Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Межнейронные связи и их нейрохимические механизмы в спинном мозгу круглоротых

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Межнейронные связи и их нейрохимические механизмы в спинном мозгу круглоротых"

РГ6 од

1 О 1993 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

УДК 591.18; 597.2; 612:814, 815, 822,3

БАТУЕВА Ирина Владимировна

МЕЖНЕЙРОННЫЕ СВЯЗИ И ИХ НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ В СПИННОМ МОЗГУ КРУГЛОРОТЫХ

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.13 — ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА

и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1993

Работа выполнена в лаборатории эволюции межнейронного взаимодействия (заведующий — профессор, доктор медицинских наук Н. П. Ве-селкин) Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН (директор — академик В. Л. Свидерский).

доктор биологических наук, профессор Л. Г. МАГАЗАНИК, доктор медицинских наук, профессор Д. П. МАТЮШКИН, доктор биологических наук, профессор Ю. П. ПУШ.КАРЕВ.

Ведущее учреждение: Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН (Санкт-Петер бург).

циализированного совета Д 002.89.01 по присуждению ученой степени доктора биологических наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН. Адрес — 194223, Санкт-Петербург, пр. Мориса Тореза, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Официальные оппоненты:

Защита состоится «

»

1993 г. на заседании спе-

Автореферат разослан « » ОМ^Л-А-^. 1993 г

Ученый секретарь специализированного совета, докт. биол. наук, профессор

М. Н. МАСЛОВА

- г -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одна из функций спинного мозга состоит в управлении движениями. Несмотря на значительный прогресс в изучении механизмов локомоторного контроля у позвоночных животных, достигнутый за последние 20 лет благодаря усовершенствованию методов анализа активности нейронов•спинного мозга ( drillner, 1375, 1981} Shik а. Orlovsky, 1976; Stein, 1978; Баев, 1991), ряд принципиальных вопросов организации даже самых простых фора локомоции (ходьба, плавание, чесание) остаются невыясненными. К таким вопросам следует отнести презде всего характеристики клеток, составляющих "локомоторный генератор", и сведения о внутренних механизмах работы генератора. Эта информация крайне важна дая понимания принципов управления движением в ноше и при неврологических расстройствах.

По общепринятому представлению, система контроля локомоции у высших позвоночных животных включает в себя несколько компонентов: I - центральный локомоторный генератор (ЦШГ), который "запускается" нисходящим командным сигналом; 2 - афферентный приток с периферии, регулирующий основной ритм путем "обратной связи"; 3 - механизм координации движений конечностей и туловищных мышц, тесно связанный с центральным генератором ( Grillner, 1979). Проблема организации работы этой системы, сформулированная еще в начале века ( Brown,1914 ), далека от разрешения. Большое число нейронов, вовлеченных в контроль стереотипных движений, и многообразие синап-тических связей между этими нейронами у высших позвоночных существенно затрудняют выяснение принципов функциональной организации центрального контроля локомоции.

Уже в прошлом десятилетии начались интенсивные поиски более простых систем, выполняющих ту же функцию и, по-видимому, основанных на тех же рабочих принципах, но болев доступных для изучения. В этом плане спинной мозг круглоротых оказался весьма ценным объектом.

Центральная нервная система у круглоротнхв основных чертах имеет то же строение, что и у высших позвоночных животных ( Hieu-wenhuys, 1977$ Rovainen, 1379 ) и в то же время отличается простотой, прежде всего, благодаря-меньшему числу нервных элементов. Спинной мозг миноги ( Xisiäpetra fluviatilia ) содержит всего лишь около 500 клеток на полусегмент, из них 10-20% составляют мотоней-

роны ( Rovainen, 1973). Мозг очень тонкий, не имеет знутримозго-вых сосудов, питательные вещества поступают в ткань мозга путем диффузия из капилляров поверхностной оболочки ( Hibbard, 1963 ). Важной особенностью мозга миноги является его способность к само-регуляцм внутриклеточных энергетических процессов, в частности, клеточного дыхания (Савина, 1983). Это свойство позволяет сохранять его изолированные участки в искусстввннкх средах с низким напряжением кислорода в течение нескольких дней. Добавление же определенных аминокислот в супарфузируиций раствор вызывает появление в вентральных корешках ритмической активности, которая по своим характеристикам полностью соответствует активности мозга интакгно-го животного во время плавания ( Cohen а. Wallen, 1980; Гооп, 1980 Wallen s. Williвше, 1934 ). Такого рода электрическая активность в изолированном препарате сшшного мозга, которая могла бы быть достаточной дая запуска типичных плавательных движений у ин-тактного животного, получила название "фиктивное плавание".

Как показали исследования, проведенные на представителях разных видов водных позвоночных (круглоротых, пластиножаберных и костистых рыбах) "фиктивное плавание" у всех животных имеет одинаковый импульсный "рисунок" (разряд - пауза) и характеризуется рецип-рокной активностью в вентральных корешках двух сторон одного сегмента и определенным: сдвигом фаз каждого цикла по дойне мозга в ростро-каудальном направлении ( Grillner, 1974; Grillner а. Ка-shin, 1976 )• В ходе дальнейших исследований оказалось, что у высших позвоночных животных (кошек) после спинализации в спинном мозгу может быть вызвана ритмическая активность, сходная с "фиктивны, плаванием" ( Foraaberg, Grillner а» Halbertima, 1980 ).ЭТИ факты подтверждали предположение о том, что в основе локомоторной ритмической активности спинного мозга разных по уровню филогенеза позвоночных животных скорее всего заложен общий универсальный механизм, который еще предстоит расшифровать ( c-rillner, 1975, 1984

Перед исследователями, изучающими организацию локомоции у водных позвоночных, встают два основных вопроса: какие клетки спинного мозга образуют ЩЕГ и каковы анатомические и нейрохимические способы взаимодействия этих клеток. Поэтов всестороннее изучение синаптических взаимодействий между функционально идентифицированными клетками спинного мозга круглоротых является актуальной зада чей, важным этапом для решения фундаментальной проблемы управлени движением. Изучение нейрональной основы ритмических движений и

сравнение организации ВДГ у низших и высших позвоночных животных позволит вплотную подойти к пониманию закономерностей эволюции спинного мозга по мере усложнения его функциональной организации.

Существует и другой аспект этой проблемы. Необходимость и сложность разработок методических подходов, направленных на восстановление двигательной функции при поврездениях спинного мозга, делают изучение механизмов сшшального автоматизма одной из фундаментальных задач неврологии.

В связи с вышеизложенным, мы поставили пелыз настоящей работы изучить особенности структурно-функциональных связей й их нейрохимических основ мевду идентифицированными клетками спинного и продолговатого мозга миноги, и на основе полученного фактического материала построить модельную схему, отражающую основные принципы работы нейрональной сети управления движением. Для достижения указанной цели было необходимо решить следующие экспериментальные задачи:

1. Получить сведения о структуре и электрофизиологических характеристиках основных элементов спинного и.продолговатого мозга миноги: первичных сегментарных аф£ерентов, мотонейронов, ретику-лоспинальных нейронов и их аксонов.

2. Исследовать способы взаимодействия нейронов - установить наличие в идентифицированных синапсах электрической, химической и/или смешанной передачи.

3. Исследовать чувствительность спинальных нейронов миноги к возбуждающим и тормозящим аминокислотам с целью определения возможных медиаторов, используемых для обеспечения межнейронных связей.

4. Методом иммуногистохимии выявить спинальные нейроны, содержащие тормозящие аминокислоты (ГАМК и таурин).

5. Получить характеристику рецепторно-канального комплекса для тормозящих аминокислот мембран нейронов спинного мозга миноги и провести сопоставление с соответствующими данными, полученными на нейронах высших позвоночных животных.

6. На основе полученных данных построить схему нейрональной сети, обеспечивающей ритмическое чередование возбуждения и торможения в могонейроках как эффекторных клетках локомоторного генератора.

Научная новизна и научно-практическое значение.

В результате элекгрофизиологических исследований, проведен-

ных на изолированном перфузируеыом препарате спинного мозга миноги, впервые было установлено, что ретикулосшгаальные аксоны и сегментарные нейроны (дорсальные чувствительные клетки) имеют прямые синаптические.связи со спинальныыи мотонейроналш. Крупные ретику-лоспинальные (Мюллеровокиа) клетки получают мультисенсорные входы со всех рецепторных аппаратов через небольшое число синаптических переключений, однако, прямых связей они не имеют ни с одним рецеп-торннм органом.

Установлено относительно небольшое, по сравнению с высшими позвоночными, количество синапсов, передающих сигналы с нисходящего тракта и/или дорсальных корешков на мотонейроны у круглоротых, что требует значительно большей надежности работы отдельного синапса. В настоящей работе показано, что это достигается большей величиной квантового выброса медиатора, а также дополнением химической передачи во многих синапсах стабильным электрическим компонентом.

Впервые получены данные о локализации тормозящих аминокислот (ГАМК и таурина) в определенных элементах спинномозгового сегмента, что позволяет понять организацию и роль торможения в локомоторном ритме.

Глицин и таурин оказывают сильное депрессирующее воздействие на активность мотонейронов. Причем обе аминокислоты блокируют не только химическую, но и электрическую передачу в синапсах.

Исследованы, кинетические и фармакологические свойства рецепторов для тормозящих аминокислот в слинальных нейронах миноги. Установлено, что рецепторы для глицина, ГАМК и таурина еще не дифференцируются как у высших позвоночных животных, на разные типы, что, по-видимому, отражает определенный этап в развитии мембранной хемореценции в филогенезе позвоночных.

Проведенное исследование имеет, главным образом, теоретическое значение. Оно существенно расширяет представление о количестве и типах нейронов, участвующих в нейрональной сети управления движением и о способах их взаимодействия. Как известно, понимание принципов конструкции нейронной сети управления координированной локомовдей является одной из принципиальных проблем нейрокиберне-тики и робототехники.

Отдельной задачей мы считали подбор и систематизацию литературы, касающейся структуры и функции "локомоторного генератора" у водных позвоночных. Эта часть обзора может быть использована для

курсов лекций по нейробиологии ЦНС и двигательных функций в университетах и медицинских вузах. Результаты работы приводятся в ряде обзоров (Шаповалов А.И., 1977, 1979, 1980, 1983), монографиях (А.И.Шаповалов, 1975; А.И.Шаповалов, Б.И.Ширяев, 1987) и руководствах ( "Neurobiology of lamprey", Physiol. Rev., 1979; "neuronal origin of rhythmic movements", 1983; "The Biology of Lampreys?

1983 ).

Положения, выносимые на защиту:

1. У круглоротых, как и у всех вышестоящих позвоночных животных, активность мотонейронов спинного мозга регулируется как супра-спинальными влияниями из центров головного мозга, тая и сегментарным сенсорным входом. В обоих случаях обязательным компонентом контроля являются прямые моносинаптичеокие влияния.

2. Сочетание химической ж электрической передачи в большинстве исследованных синапсов дает основание считать оба типа передачи необходимыми для обеспечения нормального функционирования ЦНС круглоротых в условиях слабого гомеостаза и зависимости от часто меняющихся внешних факторов.

3. Межнейронные взаимодействия в ЦНС круглоротых обеспечиваются

в основном теми же возбуждающими и тормозящими аминокислотами, которые оперируют в ЦНС высших позвоночных животных. При этом функциональные особенности отдельных нейротрансмиттеров, вероятно, генетически детерминирован^.

4. Выдвинуто предположение о наличии в мембранах мотонейронов и крупных интернейронов спинного мозга миноги единого рецептор-но-канального комплекса для тормозящих аминокислот (глицин, ГАМК, гаурин), имеющего наибольшую чувствительность к глицину.

5. Локомоторный ритм, лежащий в основе ундулирующих движений круглоротых и основанный на правильном чередовании "разряд - пауза" в вентральных корешках спинного мозга, обеспечивается определенной последовательностью вовлечения в активность нейронов сегмента: нисходящих аксонов, возбуждающих и тормозящих интернейронов, мотонейронов. Последние входят в состав спинально-го локомоторного генератора.

Аптобашш работы.

