отображены процессы, обеспечивающие изменение плотности и субьединичного состава рецепторов АМПА типа в микродоменах дендритного шипика после тетанизации синапса. Считается, что данный процесс является одним из ключевых механизмов изменения уровня нейротрансмиссии в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа (Shepherd, Huganir, 2007; Newpher, Ehlers, 2008).

В экспериментах наблюдается различный характер развития ДВП в первую минуту после ВЧС. Имеются также данные других исследователей о значительном увеличении синаптических токов в течение 30-60 с после ВЧС (Zucker, Regehr, 2002; O'Connor et al., 2005). Все это позволяет выдвинуть гипотезу о существовании в дендритных шипиках нейронов поля СА1 гиппокампа полифункциональных молекулярных комплексов, обеспечивающих их предподготовленное до тетанизации состояние. Различное состояние таких комплексов, вероятно, опосредует характер ответов нейронов и скорость выхода на максимальный уровень амплитуды п-спайка в первые 10-50 с после ВЧС.

Проведенный комплекс экспериментальных и теоретических исследований позволил построить концептуальную модель, описывающую роль функциональных межмолекулярных взаимодействий в нейрональной синаптической пластичности.

После индукции ДВП происходит запуск регуляторных каскадов, обеспечиваемых предсуществующими до активации синапса межбелковыми взаимодействиями протеома дендритного шипика. Активность ионотропных глутаматных рецепторов НМДА (чувствительны к агонисту М-метил-О-аспарагиновой кислоте) и АМПА (чувствительны к а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоте) типа определяет индукцию и развитие ДВП в поле СА1 гиппокампа (Nowak et al., 1984; Сергеев, 1999; Palmer et al., 2005). Ключевую роль при этом играет, как считается, их подвижность и закрепление в различных микродоменах дендритного шипика (Newpher, Ehlers, 2008). Ионотропные глутаматные рецепторы формируют молекулярные комплексы через взаимодействие с скаффолд-белками (каркасные белки) постсинаптического уплотнения (ПСУ) головки шипика и элементами цитоскелета (Shen et al., 2000; Honkura et al., 2008).

Основные скаффолд-белки комплексов НМДА рецепторов (НМДАР): PSD-95, PSD-93 (Postsynaptic density protein), SAP97, SAP 102 (Synapse-associated protein), Magi-2 (синоним S-SCAM (Synaptic-scaffolding molecule)) (Sheng, Hoogenraad, 2007). PSD95 также является посадочной площадкой для АМПА рецепторов (Tomita et al., 2003) и часто рассматривается как маркер ПСУ (Chen et al., 2008). Таким образом, белки постсинаптического уплотнения выступают в качестве остова, закрепляющего НМДАР в центре синаптической мембраны шипика в виде крупных макрокомплексов (Husi, Grant, 2001), что обеспечивает

локальность входящего через каналы рецепторов потока ионов кальция (Raghuram et al., 2012).

Скаффолд-белки также являются площадками для закрепления в синаптической зоне других, необходимых для развития ДВП, молекул. Прежде всего, это САМКИ (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II) (Liu et al., 2006), активируемая входящими после потенцирования синапса ионами кальция (Lisman et al., 2002). Активная САМКИ запускает разнообразные биохимические процессы, обеспечивающие структурную и функциональную синаптическую пластичность в дендритных шипиках поля СА1 гиппокампа (табл.1).

Таблица 1.

Эффекторы САМКИ макрокомплексов НМДА рецепторов

Эффектор САМКИ процесс Лит. ссылка

GluRl Усиление проводимости канала Mammenetal., 1997

Kalyrin7 Ветвление актиновой сети (увеличение размеров шипиков); закрепление кластеров GluRl-АМПАР* в активной зоне Xie et al., 2007

Tiaml Ветвление актиновой сети (увеличение размеров шипиков) Fleming et al., 1999

SynGAP Обмен Ras-ГТФ/ГДФ (выход Ras из шипиков в дендрит); дестабилизация цитоскелета (не прямая активация кофилина) Kim et al., 1998; Carlisle et al., 2008

В макрокомплексах НМДАР закреплены малые ГТФазы («малые» (около 21 кДа) О-белки), являющиеся, как известно, основными регуляторами перестроек актиновых нитей (укорочение, элонгация, ветвление) (Гусев, 2001) семейства Шю - ШюА (Ма й а1., 2007), Cdc42 (8Ыга1зЫ-Уап^исЫ е1 а1., 2009). ГТФаза Яас1 не закреплена в комплексах сама по себе, но в них представлены белки, регулирующую ее работу (табл.2).

Таблица 2.

Регуляторы активности Racl, входящие в комплексы глутаматных рецепторов.

Белок-регулятор Racl локализация функцпн Лит. ссылка

AlphaPIX (Arhgefô) GIT 1-Shank активация Racl (через обмен ГДФ/ГТФ) Nodé-Langlois et al., 2006; Zhang, Webb, 2005

BetaPIX (Arhgef?) Park et al., 2003

TI AMI Baiap2-Shank активация Racl и Cdc42 Fleming et al., 1999

Kalirin 7 NR1 (НМДАР) активация Racl и RhoA Ma et al., 2008

Киназы семейства РАК (р21-activated kinase), эффекторы малых ГТФаз Racl и CDC42, также включены в макрокомплексы НМДАР, закрепляясь на белках PIX (Manser et al., 1998). Установлено, что Racl направляется в активные шипики после активирования НМДАР (Tejada-Simon et al., 2006).

Таким образом, очевидно, что состав комплексов НМДА рецепторов представлен главным образом белками, регулирующими структурные перестройки головки шипика (изменение актинового цитоскелета).

АМПА рецепторы - тетрамеры, состоящие из двух димеров: Glul/1 (гомотетрамеры субьединиц Glul); Glul/2 (гетеротетрамеры субъединиц Glul и Glu2) - Glul АМПАР, и Glu2/3 (гетеротетрамеры субьединиц Glu2 и Glu3) - АМПАР2/3. Рецепторы, содержащие в своем составе Glu2, проницаемы для ионов натрия, но не ионов кальция. Гомотетрамеры Glul/1 проницаемы для ионов кальция (Сергеев и др., 1999; Palmer et al., 2005).

Набор протеинов в комплексах разных шипиков отличается. Это определяется прежде всего количеством скаффолд-белков. Так, с использованием метода масс-спектрометрии установлено, что в ПСУ может входить от 60 до 400 главных молекул скаффолд-белков

(Peng et al., 2004; Chen et al., 2005; Cheng et al., 2006).

