Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование электрохимического механизма влияния ГАМК на спинальные нейроны миноги

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование электрохимического механизма влияния ГАМК на спинальные нейроны миноги"



#

и РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ ИМЕНИ И.М.СБЧЕНОВА

На правах рукописи УДК 612.832+612.815.1

ЦВЕТКОВ ЕВГЕНИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО МЕХАНИЗМА ВЛИЯНИЯ ГАМК НА СПИНАЛЬНЫЕ НЕЙРОНЫ МИНОГИ

03.00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

Работа выполнена в лаборатории эволюции межнейронного взаимодействия (заведующий лабораторией - доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН Н.П. Веселкин) Института эволюционной физиологии и биохимии имени И.М.Сеченова РАН.

Ведушая организация: Институт физиологии им.И.П.Павлова РАН (Санкт-Петербург).

Защита состоится "13" октября 1998 г. в "......." часов на заседант

кандидатского совета к 002.89.01 Института эволюционной физиологии и биохимии им И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург пр. М.Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционно! физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова РАН

Научный руководитель: доктор биол. наук, вед.научный сотрудник

И.В. БАТУЕВА

Официальные оппоненты:

доктор биол. наук, профессор доктор биол. наук

А.А. АЛЕКСАНДРОВ Н.Я. ЛУКОМСКАЯ

Автореферат разослан "12" сентября 1998 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В середине 50-х годов были получены первые сведения об участии ГАМК в торможении нейронов ЦНС позвоночных животных (см. обзор Roberts et ah, 1976), в связи с чем в последующие десятилетия начались всесторонние исследования функциональной роли этой аминокислоты и механизмов ее действия. Было установлено, что в ЦНС различных представителей позвоночных и беспозвоночных животных имеются как минимум два типа ГАМК-рецепторов: бикукуллин-чувствителъные ГАМКа- и бикукуллин-нечувствительные ГАМКб-рецепторы (Bowery et al., 1980). В настоящее время имеются также данные о том, что ГАМКв-рецепторы опосредуют в основном пресинаптическую модуляцию синаптической передачи, в то время как ГАМКд-рецепторы могут быть ответственны как за постсинаптическое, так и за пресинаптическое действие ГАМК (обзор: Matsumoto, 1989).

В 80-х годах при использовании биохимических методов ГАМК была идентифицирована в спинном мозге миноги (Ногата, 1983). На интер- и мотонейронах спинного мозга миноги было показано, что эта аминокислота активирует бикукуллин-чувствителъные ГАМКд-рецепторы и ассоциированные с ними хлорные каналы, за счет чего оказывает тормозное действие на эти клетки (Homma & Rovainen, 1978; Сафронов и др., 1989). В начале 90-х годов были получены первые факты об участии ГАМК в модуляции локомоторной активности спинного мозга миноги (Alford et ah, 1990) и сделано предположение, что модулирующее действие этой аминокислоты связано с активацией пресинаптических ГАМК-рецепторов (Alford et ah, 1991). Основанием для такого предположения явились следующие факты. Было показано, что ГАМК, баклофен и мусцимол, вызывают деполяризацию аксонов интернейронов и модулируют активность, связанную с локомоторным ритмом (Alford et ah, 1991). ГАМК подавляет Са2+-компонент потенциалов действия (ПД) в соме (Leonard & WickeJgren, 1985; 1986) и отростках первичных афферентных клеток (Alford & Grillner, 1991), которые в спинном мозге миноги представлены дорсальными чувствительными клетками (ДЧК) (Martin & Wickelgren, 1971). Показано также, что ГАМК и баклофен уменьшают амплитуду моносинаптических ВПСП, вызванных в интер- и мотонейронах

стимуляцией ДЧК. При эхом мембранный потенциал (МП) и входное сопротивление в постсинаптических клетках не изменялось (СКшш^оп & ОгШпег Б, 1991). Позднее было показано депрессирующие влияние баклофена (агониста ГАМК) на Са2+-ток в мотонейронах и интернейронах спинного мозга миноги (МайивЫта е! а1., 1993). В пользу предположения о возможности пресинаптического торможения в спинном мозге круглоротых и участия в этом процессе ГАМК свидетельствовали также данные морфологов, поскольку методами иммуноцитохимии было показано, что ГАМК локализована в основном в дорсальных отделах спинного мозга (ВаШеуа е1 а!., 1990) и, что ГАМК-иммунопозитивные терминали контактируют с волокнами дорсальной колонны, в которой находятся, в основном, ДЧК и их отростки (Коуатеп, 1967; ОиъЯешоп М а1., 1991; СЬ^епзоп е! а1., 1993).

Несмотря на то, что данные, полученные в перечисленных выше работах, свидетельствуют о возможности пресинаптического торможения в спинном мозге круглоротых, до сих пор отсутствуют четкие экспериментальные доказательства того, что ГАМК действует именно на пре-, а не на постсинаптический элемент сенсомоторных синапсов; не достаточно понятен механизм этого влияния и его рецепторное обеспечение, не исследована также роль ГАМКа- и ГАМКв-рецепторов в этом процессе. Между тем вопрос о механизме пресинаптического торможения у круглоротых важен, так как исследования его деталей позволят сопоставить особенности этого механизма у круглоротых и млекопитающих, и тем самым выявить возможные пути совершенствования этого механизма в процессе эволюции.

Учитывая все вышесказанное, мы поставили ЦЕЛЬЮ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ исследование механизма влияния ГАМК на электрические параметры и ионные токи первичных механосенсорных афферентов (ДЧК) спинного мозга миноги. Поскольку литературные данные свидетельствуют о том, что ГАМК-опосредованное торможение первичных афферентов может быть связано со снижением поступления кальция внутрь клетки (Оип1ар & р13сЬЬасЬ, 1981; Оевагтетеп е£ а1., 1984), то основное внимание в настоящей работе было

:осредоточено на исследовании трансмембранного Са2+-тока в ДЧК и его модуляции агонисгами и антагонистами -у-аминомасляной кислоты.

Для достижения указанной выше цели были поставлены следующие ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЗАДАЧИ:

1) В условиях препарата изолированного мозга исследовать действие ГАМК на электрические параметры мембран сомы и отростков ДЧК. Выяснить, вызывает ли аппликация ГАМК деполяризацию сомы или отростков ДЧК, которая может свидетельствовать о наличии первичной афферентной деполяризации (ПАД), наблюдаемой во время пресинаптического торможения в спинальных нейронах высших позвоночных животных.

