Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция синаптической передачи активацией постсинаптических рецепторов, астроглией и внеклеточным матриксом мозга

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция синаптической передачи активацией постсинаптических рецепторов, астроглией и внеклеточным матриксом мозга"

На правах рукописи

У

Дембицкая Юлия Владимировна

Регуляция синаптической передачи активацией постсинаптических рецепторов, астроглией и внеклеточным матриксом мозга

Специальность 03.03.01 — Физиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

25ФЕВ 2015

005559538

Казань-2015

005559538

Работа выполнена на кафедре нейродинамики и нейробиологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Нижегородского государственного университета имени Н.И. Лобачевского.

Научный руководитель: Семьянов Алексей Васильевич,

доктор биологических наук, директор и нститута биологии и биомедицины ННГУ имени Н.И. Лобачевского.

Официальные оппоненты: Базян Ара Саакович

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией нейрохимических механизмов обучения и памяти Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. Никольский Евгений Евгеньевич доктор медицинских наук, академик РАН, заведующий лабораторией биофизики синаптических процессов Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН.

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки

Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

Защита состоится «31» марта 2015 года на заседании диссертационного совета Д 212.081.28 при Казанском Федеральном Университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Левобулачная, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: г. Казань, ул. Кремлевская, д. 35.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» www.kpfu.ru.

Автореферат разослан « /г?» С с 015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Т.А. Аникина

Общая характеристика работы

Постановка проблемы и ее актуальность. Изучение механизмов функционирования нервной системы является одним из приоритетных направлений физиологии, поскольку имеет отношение к пониманию природы таких фундаментальных физиологических процессов как память, обучение и сознание. Кроме того изучение особенностей работы нервной системы при различных патологических состояниях (деменция, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, последствия травм спинного мозга) позволит разработать новые патогенетические принципы их терапии. Важнейшим типом клеток нервной системы являются нейроны, осуществляющие функции восприятия, передачи, обработки и хранения информации в мозге. Кроме того мозг включает в себя также клетки нейроглии (астроглия, олигодендроциты, радиальная глия, микроглия, шванновские клетки), кровеносные сосуды и внеклеточный матрикс мозга (ВКМ). Очевидно, что нормальная работа нервной системы возможна лишь при условии эффективного функционирования синаптических структур, обеспечивающих межнейрональную передачу информации.

Одним из путей, обеспечивающих регуляцию передачи информации через синапсы химического типа, является модуляция процесса высвобождения нейропередатчиков. Высвобождение некоторых веществ из постсинапса способно воздействовать на пресинаптические рецепторы, меняя эффективность высвобождения нейропередатчика. Кроме того локальное изменение ионных градиентов также может участвовать в модуляции высвобождения нейропередатчика. Это связано с малой величиной синаптической щели в центральной нервной системе - 20 нм, в которой синаптические токи, включая активацию АМРА, ЫМОА рецепторов, могут приводить к существенному локальному изменению мембранного потенциала. Наличие К+ проводимости у АМРА, ЫМБА рецепторов снижает деполяризацию мембраны, что затрудняет достижения порога генерации

потенциала действия и увеличивает энергетические затраты при химической синаптической передаче. Однако К+ проводимость АМРА и ИМБА рецепторов может иметь особую физиологическую роль в модуляции высвобождения нейропередатчика. Локальное увеличение К+ может вызывать деполяризацию пресинаптического окончания и повышать вероятность высвобождения нейропередатчика. Несмотря на важность изучения причин наличия К+ проводимости у АМРА, рецепторов, этот вопрос оставался

неисследованным.

Неизученными остаются еще многие аспекты функционирования глиальных клеток. Их роль в нервной системе долгое время считалась пассивной, направленной на поддержание жизнедеятельности нейронов через обеспечение ионного гомеостаза, концентрации нейропередатчика в синаптической щели, с участием в формировании гемато-энцефалического барьера, регуляцией локального кровотока, обеспечением энергетическими субстратами и участием в выделении трофических факторов. Однако недавние исследования все больше свидетельствуют о более активной роли астроцитов в синаптической передаче, связанной с высвобождением нейромодуляторных веществ таких, как О-серин, глицин, АТФ и глутамат. Противоречивость результатов о способности астроцитов отвечать на синаптическую активацию, а также их возможная значимая роль в патогенезе ряда заболеваний нервной системы и старении, делает этот вопрос требующим более глубокого изучения с применением более совершенных экспериментальных и аналитических методик.