Белковый набор микродоменов в течение базовой нейротрансмиссии конститутивно поддерживает баланс киназ и фосфатаз, малых ГТФаз и их регуляторов, липидный состав мембраны, плотность трансмембранных белков, в том числе и АМПАР, ответственных за деполяризацию синаптической мембраны, необходимую для активации НМДАР при индукции ДВП (Nowak et al., 1984; Shepherd, Huganir, 2007; Opazo, Choquet, 2011). Все это обеспечивает, как можно предположить, пред подготовленное состояние микродомена синаптической мембраны дендритных шипиков на момент прихода нейротрансмитгера.

Можно сделать вывод, что индукция ДВП приводит к формированию системы межбелковых взаимодействий, обеспечивающих изменение синаптической эффективности. Закрепление и пространственное сближение протеинов в комплексах рецепторов, вероятно, является механизмом интеграции различных клеточных систем, что, в конечном счете, может определять высокую скорость развития процесса.

Входящие через НМДА рецепторы ионы кальция запускают сети регуляторных взаимодействий, главным образом, приводящие к структурным перестройкам в шипике и дестабилизации актиновых структур, что, в конечном счете, способствует уходу АМПАР2/3 из активной зоны и встраивание в нее поступающих из дендрита GluRl-АМПАР (Newpher, Ehlers, 2008) (рис.3).

Рис. 3. Фрагмент сети «Intermediate LTP».

Основные межмолекулярные регуляторные взаимодействия после ВЧС. Микродомены дендритного шипика: Synaptic membrane - синаптическая мембрана; perisynaptic membrane - перисинаптическая мембрана; extracynaptic membrane -внесинаптическая мембрана (зона эндоцитоза).

й - низкомолекулярные вещества; Ф - мономер; Ш - димер; & - мультимерный белок. Белки и реакции описаны в формате базы данных GeneNet (База данных и сеть создана автором и размешена на сайте

http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/gnw/genenet/viewer/AMPA.html).

Таким образом, плотность АМПАР2/3 в момент выброса нейротрансмиттера будет играть определяющую роль для индукции ДВП. Новый уровень эффективности синаптической передачи определяется плотностью введенных GluRl-АМПАР, которые постепенно заменяются АМПАР2/3 (Plant et al., 2006). Замена рецепторов нарушает цитоархитектуру шипика, что обеспечивает подвижность протеинов и формирование новых межмолекулярных взаимодействий в ответ на пришедший сигнал.

Таким образом, нейроны не только воспринимают и передают сигналы, но и «запоминают» событие в виде новой динамической организации межбелковых

взаимодействий. Сформированный таким образом «след памяти» может сохраняться и определять предподготовленное состояние всей сети молекулярных систем шипика до следующего раунда восприятие - активность.

Была поставлена задача проверить гипотезу о способности нейрона сохранять «воспоминание» о предшествующей активности в виде синхронизации межбелковых взаимодействий двух клеточных систем нейрона (цАМФ-зависимой и кальций-зависимой).

Экспериментальное исследование влияния активации цАМФ-зависимой и кальций-зависимой систем для функциональной нейроналъной пластичности.

Исследования структурно-функциональной динамики макрокомплексов одиночных синапсов в течение изменения эффективности синаптической передачи сопряжено с множеством методических и принципиальных трудностей. В связи с этим гораздо целесообразнее использовать разработанные упрощенные экспериментальные модели, позволяющие сочетать возможность выработки пластических реакций с доступностью для инструментального анализа и воздействий. Модель локальной пластичности участков сомы изолированных нейронов моллюсков in vitro была использована для оценки изменения активности нейронов в зависимости от предыдущего опыта.

В экспериментах измерялся мембранный потенциал (МП) и максимальное значение деполяризации мембраны нейронов после аппликации лидокаина в физиологических концентрациях (30 мкл 7мМ раствора гидрохлорида лидокаина) (ФК).

Аппликация ФК лидокаина приводила к обратимому сдвигу МП изолированных нейронов (п=23), находящихся в физиологическом растворе (рис. 4, график 5).

Рис. 4. Усредненные по группе нейронов реакции, вызванные аппликацией физиологических концентраций лидокаина.

Ось X - время, с; ось У - величина мембранного потенциала (мВ). Стрелкой отмечен момент добавления в среду ФК лидокаина.

1 - через 40 минут инкубации с теофиллином.

2 - через 40 минут инкубации с кофеином.

3 - через 40 минут инкубации с теофиллином, кофеином совместно с фемтомолярными концентрациями лидокаина.

4 - через 40 минут инкубации с теофиллином и кофеином.

5 - реакция контрольной группы нейронов.

Аппликация лидокаина в ФК к группе клеток, инкубированных в солевом растворе с добавлением 5 мМ теофиллина (п=23) либо кофеина (п=23) не вызывала статистически достоверного различия в пиковой амплитуде изменений МП по сравнению с контрольной группой (рис. 4, графики 1, 2). Таким образом, модификации молекулярных систем через добавление только одного метилксантина было не достаточно для усиления реакции нейронов (т.е. не активировалась их эффекторная реакция) на аппликацию ФК лидокаина.

Аппликация ФК лидокаина к нейронам (п=23), инкубированным в солевом растворе, содержащем и теофиллин, и кофеин, вызывала статистически достоверно значимое

(pO.OOl) увеличение амплитуды сдвига МП по сравнению с ответами клеток контрольной группы. Наибольшее увеличение амплитуды ответов наблюдалось через 30-40 минут инкубации (рис. 4, график 4). Видимо, только сочетанное фармакологическое воздействие двух агентов запускает межмолекулярные взаимодействия, обеспечивающие повышение реактивности нейрона на внешние воздействия.

Известно, что в фемтомолярных концентрациях (порядка 10 М) некоторые вещества при неблагоприятных условиях проявляют протекторную активность (Эпштейн и др., 2005). Было выдвинуто предположение, что в условиях повышенной реактивности под воздействием фемтомолярных концентраций веществ будет изменяться реакция нейронов на ФК лидокаина. Была поставлена серия экспериментов (п=23), в которых нейроны инкубировали в солевом растворе с добавлением кофеина, теофиллина и лидокаина в фемтомолярных концентрациях. Аппликация лидокаина в ФК не приводила к статистически значимому отличию ответов МП этой группы нейронов по сравнению с контролем, но не с нейронами, обработанными только теофиллином и кофеином (р<0.001) (рис. 4, график 3).

Установлено отсутствие эффекторных реакций нейронов на лидокаин в подпороговых концентрациях (данные не показаны).

