Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембранные механизмы модуляции возбуждающей синаптической передачи в гиппокампе крыс

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Мембранные механизмы модуляции возбуждающей синаптической передачи в гиппокампе крыс"

ЛКЛДЕЛШЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА им. А. А. БОГОМОЛЬЦА

На правах рукописи ГАРАЩУК Ольга Виталиевна ;

МЕМБРАННЫЕ МЕХАНИЗМЫ МОДУЛЯЦИИ ВОЗБУЖДАЮЩЕЙ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ В ГИППОКАМПЕ КРЫС

03.00.02 — Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев — 1992

Работа выполнена в Институте физиологии им, а. л Богсшольцл АН Украины.

Научный руководитель:

член-корреспондент АН Украины О, А. Крышталь;

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук И. С. Магура; доктор биологических наук В. Л. Зима;

Ведущая организация:

Институт биофизики клетки, г. Пущино на Оке, АН России.

Защита состоится « ¡¿¿^^г^ 1992 г. в /г часов на

заседании специализированного совета Д—016.15.01 при Институте физиологии им. А. А. Богомольца АН Украины по адресу: 252024, г. Киев-24, ул. Богомольца, 4.

О. диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. А. А. Богомольца АН Украины.

Автореферат разослан « 1992 г. . ____,,

Ученый секретарь специализированного совета •

доктор биологических наук « У 3. А. СОРОКИНА-МАРИНА

/у

Тип. КВВАИУ. 1,25; печ. л. Зак. 573. Тир. 100

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проОле{рс Исследование свойств синаптичесхой передачи в ЦНС с помощью регистрации возбуждающих постсинаптическнх токов от одиночных нейронов, находящихся в( своем естественном окружении, позволяет перейти на качественно новый уровень и значительно расширяет возможности выяснения механизмов передачи информации, обучения и паняти. Регистрация ответа одиночного нейрона на. раздражение афферентного пути дает *• более полную информацию о процессах, происходящих в синапсе, чен внеклеточное отведение интегрального фокального потенциала, исследование изненения концентрации различных ионов в применбраннон пространстве с помощью ион-селективных никроэлектродов, исследование с помощью флюорисцентных зондов. Применительно к ' г^ппоканпу новая методика дает возможность исследовать, какие рецепторы принимают участие в образовании ВПСТ, блокада какого типа присутствующих на .мембране нейрона рецепторов или ионных каналов ведет к тону или инону изненению постсинаптического тока, как.-' перераспределяются функции между рецепторныни структурами во время индукции пластических изменений в гиппоканпе скиндлннг, долго длящаяся потенциация, эпилептифорнная активностьЭ.

Свойства синаптической передачи в гиппоканпе способны модифицироваться не только при продолжительном воздействии возбуждающих аминокислот, что само по себе представляет значительный интерес, но и под влиянием аденознна и его производных. Аденозин является одним из наиболее широко распространенных в организме нейронодуляторов. В гиппоканпе аденозин способен быстро и обратимо блокировать выброс нейронедиатора, выступая в роли нейропротектора во время гипоксии и различных повреждений. Кроме воздействия на аденилат-циклазную систему через А1 и А2 рецепторы, аденозин сособен влиять на работу как мининун двух типов Мониых каналов: потенциал-чувствительного калиевого на постсинаптичесхой мембране, и потенциал-управляеного кальциевого на пресинапсе. Выявлена взаимосвязь между аденозиновыни рецепторани и рецепторами возбуждающих анинокислот, которые конвергируют на потенциал-управляеных кальциевых каналах Ы-типа. Если учесть при этом предельно высокое содержание аденозиновых рецепторов иненно в гиппоканпе, о чен свидетельствуют данные радио-лигандных исследований, становится понятным особое значение

выяснения взаимного влияния аденозина. его агонистов и антагонистов с одной стороны, и воэбуздаюиш аминокислот с другой на возбуждающие постсинаптические токи в гиппокампе.

Цель раОоты: Используя усовершенствованную методику исследовать свойства возбуждающих лос'тднмалтическнх токов СВИСТ) пирамидных нейронов гиппоканпа крыс. Исследовать влияние на ВПСТ возбуждающих аминокислот, аглнистов нетаботропных рецепторов глутаната; аденозина и его производных, блокатороа аденозиновых рецепторов.

Задачи исследования) 15 Приненить нетодику фиксации потешшала на нейроне в срезе для исследования характеристик ВПСТ пирамидных нейронов гиппоканпа крыс.

2) Исследовать влияние на ВПСТ возбуждающих аминокислот и их антагонистов, сопоставить с данными, получаемыми при регистрации фокальнмх потенциалов.

3J Исследовать влияние на симаптнческую передачу активаторов нетаботропных рецепторов.' глутаната.

45 Исследовать влияние аденозина, его агонистов и антагонистов на свойства синаптической передлчи в гиппокампе. Выяснить роль аденоэиновых рецепторов Al и А2 типа. . ,

3> Сопоставить полученное 'данные ¿ роли аденозина в регуляции проведения возбуждения в гнплоканпе с данными, полученными с поноиью других подходов.