Результаты работы были доложены на следующих научных собраниях: У" научном совещании, посвященном памяти Л.А.Орбели (Ленинград, 1968). Научных конференциях Института йм.И.М.Сеченова (1967, 1985, 1989), Международном симпозиуме "Структура и функция

синапсов" (Киев, 1976), УП-Х Совещаниям до эволюционной физиологии (Ленинград, 1981, 1982, 1986, 1990), Всесоюзной конференции-"Ыеханизмы нервной интеграции" (Ленинград, 1984), У Международном симпозиуме по моторному контролю (Варна, 1985), Всесоюзных конференциях по нейронаукам (Киев, 1986, 1988), ХУ съезде Всесоюзного физиологического общества им.И.П.Павлова (Кишинев, 1987), Международном симпозиуме "Ыеханорецепторы, развитие, структура, функция" (Прага, 1987), заседаниях Всесоюзного общества физиологов (Ленинград, 1985, 1990), УГ Международном симпозиуме по моторному контролю (Албена, 1989), П Советско-Югославском совещании "Нейро-трансмиттеры - онтогенетические к нейробиологкческие аспекты" (Москва, 1989), Всесоюзной школе-семинаре "Актуальные ¿опросы локомо-ции первичноводных позвоночных" (Кара-Дат, 1990), на научных семинарах в Отделе биологии Маркегсского Университета (г.Милуоки, США., 1992) и Отдела биологических наук Университета Миссури (г.Колам-бия, США, 1992).

Пу(1лшсярхти. По материалам диссертации опубликовано более 40 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объекта и основных методических приемов исследования, 3 экспериментальных глав (с 5-7 подразделами и обсуждением в кавдой главе), заключения, -12 выводов и -списка литературы, Работа изложена на 430 страницах машинописного текста, экспериментальный материал иллюстрируют 154 рисунка и 13 таблиц. Список литературы включает 620 работ отечественных и за- • рубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ Объект исследования. Пгагтярят оттинчого мозга.

В опытах использовано более I тысячи взрослых qcoöeä речной миноги ( Lampetra fluviatilis ) данной 27-35 см и зесом 60-80 г. Животные были пойманы в р.Неве или в устье Финского залива и предварительно содержались в аквариуме при температуре не выше Ю°С. Использовали 3 вида препаратов:

Интартная наркотизированная минога с частичной супет^узией головного или спинного мозга. Животное наркотизировали погружением на 5-7 минут в 100 мл водного раствора, содержащего 10 мг tricaine methylsulpbonate (MS 222,Sandoz). Затем миногу закрепляли в специальном станке булавками и под непрерывным протоком фи-

экологического раствора, аэрированного и охлажденного до 10° С, проводили операцию вскрытия головного ил* спинного мозга. Спинной мозг длиной 3-4 см обнажали вплоть до паутинной ободочки, которую осторожно подрезали по краям и удаляли. После этого накладывали раздражающие электроды и проверяли реакции на раздражение спинного мозга, корешков или рецепторных аппаратов. Непосредственно перед погружением в мозг отводящих микроэлектродов вводили внутримышечно ¿-тубокурарин (0,1 мг/100 г веса) и переводили животное на искусственное дыхание с помощью протока через жабры насыщенной кислородом воды.

Пшпашт изолированного мозга с нотохордом. После наркотизации животного спинной мозг вскрывали под непрерывным протоке« аэрированного физиологического раствора на уровне первого дорсального плавника и ростральнее него. Участок мозга длиной 4*5 си выделяли вместе с нотохордом и прилегающими мышцами и помещали в камеру с проточным физиологическим раствором.

Препарат полностью изолированного мозга. При изоляции мозга без нотохорда его выделяли из той же части туловища, помещали в другую камеру меньшего размера и фиксировали на дне резиновыми хомутиками и двумя крючками. В дно камеры были вмонтированы две пары раздражающих электродов из серебряной проволоки диаметром 0,3 мм. Еще две пары более тонких биполярных электрода крепились раздельно на микроманипуляторах и подводились к разным точкам мозга с дорсальной или вентральной поверхности. К клеткам полностью изолированного мозга микроэлектроды подводили под визуальным контролем.

Мотонейроны идентифицировали в электрофизиологических опытах на препарате мозга с нотохордом по антидромному ответу на раздражение вентрального корешка в месте его выхода в хрящевой канал. В опытах на полностью изолированном мозге применяли внутриклеточное маркирование пероксидазой хрена (ПХ) или красителями и наблвдали выход аксона в вентральный корешок.

Мюллеповские аксоны идентифицировали по скорости проведения, которая определялась по латентному периоду ПД, вызванного путем раздражения нисходящего тракта на расстоянии 8-10.мм от точщ отведения. Для внутриклеточной деполяризации отбирали аксоны, расположенные на глубине 300-400 мкм от дорсальной поверхности, имеющие скорость проведения не менее 4-10 м/сек'.

Растворы. Нормальный раствор, используемый для сулерфузш

препарата мозга с ногохордом, имел следующий ионный состав (толь/л): НаСХ - III; КС1 - 2,1; 0аС12 - 2,6; MgCl2 - 2,0; SaHCCXj - 6-8; глюкоза - 4. Исходно раствор имел рН = 7,5-7,6, после аэрации газовой смесью (98$ Og + 2% С02) устанавливался рН в пределах 7,2-7,4. Дня блокирования химической передачи в синапсах использовали раствор, в котором концентрацию СаС12 уменьшали до 0,5 лй! и добавляли 10 мМ MgCl2 или 2 мМ МиС12. При исследовании действия ^предполагаемых медиаторов использовали свежеприготовленные растворы того же ионного состава с добавлением аминокислот: глицина, ГАМК или таурина, а также глутамата, в -метил- D-аспартага (все реактивы производства Sigma, США) и L-ДОФА (вея-, nal, Венгрия). Замена нормального раствора на экспериментальный достигалась переключением крана в распределительной системе. Объем камеры, где находился препарат, составлял 2 мл, полная смена раствора в ней происходила за 2 минуты. Камера охлаждалась с помощью полупроводникового столика, так что температура раствора в ней поддерживалась в пределах 8-12° С.

Регистрация потенциалов. Внутриклеточное отведение осуществлялось с помощью стеклянных микроэлектродов из стекла пирекс с диаметром кончика 0,8-1,0 мкм, заполненных 3 М раствором хлорида калия, с сопротивлением 10-20 МОм. В части опытов микроэлектроды заполнялись 0,6 М раствора сульфата калия или 1%-м. раствором красителя тршшнового синего, или растворами проционовых красителей или ПХ. Внутриклеточная поляризация осуществлялась через отводящий электрод, включенный в мостовую схему. Фоторегистрация отводимых потенциалов и пропускаемого в клетку тока проводилась на двухлучевом осциллографе фотокамерой. Доя регистрации унитарных ответов в сшшной мозг погружали 2 микроэлектрода с помощью двух раздельных микромашшуляторов. Один из микроэлектродов использовали для внутриклеточной деполяризации (аксона или дорсальной чувствительной клетки), второй - для отведения синадтическо-го ответа в мотонейроне.. Расстояние между микроэлектродами составляло от 200 мкм до 8 мм. При генерации ЦЦ в одной клетке на другом микроэлектроде возникал емкостный артефакт, который удавалось уменьшить с помощью заземленных экранов, но .полностью компенсировать не удавалось, и он присутствует на всех записях унитарных ВПСП. Микроэлектроды соединяли через хлор-серебряные электрода с усилителями, входные каскады которых были собраны на транзисторах Ш1-303 В. Входное сопротивление усилителей составляло I Tfta, полоса пропускания - 10 кГц. Схема входного усили-

теля и усилительного каскада отличалась от обычно. применяемых для микроэлвктродных исследований использованием для стабилизации положения базовой линии на экране осциллографа "масштабного усилителя с автоматической стабилизацией нулевой линии". Автором схемы усилителя и исполнителем его конструкции является ст.инженер лаборатории Рябов Б.Т. В этой конструкции использована схема с включением запоминающей емкости в дополнительную цепь отрицательной обратной связи операционного усилителя. Основу схемы составляет операционный усилитель ДА-I. Баланс нулевой линии в ручном режиме осуществляется потенциометром. Кроме высокой точности стабилизации нулевой линии, важным достоинством этого узла электрофизиологической установки является возможность изменения в га-роком диапазоне коэффициента передачи устройства без дополнительней подстройки баланса. Масштабный усилитель включается между предусилителями и регистрирующей аппаратурой. В установке использованы отечественные приборы - двухлучевые осциллографы CI-I8, электростимуляторы ЭСУ-I, а также анализатор DIBAC-4000 (infer-•technique, Франция). Для погружения микроэлектродов применялись механические микромашшуляторы, собранные в лаборатории на основе отечественных микроскопов и препаратоводателей.

Маркирование клеток с помощью ПХ. Для исследования центральной локализации первичных афферентов и мотонейронов 13 животным под наркозом вводили внутримышечно 40-60 мкл 5-10$-го водного или солевого раствора ПХ ( Sigma, США, тип У1) в область туловищных сегментов. Через 30 минут животных выпускали в аквариум, где они находились от 3 до 7 суток. После этого срока животных повторно наркотизировали, кусочки епинного мозга длиной 6-8 мм извлекали и фиксировали.

У II тавотных исследовали структуру периферической части первичных афферентов с помощью антероградного транспорта ПХ. Для этого 4-5 туловищных миотомов помещали во влажную камеру, производили вскрытие, гемйоэкцию и удаление левой половины мозга. Образовавшуюся полость заполняли раствором ПХ. В правой половине мозга перерезали все вентральные корешки и сохраняли дорсальные, по которым ПХ могла транспортироваться на периферию в точение трех суток в холодильнике. Затем мозг промывали и фиксировали.

После внутриклеточного введения ПХ препарат оставляли в аэрированном физиологическом растворе на 8-24 часа, затем фиксировали. Гистохимическая обработка выявления ПХ во всех опытах про-

водилась по прописи Адамса ( Adams, 1977 ).

птятиптштйо.кяя ortnartnttffl ^яти-руятши ямщггтд унитарных ответов (квантовый анализ) производилась на машине БЭСМ6 (система АЛГОЛ, вариант 20-05-76). Используя машинные данные, производили расчеты но формулам ( araatyn et al.,1984 ) параметров Пуассоно-вского х биномиального распределений. В другой серии опытов обработка данных проводилась на ЭВМ Cemao-mera по двум программам (GIST00) и (ESTMLS) разработанным В.М.Ксжановым совместно с А.Г. Бартом и А.Э.Дитятевым. Оценка совпадения экспериментальных гистограмм с теоретическими кривыми производилась по методу максимального правдоподобия.

Иаолетшя клеток спинного мозга и регистрация мембранных токов. Для получения изолированных нервных клеток применяли метод фврыентативно-механической обработки (Veprinteev et al., 1984) с использованием 0,3$ проназы. Для исследования отбирались крупные ветвистые клетки с линейными размерами сомы от 50 до 120 шсм. О функциональном состоянии нейрональных мембран судили по стабильности натриевых потенциал-зависимых токов и малым токам утечки. Внутриклеточная перфузия клеток проводилась согласно описанной ранее методике ( Xostjruk et al., 1981; Hamill etal., 1981). Для быстрой смены раствора использовали метод концентрационного скачка (Крышталь и Пядопличко, 1975) .Измерение хеморецептив-ных токов через мембрану нервных клеток производилось в условиях фиксации мембранного потенциала (МП).

Кммтногистохимическое выявление ГАМК- и таутош-содэшсаших элементов пггиттипго мозга. Согласно разработанной прописи (stem-berger, 1979 ), иммуногистохимическая процедура проводилась в течение двух дней. Предварительно участок спинного мозга фиксировали погружением в смесь 1% параформальдегдда и 1% глутараль-дегвда на 0,1 М фосфатном буфере, обезвоживали и заключали в по-лиэтиленгликоль. Фронтальные или горизонтальные срезы толвдной 15 мкм собирали в забуференный физиологический раствор. Для выявления ГАЫК срезы последовательно инкубировали с кроличьей поли-клональной анги-ГАМК антисывороткой (Immunotech, Франция), с козьей антисывороткой против иммуноглобулинов кролика ( Cappel, США) и кроличьим ПАЛ-комплексом ( исв, Бельгия). Для выявления таурин-содержащих элементов первыми антителами были анти-таурин антисыворотка, вторые и третьи антитела были те же. Выявление ИХ проводили с использованием охлажденного до 5° С 0,03^-го диа-

минобензидина тетрагидрохлорида на 0,1 M грис-HCl буфере с добавлением Q,05# HgOjj. После отмывания срезы помещали на предметные стекла, обезвоживали и заключали в Suoitt (Kindler, ФРГ). Контролем служили срезы, обработанные по указанной выше методике при исключении первых или вторых антител.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Как известно из литературных источников, локомоторный ритм, регистрируемый в туловищных мышцах, вентральных корешках или спи-нальных нейронах круглоротых во время спокойного плавания обеспечивается спинальным автоматизмом, который запускается и контролируется сигналами с сегментарных афферентоа и высших командных центров' - ретикулярных клеток среднего и продолговатого мозга. Выявлению свйзей и характеристик влияний этих клеток на спиналь-ные мотонейроны посвящена первая часть нашего исследования. СТРУКТУгаО-ФУЖВДОНАЛЬНЬЖ СВЯЗИ В СПИННОМОЗГОВОМ СЕГМЕНТЕ.