Таким образом, совместное воздействие кофеина и теофиллина приводит к увеличению реактивности нейронов, тогда как инкубация клеток в растворе содержащем кофеин, теофиллин и лидокаин в фемтомолярных концентрациях не вызывала роста амплитуды реакции на ФК лидокаина. Можно предложить следующую реконструкцию молекулярных событий: теофиллин и кофеин инициируют рост уровня внутриклеточного Саг+ и цАМФ (Barnes, 2013; Ткачук, 2001; Mironov, Usachev, 1991), а также активацию различных контуров обратной негативной регуляции, поддерживающих концентрацию Са~ и цАМФ на безопасных для клетки уровнях. В условиях прекондиционирования нейронов лидокаином в фемтомолярных концентрациях происходит ассоциация акгивации различных контуров негативной регуляции, уровня вторичных посредников и ответа клетки на отдельные молекулы действующего вещества, превращая их в сигнальные стимулы. Важно отметить, что при этом необходима интеграция работы различных молекулярных ансамблей клетки. В данном случае, важна интеграция работы межмолекулярных взаимодействий, обеспечивающих выброс кальция из внутриклеточного депо и активирование накопления цАМФ. Нейрон таким образом «обучается», приобретает способность реагировать на подпороговые концентрации лидокаина в наших экспериментах. Аппликации ФК этого вещества, по-видимому, приводит к активации уже собранных межмолекулярных ансамблей в контурах обратной регуляции. Все это, вероятно, обуславливает тот факт, что амплитуда ответов клеток в экспериментах не

превышает уровня базового МП.

Новая структура межбелковых взаимодействий, выстроенная после активирования, может сохраняться и поддерживаться длительное время, что, вероятно, обеспечивает существование «следа» памяти на клеточном уровне и тесно связано с процессами транскрипции и биосинтеза белков (Steward, Schuman, 2001).

Оценка значимости целостности биосинтетического пути для изменения и поддержания эффективности синаптической передачи в поле CAI гиппокампа после высокочастотной стимуляции

Экспериментальная оценка роли целостности различных этапов доставки вновь

синтезированных белков из сомы для развития и поддержания ДВП Проведена экспериментальная оценка вклада целостности везикулярного пути вакуолярной системы нейрона на развитие и поддержание пластичности синаптической передачи в поле CAI гиппокампа мыши. Эксперименты проводились с блокаторами

формирования транспортных везикул - брефельдином A (BFA) и Exol на срезах, демонстрировавших стабильную амплитуду п-спайков. Амплитуда п-спайков также оставалась стабильной в течение 60 мин периода инкубации во всех группах. До добавления блокаторов в протоку осуществлялась тестовая стимуляция для проверки стабильности ответов срезов.

Инкубация срезов в течение 1 часа с 3.5 мкМ BFA (п=10) и 40 мкМ Exol (п=5) не оказывала влияния на амплитуду базового ответа нейронов CAI поля гиппокампа в течение следующих 50 мин перфузии этих срезов физиологическим раствором (рис. 5, 6). Тетанизацию срезов (1с/100 Гц) проводили в физиологическом растворе, содержащем соответствующие концентрации активных веществ. После тетанизации срезы начинали перфузировать физиологическим раствором. После тетанизации первый раз в этом периоде амплитуда п-спайков регистрировалась через 2 мин. Амплитуда п-спайков, как в контрольной группе, так и в двух группах обработанных срезов, увеличивалась не менее чем на 100%. Это свидетельствует о том, что 60 мин инкубации срезов с блокаторами не препятствует развитию ДВП.

Рис. 5. Влияние BFA на сохранение долговременной потенциации

пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа мыши и базовую амплитуду п-спайков. Динамика амплитуды п-спайков: • - контрольная группа срезов; А- группа срезов подвергшихся 60 мин воздействию брефельдина А перед тетанизацией. За 100% взята амплитуда п-спайков до индукции ДП высокочастотной стимуляцией (1 с/100 Гц). Стрелкой обозначен момент тетанизации.

■ - группе срезов подвергшихся 60 мин воздействию брефельдина А (без тетанизации). 0 минут соответствует началу перфузии срезов физиологическим раствором без брефельдина А.

Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего. *- р<0.05, **- р<0.01 по сравнению с контролем.

В контрольных группах (п=10 и п=5) в течение этого периода наблюдались небольшие колебания средней амплитуды п-спайков, что отражает сохранение ДВП в гиппокампальных срезах (рис. 5, 6)

При регистрации амплитуды п-спайка со срезов, обработанных 3.5 мкМ BFA (п=10), наблюдалось некоторое снижение амплитуды вызванных ответов, начиная с 10 минуты экспериментов. Через 25-30 мин после индукции ДВП различия средних величин амплитуд между опытной и контрольными группами становились достоверными. Спад амплитуд п-спайков продолжался весь период наблюдения (50 минут) (рис. 5).

Преинкубация срезов с Exol (п=5) приводила к снижению амплитуды популяционных ответов нейронов CAI поля гиппокампа после ВЧС. Однако характер изменений отличался от экспериментов, в которых использовался BFA. Снижение амплитуды было небольшим. Тенденция к снижению амплитуды ответов намечается только после 20 минуты после ВЧС, а в интервале 30-40 минут снижение становится достоверным. Затем наблюдается рост амплитуды ответов п-спайка с выходом на новое плато (рис. 6).

1} 1 j Uji¡ ¡i.'i f'l Щп, 4 ч} !¡líj}Mf. FHiUjrín" I , I T í T и - í 1

i т 11 i • и iт! 4 i11' ' {} I { 4 i i 1

Время,мин

20 30

Время,мин

Рис. 6. Влияние Exol на сохранение долговременной потенциации пирамидных

нейронов поля CAI гиппокампа мыши и базовую амплитуду п-спайков.

Динамика амплитуды п-спайков: • - контрольная группа срезов; А,-группа срезов, подвергшихся 60 мин воздействию Exol перед тетанизацией.

■ - группа срезов, подвергшихся 60 мин воздействию Exol (без тетанизации). За 100% взята амплитуда п-спайков до индукции ДП высокочастотной стимуляцией (1с/100Гц). Стрелкой обозначен момент тетанизации. 0-мин соответствует началу перфузии срезов физиологическим раствором без Exol. Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего. * - р<0.01 по сравнению с контролем.

BFA воздействует на GEFs ARF1 (ADP-ribosylation factor 1), которые локализованы в различных компартментах аппарата Гольджи (АГ) и транс-Гольджи сети (ТГС). Добавление BFA к культуре клеток приводит к распаду АГ, ТГС и полной блокаде доставки новых белков к местам своего назначения (Klausner et al., 1992). Эффекты Exol, как предполагают, касаются гидролиза ГТФ на белках покрытия везикул и не затрагивают целостность АГ (Feng et al., 2003).