Другим мало изученным компонентом нервной системы являются молекулы ВКМ, которые занимают пространство между нейронами и глиальными клетками в мозге. Основными компонентами ВКМ являются гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат протеогликаны, соединительные белки, стабилизирующие структуру комплекса гиалуроновой кислоты, хондроитин сульфата и гликопротеинов: тенасцин-Р и реелин. Различные

компоненты ВКМ участвуют в регуляции синаптической пластичности посредством ряда механизмов. Удаление гиалуроновой кислоты уменьшает уровень долговременной потенциации (ДВП), и усиливает латеральную диффузию АМРА рецепторов. Реелин способен увеличивать активность NMDA рецепторов и облегчать возникновение ДВП in vivo. Снижение экспрессии тенасцина-Р приводит к снижению торможения и уровня ДВП. Хондроитин сульфат протеогликаны (ХСПГ) определяют критический период в развитии зрительной коры мышей. Удаление ХСПГ приводит к снижению уровня ДВП в пирамидных нейронах области CAI гиппокампа, однако возможные клеточные механизмы этого процесса не были известны. Поскольку работы по восстановлению нейрональных связей выполняют комплексно с удалением ВКМ мозга, то такая обработка может оказывать негативное влияние на обучение и память и требует детального изучения. Важным вопросом остается изучение влияния ВКМ на астроглию, поскольку оно может оказывать влияние на синаптическую передачу. Поэтому, изучение взаимодействия пресинаптического, постсинаптического окончаний, астроглии и внеклеточного матрикса мозга является актуальной для понимания физиологии и патофизиологии нервной системы, важной для разработки методов терапевтических воздействий в лечении нейродегенеративных заболеваний, травм спинного и головного мозга.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы - изучение механизмов взаимодействия пресинаптического, постсинаптического окончаний, астроглии и внеклеточного матрикса мозга в синаптической передаче. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи по изучению:

1. роль активации постсинаптических NMDA рецепторов в модуляции высвобождения нейропередатчика в глутаматергических синапсах;

2. зависимость Са2+ активности в астроцитах от синаптической

активации и присутствия глутамата;

3. влияние ВКМ на уровень долговременной потенциации в глутаматергических синапсах;

4. влияние ВКМ на глутаматергическую, ГАМКергическую синаптические передачи и возбудимость нейронов;

5. влияние ВКМ на Са2+ активность в астроцитах.

Научная новизна работы

Данная работа является важным звеном в понимании ключевых аспектов взаимодействия пресинаптического, постсинаптического окончаний, астроглии и внеклеточного матрикса мозга в синаптической передаче:

1. Впервые показано, что накопление К+ в синаптической щели, выходящего через ЫМЭА рецепторы, вызывает потенциацию высвобождения глутамата.

2. Использован новый подход анализа распределения Са2+ активности в целом астроците для изучения зависимости от синаптической активности с использованием генетически-закодированного Са2+ индикатора.

3. Впервые показано, что глутамат, в том числе высвобожденный при синаптической активности, действуя на метаботропные рецепторы, увеличивает максимальную площадь Са2+ событий в астроцитах, не влияя на их частоту

4. Найден двунаправленный механизм влияния ВКМ на ДВП: возникновение потенциации в глутаматергических синапсах, связанной с активацией ЯОСК-киназы, и снижение возбудимости нейронов через увеличение активности БК каналов.

5. Проведено первое исследование влияния ВКМ на Са2+активность в астроцитах.

Научно-практическая значимость.

Теоретическое значение данной работы состоит в понимании фундаментальных, ранее не изученных, факторов влияющих на синаптическую передачу, таких как активация постсинаптических рецепторов, взаимодействие с астроглией и ВКМ. В данной работе используется новый подход к изучению Са2+ событий на соме и в отростках астроцитов с высоким разрешением и использованием генетического индикатора. Примененный анализ распределения Са2+ событий важен с точки зрения моделирования Са2+ событий и синаптической передачи. Практическое значение диссертации заключается в возможности применения блокаторов SK каналов и ROCK киназы для терапевтических воздействий для восстановления травм спинного мозга и нарушенных нейрональных связей. Это поможет компенсировать эффект снижения ДВП при удалении ВКМ для избежания побочных эффектов при лечении. Изучение Са2+ сигнализации в астроглии так же имеет значение для медицины, поскольку астроглия вовлечена в развитие нейродегенеративных заболеваний и процессы старения.

Связь работы с научными программами и личный вклад автора.

Основные результаты диссертационной работы получены лично автором. Автор принимал непосредственное участие в постановке, реализации задач, обсуждении результатов, их описании и подготовке к публикации.

Основные положения, выносимые на защиту.

Синаптическая передача является сложным процессом, в регуляции которого участвуют: (1) активация постсинаптических NMDA рецепторов; (2) астроглия через активацию метаботропных рецепторов глутамата; (3) внеклеточный матрикс мозга, регулирующий активность SK-каналов и ROCK-киназы.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывали были представлены на международных и региональных конференциях, в число которых входят: международная конференция Society for Neuroscience meeting

(Вашингтон, США, 2014), международная конференция 9th FENS Forum of Neuroscience (Милан, Италия, 2014), международная конференция Society for Neuroscience meeting (Сан Диего, США, 2013), научная школа OIST Computational Neuroscience Course 2014 (Окинава, Япония, 2014), международный симпозиум «Прогресс и перспективы исследований внеклеточного матрикса мозга». (Нижний Новгород, Россия) 2012 г., 2013 г., 2014 г., конференция «BSI Retreat 2012».(Каруизава, Япония, 2012).

