Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кальциевая активность клеток поля СА3 гиппокампа крыс раннего и позднего постнатального периода развития

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Кальциевая активность клеток поля СА3 гиппокампа крыс раннего и позднего постнатального периода развития"

На правах рукописи

МИТАЕВА ЯРОСЛАВА ИГОРЕВНА

КАЛЬЦИЕВАЯ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ПОЛЯ САЗ ГИППОКАМПА КРЫС РАННЕГО И ПОЗДНЕГО ПОСТНАТАЛЬНОГО ПЕРИОДА

РАЗВИТИЯ

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о Ш 2014

005556801

Нижний Новгород - 2014 г.

005556801

Работа выполнена в федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего образования "Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского" на кафедре нейродинамики и нейробиологии

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Мухина Ирина Васильевна

Официальные оппоненты:

Зннченко Валерий Петрович, доктор биологических наук, профессор, ФГБУН «Институт биофизики клетки» РАН, заведующий лабораторией внутриклеточной сигнализации.

Хаспеков Леонид Георгиевич, доктор биологических наук, ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН, заведующий лабораторией экспериментальной нейроцитологии.

Ведущая организация: ФГБУН «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова» РАН, г. Санкт-Петербург

Защита состоится «10» февраля 2015 года в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.047.01 ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» Минсельхоза России по адресу: 603107, г. Нижний Новгород, проспект Гагарина, д. 97.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» Минсельхоза России http://nnsaa.ru/.

Автореферат разослан «9» декабря 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Иващенко М.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Кальциевая сигнализация является предметом исследований многих научных направлений, связанных с изучением роли нейронов и астроцитов в обеспечении функционирования центральной нервной системы (ЦНС) в норме и при патологии (M.Nedergaard 2010; O.Petersen 2005; J.Wolfgang 2002; N.Takahashi 2007; A.Verkhratsky 2012, D.Clapham 2007, V. Parpura 2013). Значение кальциевой сигнальной системы в мозге очень велико, поскольку она принимает непосредственное участие в регулировании фундаментальных процессов нейронной интеграции, регулирует различные локализованные функциональные реакции, и обеспечивает функционирование множества внутриклеточных сигнальных путей. Метаболизм невозможен при миллимолярном уровне внутриклеточного Са2+, поэтому все живые клетки сохраняют концентрацию Са2+ на низком наномолярном уровне, создавая тем самым разность градиентов между клеточным компартментом и межклеточным пространством (C.Rose 2001; T.Collin 2005). Увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ в клетке является сигнальным процессом, запускающим многие биохимические реакции. Са2+ активность клеток - это способность клеток быстро изменять внутриклеточную концентрацию Са2+ в виде осцилляций. Спонтанная Са2+ активность в клетках формируется при активации ионотропных и метаботропных рецепторов, каналов, регулируется работой белков -транспортеров, и, вероятно, зависит от этапа постнатального онтогенеза (Р) (J.Wolfgang 2002; N.Takahashi 2007).

Гиппокамп - структура ЦНС, принимающая участие в механизмах формирования эмоций, консолидации памяти. Гиппокамп имеет определенную структуру, которая обеспечивает работу многих клеточных сетей (A.Mazzoni 2007; X.Li 2010, Y. Shi 2014). Одной из них является сеть нейронов поля САЗ. Эта сеть получает входы из энторинальной коры и клеток зубчатой фасции, кроме того пирамидные нейроны САЗ поля в процессе раннего онтогенеза образуют связи между собой и интернейронами, образуя замкнутую сеть, которая функционирует и в условиях среза и формирует спонтанную Са2+ активность (N.Takahashi 2007, X.Li 2010; T.Sasaki 2007; M.Tsukamoto-Yasui 2007; S.Sipila 2006). Как и в любом другом участке мозга клетки нейронных сетей гиппокампа взаимодействуют с глиальными клетками, основным проявлением функциональной активности которых, являются Са2+ осцилляции. Известно, что глиальные клетки, в частности астроциты, выполняют не только трофическую функцию, но и участвуют в проведении информации в нейронных сетях и синаптической пластичности, механизм взаимодействий которых остается на стадии изучения. Формирование зрелых нейронных сетей в онтогенезе будет зависеть от взаимоотношений и функционирования нейронных сетей и астроцитов на стадии раннего постнатального онтогенеза и определять такие важные функции ЦНС как обучение и память. Поэтому для оценки этапов развития функциональной взаимосвязанности нейронных и глиальных сетей, были исследованы Са2+ осцилляции нейронов и астроцитов поля САЗ гиппокампа в течение первого месяца жизни крыс.

Цель исследования.

Целью настоящей работы явилось исследование особенностей Са2+ активности клеток поля САЗ гиппокампа крыс в первый месяц постнатального онтогенеза.

Задачи исследования:

1. Выявить динамику спонтанных Са2+ осцилляций нейронов и астроцитов САЗ поля срезов гиппокампа крыс первого (раннего - Р5-8, Р14-16) и второго (позднего -Р21-25) неонатальных периодов постнатального онтогенеза;

2. Изучить параметры спонтанных Са2+ осцилляций нейронов и астроцитов САЗ поля срезов гиппокампа крыс первого (раннего - Р5-8, Р14-16) и второго (позднего -Р21-25) неонатальных периодов постнатального онтогенеза при температуре перфузионного раствора 24°С и 35°С;

3. Оценить Са2+ активность нейронов и астроцитов САЗ поля срезов гиппокампа крыс первого (раннего - Р5-8, Р14-16) и второго (позднего - Р21-25) неонатальных периодов постнатального онтогенеза при нарушении проведения возбуждения в нейронной сети;

4. Оценить Са2+ активность нейронов и астроцитов САЗ поля срезов гиппокампа крыс второго (позднего - Р21-25) неонатального периода постнатального онтогенеза при воздействии возбуждающих нейротрансмиттеров (АТФ, L- глутамат).

5. Оценить вклад различных рецепторов и каналов в формирование спонтанной Са2+ активности нейронов и астроцитов САЗ поля срезов гиппокампа крыс второго (позднего - Р21-25) неонатального периода постнатального онтогенеза.

Научная новизна. Впервые выявлены изменения характеристик Са2+ осцилляций клеток САЗ поля гиппокампа крыс первого (раннего - Р5-8, Р14-16) и второго (позднего - Р21-25) неонатальных периодов постнатального онтогенеза.

Впервые исследовано влияние температуры перфузионного раствора как фактора, повышающего метаболизм ткани мозга, на Са2+ активность клеток САЗ поля срезов гиппокампа в разные периоды постнатального развития крыс.

Оценена роль сетевой активности в формировании спонтанных Са2+ осцилляций клеток поля САЗ гиппокампа крыс первого (раннего - Р5-8, Р14-16) и второго (позднего - Р21-25) неонатальных периодов постнатального онтогенеза.