2) Исследовать трансмембранные ионные токи (Иа+, К+, Са2+) полностью изолированных ДЧК и изучить влияние на них у-аминомасляной кислоты.

3) Исследовать влияние агонистов и специфических антагонистов ГАМК на трансмембранный кальциевый ток в ДЧК и на основании фармакологических свойств определить тиц ГАМК-рецепторов, обеспечивающих модуляцию Са2+-тока.

4) На основании полученных данных сформулировать представление о возможном механизме пресинаптического торможения в афферентных путях спинного мозга круглоротых.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ. В условиях препарата изолированного спинного мозга миноги на основании тото, что ГАМК не изменяет амплитуду ПД ДЧК, не влияет на уровень МП и на входное сопротивление мембран этих клеток, было сделано заключение об отсутствии ГАМКл-рецепторов на мембранах ДЧК. Обнаруженные в большинстве ДЧК изменения длительности ПД были неодназначными и столь незначительными, что не позволяли сделать достоверный вывод относительно подавления ГАМК одного из компонентов ПД. На полностью изолированных ДЧК впервые исследованы кинетические параметры и фармакологические свойства основных потенциал-образующих токов 0Ча+, К+, Са2+). Показано, что несмотря на

большую разницу в уровне эволюционного развития между круглоротыми и высшими позвоночными животными, свойства потенциал-активируемых каналов для ионных токов, определяющих функциональные характеристики нервных клеток, являются сходными. Исследование фармакологических характеристик трансмембранного Са2+-тока в изолированных ДЧК подтвердило, что ГАМК уменьшает пиковую амплитуду входящего Са2+-тока, следствием чего может быть уменьшение выделения медиатора в сенсо-моторных и сенсо-интернейрональных синапсах. Показано, что действие ГАМК на Са2+-ток опосредуются ГАМКв-рецепторами. Агонисгы ГАМК для ГАМКл-рецепторов не влияют на амплитуду Са2+-тока. Антагонисты ГАМК для ГАМКв-рецепторов (2-гидросаклофен и 5-амино-п-валериановая кислота) блокируют эффекты ГАМК и баклофена (агониста ГАМК для ГАМКе-рецепторов). При использовании метода иммуногисгохимического выявления ГАМК в сочетении с методикой внутриклеточной окраски ДЧК пероксидазой хрена, впервые на электронно-микроскопическом уровне показано, что ГАМК-иммунопозитивные терминали образуют плотные контакты (типа "прилегания") с меченными пероксидазой хрена отростками ДЧК. Эти прилегания могут быть морфологическим субстратом пресинаптического торможения первичных сенсорных афферентов у миног.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Результаты проведенного исследования представляют интерес для общей нейрофизиологии, нейробиологии и физиологии нервной клетки. Они вносят существенный вклад в понимание механизма пресинаптического торможения в спинном мозге круглоротых и расширяют имеющиеся представления о принципах функциональной организации межнейронных синаптических связей в центральной нервной системе позвоночных, в частности, у миног. Полученные результаты имеют существенное значение для понимания механизмов регуляции активности сенсорных афферентов спинного мозга миноги, которая как известно, играет важную роль в координации работы локомоторной сети, обеспечивающей движение у миног. Результаты настоящей

заботы могут быть использованы для дополнения и уточнения имеющихся тейрональных моделей генератора локомоторного ритма у миног и могут быть юлезны для понимания процессов сенсомоторной координации движений у фугих позвоночных животных.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены и эбсуящены на следующих научных собраниях: Конференции молодых физиологов и биохимиков "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций" (Санкт-Петербург, 1995 г.); на 1(Х1) Международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996 г.); на ХХХШ Международном Конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997 г.); на |7й Европейской зимней конференции по нейронаукам [Мюнхен, 1997 г.)

ПУБЛИКАЦИИ: Основные результаты диссертации отражены в десяти публикациях

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ: Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Изложена на 165 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 рисунком и 3 таблицами. Библиография включает 297 наименований.

МЕТОДИКА И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве модельного препарата в настоящем исследовании была использована центральная нервная система (ЦНС) круглоротых. В экспериментах использовался спинной мозг трех видов миног: : Ichthyomyzon unicuspis {I. и.), Lampetra Л и via t¡/is (/../) и Petromyzon marinus (P.m.). Эксперименты выполнены как на препарате полностью изолированного спинного мозга, так и на изолированных ферментативно-механическим способом ДЧК и неидентифицированных мультиполярных нейронах спинного мозга (СМ) миноги. В опыты отбирали взрослых животных обоего пола с типичной для своего вида окраской и длинной. До использования в

эксперименте животные содержались в большиих резервуарах с аэрированной водой при температуре не выше 10 °С.

Методы, использованные при исследовании электрохимических

свойств ДЧК препарата изолированного спинного мозга

миноги.

Изоляция спинного мозга. Для изоляции спинного мозга миногу наркотизировали путем погружения на 5-7 мин в 0.025 %-ный раствор MS 222 (Sandos, Швейцария), затем вскрывали спинномозговой канал и после удаления оболочек вырезали фрагмент спинного мозга длинной около 2.5 см., который расположен ростральнее дорсального плавника. Выделенный мозг помещали в экспериментальную камеру, дно которой было прозрачным, что позволяло при освещении снизу проходящим светом фрагмента спинного мозга идентифицировать ДЧК визуально по характерным морфологическим признакам (Rovainen, 1967).

Растворы. Нормальный физиологический раствор, используемый для суперфузии, имел следующий состав (мМ): 115 NaCl, 2.0 KCl, 0.8 Nal I2PO4, 0.2 NaaHPO*, 2.0 CaClz, 0.9 MgCh, 8.0 ЫаНСОз, 5.5 СЛЬОб, pH 7.2-7.4. Раствор непрерывно аэрировали смесью 98 % Ог+ 2 % СОз. В ходе опыта нормальный физиологический раствор путем переключения протока заменяли на экспериментальный, в который добавляли ГАМК (5 мМ). Раствор с ГАМК (10 мМ) также апплицировали с помощью шприца через пипетку с отверстием 150200 мкм. Температура растворов в рабочей камере и пипетке в течение опыта поддерживалась в пределах 6-8 "С.