Таким образом, целостность всех этапов биосинтеза белков в соме важна для поддержания нового уровня синаптической эффективности после ВЧС в поле CAI гиппокампа мыши.

Теоретический анализ процессов доставки вновь синтезированных белков из сомы в дендритные шипики

С использованием технологии GeneNet построены схемы межмолекулярных взаимодействий, обеспечивающих процессы формирования везикул, переносящих вновь синтезированные белки из шероховатого эндоплазматического ретикулума (ШЭР) в АГ, а также формирование везикул на мембранах ТГС - сеть «Vesicle's trafficking».

Анализ белок-белковой сети «Vesicle's trafficking» позволил определить возможные механизмы, которые могут опосредовать наблюдаемые в экспериментах эффекты. Визуализация межбелковых взаимодействий наглядно демонстрирует мишень BFA -реакцию обмена ГДФ на ГТФ в молекуле ARF1 (рис. 7). ARF1 относится к семейству малых ГТФаз и играет ключевую роль в процессах сборки COPI-везикул в ретроградном транспорте от АГ к мембранам ЭР и закреплении белков адаптерного комплекса 1 (API) в процессе выхода вновь синтезированных белков с мембран ТГС (Sato, 2004).

Обмен ГДФ-ГТФ осуществляется через 8ес7-домен BIG1 (Brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein), белка, облегчающего перенос ГТФ на молекулу ARF1 (Mansour et al., 1999). BFA стабилизирует этот в норме быстротечный промежуточный шаг, формируя четырехчленный белковый комплекс (Chardin, McCormick, 1999). В итоге не формируется везикула и происходит нарушение прохода вновь синтезированных белков по компартментам АГ и/или их вывод из ТГС (рис. 7).

Вакуолярная система выполняет общую функцию синтеза, модификации, сортировки, формирования транспортных везикул, что обеспечивается скоординированной работой различных эволюционно сложившихся групп белков. Так, в сети «Vesicle's trafficking» реконструированы межбелковые взаимодействия, обеспечивающие интеграцию работы

белковых машин формирования везикулы и белков, регулирующих ремоделирование прилежащей актиновой сети (рис. 7). Растущая сеть нитей актина создает, как предполагают, механо-динамическую силу, отодвигающую формируемую везикулу от донорного компартмента (Anitei et al., 2010).

Таким образом, преинкубация срезов с BFA приводит тому, что зрелые АМПА рецепторы перестают поступать в дендритный ствол (Малахин и др., 2012). Вероятно, поначалу происходит нарушение процессов замены GluRl-АМПА рецепторов на GluR2/3 рецепторы, начинающийся, как известно, на 3-10 минуте и заканчивающийся к 25 минуте (Plant et al., 2006). Предположительно, может возникнуть ситуация острого дефицита GluR2-AMnA рецепторов на синаптической мембране.

Рис. 7. Фрагмент сети «Vesicle's trafficking»:

Формирование транспортных везикул на мембранах ТГС.

Golgy apparatus - АГ; TGN - ТГС; Golgi glycosylation — процесс созревания белков в компартментах АГ; sorting -процесс наплнения везикулы молекулами переносимого белка; nascent vesicle - формирующаяся покрытая клатрином везикула; ремоделирование актиновой сети: WAVE комплекс, Racl - ГТФаза, запускающая процесс ремоделирования, Megap, betaPIX - регуляторы Rac 1; polymerization - процесс полимеризации актина; GDP - ГДФ; GTP - ГТФ;

Ш - низкомолекулярные вещества; w-мономер; ©-димер; Л - мультимерный белок. Белки и реакции описаны в формате базы данных GeneNet

(База данных и сеть создана автором и размешена на сайте http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/gnw/genenet/viewer/AMPA.html).

Замена кальций проводящих рецепторов на не проводящие кальций АМПА рецепторы (а именно субъединица GluR2 определяет специфику ионной проводимости канала АМПА рецептора (Verdoorn et al., 1991)) имеет, вероятно, важное физиологическое значение - предохранение от локальных входящих токов кальция в синаптической зоне при базовой активности. Разрушение АГ препятствует созреванию вновь синтезированных белков, а разрушение ТГС - выходу успевших созреть рецепторов и формированию транспортных везикул (рис. 7).

В рамках «Vesicle's trafficking» подробно реконструированы основные этапы формирования везикулы на мембране шероховатого эндоплазматического ретикулума (ШЭР): сортировка предназначенных для переноса молекул в определенных сайтах экспорта на мембране ШЭР и образование так называемого преотпочковывающегося комплекса (prebudding complex, PC), объединение нескольких PC за счет белков, покрывающих везикулу, сброс покрытия и отсоединение везикулы от мембраны ШЭР и ее уход к АГ (рис. 8).

Имеются данные, что Exol нарушает формирование везикул, циркулирующих между ШЭР и АГ. Было выдвинуто предположение, что у не нейрональных клеток Exol может

. га s-

, JS

WAVE1WSI2/BRK1

к X т ч/ I

' | ©Д

AMPAR - АМПАР;

ускорять обмен ГТФ на ГДФ, по крайней мере, в ряде случаев, для белков семейства ARP, но точный механизм пока не установлен (Feng et al., 2003). Если эффект влияния Exol связан с блокированием первого этапа биосинтетического пути рецепторов (рис. 8), значит, данное вещество будет препятствовать входу вновь синтезированных белков, в том числе и АМПА рецепторов, в компартменты АГ, где они должны пройти окончательное созревание. Выйти из ТГС могут лишь полностью созревшие в компартментах АГ рецепторы, что контролируется на всех этапах прохода вновь синтезированного белка от компартмента к компартменту АГ (Stanley, 2011).

Рис. 8. Фрагмент сети « Vesicle's trafficking».

Формирование транспортных

везикул на мембранах ШЭР.

Endoplasmatic reticulum - ШЭР; ERES - сайты экспорта на ШЭР; prebudding complex (PC) -(преотпочковывающийся комплекс); COPII-coated vesicles -

сформированные покрытые

везикулы; Sarlb - малая ГТФаза, отвечающая за старт формирования покрытия везикулы; Sarl2 - обмен ГДФ/ГТФ на молекуле Sarlb; СОРИ (Sec23a, Sec24a, Secl3, Sec31a, pi25a); polymerization - процесс полимеризации PC; GDP - ГДФ; OTP - ГТФ; AMPAR -

АМПАР; Ы - низкомолекулярные вещества; Ф - мономер; Ш - димер; S& -мультимерный белок. Белки и реакции описаны в формате базы данных GeneNet (База данных и сеть создана автором и размешена на сайте http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/gnw/genenet/viewer/AMPA.html).