Дорсальные чувствительные клетки (1ЧК). Морфология и электрические свойства. ДЧК являются первичными афферентными клетками спинного мозга круглоротых ( ïïieuvrenhuya, 1964; Martin a. Wickalgren, 1971 )• По расчетам, сделанным нами на серийных фронтальных срезах, в одном сегменте содержится от 17 до 20 пар ДЧК, лежащих с промежутками в 140-200 мкм одна от другой. После импрегнации серебром по Гсльджи или внутриклеточной окраски процконо-выми красителями ДЧК.отчетливо различаются как округлые клетки с диаметром сомы от 40 до 80 мкм. Другим характерным признаком ДЧК является их биподярносгь: от сомы отходят два отростка в ростро-каудальном направлении, причем ростральноидущий прослеживается до продолговатого мозга, а каудальновдущий проходит лишь 5-10 сегментов. На расстоянии 10-50 мкм от сомы от одного из этих отростков отходит коллатераль, которая направляется в дорсальный корешок и далее уходит в мышцы. В наших опытах ДЧК имели мембранный потенциал (МП) от 70 до 85 мВ, потенциал действия (ПД) от 75 до III мВ при длительности 2-5 мс. Следовая гиперполяризация составляла Ю-15 мВ. При ритмической стимуляции спинальных трактов ДЧК воспроизводили частоту до 125 имп/с. Раздражение дорсального корешка или периферических нервов вызывало в них одиночные или ритмические ПД без признаков предшествующего синаптического ответа. Скорость проведения по отросткам, направленным в ростральную часть спинного мозга, составляла з среднем 0,8*0т-12 м/с, по от-

росткам, идущим в каудальном направлении - 0,6±0,П м/с, После антероградкого транспорта ПХ (инъекция в ДЧК и транспорт в дорсальный корешок и на периферию^были прослежены отростки ДЧК (чувствительные нервные волокна) в миосептах и только в париетальных (красных) мышечных волокнах, где основной ствол обнаруживал обильное дихотомическое ветЕлвние. Диаметр концевых волоконец составлял 0,2-0,5 мкм. Ветвление чувствительного нерва удавалось проследить на протяжении 2/3 длины мышечного волокна.

Мотонейшны спинного мозга. Судя по количеству волокон в вентральном корешке; в одном сегменте взрослой миноги Ьатре^га :Е1иу1аи11я имеется 150-200 мотонейронов. При аппликации проца-онового желтого на вентральный корешок в каждом из 8 опытов было выявлено от 20 до 56 мотонейронов, имеющих чаще всего веретенови-дную форму сомы с размерами от 20x45 до 30x120 мкм. Дэндриты и аксоны мотонвйронов лучше прослеживались после ретроградного транспорта ПХ или внутриклеточной маркировки, Дендриты были ориентированы в медиальном и латеральном направлениях, они достигали области локализации Мшлеровских аксонов и доходили до краевой зоны мозга, где давати обильное ветвление, истончаясь до 0,2 мкм. У трех из 40 мотонейронов дендрита переходили на противоположную сторону мозга. Между крупными ветвями дендритов близко к соме прилегают слабо окрашенные клетки-сателлиты. Насыщенные продуктом реакции ПХ аксоны у 15 из 42 внутриклеточно маркированных мотонейронов отходили от одного из крупных дендритов. У трех клеток наблюдалось разделение аксона на две коллатерали, направленные в соседние корешки. Данные о структуре, размерах и количестве мотонейронов совпадают с литературными.

Сома мотонейронов миноги, как и у всех позвоночных, электрически возбудима, при трансмембранной деполяризации током 1-2 нА возникает ЕД и ритмический разряд при узеличэнии силы тока. № составляет в среднем 67,2±4,2 мЗ (п=151), средняя амплитуда антидромных ПД 84,0*10,4 мВ (и=111), частота воспроизведения стимулов - 50-100 имп/с ( п=85), скорость проведения по аксонам 0,55^0,17 м/с ( п=138). При раздражении вентрального корешка током нодпороговой силы в мотонейронах часто возникает небольшой местный ответ, который трактуется как результат опосредованных влияний с других мотонейронов (Тамарова, 1978).

На 24 мотонейронах наш были исследованы постсинаптические возбуждающие потенциалы (ВПСП), возникающие при раздражении дорсального корешка. Заднекорешковые ВДСП имели синаптичеокую за-

держку 1-2 мс, что указывало на возможность прямой связи между пер-зкчнымя а£форентами а мотонейронами. Для более детального анализа этих связей был использован метод одновременной регистрации актив-юсти в двух клетках - ДЧК и мотонейроне.

Свойства унитарных ВПСП, возникающих в мотонейронах при раздражении отдельных ЛЧК. Всего было обследовано 40 ДЧК и 140 мотонейронов. Количество исследованных пар ДЧК - мотонейрон составило 96. ШСП в ответ на прямое раздражение ДЧК были получены в 32 мотоней-эонах. Б 4 опытах при раздражении одной ДЧК ШСП были зарегистриро-?апы в 1-2 мотонейронах из 7-13, подобранных в пару. По данным всех эпытов число мотонейронов, дающих ответы на прямое раздражение ДЧК, доставляет 20-25% от общего числа исследованных клеток. При прямом раздражении мотонейронов никаких ответных реакций в ДЧК не наблюда-хл. Также не было выявлено прямых связей между разными ДЧК и между 1ЧК и Мгалеровскдми аксонами.

Анализ унитарных ВПСЖ показал, что их амплитуда составляет в среднем 1,4±0,072 мВ, длительность - 10,0*1,32 мс. Латентный период [ЛП) ответов варьировал от I до 10 мс при расстояниях между клетка-га от I до 4 мм. Синоптическая задержка, измеренная лак разноотъ наяду средними значениями ЛП качала ВПСП и временем проведения по иссону, в половине случаев практически отсутствовала. Этот результат, а также отсутствие случаев "выпадений" ШСП были надежными по-сазателями наличия прямой связи между ДЧК и мотонэйронами. Короткая ;инаптическая задержка (меньше I мс) и устойчивость ВПСП в бескаль-даевой среде свидетельствовали в пользу смешанного электро-химиче-жого механизма передачи в исследованных синапсах.

Вышеприведенные данные были дополнены исследованием структур-юй основы этой связи - наблюдением контактов внутриклеточно марки-зованных взаимодействующих клеток. Всего было окрашено 7 пар. Места ¡«прикосновения окрашенных отростков ДЧК с девдритами мотонейрсноз анализировали на светооптическом уровне и считали, что контакт воз-южон, если под масляной иммерсией при увеличении в 2025 раз нет ¡аметной щели между контактирующими структурами. Во всех случаях, согда в мотонейроне возникал ВПСП в ответ на ПД ДЧК, наблюдали так-13 наличие контактных зон, обычно типа en passant.

Ретикудоспинальные (Мюллеровские) нейроны продолговатого мозга. Ьаллеровские (наиболее крупные из ретикулярных) клетки продолговатого и среднего мозга круглоротых с коротким ЛП получают сигналы со зсех органов чувств и отвечают разрядами ЦД при раздражении вести-

булярного аппарата, зрительных нервов и органов боковой линии. Мюллеровские и Маутнеровскке .нейроны круглоротых, по нашим данным, не различаются по электрическим свойствам, синаптическим входам и имеют сходную структуру. Их МП в среднем составляет 69,0*16,7 мВ ( п= =27), R „ составляет от 0,6 до 3,0 МОм ( n=I5), амплитуда антидромных ЦД - 84,943,9 мВ ( п =36 ). Сома Маутнеровских клеток круглоротых электрически возбудима и способна к генерации ПД.

Наиболее эффективными, судя по амплитуде, ЛП и длительности ШСП, являются влияния на Мюллеровские клетки с вестибулярного аппарата. При раздражении отдельных нервных веточек, проходящих внутри вестибулярной капсулы, в Мюллеровских клетках регистрировались ШСП и ТПСП с ЛИ 1,5-3,0 мс, в то время как фокальный потенциал в толще УШ нерва возникал с Ш 2,0^0,18 мс. При суперфузии препарата раствором с добавлением ма2+ и снижением Са2+ до 0,5 ммоль/л небольшой стабильный компонент ВПСП сохранялся в течение 30 мин и более. Однако анализ ответов, возникающих в Мшлеровских клетках при раздражении отдельных волокон УШ нерва (обследовано 150 волокон и 35 нейронов), показал, что моносинаптических связей в этом случае нет - ответы возникали нерегулярно, с нестабильным ЛП, по-текциировались при ритмическом раздражении. По-видимому, большая часть волокон вестибулярного нерва не имеет прямых проекций ни на Мюллеровские, ни ка Ыаутнеровские нейроны, как это предполагали ранее. Можно думать, что дополнительное переключение и предварительная обработка сенсорной информации, поступающей к Мшлеровским клеткам со всех органов чувств, включая и вестибулярный аппарат, необходимы для наиболее полной интегративной деятельности Мюллеро-вских клеток. Сформированный командный разряд направляется по нисходящим аксонам в спинной мозг.

Проведение возбуждения по нисходящим волокнам. Ретиктаомото-нейрональные ШСП. Аксоны Мюллеровских клеток являются единственный прямым нисходящим трактом у круглоротых, так как они, имея большой диаметр (от 20 до 70 мкм), вдут не ветвясь до самых каудаль-

ных отделов спинного мозга. Аксоны не миелинированы, но благодаря большому диаметру, имеют скорость проведения до 6-10 м/с. При стимуляции ретикулоспинальных нейронов (прямо или через рецепторный аппарат) серебряным шариковым электродом, помещенным на поверхность спинного мозга, можно отвести потенциал дорсальной поверхности (ЦДЛ) с амплитудой 100-250 мкВ, который мы рассматривали как результат суммарного отведения импульсной активности различных

элементов. Наиболее ранний отрицательный компонент имел наиболь-иую амплитуду, наименьшую длительность и его ЛИ совпадал с ЛП ПД, отводимых внутриклеточно от одиночных Мюллеровских аксонов. На основании этих признаков он рассматривается как результат синхронной активности наиболее крупных ретикулосшшальных аксонов.

Появление раннего отрицательного компонента ЦДЛ сопровождается возникновением в сегментарных мотонейронах ВПСН, сегментарная задержка которых, вычисленная по интервалу между пиком начального отрицательного компонента ПДЕ и началом ШСП, составляла менее I мс. Отсвда следовало, что наиболее быстропроводящие рётикулоспи-нальные аксоны активируют мотонейроны моносиналтически. Моносинап-гические ШСП в этой серии опытов были обнаружены в 22 из 30 обследованных мотонейронов. Они характеризовались амплитудой от 0,3 до 3,0 мВ, быстрым временным течением (длительность переднего фронта от 0,7 до 2,0 мс), мало потенциировалиоь при ритмической стимуляции, не проявляли чувствительности к поляризующему току. В некоторых мотонейронах ШСП возникали с сегментарной" задержкой 2-4 мс, что свидетельствовало о возможности да- и полисинаптических связей мотонейронов с Мюллеровскими аксонами или о вовлечении болев медленных нисходящих волокон. ВПСП с большой сегментарной задержкой могли регистрироваться без моносинаптических ВПСП или вместе с ними. Чтобы избежать суммации влияний, индуцируемых из разных источников, был проведен анализ унитарных ответов, возникающих в мотонейронах при трансмембранной поляризации, более 70 отдельных Мюллеровских аксонов. В 44 мотонвйронах была обнаружена мо-носинапгическая связь с Мюллеровскими акоонами, что позволило выяснить особенности унитарных ответов. Синоптическая задержка во многих случаях практически отсутствовала или составляла 0,1-0,15 мс. В некоторых клетках унитарный ВПСП разделялся йа ранний и поздний компоненты, при этом синалтическал задержка для второго составляла 0,7-2,2 мс, что рассматривалось нами как признак моноси-наптического ответа с' химической передачей. Ранни! компонент кроме короткой синалтической задержки проявлял устойчивость в бескальциевой среде и на основании этих признаков был рассмотрен как электрический. Он отличался стабильностью и не изменял своей амплитуды при ритмическом раздражении, в то время как химический проявлял отчетливую частотную.потенциацию. Сравнивая амплитуды унитарных ВПСП с моносинаптическими ответами, возникающими при раздражении всего тракта, мы установили, что каждый мотонейрон моно-

синаптическя связан с несколькими Мюллеровскими аксонами. При исследовании суммарных ШСП имели место случаи, когда не моносинапти-ческие ВПСП имели временные параметры, характерные для электрических ответов. Эти факты позволяли предполагать, что не только гигантские Мюллеровские аксоны, но и другие элементы спинного мозга миноги, в том числе промежуточные нейроны, могут устанавливать с мото нейронами синаптические контакты, обладающие электрическим механизмом передачи, что позднее неоднократно было подтверждено другими авторами. Таким образом, в этой части работы мы показали, что мотонейроны спинномозгового сегмента имеют моносинадтические связи как с нисходящей командной системой Мюллеровских аксонов, так и с первичными сегментарными афферентами - дорсальными клетками. По общепринятому мнению, ДЧК являются афферентами кожной чувствительности, на основании обнаруженных нами терминалей ДЧК в красных мышечных вс локнах мы предполагаем, что эти клетки обеспечивают не только кожную, но и мышечную чувствительность у круглоротых. Являются ли ДЧК единственной популяцией механочувствительных клеток-вопрос дискуссионный, требующий дальнейшей разработки.