Стимуляция отростков ДЧК осуществлялась через радиочастотный выход стимулятора ЭСУ-1 Прямоугольными импульсами длительностью 0.1 мс с силой не более 50-60 мкА при помощи биполярного электрода, изготовленного из изолированной на всем протяжении и оголенной на торцах нихромовой проволоки с диаметром 100 мкм.

Регистрация ответов клеток производилась монополярно относительно индифферентного электрода с помощью стеклянных микроэлектродов, заполненных 3 М раствором хлорида калия. Мнкроэлсктроды вытягивались

на полуавтомате МЭ-3 из стеклянных (стекло марки "Пирекс") заготовок длиной 60-70 мм, диаметром 1.5-2 мм. Сопротивление микроэлектрода составляло 10-20 МОм, диаметр кончика - 0.5 мкм. Перемещение мнкроэлектродов осуществлялось во всех экспериментах с помощью микроманипулятора.

Усиление сигналов производилось усилителем постоянного тока с входным сопротивлением 1 ГОм. Усиленные сигналы подавались на осциллограф С-1-69 (Россия), который использовался для визуального наблюдения. Паралельно осциллографу через согласующий усилитель сигналы подавались на компьютер IBM РС-486. Мембранный потенциал клеток контролировался по цифровому милливольтметру и регистрировался при помощи самописца КСП4.

Наблюдение и запись потенциалов осуществлялись регистрирующей программой XS 2. Для записи потенциалов действия регистрировались выборки из 10 пробегов (1000 точек в пробеге, интервал между точками -50 мкс). Для анализа потенциалов действия использовали дае анализирующие программы: POTENTL9 (разработана в лаборатории эволюции межнейронного взаимодействия Института эволюционной физиологии и биохимии им И.М. Сеченова А.Г. Дитятевым) и CLAMPFIT пакета pCLAMP 6.4 (Axon Instruments, USA).

Методы, использованные при исследовании параметров

потенци ал-активируемых токов изолированных нейронов

спинного мозга миноги.

Изоляцию клеток осуществляли ферментативно-механическим способом, который включал в себя обработку изолированных фрагментов мозга протеолитическими ферментами (1) и последующую механическую диссоциацию ткани путем пипетирования через пипетки Пастера (2).

1) Ферментативная обработка мозга проводилась в два этапа. На первом этапе фрагменты изолированного мозга, длинной около 1 см, инкубировались в течение 25-30 мин. в растворе с коллагеназон (1.6 мг/мл, Collagenase Type IA, Sigma, USA, раствор №3), после чего (второй этап)

снимали мягкую мозговую оболочку, изготавливали фронтальные срезы толщиной 1.5 мм и помещали их на 2.5 часа в раствор с проназой (0.5 мг/мл, Pronase Е, Sigma, US, раствор № 4). После ферментативной обработки срезы мозга промывались в трех сменах нормального раствора (раствор № 1) с добавлением 0.03 мг/10мл стрихнина и 0.05 мг/Юмл леопептина (по 10, 5, 10 мин, соответственно). В первый промывочный раствор добавляли бычий сывороточный альбумин (8 мг/Юмл, BSA, Sigma, USA). Инкубирование проводилось на шейкере при постоянной аэрации растворов кислородом; температура поддерживалась на уровне 8-10 °С.

2) Механическую диссоциацию спинномозговой ткани осуществляли путем многократного пропускания срезов через пипетки Пастера с диаметром кончиков от 720 мкм до 150 мкм. Через 20-30 минут мозг полностью распадался и клетки в растворе переносились в экспериментальную камеру для проведения электрофизиологических тестов.

Экспериментальная камера, состояла из двух отсеков - большого и малого. В большом отсеке (объем 5 мл) производили выбор клетки для тестирования и путем приложения отрицательного давления в пипетке добивались контакта внутрипипеточного раствора с цитоплазмой клетки (конфигурация "целая клетка"). В малом отсеке камеры, объемом 0.5 мл, проводили электрофизиологические и фармакологические тесты. Малый отсек отделялся от большого плексигласовой перегородкой, что предотвращало попадание тестирующих растворов из малого отсека камеры в большой, где в нормальном растворе (раствор № 1) хранились клетки, используемые в последующих тестах.

Изготовление пипеток. Для обеспечения контакта с клеткой применялись микропипетки, изготовленные из микрогематокритных капиллярных трубок (Fischer Sei. brand, USA). Пипетки вытягивались в две стадии на кузнице МЭ-3 (Киев, Украина). Кончик пипетки оплавляли, после чего его внутренний диаметр составлял 1.5-2.5 мкм. Оплавленные микропипетки покрывались изоляционным воском, заполнялись одним из растворов, приведенных в табл.1 (раствор N6, N7, N8 или N9 в зависимости от типа электрофизиологического теста), и закреплялись в держателе установки.

Держатель, в свою очередь, крепился на микроманипуляторе, с помощью соторого кончик пипетки подводился к клетке в экспериментальной камере.

Регистрация токов. Токи регистрировались монополярно относительно индифферентного электрода в условиях фиксации потенциала на целой клетке [метод пэтч-кламп в конфигурации "whole-cell"- "целая клетка"). Емкостной гок и ток утечки компенсировали с помощью метода, описанного в литературе 'Сигворс и др., 1987). В работе был использован усилитель AXOPATCH-1D с головкой CV-4 (Axon Instruments, USA). Во входной головке применялось сопротивление обратной связи 5 ГОм. Регистрируемые токи оцифровывались аналого-цифровым преобразователем DigiData-1200 (Axon Instruments, USA) и сохранялись на твердом диске компьютера IBM РС-486 (USA) программой CLAMPEX пакета pCLAMP 6.2. Высокочастотные шумы до ввода в ЭВМ удалялись фильтром Бесселя второго порядка с полосой пропускания 3 кГц. Программа CLAMPEX позволяет фиксировать потенциал или ток на мембране на заданном уровне и смещать их в соответствии с задачей эксперимента. Анализ данных проводился программой CLAMPFIT того же пакета. Документальная запись осуществлялась струйным принтером DeskJet 500C (Hewlett Packard, USA).

Растворы, используемые в экспериментах. При исследовании грансмембранных токов у изолированных нейронов спинного мозга миноги применялись растворы, состав которых зависел от целей и задач конкретного эксперимента. Полный перечень использованных растворов представлен в таблице № 1. Смена растворов в экспериментальной камере осуществлялась путем переключения протока, однако, в тех случаях, когда была необходима преинкубация каким-либо фармакологическим агентом, проводилась аппликация фармакологических веществ из шприца Гамильтона.