Научная новизна. в настоящей работе иселгдоеаио влияние на ВПСТ внеклеточного приложения ' возбуадакчщ«? аминокислот и их антагонистов. Показано, что активатор нетаботропных рецепторов Транс-ACPD блокирует синаптическую передачу в зоне CAI гиппоканпа предполо*ительно путем изменения возвудиности клеточной иембраны Пирамидных нейронов. , >

В работе впегвые показано, что кроне известного ранее блокирующего действия, и »¿давно Ъйнаруяенного потенциируюшего влияния ннэхнх концентраций аденозина, после"овательное приложение аденозина и его антагонистов приводит 'значительной потенцнаиин как возбуждаювах постсинаптических токов одиночных нейронов, так и возбуждающих постсинаптических потенциалов, регистрируемых адеклеточно. ВПСТ н фокальный.потенциал остаются потенциированными длительное время после удаления аденозина и антагонистов из , внеклеточного раствора, Градуальное уменьшение начинается ' только 30 - 40 мин.

На основании полученньгс данных построена качественная нодель, объясняющая механизм возникновения данной потенциации.

Теоретическое и практическое значение работы: Приведенная в диссертационной работе модификация методики фиксации потенциала на нейроне в срезе делает ее доступной для использавания практически в любой биофизической лаборатории без затраты значительных средств,

Исследование влияния селективного агониста нетаботропных рецепторов транс-ACFD на сннаптнческую передачу о гнппоканпе является одной из первых работ по выяснению физиологической ро и этого недавно обнаруженного класса глутанатных рецепторов в процессе передачи ннфорнации в ЦНС. Предполагается, что иненно этот класс глутанатных рецепторов отвечает за индуцирование синаптической пластичности в ЦНС.

t

Впервые описанное в . данной работе, усиление синаптической передачи при последовательной приложении ёденозина и нетилксантиноэ растфяет представления о роли аденозиновых рецепторов в модуляции синаптической передачи. Длительность индуцируемых изменений позволяет предположить причастность' обнаруженного Фенонена к явлениян синаптической пластичности.

Апробация работы: Основные результаты работы доложены на: Советско-анериканском симпозиуме по нолекулярной нейробиол гни СКиеа, 19915¡советско-гернанскон синпозиуне по возбудинын мембранам СКиев. 19915; -Международном синпозиуне "Ионные каналы и нозг" сТокио, 19915; на сенинарах Института Физиологии ин. A.A. Богомольца АН Украины С1990, 1991) и на заседании Ученого совета Института физиологии ин. A.A. Богонольца АН Украины в феврале 1992 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы, Работа нэлозена на 134 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками. Список литературы насчитывает 190 источников.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование влияния различных модуляторов на свойства синаптической передачи в гиппоканпе проводилось путен одновременной регистрации фокальных потенциалов и возбуждающих постсннаптнческих токов СВПСТ5 одиночных пнранидных нейронов в срезе.

Для регистрации постсннаптических токов нани была значительно модифицирована существовавшая ранее методика, что сделало ее воплощение доступным в любой биофизической лаборатории. Исследова-

иия проводились на срезах гнппоканпа (200-400 нхн) 20 дневньк крыс. После инкубации в растворе 1Ш1К8 ("Bigaa"), насыщаемой карбогеком С93ч Oj и Зх COgí один из срезов без предварительной ферментативной обработки препарировали с помощью струн внеклеточного раствора, вытекающей под давлением из кончика стеклянной пипетки диаметром 100 нкн. Таким образом, срез рассекали мекду etratuia Orlens и Stratum pyramidale, и удаляли иеболъиую часть ткамн с альвеолярной стороны среза, обеспечивая свободный доступ к соме пирамидных нейронов. Затеи препарированный срез помевэлн & экспериментальную камеру при комнатной температуре.

В электрофизнологических исследованиях использовали установку для фиксации мембранного потенциала на целой клетке. .дополненнув системой протока «идкости, внеклеточном стимулирующим и отводясии электродами. Срез постоянно лерфузировалн окснгенированньи раствором HAHКБ, pH 7.3. Скорость протокй сидхостн составляла 3 ил/нин. Внеклеточные электроды погругали в срез, как показано на рнс. 1С а), что обеспечивало раздражение коллатералей Ваффера и регистрацию внеклеточного ППД. Эти t» электроды достаточно secmo фиксировали срез на дне камеры, что позволяло проводить длительное отведение ВПСТ от отдельных нейронов. Для фиксации мембранного потенциала нейронов применяли стеклянные микрогжпетки с диаметров кончика 2-6 нкн, которые заполняли внутриклеточный раствором следувкего состава С в мнллимолях на 1 л); CeF - loo. CeCJ - 10, ctsOH-HEPEa - ío, h*h2fo4 - ао. pii 7,а.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Природа ьозОукдад^гго постсииаптнческого тсиа.

В пирамидных нейронах зоиы СМ гиппоканпа после образования

рысокоонного контакта в ответ на стимуляцию коллатераяеИ Ваффера

регистрируются входящие токи имеющие анплитуду от 50 до сотен пА d

зависимости от силы стимуляции и поддерживаемого потенциала. Эти

токи обладают характерной синаптической. эадераой в 3-е ис, и

р t

одновременно с подавлением ППЛ блокируются ТТХ C1 ЖЭ и ионани Кзс <10 нЮ. Приведенные выве данные свидетельствуют о тон. что регистрируемый входявий ток инеет смнаптическую природу и является возбуждающим постсинаптическин током.

Оказалось, что вопьт-амперная характеристика на пике тока {«быстрый» компонент) линейна на всем интервале поддерживаемых потенциалов с потенциалом реверсии около -»20 нВ. в то время как

Рис.1 а)- ПрэпарированннЧ срез гиппокампа 1 - стеклянная никропипотка. 2 - пнеклоточшД отводяснй, 3 - стннулирушгчЛ элоктроды.