Важным результатом этой части работы является демонстрация да; мя методами прямой связи между отростками ДЧК и девдритами мотонейронов. Наличие таких связей до сих пор ставилось под сомнение (Tiegs, 1953; Neuwenhuys, 1977; Buchaaan, 1982). Более сложным является вопрос о количестве контактов у одной взаимодействующей пары: ДЧК - мотонейрон. Статистический анализ амплитуд унитарных ответов свидетельствует о том, что у каждой пары контактов не много, но больше одного. Точная оценка их количества затруднительна в связи с отсутствием электронномикроскопического контроля. Полученные результаты дают возможность не только с уверенностью говорить о прямых сенсомоторннх влияниях у круглоротых, но и позволяют утверждать, что передача в обсуждаемых синапсах осуществляется смешанным электро-химичэским способом.

На основании данных, полученных в настоящей работе и известных из литературы, можно сделать вывод о том, что сенсомоторные .влияния у всех позвоночных, начиная от круглоротых, осуществляйте? с непременным участием моносинаптических влияний на могонейроны, но характер передачи в филогенезе претерпевает существенные изменения - в ней утрачивается электрический компонент (Шаповалов, 1975).

Результаты нашей работы свидетельствуют так же о том, что ре-

тикулоспинальныв нейроны миноги обладают свойствами, качественно сходными со свойствами аналогичных клеток у млекопитающих: те и другие получают синаптические входы из большого числа афферентных источников, включая восходящие тракты спинного мозга. Это обстоятельство определяет важную роль интеграгивных механизмов в деятельности ретикулосшшальных нейронов и их роль в процессах координации двигательной активности у всех видов позвоночных животных. Такие свойства Мюллеровских клеток, как отсутствие выраженной аккомодации к медленно нарастающей деполяризации и способность к длительным стабильным разрядам, хорошо соответствуют их синаптической организации, способствуют обеспечению интегративной функции. Быстрота проведения командного сигнала к сегментарному аппарату, к мотонейронам в частности, достигается высокой скоростью проведения по ретикулосшшальннм волокнам, что обеспечивается гигантскими размерами Мюллеровских аксонов, а у млекопитающих - процессом миели-низации.

Существенным результатом этой части работы является также демонстрация прямых ретикуломотонейрональных связей и анализ унитарных ВПСП, позволивши установить смешанный характер передачи и в этих синапсах. Данные о наличии химического и электрического компонентов хорошо коррелируют с результатами электронномикроскопиче-ских исследований, в которых показано существование смешанных синапсов на поверхности гигантских аксонов миноги (РГешШ^ег а. йотахпеп, 1974; ШпеЬаа, 1975) • Сочетание моносинаптических и опосредованных через другие нервные клетки связей гигантских аксо-цов с мотонейронами еще больше расширяет функциональные возможности ретикулосшшальных нейронов, как клеток, управляющих двигательным поведением животных.

НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ВОЗБУЖДЕНИЯ СШНЛШШ НЕЙРОНОВ

Для понимания организации локомоторного ритма важно знать не только элементы и структуру связей в нейрональной сети, составляющей ЦДГ. Не менее важно иметь представление о нейрохимии этих связей и, пожалуй, это звено является решающим, так как при фармакологическом вмешательстве любой устойчивый локомоторный ритм может быть с легкостью разрушен.

Электрическая передача в спинном мозгу миноги. Ее роль в обеспечении функциональной связи командных центров и сегментарных мо-тотйронов. Как было показано в предыдущем разделе ншей работы, моносинаптические влияния с Мюллеровских аксонов и сегментарных

афферентов осуществляются посредством электрической и химической передачи поступающих сигналов. Как известно, миноги в естественных условиях живут при больших колебаниях температуры внешней среды - от 2° С до 20° С. Если перфузировать препарат спинного мозга физиологическим раствором с t= 3° С, можно наблюдать полное угнетение химических компонентов ВПСП, б то время как электрические компоненты сохраняются. При высокой частоте стимуляции нисходящего тракта электрические ШСП сливались в плато деполяризации с амплитудой до 8-12 мВ, и в клетках с хорошо выраженной электрической передачей могли генерироваться одиночные и ритмические ВПСП.

Перфузия препарата неаэрированным физиологическим раствором в течение часа и более также приводила к подавлению химической передачи, однако примерно в 46% исследованных мотонейронов ( п=187), у которых электрический компонент составлял 80-90? общей амплитуды ВПСП, было возможно вызвать спайковую активность при раздражении нисходящего тракта одиночными и ритмическими импульсами. Электрические ШОП проявляли слабую зависимость от МП, не блокировались в бескальциевых растворах и при добавлении в перфузирующий раствор фенобарбитала и других наркотических веществ. ВПСП, возникающие при раздражении других синаптических входов - дорсальных корешков и проприоспинальных нейронов, также проявляли стабильность в бескальциевой среде, при ритмическом раздражении и внутриклеточной поляризации.

Таким образом, было установлено, что электрическая передача широко распространена в спинном мозгу миног, устойчива и эффективна. В определенных условиях она может быть облегчена, например, под влиянием 4-ашнопиридина (4-АЩ. Увеличение амплитуды и длительности электрических ШСП при перфузии препарата раствором с 4-АП, очевидно, связано с увеличением длительности пресинаптиче-ского тока. Увеличение амплитуды ШСП при неизменной или даже уменьшающейся амплитуде пресинаптического ПД было расценено нами как лучшее воспроизведение (с меньшим затуханием) более длительных сигналов с пресикалса по сравнению с короткими, равноценными по амплитуде, что имеет место и в электрических синапсах беспозвоночных ( Bennett et al., 1967; Мс Mahan a. Purves,1976; Getting, 1979). Эти опыты показали, что электрическая передача, несмотря на свою устойчивость, может быть модифицирована под влиянием химических веществ и, возможно, под влиянием эндогенных факторов.

Широкая распространенность электрической передачи во всех

отделах ЦН'С круглороткх свидетельствует о том, что электрические санадсы необходимы для работы ДНО этих животных. Известно, что у беспозвоночных и рыб элоктричеокие синапсы неизменно присутствуют в целях нейронов, контролирующих быстрые и наиболее жизненно важные реакции: быстрое сокращение у пиявки, захлопывание раковины у моллюска, электрические разряды у рыб и т. д. У круглоротых, на наш взгляд, электрическая передача способствует сохранению функциональной связи в ЦНС в неблагоприятных условиях, когда химическая передача может быть существенно депрессирована. По систэме гигантских аксонов, в частности, командный сигнал может1 чисто электрически активировать сегментарные нейроны и вызвать соответствующую ситуации моторную реакцию, например, избегание опасности.

Химическая передача в спинном мозгу миноги. Определение местоположения синапса но параметрам унитарных ответов. Локализация маркированных контактов. Эффективность работы любого синапса как химического, так и электрического, во многом зависит от его местоположения на сома-девдритной мембране, точнее от его удаленности от начального сегмента аксона. В естественных условиях клетки активируются скорее всего в результате срабатывания множества счна-псов, и оценить роль отдельного контакта достаточно трудно, хотя и необходимо для понимания самого механизма синалтической передачи. Как известно, Рэллом была разработана теория кабельных свойств мотонейронов с дендритаии ( Ball, 1967; 1977 ).Одним из ее важнейших применений стало использование параметров пассивных электрических свойств клетки и временного хода унитарных ВИСИ для определения местоположения синапса по отношению к соме ( Burke, 1967; Jack et al., 1971; Barrett a. Grill, 1974 ). Согласно теории, константа даны ( l ),отражающая степень затухания синалти-ческого потенциала при его распространении по дендриту на сому, может быть выражена через временные параметры унитарного ВПСП (время нарастания И полуширину) ( Eadmana, Walmsley, 1983 )•

Анализ зависимости между амплитудными и временными параметрами был проведен наш на унитарных ответах в 19 мотокейронах. Ответ, записанный в каждой клетке, усредняли и записывали на. анализаторе BIDA0-4O00 (50-100 реализаций). Данные о временных параметрах ответов были статистически обработаны по специальным программам с использованием мацшна ДЗ-28. Между всеми временными параметрами была обнаружена достоверная корреляция, что давало возможность воспользоваться теоретическим положением, определяющим со-

ответствие амплитудно-временных параметров локализации синапса. На основе анализа графика зависимости полуширины 19 унитарных ВПСП от времени достижения пиковой амплитуды, было сделано заключение о том, что исследуемые ретикуломотонейрональные синапсы локализованы на двух уровнях: I - вблизи сомы, П - на некотором расстоянии от сомы. Возможно эти уровни соответствовали проксимальным и дастальным участкам дендритов.

Для проверки правильности этого заключения была проведена реконструкция по серийным срезам двух маркированных ПХ мотонейронов, имеющих контакты с Мшлеровскими аксонами. Реконструкция показала, что один мотонейрон имел одну достаточно протяженную контактную зону с Мюллеровским аксоном (Ma) I и две - с Маб. Второй мотонейрон имел одну контактную зону с Маб и три - с Маб. Все меченые контакты группировались на двух уровнях расстояний от сомы: I - 42-70 мкм; П - II2-I95 ыкм. Эти морфологические данные находились в полном соответствии с заключением, сделанным на основе теоретического расчета, что свидетельствовало о применимости основных положений теории кабельного проведения к спинальным нейронам круглоротых.

Квантовый характер выделения медиатора. Отмечая эффективность и широкое распространение электрической передачи в ЦНС круглоротых, нельзя недооценивать роль химических синапсов. По данным ультраструктурных исследований химические синапсы с типичной структурой активной зоны все же преобладают в спинном мозгу миноги, в то время как щелевые контакты обнаруживаются значительно реже С Christensen, 1976; 1983

В настоящее время нет единого мнения о механизме выделения медиатора в центральных синапсах и о тех ультраструктурных особенностях, которые могут определять сложный характер флуктуации амплитуд унитарных ВПСП. Одна из наиболее распространенных точек зрения, впервые высказанная для нервно-мышечной передачи и позднее распространенная рядом авторов и на центральные синапсы, это квантовая гипотеза, согласно которой максимальная амплитуда унитарных ВПСП представляет собой сумму квантовых потенциалов, постоянных по величине ( Pat a. .Kata, 1951; Dal Castillo a. Katz, 1956; Katz

a. Miledi, 1963; Kuno, 1964). В последние годы в связи С плодотворной разработкой теории квантового выброса медиатора (Korr

a. Mallet, 1985; Walmeley et al., 1987 i Барт, Дитягев,

Кожанов, 1988) возрос интерес к экспериментальной проверке основных положений квантовой теории, и получен обширный материал на

спинальных нейронах рыб ( РаЬег а. Кот, 1932; Шаповалов и Кожанов, 1985), земноводных (вгаг^уп Qt а!., 1982} 1984) и млекопитающих ( Иеа1 et а1., 1983 )•

Эти и другие литературные данные явились предпосылкой для проведения нами статистического анализа флуктуации амплитуд унитарных ретикуломотонейронасьных ЕПСП миноги. Задача представлялась выполнимой, так как у нас уже имелся большой экспериментальный материал (регистрация в 82 парах), который мог быть частично использован для такого рода анализа..Специальная серия опытов потребовалась лишь для того, чтобы увеличить число записей индивидуальных унитарных ШСП, которые получали при стимуляции аксона с частотой I имп/2 с. Определенными преимуществами унитарных ответов мотонейронов миноги является стабильность ПД в Ма, большая по сравнению с шумами, амплитуда унитарных ответов, большая вероятность выделения медиатора (отсутствие выпадений ответов). Некоторое осложнение представляет собой наличие электрического компонента. Поэтому для статистического анализа флуктуации амплитуд были отобраны 5 выборок унитарных ответов с числом измерений от 95 до 300, которые возникали в синапсах, где, судя по Са - Мп2+ тесту, электрическая передача была слабо выражена.