Средние величины параметров, представленных в разделе "Результаты и их обсуждение", приведены со средней квадратичной ошибкой и рассчитывались по методике, описанной в литературе (Лакин, 1980). Достоверность различий оценивалась по критерию Стьюдента.

Таблица № 1. Растворы, используемые в опытах на

изолированных клетках.

Номера растворов и концентрации солей (мМ/л)

Наружные растворы Пипеточные растворы

№ 1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 №9

N801 92.00 115.00 92.00 92.00 - - - - -

к а 3.40 2.30 3.38 3.43 - - - -

С,1СЬ*2Н:0 2.60 4.70 0.99 - - - - -

М $СЬ 2.40 0.90 0.99 2.40 2.40 - - - -

ВиС1:*2НаО - - - - 60.00 - - - -

ЭГТА 0.30 0.30 1.50 0.10 5.00 8.50 8.50 5.00

НЕРЕЭ-Ка 20.00 - 20.00 20.00 - - • -

НЕРЕЭ - - . - 15.00 - 10.00 10.00

КаНССЬ 3.00 6.40 3.00 3.00 - - - - -

ИаНгРО^ 0.75 0.80 0.75 0.75 - - -

1ЧагНРС>4 0.25 0.20 0.25 0.25 - - - -

СйНиОб 10.00 8.00 10.00 9.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00

ТЕА-С1 - - - - 40.50 - 8.00 8.00 -

К.Р - - - 110.00 - - 55.00

ОС! - - - - - - 55.00

Тпэ-Ъаяе - - - - 20.00 - - -

С;з Гототамат - - - - 100.00 50.00

СзМеБО« - - - - 20.00 20.00 -

АТФ'Тпв - - - - - 5.00 -

ГГФ*Тп8 - - - - - - 1.00 -

КФ*ТП8 - - - - - 14.00 -

КФК - - - - - - - 50и/т -

Леопсптин - 10*10-» 10*10* -

РН 7.4 7.3 7.4 7.4 7.4 7.2 7.3 7.3 7.3

Сокращения:

АТФ*Тт - Аденозин-5-трифосфат; ГТФ*Тп$ - Гуанозин-5-трифосфат; КФ*Тп$ -Креатинфосфат; КФК - Креатинфосфокиназа; ЭГТА - Этиленгликоль тетрауксусная кислота; ТЭА-С1 - Тетраэтиламмоний-хлорид.

Использованные растворы:

№ 1 - нормальный раствор для изолированных клеток; Ка 2 - раствор для препаровки спинного мозга; № 3, № 4 - раствор для коллагеназы и ироназы, соответственно; № 5 - нормальный раствор для исследования токов через Са2+-каналы; № 6, № 7, № 8, № 9 - пипеточные растворы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Исследование действия ГАМК на электрические параметры ДЧК миноги Lampetra fluviatilis в условиях препарата спинного мозга.

При вну!риклеточном отведении МП ДЧК его значение, в среднем, составило 74.6±2.3 мВ, п=83. При раздражении рострально и/или каудально идущих отростков этих клеток импульсами деполяризующего тока в соме ДЧК регистрировались одиночные ПД со средней амплитудой 104±3.2 мВ. Сопротивление мембран ДЧК составило 36±4 МОм.

Действие у-аминомасляной кислоты было исследовано на 47 клетках. Во всех тестах суперфузия препарата мозга раствором с ГАМК в течении 5-10 мин не вызывала изменений уровня МП и амплитуды вызванных ПД у большинства ДЧК. Аналогичные тесты проводились на клетках сенсорных ганглиев других позвоночных животных (De Groat, 1972; Adams & Brown, 1975; besehenes et al., 1976). В большинстве описанных случаях было показано, что, в отличие от миног, аппликация ГАМК на сенсорные нейроны этих животных вызывает деполяризацию соматической мембраны (De Groat, 1972; Adams & Brown, 1975; Deschenes et al., 1976; Curtis & Lodge, 1982; Evans, 1986) и уменьшение амплитуды ПД (Cattaert et al., 1992).

По своей природе ГАМК-индуиируемая деполяризация (ГИД) аналогична так называемой первичной афферентной деполяризации (ПАД), которая регистрируется у многих животных во время пресинаптического торможения (Deschenes et al., 1976; Lovick, 1981; Kelly & Smith, 1988; Cattaert et al., 1994). Также как и ГИД, ПАД является хлор-зависимым процессом и блокируется бикукуллином (Levy, 1975; Lovick, 1981; Kelly & Smith, 1988) и пикротоксином (Cattaertet al., 1992), которые являются специфическими блокаторами ГАМКд-рецепторов (Bowery et al., 1981; Hill & Bowery, 1981; Newbeny & Nicoll, 1984). Отсутствие деполяризации сомы ДЧК миног при аппликации этой аминокислоты, вероятнее всего, свидетельствует о том, что бикукуллин-чувствительная группа ГАМК-рецепторов не представлена на соматической мембране этих клеток.

Учитывая, что ПАД в мозге других позвоночных животных развивается, прежде всего, на терминальных отростках сенсорных нейронов (Lew, 1975; Lovick, 1981; Kelly & Smith, 1988), а не на их соматической мембране, нами был проведен анализ порогов возникновения ПД на соме ДЧК при раздражении ростральных и/или каудальных отростков этих клеток. При проведении теста мы руководствовались теоретическим положением о том, что следствием кратковременной деполяризации отростков ДЧК (если таковая присутствует) будет снижение порога возникновения антидромного ПД, регистрируемого на соме клетки (Wall, 1958).

Проведенные тесты показали, что добавление в суперфузирующий раствор ГАМК не вызывает изменения возбудимости волокон ДЧК, поскольку пороговый потенциал антидромного ПД у всех исследованных клеток оставался стабильным на протяжении всего времени подачи ГАМК (n= 15). Последнее с высокой степенью вероятности, свидетельствует о том, что ГАМК-индуцированная деполяризация - аналог ПАД высших позвоночных, и, соответственно, ГЛМКА-рецепторы, отсутствуют не только на плазматической мембране сомы ДЧК, но и на их отростках. Сделанный вывод дает основание предположить, чго у миног механизм пресинаптического торможения реализуется не через активацию ГА М Кд-рецептор о в, а посредством иного механизма.