Публикации. Результаты данного исследования опубликованы в 3 научных изданиях, рекомендованных ВАК, в трудах 9 международных и региональных конференций, 3 учебно-методических пособиях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, теоретической части, практической части состоящей из трех глав, заключения, библиографического списка литературы (231 наименование). Общий объем текста работы - 154 страницы машинописного текста. Количество рисунков -40.

1. Материалы и методы исследования

1.1. Объекты исследования. Эксперименты проводились на пирамидных нейронах области CAI срезов гиппокампа мышей линии C57BL/6J, возрастом 28-35 дней. Инкубация срезов проводилась при постоянной температуре (34°С) для экспериментов по изучению роли К+ и Са2+ активности в астроцитах. Для исследования роли ВКМ инкубация срезов проводилась при постоянной температуре (37°С): контроль (0,2% альбумина), а при удалении ВКМ ферментом хондроитиназой ABC (0,2% альбумина, 0.2и/мл хондроитиназы ABC (ХАВС)). Для контроля удаления ВКМ проводился штуногистохимический анализ.

1.2. Электрофизиология. Все электрофизиологические записи проводились при температуре 34°С. Для электрической стимуляции

использовались стальные биполярные электроды, а для электрофизиологической регистрации в режиме патч-кламп - стеклянные микроэлектроды сопротивлением 3-5 М£2. Во время записи полевых ВПСП (пВПСП) ДВП индуцировалась с помощью двух протоколов: 1) STDP протокол {от англ. spike-timing-dependent plasticity); 2) тетаническая стимуляция (nonSTDP).

Для изучения роли К+ на потенциацию высвобождения нейропередатчика проводилось измерение К+ тока методом патч-клампа в астроцитах области str. radiatum, при стимуляции коллатералей Шаффера (КШ) и антидромной стимуляции (АД) аксонов в области str. oriens. Измерение потенциации возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП) проводилось при стимуляции КШ (5 стимулов, 50 имп/с) при использовании внутриклеточных растворов: 1) на основе KCH3S03; 2) на основе N-метил - D-глюкозамина (для замены К+) - NMDG+CH3S03; 3) на основе KCH3S03 с добавлением ¡МК801 (внутриклеточный блокатор открытых NMDA рецепторов).

Для изучения роли ВКМ в синаптической передаче с помощью метода патч-кламп проводились: 1) регистрация долговременной потенциации, в контрольных условиях, при блокировании SK каналов с помощью апамина (1нМ), и при блокировании SK каналов и ингибировании ROCK-киназы с помощью Y-27632 (10 мкМ); 2) измерение параметров глутаматергической синаптической передачи, в присутствии РТХ (100 мкМ), (S)-MCPG (200 мкМ), CGP (5 мкМ) блокирующих ГАМКд, mGluRs, ГАМКБ, соответственно; 3) измерение параметров ГАМКергической синаптической передачи, в присутствии NBQX (25 мкМ), D-APV (50 мкМ), (S)-MCPG (200 мкМ), CGP (5 мкМ) блокирующих АМРА, NMDA, mGluRs, ГАМКБ, соответственно; 4) измерение клеточной возбудимости при блокировании SK каналов с помощью 1нМ апамина, и при блокировании ВК каналов с помощью паксилина (5 мкМ), а также в присутствии NBQX (25 мкМ), D-APV (50 мкМ), РТХ (100 мкМ),

блокирующих АМРА, NMDA, ГАМКа, соответственно; 5) запись К+ тока через SK каналы, выделяемого с помощью апамина (1нМ). Для каждого эксперимента использовался соответствующий внутриклеточный раствор.

1.3. Двухфотонная лазерная сканирующая микроскопия и фотостимуляция глутаматом. Метод применялся для изучения флуктуации концентрации кальция в соме и отростках астроцитов. Использовались срезы гиппокампа мышей линии GCaMP2 возрастом 2-4 месяца, экспрессирующих в астроцитах белок - Са2+индикатор окрашивались сульфородамином 101 (100 нМ). Эксперименты поводились на микроскопе Nikon Eclipse, оснащенным фемтосекундным импульсным инфракрасным лазером Coherent Chameleon XR (890 нм). Фотостимуляция связанного глутамата (400 мкМ во внеклеточном растворе) проводилась лазером длиной волны 405 нм длительностью 5 мс.

1.4. Анализ данных и статистическая обработка. Анализ электрофизиологических и данных имиджинга проводились в программах Clampfit, Matlab 2012b, Origin 8, Python. Результаты представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего. Различия средних рассчитывались с помощью теста Манна-Уитни и теста Вилкоксона и считались достоверными при р<0.05.

2. Результаты и их обсуждение

2.1. Модуляция высвобождения нейропередатчика К+ выходящим при активации синаптических NMDA рецепторов

2.1.1. Роль NMDA рецепторов в синаптической пластичности.