На всех 5 выборках была установлена общая закономерность -в исследованных синапсах медиатор выделяется дискретными порциями. Экспериментальное распределение флуктуации амплитуд ответов может аппроксимироваться в разных выборках как биномиальным, так и Пуассоновским или Гауссовсклм распределениями. Установлено, что величина квантового потенциала в мотонейронах миноги составляет 134-400 мкВ, то ость выше, чем в мотонейронах других позвоночных животных (47-100 мкВ). Возможно, этот факт отражает существенное свойство синапсов, например, увеличивает степень стабилизации амплитуды постсинапгических ответов ж надежность передачи. Нэ исключено также, что определенную роль может играть ультраструктура контактной зоны, в частности наличие нескольких близко расположенных активных зон ( Christensen, 1983 ).

Несмотря на многочисленные работы, в которых показан дискретный характер выделения медиатора в центральных синапсах животных разного филогенетического уровня, проблема выделения медиатора в одиночных синапсах еще далека от разрешения, и имеется ряц труднопреодолимых препятствий на пути исследования природы кванта. Некоторые из них мы подробно рассмотрели в разделе "Обсуждение" этой главы.

розбужиаюшие .медиа!от спикальных нейронов. Исследуя особенности химической передачи з синапсах ДНО миноги, нельзя не коснуться вопроса о природе химических веществ, которые, хотя бы предположительно, могут быть кандидатами в медиаторы.

В последние годы получены неопровержимые доказательства того, что дая возбуждения нейронов в спинном мозгу круглоротых используются возбуждающие аминокислоты (ВАК). Их присутствие в спинном мозгу миноги установлено биохимическими методами ( Homme., 1983 )> показано, что в мембранах спинальных нейронов имеются системы активного захвата ВАК ( Brodin a. c-riliner, 1985 ), Длительный и стабильный локомоторный ритм или "факгизное плавание" могут быть вызваны на участках спинного мозга длиной от 2 до 30 сегментов добавлением в перфузируидий раствор нша, какната, глутамата, аспартата, а также 1 -ДОФА. Особенно легко "фиктивное плавание" вызывается при сочетании фармакологического воздействия (аппликации ВАК) и раздражения высших командных центров - ретикулярных нейронов продолговатого и среднего мозга. Из ВАК наиболзе эффективными являются NMDA и калнат. На основании действия специфических антагонистов ВАК на локомоторный ритм и потенциалы в идентифицированных спиналышх ке'йроках было установлено, что локомоторный ритм вызывается воздействием ВАК преадз всего на ШЛА и каи-натные рецепторы, в то время как квисквалатные рецепторы и их антагонисты не участвуют в генерации ритма ( Bole a. Grillner, 1985). В тех клетках, где плотность ИШ)А рецепторов относительно велика (мотонейроны, сс-интэряейроны) в растворах с TIX при добавлении слабой концентрации ЕШ)А возникают осцилляции Ш. Такие клетки могут становиться пейсмекерамк локомоторного ритма ( 3ig-wardt et al., 1985; Wallen a. C-rilluer, 1987 ).

На основании этих сведений мы предприняли исследование действия ВАК на спинальные нейроны миног с целью получить дополнительные данные о свойствах мембранных рецепторов ЕАК изолированных клеток и мотонейронов препарата спинного мозга.

На препарате мозга была установлена чувствительность мембран .всех клеток к глутамату и и -метил-Д-аопартату ( мша при добавлении в перфузкругадай раствор I толь/л глутамата в течение 1-1,5 минут в мотонейронах возникала деполяризация 8,4*0,23 мЗ (а =15) и иногда - спонтанная активность. Аналогичное действие оказывал КША. На 7 мотонейронах было проверено действие антагониста КША рецепторов 2AîV на рэтикуломотонейрональные (PB) ВПСП. По-

казано, что 0,1 ммоль/л 2 apv частично ¿локирует РФ-БПСП, воздействуя на поздние компоненты моносинаптичэских ШСП.

Действие глутамата, каината и l -аспартата было исследовано также на изолированных клетках спинного мозга. Порог активации глутамат-активирусмых токов составлял около 25, а каинат-активпру-емых - около 100 мкмоль/л. После аппликации обеих аминокислот де-сенситязации на обнаружено. Отличительная особенность ответа на каинат состояла в том, что ток нэ достигал стационарного уровня в течение всего времени аппликации,. Очевидно этим можно объяснить сильное возбуздающзе и нейротоксическое действие больших концентраций. данного вещества, что уже было описано в литературе.

Интересные данные были получены при исследовании действия L -ДОФА. Как известно, l -ДОФА облегчает- фиктивную локомоцию у деце-рабрированннх кошек, а у миног вызывает устойчивое и длительное фиктивнее плавание ( р0оп, 1980 ).В первой серии опытов эффект X. -ДОФА оказался сходным с действием кислых аминокислот - гомоцистеа-та, глутамата и аспартата - активировался натрий-гсалиевый ток с потенциалом реверсии около 0 мВ. Однако при детальном исследовании оказалось, что ответы на ъ-ДОФА проявляют десенситизацию, блокируются стрихнином и равновесный потенциал для этих токов часто имеет значение, близкое к равновесному потенциалу для хлора. Последующие эксперименты показали, что медцу глицинсм и 1 -ДОФА наблюдается полная перекрестная десенс.итизация. Из этих данных был сделан вывод, что ь-ДОФА может быть агонистом глицина. Это предположение подтвердилось, когда выяснилось, что I,-ДОФА, как н глицин, может потенциировать ответы на аппликацию iíhda. С учетом этих данных имеет смысл пересмотреть ранее высказаннуа в литературе гипотезу о механизме влияния ь-ДОФА на локомоторную ¿ктив-нссть только путем увеличения количества медиатора в терминалях моноаминвргичееккх нейронов ( Anden et- al., 1956; Luudberg, 19655 Баев, 1Э77) и учесть двойственность природы этого воздействия в спинном мозгу круглоротых как на процессы возбуздения, так и на процессы торможения, что особенно вачено для возникновения ритмических разрядов во время плавательных движений.

Результаты анализа свойств хаморецептивных токов, вызываемых аппликацией каината, квисквалата, глутамата и аспартата к мембранам изолированных нервных клеток спинного мозга миноги, убеадает в том, что уже у круглоротых постскнаптические рецепторы возбуждающих аминокислот соответствуют тем основным типам, на которые подразделяются рецепторы нейронов высших позвоночных животных

(Watkins a. Evana, 1981). Как фармакологические свойства, так и ионная селективность каналов различных рецепторов у миног те же, что и у высших позвоночных ( Dale a. Grillner, 1986; Kayer а.

Westbrook 1986 ) « HMDA и какнатно-квисквалатные рецепторы проницаемы к ионам Ка+ и К*" , a ШЮА рецепторы, кроме одновалентных ионов, регулируют и Са2+- проницаемость. В последние годы установлено, что мша рецепторы, обеспечивая осцилляции МП, играют ключевую роль в организации локомоторного ритма как у низших ( Sig-vardt et al., 1985i Wallen a. Orillner , 1987 ), так и y высших ( Ascher a. Howak, 1987 ) позвоночных. Такое сходство функциональных свойств важнейшего участка химического синапса свидетельствует о важности и перспективности исследования химических синапсов кру-глоротых, как простой и надежной модели центральных синапсов позвоночных животных.

НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ТОШСЖЕНИЯ СПИНАЛЬШХ НЕЙРОНОВ

Стереотипные ундулирующие плавательные движения миног сопровождаются локомоторным ритмом, который можно регистрировать в каждом миотоме или вентральных корешках. Он состоит из двух фаз, образующих один цикл. I фаза - разряды ВД и 2 - период "молчания". Фаза "молчания"или относительной гиперполяризацни является свидетельством значения тормозных механизмов в формировании локомоторного ритма. Добавление в раствор стрихнина и бикукуллина - антагонистов тормозных медиаторов - существенно меняет локомоторный ритм и в конце КОНЦОВ приводит К судорожным разрядам ( Orillner, 1930; Cohen a. Harris-Warrick, 1984; Alford a. Williams, 1987 ). Предполагают, что в спинном мозгу круглоротых, так не как и у высших животных, в качестве тормозных медиаторов могут использоваться глицин, таурин и ГАЖ ( Hemma, 1983). Однако влияние этих аминокислот на мотонейроны миноги до сих пор не было исследовано.

Влияние глигана (ГШ) было изучено на 32 мотонейронах 29 препаратов спинного мозга. Уже в концентрации IxIQ-0 моль/л ГЖ вызывал гиперполяризацию мотонейронов в нормальном растворе и в бас-кальциевой среде. В половине мотонейронов наблюдалось уменьшение амплитуды моносинаптических ВПСП, но в другой половине мотонейронов наблюдалась потенциация ВПСП до 300$ и возвращение амплитуды ВПСП к исходной величине в нормальном растворе. Мы предполагаем, что потенциация ШСП может быть вызвана действием ГЛИ на глицин-чувствительный участок шва рецепторов, присутствие которых в мотонейронах миноги установлено ранее ( Srilikeг et al., 1981;

Brodin et al., 1985s Buchanan et гЦ., 1987 ) и подтверждено в предыдущем разделе нашей работы. При увеличении концентрации ГЛИ до 2х10~3 моль/л гиперполяризация увеличивалась и наблюдалось только угнетение ШСП разных входов вплоть до полного блока. При действии на унитарные ШСП ГЛИ полностью блокировал как химические, так и электрические компоненты ответа. Антидромные ЦЦ мотонейронов при таких концентрациях ГЛИ существенно не менялись.

При аппликации ГЛИ к мембранам изолированных клеток спинного мозга ( п=121) нейроны отвечали входящим током до 20 нА. Ответы чаще были десенситизирующимися, причем кинетика десенситизацки зависела от концентрации ГМ и температуры раствора. Глицинактивиру-емые токи имели порог активации 5-10 мкМ. По зависимости "доза-эффект" методом наименьших квадратов была определена концентрация половинного эффекта для взаимодействия ГЛИ с рецептором, равная 16 мкМ. Коэффициент Хилла колебался в пределах 1,2-2,5. Глицинак-тивируемыа токи реверсировали при поддерживаемом потенциале (-25)--(30) мВ, что в наших экспериментальных условиях соответствовало равновесному потенциалу для хлора.

Судя по низким концентрациям, при которых ГЛИ активирует мембраны мотонейронов и по силе депрессируюцего действия на ШСП, ГЛИ может рассматриваться как основной кандидат на статус тормозящего медиатора для мотонейронов миноги.

Действие татоина (Т) исследовано на 42 мотонейронах 12 препаратов спинного мозга. Пороговая концентрация бхЮ-4 моль/л вызывала увеличение МП во всех мотонейронах на 5,7*0,4 мВ ( п=18) и снижение на 3-4 мВ амплитуды моносинаптических Ш-ВПСП. Предельная концентрация 4хЮ-^ моль/л вызывала гиперполяризацию на 7,0*3,2 мВ (п =22) и полное подавление моносинаптических ШСП. В тех же условиях не наблюдалось нарушений в проведении возбуждения по Мюллеро-вским аксонам и аксонам мотонейронов. Эти факты свидетельствовали об избирательном воздействии Т на те участки мембран мотонейронов, где возникают постсиналтические ответы.

Чтобы более детально прооледить влияние Т на электрические и химические ШСП, препарат суперфузировали последовательно нормальным раствором, затем раствором, в котором ионы Са2+ были заменены ионами Мп2+ и бескальциевым раствором с добавлением Т. В каждом мотонейроне регистрировали как суммарные ШСП, вызванные раздражением тракта, так и унитарные ШСП, вызванные активацией одиночного Мюллеровского аксона. В этих условиях Т полностью блокировал проведение через смешанные ретикуломотонейрональные синапсы.