Научно-практическая значимость. Проведенная работа позволила расширить представления о Са2+ сигнализации в клетках гиппокампа крыс раннего и позднего этапов неонатального периода постнатального онтогенеза, а также выявить зависимость Са2+ активности от функционирования нейронных сетей. Полученные данные могут быть использованы при проведении тестирования лекарственных средств и кормовых добавок для молодняка сельскохозяйственных животных в доклинических исследованиях по оценке токсического и нейротропного влияния на развитие мозга в онтогенезе. Кроме того, результаты работы могут быть использованы в образовательном процессе для студентов и аспирантов биологических и ветеринарных специальностей в качестве специальных курсов лекций и лабораторных практикумов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Параметры Са2+ осцилляций клеток САЗ поля срезов гиппокампа различны в зависимости от периода постнатального онтогенеза крыс.

2. Кальциевая активность клеток САЗ поля срезов гиппокампа зависит от активности нейронной сети в первые две недели постнатального онтогенеза, в отличие от клеток САЗ поля срезов гиппокампа крыс позднего неонатального периода (Р21-25) онтогенеза.

3. Основную роль в спонтанной Са2+ активности сети нейронов и астроцитов САЗ поля срезов гиппокампа крыс позднего (Р21-25) неонатального периода

постнатального онтогенеза играют ионотропные и метаботропные рецепторы глутамата, а также потенциал зависимые Са2+ каналы L-типа.

Личный вклад соискателя. По теме диссертации автором проанализировано 211 источников отечественной и зарубежной литературы. Проведено комплексное исследование по изучению кальциевой активности клеток поля САЗ гиппокампа крыс как раннего, так и позднего постнатального периода развития. Лично проводила научные эксперименты, лично участвовала при проведении экспертных оценок результатов функционального флуоресцентного кальциевого имиджинга, фармакологического анализа и кросс - корреляционного анализа. Лично готовила научные статьи по результатам проведенных исследований, готовила и выступала с докладами на международных и региональных конференциях, школах, симпозиумах.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на конференции молодых ученых «Нелинейные волны-2010» (Н. Новгород, 2010), XVII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» (Москва, 2010), международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2010), III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов - биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Н. Новгород, 2010), международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011), международной конференции IEEE Conference Proceedings: Information Photonics (IP) (Канада, Оттава, 2011), международном симпозиуме «Topical Problems of Biophotonics — 2011» (Санкт -Петербург - H. Новгород, 2011), международной научной конференции и молодежной школе "На пути к нейроморфному интеллекту: эксперименты, модели и технологии" (Н. Новгород, 2011), конференции молодых ученых «Нелинейные волны-2012» (Н. Новгород, 2012), международном симпозиуме «Topical Problems of Biophotonics — 2013» (H. Новгород - Ярославль - Казань, 2013), форуме молодых учёных Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского (Н. Новгород, 2013) международной научной школе «Горизонты современной нейронауки» (Н. Новгород, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 печатные работы, 4 из которых - статьи в рецензируемых журналах, 4 статьи в журналах из списка РИНЦ, 2 статьи в ведущих рецензируемых научных изданиях, индексируемых в системах цитирования Scopus, 1 статья в ведущих рецензируемых научных изданиях, индексируемых в системах цитирования Web of Science, 2 - учебно-методических пособия, 18 - тезисы докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа в объеме 116 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 9 отечественных и 202 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 18 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследований in vitro служили переживающие срезы гиппокампа самцов аутбредных крыс Wistar раннего (Р5-8; Р14-16) и позднего (Р21-25) этапов неонатального периода постнатального онтогенеза. Всего в экспериментах было использовано 145 животных. Основные правила содержания и ухода за

экспериментальными животными соответствовали нормативам, данным в Приказе Минздрава России № 708н от 23.08.10 «Об утверждении Правил лабораторной практики» и были согласованы с этическим комитетом при ГБОУ ВПО НижГМА Минздравсоцразвития России.

Приготовление переживающих срезов гиппокампа. Приготовление переживающих срезов гиппокампа проводилось с помощью вибротома (Microm HM 650V, Германия), при температуре близкой к 0°С, согласно ранее разработанному протоколу. Угол резки, частота вибрации и скорость режущей подачи лезвия подбирались таким образом, чтобы максимально сохранить клеточную структуру области, с клеток которой регистрировались Са2+ осцилляции. После приготовления срезы восстанавливались в течение одного часа в специальном карбогенизированном растворе (5% С02, 95% 02), при температуре 36°С, после чего считались пригодными для дальнейших экспериментов.

Визуализация и регистрация Са2+ активности клеток срезов гиппокампа. Для маркирования клеток срезов мозга в работе были использованы два типа зондов: Са2+ чувствительный зонд Oregon Green-488 В APT А-1 AM (OG) (Invitrogen, США) и астроцитарный маркер Sulforhodamine 101 (SR) (Sigma, США). В работе был использован лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Carl Zeiss LSM 510 DuoScan (Германия). Интенсивность флуоресценции (усл. ед.) показывала зависимость внутриклеточной концентрации ионов кальция от времени, свидетельствующую о метаболической активности клеток.

Выделение Са2+ осцилляций, полученных при помощи функциональной, флуоресцентной конфокальной микроскопии, проводили с помощью оригинального программного пакета "Astroscanner" (Пимашкин A.C., 2010). Анализировались записи функции F(t) средней интенсивности флуоресценции OG выделенной области поля (совпадающей с телом клетки) от времени. Для определения времени начала (Tstart) и конца (Tend) Са2+ осцилляции был взят порог отклонения от среднего значения в размере стандартной квадратичной ошибки F(t). Полученные данные отражали количество Са2+ осцилляций в минуту и их длительность, а также параметры распространения Са2+ осцилляций во времени.

Методика фармакологического анализа. Для оценки роли рецепторов и каналов в генерации Са2+ осцилляций в клетках поля САЗ гиппокампа крыс, в перфузионный раствор нормального Рингера добавлялись различные агонисты, антагонисты и блокаторы рецепторов и каналов. В начале регистрировались спонтанные Са2+ осцилляции клеток, выступающие в качестве контрольных. Затем в перфузионный раствор добавлялся блокатор потенциал-зависимых Na+ каналов -тетродотоксин (ТТХ) (Sigma, США) в концентрации 1мкМ, для нарушения проведения возбуждения в нейронной сети. Добавление остальных веществ производилось на фоне ТТХ, для возможности дальнейшего анализа Са2+ активности отдельных клеток.