Основываясь на полученных нами данных об отсутствии деполяризующего действия ГАМК на мембраны ДЧК, а также на данных литературы о наличии в спинном мозге миноги ГАМКв-рецепторов (Christenson & Grillner, 1991), можно было предположить, что у миног в обеспечении пресинаптического торможения участвуют не ГАМКд-, а ГАМКв-рецепторы, что имеет место у некоторых других позвоночных животных (Deisz & Zux, 1985, Stuart & Redman, 1992). Для проверки этого предположения нами был проведен анализ влияния ГАМК на длительность вызванных ПД ДЧК миног. При проведении этого анализа мы руководствовались данными литературы о том, что активация ГАМКв-рецепторов модулирует работу калиевых и/или кальциевых каналов и, как следствие этого, приводит к изменению формы ПД, а точнее к изменению его длительности. Подобный

эффект ГАМК (баклофена) был описан на сенсорных клетках некоторых позвоночных животных (Dunlap & Fischbach, 1981, Klein & Kandel, 1978), a также на нейронах спинного мозга миноги (Leonard & Wickeigren, 1985, Leonard & Wickeigren, 1986).

Проведенные тесты показали, что в наших экспериментальных условиях аппликация ГАМК изменяет длительность ПД ДЧК. Однако, эффект, проверенный на 18 клетках, оказался неоднозначным. В большинстве случаев длительность спайка уменьшалась (п=10), у части клеток - не изменялась (п=4) или наоборот возрастала (п=4). Суммарный эффект влияния ГАМК на длительность ПД составил -2.16% от нормы. Однако, статистический анализ показал, что этот эффект не является достоверным. Полученный результат может означать либо то, что на мембранах ДЧК миног ГАМКв-рецепторы вообще отсутствуют, либо, что активация этих рецепторов приводит к модуляции кальциевого компонента ПД, который в нормальном физиологическом растворе маскируется натриевым и калиевым токами, текущими во время ПД. Поэтому для ответа на вопрос о влиянии ГАМК на кальциевый ток были необходимы дополнительные исследования с использованием более адекватных методов.

Исследование основных свойств трансмембранных токов изолированных ДЧК методом пэтч-кламп.

Для более обоснованного заключения о влиянии ГАМК и ее агонистов и антагонистов на токи, текущие через мембрану ДЧК, был использован метод фиксации потенциала сомы клеток, изолированных ферментативно-механическим способом. Возможность применения этого метода к изолированным нейронам спинного мозга миноги была показана ранее (Русин и др., 1988). Однако ионные токи, лежащие в основе ПД, не были исследованы, что и определило следующий этап настоящей работы, который включал в себя описание основных кинетических параметров трансмембранных токов ДЧК.

Проведенные тесты показали, что при фиксации МП на уровне -100 мВ деполяризация ДЧК импульсом потенциала (от -70 до 10 мВ,

длительностью 50-100 мс) вызывала появление интегрального трансмембранного тока, который помимо емкостного тока и тока утечки включал в себя ионный компонент, состоящий из Na+-, К+- и, при определенных условиях (см. ниже), Са2+-токов (n=32, L.f).

Характеристики Na+-TOKa исследовались в условиях блокады калиевого тока ТЭА (наружный раствор №1 с добавлением от 10 до 100 мМ ТЭА, пипеточный раствор №7 или №9). Было показано, что этот ток однороден и полностью блокируется 1 мкМ ТТХ. Судя по кинетике инактивации и активации, процессы, происходящие в натриевых каналах ДЧК, по-видимому, аналогичны таковым у высших позвоночных (Ranson & Holz, 1977, Matsuda et al., 1978, Fukuda & Kameyama, 1980, Kostyuk et al., 1981), и также могут быть описаны в рамках модели Ходжкина и Хаксли (Hodgkin & Huxley, 1952).

К+-ток исследовался в условиях блокады натриевой проводимости ТТХ (наружный раствор № 1 с добавлением 1 мкМ ТТХ, внутрипипеточный раствор № 6). Этот ток активировался при потенциале около -70 мВ и далее линейно возрастал пропорционально МП. В отличие от Na+-TOKa, выходящий К+-ток не проявлял признаков инактивации в течении 500-1000 мс записи при любом надпороговом потенциале. Также как и Na+-TOK, К+-ток может быть описан в терминах модели Ходжкина и Хаксли (Hodgkin & Huxley, 1952). Следует отметить, что в большинстве ДЧК наряду с медленным К+-током также наблюдался выходящий ток с более быстрой кинетикой. Этот компонент был более чувствителен к блокаторам К+-каналов (ТЭА, 4-АП), чем медленный К+-ток, но изолировать и изучать его кинетические характеристики не входило в наши задачи.

Са2+-ток исследовался в условиях блокады калиевого и натриевого компонентов трансмембранного тока при использовании наружного раствора № 1, в который добавляли СаСЬ до 10 мМ, и пипеточного раствора №8 с добавлением ферментов. В этих условиях деполяризация мембраны ДЧК вызывала входящий ток через кальциевые каналы, который имел сходные характеристики у использованных видов миног (п=32, L.f:, п=20, f.и:, п=14, P.m.). Саг+-ток был неоднородным и включал в себя быстро и медленно

инактивирующиеся компоненты. Судя по порогу этих компонентов и по особенностям их инактивации можно предполагать, что на мембране ДЧК у всех исследованных видов миног существует по крайней мере два типа кальциевых каналов: высоко- и низкопороговые. Для более обоснованного заключения о типах Са2+-каналов необходимы дополнительные исследования с применением канальных блокаторов.

Для изучения свойств Са2+-каналов более удобным носителем тока являются ионы бария (Fenwick et al., 1982), поэтому тесты, направленные на изучение основных кинетических (за исключением параметров инактивации) и фармакологических характеристик Са1+-каналов, проводились с использованием наружного раствора № 5, в котором ионы Са2+ были заменены на ионы бария. Замена ионов в наружном растворе приводила к возрастанию амплитуды регистрируемого тока и исчезновению его инактивации, при этом другие характеристики тока, как-то: зависимость времени до пика, вольт-амперная характеристика и кривая проводимости не изменялись (n=32, L.f.\ n=20, J.u.; п=14, P.m.).