При шизофрении наблюдается снижение числа субъединиц GluR2 АМПА рецепторов, которые проходят гликозилирование в ЭР и АГ (Tucholski et al., 2013), что свидетельствует о важном физиологическом значении описываемых процессов.

В нашей работе показано отсутствие влияния ингибиторов на базовую нейропередачу и увеличение ее эффективности в первые минуты после ВЧС. Видимо, вещества не нарушают ни доставку АМПА рецепторов из внутриклеточного везикулярного запасника, ни их рециркуляцию в дендритных шипиках в процессе развития ДВП (Shi et al., 1999). Преинкубация срезов с BFA и Exol приводит после ВЧС к снижению амплитуды ответов нейронов. Эффект BFA более выраженный, стабильный и необратимый. Эффекты Exol не такие выраженные и обратимые.

Итак, разрушение целостности различных этапов доставки белков от мест их созревания к синапсам приводит к нарушению поддержания нового уровня нейротрансмиссии, что наиболее очевидно начинает проявляться через 25-40 минут после индукции ДВП. Таким образом, и BFA, и Exol нарушают процессы перехода к долговременному поддержанию новой плотности АМПА рецепторов в шипиках. Тот факт, что Exol не нарушает целостности АГ и ТГС (Feng et al., 2003) делает его перспективным для исследований везикулярного транспорта. Точные механизмы влияния Exol в нейрональных клетках требуют дальнейшего детального исследования.

выводы

1. Впервые показано, что структура межмолекулярных взаимодействий различных систем нейронов обусловлена предшествующими информационными процессами в клетке и определяет динамику функциональной пластичности. Экспериментально в поле CAI гиппокампа выявлены, по крайней мере, два варианта развития ДВП после ВЧС, вероятно, свидетельствующие о исходно различном функциональном состоянии дендритных шипиков.

2. После специфической активации синапса происходит структурно-функциональная реорганизация протеома, сопряженная, но не ограниченная перемещением АМПА рецепторов между зонами шипика. Поддержание нового уровня синаптической эффективности не нуждается в дополнительных внешних воздействиях, а определяется инициированными внутриклеточными процессами.

3. Впервые экспериментально показано, что кратковременная блокада процессов посттрансляционной модификации вновь синтезированных в соме белков не оказывает влияния на базовую активность нейронов и развитие ДВП, но нарушает процессы поддержания нового уровня синаптической эффективности в поле CAI гиппокампа мыши.

4. Впервые построена сеть межмолекулярных взаимодействий, обеспечивающая изменение и поддержание ДВП в CAI поле гиппокампа. Выявлены регуляторные контуры, интегрирующие и синхронизирующие активность в функциональных сетях дендрита.

5. На одиночных нервных клетках впервые экспериментально показано, что интеграция цАМФ-зависимой и кальций-зависимой систем является одним из ключевых механизмов функциональной нейрональной пластичности.

Сппсок публикаций по теме диссертации в реферируемых научных журналах, включенных в

список ВАК

1 Колчанов H.A., Подколодная O.A., Игнатьева Е.В., Суслов В.В., Хлебодарова Т.М., Проскура А.Л., Воронич Е.С., Дубовенко Е.А. Интеграция генных сетей, контролирующих физиологические функции организма. // Вестник ВОГиС, 2005, т.9, N2, с. 179-198.

2. Zapara Т.А, Proskura A.L, Ratushnyak A.S, Shtark M.B, Epstein O.I. Substances in subthreshold concentrations under stress conditions can act as conditioned stimuli and trigger defense reactions //Bull. Exp. Biol. Med. 2009, № 147(1). P. 42-44. (Запара T.A., Проскура А.Л., Ратушняк A.C., Штарк М.Б., Эпштейн О.И. В стрессовых ситуациях вещества в подпороговых концентрациях могут приобретать значение условных стимулов, инициирующих защитные реакции. Бюл. Эксперим. биол. и мед., 2009, Т. 147, № 1, С. 43-46.)

3. Малахин И. А., Проскура А. Л., Запара Т. А., Ратушняк А. С. Влияние сборки транспортных везикул на процессы сохранения эффективности синаптической передачи. Вестник НГУ, 2012, Т. 10, № 4, С. 14-20.

Список публикации по теме диссертации

4 Проскура А.Л., Запара Т.А., Ратушняк A.C. Вещества в подпороговых концентрациях могут приобретать значение условных стимулов. // Тезисы докладов VI Сибирского физиологического съезда, Барнаул 2008 с. 173

5. Проскура А.Л., Запара Т.А., Ратушняк A.C. Механизмы структурно-функциональнои пластичности. // Тезисы докладов XXI съезда физиологического общества им. И.П. Павлова, Калуга 2010 с. 504

6. Проскура А.Л., Малахин И.А., Запара Т.А., Ратушняк A.C. Теоретико-экспериментальныи анализ межмолекулярных взаимодействий при реализации нейроном информационных функций // Труды конференции «Нелинейная динамика в когнитивных исследованиях-2011 » Нижний Новгород, 2011, С. 158-161.

7. Проскура А.Л., Малахин И.А., Запара Т.А., Ратушняк A.C. Информационные функции и молекулярные механизмы пластических реакций в нейронных системах. // Сборник научных трудов XIII Всероссийской научно-технической конференции «Нейроинформатика-2011» Москва, 2011,С. 29-39.

8. Проскура А.Л., Малахин И.А., Ратушняк A.C., Запара Т.А. Участие везикулярного транспорта рецепторов глутамата в регуляции эффективности синаптической передачи // В сб.: VII Сибирский съезд физиологов. Материалы съезда. Под ред. Л.И.Афтанаса и др. Красноярск. 2012. С. 436-437.

9 Проскура А.Л., Ратушняк A.C., Запара Т.А. Интерактом дендритного шипика нейрона в информационных процессах // Материалы XVI Международной конференции по нейрокибернетике. Ростов-на-Дону, 2012,Т. 1 С. 40-43.

10. Малахин И.А., Проскура А.Л., Запара Т.А., Ратушняк A.C. Нейрон как базовый элемент когнитивных систем // Глава в монографии "Лекции по нейроинформатике", отв. ред. Ю.В. Тюменцев, ИНЯУМИФИ", Москва ISBN 978-5-7262-1619-5, 2012, С. 61-102.