- 26 -

Измерение на 5 мотонайронах входного сопротивления в нормальном растворе и при добавлении Т не выявило существенных различий в том и другом случаях. Сопротивление измеряли по изменению амплитуды антидромного ДД при действии толчка тот длительностью 20 же. Однако полученные результаты отражают в основном состояние соматической мембраны, в то время как полное блокирование электрических ШСП, на наш взгляд, может иметь только одно объяснение: происходит сильное шунтирование ШОП непосредственно в области распространения тока с про- на постсинаптичоские участки мембраны. Полученные результаты в совокупности с литературными данными о структуре синапса являются серьезным указанием на локализацию тормозящих синапсов на дендритах вблизи возбуждающих.

Подводя итог, можно сказать, что Т оказывает действие на активность мотснейронов, которое по силе эффекта не уступает ГЖ. В то же время Т стабилизирует ЫП на более низком уровне, при повторных применениях (и отмывании) способствует увеличению амплитуды и устойчивости ответов. Эти эффекты Т, видимо, определяются способностью Т регулировать транспорт основных лотэкциалобразующих ионов, а также осмотические процессы. Не исключено, что избыток Т при суперфузии препарата создает дополнительные возможности для облегчения процессов гомэостаза и восстановления исходных ионных градиентов в работающей клетке.

ГАМК также вызывала гшерполяризацию в мотонейронах к оказывала депрессирующее действие на ВЛСП разных входов, но специфическое действие этой аминокислоты имело более высокий порог и проявлялось -в более широком диапазоне концентраций (5х10~^ - 1x10 моль/л). В отличие от ГШ-эффектов, под влиянием ГАМК в первую очередь происходило угнетение полисинаптдческих компонентов ВПСП. Другое отличие состояло в том, что ГАМК в концентрации до 1x10""^ моль/л не вызывала полного блока электрической передачи.

Изолированные клетки спинного мозга также проявляли чувствительность к ГАЖ. Также как и в случае ИИ-ответов, аппликация ГАМК вызывала десзнситизируицийся хлорный ток, который имел порог активации 1-2x10"^ моль/л, а максимальные ответы возникали при концентрации 1-2x10"^ моль/л. Концентрация, при которой возникал половинный эффект, составляла 1,5x10 моль/л. Коэффициент Жлла колебался в пределах 1,6-2,1, что -предполагает-связывание 2-3 молекул ГАМК с одним рецептором.

Сильное депрессирущее действие ГЛИ и ГАМК на синаптическую

активность моторных клеток и активация хлорных токсе свидетельствовали о наличии в мембранах специфических рецепторов, воспринимающих тормозящие аминокислоты. Важно было выяснить, имеется ля в мотонейронах миног одна популяция рецепторов для ГЛИ и ГАЖ, или же, как у всех высших позвоночных, две разные.

Свойства решит ошв тожозяших аминокислот в спинадькнх нейронах. На основании литературных данных мы использовали прежде всего стрихнин, как наиболее надэжный антагонист для ГЛИ-рецептороз, имеющий на несколько порядков меньше сродство к ГАМК-рецепторам у высших позвоночных. Исследование антагонистического действия стрихнина (бхГС""6 моль/л) выполнено на 24 мотонейронах 22 препаратов. При суммировании результатов, полученных на всех мотонейронах, оказалось, что стрихнин увеличивал амплитуду ВПСП, по сравнению с заблокированной аминокислотами: в растворах с ГЛИ - на 25-400$; в растворах с ГАМК - от 30 до 300$. Эти данные свидетельствовали о том, что стрихнин .примерно в одинаковой степени уменьшает блокирующее действие на ВЙСП как ГШ, так и ГАМК.

Сильным и специфическим, но неконкурентным, антагонистом ГАМК-рецепторов является пикротоксин ( и<. Geer et al., 1987 )Длияние пикротоксина (бхЮ-4 моль/л) на ГЛИ- и ГАМК-эффекты было исследовано на 22 мотонейронах 18 препаратов спинного мозга. Установлено, что пикротоксин в одинаковой степени снижает депрессию РВ-ВПСП, вызванную как ГАМК, так и ГЛИ. Бикукуллин. как надежный антагонист ГАМКд-рецепторов, обеспечивающих постсинаптическое торможение., также был использован в опытах на 5 препаратах спинного мозга. Применялись одни и те же концентрации тормозящих аминокислот для подавления ВПСП во всех опытах с антагонистами: ГЛИ - 5x10"^ моль/л, ГАМК - 2,5х1С~3 моль/л. Бикукуллин в концентрации 5XI0-6 моль/л был почти неэффективен, в концентрации 1x10 моль/л действовал подобно стрихнину и пикротоксину - вызывал увеличение депрессиро-ванных обеими аминокислотами ответов на 50-250$, не изменяя МП и исходной величины ВПСП. Таким образом, влияние трех специфических антагонистов на воздействия ГЛИ и ГАЖ на ВПСП мотонейронов были сходными и выражались в устранении депрессирующего действия тормозящих аминокислот.

Действие тех же антагонистов было исследовано на изолированных клетках. Каждый из антагонистов значительно снижал ответы на аппликацию как ГЛИ, так и ГАЖ.

Результаты опытов с влиянием антагонистов на ГЛИ- и ГАМК эффекты при суперфузии препарата этими аминокислотами и на хлорные

токи в изолированных клетках заставляли предполагать отсутствие избирательности связывания того или другого антагониста и указывали на возможность существования одного рецептора для тормозящих аминокислот-. В таком случае аппликация ГЛИ к изолированной клетке должна была влиять на связывание рецептором ГАЖ и наоборот. Для определения взаимозависимости ответов на приложение ГЛИ и ГАМК были проведены эксперименты по перекрестной десенситизации. После приложения к клетке подпороговых концентраций ГЛИ (или ГАМК) в течение 30 секунд (времени, достаточного для установления уровня стационарной десенситизации) аппликация даже насыщенных концентраций как ГЛИ, так и ГАМК не могла вызвать максимальных ответов. Двукратное уменьшение контрольного ответа наблюдалось при десенси-тизирующей концентрации ГАМК 0,5 ммоль/л, для глицин- и 0,2 ммоль/л для ГАМК-активируемых токов. Десенситизация была обратимой, и после 15-30 свкунц пребывания в нормальном растворе клетки вновь обретали исходную чувствительность к медиаторам.

Таким образом, в опытах на изолированных клетках ГЛИ и ГАМК проявляли полную перекрестную десенситизацию, что можно рассматривать как подтвервдвние данных, полученных в опытах с антагонистами. Совокупность всех полученных фактов позволяет сделать достаточно обоснованное предположение о наличии в мембранах крупных клеток спинного мозга миноги общего рецепторно-канального комплекса, реагирующего как на ГЛИ, так и на ГАЖ, однако более чувствительного к ГЛИ.

ГАМК-иммтаоположительные клетки в спинном мозгу. Основную масо-у ГАМК-иммуноположительных клеток спинномозгового сегмента миноги составляют мелкие, округлые или овальные нейроны с диаметром 12-20 мкм, имеющие чаще всего два тонких отростка. Эти клетки, обозначенные нами как клетки типа I, локализованы в дорсальной части мозга над Мкшлеровскими аксонами на уровне ДЧК. На горизонтальных срезах их часто можно видеть сконцентрированными вблизи ГАМК-иммуноотрицательных ДЧК. Судя по вполне определенной локализации в дорсальной части мозга фрагментированных ярко окрашенных волокон, отростки этих клеток образуют два скопления ГАМК-иммуно-положительных волокон, расположенных симметрично по отношению к центральному каналу в обеих половинах дорсальной части спинного мозга.

Другие типы ГАМК-иммуноположительных клеток выявлялись не на всех срезах, и их количество на сегмент, видимо, существенно ме-

ньше по сравнению с числом клеток I типа. Общими признака^ этих клеток являются: большой размер сомы (до 50 мкм), длинные4отростки (до 300 мкм) и менее интенсивная окраска. В зависимости от локализации эти нейроны можно разделить на два типа: тип 2 - клетки, локализованные по краям латеральной клеточной колонны, состоящей из ГАМК-иммуноотрицательных клеток, и тип 3 - клетки, расположенные в вентролатеральных углах спинного мозга. Последние по ряду морфологических признаков (размерам перикариона, числу отростков, малому количеству на полусегмент) соответствуют описанным ранее как "краевые клетки" ( Rovainen, 1974 ).

Кроме этих нейронов, достаточно многочисленную группу ГАМК-иммуноположительных элементов составляют клетки, локализованные вокруг центрального канала, но их функциональная принадлежность пока точно не установлена. Скорее всего, это эпендимальные клетки.

Основная масса ГАМК-иммуноположительных клеток по своим размерам, форме сомы, локализации в дорсальной части мозга, количеству и направлению отростков соответствует наиболее распространенному в ЦНС позвоночных животных типу ГАЖ-ергических клеток ( ыс Geer а. Мс Gear, 1975; Rinvik et al., 1987; Chmlelowska et al., 1988 ). Хорошо известно, что первичные афферентные клетки высших позвоночных животных чувствительны к ГАМК (Hishi et al., 1974; Gallagher et al., 1978 ). ДЧК миноги также проявляют чувствительность к ГАМК ( Leonard a. Wickelgren, 1985; 1986 ) . По нашим данным, отростки ДЧК окружены пучками ГАМК-ергических волокон, которые могут выделять ГАМК, результатом чего может быть снижение выделения медиатора в пресиналтическом волокне. Такое предположение находит экспериментальное подтверждение в работе Кристенсона и Гриллнера, которые показали, что под влиянием ГАМК происходит уменьшение выделения медиатора из отростков ДЧК ( Ohriatenson a. Grillner, 1987 ) .Имеющиеся факты о модуляции ГАМК Са2+-тока через мембрану ДЧК ( Leonard a. Wickelgren, 1986 ) служат показателем возможности наличия на поверхности ДЧК и их отростков ГАМК^-рецепторов.

Тауриниммуноположительнцэ элементы спинного мозга. Наиболее, многочисленные тауринсодержащие клетки были сосредоточены вокруг центрального канала. При светооптическом анализе можно было видеть, что некоторые из этих клеток посылают короткие отростки с утолщениями на концах в полость центрального канала. Другие отростки были направлены в толщу мозга и шли в вентральном, латеральном или дорсальном направлениях. Наибольший диаметр имели латеральноидущие от-

ростки (до 200 мкм). Каждый отросток, не доходя до поверхности, давал обильное кустистое ветвление, расположенное вблизи Мюллеров-ских аксонов, Маутнеровского аксона или в области латерального нейропиля. Судя по морфологичвскому строению, описанные выше тау-ринсодержащие клетки являются элементами радиальной глии, наличие которой характерно для спинного мозга низших позвоночных ( Connors a. .„Ransom, 1987 ).

На трех фронтальных срезах по ходу латеральных отростков в области латеральной клеточной колонны бшш обнаружены округлые яр-ноокрашенные клетки с диаметром сомы до 30 мкм. Их морфологическая идентификация и трактовка функциональной роли пока затруднительны. Скорее всего это один из типов тормозных интернейроков.

Кроме мелких клеток, расположенных вокруг центрального канала, менее выраженную, но все же явно иммуноположительную реакцию на таурин дали крупные клетки, расположенные в вентральном углу мозга (краевые клетки). Пока мы не можем сказать, это те же-клетки, которые содержат ГАМК, или имеются две популяции краевых клеток с разными тормозными аминокислотами. На основании локализации таурина в спинном мозгу миноги можно предполагать, что таурин выполняет как медиаторную, так и нейромодуляторную.функции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Определить структуру и принципы работы нейрональной сети, обеспечивающей управление движениями, - одна из фундаментальных задач нейрофизиологии. Количество популяций нейронов, составляющих локомоторный генератор, видимо, может быть разным в зависимости от сложности выполняемой функции.

ОДГ у высших позвоночных, безусловно, более сложен, чем у водных позвоночных, к которым относятся и круглоротые. Его активность должна формироваться с "учетом" взаимодействия конечностей разного уровня, флексорных и экстензорных мышц, включать дополнительный контроль позы, то есть координировать рубро-, вестибуло- и церебел-ло-спинальные влияния на сегментарный аппарат. Наиболее сложные, пластические генераторы, которые возникают в процессе приобретения индивидуального опыта у высших позвоночных и человека, связанные с определенной направленностью действия, включают десятки тысяч нейронов и требуют длительной настройки и тренировки.