Таким образом, исследование основных параметров трансмембранных токов ДЧК миног показало, что эти токи не имеют особых отличий от соответствующих токов нейронов высших позвоночных животных. Последнее свидетельствует о том, что ферментативная обработка СМ не нарушает основных свойств мембран спинальных нейронов миноги, что позволило перейти к следующему этапу работы, а именно к изучению модулирующего влияния ГАМК, ее агонистов и антагонистов на отдельные токи ДЧК, т.е. к фармакологическим тестам.

Исследование влияния ГАМК, агонистов ГАМКа- и ГАМКв-рецепторов активируемые на потенциал-чувствительные токи ДЧК миног.

При добавлении ГАМК (1-4 мМ) в суперфузирующий раствор было установлено, что эта аминокислота не оказывает влияния на калиевый и натриевый компоненты трансмембранного тока (n=10, L.£), однако статистически достоверно снижает амплитуду Ва2+-тока, текущего через

кальциевые каналы (п=11, ¿./; п=20, /а.; п=14, Р.т.). Выраженность ГАМК-эффскта варьировала у разных клеток (независимо от вида) от 13 до 100%. В среднем уменьшение амплитуды Ва2+-тока при действии ГАМК составило 28.5 ± 4.9 % (п=45).

Для исследования механизма действия ГАМК была проведена серия экспериментов с применением специфических антагонистов ГАМКа- и ГАМКб-рецепторов. Тесты показали, что специфический антагонист ГАМКл-рецепторов - бикукуллин (100 мкМ, п=7, Ь.Г) - не влиял на ГАМК-эффекты, в то время как дигидросаклофен (160 мкМ, п=4, Ь.Е) - специфический антагонист ГАМКв-рецепторов - стабилизировал Ва24"-ток и делал его нечувствительным к действию ГАМК. Полученный результат свидетельствует о том, что ГАМК модулирует Ва2+-ток ДЧК посредством активации ГАМКв-рецепторов. Этот вывод был подтвержден при тестировании действия специфических агонистов ГАМК на Ва2+-ток. Было показано, что специфические агонисты ГАМКа-рецепторов - глицин (1 мМ, п=8, Ь.Г) и таурин (5 мМ, п=6, Ь.£) - не вызывали изменения амплитуды Ва2+-тока, подобно ГАМК, в то время как специфические агонисты ГАМКв-рецепторов - баклофен (0.5 мМ, п=12 1.и:, п=25, X./) и мусцимол (0.5 мМ, п=8, ¡.и.) - оказывали такое же воздействие на Ва2+-ток, как и ГАМК, и снижали амплитуду Ва2+-тока в среднем на 28.4±3.3%, и на 13.5 ± 3.1 %, соответственно.

Действие баклофена бьшо изучено более детально на миногах вида Ьатрс1га АиуШПк;. Применение специфических антагонистов показало, что эффект баклофена, так же как и влияние ГАМК, не устранялся бикукуллином (п=2), в то время как специфические антагонисты ГАМКБ-рецепторов -6-амино-валериановая кислота (0.5 мМ, п=6, Ь.Г.) и дигидросаклофен (100 мкМ, п=4, Ь.£) - полностью устраняли депрессирующий эффект баклофена на Ва2+-токи.

Для того, чтобы убедиться в том, что снижение амплитуды Ва2+-тока при воздействии ГАМК и баклофена не связано с шунтирующим действием этих веществ на мембраны ДЧК (что возможно в случае активации хеморецептивных каналов, например хлорных) было исследовано влияние этих веществ на проводимость мембран ДЧК (наружный раствор № 1, пипеточный

раствор №6). Об изменении проводимости судили по изменению амплитуды пассивного тока, возникающего при подаче серии подпороговых импульсов потенциала с амплитудой 20 мВ, длительностью 100 мс и интервалом 200 мс. Измерения, проведенные на 8 ДЧК (£./"), дали однозначные результаты: ни в одной клетке проводимость мембраны при действии ГАМК и баклофена не изменялась. В то же время аналогичные тесты, проведенные на ветвистых неидентифицированных спинальных нейронах, свидетельствовали о том, что ГАМК, активируя ГАМКд-рецепторы, увеличивает проводимость мембраны нейронов и вызывает хеморецептивный хлорный ток, а баклофен, не являясь агонистом ГАМКл-рецепторов, как и следовало ожидать, подобного действия не оказывал (п=8).

Таким образом, проведенные эксперименты убедительно свидетельствуют о том, что на мембране сомы ДЧК имеются ГАМКб-рецепторы. Несмотря на то, что методический подход, использованный в работе, не дает возможности с полной уверенностью утверждать, что эти рецепторы присутствуют не только на соме, но и на отростках ДЧК, мы, основываясь на собственных данных и данных литературы (Alford & Grillner, 1991), полагаем, что функциональное назначение ГАМКв-рецепторов связано с обеспечением механизма пресинаптического торможения. Дополнительным серьезным аргументом в пользу этого предположения может служить факт наличия на отростках ДЧК особых структур, которые могли бы представлять собой морфологический субстрат пресинаптического торможения. В связи с этим следующим этапом работы явилось исследование ультраструктурных особенностей контактов между меченными пероксидазой хрена отростками ДЧК и ГАМК-иммунопозитивными клетками спинного мозга миноги. Эти исследования были выполнены морфологами нашей лаборатории (Аданина В.Д, Веселкин Н.П.) при нашем участии.

Исследования, выполненные на ультратонких срезах спинного мозга миноги показали, что в его дорсальном отделе помимо меченных ПХ ГАМК-иммунонегативных профилей отростков ДЧК имеются ГАМК-иммунопозитивные и ГАМК-иммунонегативные профили

неидентифицированных клеток и их отростков. ГАМК-иммунопозитивные

профили, содержащие синаптические везикулы и с высоким содержанием ГАМК были квалифицированы как профили отростков тормозных ГАМК-содержащих нейронов.

Было установлено также, что отростки ДЧК и ГАМК-содержащие элементы образуют аксо-дендритные синапсы с неидентифицированными дендритами. В отличие от них ультраструктуры типа аксо-аксональных синаптических контактов между отростками ДЧК и ГАМК-позитивными элементами наблюдались крайне редко - не более 2-3% исследованных случаев. В то же время ГАМК-иммунопозитивные профили, содержащие везикулы, образовывали плотные прилегания к аксонам ДЧК в непосредственной близости от их контактов с постсинаптаческими нейронами. Мембраны в области плотных прилеганий профилей отростков ДЧК и ГАМК-иммунопозитивных элементов не проявляли структурной специфики, характерной для синапсов.