И. Малахин И.А., Проскура А.Л., Запара Т.А., Ратушняк A.C., Вечкапова С.О. Клеточные основы когнитивности // сб. 5й международной конференции по когнитивной науке. Калининград, Россия, 18-24 июня 2012, С. 516-518. .

12. Proskura A.L., Zapara Т.А., Zasypkina I.I., Ratushnyak A.S. Mechanisms of structure functional reconstruction of synaptic strength changing // BGRS\SB' 10 Novosibirsk, Russia, p.237.

13. Proskura A.L., Zapara T.A., Ratushnyak A.S. Intermolecular interaction at plastic reactions in hippocampus // «Seventh International Interdisciplinary Congress», Ukraine, 2011,C. 348-349

14. Proskura A.L. Ratushnyak A.S. Signal Transduction in Neuron Activation Gene Network // Simpler nervous systems. IX East European Conference of the ISIN. St.-Peterburg. 2009. P.85.

15. Proskura A.L., Zapara T.A., Malahin I.A., Ratushniak A.S. Investigation of the contribution of vesicular-transport in monosynaptic long-term potentiation II Simpler nervous systems. X East European Conference of the ISIN. St.-Peterburg. 2012. P.41.

16. Proskura A.L., Malakhin I.A., Zapara T.A. Mechanisms of ampa receptor trafficking as a base of changing the synaptic efficiency // BGRS\SB' 12 Novosibirsk, Russia June 25-29, 2012, pp.254.

17. Malakhin I.A., Proskura A.L., Vechkapova S.O., Zapara T.A., Ratushniak A.S. Theoretically-experimental research of vesicle trafficking mechanisms in the synaptic plasticity process // BGRS\SB'12 Novosibirsk, Russia June 25-29, 2012, pp. 194.

18. Проскура A.JI., Малахин И.А., Запара T.A., Ратушняк А.С., Молекулярные функциональные системы как основа когнитивных реакций нейрона // Сб. трудов XV Всероссийской научно-технической конференции «Нейроинформатика-2013», Москва, С. 45-55

19. Проскура A.JI., Запара Т.А., Малахин И.А., Ратушняк А.С., Роль белковых кластеров ионотропных глутаматных рецепторов в процессах развития долговременной потенциации // Рецепторы и внутриклеточная сигнализация. Сборник статей. Том. 1. /Под редакцией В.П. Зинченко, А.В. Бережнова-М.: ООО «ИД В. Ема», 2013.С. 353-358.

20. Ратушняк А.С., Запара Т.А., Вечкапова С.О., Проскура А.Л., Малахин И.А. Функции и молекулярные механизмы работы нейрона как элемента когнитивных систем // Нейронаука для медицины и психологии: 9-й Международный междисциплинарный конгресс. Судак, Крым, Украина. 2013: Труды / Под ред. Лосевой Е.В., Крючковой А.В., Логиновой Н.А. - М.: МАКС Пресс, 2013, ISBN 978-5-317-04437-4, С.266-267.

21. Запара Т.А., Ратушняк А.С., Вечкапова С.О., Проскура А.Л. Влияние полиморфных форм глицина на аберрантную активность пирамидных нейронов в срезах гиппокампа // Нейронаука для медицины и психологии: 9-й Международный междисциплинарный конгресс. Судак, Крым, Украина, 2013 г.: Труды / Под ред. Лосевой Е.В., Крючковой А.В., Логиновой Н.А. - М.: МАКС Пресс, 2013, ISBN 978-5-317-04437-4, С.145-146.

Подписано к печати 8 ноября 2013г. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 050. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Проскура, Анна Леонидовна, Новосибирск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Конструкторско-технологический институт вычислительной техники СО РАН • -

На правах рукописи

УДК 576.32/.36: 612.014

04201452141

ПРОСКУРА Анна Леонидовна

РОЛЬ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В НЕЙРОНАЛЬНОЙ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ

03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1. Синагггическая пластичность 8

1.1. Глутаматэргические синапсы зоны CAI гиппокампа 8

1.1.1 Микродоменная организация дендритного шипика поля СА1 гиппокампа 13 1.1.2. Цитоскелет как базис структурной пластичности децдритного шипика 16

1.2. Изменение и поддержание синаптичесшй эффективности 20

1.2.1. Вакуолярная система нейрона 21 Фосфоинозигиды вакуолярной системы нейрона 23 Белки-транспортеры, доставляющие везикулы в дендриты и шипики 24

1.2.2. Вклад малых ГТФаз в процессы синаптической пластичности 26 Малые ГТФазы в вакуолярной системе нейрона 26 Малые ГТФазы — ключевые регуляторы динамики цитоскелета 30

1.3. Регулирование динамики глутаматных рецепторов в шипике 33

1.3.1. Поддержание плотности АМПА рецепторов в неактивном синапсе 36

1.3.2. Зависимая от активности НМДА рецептора динамика АМПА рецепторов в процессах синаптической пластичности 37

1.4. Представление синаптической пластичности в базе данных GeneNet 40 Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВА НИЯ 45

2.1. Объект исследования 45

2.1.1. Подготовка срезов 45

2.1.2. Выделение одиночных клеток 46

2.2. Электрофизиологические методы 46

2.2.1. Электрическая стимуляция и запись ответов нейронов поля CAI гиппокампа 46

2.2.2. Запись мембранного потенциала одиночных нейронов Lymnaea stagnalis 48

2.3.1. Эксперименты с брефельдином А 48

2.3.2. Эксперименты с Exol 48

2.3.3. Эксперименты на изолированных нейронах 49

2.3.4. Статистическая обработка экспериментальных данных 49

2.4. Биофизическая модель 49

2.5. Реконструкция межбелковых взаимодействий 50 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ 51 3.1.1. Анализ динамики изменения амплитуды п-спайка нейронов поля CAI гиппокампа после ВЧС 51

3.1.2 Теоретический анализ межбелковых взаимодействий ионотропных глутаматных рецепторов 58

3.1.3. Математический анализ динамики перераспределения АМПА рецепторов в ранней фазе ДВП 72

3.1.4. Экспериментальное исследование изменения активности одиночных нейронов в зависимости от предыдущего опыта 81

3.2. Оценка значимости целостности биосинтетического пути для изменения и поддержания эффективности синаптической передачи в поле CAI гиппокампа после высокочастотной стимуляции 86 3.2.1. Экспериментальная оценка роли целостности различных этапов доставки вновь синтезированных

белков из сомы для развития и поддержания ДВП 86 3.2.2. Теоретический анализ процессов доставки вновь синтезированных белков из сомы в дендритные