Величина потенциации сравнивалась в контроле и в присутствии D-APV (50 мкМ) как угол наклона пВПСП для двух протоколов nonSTDP и STDP. Показано, что при применении nonSTDP протокола в контроле возникает ДВП, а в присутствии D-APV - нет (Рис. 1 а). В случае STDP протокола также в контроле возникает ДВП, а в присутствии D-APV - нет (Рис. 1 Ь). Таким

образом, активация ЫМБА рецепторов для синаптической пластичности в гиппокампе при БТОР и пог^ТОР типах индукции ДВП.

Рис. 1 Запись ДВП в контроле и в присутствии Э-АРУ; а - БТБР протокол возникает в; Ь - попБТОР протокол.

2.1.2. Роль NMDA рецепторов в накоплении К+ в синаптическом пространстве

Проводилась запись К* тока в астроцитах при стимуляции КШ и АД отдельно и парно. Сравнивались величина ответов, вызываемых парной стимуляцией и арифметической суммы на отдельную стимуляцию в контроле и при блокировании ИМБА рецепторов с помощью Э-АРУ (50 мкМ). Оказалось, что при блокировании ЫМОА рецепторов нелинейного увеличения К+ тока в астроцитах не происходит (Рис. 2,а), указывая, что активация ЫМБА рецепторов приводи к значительному увеличению К+ 8синаптической щели, который может деполяризовать пресинаптическое окончание и захватываться астроцитами.

2.1.3. Роль NMDA рецепторов и выходящего через них К+ на потенциацию ВПСП

Запись ВПСП в условиях стимуляции КШ 5 стимулов, 50 имп/с, с различными внутриклеточными растворами показала, что замена К+ на ЫМОС+ приводит к снижению потенциации ВПСП (Рис. 2,Ь). Результат указывает на необходимость К*, выходящего из постсинапса, для потенциации высвобождения нейропередатчика. Также блокирование ЫМОА рецепторов с

10 мс

°10 мс

помощью ¡МК801 приводит к снижению потенциации ВПСП (Рис. 2,Ь), указывая на ЫМОА рецепторы как на источник К+, необходимого для потенциации ВПСП.

i

Сумма 200

Парная стим. о

| 150 _ 50 пА & 200 мс

Сумма о^ jq Парная" стим.

0

К+ NMDG+ К+ iMK-801 3.0i

5mBL с2-5

100 мс U ^ Q

ш

^K-J

Контр. АРУ

0.51

200 мс

1 2 3 4 5 # ВПСП

Рис. 2 NMDA-зaвиcимaя модуляция высвобождения нейропередатчика. а

- К+ ток в астроците при парной стимуляции КШ и АД в контроле и с Э-АРУ; Ь

- потенциация ВПСП с растворами на основе К+, ЫМЭС+, и К+ с ¡МК801.

2.2. Изучение Са синаптической активации

сигнализации в астроцитах в условиях

2.2.1. Воздействие глутамата высвобожденного при фотостимуляции на распределение Са2+сигналов в астроцитах

Сравнение Са2+ активности в астроцитах экспрессирующих Са~+ индикатор ОСаМР2 (Рис. 3, а) в контроле и при фотостимуляции связанным глутаматом показало, что частота Са2+ событий увеличивается, но уменьшается а максимальной площади (8тах) Са2+ событий (Рис. 3, Ь). а длительности Са'4 событий в астроцитах при фотостимуляции достоверно не отличалась от контроля. Данные результаты свидетельствуют, что астроцитарная Са2 активность способна изменяться в присутствии глутамата.

2.2.2. Воздействие глутамата высвобожденного при электрической стимуляции на распределение Са2+сигналов в астроцитах

Контроль сравнивался с электрической стимуляцией КШ с частотой 0,2 имп/с. При этом произошло уменьшение а для 8тах (Рис. 4, а), но достоверных изменений частоты и а длительности не наблюдалось. Это означает, что

астроцитарные Са~ события зависят не только от присутствия глутамата, но и от синаптического высвобождения глутамата и при этом новые события не возникают.

^ шах (М™2)

Рис. 3 Анализ Са2* событий в астроцитах. а - астроцит экспрессирующий вСаМР2; Ь - 8тах Са2+ событий в контроле и при фотостимуляции.

2.2.3. Изучение роли швЫЯв в генерации Са2+ сигналов в астроцитах

Для выявления определенного типа рецепторов, ответственных за изменения Са2' активности в астроцитах при синаптической активации был протестирован наиболее вероятный кандидат - метаботропные рецепторы глутамата (тС1и118). Сравнивалась Са2+ активность в астроцитах в контроле и в присутствии блокатора тС^Яв - (8)-МСРв 600 мкМ. В результате произошло увеличению значения а для 8тах(Рис. 4, Ь), что говорит об уменьшении вклада в распределение событий большого размера. При этом не произошло достоверного изменения а для длительности и частоты событий. Эти эксперименты подтверждают важную роль активации твЬИ^ в генерации Са2+ событий в астроцитах.