Полученные результаты дают основание предположить, что плотные прилегания, наряду с аксо-аксональными синапсами, также представляют собой морфологический субстрат пресинаптического торможения. В этом случае, активация ГАМК-рецепторов на мембране афферентов может происходить не только синаптически, но и экстрасинаптически и такая возможность в настоящий момент обсуждается в литературе (Stuart & Redman, 1992). Сопоставляя полученные факты с данными литературы, можно предположить, что ГАМК активирует рецепторы отростков ДЧК либо в результате несинаптического выделения (Christenson et al., 1993, Agnati & Fuxe, 1998, Barb our & Hausser, 1997, Fuxe & Agnati, 1991), либо путем диффузии из пресинаптических терминален близлежащих аксо-дендритных синапсов (Somogyi, 1989, Mody et al., 1994).

Независимо от того, каким образом ГАМК достигает рецепторов на мембранах первичных афферентов, механизм пресинаптического торможения у миног может быть представлен схемой, согласно которой отростки ДЧК являются основным звеном, которое подвергается модуляции ГАМК, выделяемой из ГАМК-ергических окончаний интернейронов. Высвобождение ГАМК из этих терминален может приводить к модуляции эффективности

синаптической передачи в сенсомоторном синапсе за счет активации ГАМКв-рецепторов на отростках ДЧК и уменьшения входа Ca2' в контактных зонах первичных афферентов.

При сравнении экспериментальных данных, полученных на спинном мозге круглоротых и млекопитающих следует отметить, что физиологический и морфологический базис пресинаптического торможения первичных афферентов у этих животных не совпадает в деталях. В частности, у миног пресинаптическое торможение опосредуется ГАМКв-рецепторами, в то время как ГАМКл-рецепторы, по крайней мере на ДЧК, отсутствуют. В отличие от круглоротых, пресинаптическое торможение на первичных афферентах млекопитающих опосредуется ГАМКл- (Persohns et al., 1991; Stuart & Redman, 1992; Thompson & Wall, 1996) и/или ГАМКв-рецепторами (Dunlap, 1981; Deisz & Zux, 1985; Stuart & Redman, 1992; Matsushima et al., 1993). Кроме того, у млекопитающих ГАМК-содержащие бутоны образуют синаптические контакты с первичными афферентными волоконами, которые были описаны в деталях ранее (Barber et al., 1978; Maxwell, 1990), в то время, как у круглоротых подобные синапсы встречаются очень редко, если они вообще есть (Christenson et al., 1993 и настоящая работа).

Вероятно, особенности физиологических и морфологических характеристик пресинаптического торможения у круглоротых и млекопитающих связаны с эволюционными различиями. Тем не менее, необходимо отметить, что у миног был исследован всего лишь один тип сенсорных афферентов (Christenson et al., 1988а; Christenson et al., 1988b), которые представлены ДЧК. Поэтому нельзя исключать возможность того, что ГАМКл-зависимое пресинаптическое торможение и соответствующий ему синаптический аппарат могут быть реализованы в других функциональных сетях спинного мозга миноги.

22

ВЫВОДЫ:

1) Исследования, проведенные на препарате изолированного спинного мозга миноги, показали, что ГАМК не изменяет электрических параметров соматической мембраны первичных афферентных клеток (ДЧК) и не изменяет порога возникновения ортодромного ПД. Эти факты ставят под сомнение представление о возможном участии ГАМКл-рецепторов в лресинаптическом торможении первичных сенсорных афферентов у этих животных.

2) Исследование кинетических и фармакологических свойств основных потендиал-активируемых токов (Na+, К+, Са2+) в изолированных ДЧК показало, что эти свойства близки к таковым у нервных клеток высших позвоночных животных: имеется несколько типов калиевых и кальциевых каналов, в то время как каналы для натрия однородны.

3) Установлено, что ГАМК и баклофен не изменяют параметров Na+-и К+ трансмембранных токов ДЧК, но уменьшают (на 28% и 22%, соответственно) максимальную амплитуду Са2+-тока.

4) Применение агонистов и антагонистов ГАМКл- и ГАМКв-рецепторов показало, что модуляция Са2+-тока осуществляется за счет активации ГАМКв-рецепторов, в то время как ГАМКд-рецепторы не участвуют в этом процессе, и по-видимому отсутствуют на мембранах ДЧК.

5) В основе механизма пресинаптического торможения активности мото- и интернейронов миноги, обнаруженного ранее при раздражении первичных афферентов (ДЧК), лежит воздействие ГАМК на ГАМКв-рецепторы и уменьшение поступления Са2+ внутрь ДЧК, что, в свою очередь, приводит к уменьшению выделения медиатора в пресинаптических структурах, локализованных на соме и отростках этих клеток.

6) ГАМК, выделяемая из многочисленных ГАМК-имунопозитивных элементов, расположенных в дорсальной части спинного мозга миноги, видимо, оказывает экстрасинаптическое действие на ГАМКв-рецепторы. Предполагается, что ГАМК может выделяться несинаптически из прилегающих к отросткам ДЧК ГАМК-ергических элементов и/или

диффундировать из аксо-дендритных синапсов, расположенных иа других клетках.

7) Полученные результаты позволяют провести сопоставление

исследованных механизмов пресинаптического торможения в спинном мозге круглоротых и млекопитающих и выявить возможные пути совершенствования этих механизмов в процессе эволюции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Батуева И.В., Судеревская Е.И., Цветков Е.А., Веселкин Н.П. Исследование влияния гамма-аминомасляной кислоты на дорсальные чувствительные клетки изолированного спинного мозга миноги, Ж. эвол. биох. и физиол. ¡995, Т.31, С.286-291.

2. Батуева И.В., Цветков Е.А., Бьюкенен Дж.Т., Веселкин Н.П. Исследование потенциал-активируемых токов в изолированных нейронах спинного мозга речной миноги Lampetra fluviatilis, Ж. эвол. биох. и физиол. 1996, Т.32, С.267-283.

3. Цветков Е.А. Потенциал-зависимые токи в нейронах спинного мозга миноги, Материалы конф. "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций". Санкт-Петербург, Россия, 19-21 сентября 1996, С. 190.

4. Батуева И.В., Бьюкенен Дж.Т., Цветков Е.А., Веселкин Н.П. Модуляция токов кальциевых каналов в дорсальных чувствительных клетках спинного мозга миноги, Сб. тезисов 1(Х1) Межд. совещ. по эвол. физиологии. Санкт-Петербург, Россия 1996, С. 16-17.