65- ВЛНЯИН9 се/зктиокого блокатора tJKDA рецепторов M.-APV ССОнкнодь/л) на возбуядаюетй постсииаптичесний ток СВПСТ); вольт-янперныэ характеристики контрольного С1- на пике тока, 2- ил 2ö~il üc после пика тока) и подавленного СЗ- на пик о тока, <1- нл 20-fi не после пика тока) ОПСТ.

D3- Вянпннэ селектноного блоклтора но-ниол роцептороз сякус СЮнкноль/л) на ОПСТ; вольт-днперинэ характеристики контрольного С1- на пике тока, 2- на 20-П не поел? пика тока) н подавленного ejus г.икэ тоШ СПСТ.

сольт-зипернап характеристика па 20-11 ко поел? шил тока с«иодлонныЗ» конпонент) обладает четко выраггиной нелинейность» в китерзылэ -60 —20 нВ. Для ксслодования природы этих коипонектоэ СПСТ ни поучали в/ипнио солзктиэного блогетора «¡ал рэцгптораэ вь-ЛГУ и еэлэкгивного блокатора нэ-шазл рецепторов сгах на рзгнетрнруоння ток Срис.1).

При поддзрпшасиьк ианбрапичх потенциал« -100 - -70 «В АРУ на оклзавал сусгстоемкого олиякнл на СПСТ, в то врэил как при потенциалах пг? .-.70 нВ АГ? значительно подаолал "нэдлгнш.Д" компонент СПСТ Сп « 24) срис. 1сб)). • Э*ект АРУ Сил яолностьо обратит г.1, Наоборот, С1?ОХ почтя полиость» подавлял СПСТ, регистрирует» при поддергиваете: потетшамх -100 - -70 иЭ. При подсэршвает« потенциалах -50 - 20 нО спад блокировал только "быстрый" компонент СПСТ Сп «20), оичлемпя ого нэдяанну» состаолясг^о Срис. 1 о). Ток, оставкШся пос» прклог'эии?} Ст. полностью блокируется АРУ. подтверздая теи оамш, что оститочмия ток опосредуется №ФА рецепторам, Провгг.оишп нсс«доп»ш1я

показывают, что ВПСТ состоит нэ двух компонентов - CNQX-чувствительного "быстрого", н АГ\'- чувствительного "медленного".

2. Действие агопистов н антагонистов глутамата на постсинаптнческиЯ ток.

Поскольку сннаптическая передача неаду неПронани САЗ и CAI зон является глугаиатэргической.' необходимо (*ыло вьыснить, как влияет экзогенное приложение глутаната. его агонистоо и антагонистов .на наблюдаеные гсостсинипгические токи. При аппликации 250-500 нк.М L-глутамата СЬ-Глу.) мы • наблюла пи кратковременное подавление Св средней на 50*3, а затем восстановление ВПСТ на протяжении 3-10 нин, По виду кривых вольт-анпорнмх характеристик, токи, регистрируемые до и во рреми аппликации L-Глу можно разделить во вренени на 3 группы Сен. текст к рис. 23.

Вольт-анперные характеристики первых двух групп качественно не отличались для воех исследованных нейронов Cn=30?, за исключением меньшей амплитуды восстановленного ответа по сравнению с контрольный, к кривые вольт-амперных характеристик на 20 мин после приложения L-Глу имели даже на пике тока нелинейный вид Срис.2СаЭЭ. При удалении глутаната из внеклеточного раствора лостси:(аптический ток возрастал по амплитуде и вольт-анпеон'ея характеристика на пике тока приобретала линейный Рид. При повторной приложении глутаната сп=95 не происходило унеиыоения ангиитуды ВПСТ, однако вольт-амперная характеристика на пике тока опять приобретала нелинейный вид. Если срезы предварительно проинкубировать более 30 нин в растворе, содержащем 230 1 ям глутаната, то вольт-ьнперная характеристика пика тока также становится нелинейной.

ИетаОотрошше -^цепторы, в последнее время было показано, что кроне рецепторов, связанных с ио^ын каналом Сионотропных рецепторов ПИРА и не-NMDA типяЗ. , , L-Гчу взаимодействует с рецепторани, не связанными с илнныии каналами, однако приводящими к активации оир<? доленных CJ-бепков и гидрплнзу фоефоинознтида для передачи сигнала внутрь клетки ст.н. нетаботропцыи рецепторьО, Ны исследовали влияние х-'сткого циклического аналога глутаната '. Транс-Асго. являющегося специфичен к ин лигандоп нет^.ботролных рецепторов, на свойства сннаптическоЯ передачи о гиппоканпе.

При добаолгнин во внеклеточный раствор транс-ACFD в концентрации свыае 50 нккольля популяционный потенциал действия СППДЭ, рггнетрнруеный в зон? CAI, полностью и обратимо подавлялся в

"то »реня как величина ВПСТ, отводимого от одиночных нейронов в зоне

Рис.2а)- Влияние продолжительной аппликации глутаната С250мкмоль/л) на ВПСТ; вольт-амперные характеристики контрольного ВПСТ С1), и токов, зарегистрированных через 10 С2) и 20 СЗ) мин после добавпения глутаната во внеклеточный раствор; все вольт-анпернне характеристики нзмеряны на пике тока.

б)- Влияние транс-acpd СЮОнкноль/л) на синаптическую передачу в зоне СЛ1 гиппокампа крыс. Временной ход подавления популяционного потенциала действия СППД), отводимого внеклеточно, одновременно с регистрацией ВПСТ Свверху; поддергиваемый потенциал -70 нВ). По оси ординат - нормированная амплитуда ППД.