2.2.4. Изучение роли тОи!^ в генерации Са2+ сигналов в астроцитах при синаптической активации

Далее была изучена Са2^ активность в астроцитах при блокировании тС1иЛ8 и электрической стимуляции. В присутствии МСРв и при

электрической стимуляции с МСРО а для 8тах (Рис. 4, с), а для длительности и частота событий достоверно не изменяются. Это указывает, что при синаптической активации происходит активация тС1иЯ, что влияет на свойства Са2+ событий в астроцитах.

НО2 £

1 Контроль ' 0.2 Гц

Vi101' зк

м

ю

Контроль

МСРв

§10

н

3

ю . §101-о

|ю°

у

Контроль МСРС 0.2 Гц МСРв

10° 101 ю2 ю3 ю4

<0»т2)

10° 101 102 103 104

8тах(цт2)

10° 101 102 103 104

<(цт2)

5 4

I 3

сл

а 2 1 0

1А

Контроль 0.2 Гц

N.8.

Контроль МСРй

» 8 II

Контроль 0.2 Гц

МСРв мере

Рис. 4 Анализ Са2+ событий в астроцитах. На верхних панелях представлены распределения а 8тах, на нижних - средние значения; а - 8тах Са"+ событий в контроле и при электрической стимуляции 0,2 имп/с; Ь - 8тах Са2 событий в контроле и при блокировании твЬИ.; с - 8тах Са^+ событий при блокировании шС1иЯз и электрической стимуляции 0,2 имп/с.

2.2.5. Воздействие низкочастотной электрической стимуляции на распределение Са2+ сигналов в астроцита

Низкочастотная стимуляция приводит к увеличению а для 8тах по сравнению с контролем, но не вызывает достоверных изменений частоты и а длительности по сравнению с контролем. Данный результат свидетельствует, что протокол стимуляции долговременной депрессии приводит к снижению

Ca" активности в астроцитах и уменьшению вклада событий с большой площадью..

2.3. Роль внеклеточного матрикса (ВКМ) в синаптической передаче и пластичности в гиппокампе

2.3.2. Влияние ХСПГ на долговременную потенциацию

Сравнивалось возникновение ДВП в контроле и после обработки ХАВС после пяти повторений тетанической стимуляции КШ (Рис. 5, а). Уровень ДВП после ХАВС был значительно ниже чем контроле (Рис. 5, Ь). При тетанической стимуляции наклон ВПСП и количество возникающих ПД снижается после обработки ХАВС в сравнении с контролем. Данный результат может свидетельствовать, о том, что нарушен механизм возникновения ДВП. а b

5 TBS

Усилитель

Стимулятор

Контр. ^

JV_J _

5 мВ|_

ХАВС 50 мс

С

о 5 TBS 54-

CQ а: -з

0 °

1 2

X

iH

Он

I

-10 О 10 20 30 40

Время, мин

Рис. 5 Тетаническая стимуляция КШ (5 повторений) для инициации ДВП; а -схема расположения электродов; Ь -ДВП не возникает после ХАВС.

2.3.3. Влияние ХСПГ на тормозную синаптическую передачу

Коэффициент парной стимуляции (КПС) тормозных токов с межстимульным интервалом 50 мс после обработки ХАВС достоверно не отличается от контроля (Рис. 6,а). Частота и амплитуда спонтанных и миниатюрных тормозных постсинаптических токов (сТПСТ и мТПСТ соответственно) после обработки ХАВС также достоверно не отличается от контроля (Рис. 6,Ь). Также было показано, что торможение не изменилось при тетанической стимуляции (5 повторений) после удаления ВКМ.

Контр

2,5 О

и '

£1,5

^1,0 си а.0,5

I ХАВС ой1^

1/1/50

90 МС Ыонтп ХАВГ

N.8.

о.

н

I

о

и

121

Н"

и 6 С 0

т ^ 4

о

х 30 пА |_

500 мс

N.8.

«| |—вп

и

Контр. ХАВС ^Контр. ХАВС

Рис. 6 Тормозная синаптическая передача после удаления ХСПГ; а -КПС тормозных токов; Ь - мТПСТ в контроле и после удаления ХСПГ.

Средняя амплитуда ответов и амплитуда пачечных ответов после высокочастотной стимуляции для последних 5 мин записи достоверно не отличаются между контролем и после ХАВС. Таким образом спонтанная и вызванная высокочастотной стимуляцией тормозная синаптическая передача не изменяется после удаления ХСПГ.

2.3.4. Влияние ХСПГ на соотношение возбуждения и торможения и на тоническую ГАМКергическую проводимость

Сравнение соотношения амплитуды и площади ВПСТ и ТПСТ не показало достоверных различий между контролем и ХАВС. Также не произошло значительного изменения тока фиксации (тонического тока) в контроле и ХАВС. Данные результаты говорят о том, что соотношения возбуждения и торможения и базового тонического торможения не происходит после удаления ХСПГ.

2.3.5. Влияние ХСПГ на возбуждающую синаптическую передачу

Изучение возбуждающей синаптической передачи показало, что после обработки ХАВС КПС достоверно не изменяется. Также не изменяется частота миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов (мВПСТ) и частота NМОА рецептор-опосредованных ВПСП после обработки ХАВС (Рис. 7,а). Таким образом вероятность высвобождения глутамата в контроле и после ХАВС не отличается.

b

а

12, N.S.