шипики 90

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 104

ВЫВОДЫ 105

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 106

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 130

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Растущие потребности создания инновационных методов и аппаратно-программных средств диагностики, профилактики и коррекции нейропатологий, скрининга фармакологически перспективных соединений, разработки новых поколений информационных устройств усилили актуальность исследований в области нейронаук. Происходит стремительное накопление значительных объемов экспериментальных данных об эволюции, структуре, функции мозга и нервной системы на самых различных уровнях их иерархической организации (Hanse, Gustafsson, 1992; Попов и др., 2004; Балабан, Гуляева, 2006; Newpher, Ehlers, 2008; Балабан, Коршунова, 2011; Kandel, 2012). Представление о нейроне как о простом передатчике сигналов уже не кажется убедительным. Поэтому ключевой задачей современной нейробиологии является выявление свойств нервных клеток, лежащих в основе обучения, памяти и других процессов, являющихся базой шшитивности. Как именно достигается сочетание стабильного хранения воспоминаний с высокой пластичности межнейронных связей остается еще одной важнейшей нерешенной проблемой. Несмотря на огромный объем аналитических данных, практически отсутствуют реальные концептуальные модели нейрона и, в частности, синапса, способные объединить накопленный эмпирический материал в систему знаний.

Нейрональную пластичность можно определить как фундаментальное свойство центральной нервной системы (ЦНС), связанное с изменением возбудимости нейрона, вызванное процессами обучения, основу которого составляют сложные и недостаточно изученные межмолекутярные взаимодействия, приводящие к долгосрочным изменениям нейронных сетей и опирающиеся на экспрессию генов (Анохин, 1998; Greer, Greenberg, 2008). Нейрон — функциональная единица ЦНС, синапсы же являются местами их контактов между собой или клетками других типов (Smrt, Zhao, 2010). По существующим представлениям именно синаптические межклеточные контакты являются элементами, которые обеспечивают нейрональную пластичность, а молекулярные механизмы изменения эффективности синаптической передачи лежат в основе процессов памяти и обучения (Martinet al., 2000; Smrt, Zhao, 2010; Nalloor et aL, 2012).

Наиболее разработанной клеточной моделью для изучения синаптической пластичности in vitro является долговременная потенциация (ДВП) — длительное увеличение эффективности синаптической передачи, возникающее после интенсивного и непродолжительного выброса нейротрансмиттера, например, в результате высоючастотной стимуляции афферентных входов (Bliss, Collingridge, 1993). Преобладающее большинство нейрофизиологических исследований направлено на изучение электрогенной активности. При этом их взаимосвязь с молекулярными

процессами остаются недостаточно изученными.

Установлено, что развитие ДВП сопровождается преобразованием морфологии дендритных шипишв — небольших выростов мембраны дендрита, богатых актином и образующих синаптические контакты (Yuste, Bonhoeffer, 2001; Honkura et al, 2008). Эти структуры были описаны более ста лет назад, но их роль в процессах нейрональной синаптичесюй пластичности до конца не ясна (Yuste, Bonhoeffer, 2004).

В настоящее время не достаточно изучены механизмы, определяющие скорость и временную динамику развития ДВП. Не в полной мере определены процессы, обеспечивающие переход на долговременное поддержание более высокого уровня синаптичесюй передачи. Для интерпретации и синтеза многочисленных данных о ДВП удобно использовать информационные технологии (такие как, например, технология GeneNet (Kolpakov, Ananko, 1999; Ananko et al., 2005; Колчанов и др., 2005)), позволяющие осуществить комплексный анализ белок-белковых взаимодействий, сопоставить обширные гетерогенные экспериментальные данные, реконструировать внутриклеточные взаимодействия и описать концептуальную модель развития ДВП.

Этому направлению исследований и посвящена данная работа.

Цели и задачи исследования

На основе поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Проанализировать в экспериментах in vitro временную динамику изменения амплитуды ответов нейронов поля CAI срезов гиппокампа мыши в первые минуты после высокочастотной стимуляции.

2. Оценить влияние периодической стимуляции на длительное поддержание нового уровня нейропередачи.

3. Построить и проанализировать схемы межмолекупярных взаимодействий ионотропных глутаматных рецепторов, обеспечивающих изменение синаптической эффективности в поле CAI гиппокампа.

5. Провести экспериментальную оценку и теоретический анализ влияния блокады формирования везикул, переносящих вновь синтезированные белки, на временную

динамику развития и поддержания нейротрансмиссии в поле CAI срезов гиппокампа 4 мыши.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Кратковременное нарушение процессов посттрансляционных модификаций вновь синтезированных белшв в соме не оказывает влияния на фазы индукции и развития

* долговременной потенциации в поле CAI гиппокампа мыши.

Научная новизна полученных результатов

Выявлены достоверные отличия в характере динамики подъема амплитуды популяционных ответов нервных клеток. Уточнен временной диапазон развития и фиксации нового уровня нейропередачи нейронов поля CAI гиппокампа после высокочастотной стимуляции.

Впервые реконструированы межмолекулярные взаимодействия в юмплексах ионотропных глутаматных рецепторов.

Впервые построены интерактивные схемы, молекулярных процессов, лежащих в основе функциональной пластичности и долговременного поддержания эффективности синаптичесюй передачи.

Впервые показано, что кратковременная блокада доставки вновь синтезированных белков из сомы не снижает базовую активность нейронов, не нарушает индукцию ДВП, но

* препятствует долговременному сохранению нового уровня синаптичесюй эффективности.

Практическая значимость полученных оригинальных результатов заключается в том, что они расширяют понимание клеточных процессов, играющих важную роль при сохранении информации в мозге, позволяют уточнить и дополнить имеющиеся представления о молекулярно-клеточных механизмах изменения синаптичесшй эффективности. Результаты могут быть использованы при планировании экспериментов, а также в учебных курсах по нейробиологии и нейроинформатике. Полученные теоретические и экспериментальные данные могут лечь в основу разработки моделей исследования фармаюлогически перспективных соединений, инновационных методов и аппаратно-программных средств диагностики, профилактики и коррекции нейропатологий.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Синаптическая пластичность

Синаптическая пластичность — это способность нейронов реагировать на различные воздействия (физиологические или патологические) изменением эффективности синаптической передачи (Citri, Malenka, 2008). Синаптические межклеточные контакты обеспечивают пластичность нервной системы, а изменение эффективности синаптической передачи ответственно за реакции восприятия, проведения возбуждения, обучение и запоминание (Martin et aL, 2000; Nalloor et al, 2012). Их работа обеспечивает основную часть жизненно важных функций нервной системы, опосредуя реализацию физиологических процессов, связанных с передачей электрических и химических сигналов (Smrt, Zhao, 2010). Нарушение работы этих элементов нервных клеток прямо или косвенно связано со многими патологическими состояниями у человека (Kasai et al., 2010; Lai, Ip, 2013). Поэтому одним из актуальных направлений нейробиологии и физиологии является исследование молекулярной организации и механизмов функционирования этих клеточных структур.