оч- Влияние транс-ACPD на амплитуду антидромного популяционного пика С АПП) в области клеточных тел пирамидных нейронов поля CAI и САЗ. 1 - контрольный АПП, 2 - АПП при добавлении во внеклеточный раствор 100 нкмольлп транс-ACPD.

CAI, не изменялась (п=4) срнс.2сбээ. Лля выяснения природы данного явления, мы исследовали влияние транс-ACPD на анплитуду антидромного популяционного пика САПП), отводимого в области клеточных тел пирамидных нейронов CAI и САЗ зоны. Транс-ACPD в концентрации 50 - 250 нкноль/л полностью подавлял АПП пирамидных нейронов зоны CAI (n-ll), однако почти не влиял на анплитуду АПП пирамидных нейронов зоны САЗ (п=б) Срис.Зв). Подавление АПП пирамидных нейронов в зоне CAI было обратимым и доза-зависимым.

3. Действие агоинстов и аитагсшнстоо адеиоэкмовых рецепторов на постсинаптнческмЯ тох

Аденозин является широко распространенным нейромодулятором в ЦНС млекопитающих, дейсТЕше которого опосредуется рецепторами Al и А2 типов. Мы изучали действие аденоэина, агонистов и антагонистов аденозиновых рецепторов на постсинапткческий ток. Оказалось, что в

A L

малых концентрациях СЮ" - 3*10 Ю это вещество способно

потенцииросать СПСТ, а начиная с концентрация u Disa

наблюдается бкокируссмй oj}ехт адгнозина Срис.ЭСа)Э. Действие аденоэина при всех исследованных концентрациях полностью обратило. Для выяснения оклада рецепторов А1 и А2 типа в набвадаеный Эффект аденознна ни исследовали действие селективного агониста А1 рецептороо инклопентиладеноэнна (СРА) на постсинаптический ток. При аппликации СРА наблюдалось только подавягнно сннаптической передачи во псен диапазоне концентраций Срнс.ЗСо)>.

Многие весаства класса нетилксантннов, как природного, так н искусственного происхокдения, являются бяокаторами аденоэиновш рецепторов. В наах эксперимента» С-циклопснтил-теофмллин ССРТ, ЗнкЮ. теофнляин С120 мкЮ п кофеин С1нЮ при добавлении ео ьнеклеточныЯ растшр оызызали увеличение постсинаптического тока приблизительно в 2 раза (рис.ЗСа)З. Необходимо подчеркнуть, что и адзнозии, и все исследо&внныэ ксантииц только уиенььаяи ила увеличивали амплитуду БПСТ, никак не влияя на его потенциал реверсии и кинетику,

4. Совместное леГ.стсво одеиозина и его шяегоакстоэ

вшшэ&ет значительное усиление сшаатинесиоЗ передана.

В длльнейЕЯМ нас интересовал вопрос устранения ксаитннанн опосредованного сденозимон подавления синаптнческой передачи. С этой цель» бия проведен слздуециО эксперимент; поедг подавления БПСТ аденоэинон о концентрации 10"5М. в пер^узирувщШ рсстоор добавляли один из ксангиноэ Собично СРТ) о указанной виз? концентрации. Полученньй результат превэоеая осе ожидания. Охаэадось. что при такой постановке эксперимента происходит не только восстановление, но и значительное увеличение ВПСП Св случае СРТ о среднем в 6*2 раз Св»30). рнс.ЗСб.сЭ). Синаптическая передача усиливалась и при испо льзовании внесто СРТ теофиллина с в среднем d 3.7+0.3 раз, п*11) или кодеина Со средней в 3.4+0.3. раза и-13ээ. Для выяснения, является дн предварительное прилогзнне адзнозина необходиныи для по пучения потенцнации, в некоторьи опытах аденозии 10 Ми СРТ 3 Ю^Н апплмцировалн одновременно, что приводико к более медленной и менее значительной потенциацин ( в 3-4 раза, см. рис.ЗСвЗЭ. Нам не удалось достичь потенциацин в случае приложения сначала СРТ, а затен аденознна.

Для выяснения имеет ли обнаруженное нами значительное увеличение постсинаптического тока пре- или постсинаптическую природу, ны

t) СИ б) о)

г

и

о

г,ч ,71 ^ .у*' Пч('.'0

Рнс.ЗаЭ- Слияние эденозина CAdo) о го агоннста цнклолеитил -аденознна ССРАЭ м антагониста циклопентилтеофиллина CCPTJ на ВПСТ. 6)- вверху: Экспериненталынц-э при виз токоэ, получении? на одной и тоП re клетке; 1 - контрольны.! ВПСТ; 2 •• подавленна!) алемоэннии в Koi-гиентрашш ЮмкН; 3 - потенцнированнкП при последовательной аппликации аденознна н СРТ в концентрации 5нкН- mur.ty; одновременная регистрация ППД; 1 - контрольна ППД, 2 потеншшрованныя.

to- временная зависимость потеициации ВПСТ з случае аппликации СРТ после подавления ВПСТ адгнознном С1) и в случае одновремемнМ1 аппликации веществ С2),

По осн ординат - нормированная амплитуда ВПСТ.