N.S.

V. o.- H'o.6

^rn /1

Контр. 1 Q

£0.8

O

o

^NMDAq1'2 AMPA S0,9

умма |o"6

20 nA |_ 0.2

400 мс

ш 0.4

X [¡П00пА|_ o,0

0.0

Контр. ХАВС

Контр. ХАВС

Рис. 7 Возбуждающая синаптическая передача после удаления ХСПГ; а - мВПСТ в контроле и после ХАВС; b - соотношение AMPA/NMDA токов.

Соотношения NMDA/AMPA токов в безмагниевой среде не изменилось после обработки ХАВС по сравнению с контролем (Рис. 7, Ь). Что означает, что возбуждающая синаптическая передача не изменилась после удаления ВКМ.

3.6. Влияние удаления ХСПГ на парную депрессию АМРА токов

Изучение парной депрессии АМРА токов на срезах, инкубированных в

бафиломицине Al (4рМ) (блокатор протонной АТФ-азы), не показало достоверных различий между контролем и обработкой ХАВС. Таким образом свойства активации АМРА рецепторов не изменились после удаления ХСПГ.

3.7. Влияние ХСПГ на возбудимость CAI пирамидных нейронов и параметры потенциалов действия

Изменение возбудимости нейронов показало, что после обработки ХАВС нейроны генерировали значительно меньшее число ПД по сравнению с контролем в ответ на одну и ту же величину подаваемого тока (Рис. 8, а). При этом порог генерации и полуширина ПД в контроле и после обработки ХАВС достоверно не изменились. Входное сопротивление также не изменилось. Однако наблюдалось увеличение постгиперполяризации после деполяризующих ступенек, после обработки ХАВС по сравнению с контролем (Рис. 8, Ь). При блокировании АМРА, NMDA и ГАМКд рецепторов различия между контролем и ХАВС сохранялись. Также не произошло достоверных изменений тока через h-каналы при удалении ХСПГ. Показано что ВК тип

каналов не вовлечен в снижение возбудимости, т.к. при их блокировании паксилином 5мкМ возбудимость после ХАВС не восстанавливалась до контрольного уровня.

а Ь

I 30

25\ Контр. ХАВС

о. ь X

о

U

m

<

х

с20

о 15 ¡Ю У 5 0

250 мс

1Л5

150 300 450

I;„j> пА

10 ш8

s о;

„ L_ 14

250 мс<2

V*

о

г

150 300 450

!;„;, ПА

Рис. 8. Возбудимость пирамидных нейронов области CAI; а - снижение возбудимости после обработки ХАВС; b - увеличение послеберстовой гиперполяризации после обработки ХАВС.

3.8. Влияние ХСПГ на возбудимость CAI пирамидных нейронов при блокировании SK каналов

Добавление апамина, блокатора SK каналов (100 нМ), вызвало повышение возбудимости в срезах при удалении ХСПГ до уровня контроля (Рис. 9, а). Также при блокировании SK каналов разница в амплитуде послеберстовой гиперполяризации между контролем и удалением ХСПГ исчезала (Рис. 9, Ь). Таким образом, удаление ХСПГ приводит к увеличению активации SK каналов и снижению возбудимости нейронов.

2.3.9. Влияние удаления ХСПГ на ток через SK каналы

Ток, опосредованный SK каналами при подаче деполяризующих мембрану до 0 мВ ступенек тока длительностью 500 мс, увеличивался после обработки ХАВС в сравнении с контролем (Рис. 10, а). Амплитуда остальных кальций-зависимых К+ токов не изменялась после удаления ХСПГ (Рис. 10, Ь). Таким образом прямое измерение тока SK каналов подтверждает его увеличение после удаления ХСПГ.

О 100 200 300 400

I¡„j, "А

Рис. 9 Возбудимость пирамидных CAI нейронов в присутствии апамина - блокатора SK каналов; а - снижение возбудимости после удаления ХСПГ; b -увеличение послеберстовой гиперполяризации после удаления ХСПГ.

2.3.10. Влияние активации SK каналов на NMDA-рецептор-опосредованного тока при удалении ХСПГ.

Соотношение амплитуд фармакологически выделенных ымодВПСТ и кмодВПСТ при блокировании SK каналов апамином, достоверно ене различалось в контроле и после ХАВС. Это означает, что активация NMDA рецепторов не меняется после удаления ХСПГ.

rbl

Контр. ХАВС

Контр. ХАВС

Рис. 10 запись К+ токов при деполяризации до 0 мВ в контроле и после удаления ХСПГ; а - 8К ток; Ь - „ог^К ток.

2.3.11. Влияние ХСПГ на долговременную потенциацию при блокировании 8К каналов

Уровень ДВП в присутствии блокатора БК каналов апамина при обработке ХАВС стал выше чем в контроле (Рис. 11, а). Это дает основание

думать, что ДВП не только восстанавливается, но существует возможность потенциации, опосредованной активацией ROCK-киназы.