В наиболее простом случае генератор, видимо, может представлять собой двухнейронную рефлекторную дугу, если эфферентный ней-

рон обладает способностью давать устойчивые колебания МП ( Brown, 1914). Относительно небольшое число популяций требуется в "жестких" генераторах, работающих постоянно и независимо, как например, в "дыхательном центре" ( Thompson, 19В5 ).Генераторы, обеспечивающие "избегание опасности", то есть такие двигательные акты как улета-ние, уползание, уплывание, чесание и другие, должны работать в любых неблагоприятных условиях без дополнительной коррекции. Популяции клеток, составляющих такие нэйрональные цепи, тоже немногочисленны и чаще всего связаны электрическими взаимодействиями ( irisen et al., 1976» Russell, 1976; Getting et al.t 1980; Edvsards a. Mulloney, 1987 ).

Несмотря на очевидное разнообразие ЦКГ, существуют и общие фундаментальные свойства, которые, видимо, присущи всем сшхнальным генераторам. Это наличие нейронов с МША рецепторами, которые легко становятся осцилляторами, и необходимость пускового сигнала с нисходящих командных систем или периферических рецепторов.

По нашему представлению, ключ к пониманию взаимодействия клеток в сети, составляющей любой ВДГ, лежит в характеристике синапти-ческих связей между нейронами. С этой точки зрения, главным результатом проведенной работы являются полученные данные о свойствах и функциональном взаимодействии основных клеточных популяций спинного мозга круглоротых, о тех элементах, которые обеспечивают спи-нальный автоматизм.

Несмотря на трудоемкость получения унитарных ответов, мы старались широко использовать этот метод, так как он дает наиболее точные сведения об основных параметрах синоптических влитий - о величине синаптической задержки, амплитуде минимального синаптиче-ского ответа, способе передачи в синапсе, а в случае маркирования взаимодействующих элементов ПХ или проциоковьми красителями, дополняется сведениями о способе контактов и их локализации на сома-дендритной мембране.

Другой существенный вклад в понимание функциональных связей в спинномозговом сегменте миноги - это подробное изучение свойств электрических синапсов на мотонейронах и попытка оценить их роль в обеспечении взаимодействия центров головного мозга с двигательным аппаратом. Последнее достигается благодаря устойчивости электрической передачи, другие же ее свойства - быстрота и стабильность -весьма существенны для обеспечения синхронизации активности близкорасположенных нейронов одной популяции, в частности, мотонейронов.

И, наконец, еще один важный результат - это определение в спин-

ном мозгу круглоротых локализации тормозных интернейронов, накапливающих и, видимо, использующих для регуляции возбуждения, ГАМК и таурин.

Несмотря на успехи, достигнутые за последние 10-20 лет в области изучения межнейрональных связей в ЦНС круглоротых, пока еще трудно до конца понять, как организовано управление плавательными движениями у этих животных. Однако все имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что основную роль в локомоторном контроле у круглоротых выполняет сшшальный автоматизм.

Как мы ужа знаем, локомоторный ритм представляет собой сочетание в определенном временном интервале залпа спайковых разрядов (I фаза) и периода торможения (2 фаза) общей длительностью цикла 100-1000 mc ( Russell а. Wallen, 19ÖO; 1935; Wallen, 1982 ) .Для того, чтобы понять организационную структуру локомоторного генератора, важно знать, какие именно нейроны активны в I и 2 фазы локомоторного цикла. На основании данных, изложенных в настоящей работе , мы предлагаем для обсуждения схему возможного взаимодейстзия нейронов в одном спинномозговом сегменте в процессе формирования локомоторного ритма.

Мы предполагаем, что в процессе выполнения стереотипных уиду-лирующих движений туловища миноги имеет место определенная последовательность активации клеток полусегмента.

I йаза локомоторного цикла (возбуждение) включает: I - командный разряд Мкшлеровских аксонов; 2 - разряд мотонеиронов и их аксонов в вентральном корешке, вызванные прямыми и опосредованными через возбувдающие интеркейроны (Ilj) влияниями о Мюллэровских аксонов;' 3 - деполяризацию ГАМК-ергических тормозных интернейронов (Ид), тормозных нейронов латеральной колонны (И^), а также краевых клеток (КК) и клеток, локализованных вокруг центрального канала (ЦКК). Последнее (деполяризация большой популяции нейронов) вызывает выход ГАМК и таурина из соответствующих клеток, что индуцирует 2 йазу локомоторного цикла (тормолбшш). во время которой происходит следующее: I - гиперполяризация и подавление активности мотонейронов; 2 - подавление активности в волокнах вентрального корешка и латеральном нейропияе; 3 - создаются условия для перехода на длительную внутрисегментарную регуляцию - при сокращении мышц активируются отростки первичных соматических афферентов ДЧК, эти клетки генерируют разряды, которые прямо или опосредованно через возбуждающие ингернейрсны (Hj) активируют мотонейроны, и цикл повторяет-

ся от п.2 фазы I. Далее этот цикл может воспроизводиться без нисходящего командного сигнала.

Сателлитные ГАМК-ергические интернейронн (1^) деполяризуютоя при тетаническом разряде ДЧК и выделяют ГАМК, прорывая тем самый активность как в самих ДЧК, так а в восходящих чувствительных путях дорсальной части спинномозгового сегмента.

Если в представленной функциональной схеме попытаться выделить ведущую роль какой-либо одной популяции, то ею, на наш взгляд, может быть мотонейронный пул. Как мы уже отмечали, мотонейроны миноги имеют на поверхностной мембране, наряду с каинатными, nmda рецепторы и, благодаря такому сочетанию, в мембранах мотонейронов может происходить саморегуляция протекающих в определенной последовательности натриевых, кальциевых и калиевых токов. Эти свойства мотонейроноз, видимо, могут обеспечить ритмические осцилляции и двигательную активность в условиях ограниченного притока импуль-сации на мотонейроны, например,'при полкой деафферентацин или в глубоком наркозе, когда большая часть влияний с интернейронов устранена. Достаточно присутствия небольшой концентрации возбуждающих аминокислот или незначительного смещения МП в сторону деполяризации, чтобы популяция сегментарных мотонейронов, объединенная в один функциональный пул электрическими межмотонейроналышми связями, начала генерировать ритмические разряды.

Такую точку зрения на роль мотонейронов разделяют не все исследователи. Хотя осцилляции МП могонейронов во время "фиктивного плавания" описаны в нескольких работах ( Kussell a. Wallea, 1980s 1983;'ÄovaLnen, 1983 ), авторы считают, что колебания МП мотонейронов "навязаны" влияниями с интернейронов (Wallen a. Williams, 1982; Buchaua a. Grillner, 19B7¡ Buohanan et al., 1989Наличие пре-моторных возбуждающих и тормозящих интернейронов сначала постулировалось ( Russell е. Wallen,1983), затем они были описаны ( Зи-ohanan a. Grillner, 1987 ) и были приведены доказательства "неучастия" мотонейронов в цепи генератора. Они сводились к двум фактам: I - поляризация и разряды одного могонейрона не меняли ритма

( Russell a.Wallen, 1987 ); 2 - антидромная стимуляция вентрального корешка не нарушала ритма в соседних сегментах С Wallen а. Lansner,l984 ). На наш взгляд, эти фанты не являются абсолютным доказательством в пользу существования премоторных пейсмекерных нейронов, так как "настроечная" деполяризация в 0,02-0,8 мВ, необходимая для синхронизации активности популяции мотонейронов ( Russell

В

Схема регуляции активности мотонейроноз в полусегменте спинного мозга миноги при локомоции.

А - две фазы локомоторного цикла, регистрируемые в мотонейронах: I - возбуадение; 2 - торможение. Общая продолжительность цикла - 200-1000 мс. Б - основные клеточные элементы полусегмента, активность которых создает локомоторный ритм. 1-6 - Мюллеровские аксоны, М - мотонейроны, ДЧК - дорсальные чувствительные клетки, И£_4 - тормозные ингернейроны, ЦКК - центральноканальные клетки, В1 - вентральный корешок, да - дорсальный корешок. В - схема взатеоде! ствия клеток в процессе выполнения локомоторной программы. И^ - возбуждающие интернейроны. Остальные обозначения, как на фрагменте Б, Черным цветом, обозначены клетки, содержащие ГАМК. Заштрихованы клетки, содержащие таурин. Пояснение работы схемы дано в тексте.

a. Valien,1983),можэт быть достигнута н благодаря электрическим связям мевду моторными клетками (Тамарова, 1978), а генераторы соседних сегментов могут работать независимо.

В предложенную нами схему легко вписываются данные, полученные в работах других авторов. Возбуждающие янтврнвйроны (Hj), раздражение которых увеличивает частоту разрядов в вентральных корешках, описаны Ровайненом ( Rovainen,1983 ), а также Бьюкененом я Гриллнером ( Buchanan а. Grillner, 1987 ), как клетки, которые возбуждаются моносинаптически от Мюллеровских аксонов и полисинапти-чески от ДЧК и сами,, в свою очередь, моносинаптически возбуждают сегментарные мотонейроны. Тормозные интернейроны (I^), ГАМК-ерги-ческие, по нашим данным, электрофизиологкчески исследованы Быоке-неном и другими авторами, установившими, что при их внутриклеточной стимуляции в мотонейронах возникают моносинаптическле ТПСП ( Hovainen, 1974; Buchanan а. Cohen,1982). Тормозные ннтернейроны (H3_4) морфологически креме нас пока никем не описаны, однако их локализация вблизи крупных иммунонегативных клеток-мишеней и выявленное накопление ими тормозящих аминокислот позволяет предполагать их тормозную функцию.

Морфологическую и физиологическую идентификацию сами типов клеток, включенных в предложенную схему, можно считать ее преимуществом перед другими аналогичными схемами. Определенным недостатком предложенного варианта ВДГ является отсутствие данных о связях с нейронами противоположной стороны и экспериментальной проверки на модели. То и другое может быть предметом дальнейшей работы.

Предложенный нами вариант генератора может показаться олишком. примимвным для исследователей, работающих на спинном мозге высших позвоночных, но подобные простые схемы функционируют у беспозвоночных ( Moore, 1979; Getting, 1980; Seiverston а. Miller, 1980; Brodfuchrer a. Prizen, 1987 ) и, видимо, могут использоваться у низших позвоночных животных.

ВЫВОДЫ

1. Исследованы механизмы взаимодействия между идентифицированными клетками спинномозгового сегмента миноги, выяснена роль супра-спинальных и соматосенсорных влияний на мотонейроны, сформировано представление о нейрональной сети, обеспечивающей координированные сокращения туловищных мышц и плавательные движения животных.

2. При использовании двух взаимодополняющих методов (электрофизио-

логического и морфологического) установлено, что около 20$ мотонейронов спинномозгового сегмента речной миноги имеют прямые контакты с отростками дорсальных чувствительных клеток. Через эти контакты осуществляется прямое сенсорное влияние на мотонейроны.

3. Методом антероградного транспорта пероксвдазы хрена выявлены окончания чувствительных нервов в красных мышечных волокнах миноги, что позволяет рассматривать эти волокна как структуры, предшествующие мышечным веретенам наземных позвоночных.

4. Результаты исследования электрических характеристик и синапти-ческих входов ка рэтикулоспзшалыше нейроны крутлоротых свидетельствуют о сходстве функциональных свойств этих клеток у всех видов позвоночных животных. Маугнеровские нейроны крутлоротых не отличаются по своим характеристикам от Мюллеровских клеток. Те и другие с минимальным латентным периодом интегрируют информацию со всех сенсорных систем и направляют командный сигнал

по нисходящим аксонам в спинной мозг.

5. Анализ унитарных БПСП позволяет заключить, что как ретикуло-, так и сенсомоторные БПСП состоят из двух компонентов - электрического и химического, отличапцихся по временному течению, амплитуде, чувствительности к недостатку Са^+ в среде и другим характеристикам.

6. Электрическая передача в синапсах на мотонейронах миноги устойчива: не зависит от изменений мембранного потенциала, наличия Са2+ в среде и остается стабильной при воздействии низкой температуры, асфиксии и наркотических веществ.

7. Получены результаты, свидетельствующие о том, что электрическая передача необходима в синапсах низших позвоночных для обеспечения функциональной связи моэду нейронами в условиях несовершенного гомеостаза и сильно меняющихся факторов внешней среды.

8. Удовлетворительное соответствие экспериментально полученных гистограмм амплитуд минимальных БПСП теоретическим кривым, соответствующим одной из основных закономерностей дискретного распределения случайных величин (Пуассон, бином, Гаусс) подтверждает дискретный характер выделения медиатора в ретикуло- и сен-сомоторных синапсах миноги.

9. Возбуждающие аминокислоты вызывают химически индуцированные тоет в; мембранах изолированных клеток л деполяризации нейронов препарата спинного мозга миноги. Исследование фармакологических

и канальных свойств позволяет заключить, что рецепторы возбуждающих аминокислот у круглоротых подразделяются на те же основные типы, что и у других позвоночных животных С Н1ША и не hmda рецепторы).