исследовали действие APV и спах на потенциированныИ B1ICT. Кьк показано ранее, в контрольном ВПСТ присутствует 2 компонента, опосредуемые рецепторами не-utiDA и khda типа. О потенциирооаинок постсмнаптнческо.ч токе эти компоненты присутствуют о тон t.e соотношении, а последовательное прнлогэнив аитагонистоэ шя>л и 1!Э»ш:ВА рецепторов приводят к полному обратимому нсчозно&енн& постсинаптического тока. Т.е. ^следствии нлбяздаенол потенцмашш П5ИЯ0ТСП только апплнтуда ВПСТ, на не меняется ни кинетика, ни относительный вклад различии компоненте» а постсинаптичесгиП ток, На рис.4Са> представдгн грр.Сик временного хода потенциашш для нормированного максимума ВПСТ. прядставляюшзго о основном hs-hmda компонент, н нормированной солячнни тока на 20 но поел* максимума, представляв Я а основной ШЯА-коипоиснг. При иаблздаеноЯ потсицнацни ко ненпетси такта н потенциал ров*реп» ВПСТ, по-прея!(?му составляя »20*3 i<D. Совокупность получ*нша лчншдг мот основами? предполагать, что и&бллдаениЗ {енонен нняот пресннаптнческуп природу.

7

а)

б)

В а с

&

i

□

O-i

4

Р

В-2

3

■v»

Q

2

111

' МИН

в

мин

о

о 3 6 9 12 13 Ada Al\o + CFT

О

5 10 15

Глу. 250

Рис.4 аЗ- временная зависимость потенциацим не-NMDA компонента ВПСТ с1. регистрация на пике токаз и hmda компонента ВПСТ С2, регистрация через 28 не после пика тока).

63- вренемная зависимость подавления потенциированного С1) н контрольного С23 ВПСТ при аппликации 250 нкИ глутаната, По оси ординат - нормированная анплитуда ВПСТ.

3. Свойства потенциированного постсииалтичесхого тока В дальнейших исследованиях было интересно выяснить, приобретает ли синаптическая передача какие-либо новые свойства во время наблюдаемой потенциацин. Для выяснения данного вопроса кы исследовали действие L-Глу на потенциирозанныЯ ток. Если прн добавлении глутаната во внеклеточный раствор в концентрации 0.3 нМ контрольный ВПСТ подавляется почти наполовину, то потенцинробанный ВПСТ обладает гораздо иеньЕгй чувствительностью к глутанату. В случае потонциированного ВПСТ относание 1«1и^1контр составляет ООХ, а в случае контрольного БПСТ - 45* срис. 4Сбэз.

Интересен такгз тот факт, что постсинаптический ток остается потенциирооаннш даез d случае удаления из внеклеточного раствора как адекоэина над его антагониста й отдальности, так ы при их соекестной отнюко срис.ЗС»33, При последовательном придоЕэнии адгнознна к его антагонистов, изменяется но только ьеличина постсикаптического тока, регистрируемого на одиночной нейроне, ио таккэ у&одачмвается иитегральныя ответ - попудяционный спайх. стьоданма ьнекмточно с в 2 - 2.3 раэаз сем. рис.Зс633, Величина пэтеишшромнного ППД сугастеенно не изменяется ¡¡а протяоняи 30-40 ивн отишим, a »атеи начинает иедмнно уноньоться, Итак, ©сет со ввгклэточноа раствор© содгргмтсс аганозни о достаточно

высоких концентрациях, ксантины способны тпьаать значительное и долгодлякеесп усиление синаптнческой передачи.

6. Еилсненне воомогаак механизмов потенцнацин синаптнчесхоЯ передачи.

Полученныа нами результаты свидетельствуют о тон. что

последовательное прилокение аденозчна и его антагонистов приводит к

усилению синаптнческой передачи. Это усиление скорее всего

происходит из-за увеличения выброса недиатора в синаптическую пель.

Цель» дальнейпих исследований было выяснение, какой иненно тип

аденизиновых рецепторов отвечает за наблюдаемую потенциацию. Тот

факт, что наблюдаемая потенциация достигает при использовании СРТ

(наиболее селективного антагониста А1 рецепторов) гораздо большего

значения, подводит к мысли о возможной роли А1 рецепторов. Длч

изучения такой воэможости мы использовали вместо аденсэнна

селективный агоннст А1 рецепторов CPA в концентрации C3"l0~'tt>. f>

которой он вызывает эффект, аналогичный эффекту аденоэина и

-7

концентрации 10 JM. При предаппликации CPA 3*10 N, добавление во внеклеточный раствор СРТ в концентрации 3«10'Ч>Н аыз1гв'двт потенциацию синаптнческой передачи в среднем в 6. 4 +2 раза.

Известно, что взаимодействие аденоэиновых рецепторов с аденилат-цнклаэной системой опосредовано О-протеинами. А1 рецепторы сэязани с Pertueala-токсин СРТХЭ-чувствительнынн Oi-беяками Сннгнбируюкими аденияат-циклаэуЭ, а А2 рецепторы - с РТХ нечувствительными Оа-белками Сактивируюцини аденплат-цикпачу). Опыты на срезах, проинкубированных с РТХ с500 нг/нл, 36°С, 24 часа) показали, что хотя аденоэин и перестает блокировать ВПСТ, ксантины сохраняют способность значительно потенциировать отает. Однако и о Этом случав присутствие аденозина во внеклеточной растворе являлось дбсолатно необходимые. Полученные данные ддют возможность захламить, что для ооэннкновения потенциации не является необходимый предварительная подавление син&птнчэасой передачи, однако абсолютно необходима является присутствие а омиваюгзм раствора агониста А1 рецепторов в достаточно высокой концентрации. Взаимодействие аденоэина с А2 рецепторами, связанными с не блокируемом РТХ аа болкани, вьгракается, по-видимому, только а незначительной потенциации ВПСТ при аппликации 10"^ 11 вдоноэина спорядка 1.7 раэаэ.