2.3.12. Влияние ХСПГ на долговременную потенциацию при блокировании SK каналов и ROCK- киназы

Уровень ДВП в присутствии апамина и ингибитора ROCK-киназы Y-27632 (10 мкМ), ответственной за перестройку цитоскелета шипиков достоверное не различался в контроле и при обработке ХАВС (Рис. 11, Ь), доказывая возможность потенциации, связанной с активацией ROCK-киназа зависимого пути.

b

5 TBS \

5 TBS Контр. |

ХАВС

10 0 10 20 30 40

Время, мин

С с U6 С 5 сп 0 i 4

¡3

CÜ о

X ¿

50mc|J

L

m

-10 0 10 20 30 40

Время, мин

Рис. 11 Тетаническая стимуляция КШ (5 повторений) для инициации ДВП; а - в присутствии апамина 100 нМ блокатора SK каналов; b - в присутствии апамина и блокатора ROCK- киназы Y-27632 10 мкМ.

2.3.13. Влияние ХСПГ на Са2+ динамику в астроцитах

Изучение распределения Са2+ событий в астроцитах показало, что частота Са2+ событий в контроле и после ХАВС не изменяется, а также не изменяется а для Smax, в то время как происходит увеличение длительности Са2* событий. Это может указывать на изменение свойств возникновения и распространения Са2+сигналов в астроцитах при удалении ХСПГ.

Результаты и обсуждения

Полученные результаты хорошо согласуются друг с другом и свидетельствуют, что синаптическая передача - это сложный процесс, который регулируется сложным взаимодействием пре-, постсинаптического окончаний,

глии и ВКМ. Таким образом синапс нужно рассматривать как многокомпонентную систему включающую не только взаимодействие пре- и постсинаптического окончаний, но также взаимной влияние нейронов, глиальных клеток и ВКМ.

Результаты работы подтверждают, что модуляция высвобождения нейропередатчика осуществляется увеличением К+, вытекающего при активации синаптических NMDA рецепторов, приводя к потенцированию пресинапса и повышению вероятности высвобождения нейропередатчика. Таким образом локальные изменения ионных концентраций могут выполнять роль обратной связи, регулирующей синаптическую передачу.

Применение нового метода анализа Са2+ активности на соме и в отростках астроцита, показало способность астроцитов генерировать Са2+ сигналы в ответ на синаптическую активацию. В работе было продемонстрировано, что не только присутствие глутамата влияет на Са2+ активность в астроцитах, но и присутствие глутамата, высвобожденного при синаптической активации. Это влияние опосредованно активацией метаботропных рецепторов глутамата на астроцитарной мембране. Таким образом было показано наличие зависимости Са2+ активности в астроцитах от синаптической активации, что является важным условием формирования обратной связи между нейронами и астроцитами, необходимой для регуляции синаптической передачи.

Изучение роли ВКМ в синаптической передаче показало наличие сложного взаимодействия между ними посредством двух механизмов влияющих на долговременную потенциацию. Во-первых, ВКМ регулирует возбудимость нейронов и уровень потенциации через активность SK каналов. Во-вторых, ВКМ связан с регуляцией перестройки цитоскелета, опосредованной активацией ROCK- киназы. При этом ВКМ не меняет базовых свойств глутаматергической и ГАМКергической синаптических передач. Кроме того ВКМ влияет на свойства Са2+ событий в астроцитах, приводя к

увеличению их длительности, что также может иметь важное значение для понимания роли ВКМ в регуляции нейрон-глиального взаимодействия.

Данная работа позволила заполнить многие пробелы знаний о взаимодействии элементов синапса как многокомпонентной системы. Понимание взаимодействия пре-, постсинаптического окончаний, глии и ВКМ может играть важную роль в ряде физиологических процессов, участвующих в обеспечении эффективной работы нервной системы.

Выводы и основные результаты работы:

1. Выход К+в синаптическую щель при активации NMDA рецепторов потенциирует высвобождение нейропередатчика.

2. Синаптически высвобождаемый глутамат воздействует на метаботропные рецепторы астроцитов, приводя к увеличению площади Са2+ событий, не влияя на их частоту.

3. Снижение ДВП при удалении ВКМ вызвано снижением возбудимости нейронов, опосредованное увеличением тока через SK каналы.

4. Удаление ВКМ приводит к возникновению потенциации через ROCK-киназа зависимый путь, подавляемой снижением возбудимости.

5. Удаление ВКМ вызывает увеличение длительности Са2+ событий в астроцитах, не влияя на их максимальную площадь и частоту.

Публикации автора по теме диссертации.

В журналах из списка периодических изданий рекомендованных ВАК:

1. Danielyan A., Wu Y. W., Shih P. Y. Dembitskaya Y, Foi A., Semyanov A. Denoising of two-photon images with block-matching 3D filtering. // Methods, -T.68. - Глава 2. - С. 308-316. - 2014.