Для изучения роли рецепторов глутамата были проведены эксперименты с добавлением антагониста NMDA рецепторов — МК-801 ((5R,10S)-(-)-5-methyl-10,l 1-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cylcohepten-5,10-imine maleate), (Tocris, Великобритания) концентрацией 20 мкМ; антагониста АМРА и каинатных рецепторов — CNQX (6-Cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dion), (Tocris, Великобритания) концентрацией 20 мкМ; антагониста метаботропных рецепторов глутамата 1 и 2 группы — MCPG ((RS)-a-methyl-4-carboxyphenylglycine disodium salt), (Tocris, Великобритания) концентрацией

20 мкМ. Для изучения роли потенциал зависимых Са2+ каналов L-типа были проведены эксперименты с добавлением блокатора этих каналов — verapamil hydrochloride (Tocris, Великобритания) концентраций 100 мкМ. Для изучения роли пуринергических рецепторов были проведены эксперименты с добавлением антагониста Р2Х рецепторов (Р2Х1,2,3,4,7,2/3) — TNP-ATP triethylammonium salt, (Tocris, Великобритания) концентрацией 20 мкМ; антагониста Р2 рецепторов — suramin hexasodium salt, (Tocris, Великобритания) концентрацией 100 мкМ. Для изучения роли рецепторов, инициирующих высвобождение Са2+ из внутриклеточных депо были проведены эксперименты с добавлением антагониста 1Р3 рецепторов, блокатором гап-контактов, блокатором TRPC каналов — 2-АРВ, (Tocris, Великобритания) концентрацией 100 мкМ; ингибитором высвобождения Са2+ из эндоилазматического ретикулума, через рецепторы рианодина — dantrolene, sodium salt, (Tocris, Великобритания) концентрацией 30 мкМ; антагонистом митохондриального Na+/Ca2+ обменника — CGP 37157, (Tocris, Великобритания) концентрацией 10 мкМ. Для изучения влияния АТФ на Са2+ активность клеток срезов гиппокампа были проведены эксперименты с добавлением в перфузионный раствор агониста Р2 рецепторов — adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate (Sigma, США) разных концентраций от 5 до 20 мкМ, с шагом в 5мкМ. Для изучения влияния L-глутамата на Са2+ активность клеток срезов гиппокампа были проведены эксперименты с добавлением в перфузионный раствор агониста — L-глутамата (Sigma, США) разных концентраций от 5 до 20 мкМ, с шагом в 5мкМ.

Метод корреляций. Для оценки синхронности возникновения Са2+ осцилляций клеток поля САЗ гиппокампа крыс был использован метод кросс корреляционного анализа. Выбиралось временное окно длинной 3 секунды и в пределах этого окна искались синхронные Са2+ осцилляции на всевозможных парах клеток. Далее число синхронно работающих Са2+ осцилляций нормировалось на минимальное число Са2+ осцилляций на одной из клеток анализируемой пары.

Статистическая обработка результатов. Полученные результаты in vitro обрабатывались статистически с помощью пакета прикладной программы Origin 7.0 (OriginLab Corporation, США). Значения данных представлены в виде — "среднее значение ± стандартная ошибка среднего", где п - число клеток. Для оценки достоверности различий между группами проводили парный двусторонний тест Стьюдента для выборок с неравными дисперсиями. Считались достоверными следующие уровни: *—р<0,05; **— р<0,005; *** — р <0,001, где р- достоверность различий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование динамики спонтанных Са2+ осцилляций клеток срезов гиппокампа крыс первого (раннего - Р5-8, Р14-16) и второго (позднего - Р21-25) неонатальных периодов постнатального онтогенеза

Было проведено исследование динамики спонтанных Са2+ осцилляций клеток срезов гиппокампа крыс раннего (Р5-8, Р14-16) и позднего (Р21-25) неонатальных периодов постнатального онтогенеза. На рисунке 1 представлены гистограммы, отражающие изменения количества Са2+ осцилляций и их длительности в зависимости от периода постнатального онтогенеза.

Выявлено увеличение длительности и уменьшение количества Са осцилляций пирамидных нейронов и интернейронов при переходе от раннего этапа постнатального онтогенеза к позднему. Длительность Са2- осцилляций астроцитов также увеличивалась в процессе постнатально онтогенеза, а изменение частоты имело сложный характер. Так при сравнении животных младшей возрастной группы Р5-8, с животными Р14-16 наблюдалось увеличение количества астроцитарных Са2+ осцилляций, а при сравнении с группой Р21-25 показано значительное снижение до значений ниже уровня показанных у животных младшей возрастной группы.

Уменьшение количества Са2+ осцилляций при переходе от раннего этапа неонатального периода к позднему обусловлено формированием и усложнением синаптически связанных нейронных сетей и переходом электрических синапсов в химические. Переходным периодом является 14-16 день постнатального онтогенеза, когда у клеток начинают доминировать химические синапсы, к 21 дню - наблюдается полностью сформированная нейронная сеть. В отсутствии афферентации, в условиях среза, эта сеть является молчащей, поэтому внешние проявления активности сети, выражающиеся в Са2+ активности клеток, очень низкие.

2,25 2.001.73 -■ 1.50 -' 1.25 -1.000.75 0.500.25 -0,00

I Р 5-8 ЗР 14-16 |Р 21-25

Пирамидные Интернейроны Астроциты нейроны

- да гЛ*

Щ

У/

У/ ......щ

I

Й)

Пирамидные Интернейроны Астроциты нейроны

Рисунок I. Изменение (А) количества Са2+ осцилляций и их (Б) длительности в клетках поля САЗ гиппокампа крыс раннего (Р5-8) и позднего (Р14-16; Р21-25) этапа постнатального онтогенеза. По оси ординат — (А) количество Са2+ осцилляций в минуту; (Б) длительность Са2+ осцилляций, е.; по оси абсцисс - (А, Б) тип клетки. *** р<0,001; * р<0,05, критерий Стьюдента, п=180.

Электрически связанная сеть является мапоконтролируемой, возбуждение свободно распространяется по сети, вовлекая в работу все клетки, что проявляется в высокой Са2+ активности клеток гиппокампа крыс раннего постнатального онтогенеза. В срезе гиппокампа крыс позднего неонатального периода постнатального онтогенеза спонтанная Са + активность низкая в связи с отсутствием активной нейронной сети. В этом случае спонтанные Са2+ осцилляции, вероятно, обусловлены в основном метаболической активностью клеток. Для проверки данной гипотезы были проведены эксперименты с изучением влияния температуры

перфузионного раствора на Са2 активность клеток САЗ поля срезов гиппокампа крыс, так как известно, что температура регулирует скорость внутриклеточных метаболических процессов.

2. Исследование параметров спонтанных Са2+ осцилляций клеток срезов гиппокампа крыс первого (раннего - Р5-8, Р14-16) и второго (позднего - Р21-25) неонатальных периодов постнатального онтогенеза при температуре перфузионного раствора 24°С и 35°С 2.1. Са2+ активность клеток САЗ поля срезов гиппокампа крыс раннего Р5-8 неонатального периода постнатального онтогенеза при температуре перфузионного раствора 24°С и 35°С

Методом конфокальной флуоресцентной микроскопии были получены изображения поля САЗ гиппокампа крыс раннего неонатального периода

SK-

«

в

■ ' у . f"

I -1

Рисунок 2. Конфокальные изображения поля САЗ гиппокампа крысы (Р8), полученные с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM 510 DuoScan. Флуоресценция Sulforhodamine 101 (650-710 нм) и Oregon Green-488 BAPTA 1AM (500-530 нм). Идентификация клеток: желтые клетки -астроциты, зеленые - нейроны. Масштаб 20 мкм

На рисунке 3 представлены гистограммы, отражающие изменения количества Ca2f осцилляций и их длительности в зависимости от температуры перфузионного раствора, при которой регистрировалась активность клеток. Изменение температуры перфузионного раствора с 24 С до 35 С вызывало повышение Са2+ активности нейронов гиппокампа при отсутствии изменений в реакции на температуру в астроцитах. В пирамидных нейронах и интернейронах при регистрации активности с температурой перфузионного раствора равной 35° С увеличивалось количество Ca осцилляций и снижалась их длительность, по сравнению с частотой и длительностью Са2+ осцилляций при температуре 24°С. В астроцитах при изменении температуры перфузионного раствора статистически значимых изменений параметров Са2+ осцилляций не происходило. Следует отметить, что при повышении температуры перфузионного раствора происходит ускорение метаболических процессов в клетках. Прежде всего, это должно отражаться на частоте генерации спонтанных потенциалов действий (импульсов) в нейронах. Поэтому в раннем неонатальном периоде постнатального онтогенеза при преобладании электрических синапсов в

нейрональной сети повышение температуры и увеличение метаболической активности клеток приводило к увеличению Са2' активности нейронов. В отличие от нейронов, астроциты - это электрически не возбудимые клетки и регистрация при температуре перфузионного раствора равной 35°С не влияло на астроцитарную Са активность.

2,2 2.01.8-

0,8 -06 -

1=24 С 11=35 С

|

Пирамидные нейроны

Интернейроны Астроциты

Пирамидные нейроны

Интернейроны Астроциты

Рисунок 3. Изменение (А) количества Са2+ осцилляций и их (Б) длительности в клетках

поля САЗ гиппокампа крыс раннего (Р5-8) этапа постнатального онтогенеза при регистрации активности с температурой перфузионного раствора 24°С и 35°С. По оси ординат - (А) количество Са2' осцилляций в минуту; (Б) длительность Са2+ осцилляций, е.; по оси абсцисс - (А, Б) тип клетки. *** р<0,001; * р<0,05, критерий Стьюдента,

п=140

С одной стороны, отсутствие температурной зависимости Са2' осцилляций в астроцитах, в отличии от нейронной активности, свидетельствует о различных механизмах, обеспечивающих возникновение спонтанных изменений кальция. С другой стороны, отсутствие ответной реакции астроцитов на усиление активности нейронной сети при повышении температуры было обусловлено отсутствием связей между нейронной и глиальной сетями на данном этапе развития мозга.

2.2. Са2+ активность клеток САЗ поля срезов гиппокампа крыс раннего Р14-16

неонатального периода постнатального онтогенеза при температуре перфузионного раствора 24°С и 35°С

Методом конфокальной флуоресцентной микроскопии были получены изображения поля САЗ гиппокампа крыс на 14-16 день постнатального онтогенеза (рис. 4). На рисунке 5 представлены гистограммы, отражающие изменения количества Са2+ осцилляций и их длительности в зависимости от температуры перфузионного раствора, при которой регистрировалась активность клеток.

В отличие от предыдущей серии экспериментов в серии на срезах гиппокампа крыс возрастной группы Р14-16 было выявлено повышение частоты и снижение длительности Са2+ осцилляций астроцитов (рис. 5). При этом нейроны (пирамидные и интернейроны) демонстрировали активный ответ на изменение температуры только по параметру количества Са2' осцилляций.

Рисунок 4. Конфокальные изображения поля САЗ гиппокампа крысы (PI4), полученные с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM 510 DuoScan. Флуоресценция Sulforhodamine 101 (650-710 нм) и Oregon Green-488 BAPTA 1AM (500-530 нм). Идентификация клеток: желтые клетки -астроциты, зеленые нейроны. Масштаб 20 мкм

t=24 с 11=35 С

Пирамидные нейроны

J

Интернейроны Астроциты

- —г—[—■—' I ' I ■—1—Г^^-'—Г 1 I 1 I

Пирамидные нейроны

Интернейроны Астроциты

Рисунок 5. Изменение (А) количества Са2' осцилляций и их (Б) длительности в клетках

поля САЗ гиппокампа крыс раннего (Р14-16) этапа постнатального онтогенеза при регистрации активности с температурой перфузионного раствора 24°С и 35°С. По оси ординат - (А) количество Са2+ осцилляций в минуту; (Б) длительность Са2* осцилляций, е.; по оси абсцисс - (А, Б) тип клетки. *** р<0,001; * р<0,05, критерий Стьюдента, п=200

Таким образом, к 14 дню постнатального онтогенеза гиппокампа крыс линии \Vistar наблюдалась более выраженная реакция клеток на повышение метаболизма в результате увеличения температуры перфузионного раствора. В температурно-зависимый ответ вовлекались и астроциты, в отличие от предыдущей возрастной группы. Вероятно, что более выраженная реакция на изменение температуры всех клеток обусловлена тем, что начиная с 14 дня постнатального онтогенеза наступают значительные перемены, связанные с экспрессией новых рецепторов, каналов, усложнением передачи импульсов через химические синапсы в нейронной сети и многообразием молекулярных контактов в межклеточном взаимодействии между нейронами и глией.

2.3. Са2+ активность клеток САЗ поля срезов гиппокампа крыс позднего Р21-25 неонатального периода постнатального онтогенеза при температуре перфузионного раствора 24°С и 35°С

Методом конфокальной флуоресцентной микроскопии были получены изображения поля САЗ гиппокампа крыс позднего этапа неонатального онтогенеза

Рисунок 6. Конфокальные изображения поля САЗ гиппокампа крысы (Р 21), полученные с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM 510 DuoScan. Флуоресценция Sulforhodamine 101 (650-710 нм) и Oregon Green-488 В APTA 1AM (500-530 нм). Идентификация клеток: желтые клетки - астроциты, зеленые нейроны. Масштаб 20 мкм

Проведенные эксперименты на срезах гиппокампа крыс возрастной группы Р21-25 продемонстрировали различные ответы нейронов и астроцитов на изменение температуры перфузионного раствора (рис. 7).

t=24C 11=35 С

Пирамидные нейроны

Интернейроны Астроциты

Пирамидные нейроны

Интернейроны Астроциты

Рисунок 7. Изменение (А) количества Са2+осцилляции и их (Б) длительности в клетках

поля САЗ гиппокампа крыс позднего (Р21-25) этапа неонатального онтогенеза при регистрации активности с температурой перфузионного раствора 24°С и 35°С. По оси ординат - (А) количество Са2* осцилляций в минуту; (Б) длительность Са2н осцилляций, е.; по оси абсцисс - (А, Б) тип клетки. *** р<0,001; * р<0,05, критерий Стьюдента,

п=180

Пирамидные нейроны и интернейроны продемонстрировали увеличение длительности Са2 осцилляции при температуре перфузионного раствора 35 С по сравнению с аналогичными показателями при температуре 24°С.

Подобная динамика может быть связана с тем, что в условиях зрелой нейронной сети, когда большинство пирамидных и интернейронов имеют химические синапсы, при повышении температуры спонтанная Са2' активность клеток нейронной сети повышается в основном за счет увеличения длительности Са2+ осцилляции, однако в целом Са2+ афферентации низка.

Активность зрелой астроцитарной сети не изменяется при повышении температуры, что еще раз доказывает, что повышение астроцитарной Са2+ активности зависит от активности нейрональной сети, а не от скорости внутриклеточных метаболических реакций.

активность этой неактивной сети в условиях отсутствия

3. Исследование Са + активности клеток САЗ поля срезов гиппокампа крыс раннего (Р5-8, Р14-16) и позднего (Р21-25) неонатальных периодов постнатального онтогенеза при нарушении проведения возбуждения в нейронной сети с помощью блокады потенциал - зависимых натриевых каналов

тетродотоксином

С целью изучения роли сетевого фактора проведения возбуждения по отросткам нейронов от клетки к клетке в формировании спонтанных Са2+ осцилляций в нейронах и астроцитах поля САЗ были проведены эксперименты с блокадой потенциал - зависимых быстрых натриевых каналов тетродотоксином (рис. 8).

1.00 -

0.75 -

0.25

0,00

Р 5-8,1=35"С 3 Р 5-8,1=35°С + ТТХ | р 14-16, (=35°С |Р 14-16,1=35°С + ТТХ |Р 21-25,1=35°С IР 21-25,1=35°С + ТТХ

Л

***

и*

м

и

Пирамидные Интернейроны Астроциты нейроны

Рисунок 8. Изменение количества Са2+ осцилляций в клетках поля САЗ гиппокампа крыс трех возрастных групп (Р5-8; Р14-16; Р 21-25) при температуре перфузионного раствора 35°С и добавлении в перфузионный раствор ТТХ (1 мкМ). По оси ординат -количество Са2' осцилляций в минуту; по оси абсцисс - тип клетки. *** р<0,001, критерий Стьюдента, п= 180

В ходе экспериментов в перфузионный раствор добавлялся блокатор Ыа каналов - тетродотоксин (ТТХ) в концентрации 1 мкМ. В результате проведенных экспериментов были зарегистрированы Са2* осцилляции клеток поля САЗ гиппокампа и проанализировано их количество в минуту.

При добавлении в перфузионный раствор блокатора натриевых каналов тетродотоксина в концентрации 1 мкМ наблюдалось уменьшение количества Са2+ осцилляций в пирамидных нейронах, интернейронах и астроцитах гиппокампа крыс возрастной группы Р5-8 на 95%, 83% и 38% соответственно. В возрастной группе Р14-16 так же наблюдалось снижение количества Са2г осцилляций, но на 62%, 69% и 61% в пирамидных нейронах, интернейронах и астроцитах соответственно. У животных старшей возрастной группы Р21-25 при добавлении в перфузионный раствор ТТХ Са24 активность клеток значительно не изменялась.

Таким образом, было показано, что в раннем неонатальном периоде постнатального онтогенеза Са2' активность нейронов полностью зависела от активности нейронной сети и резко снижалась при нарушении проведения сигнала по сети, в которой нейроны связаны электрическими синапсами.

При изучении структуры нейрональных сетей было показано, что в раннем постнатальном периоде существует строгая синхронизация активности пирамидных нейронов и интернейронов, за счет формирования стабильной нейрональной сети при условии проведения возбуждения через электрические синапсы. Астроциты на данном этапе развития в общую функциональную сеть не вовлечены (рис.9).

Спонтанная Са2+ активность клеток гиппокампа животных средней возрастной группы так же зависела от сетевой активности, существующей за счет частичной сохранности электрических синапсов на данном этапе развития, поэтому добавление тетродотоксина также уменьшало количество Са2+ осцилляций в нейронах. Снижение астроцитарной Са2+ активности в группе Р14 является ответной реакцией астроцитов на активность нейрональной сети, что доказывает наличие нейрон - глиальных взаимосвязей с 14 дня постнатального онтогенеза.

На 14-16 день постнатального онтогенеза число синхронно работающих нейронов снижается. Вероятно, что электрические синапсы остаются только у пирамидных нейронов, а у интернейронов почти отсутствуют (рис.10).

II Ц| II 1 1 1

1 л_ № 1-1 : . 111 лит т • ■ «• % • . . . • ц • • . * 1 • 1 .. ЛЛь № ' « • 1 . .11 1 А 1 . 1 .

5 50

300 400

Время, с

Доля переданных импульсов, т = 0± 1 с

^ 0.

Доля переданных импульсов, т - 0± 1 с

г о X

5

0

1

10.9

1о.в

Номер клетки

Номер клетки

Рисунок 9. (А) растровая диаграмма Са активности клеток, точками отмечено возникновение Са2+ осцилляций и график зависимости количества Са2+ осцилляций за 3 секунды от времени; кросс-корреляционные матрицы, позволяющие оценить у крыс Р5-8 синхронность возникновения: (Б) спонтанных Са2* осцилляций клеток и (В) при добавлении в перфузионный раствор ТТХ, 1мкМ

-

. А*. ь к. А . (Л.. лАД^ЛА -

ь : :П::.:1 ::::.!• ::: < : •«.'г : \ 1 {. . . . _ 1_ . . . .,

Время, с

Доля переданных импульсов, т = 0± 1 с

Доля переданных импульсов, т = 0± 1 с

100 120 140 160

г; - :С!ггт-~;:

■г:;- Ав'.й и .

! I ми ГЦ С 5

! ; 1111 г -- в :

60 80 100 120 140

Номер клетки

Номер клетки

Рисунок 10. (А) растровая диаграмма Са2т активности клеток, точками отмечено возникновение Са2+ осцилляций и график зависимости количества Са2+ осцилляций за 3

секунды от времени; кросс-корреляционные матрицы, позволяющие оценить у крыс Р14-16 синхронность возникновения: (Б) спонтанных Са2+ осцилляций клеток и (В) при добавлении в перфузионный раствор ТТХ, 1мкМ

В возрасте 21-25 дней постнатального онтогенеза отмечается полностью сформированная нейронная сеть с выраженным преобладанием химических синапсов, наличием молекулярной сети внеклеточного матрикса мозга, активной метаболической системы синтеза и деградации нейротрансмиттеров, нейромодуляторов, набором белков транспортной системы, как на внешней мембране клетки, так и внутренних органелл. Поэтому, отсутствие эффекта тетродотоксина на спонтанную Са2+ активность клеток группы Р21-25, обусловлено отсутствием спонтанной активности нейронной сети в САЗ поле среза гиппокампа, в которой нейроны связаны химическими синапсами. Соответственно мы не наблюдали и изменения астроцитарной Са2^ активности (рис. 11)

§ ? О

1 /«111 1 Ш й 1 /ш] Л) 1 11м1 1Й4 шЛ,

. - 1 . • . • • У- • - V • • •■•"•■ .

£ о X

Номер клетки

Номер клетки

Рисунок 11. (А) растровая диаграмма Са2' активности клеток, точками отмечено возникновение Са2+ осцилляций и график зависимости количества Са2+ осцилляций за 3

секунды от времени; кросс-корреляционные матрицы, позволяющие оценить у крыс Р21-25 синхронность возникновения: (Б) спонтанных Са2+ осцилляций клеток и (В) при добавлении в перфузионный раствор ТТХ, ) мкМ

4. Исследование Са2+ активности клеток САЗ поля срезов гиппокампа крыс (Р21-25) при воздействии возбуждающих нейротрансмиттеров (АТФ, Ь- глутамат)

Для изучения механизмов спонтанных Са2+ осцилляций в нейронах и астроцитах зрелой сети были проведены эксперименты с добавлением возбуждающих нейротрансмиттеров - АТФ и Ь-глутамата (рис. 12). Добавление тетродотоксина позволяло оценить работу отдельных синапсов и клеток. Нейротрансмиттеры глутамат и АТФ контролируют около 80% синаптической передачи в гиппокампе.

Было показано, что при добавлении в перфузионный раствор агониста Р2 -рецепторов АТФ, происходит увеличение количества Са2+ осцилляций в клетках поля САЗ гиппокампа крыс: в пирамидных нейронах на 100%, в интернейронах на 85%, в астроцитах в 2 раза.

ТТХ. 1мкМ ■ АТФ 20миМ ^о У///А тгх. !мкМ - L-r.-rvra.4in- 20мкМ

Пирамидные Интернейроны Аетроциты нейроны

Рисунок 12. Относительное изменение количества Са2* осцилляций в клетках поля САЗ гиппокампа крыс Р21-25 при воздействии АТФ, 20мкМ и Ь-глутамата, 20 мкМ. По оси ординат - относительные изменения количества Са2+ - осцилляций в %; по оси абсцисс - тип клетки. Пунктирная линия - контрольные значения Са2+ активности при регистрации с добавлением в перфузионный раствор ТТХ, 1 мкМ. ***р<0,001; * р<0,05, критерий Стьюдента, п=150

При добавлении в перфузионный раствор агониста рецепторов глутамата - Ь-глутамата было зарегистрировано увеличение количества Са2+ осцилляций в клетках поля САЗ гиппокампа крыс: в пирамидных нейронах на 71%, в интернейронах на 42%, в астроцитах на 100%.

В состоянии покоя животного, в гиппокампе уровень внеклеточного глутамата колеблется от 1 до 2 мкМ, а уровень АТФ составляет 100 нМ. А концентрация данных веществ в 20 мкМ считается полумаксимальной эффективной концентрацией и может наблюдаться при повышенной активности мозга, например, во время исследовательского поведения животного. При сохранении проведения возбуждения в нейронной сети, АТФ и Ь-глутамат зависимая активация синаптической передачи приводила к значительному повышению Са2 активности в сети, что отражалось в наличии синхронизации между клетками при добавлении возбуждающих нейротрансмиттеров (рис.13).

Время, с

Б

Г

Д Доля переданных импульсов, т = 0± 5 с Е Доля переданных импульсов, т = 0± 5 с

Номер клетки Номер клетки

Рисунок 13. (А, Г) растровые диаграммы Са2* активности клеток, точками отмечено возникновение Са2+ осцилляций и график зависимости количества Са2' осцилляций за 5

секунд от времени; (Б, Д) - кросс-корреляционные матрицы, позволяющие оценить синхронность возникновения Са2+ осцилляций клеток поля САЗ гиппокампа крыс (Р21 -25); (В, Е) - кросс-корреляционные матрицы, позволяющие оценить синхронность возникновения Са2+ осцилляций клеток поля САЗ гиппокампа крыс (Р21-25) при добавлении в перфузионный раствор (В) АТФ, 5мкМ; (Е) Ь-глутамата, 5мкМ.

Таким образом, проведенное исследование позволило выявить зависимость Са2+ активности клеток поля САЗ гиппокампа крыс (Р21-25) от метаболического

Доля переданных импульсов, т = 0± 5 с

20 40 80 80 100 120 140 160

Номер клетки

Время, с

Доля переданных

L-глутамат

Номер клетки

L-глутамат L-глутамат 5 мкМ

импульсов, T -

0± 5 с

состояния клеток, связанной, вероятно, с повышением выброса в синаптическую щель нейротрансмиттеров.

4. Анализ вклада различных рецепторов и каналов в формирование спонтанной Са2+ активности клеток САЗ поля срезов гиппокампа крыс позднего (Р21-25) неонатального периода постнатального онтогенеза

Следующим этапом нашей работы явилось изучение различных молекулярных механизмов, обуславливающих спонтанную Са2+ активность в клетках (рис.14).

S ^

ii 1 --Т-Н--

... •!'

I I 1

I I

IS

Ал

Jj

Рисунок 14. Относительное изменение количества Ca2* осцилляций в (А) пирамидных нейронах, (Б) интернейронах, (В) астроцитах поля САЗ гиппокампа крыс Р21-25. По оси ординат - относительное изменение количества Ca2* осцилляций в %; по оси абсцисс -параметры регистрации Ca2* активности клеток при добавлении в перфузионный раствор веществ: (1) МК-801, 20 мкМ; (2) CNQX, 20 мкМ; (3) MCPG, 20 мкМ; (4) Verapamil, 100 мкМ; (5) TNP-ATP triethylammonium sah, 20 мкМ; (6) Suramin hexasodium sah, 100 мкМ; (7) 2-APB, 100 мкМ; (8) Dantrolene, sodium salt, 30 мкМ; (9) CGP 37157, 10 мкМ; (10) -регистрация при добавлении в перфузионный раствор всех вышеперечисленных веществ (11) бескальциевый перфузионный раствор. Пунктирная линия - контрольные значения Ca2* активности при регистрации с добавлением в перфузионный раствор ТТХ, 1 мкМ. ***р<0,001; * р<0,05, критерий Стьюдента, п=150.

Была исследована роль ионотропных и метаботропных рецепторов глутамата, потенциал зависимых Са + каналов Ь-типа, пуринергических рецепторов, рецепторов инозитол три фосфата и рианодина, ТИРС каналов, а также митохондриального

Иа+/Са2+ обменника, работа которых приводит к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ (рис.14). Проведенные эксперименты показали, что в возникновении Са2+ осцилляций в пирамидных нейронах большую роль играют ионотропные и метаботропные рецепторы глутамата и потенциал зависимые Са каналы Ь-типа. В генерацию Са2+ осцилляций в интернейронах вносят большой вклад ионотропные рецепторы глутамата и потенциал зависимые Са2+ каналы Ь-типа. При оценке вклада данных рецепторов и каналов в генерацию Са2+ осцилляций в астроцитах, достоверно значимых различий показано не было. Также было показано значительное снижение Са2+ активности клеток при регистрации с добавлением в перфузионный раствор блокаторов и антагонистов всех исследуемых каналов и рецепторов. Полное исчезновение Са2+ осцилляций в клетках поля САЗ наблюдалось только при регистрации активности клеток в бескальциевом растворе.

Таким образом, Са2+ сигнализация в развивающемся мозге - это сложный многокомпонентный процесс, вовлекающий различные рецепторные системы, способные к взаимозамещению при нарушении нормального функционирования одной или нескольких из них.

ВЫВОДЫ

1. Параметры Са2+ осцилляций клеток САЗ поля срезов гиппокампа изменяются в зависимости от периода раннего постнатального онтогенеза крыс: с увеличением возраста животного происходит повышение длительности и снижение частоты спонтанных изменений концентрации внутриклеточного Са2+, как в нейронах, так и астроцитах;

2. Са2+ активность нейронов САЗ поля срезов гиппокампа крыс зависит от уровня метаболизма, обусловленного температурой перфузионного раствора: количество Са2+ осцилляций повышается с изменением температуры перфузионного раствора с 24°С до 35°С во всех возрастных группах животных, длительность Са2+ осцилляций в ответ на изменение температуры нелинейно варьирует в зависимости от этапа постнатального онтогенеза животного;

3. Усиление метаболизма при повышении температуры перфузионного раствора с 24°С до 35°С не влияет на количество и длительность Са2+ осцилляций в астроцитах срезов САЗ поля гиппокампа крыс (Р5-8 и Р21-25), но вызывает снижение длительности и повышение частоты Са2+осцилляций у крыс группы Р14-16;

4. При нарушении проведения возбуждения в нейронной сети происходит снижение спонтанной Са2+ активности, как нейронов, так и астроцитов САЗ поля срезов гиппокампа крыс Р5-8 (снижение количества Са2+ осцилляций: пирамидные нейроны - на 95%, интернейроны - на 83%, астроциты - на 38%), 14-16 (количества Са2+ осцилляций: пирамидные нейроны - на 62%, интерней|>оны - на 69%, астроциты -на 61%), в то время как отсутствуют изменения в Са* активности нейронов и астроцитов САЗ поля срезов гиппокампа крыс Р21-25.

5. На раннем (Р5-8) этапе неонатального постнатального онтогенеза Са активность клеток зависит от наличия сетевой активности при отсутствии афферентации. На позднем (Р21-25) этапе неонатального периода постнатального онтогенеза Са2+ активность клеток в условиях отсутствия афферентации низка и сетевая Са2+ активность появляется только в присутствии раздражителя.

6. Характеристики Са2+ осцилляции в САЗ поле срезов гиппокампа изменяются при воздействии возбуждающих нейротрансмиттеров АТФ, L- глутамата (увеличение количества Са2+ осцилляций при добавлении АТФ: в пирамидных нейронах на 100%, в интернейронах на 85%, в астроцитах в 2 раза; при добавлении L-глутамата: в пирамидных нейронах на 71%, в интернейронах на 42%, в астроцитах на 100%).

7. В возникновении Са2+ осцилляций в нейронах поля САЗ гиппокампа крыс Р21-25 основную роль играют ионотропные и метаботропные рецепторы глутамата, а также потенциал зависимые Са2+ каналы L-типа.

Практические рекомендации

1. Исследование особенностей Са2+ активности клеток поля САЗ гиппокампа крыс раннего (Р 5 - 8; Р 14 - 16) и позднего (Р 21 - 25) этапов неонатального периода постнатального онтогенеза может быть использовано при проведении тестирования лекарственных средств и кормовых добавок для молодняка сельскохозяйственных животных в лечебно-профилактических целях.

2. Результаты диссертационного исследования могут быть использованы в образовательном процессе для студентов и аспирантов биологических и ветеринарных специальностей в качестве специальных курсов лекций и лабораторных практикумов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Калинцева (Митаева), Я.И. Спонтанная и вызванная глутаматом кальциевая астроцитарная активность в переживающих срезах гиппокампа крыс. / Я.И. Калинцева (Митаева), A.B. Потанина, A.C. Пимашкин, И.В. Мухина, В.Б. Казанцев, Ю.Н. Захаров, A.B. Семьянов // Вестник Московского Университета. - 2011. - Серия 16 Биология -№2. - С. 55-56.

2. Калинцева (Митаева), Я.И. Флуоресцентный сканирующий мониторинг кальциевой активности нейронов гиппокампа при последовательном воздействии модуляторов синаптической передачи / Ю.Н. Захаров, A.B. Ершова, Я.И. Калинцева (Митаева), И.В. Мухина // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. - 2011. - Серия Радиофизика-№ 5. - С. 146-151.

3. Калинцева (Митаева), Я.И. Оценка динамики функционального состояния диссоциированной культуры клеток гиппокампа in vitro / E.B. Митрошина, M.B. Ведунова, O.B. Широкова, Я.И. Калинцева (Митаева), Ю.Н. Захаров, И.В. Мухина // Вестник Нижегородского Государственного Университета им.Н.И. Лобачевского. -2011. - Серия Биология - № 2(2). - С. 283-286.

4. Калинцева (Митаева), Я.И. Флуоресцентный анализ паттернов метаболической активности нейрон-глиальной сети / Ю.Н. Захаров, Е.В. Митрошина, М.В. Ведунова, С.А. Коротченко, Я.И. Калинцева (Митаева), A.B. Потанина, И.В. Мухина // Оптический журнал. - 2012 - Т.79- № 6. - С.47-51.

Публикации в научных журналах, сборниках научных статей, материалах

конференций:

5. Калинцева (Митаева), Я.И. Изменение астроцитарной кальциевой активности в переживающих срезах гиппокампа крыс под действием разных концентраций

глутамата / Я.И. Калинцева (Митаева), A.B. Потанина, A.C. Пимашкин, A.B. Семьянов // Сборник тезисов докладов конференции молодых ученых «Нелинейные волны-2010». Н.Новгород. - 2010,- С.49.

6. Калинцева (Митаева), Я.И. Изменение спонтанных кальциевых осцилляций астроцитов гиппокампа крыс разного возраста / A.B. Потанина, Я.И. Калинцева (Митаева), A.C. Пимашкин, A.B. Семьянов // Сборник тезисов докладов конференции молодых ученых «Нелинейные волны-2010». Н.Новгород. - 2010. - С. 105.

7. Калинцева (Митаева), Я.И. Изменение астроцитарной кальциевой активности в переживающих срезах гиппокампа крыс под действием разных концентраций глутамата // Сборник тезисов докладов XVII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», секция «Биология». Москва.-2010.-С. 222.

8. Калинцева (Митаева), Я.И. Изменение астроцитарной кальциевой активности в переживающих срезах гиппокампа крыс под действием разных концентраций глутамата / Я.И. Калинцева (Митаева), A.B. Потанина, A.C. Пимашкин, A.B. Семьянов // Сборник тезисов докладов 14 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино. - 2010 - С. 107.

9. Калинцева (Митаева), Я.И. Изменение спонтанных кальциевых осцилляций астроцитов гиппокампа крыс в онтогенезе / A.B. Потанина, Я.И. Калинцева (Митаева), A.C. Пимашкин, A.B. Семьянов // Сборник тезисов докладов 14 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино. - 2010 - С.215.

10. Калинцева (Митаева), Я.И. Изменение астроцитарной кальциевой активности в переживающих срезах гиппокампа крыс под действием разных концентраций глутамата / Я.И. Калинцева (Митаева), A.B. Потанина, A.C. Пимашкин, И.В. Мухина, В.Б. Казанцев, Ю.Н. Захаров, A.B. Семьянов // Сборник тезисов докладов III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов -биологов «Симбиоз-Россия 2010». Нижний Новгород. -2010 -С. 171.

11. Калинцева (Митаева), Я.И. Изменение спонтанной кальциевой активности нейронов и астроцитов гиппокампа крыс в период постнатального онтогенеза / A.B. Потанина, Я.И. Калинцева (Митаева), A.C. Пимашкин, И.В. Мухина, В.Б. Казанцев, Ю.Н. Захаров, A.B. Семьянов // Сборник тезисов докладов III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов - биологов «Симбиоз-Россия 2010». Нижний Новгород. - 2010 - С. 184.

12. Калинцева (Митаева), Я.И. Изменение спонтанной кальциевой активности астроцитов переживающих срезов гиппокампа крыс в период постнатального онтогенеза / A.B. Потанина, Я.И. Калинцева (Митаева), A.C. Пимашкин, Ю.Н. Захаров, И.В. Мухина, В.Б. Казанцев, A.B. Семьянов // Сборник тезисов - БиоН Нейротехнологии. Москва. - 2010. - С. 23-24.

13. Калинцева (Митаева), Я.И. Приготовление переживающих срезов мозга крыс / Я.И. Калинцева (Митаева), И.В. Мухина, A.B. Семьянов // Учебно-методическое пособие. - Нижний Новгород: Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского.-2011,-С. 1-36.

14. Калинцева (Митаева), Я.И. Кальциевый имиджинг в клеточных культурах и тканях / Е.В. Митрошина, М.В. Ведунова, Я.И. Калинцева (Митаева) // Учебно-методическое пособие. - Нижний Новгород: Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского. — 2011.- С. 1-28.

15. Kalintseva (Mitaeva), Y.I. Neuroscience imaging information content enrichment by nonlinear and phase-sensitive photonics / I.V. Mukhina, Y.I. Kalintseva (Mitaeva), V.V. Lobyntseva, Yu.N. Zakharov // IEEE Conference Proceedings: Information Photonics (IP), 2011 ICO International Conference on Issue Date: 18-20 May 2011. On page(s): 1 - 2. Print ISBN: 978-1-61284-315-5.

16. Калинцева (Митаева), Я.И. АТФ индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах гиппокампа крыс / Я.И. Калинцева (Митаева), А.В. Потанина, И.В. Мухина // Сборник тезисов трудов конференции. «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация». Пущино. - 2011. -С. 114.

17. Kalintseva (Mitaeva), Ya.I. Monitoring of function network activity in vitro / I.V. Mukhina, A.S. Pimashkin, E.A. Koriagina, E.V. Mitroshina, Ya.I. Kalintseva (Mitaeva), Yu.N. Zakharov, V.B. Kazantsev // Proceeding "Topical Problems of Biophotonics — 2011", St. Peterburg - Nizhny Novgorod, Russia, 16-22 July, 2011. - P. 242-243.

18. Калинцева (Митаева), Я.И. АТФ индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах гиппокампа крыс / Я.И. Калинцева (Митаева), А.В. Потанина, И.В. Мухина // Сборник докладов международной научной конференции и молодежной школы "На пути к нейроморфному интеллекту: эксперименты, модели и технологии". Н.Новгород. - 2011 - С. 11-12.

19. Калинцева (Митаева), Я.И. АТФ индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах гиппокампа крыс / Я.И. Калинцева (Митаева), И.В. Мухина // Сборник тезисов докладов конференции молодых ученых «Нелинейные волны-2012». Н.Новгород. - 2012 - С.58-63.

20. Mitaeva, Y.I. ATP-induced calcium signaling in rat hippocampal cells / Y.I. Mitaeva, A.M. Mozherov, I.V. Mukhina // Proceeding "Topical Problems of Biophotonics — 2013", Nizhny Novgorod, Russia, 21-27 July, 2013. - P. 241-242.

21. Kalintseva (Mitaeva), Ya.I. Microelectrode arrays and Ca2+ imaging in combination with in vitro model of stroke as a tool to investigate pathological changes in network activity / I.V. Mukhina, M.V. Vedunova, E.V. Mitroshina, T.A. Sakharnova, Ya.I. Kalintseva (Mitaeva), Yu.N. Zakharov, A.S. Pimashkin, V.B. Kazantsev // Proceeding "Topical Problems of Biophotonics — 2013", Nizhny Novgorod, Russia, 21-27 July, 2013. - P. 245-247.

22. Митаева, Я.И. Изменение Ca2+ сигнализации клеток поля САЗ гиппокампа крыс разных возрастных групп в зависимости от t° перфузионного раствора и при блокаде Na+ каналов / A.M. Можеров, Я.И. Митаева, И.В. Мухина // Сборник тезисов Форума молодых учёных Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского. Н. Новгород - 2013 - С. 33.

23. Mitaeva, Y.I. Network Ca2+-cell activity field CA3 hippocampal slices of rat early and late postnatal development / Y.I. Mitaeva, A.M. Mozherov, I.V. Mukhina // Proceeding of the International Scientific School "Frontiers in Modern Neuroscience", Nizhny Novgorod, Russia, 15-18 June, 2014. - P. 22-23.

24. Mitaeva, Y.I. Temperature-dependent changes in Ca2+-cell activity field CA3 hippocampal slices of rat early and late postnatal development / A.M. Mozherov, Y.I. Mitaeva, I.V. Mukhina // Proceeding of the International Scientific School "Frontiers in Modern Neuroscience", Nizhny Novgorod, Russia, 15-18 June, 2014. - P. 25-26.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЦНС - центральная нервная система Р - день постнатального развития АТФ (АТР) - аденозин три фосфат NMDA - N - метил - D - аспартат

АМРА - 2 - альфа - амино - 3 - гидрокси - 5 - метил - 4 - изоксазольпропионовая кислота

КА - каиновая кислота

mGluR - метаботропные рецепторы глутамата

OG - Oregon Green-488 В APT А-1 AM

SR - Sulforhodamine 101

ИТФ (IP3) - инозитол три фосфат

RyR - рианодиновый рецептор

TRP (transient receptor potential channels) - рецептор—активируемых неселективных Са2+ каналов

Р2Х - ионотропные пуринергические рецепторы P2Y - метаботропные пуринергические рецепторы

Подписано в печать 8.12.2014 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1. Заказ № 728. Тираж 85 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ННГУ им. Н.И. Лобачевского. 603000, г. Нижний Новгород, ул. Б. Покровская, 37