10. Иммуногистохимическим методом выявлена локализация в спинном мозгу миноги ГАМК и таурина. Распределение ГАМК- и таурин-содержащих клеток в совокупности с электрофизиологическими данными о влиянии ГАМК, глицина и таурина на' активность мотонейронов свидетельствуют о том, что основным тормозящим медиатором для моторных клеток является глицин. ГАМК, по-ввдимому, используется для модуляции активности элементов дорсальной части спинномозгового сегмента.

11. Наличие перекрестной десенситизации рецепторов мембран изолированных клеток при аппликации глицина и ГАМК, а также влияние специфических антагонистов (стрихнина, бикукуллнна, шосроток-сина) на химически индуцированные токи, вызванные глицином и ГАМК, свидетельствуют о наличии в мотонейронах и крупных кнтер-нейронах миноги единого рэцепторно-канального комплекса для тормозящих аминокислот, что можно рассматривать как эволюционное несовершенство, имеющее место на определенном этапе становления хеморецептивных свойств мембран нейронов в ряду позвоночных животных.

12. Локомоторный ритм, лежащий в основе увдулирушцих движений круглоротых Ii основанный на правильном чередовании "разряд - пауза" в вентральных корешках спинного мозга, обеспечивается определенной последовательностью вовлечения структурных элементов сегмента: нисходящих аксонов или/и сегментарных афферейтов, возбуждающих и тормозящих интернейронов, мотонейронов. Последние, обладая нюх рецепторами и способностью к генерации осцилляций мембранного потенциала, в условиях пониженной интврнейрональной активности, видимо, сами могут стать источником ритмических колебаний. Дудучи объединенными электрическими связями в единый функциональный модуль, мотонейроны могут принимать на себя функцию генератора локомоторного ритма.

Список основных публикаций по материалам диссертации:

1. Батуева И.В., Шаповалов А.И. Электрическая активность ретикулоспинальных нейронов речной миноги// Ж.эвол. биохим. физиол. - 1968 - т.4, Н4 - с. 432-445.

2. Батуева И.В. Свойства ретикулоспинальных нейронов миноги// Тезисы докладов 5-го научного совещания по эволюц. физиол., посв.памяти Л.А.Орбели. -Л.- Наука, 1968. - с. 22.

3. Батуева И.В., Белозерова Т.В. Ретикулоспинальные влияния на сегментарные нейроны у речной миноги // Ж. эвол. биохим. физиол. -1970 - т.4, N6 - с. 498-508.

4. Батуева И.В., Шаповалов А.И. Синаптические воздействия, вызываемые в мотонейронах миноги при супраспинальном и интраспинальном раздражении// Нейрофизиология. - 1974 - т.6, N6. -с. 629-635.

5. Батуева И.В., Шаповалов А.И. Синаптические воздействия, вызываемые в мотонейронах миноги при прямом раздражении одиночных преоинаптических волокон // Нейрофизиология. - 1977 - т.9, N4. -с. 330-395.

6.. Батуева И.В., Шаповалов A.M. Электротонические и химические ВПСП в мотонейронах миноги при раздражении нисходящего тракта и заднекорешковых афферентов // Нейрофизиология. - 1977 - т.9, N5. -о. 512-517.

7. Шаповалов A.M., Батуева И.В., Кожанов В.М. Синаптические процессы в центральных нейронах при активации индивидуальных преоинаптических элементов // В сб. Функциональное значение электрических процессов головного мозга. - Москва. - 1978 - с. 198-203.

8. Батуева И.В. Влияние недостатка кальция и добавления его антагонистов на синаптические потенциалы мотонейронов изолированного спинного мозга черепахи Emys orbicularis// Журн. эвол. биох. и физиол.- 1980.- т.16, N4.- с.365-370.

9. Батуева И.В. Модификация аминопиридином электротонической передачи в ретикуломотонейрональных синапсах миноги // Ж. эвол. биохим. физиол. - 1981 - т.17, N4. - с. 372-377.

10. Батуева И.В. Свойства элементарных синаптических потенциалов спинальных мотонейронов миноги // Тезисы 8-го научного

совещания по эволюционной физиологии.-Л., Наука,-1982 - с.27-29.

11. , Батуева И.В. Свойства элементарных синалтических потенциалов, вызванных в могонейронах миноги раздражением одиночных афферентов // Ж. эвол. биохим. $изиол. - 1983 - т.19, N1.- с.54-61.

12. Шаповалов А.И, Батуева И.В. Взаимодействие первичных сегментарных афферентов с мотонейронами в спинном мозге речной миноги // Физиол. Ж.СССР . - 1984 т.70, N8.- C.II78-II88.

13. Батуева И.В. Интегративные свойства электрических и химических синапсов в спинном мозге речной миноги // Тезисы цокл. на Всесоюзной конференции "Механизмы нервной интеграции". -Ленинград. - 1984. - с. 5-6.

14. Bàtueva I.V., Shapovalov A.I., Shiriaev B.I. Combined norphdlogical and electrophysiological description of connexions oetween single primary afferent fibres and individual motoneurons in the frog and fish spinal oord. // Abstr. of Fifth Internat. 3ymp.Motor control. - Varna.- 1985. - p.15.

15. Батуева И.В., Судеревская Е.И. Электрическая передача и ее юль в синапсах спинного мозга речной миноги // Ж. эвол. биохим. ризиол. - 1987 - т.23, N1. - с.68-75.

Î6. Батуева Й.В., Судеревская Е.И. Проекции первичных афферентов в туловищных сегментах спинного мозга черноморского жата // Тезисы докл. 9-го Всесоюзного совещания по эволюц. зизиол. - Ленинград. - 1986 - с.34-35.

17. Батуева И.В., Судеревская Е.И. Влияние таурина на юстсинаптические реакции в мотонейронах изолированного спинного юзга речной миноги // Тезисы докл. на конференции по нейронаукам. • Киев. - 1986 - с. 68.

18. Батуева И.В. Структура центральной и периферической части юрвичных-. соматических афферентов спинного мозга речной миноги// I. эвол. биохим. физиол. - 1987 - т.23, N3. - с.338-343.

19.' Батуева И.В., Веселкин Н.П., Судеревская Е.И. Тормозные ффекты таурина на мотонейроны спинного мозга речной миноги // эйрофизиология. - 1987 - т.19, N4. - с.551-554.

'20. Сафронов Б.В., Баев К.В., Батуева И.В., Русин К.И., удеревская, Е.И. Особенности влияния тормозных медиаторов на

нейроны спинного мозга миноги // Тезисы докл. Всесоюзной конференции по нейронаукам. - Киев - 1988 - с.63.

21. Batueva I.V. Meohanoreceptor cells of the lamprey spinal oord: features, inputs, connections // Abstr. of Satellite Symp. "Meohanoreceptors, development, Btruoture, function". - Prague -1987 - p.5.

22. Батуева И.В., Судеревская Е.И. Сегментарный контроль мотонейронов в спинном мозгу позвоночных // Тезисы докл. 15-го съезда Всесоюзного физиологического общества им.И.П.Павлова. -Кишинев. - 1987 -с. 187-188.

23. Batueva I.V. Effecienoy of eleotrical transmission in retioulomotoneuronal synapses of lamprey spinal cord // Exp.Brain Res. - 1987 - v.69, N1.- p.131-139.

24. Batueva I.V. Meohanoreoeptor cells of lamprey spinal cord: direct connections with identified segmental пеигопв // In: Mechanoreoeptors, ede.P.Hnik, T.Soukup et al.. Plenum Press, N-Y, - 1988 - p.361-364.

25. Батуева И.В., Шупляков О.В. Количественное исследование ретикуломогонейрональных контактов в спинном мозге речной миноги // Нейрофизиология. - 1988 - т.20, Кб. - с. 834-836.

26. Русин К.И., Баев К.В., Батуева И.В., Сафронов Б.В., Судеревская Е.И. Действие L-ДОФА и кислых аминокислот на изолированные нейроны спинного мозга миноги // Нейрофизиология. -1988. - Т.206, N5. - с.706-708.

27. Сафронов Б.В., Баев К.В.. Батуева И.В., Русин К.И.,

Судеревская Е.И. Особенности влияния глицина и гамца-аминомасляной кислоты на нейроны спинного мозга миноги // Нейрофизиология. - 1988. - т.20, N6. - с.823-825.

28. Русин К.И., Баев К.В., Батуева И.В., Сафронов Б.В., Судеревская Е.И. Действие Ь-ДОФА на нейроны спинного мозга миноги // Ж. эвол. биохим. физиол. - 1989. - т.25, N3. - с.404-405.

29. Батуева И.В., Судеревская Е.И., Веселкин Н.П., Пьер Ж., Реперан Ж. ГАЫК-иммунореактивные клетки в спинном мозгу речной миноги //Ж. эвол. биохим. физиол.-1989.-т.25, N5.- с. 678-680.

30. Сафронов Б.В., Баев К.В., Батуева И.В., Русин К.И., Судеревская Е.И. Единый рецепторно-канальный комплекс для

тормозящих медиаторов в мембранах нервных клеток спинного мозга миноги // Биомембраны. - 1989. - т.6, N9. - с. 977-986.

31. Safronov В.V., Baev К.У., Batueva I.V, Rusin K.I., Suderevskaya E.I. Peculiarities of receptor-channel complexes for inhibitory mediators in the membranes of lamprey spinal cord neurons // Neurosoi.bett. - 1989. - v.102, H1. - p.82-86.

32. Батуева И.В., Судеревская Е.И. Влияние глицина и гамма-аминомасляной кислоты на вызванную активность мотонейронов спинного мозга миноги //Нейрофизиология.-1990.-т.22, N3.-c.39I-394

33. Батуева И.В., Судеревская Е.И. Влияние глицина и гамма-аминомасляной кислоты на возбуждающие постсинаптические потенциалы спинальных мотонейронов миноги в присутствии антагонистов // Нейрофизиология. - 1990. - т.22, N3. - с.394-397.

34. Batueva I.V.-, Suderevskaya E.I., Vesselkin N.P., Pierre J., Keperant J. Localisation of GABA-immunopositive cells in the lamprey spinal cord // J. Hirnforsch.. - 1990 - v.31, N5. -p.739-745.

35. Батуева И.В., Судеревская Е.И. Фармакологическое исследование рецепторов тормозящих аминокислот в мотонейронах спинного мозга миноги // Тезисы докл. 10-го Всесоюзного совещания по эволюционной физиологии. - Ленинград. - 1990. - с.143.

36. Батуева И.В., Веселкин Н.П., Судеревская Е.И., Пьер Ж., Реперан Ж. Локализация и типы клеток, содержащих тормозящие аминокислоты в спинном мозгу речной миноги // Тесисы докл. 10-го Всесоюзного совещания по эволюционной физиологии . -Ленинград. - 1990. - с.225-226.

37. Судеревская Е.И., Батуева И.В., Веселкин Н.П. Тормозящие интернейроны и их роль в организации локомоторного ритма у круглоротых (речной миноги) // Тезисы докл. Всесоюзной школы-семинара "Актуальные вопросы локомошш первичноротых позвоночных". - Кара-даг. - 1990. - с.53.

38. Судеревская Е.И., Батуева A.B., Веселкин Н.П., Пьер Ж., Реперан Ж. Таурин-иммунореактивные элементы спинного мозга речной миноги // Ж. эвол. биох. физиол. - 1991. - т.27, N4. - с. 503-505.

39. Веселкин Н.П., Батуэва И.В., Кожанов В.М. Попытка идентификации рецепторов возбуждающих и тормозящих аминокислот в

спинном мозгу низших позвоночных // Биологические мембраны. -1991.- т.8, N11.- С.П79-И8Г.

40. Дитятев А.Э., Батуева И.В., Кожанов В.М. Пути стабилизации амплитуды постсинаптических потенциалов в межнейронных синапсах позвоночных // Е. эвол. биохим. физиол. . - 1992. - т.27, Н2. - с. 232-239.

41. Батуева И.В., Веселкин Н.П., Судеревская Е.И., Пьер Ж., Реперан Ж. Влияние тормозящих аминокислот на синаптическую активность мотонейронов спинного мозга миноги // Ж. эвол.биох. физиол. - 1992. - т.27, N2. - с.170-190.

Подписано к печати Ж>. 04 % . Заказ . Тира-- /й? Формат бумаги 60x84 1/16, пот. л. Бесплатно.

Ш-3. 191104 С.-Петербург, Литейный пр., дом № 55.