Однако возможно предлояожть, что увеличение оызрсса медиатора является следствием увеличения количества uAttJ а пресинаптическом

окончании. Для проверки данного предположения иы кссладовали Э-нзобутил-1-нетилксантин С1ВМХ5 - самый сильный среди иетнлксантинов ингибитор фос<>одиэстерази. Аппликация 1нМ 1внх вызывает потенциацию ВПСТ приблизительно в 1.6 раза. Будучи добавленный во внеклеточнай раствор, содерсаиий 10 И аденозина, 1ВМХ не способен снять блокирующего действия аденозина, т.е. является очень слабый антагонисток аденозиновьк рецепторов. Однако, если эатен в омывающий раствор добавить ОРТ на Фоне Аг1о+1ВМХ. то происходит значительная потенциаиия постсинаптического тока.

0БСЯЩ1ЕШШ РЕЗУЛЬТАТОВ 1, Свойства постсанаптнчеашк токов. Влияние атошгстоо и -.антагонистов гдутшата иа ВПСТ.

Использование методов фиксации мембранного потенциала и внутриклеточной перфузии для работы с нейронами, находящийся в своем естественной окружении позволяет перейти на качественно носцй уровень изучения функционирования синаптических контактов в условник, наксимально приблшйгнньк к естественным. Использованная в данной работе летодика является модификацией методики Сакнанна с соавторами и имеет ряд судественных преимукеств. Она не требует дорогостоящего оборудования как то оптика Нонарского, вибрато» Для получения тонких срезов СЮ0-150 икн) одинаковой толаины. Волге проста н удобна в обравении. ноагт быть реализована практически с дабой биофизической лаборатории без затраты значительных средств, обеспечивает длительную стабильную регистрацию, удовлетворительное качество фиксации потениала. Ногат быть применена таксе и при исследовании другик отделов нозга с хоросо вырасенной структурированностью, например гранулярных клеток зубчатой £-<зсцни или клеток Пуркннье нози^чка. Вольт-анперные характеристики дла шэд-активируеных токов в нагний-содергакам растворе и 'Нечувствительных натриевы« токов через потенциал-управлаеиыэ шшлу . сходны с ьодьт-амперныни характгристнканн. полученный!! рглтс на изолированных нейрона», что могет слуспь покбэатед^н удовлетворительной фиксации потенциала в случае »¡ссдсдзьгния нейронов. иа80дяс4хся в ткани среза. При исслэдовакии природы СПСТ была подтверкдгны данныэ других авторов о тон, что ВПСТ состоит ИЗ . гэух «онпоиентоо - опосредуемых рецептор&ки «гад ц типа.

Хаиниэ, получение в опыта* с зкзотенныа придокэнион гдутопат* ШчТсрсою сопоставить с шиш,Кркзталя с соавт. , вояучогшыни в

1S

опытах по "перестраивани»" сниаптическоЯ передачи. Показано, что. действительно. при приложении глутаната синаптическая передача сначала подавляется, однако довольно быстро восстанавливается d присутствии во внеклеточном растворе глутамата. Это восстановление, однако, имеет не одну, как считалось ранее, а, по-видиному, дээ Фазы. Вначале, до 10 мин от начала действия глутаната, происходят оосстановление ВПСТ без изменения вольт-амперной характеристики, а затеи, от 10 до 20 мин от начала действия глутаната, происходит включение болыпего количества NMDA рецепторов, и вольг-анперная характеристика максимальной амплитуды тока приобретает нелинейный оид. Интересно такге явление "памяти",- при вторичном приложении глутаната ВПСТ не подавляется, однако вольт-анперная характеристика, измеренная на пике тока становится нелинейной. Простейсее объяснение заключается в тон. что при приложении глутаната происходит деполяризация мембраны, и в результате устранения блокирующего действия ионов нагния токи, опосредуемые ШБЛ рецепторани, вносят значительный вклад в ВПСТ. Однако ранее било показано с использованием метода фиксации том, что при добавлении глутамата 1>о внеклеточныЯ раствор потенциал на ненбрано вначале действительно изменяется в сторону деполяризации, однако очень скоро возникает стойкая гиперполяризация. Нам не удалось ответить на вопрос, является ли искривление пиковой вольт-амперной характеристики следствием увеличения количества активированных NMDA рецепторов, или это обусловлено увеличением времени открытого состояния ионных каналов, связанных с nmda рецепторани.

Что ге касается опытов по выяснению влияния на синаптнческув передачу агонистов нетаботропных рецепторов, то полученные нами данные из согласуется с предположением, выдвинутым Баскисон и Паленкой, ибо указывают на изменение возбудимости клеточной нембрвны пирамидных нейронов зоны CAI под действием транс'-АСРО, а не количества высвобоздаеного медиатора. Наблюдаемое изменение возбудиности ногет обуславливаться деполяризацией пирамидных нейронов гиппокампа и/илн подавлением калиевой проводимости при активации нетаботропных рецепторов глутаната. как это было показано Чарпакон с соавторами при работе на культивируеных срезах гиппокампа. Исследование в/няиня агонистов нетаботропных рецепторов глутамата на свойства синапгической передачи ногет инеть ваэюе значение для выяснения механизмов синаптнческой пластичности, обучения и памяти.

и

2. Влилин» arouacTO» и антагонистов аденозвиа

на постсннаптическвй ток Из литературных данных известно, что прн внеклеточном приложении возбуждающих анинокиелот меняется чувствительность синаптической передачи к. аденоэину. Целью проведенных нами опытов было выяснение влияний аденоэина на постсинаптическмй ток.. Результаты опытов свидетельствуют, что это векество способно не только мнгибировать ППД, но и усиливать синаптическу» передачу. Это подтверкдает данныз Нишннура и др., полученные с применением нетода регистрации фокального потенциала гранулярных нейронов зубчатой извилины на срезах гилпоканпа норских свинок. Нам не удалось наблюдать увеличение амплитуды ВПСТ. используя вместо аденоэина селективный агонист А1 рецептора CFA, что дает основания заключить, что А1 рецепторы не приминают участия в наблюдаемой потенциацнн.

Обнаруженное усиление синаптической передачи при последовательном действии аденоэина и его антагонистов представляет значительный ннтерес. Во-первых, илластрирует физиологические возможности функционирования данной системы. Во-вторых показывает, что широко распространенный в организме нейромодулятор аденозин способен оказывать на синаптическу» передачу не только ингибирушее, но и потенциирукдае действие. К тому s» аденозин и его антагонисты требуются только для индукции усиления синаптической передачи, но не требуются для его поддержания. Данные свойства ставят открытое явление в один ряд с долгодляцейся потенциацней, формированием устойчивых очагов эпняептиформной активности и др.

Возникают, однако, некоторые вопросы связанные с физиологической природой обнаруженного яменин. Полученные в работе данные дэют возможность заключить, что увеличение ВПСТ - явление пресинаптнческоН природы и связано скорее всего со значительный увеличением выброса медиатора. Так данный эффект не зависит от вынывания цитоплазмы из постсинаптмческого неПрона и, более того, от присутствия во внутри»леточном растворе ионов фтора, которые блокируют высокопороговыр кальциевые каналы и иммобилизует G-белки. Кроме того, при потенциаини синаптической передачи уве ничивается только анппитуаа ВПГТ. К потенциал реверсии, н относитепьный вклад в суниарный ток компонентов, опосредуемых рецепторами nmda и не-nmpa типа остаются неизменными. Наблюдаемая потенцнаиия

проявляется не только на клеточной, но такие и на интегральнон уровне, выражаясь в двух - трех кратнон увеличении анплитуды фокального потенциала.

Характеристики доэа-эависииости действия СРТ на фоне различных концентраций аденозина показывают, что возникновение значительной потенциации синаптической передачи аоэножно только в присутствии достаточно высокой концентрации аденоэина в кондиционирующем растворе, Важен также тот <Jkikt, что СРТ является наиболее селективным блокаторон А» рецепторов в ряду других исследованных нетилксантинов и вызывает наиболее значительное усиление синаптической передачи. Для индукции изучаемого явления достаточно использовать внесто аденоэина селективный агоннст А« рецепторов CPA. Все вышесказанное говорит о тон, что данное явление опосредуется скорее всего А« рецепторами аденозина. Против сколь-нибудь эничительной роли А»-реиепторов в наблюдаемой потенциации свидетельствуют результаты опытов с Pertuaais-токсинон Сувеличение иАМФ через РТХ-нечувствительные (Ь-5елки не приводит к существенному увеличению анплитуды ВПСТ) и с аппликацией аденозина на фоне предварительной аппликации СРТ с взаимодействие смешанного агониста аденозина только с А»-рецепторани, так как А» заблокированы СРТ, не приводит к потенциации ВПСТ). К тому ¡ге биохимические исследования показывают, что в гиппокампе, а именно в слое stratum radlatum наблюдается наибольшая концентрация А»-рецепторов.

Кроне того опыты с Portuesla-токсином, ингибирующим опосредованное г 'А»-рецепторанн действие аденоэина на аденилат-циклазную систену путем блокирования РТХ-чувствительных си-белков показывают, что изменение уровня цАМФ внутри клетки не является основополагающей причиной возникновения потенциации. В пользу этого свидетельствуют также опыты ,,с блокаторон фосфодиэстераэы IBMX. По-видимону. неханизн возникновения потенциации следует искать »среди не связанных с аденилат-циклаэной системой активируемых аденозннон ионнм^ каналов. Учитывая полученные результаты, л такяе совокупность ине.тихся в литературе данных ногно лредлоаить следующую качественную модель возникновения данного явлення,

А»-рецепторы аденозина ногут находиться в двух состояниях; с низким сродством к аденоэину ссобственно молекула рецептора) и б ^ькоким сродством к аденоэину срецепторныЯ комплекс, состояний из нолекулы рецептора, системы 0-протеинов, передаювдх сигнал с

рецептора на аденилат-циклазную систему н потенциал-управляеного кальциевого каналах Переход иэ состояния с низкнн сродством в состояние с высоким сродством ноает осуществляться аденозинон «прямой путь, молекула аденозина связываясь с рецептором инициирует присоединение G-белковЭ и при отсутствии аденозина или хронической блокаде части аденозиновых рецепторов, например кофеином. В этон случае недостаток блокирующего действия аденозина ощущается клеткой Свояножно через уровень цАМФ или другие неханиэмю и происходит опосредованный переход-оставиихся рецепторов в состояние с высоким сродством к агонисту. В недавней работе Чериеаской с соавторами показано, что на пнранидных нейронах гиппоканпа САЗ a CAI зол аденоэнновые рецепторы связаны с потенциал-управляеиьии кальциевьши каналами н-типа, Причен аппликация аденозина к поверхности нейрона приводит к подавлению кальциевого тока. Мы предположили аналогичный нехаиизн действия, а инеиио-, что аденозин не только инициирует образование рецептор-канальных комплексов с высокий сродстоои. но и, связываясь с ними, одновременно блокирует кальциевый каналы М типа, которые, согласно модели, и являются составляюкгй часть*} этих комплексов, В свой очередь добавление антагонистов ■А»-рецепторов приводит к деблокированию и иосноиу входу кавьция в ьдэтку, Этот поток ионов Са2+ вызывает, по-вндинону, Са2*-завнсиныЯ выброс кальция из внутриклеточных депо Сна срезах, проинкубированы^ 40 ник с ЮОмкМ рианодина невозможно получить потенциацию ответа более чен в 3 разаЗ, что и обуславливает мощное усиление выЗроса медиатора и регистрируемое нами увеличение ВПСТ.

Учитывая продолжительность наблюдаемой потенциаини, нокно предпологить. что обнару»гнное нани явление значительного, усиления синаптическоВ передачи найдет свое место среди механизмов, обуславливавших сннаптнчсскув пластичность о гиппокакпе.

выводи

1. Разработана методика, позволяющая осуществлять фиксации потенциала на мембране нейронов в срезах головного нозга. Методика Обеспечи&ает возвоаюсть длительной регистрации как токов, о&еспечньа*етх алектричесг.у» возбудимость нейронов. так к постсинаптических токов. Изучена свойства воабукдакетх постсииапшческих токов пирамидных ..ейроноо зоны CAI гкппокакпа крыг. Быделйпш 2 комаоканта ВПСТ. опосредуете рецепторат: К1ША и до-tssaA типа.

2. Показано, что при продолаительной аппликации глутамата С20 ннн и более) вольт-акперная характеристика на пике тока приобретает нелинейный вид, а относительный вклад NHDA-рецепторов в суммарный ВПСТ увеличивается со средней на 20ХЭ. При продолжительной аппликации аспартата характер вольт-аиперноП характеристики на пике тока не изменяется, а относительный вклад NMDA-рецепторов в суммарный ВПСТ уненыгается С в среднем на 10 - 1350.

3. Исследовано влияние действующего на нетаботропнш рецепторы агониста глутамата транс-ACPD на свойства синаптической передачи в гнппокампе. Показано, что подавление фокального потенциала под действием тране-ACPD является результатом подавления возбудимости нейронов CAÍ. но не САЗ зоны.

4. Исследовано действие аденозина, его агонистов н антагонистов на ВПСТ. В зависимости от концентрации аденоэнн способен оказывать на ВПСТ как подавляющее Св концентрации свыше 3 мкЮ так н потенциирувщее действие С в концентрациях ниже I мЮ. Атагонисты аденозиновьсс рецепторов кофеин, теофиллнн, СРТ, в-фенилтеофнллнн вызывают двухкратное увеличение амплитуды ВПСТ.

3. Обнаругено, что при последовательном приложении аденозина С или СРА) и метнлксантинов возникает значительная потенииация ВПСТ И ППД, которая не исчезает н через 30 мин после удаления аденозина и ксантинов. Средняя величина отношения анплитуды потенциированного ВПСТ к контрольному значению 6±2. Увеличение амплитуды ВПСТ возникает из-за синхронного увеличения компонентов, опосредуемых рецепторами «MDA и не-NMDA типа. Усиление синаптической передачи сопровокдается потерей чувствительности к экзогенно приложенному глутанату.

6, Исследованы свойства погенциированных ВПСТ. Показано, что возникновение потенциацни связано, по-видимому, с Функционированием Al рецепторов аденозина, и не зависит от уровня внутриклеточного ЦА№.

7. Предложена качественная модель возникновения потенциацик при действии аденозина и ксантинов. Свойства потенциированных ВПСТ и ППД позволяют относить ббнаруяеннмй феномен к явлениям синаптической пластичности.

Иатериалм диссертации опу&шоваиы в следугцнх работах:

Garasohuk О., Kovalohuh Yu., Krlatil О. Adenoalne-dependeot enhancement Ьу methyIxenthines of exltatorr lynaptlo tranemlselon

In hippocampus of rata// Heurosol. Lett.- 1992.-135.-10-12.

Garaechuk 0., Kovalchuk Yu., Krlstal 0. Excitatory synaptic transmission in the hippocampus le subjected to adenoaine-dependent potentiation by methylxanthines // In matherials of "7th international symposium on neuroreceptors, ion channels and brain".- 1992,- In ргевв.

Garaechuk O.V., Kovalchuk Yu.N. , Kriatal O.A. Trane-ACFD selectively Inhibits excitability of hippocampal CA1 neurones // Eur. J. Pharmacol.- 1992.- in ргевв.

Гаращук O.B. , Ковальчук Ю.Н., Крышталь O.A. Исследование синаптнческой передачи в срезах гиппокампа крыс с приненениен модифицированной нетодики' фиксации потенциала // Нейрофизиология.-1991.- Т. 23, N 6.- С. 731-737.

Гаращук О.В., Ковальчук Ю.Н., Крышталь О.А. Опосредованная рецепторани аденозина потенциация синаптнческой передачи в гиппоканпе крыс// ДАН. - 1991,- Т. 320, N 3,- С. 733-736.

Гаращук 0. В., Ковальчук Ю. Н., Крышталь 0.А, Влияние транс-ACPD -специфического агониста глутаната, взаимодействующего с нетаботропныни рецепторами, на синаптическую передачу в гиппоканпе крыс// Нейрофизиология.- Т. 24, N 2.- 1992.- С. 211-214.