2. Shih P.-Y., Savtchenko L.P., Kamasawa N., Dembitskaya Y., McHugh T.J., Rusakov D., Shigemoto R., and Semyanov A. Retrograde synaptic signaling

mediated by K+ efflux through postsynaptic NMDA receptors. // Cell Reports, - 2012. - T.5. - Issue 4. - C. 941-951, -2013.

3. Wu Y.-W., Tang X., Arizono M., Bannai H., Shih P.-Y., Dembitskaya Y., Kazantsev V., Tanaka M., Itohara S., Mikoshiba K., Semyanov A. Spatiotemporal Calcium Dynamics in Single Astrocytes and Its Modulation by Neuronal Activity. // Cell Calcium. - T.55. - Глава 2. - С. 119-129. - 2014.

Публикации в других изданиях (учебно-методические пособия):

1. Дембицкая Ю.В., Лебедева А.В., Тюрикова О. В., Семьянов А.В. Методика регистрации электрической активности нейронов методом «патч-кламп». // Издательство ННГУ им. Н.И. Лобачевского, - Нижний Новгород, -2012. - 27с.

2. Дембицкая Ю.В., Семьянов А.В. Методика настраивания дифференциального интерференционного контраста на микроскопе Olympus BX51WI. // Издательство ННГУ им. Н.И. Лобачевского, - Нижний Новгород, -2012,- 14с.

3. Тюрикова О .В., Дембицкая Ю.В., Лебедева А.В., Доронин М.С., Семьянов А.В. Основы метода ПЦР и его применимость в нейробиологии. // Издательство ННГУ им. Н.И. Лобачевского, - Нижний Новгород. - 2014. - 20с.

Труды конференций и симпозиумов:

1. Dembitskaya Y., Song I., Dityatev A., Semyanov A. Chondroitin sulfates proteoglycans regulate excitability and synaptic transmission of CA1 pyramidal neurons. // "BSI Retreat 2012". - RIKEN, Karuizawa, Japan. - 2012, - Ноябрь 12-13.

2. Dembitskaya Y., Song I., Dityatev A., Semyanov A. The Role of extracellular matrix in regulation of excitability and synaptic transmission in CA1 pyramidal neurons of hippocampus. // Международный симпозиум «Прогресс и перспективы исследований внеклеточного матрикса мозга». - ННГУ им. Н.И. Лобачевского, - Нижний Новгород, Россия, -2012,-22 ноября.

3. Wu Y. W.,Tang X., Arizono М., Bannai Н., Shih P.Y., Dembitskaya Y., Kazantsev V., Tanaka M., Itohara S., Mikoshiba K., Semyanov A. // Spatiotemporal

dynamics of Ca2+ signaling in single hippocampal astrocytes. - Society for Neuroscience meeting. - San Diego, California, USA, - 2013, - 9-13 ноября.

4. Dembitskaya Y., Song I., Doronin M., Dityatev A., Semyanov A. Effect of extracellular matrix removal on synaptic signalling and plasticity in hippocampal slices. // Международный симпозиум «Прогресс и перспективы исследований внеклеточного матрикса мозга». - ННГУ им. Н.И. Лобачевского, - Нижний Новгород, Россия, - 2013, - 20-21 ноября.

5. Dembitskaya Y., Song I., Doronin M., Dityatev A., Semyanov A. Effects of enzymatic removal of chondroitin sulfates on neural excitability and synaptic plasticity in the hippocampal CA1 region. // 9th FENS Forum of Neuroscience. -Milan, Italy, - 2014, - 5-9 июля.

6. Dembitskaya Y., Song I., Doronin M., Dityatev A., Semyanov A. Effects of enzymatic removal of chondroitin sulfates on neural excitability and synaptic plasticity in the hippocampal CA1 region // OIST Computational Neuroscience Course 2014, Okinawa, Japan, -2014,-16 Июня- 3 Июля.

7. Dembitskaya Y., Song I., Doronin M., Dityatev A., Semyanov A. Enzymatic removal of chondroitin sulfates modulates neuronal excitability and synaptic plasticity in the hippocampal CA1 region // Society for Neuroscience meeting. - Washington, Washington DC, USA, - 2014, - 15-19 ноября.

8. Dembitskaya Y., Wu Y.-W., Brenner Т., Semyanov A. Tonic GABAa conductance differentially regulates different types of LTP. // Society for Neuroscience meeting. - Washington, Washington DC, USA, -2014,-15-19 ноября.

9. Dembitskaya Y., Song I., Doronin M., Dityatev A., Semyanov A. Effects of enzymatic removal of chondroitin sulfates on neural excitability and synaptic plasticity in the hippocampal CA1 region. // Международный симпозиум «Прогресс и перспективы исследований внеклеточного матрикса мозга». -ННГУ им. Н.И. Лобачевского, - Нижний Новгород, Россия, - 2014, - 1-2 декабря.

Подписано в печать 21.01.2015 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1. Заказ № 17. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ННГУ им. Н.И. Лобачевского. 603000, г. Нижний Новгород, ул. Б. Покровская, 37