1.1. Глутаматергические синапсы поля CAI гиппокампа

Гиппокамп является удобной структурой мозга для изучения процессов синаптической пластичности. Во-первых, показана активная вовлеченность этого отдела мозга в процессы восприятия информации, ее распознавания, анализа и запоминания (Kjelstrup et al, 2008; Hawley et al., 2012). Во-вторых, гиппокамп имеет упорядоченную структуру афферентных и эфферентных волошн. Это позволяет изучать его не только in vivo, но и in vitro на переживающих срезах гиппокампа, которые, будучи погруженными в специальный солевой раствор, максимально приближенный по составу к спинномозговой жидкости, сохраняют жизнеспособность в течение несшльких часов (а при соблюдении некоторых дополнительных мер — даже суток) (Warburg et aL, 1924). На основании ряда критериев (морфологических, электрофизиологических, характеру связей, чувствительности к ишемии и др.) гиппокамп

делится на четко дифференцированные зоны: зубчатую извилину и область пирамидных клеток (Аммонов рог) — CAI поле, САЗ поле (иногда в этой зоне выделяют отдельно небольшое СА4 поле), СА2 поле (Lorente de No, 1934; Isaacson, Pribram, 1975). Установлено, что основным источником афферентных входов гиппокампа являются нейроны энторинальной юры, аксоны которых в составе перфорантного пути образуют синаптические соединения с нейронами гранулярных клеток, а также с дистальными частями апикальных дендритов пирамидной области САЗ (Biscoe, Duchen, 1985). Аксоны гранулярных клеток образуют мшистые волокна, которые проецируются на пирамидальные клетки САЗ поля (Claiborne et al., 1993). Часть аксонов пирамидных клеток САЗ поля образует шллатерали Шаффера, которые проецируются на пирамидные клетки CAI поля (Frotscher, Gähwiler, 1988). Аксоны пирамидных клеток CAI через фимбрию образуют эфферентные выходы гиппокампа (Jones, 1993) (рис. 1). Поле CAI обладает выраженной ламинарной организацией клеточных связей и малым числом рекуррентных взаимодействий (Szirmai et al., 2012), что делает его перспективным объектом для электрофизиологических исследований.

В синапсах коллатералей Шаффера нейромедиатором является туга мат, а в роли рецепторов пирамидных нейронов CAI поля выступают гаутаматные рецепторы нескольких типов (Collingridge etaL, 1983).

Глутаминовая кислота является возбуждающим медиатором в синапсах нервной системы позвоночных (Moloney, 2002). Существуют ионотропные и метаботропные гаутаматные рецепторы. Медленная реакция на гаутамат опосредуется метаботропными гаутаматными рецепторами. Они связаны с G-белювым комплексом и модулируют уровень продукции вторичных мессенджеров. Выделяют три группы рецепторов. Рецепторы группы I, mGluRl и 5, активируют фосфолипазу С, что ведет к активации внутриклеточных посредников: инозитолтрифосфатов, протеинкиназы С и подъему уровня ионов кальция. Рецепторы групп II и III, mGluR2, 3 и mGluR4,6,7,8 соответственно, реализуют сигнал через цАМФ (циклоаденозинмонофосфат) (Lee et al., 2004).

Современная классификация ионотропных гаутаматных рецепторов основана на их чувствительности к действию различных агонистов: N - мети л- D- aci i араги н о в ой (НМДА), а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой (АМПА), каинатной и квисквалатной кислот (Bochet, Rossier, 1993).

НМДА рецепторы селективно связывают НМДА. Известно пять субъединиц по 40-92 кДа, одной NR1 (NMDAR1, zeta) и четырех NR2 (NMDAR2A-NMDAR2D, epsilon 1-4), каждая из которых кодируется отдельным геном (Grinl (субъединица zeta), Grin2a-2d (субъединицы epsilon 1-4)) (Nagasawa et aL, 1996). Гликопротеид-липидные субъединицы формируют рецепторно-ионофорные комплексы с медленной динамикой запуска, так как для их активации необходимо совпадение химического сигнала с определенным потенциалом на мембране (потенциал-чувствительность — необходима деполяризация мембраны в диапазоне -30 — -20 мВ). Блокируется канал ионами магния (Nowak et al, 1984; Сергеев, 1999).

АМПА рецепторы селективно связывают АМПА, а также каинат и квисквалат. Структурно АМПА рецептор — тетрамер, который может образовываться из 4 типов субъединиц (GluR 1-4), кодируемых отдельными генами (Gria 1-4) (Palmer et al., 2005). В глутаматергических синапсах CAI поля гиппокампа взрослых млекопитающих присутствуют рецепторы с субъединичным составом GluRl/1 (гомотетрамеры субъединицы GluRl), GluRl/2 (гетеротетрамеры субъединиц GluRl и GluR2) и GluR2/3 (гетеротетрамеры субъединиц GluR2 и GluR3). Каждая субъединица составлена примерно из 900 аминокислот с молекулярным весом около 105 кДа. Они обладают высокой гомологией — примерно 68-74% на уровне полипептидной цепочки и примерно 70% на уровне генов. Рецепторы, содержащие в своем составе GluR2, проницаемы для ионов натрия, но не ионов кальция. Гомотетрамеры GluRl проницаемы и для кальция (Сергеев и др., 1999;

Palmer et al., 2005).

В ЦНС находится порядка 106 тутаматергических нейронов (Ereciñska, Silver, 1990). Пирамидные нейроны САЗ и CAI полей гиппокампа формируют аксо-дендритные глутаматергические возбуждающие ассиметричные синапсы. Причем аксоны шллатералей Шаффера могут образовывать синаптические соединения как непосредственно с дендритами, так и с небольшими выростами на их поверхности — дендритными шипиками (шиниковые синапсы) (Harris, Stevens, 1989; Smrt, Zhao, 2010).

Дендритный шипик — мембранный вырост на поверхности дендрита, который образует синаптическое соединение (Smrt, Zhao, 2010) (рис. 2).

Рисунок 2. Схематическое представление нейрона и его шипиковых синагггических контактов (взято из Smrt, Zhao, 2010). Красным кружк

Информация о работе

Проскура, Анна Леонидовна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2013
ВАК 03.03.01

Диссертация

Роль функциональных межмолекулярных взаимодействий в нейрональной синаптической пластичности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы