Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли метаботропных глуматных рецепторов в модуляции синаптической передачи в мотонейронах изолированного спинного мозга

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли метаботропных глуматных рецепторов в модуляции синаптической передачи в мотонейронах изолированного спинного мозга"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ ИМЕНИ И.М. СЕЧЕНОВА

РГб од

На правах рукопис! УДК 612.832+612.815.:-

МЕЛЬЯН Зарэ Эннэевна

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ МЕТАБОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В МОДУЛЯЦИИ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ В МОТОНЕЙРОНАХ ИЗОЛИРОВАННОГО СПИННОГО МОЗГА

. ЛЯГУШКИ

03.00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ ИМЕНИ И.М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК 612.832+612.815.1

МЕЛЬ ЯН Зарэ Эпнэевна

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ МЕТАБОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В МОДУЛЯЦИИ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ В МОТОНЕЙРОНАХ ИЗОЛИРОВАННОГО СПИННОГО МОЗГА

ЛЯГУШКИ

03.00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в лаборатории эволюции межнейропного взаимодейс (заведующий - доктор медицинских наук, профессор Н.П. Веселкин) Инсти эволюционнной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Научные руководители: канд. биол. наук, ст. научный сотрудник • В.М. КОЖАНОВ

доктор биол. наук, профессор С.М. МИНАСЯН

Официальные оппоненты: доктор биол. наук, профессор С.А. ДАМБИНОВА

доктор биол. наук Н.Я. ЛУКОМСКАЯ

Ведущая организация: Институт экспериментальной медицины РАМН

Защита состоится декабря 1996г. в часов на засед

диссертационного совета К 002.89.01 в Институте эволюционной физиологи биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу. 194223, Санкт-Петербург, пр. М. То 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюцио физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова.

Автореферат разослан

•Я-

ноября 1996 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.В. ЗУЕВА

al., 1985) и последующая идентификация различных подтипов (Harvey et aJ., 1991; Eaton el al., 1993; Jane et al., 1994, 1995; Kemp et al., 1994; Bond & Lodge, 1995; Bushell et al., 1995; Roberts, 1995; Salt & Eaton, 1995a, 1995b; Salt & Turner, 1996; Thompson et al., 1995; Thoreson et al., 1995; Vignes et al., 1995) метаботропных глутаматных рецепторов (мГлуР), повлекли за собой интенсивные исследовашм их структуры, фармакологии и роли в центральной нервной системе позвоночных животных. Оказалось, что активация мГлуР приводит к запуску определенных ферментативных систем, осуществляющих ряд метаболических реакций, посредством которых происходит регуляция различных клеточных событий, включая модуляцию синаптической передачи. Исследования последних лет показали, что метаботрогтные глутаматные рецепторы играют важную роль в развитии таких форм синаптической пластичности, как долговременная потенциация и депрессия. Активация мГлуР необходима для индукции и поддержания длительных изменений синаптической передачи в мозге млекопитающих (Collingridge et al., 1983; Kauer et al., 1988; Masu et al., 1991; Basbix et al., 1993; Bonolotto & Collingridge, 1993, 1995; Linden, 1994; Collins, 1994; ffirano et al., 1994; Shigemoto et al., 1994 и т. д.).

Исследования, касающиеся роли метаботропньк глутаматных рецепторов в центральной нервной системе низших позвоночных, немногочисленны. Недавно Krieger с соавторами сообщили о присутствии этих рецепторов в спинальных нейронах миноги и их участии в регуляции двигательной активности (Krieger et al., 1994; 1995).

Предположение относительно вовлечения мГлуР в модуляторные процессы в спинном мозге лягушки впервые было высказано в работах (Nakamura et al., 1993; Курчавый и др., 1995), где исследовалось влияние глутамата на возбуждающие постсинаггтические потенциалы (ВПСП), вызванные в мотонейронах в ответ на раздражение латеральных столбов, ретикулярной формации (РФ) и дорсального корешка (ДК). Впоследствии было показано, что активация мГлуР также увеличивает амплитуду ВПСП в мотонейронах лягушки (Gotani et al., 1995).

Учитывая все вышесказанное, в настоящее время представляется весьма актуальным исследование роли метаботропных глутаматньсх рецепторов в процессах синаптической пластичности в спинном мозге лягушки.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Целью настоящего исследования явилось изучение роли метаботропных глутаматных рецепторов в модуляции синаптической передачи в мотонейронах спинного мозга лягушки.

з

ОСНОВНЬЕ ЗАДАЧИ:

1. Провести детальное исследование влияния агонистов и антагонистов мГлуР посттетанические изменения моно- и полисинаптических ВПСП, вызванных в поясшгчи мотонейронах спинного мозга лягушки в ответ на раздражение РФ и ДК.

2. Применяя специфические блокаторы различных групп, попьгтат идентифицировать подтип(ы) мГлуР, участвующих в модуляции постгетаничеы потенциации (ПТП) и депрессии (ЛТД) сннаптической передачи в мотонейронах.

3. Провести анализ изменений спонтанных и миниатюрных постсиналтичеа потенциалов, а также облегчения ответов на парные стимулы на фоне блокады мГлу! целью выявления локализации этих рецепторов на ггре- и/или постсиналтичеа элементах мембраны.

4. Исследовать влияние антагонистов NMDA и ГАМК рецепторов на ПТП и Г РФ и ДК ВПСП на фоне блокады мГлуР с целью выяснения участия возбуждающи тормозных ионотропных рецепторов в исследуемых процессах.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ:

1. Четко показано вовлечение метаботропных глутаматных рецепторов в модуля1 синаптической передачи в ретикулоспинальных и дорсальнокорешховых синапсах мотонейронах спинного мозга лягушки.

2. Впервые зарегистрированы длительные изменения возбуждающей синаптичес передачи в ответ на тетаническое раздражение ретикулярной формации и дорсалы корешка в мотонейронах лягушки на фоне блокады метаботропных глутамат рецепторов.

3. Идентифицированы подтипы метаботропных глутаматньсх рецепто участвующие в модуляции длительности посттетанических изменений синаптиче< передачи в мотонейронах и сделана попытка установить уровни их локализаци пределах синапса.

4. Установлена роль NMDA рецепторов, участвующих в развитии длител! пластических изменений в мотонейронах на фоне блокады метаботропных глутамат рецепторов.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Резуль проведенного исследования представляют интерес для общей нейрофизиолс нейробиологии и физиологии нервной клетки. Они расширяют имеющиеся представл о функциональных принципах организации межнейронных синаггтических связ< центральной нервной системе позвоночных, имеют существенное значение для выяси механизмов таких физиологических феноменов как долговременная потенциащ

депрессия, лежащих, как известно, в основе процессов памяти, обучения, функционирования некоторых сенсорных систем, в частности, в ноцицепции.

Полученные данные важны для понимания общих механизмов функционирования достаточно недавно идентифицированной фрахцнл метаботрошгых рецепторов, участвующих во многих физиологических и биохимических процессах не только в нервной системе, но и в гуморальной регуляции организма.

V съезде армянского физиологического общества (Ереван, 1994г), на конференции молодых физиологов и биохимиков России "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций" (Санкт-Петербург, 1995г, 19-21 сентября), на симпозиуме "Presynaptic mechanisms of neurotransmission" (San Diego, USA, 1995, 9-11 November), на I (ХГ) международном совещаншг по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 199бг, 22-26 апреля).

выводов н списка литературы. Изложена на 137 страницах машинописного текста, иллюстрирована 40 рисунками и 5 таблицами. Библиография включает 163 наименования.

Эксперименты проводились на препаратах изолированного спинного мозга-ствола ля1ушек Rana ridibunda. Животные обоего иола, весом 50-150 г подвергались эфирному наркозу, после чего производилась дорсальная ламинэктомия на всем протяжении спинного мозга и вплоть до зрительных бугров ствола головного мозга. Костная пластина с обнаженным мозгом вырезалась и помещалась в промежуточную препаровальную ванночку с раствором с охлажденным (до +4-6°С) раствором Риигера. Задние и передние корешки 9-го и 10-го сегментов, соответствующие поясничному утолщению левой стороны обрезались дистально. Все остальные корешки и нервы, связывающие мозг с костной пластиной, перерезались. После этого мозг переносили в экспериментальную сильгардовую камеру. Затем производилась сагиттальная гемнсекцня спинного мозга до уровня 5-6-го сегментов и перерезка дорсальных столбов на уровне 3-4-го сегментов. Мозг с помощью тонких прямых к загнутых иголок фиксировался в камере таким образом, чтобы нижняя его часть примерно до 7-го сегмента лежала медиальной стороной (т. е. стороной гемисекции) вверх, а ствол располагался вверх дорсальной стороной. Такое расположение мозга позволяло свободно вводить микроэлектрод в ткань, избегая предварительного снятия мягких оболочек с целью наименьшего травмирования

.. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на

; Основные результаты диссертации отражены в семи публикациях.

. Диссертация состоит нз введения, 6 глав,

МЕТОДИКА И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

днстальных дендритов мотонейронов, достигающих почти что поверхности спинного мо с латеральной стороны.

Корешки полностью освобождались от твердой мозговой оболоч] приподнимались над раствором и укладывались на позолоченные электроды. Кажд передний и задний корешок спинного мозга лежал на трех электродах, два из котор (проксимальные) использовались для биполярного раздражения, а третий (дистальньш для монополярной регистрации корешковых потенциалов. После завершения в< описанных процедур по корешковым потенциалам проверялось функционалы состояние мозга.

Перфузия мозга осуществлялась раствором Рингера следующего состава (в mMj NaCl - 98, KCl - 2, NaH2P04 - 1.4, Na2HP04 - 1.6, NaHC03 - 9.3, MgCl2 - 0.5, глюкоза ■ СаСЬ - 1.1 (pH=7.4-7.6). Температура раствора в камере постепенно доводилась до 18°С. Для поддержания постоянной температуры раствора использовали охлаждаюа столик. Раствор постоянно аэрировался карбогеном (смесь 02 - 98% и С02 - 2%).

Для проведения фармакологических тестов использовался тот же раствор добавлением общего агониста метаботрошгых глутаматных рецепторов - (±] аминоцюслопентан-транс-1,3-дикарбоксилата (tACPD; TOCRIS; 50 мхМ), специфическ агониста III группы мГлуР - Ь-2-амнно-4-фосфонобутирата (L-AP4; TOCRIS; 1 м1 антагонистов метаботропньсх глутаматных рецепторов широкого спектра действия - (+' метнл-4-карбокснфенилглицина ((+)-MCPG; TOCRIS; 100 мкМ) и (RS)-; дипщроксифенилглицина ((RS)-MCPG; TOCRIS; 125 мкМ), специфических блокато двух классов мГлуР - (25,35,45)-2-метил-2-(карбоксициклопропил)глнцина (МС( TOCRIS; 200-400 мкМ) (антагонист ACPD-чувствительных мГлуР) и (5)-2-амино-2-мет 4-фосфонобутирата (МАР4; TOCRIS; 25 мкМ) (антагонист Ь-АР4-чувствительных мГл) блокатора NMDA рецепторов - (±)-2-амино-5-фосфонопентанат (АР5; RBI; 50 мкМ) также глутамата (Глу; SIGMA; 1 мМ), тетродотоксина (ТТХ; SIGMA; 1.5 мкМ), пикротоксина (РТХ; SIGMA; мкМ). В части экспериментов для с ниже] полисинаптической активности использовали мефенезин (SIGMA; 1.5-1.8 мМ) (Бег; 1949; Floeter & Lev-Tov, 1993; Pinco &. Lev-tov, 1993), который также добавляла перфузирующий раствор.

Внутриклеточное отведение от мотонейронов 9-10 поясничных сегментов спинн мозга производилось со стороны гемисекции с помощью микроэлектродов, заполнен! ЗМ раствором KCl, с диаметром кончика 1-1.5 мкм и сопротивлением 7-15 МОм.

Регистрировали возбуждающие постсннаптические потенциалы от д синаптических входов (афферентного и ретикулоспинальиого), а также спонтам (сПСП) и миниатюрные постсннаптические потенциалы (мПСП). При стимуля:

дорсального корешка генерировались ДК ВПСП, а при стимуляции ретикулярной формации ствола - РФ БПСП. Раздражение РФ производилось биполярным электродом, сделашгьш из изолированной на всем протяжении и оголенной на торцах нихромовой проволоки толщиной 100 мкм. Размер электростатически заточенных кончиков составлял примерно 50-60 мкм, расстояние между ними составляло 500 мкм. Устанавливался он так, что его полюс располагался вдоль продольной оси мозга. Стимуляция спинномозговых корешков и ретикулярной формации производилась через радиочастотный выход стимулятора ЭСУ-1, соединенный с коммутатором, прямоугольными импульсами длительностью 0.1 мс с силой не более 50-60 мкА.

Регистрация всех сигналов производилась монополярно относительно индифферентного электрода, который погружался в раствор, омывающий мозг. Усиленные сигналы подавались на осциллограф С-1-69, который использовался для визуального наблюдения. С осциллографа через согласующий усилитель сигналы подавались на компьютер IBM РС-386, США. Мембранный потенциал (МП) клеток контролировался по цифровому милливольтметру и регистрировался при помощи самописца КСП4. Спонтанные постсиналтические потенциалы и сопротивление мембраны, регистрируемое в некоторых опытах, также выводились на самописец.

Наблюдение и запись потенциалов осуществлялась регистрирующей программой XS2. Для синаптических потенциалов регистрировались выборки из 20-ти пробегов (3000 точек в пробеге, интервал между точками - 50 мке), для потенциалов действия - выборки из 5-ти пробегов (1000 точек, 50 мке), для спонтанных и миниатюрных синаптических потенциалов - 120 пробегов (9000 точек, 50 мке).

Для анализа синаптических потенциалов и потенциалов действия использовали две анализирующие программы: POTENTL9 (разработана в лаборатории эволюции межнейронного взаимодействия института Эволюционной физиологии и биохимии им И.М. Сеченова А.Э. Дитятевым) и CLAMPF1T пакета PCLAMP 6.2., которые позволяли измерять параметры исследуемых потенциалов, осуществлять усреднение и вычитание данных, а также проводить графический анализ полученных результатов. Для построения графиков и диаграмм пользовались также программой SIGMAPLOT для WINDOWS. Компьютерный анализ миниатюрных постсинаптических потенциалов производился с помощью модифицированной программы Анкри и др. (Ankri et al., 1994). Документальную запись осуществляли лазерным принтером EPSON epl-7100, США.

МОДУЛЯЦИЯ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ В МОТОНЕЙРОНАХ ЛЯГУ1Ш В УСЛОВИЯХ БЛОКАДЫ МЕТАБОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ МС

Влияние блокады мГлуР на потенинацию ВПСП, вызванную глутаматом. В мотоненронах исследовалось влияние антагонистов метаботропных глутамат! рецепторов алгрокого спектра действия - (К5)-3,5-дигидроксифенилглицина ((КЗ)-МС1 125 мкМ) и его более активного изомера (+)-а-метил-4-карбокснфенилглицнна (I МСРС; 100 мхМ) на потенциацию РФ и ДК ВПСП, вызванную приложением глутам; Кратковременная аппликация I мМ глутамата вызьшала во всех зарегистрирован! клетках деполярнзацнонный ответ, по мере нарастания которого наблюдал значительное увеличение амплитуды моно- и полисинаптических ДК и РФ ВПСП, а та] увеличение амплитуды и частоты спонтанных ПСП. В присутствии одного из антагонис мГлуР ((ДБ)- или (+)-МСРС), аппликация глутамата также вьгзьшала в мотонейр деполяризационньш ответ, однако потенциации моносинаптических РФ ВПСП (п=5 этих условиях не наблюдалось. Что касается ДК ВПСП, то здесь подобный эфс£ блокады мГлуР на глутамат-вызванную потенциацию наблюдался в 1 из зарегистрированных клеток. Более того, в отдельных случаях отмечалась депрессия ВПСП - 44%±5.4 (п=3) и ДК ВПСП - 25% (п=1). Амплитуда спонтанных ПСП при э не увеличивалась, а в отдельных случаях даже снижалась.

Влияние блокады мГлуР на длительность ПТП и ПТД возбуждающей синаптичес П£р£Яанн. В 18 мотонейронах (МП=60-80 мВ) было исследовано влияние МСРв процессы посттетанкческой потенциации (ПТП) и депрессии (ПТД) ДК и РФ ВП Тетаническое раздражение (5 стимулов с частотой 100 Гц, 5 раз в сек в течение I к РФ и ДК вьоьшало в клетках кратковременную потенциацию (РФ ВПСП - 86.3±48. п=3; ДК ВПСП - 31 А±9%, п=3) или депрессию (РФ ВПСП - 51.2±14.1%, п=10; ДК ВГ - 4б.8±23%, п=2) моносинаптических ВПСП. Латентньш период РФ ВПСП составят 2.8 мс, ДК ВПСП - 1.3-1.8 мс. Амплитуда ВПСП возвращалась к норме в течение 1: мин.

Добавление в перфузирующий раствор 100 мкМ (+)-МСРО или 125 мкМ С МСРй (время экспозиции 20-25 мин) не оказывало существенного влияния на ампли ВПСП, за исключением отдельных случаев, когда наблюдалась незначительная депре* (менее 5%). Сопротивление мембраны при аппликации тахже МСРО не изменялось, изомера во всех исследованных клетках оказывали идентичное действие и приводи/ увеличению длительности ПТП и ПТД. Этот эффект сохранялся в течение всего пер1 регистрации - 1.5-14 ч. Максимальная величина ПТП на фоне действия МСРС состав 236.7±191.3% (п=3) для РФ ВПСП и 71.3±44.5% (п=3) для ДК ВПСП, максимал

величина ПТД РФ ВПСП - 63.1±21.6% (п=Ю), ДК ВПСП - 60.7±11.7% (п=2). Примерно через 5 мин после тетанического раздражения значения потенниации и депрессии уменьшались, образуя плато (ПТП РФ ВПСП - 143.4+44.1%, ДК ВПСП - 41.8±9.1%; ПТД РФ ВПСП - 46.6+3.5%, ДК ВПСП - 44.9±5.1%. Повторная тетаническая стимуляция (применение 2-3-х последовательно прилагаемых тетанусов) в контрольных экспериментах подобных эффектов не вызывала.

В 7 экспериментах одновременно исследовалось влияние MCPG на ПТП н ПТД моно- и полиснналтических ВПСП. Динамика постгетанических изменений моно- и полисиналтической передачи в мотонейронах была примерно одинаковой. Тем не менее, величина ПТП/ПТД полиснналтических ВПСП превышала значения ПТП/ПТД моносинаптической возбуждающей передачи. Средний уровень потенцнацин в этих экспериментах составлял: для моносинаптических РФ ВПСП - 64.3+66.2% (п=2), ДК ВПСП - 15.4+9% (п=1); для полиснналтических РФ ВПСП - 221.6+105.2%, ДК ВПСП -76.6+12.4% (усреднение по 3-м точкам плато). Средние значения депрессии: для моносинаптических РФ ВПСП - 24.6+14.9% (п=3), ДК ВПСП - 28.7+2.1% (п=1); для полиснналтических РФ ВПСП - 35.9±22.8%, ДК ВПСП - 55.2+5.4%. После добавления в раствор одного из блокаторов мГлуР значения ПТП составили: для моносинаптических РФ ВПСП - 215.2±171.4% (п=2), ДК ВПСП - 16.5±7.8% (п=1); для полиснналтических РФ ВПСП - 317.9±213.9%, ДК ВПСП - 58.9±38.5%. Величина ПТД: для моносинаптических РФ ВПСП - 36.1±11.6% (п=3), ДК ВПСП - 40+4.6% (п=1); для полисинаптических РФ ВПСП - 61.9+16.9%, ДК ВПСП - 50±11%.

Влияние MCPG на фасилитаиию_моносинаптических_ШЗСД. В 7 опытах

исследовалось влияние MCPG на ВПСП, вызванные в мотонейронах в ответ на парную стимуляцию ретикулярной формации. Парное раздражение в норме обычно приводило к потенциацни амплитуды ВПСП, вызванного в ответ на второй стимул. Это явление, известное под названием синаптического облегчения (или фасилитации), отражает изменение выброса передатчика из пресинаптической терминали. Изменение фасилитации может служить в качестве индикатора пресинаптической локализации исследуемого эффекта. В наших экспериментах добавление в раствор одного из блокаторов мГлуР (100 мкМ (+)-MCPG или 125 мкМ (RS)-MCPG) приводило к увеличению фасилитации моносинаптических РФ ВПСП во всех исследованных клетках. Уровень фасилитации (отношение амплитуды ВПСП2 к ВПСП1) в норме составлял 1.17±0.13 (п=7), тогда как на фоне действия MCPG он был равен 1.30±0.08 (р<0.005; п=7).

Влияние MCPG на спонтанные и миниатюрные ПСГ1. В 8 клетках из 11 MCPG обратимо увеличивал частоту спонтанных постсинаптических потенциалов. В двух опытах, после блокады спайк-обусловленных ответов тетродотоксином (1.5 мкМ), в

мотонейроне регистрировались миниатюрные ПСП. Частота мПСП после воздействия ] мкМ (+)-МСРО заметно снижалась (на 53.7±23.3%, п=2), тогда как амшигг миниатюрных ПСП уменьшалась незначительно (на 4.2+2.3%, п=2).

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОДТИПОВ МЕТАБОТРОПНЬ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В МОДУЛЯЦИИ ДЛИТЕЛЬНОС ПЛАСТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ В МОТОНЕЙРОН,

Исследование роли подтипов III_группы мГлуР_в модуляции длительно

блокатора П1 группы мГлуР, связанной с сАМР-каскадом метаболических реакций, М/ на потенцнацию или депрессию, вызванные в мотонейронах в ответ на тетаничео стимуляцию ретикулярной формации и дорсального корешка. Во всех опы использовали тот же протокол тетанического раздражения, что и в эксперимента; МСРО. В норме тетаническая стимуляция РФ индуцировала депрессию (37.7±20%, п или потенцнацию (35.3%, п=1) моносинаптических ВПСП. Тетаническая стимуля дорсального корешка в 3 клетках из 5 вызывала депрессию (43.1±19.1%, г моносинаптических ВПСП, тогда как в остальных наблюдалась потенциация (78.2%±5 п=2). В течение 20-40 минут амплитуда РФ и ДК ВПСП полностью восстанавливал Аппликация 25 ¡.(кМ МАР4 (20 мин) приводила к увеличению длительности пластичес изменений во всех исследованных мотонейронах. Эффект сохранялся в течение в< периода регистрации (1.5-3 ч). Величина ПТД РФ ВПСП в присутствии МАР4 состав! 55.3±27% (п=2), ДК ВПСП - 62.6±3.6% (п=3). Значения ПТП составляли: 31.8% (п=1) РФ ВПСП и 72.2+21.1% (п=2) для ДК ВПСП.

В 3 клетках из 5 добавление в перфузирующий раствор МАР4 приводил' небольшому увеличению амплитуды моносинаптических ДК ВПСП (13.5±7.3%), тогда в двух остальных - отмечалась депрессия (17% и 3%). Амплитуда моносинаптических ВПСП под воздействием МАР4 возрастала во всех зарегистрированных клетках (9±5.

В 5 экспериментах исследовалось влияние аппликации МАР4 на фасилита моносинаптических РФ и ДК ВПСП. Облегчение синаптической передачи в ответ парную стимуляцию во всех зарегистрированных клетках снижалось на фоне М/ Фасшштация (ВПСП2/ВПСП1) РФ ВПСП в норме составляла 1.19±0.15 (п=3), а т добавления в раствор МАР4 - 1.06±0.15 (р<0.02; п=3). Что касается ДК ВПСП, то зде

ЛЯГУШКИ

Исследовалось влияние специфическ

п=3).

одном нз двух зарегистрированных мотонсйропов в норме наблюдалась незначительна.!: потенциаиня второго отпета 1.07, о во втором случае была зарстстрироваиа леирессп* ВПСП2 - 0.64. Соотношения ВПСП2/ВПСП1 после воздействия МЛР4 п этих k;iciкп\ составили 0.94 и 0.61, соответственно.

В одном опыте исследовалось влияние спецпфнческого aiomicia Ш iруппы мГтуГ L-AP4 на возбуждающие посгсннаптические потенциалы, а также на поспстанмчсскис изменения синаптической передачи, вьпванные в мотопенропе раздражением ПК Лпплнкапня 1 мМ L-AJP4 (время экспозиции 15 мин) оказывала ипгнбнруюшсс действие на моносинаппгческне ДК ВГТСП, снижая их амплитуду на 42.5%. В норме тетаннчсское раздражение (протокол тетануса тот же, что и п опытах с MCPG) дорсального корешка вызьтало в нотонейронс кратковременную депрессию сннл/ттсскпГ/ передачи (55.1 Т). Через 20 минут после тетануса амплитуда ВПСП полностью восстанавпнвапась В присутствии L-AP4 после тетанической стимуляции в клСгкс также наблюдалась депрессия (53.5%). Полггое восстановление исходной амплитуды ВПСП ил фоне действия L-AP4 происходило в течение 20 минут, так же как и в нормальном растворе.

ЦкдЕдоааицс_цади__шш1шшв_II_пшгоы—цГдуЕ_я_модуляции_длительности

связанной с фосфопиозитидным пшролизом, МССС на процессы посттстанической потеицнацни и депрессии исследовалось в 6 поясничных мотопейронах. Существенного влияния на амплитуду моносинаптнческих ВПСП, зарегистрированных в ответ па стимуляцию обоих входов (нисходящего и афферентного), это вещество не оказывало 11 случае РФ ВПСП во всех зарегистрированных клетках наблюдалась незначительная депрессия (4 5 + 3%, п=3). ДК ВПСП в двух клетках из 3 под воздействием МСС С не щмспялись, а в одном мотонейроне наблюдалась небольшая потеппплпмя отпета - I -УЬ Тетапнческая стимуляция ретикулярной формации в норме приводила к посгтетпиичсскоп депрессии (45 3+0.4%) в 2 случаях из 3. В одной клетке отмечалась потгпннаннч (135.5%). Полное восстановление амплитуды происходило в течение 25-35 мин При теташпеском раздражешш дорсального корешка во всех зарегистрированных клетках наблюдалась депрессия (29 9± 15.6%, п = 3). В течение 20-25 минут амплитуда ИНГИ возвращалась к исходному уровню. При добавлении в перфузируюшнн раствор 'НЮ чкМ МССС (20-25 мин) длительность посттеталнческой потенпиапипУдспрсссин РФ и ПК ВПСП не изменялась. Величина депрессии РФ (46.2+10.6%. п=2) и ДК ВПСП (27.5+15.4%, п=3) по амплитуде также мало отличилась от нормы, хотя потсипнапня РФ ВПСП была больше, чем в нормальном растворе (225.1%, п=1)

В 10 поясничных мотопейронах исследовали плпяшге активации П группы чГлуР ня процессы посттетанической потепппаннн и депресспн РФ и ЦК ВПСП При техническом

Влияние специфического блокатора II фупиы мГлуР.

раздражении ретикулярной формации в норме в 1 мотонейроне из 4 бьи зарегистрирована потенциацня ВПСП, которая составляла 100.4%, в остальных мотоненронах отмечалась депрессия - 47.7+20.8%. Тетаническая стимуляция дорсально корешка вызьшала депрессию ВПСП во всех зарегистрированных клетках (59.7±27.7i п=6). В течение 15-45 мин амплитуда РФ и ДК ВПСП полностью восстанавливала: Подобные кратковременные изменения амплитуды ВПСП регистрировались в присутств! 50 мхМ tACPD (15-25 мин). Величина посттетанической потенцнации РФ ВПС составляла 52.2% (п=1). Депрессия РФ ВПСП составляла 55.9±29.4% (п=3), депрессия J ВПСП - 57.8±26.7% (п=6). Восстановление исходной амплитуды происходило примерно то же время, что и в нормальном растворе. После возвращения амплитуды ДК и РФ норме в некоторых экспериментах в раствор, содержащий поддерживаю щ; концентрацию tACPD, добавляли 100 мкМ (+)-MCPG или 125 мкМ (RS)-MCPG. Во вс исследованных мотонейронах аппликация MCPG на фоне действия tACPD, приводила увеличению длительности ПТП и ПТД, которое сохранялось в течение всего перио регистрации (1.5-2 ч). Величина посттетанической потенциации РФ ВПСП на фо tACPD+MCPG составляла 67.7% (п=1), величина депрессии РФ ВПСП - 66.2+34.7% (п= депрессии ДК ВПСП - 80.4±18.2% (п=5). Таким образом активация II группы мГлуР длительность посттетанических изменений не влияла, однако добавление перфузирующий раствор 50 мкМ tACPD приводило к небольшому увеличению амплиту моносинаптических ВПСП. Амплитуда РФ ВПСП возрастала 2 клетках из 3 на 1б.9±9.8 амплитуда ДК ВПСП - в 5 мотоненронах из 6 в среднем на 10.2±5.4%.

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ NMDA И ГАМК РЕЦЕПТОРОВ В ПРОЦЕССАХ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ, ЗАПУСКАЕМЫХ БЛОКАДОЙ МЕТАБОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Исследование влияния блокатора NMDA рецепторов АР5 на длительно посттетанической потеннианни и пепрессии ВПСП. С целью выяснения роли NM рецепторов в индукции посттетанических изменений ВПСП, вызванных в пояснич^ мотоненронах раздражением ретикулярной формации и дорсального корен исследовалось влияние блокатора NMDA рецепторов АР5. Аппликация 50 мкМ АР течение 30-60 мин приводила к снижению NMDA-обуслоаленных компонентов ВП( тогда как амплитуда моносинаптических HeNMDA-обусловленных компонентов изменялась. Было обнаружено, что в ответ на тетаническую стимуляцию в присутствии мкМ АР5 в мотонейронах регистрируются посттетанические изменения синаптичес передачи, которые по динамике своего развития, величине и длительности не отличак

г регистрируемых в нормальном в растворе. Теталическое раздражение РФ вызывало остгетаническую депрессию во всех зарегистрированных клетках (52.1 + 19.9%, п=5). акое же раздражение дорсального корешка приводило к депрессии в 4 случаях из б !5.7±17.4%), а 2 мотонейронах наблюдалась посттеталическая потенциация ДК ВПСП -5.6±48%. Последующее добавление в перфузирующий раствор, содержащим оддерживающую концентрацию АР5, 10Ö мкМ (+)-MCPG или 125 мкМ (RS)-MCPG 1нтельнь(х изменений синаптнческой передачи не вызывало, указывая на то, что редварительная блокада NMDA рецепторов блокирует MCPG-вызванное увеличение пительности процессов посттеталнческой потешшацни/депресски в мотонейронах, аблюдаемое в случае когда NMDA рецепторы оставались интактными. Величина осггетанической депрессии РФ ВПСП составляла 47±22.2% (п=5). Посттеталическая епрессия ДК ВПСП составляла 23.1±10% (п=4), потенциация ДК ВПСП - 40.3+9.3% 1=2). Восстановление исходной амплитуды РФ и ДК ВПСП после тетануса на фоне АР5 ак в присутствии, так и в отсутствии MCPG, происходило в течение 15-35 мин.

В 4 экспериментах исследовали посттеташгческие изменения РФ и ДК ВПСП в словиях блокады NMDA рецепторов и Ь-АР4-чувствнтельных мГлуР. Предварительная пплихацня антагониста NMDA рецепторов АР5 (50 мкМ), как уже отмечалось, не казывала влияния на динамику регистрируемых в клетках посттетанических изменений озбуждающей синаптической передачи. В 3 мотокейронах. в ответ на тетаническуга тимуляцию дорсального корешха была зарегистрирована депрессия моносинаптических 1ПСП (58.4±15.6%). Добавление в раствор с поддерживающей концентрацией АР5 пецифического блокатора мГлуР II группы МАР4 в концентрации, которая без [редварительноп блокады NMDA рецепторов обычно вызывала длительные пластические вменения как РФ, так и ДК ВПСП (25 мкМ), к увеличению длительности [остсинаптических изменений не приводило. Длительность посттетанической депрессии :ак до, так и после аппликации МАР4 составляла 15-30 мин. Величина депрессии на ¡юне действия АР5 и МАР4 составляла 58.5±7.3% (п=3). То же самое наблюдалось при етанической активации ретикулоспинального входа мотонейрона. Величина депрессии 'Ф ВПСП в растворе, содержащем только АР5 составляла 60% (п=1), а после совместной лпликации АР5 и МАР4 - 54.3% (п=1). Восстановление амплитуды в обоих случаях гронсходило в течение 30-35 мин после тетанического раздражения.

Исследование влияния блокатора ГАМК рецепторов пнкротоксина на плительuacib

>ецепторов в индукции посттетанических изменений, развивающихся в ответ на ¡аздражение ретикулярной формации в поясничньсх мотонейронах спинного мозга [ягушки, в двух экспериментах тестировали влияние антагониста этих рецепторов

С целью исследования роли тормозных ГАМК

пикротокснна (PIX) на возбуждающие посгсппаитпческне потенциалы. В i мотонейронах при тстапическоп стимуляции РФ была зарегистрирована лепр (56.3+7.1%, п=2). Восстаиоплепне исходном амплитуды происходило в течение 30 у Добавление в перфузнрующнй раствор 10 мкМ Р'ГХ (время экснознинн 5-8 пин) в клетках приводило к увеличению амплитуды моиосинаптических ВПСГ1 на 31.4+1 Тетаимческая стимуляция на фоне действия РТХ также вызывала кратковременную ( 30 мин) депрессию ВПСП (51.6±14.4%, п=2). Последующее добавление в перфуэиру ряствор, солсржлщип полдержнплкнкуго концентрацию РТХ, обычной концентрации MCPG (125 мкМ) приводило к увеличению длительности посттетанической депре Амплитуда ВПСП не восстанавливалась в течение всего периода регистрации (по Величина депрессии в этих условиях составляла 69+3.2% (п=2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исследование влияния блокады мстлботропных глутаматных рецепторо глугамат-обусловлешгую потенцнацню возбуждающих постсинагтгческнх потенциал! длительность посттетапичсскоп потенциации и лспрсссии ВПСП, вызваниь поясничных мотонеиронах раздражением дорсального корешка и ретикулярной форм а также па спонтанные и миниатюрные ностсипаптнческне потенциалы, показалс мГлуР модулируют синаптичсскую передачу в спинном мозге лягушки. Это подтве результаты предыдущих исследований (Nakamura el nl., 1993; Курчавьш к др., 1995; ( et al., 1995), в которых было обнаружено, что глутамат потенпирует амплитуд (Nakaniura et al., 1993), РФ и ДК ВПСП (Курчавый и лр., 1995) и впервые было выск предположение о позможиом участии мГлуР п механизме этой потенциации. Впослел было показано (Golani et al., 1995), что агонпст мГлуР 1S.3R-ACPD также увелим амплитуду моносипаптичсскпх ЛС ВПСП п мотонеиронах лягушки, и эта потенциям чувствительна к блокаде NMDA рецепторов АР5. Угнетение потенцирующего вл глутамата па моносниаптичсские РФ и ДК ВПСП, а также уменьшение ампл спонтанных постсипаптнчсских потенциалов па ([юне Глу-ответа при апплн; блокатора мГлуР MCPG, зарегистрированные в наших экспериментах, свидетельству участии пресинаптического мГлуР в модуляции возбуждающей снпагтпеской перев исследуемых синапсах.

Учитывая накопившееся за последние годы большое количество д; относительно вовлечения мГлуР в процессы долговременной потенппанин (Basl Collingridgc, 1994; Miisgravc el al., 1994; O'Connor et al., 1994; Richter-Levin et al., Riedel el al., 1994a, 1994b; Vallejos-Oniada el al., 1995 и т. л.) и лспрсссии (Нагч'а

1994; Linden, 1994; Nakanishi et al., 1994; Linden & Connor, 1995; Ornara et al., 1995 и т. а.) в головном и спинном (Koerber & Mendel), 1991; Lev-Tov & Piuco, 1992; Randic el a!., 1993; Liu & Sandkuhler, 1995; Lozier & Kendig, 1995) мозге млекопитающих, былс интересно провести исследование роли этих рецепторов в подобных процессах у низших позвоночных. Применение блокаторов мГлуР общего действия (+)- и (RS)-MCPG перед теталической стимуляцией ретикулярной формации и дорсального корешка приводило к увеличению длительности постгетанической потенциации или депрессии моно- и полисинаптических ВПСП в поясничньсх мотонейронах спинного мозга лягушки. Анализ литературных данных показал, что это единственный случай, когда не активация (Bortolotto & Collingridge, 1993, 1995; Manahanvaugban & Reymann, 1995b), а блокада метаботропных глутаматных рецепторов, вызывает в синапсах центральной нервной системы длительные изменения синаптической передачи. Тетаяическое раздражение ретикулоспинального и афферентного входов в наших экспериментах вызывало в мотонейронах либо потенциацию, либо депрессию моно- и полисинаптических ВПСП, что согласуется с результатами, полученными Randic с соавт. (1993) на спинном мозге крысы. После аппликации MCPG длительность как ПТП, так и ПТД в мотонейронах лягушки значительно возрастала. Величина ПТП и ПТД по амплитуде для моносинаптических ВПСП бьша несколько меньше, чем для полисинаптических, что указывало на возможное увеличение порога возбудимости интернейронов в процессе тетанизации. Однако, данные, полученные при регистрации унитарных ВПСП (Melian et al., 1995), показали, что раздражение при том же протоколе тетануса одиночных волокон ретикулярной формации на фоне блокады мГлуР также вызывает длительные изменения возбуждающей синаптической передачи.

Увеличение частоты спонтанных постсипаптических потенциалов, изменение уровня фасилитации, а также отсутствие изменений сопротивления мембраны под воздействием блокаторов мГлуР, явно указывают на вовлечение в исследуемые процессы метаботропных глутаматных рецепторов, имеющих пресиналтическую локализацию. Увеличение частоты сПСП и снижение частоты мПСП указывает, по всей вероятности, на то, что здесь мы имеем дело со смешанным эффектом по крайней мере двух подтипов мГлуР, один из которых изменяет порог возбудимости пресинаптических волокон, а второй снижает вероятность выброса передатчика в синапсах на мотонейронах. Подобные результаты были получены в работе Poncer с соавт. на клетках гиппокампа крыс (Poncer et al., 1995).

С целью выявления подтипов мГлуР, вовлекаемых в длительные пластические

изменения синаптической передачи в мотонейронах лягушки, были проведены

эксперименты с применением специфических агонистов и антагонистов различны: мГлуР.

В наших опытах селективный блокатор III группы мГлуР МАР4, подобно приводил к увеличению длительности ПТП и ПТД в мотонейронах, указывая на мГлуР этой группы в исследуемых процессах. Ill группа мГлуР, как известно (Na 1994; Pin & Bockaert, 1995), связана с ингибированием активности аденилил цик активируется агонистом L-AP4. Аппликация этого вещества снижала амплитуду В наших экспериментах. Подобные результаты были получены в нейронах неокортекс (Burke & Hablitz, 1994). Анализ спонтанных постсинаптических потенций фасилитации в ответ на парную стимуляцию волокон указывал на пресинапти локализацию мГлуР, участвующих в ингибированни. Исследования с приме специфических агонистов и антагонистов III группы мГлуР, выявили ингибир действие рецепторов этой группы на возбуждающую синаппгческую nepej гиппокампе крыс (Busbell et al., 1995; Gereau & Conn, 1995; Manzoni et al., 1995; Vi al., 1995). Анализ миниатюрных постсинаптических токов, а также фасил постсинаптических ответов на парную стимуляцию определенно указьш; пресинаггтический уровень локализации мГлуР (Gereau & Conn, 1995). На спинное крыс были получены аналогичные результаты. L-AP4 ингибировал возбужд; синаптнческую передачу в мотонейронах (Kemp et al., 1994; Jane et al., ннгибирование это было связано с сАМР каскадом метаболических реакций и пресинаптическую локализацию.

Таким образом, основываясь на результатах, полученных нами при исслед< влияния агониста III группы мГлуР L-AP4 и блокатора этих рецепторов МАР4 на 1 а также воздействия MCPG на спонтанные и миниатюрные ПСП, и литературных д можно заключить, что мГлуР, обусловливающие увеличение длител посттетаднческих изменений ВПСП в наших экспериментах, относятся к Щ метаботропных глутаматных рецепторов и имеют пресинаптическую локализаци пресинаптический уровень наблюдаемых феноменов указывает также анализ фасшп ответов на парную стимуляцию, зарегистрированных на фоне действия MCPG и МА

Что касается, идентификации конкретных подтипов П1 группы мГлуР, то можно отметить только, что, согласно имеющимся данным, MCPG блокирует i подтипы III группы мГлуР. В частности, было показано, что MCPG не блокирует ^ (Hayashi et al., 1994; Tbomsen et al., 1994) и мГлуР7 (Saugstad et al., 1994; Pin & Bo 1995). На основании этого можно заключить, что в нашем случае мы имеем вероятно, либо с мГлуРб, либо с мГлуРв- мГлуРв, как было показано (Nawy & Jahr, Schiells & Falk, 1990; Nakanishi, 1994; Thoreson et al., 1995), имеет иной, чем остг

годтипы этой фуппы, механизм сигнальной трансдукции, что обусловливает его :пецпфическую роль в определенных синапсах, в частности, в биполярных клетках :етчатки, где он обеспечивает деполяризацию постсиналтическои мембраны через :вязьшанне с сАМР каскадом; тогда как мГлуР8 является вполне типичным 1редставителем III фуппы и обусловливает, по всей вероятности (Pin & Bockaert, 1995), шгибирование потенциал-зависимых Са"+ токов.

Отсутствие изменений величины и длительности процессов посттетанической ютснциации и депрессии ВПСП в ответ на аппликацию специф(гческого блокатора П -руппы мГлуР MCCG свидетельствует о том, что рецепторы этой фуппы в модуляции юсттетанических изменений в исследуемых синапсах не участвуют. На это указывает также отсутствие влияния на ПТП/ПТД агониста этих рецепторов ACPD. Однако ACPD (ьоьгвал в наших экспериментах небольшое увеличение амплитуды моносиналтическнх ЗПСП. Эти результаты коррелируют с данными, полученными Gotani с соавторами (1995) 1ЯЯ ЛС ВПСП в мотонейронах лягушки, а также Bond & Lodge (1995), исследовавших шиянне ACPD на возбуждающую синаптическую передачу в спинном мозге крысы. Небольшая величина наблюдаемой нами потенциации по сравнению с полученной для ЛС ЗПСП могла быть обусловлена применением tACPD, тогда как Gotani et al., использовали (аиболее активный изомер (1S,3R)-ACPD. В противоположность данным Bond & Lodge, в эаботах Kemp et al. (1994) и Jane et al. (1994) сообщалось об ингибирующем действии \CPD на ВПСП в спинальиьсх нейронах крысы. Аналогичные результаты были получены ia головном мозге млекопитающих. Было показано, что аппликация tACPD в тшпокампальных, стриатальньсх и мозжечковых клетках (Baskys & Malenka, 1991; Baskys ;t al., 1991; Anwyi, 1992) активировала пресиналтический мГлуР, который оказывал шгибирующее влияние на амплитуду АМРА-вызвакных ВПСП.

Таким образом, полученные данные не исключают участия в модуляции :инаптической передачи в мотонейронах ACPD-активируемых мГлуР, относящихся, по-ищимому, к 1 фуппе метаботропных глутаматных рецепторов. Эта фуппа рецепторов, как «вестно (Pin & Bockaert, 1995), ответственна также за мГлуР-обусловленное изменение юзбудимости мембраны, следовательно, можно предположить, что увеличение частоты :понтанных ПСП под влиянием MCPG в наших экспериментах могло быть обусловлено юдтипами, относящимися к I группе - мГлуР i и мГлуР3.

Отсутствие существенного изменения амплитуды моносиналтическнх ВПСП, либо «большое ее уменьшение, в ответ на добавление в перфузирутощий раствор общего Злокатора метаботропных глутаматных рецепторов MCPG, тогда как при аппликации щтагониста III фуппы мГлуР МАР4 амплитуда ВПСП возрастала, а при добавлении итшиста этой фуппы L-AP4 - снижалась, подтверждает предположение о вовлечении двух

групп мГлуР в процесс модуляции синаптической передачи в мотонейронах лягушка из них, III, снижает выброс передатчика в исследуемых синапсах и участвует в мод длительности посттетанических изменений ВПСП, а другая, скорее всего I, ответе за увел!гченне амплитуды ВПСП под воздействием ACPD, а также принимает уча изменении возбудимости, наблюдаемом при теташгческой стимуляции.

Тот факт, что величина ПТП по амплитуде на фоне действия MCPG, но не была больше, чем в норме, тогда как значения ПТД превышали нормальны аппликации как MCPG, так и МАР4, говорит о том, что возможно в модуляции про потенциации и депрессии лежат механизмы, вовлекающие разные подтипы мГлуР.

Наиболее изученная форма синаптической пластичности - долговре! потенциация - представляет собой длительное увеличение силы синаптической пер наблюдаемое в результате высокочастотной стимуляции соответствующих входо; индукции ДВП необходима, как было показано (Hvalby et al., 1987), соактивация постсинаптических элементов, хотя окончательным триггером для ДВП яв постсинаптическое увеличение концентрации Са (Collingridge & Bliss. 1987). Гл5 выбрасываемый в результате высокочастотной стимуляции, связьшаетс постсинаптически расположенными NMDA и HeNMDA рецепторами (Malenka, Различают две формы ДВП: NMDA-зависимую и NMDA-независимую. В первом мГлуР могут осуществлять переход NMDA-индуцированной кратковрек потенциации в долговременную (Bashir et al., 1983) через активацию определ ферментативных систем, в частности, киназных, а также усиление активации Г рецептора (Harvey et al., 1990, 1991; Aniksztejn et al., 1992; Anwyl, 1992; Kelso et al., Behnisch & Reymann, 1993; Fitzjoin et al., 1995, 1996). В случае NMDA-независимой предполагается, что мГлуР могут играть роль основного триггера (Bashir et al., 1983 изучении механизмов поддержания долговременной потенциации была обнаружена связь между ДВП и увеличением глутаматного выброса (Dolphin et al., 1982; Bliss 1986, 1990; Errington et al., 1989; Malinow & Tsien, 1990), предполагая доминиру роль пресинаптических элементов.

Явление долговременной депрессии представляет собой длительное сни эффективности синаптической передачи и включает 3 процесса: деполяри постсиналтической мембраны, активацию АМРА и метаботропных глутаг. рецепторов, сопровождающиеся вхождением Са2* через потенциал-зависимые каналы. Предполагается, что мГлуР, участвующие в индукции ДВД, относятся к I i (Masu et al., 1991, Shigemoto et al., 1994). Несмотря на то, что индукция ДВД прош на постсиналтической мембране, она обусловлена длительным снижением вь передатчика из пресинптическнх терминален, что предполагает существ<

IS

етроградного мессеняжера, роль которого выполняет, по-видимому, арахвдоновая кислота Bolshakov & Siegelbaum, 1995).

Что касается полученньи нами результатов, то трудно, что либо сказать о [еханнзмах индукции ПТП и ПТД, так как ни один из исследуемых нами антагонистов АР5 - блокатор NMDA рецепторов, РТХ - блокатор ГАМКа рецепторов, а также MCPG) е блокировал кратковременную потенциацию или депрессию, регистрируемые в ютонейронах лягушки в норме в ответ на тетаническое раздражение. Кроме того, в итературе фактически отсутствуют сообщения о регистрации ДВП или ДБД в ютонейронах лягушки в нормальных условиях. В исследовании Farel (1974) в спинном юзге лягушки была зарегистрирована ДВП вентральнокорешковьсх потенциалов в ответ а кратковременное высокочастотное раздражение ЛС, однако зтн данные впоследствии е подтвердились. Здесь необходимо отметить, тем не менее, результаты, полученные в аботе Glaum & Miller (1993), исследовавших возбуждающую сннаптическую передачу в ейронах nucleus tractus solitarius (NTS) у крыс. Авторы показали, что в исследуемых инапсах имеет место смешанное действие пре- и постсинаптическнх метаботропных путаматных рецепторов, причем способность постсинаптическнх мГлуР облегчать инаптическую передачу, по-видимому, маскируется сильным ингибиторным действием ресинаптических метаботропных ауторецепторов. Если предположить подобньш :еханизм действия в нашем случае, то возможно, что за индукцию ДВП и ДВД в ютонейронах ответственны постсинаптичскн локализованные подтипы мГлуР, которые не локируются или слабо блокируются MCPG и действие их выявляется лишь гтри блокаде ресинаптического ингибиторного подтипа мГлуР, относящегося к III группе (мГлуР^ или [Глу?8). Нельзя, тем не менее, исключить участие других рецепторов и ферментативных истем в наблюдаемых процессах. Что касается, перехода регистрируемой в норме ратковременной потенциации или депрессии в долговременную, то здесь, суш по нашим аннь[м, NMDA рецепторы вместе с мГлуР принимают самое непосредственное участие, в тличие от ГАМК рецепторов, блокада которых на длительность ПТП и ПТД не влияла, 'читмвая предположение о том, что в поддержании долговременных процессов рннимают участие в основном пресинаптические механизмы, нельзя исключить, что в ашем случае мы имеем дело с пресинаптическим NMDA рецептором. Существование того рецептора было показано в различных областях мозга млекопитающих - гиппокампе Viartin et al., 1991), коре (Gothen & Fink, 1991; Fink et al., 1992), базальных ганглиях Blandini et al., 1995), стриатуме (Sandor et al., 1995), а также в спинном мозге (Liu et al., 994). В последнем исследовашш сочетание методов электронной микроскопии и ммуногистохимии выявило наличие NMDA рецепторов в пресинаптических тутаматэргических терминалях в непосредственной близости от участка выброса

везикулы в активной зоне синапса, что предполагает роль пресинаптического рецептора в модуляции выброса глутамата.

Таким образом, суммируя полученные нами данные, можно заключить, модуляции посттетанических изменений возбуждающей синаптической пере мотонейронах лягушки, помимо подтипов III и, предположительно, I групп участвуют также пресинаптические NMDA рецепторы. Потребуются даль исследования для выяснения роли I группы мГлуР в наблюдаемых феном идентификации конкретных подтипов мГлуР, вовлекаемых в модуляцию, а также определения локализации NMDA рецептора. Ниже приведена схема предпол; локализации групп мГлуР и NMDA рецептора, участвующих в модуляции еинапп активности в спинном мозге лягушки.

мГлуР I

ИНТЕРНЕЙРОН

МОТОНЕЙРОН

выводы

1. Исследовались возбуждающие постсинаптические потенциалы, вызванные истивацией ретикуломотонейронального н афферентного синаптических входов, а также :понтанные и миниатюрные постсинаптические потенциалы, зарегистрированные в юяеничных мотонейронах изолированного спинного мозга лягушки.

2. Применение антагониста мГлуР общего действия МСРО угнетало увеличение 1мплнтуды ВПСП, наблюдаемое в мотонейронах в ответ на аппликацию глутамата, тсазывая на вовлечение мГлуР в модуляцию синалтической передачи в исследуемых :инапсах.

3. Блокада мГлуР совместно с теташгческой стимуляцией исследуемых входов индуцировала в спннальньк мотонейронах лягушки длительные изменения эффективности :инаптической передачи, тогда как в исследованиях на млекопитающих, подобные пменения были получены при активации мГлуР.

4. Анализ сПСП и мПСП, а также изменение фасилитации ответов на парную ггнмуляцию и отсутствие изменений сопротивления мембраны указывают на тресинаптическую локализацию мГлуР, ответственных за запуск длительных изменений :инаптической передачи в мотонейронах лягушки.

5. Фармаколоппеское исследование влияния агоннстов и антагонистов различкьсх ■рупп мГлуР выявило вовлечение в процессы длительной потенциацин и депрессии ВПСП II группы мГлуР, связанной с сАМР-каскадом метаболических реакций, не исключая при >том возможное участие также подтипов Г группы мГлуР, связанных с фосфокнозитидным "идролнзом. Подтипы II группы мГлуР, судя по полусенным нами данным, в процессы .(одуляции синалтической передачи в мотонейронах лягушхи не вовлекаются.

6. Добавление в перфуз!гругощий раствор антагониста ИМБЛ рецепторов АР5 ^локировало мГлуР-обусловленное увеличение длительности посттетанических изменений ВПСП, указывая что активация ИМОА рецепторов необходима для запуска длительных тластнческнх изменений в мотонейронах лягушки.

7. Аппликация антагониста ГАМКа рецепторов пнкротоксина на мГлуР-зб условленное изменение длительности ПТП и ПТД не влияла. На основании этого можно предположить, что ГАМКа рецепторы в исследуемьи процессах не участвуют.

8. Таким образом, в настоящем исследовании выявлены две группы мГлуР, (Частвуюгщгх в модуляции синалтической передачи в спинальных мотонейронах лягушки. Эдна из них (III) осуществляет модуляцию глутаматного выброса, а другая (скорее всего Г) обеспечивает изменение порога возбудимости пресиналтических волокон.

Список работ, опубликованных по теме диссертант

1. Мельян З.Э., Модулирующее влияние глутамата на синаптическую пер< мотонейронах изолированного спинного мозга лягушки, Материалы V съезда Арм> Физиологического Общества, Ереван, 1994, с.55.

2. Курчавый Г.Г., Калинина Н.И., Мельян З.Э., Веселкин Н.П., Потен постсинаптических потенциалов под влиянием глутамата и агонистов в мотоне лягушки, Ж. Эвол. Биох. и Физиол., 1995, т.31 N4, с.430-443.

3. Melian Z.H., Dityatev А.Е., Kozhanov V.M., Clamann H.P., Block of metal glutamate receptors prolong posttetanic potentiation and depression in synapses I descending fibers and motoneurons of the frog, Sympos.: Presynaptic Mecham Neurotransmission. San Diego, USA, 9-11 November, 1995.

4. Мельян 33., Метаботропные глутаматные рецепторы модулируют длите постгетанической потенциашш и депрессии в мотонейронах спинного мозга л Материалы I Конференции Молодых Физиологов и Биохимиков "Биохимиче Биофизические Механизмы Физиологических Функций". Санкт-Петербург, 1995, с.1'

5. Мельян З.Э. и Кожанов В.М., Исследование роли метаботропных глутг рецепторов в модуляции длительности постгетанической потенциацни и депр< супраспинальных и афферентных синапсах на мотонейронах изолированного ci мозга лягушки, Материалы / (XI) Международного Совещания по Эволю Физиологии, Санкт-Петербург, 1996, с.145.

6. Мельян З.Э. и Кожанов В.М., Влияние метаботропных глутаматных реи на длительность посттетаннчес хих изменений постсинаптических потенци мотонейронах лягушки Rana ridibunda, Ж. Эвол. Биох. и Физиол. (в печати).

7. Melian Z.H., Kozhanov V.M., Dityatev А.Е., Clamann H.P., Prolong posttetanic potentiation and depression by the metabotropic glutamate receptor a MCPG in spinal motoneurons of the frog, J. Neuropharmac. (in press).