5. Батуева И.В., Бьюкенен Дж.Т., Цветков Е.А., Сагателян А.К., Веселкин Н.П. Кальциевый ток и ГАМКб рецепторы в дорсальных чувствительных клетках спинного мозга миноги, Росс. Физиол. Журн. 1997, Т.83, С.79-90.

6. Батуева И.В., Бьюкенен Дж.Т., Цветков Е.А., Сагателян A.K., Веселкин Н.П. Влияние баклофена на ток кальциевых каналов в дорсальных

чувствительных клетках спинного мозга миноги, Росс. Физиол. Журн. 1997, Т.83, С.92-104.

7. Vesselkin N.P., Batueva I.V., Buchanan J.T., Kurchavyi G.G., Tsvetkov E.A., Sagatelyan A.K., Suderevskaya E.I., Reperant J., Rio J.-P., Adanina V.O. DifTerent functional properties of different types of neurons in spinal cord of lower vertebrates, In Abstr. of 33 Internat. Congr. of Physiol. Sei IUPS Abstr. L072.05. St. Peterburg, Russia Congress, St.Peterburg 1997.

8. Vesselkin N.P., Reperant J., Batueva I.V., Buchanan J.T., Adanina V.O., Rio J.-P., Tsvetkov E.A. GABA-imunopositive boutons contact the primary afferent terminals in the lamprey spinal cord, In Abstr. of 17th Eur.Winter Conference of Brain Research, Arc 2000 (France) 1997, P.73.

9. Сагателян A.K., Судеревская Е.И., Батуева И.В., Бьюкенен Дж.Т., Веселкин Н.П., Цветков Е.А. ГАМК-активируемый хлорный ток в изолированных нейронах спинного мозга миноги, Ж. эвол. биох. и физиол. 1998, Т.34, С.419-

10. Batueva I.V., Tsvetkov Е.А., Sagatelyan А.К., Buchanan J.Т., Vesselkin N.P., Adanina V.O., Suderevskaya E.I., Rio J.-P., Reperant J. Physiological and morphological correlates of presynaptic inhibition in primary afferents of the lamprey spinal cord // Neuroscience (1998, принято в печать).

Работа выполнена при финансовой поддержке NIH Fogarty International Research Collaboration Awards (США, грант № 1 R03 TW00245-01), Российского фонда фундаментальных исследований (Россия, гранты № 93-04-7461, № 96-04-50611 и № 9615-97650) и гранта 1997 года для студентов, аспирантов и молодых ученых Санкт-Петербурга (№ М97-2.4К-547).

429.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цветков, Евгений Александрович, Санкт-Петербург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ

ИМ.И.М.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК 612.832+612.815.1

ЦВЕТКОВ Евгений Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО МЕХАНИЗМА ВЛИЯНИЯ ГАМК НА СПИНАЛЬНЫЕ НЕЙРОНЫ МИНОГИ

Диссертация

На соискание ученой степени кандидата биологических наук Специальность: 03.00.13 - Физиология человека и животных

Научный руководитель: вед. научный сотрудник доктор биол. наук Батуева И.В.

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1998

ОГЛАВЛЕНИЕ:

ВВЕДЕНИЕ___________4

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ_ 11

1.1. Химический синапс и роль ионов кальция в его работе. 11

1.2. Пресинаптическое торможение. История вопроса._ 18

1.3. Механизмы, лежащие в основе пресинаптического торможения первичных афферентов спинного мозга позвоночных животных.__22

1.3.1. Медиаторная роль ГАМ К._ 24

1.3.2. Распределение ГАМ К по структурам спинного мозга._ 28

1.4. Роль ГАМК-рецепторов в механизме пресинаптического торможения.__29

1.4.1. ГАМКЛ-рецепторы и их роль в механизме пресинаптического торможения._ 30

1.4.2. ГАМКБ-рецепторы и их роль в пресинаптическом торможении._ 34

1.5. Пресинаптическое торможение в спинном мозге миноги.__38

ГЛАВА II. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ_ 48

2.1. Объект исследования и препаровка.__48

2.2. Методики, используемые при работе на препарате спинного мозга миноги in vitro.__48

2.3.

Методики, используемые при работе на изолированных клетках спинного мозга миноги._ 53

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ*_ 62

3.1. Исследование свойств дорсальных чувствительных клеток, проведенные на препарате изолированного спинного мозга речной миноги ЬатреШ Атшй__62

3.1.1. Электрические характеристики ДЧК._ 62

3.1.2. Влияние ГАМ К на электрические параметры ДЧК._ 63

3.2. Характеристики потенциал-активируемых трансмембранных токов изолированных дорсальных чувствительных клеток.__67

3.2.1. Ионный ток через натриевые каналы.__71

3.2.2. Ионный ток через калиевые каналы._ 82

3.2.3. Ионный ток через кальциевые каналы._ 85

3.3. Влияние ГАМК и агонистов ГАМК-рецепторов на трансмембранные токи изолированных ДЧК миног._ 92

3.3.1. Кальциевый ток и его модуляция ГАМК и агонистами ГАМКА-рецепторов._ 93

3.3.2. Кальциевый ток и его модуляция агонистами

ГА МКБ-рецепторов._ 104

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ_ 117

ВЫВОДЫ__ 140

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА_ 142

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. В середине 50-х годов были получены первые сведения об участии ГАМК в торможении нейронов ЦНС позвоночных животных (см. обзор Roberts et al., 1976), в связи с чем в последующие десятилетия начались всесторонние исследования функциональной роли этой аминокислоты и механизмов ее действия. Было установлено, что в ЦНС различных представителей позвоночных и беспозвоночных животных имеются как минимум два типа ГАМК-рецепторов: бикукуллин-чувствительные ГАМКд- и бикукуллин-нечувствительные ГАМКв-рецепторы (Bowery et al., 1980). В настоящее время имеются также данные о том, что ГАМКв-рецепторы опосредуют в основном пресинаптическую модуляцию синаптической передачи, в то время как ГАМКА-рецепторы могут быть ответственны как за постсинаптическое, так и за пресинаптическое действие ГАМК (обзор: Matsumoto, 1989).

В 80-х годах при использовании биохимических методов ГАМК была идентифицирована в спинном мозге миноги (Homma, 1983). На интер- и мотонейронах спинного мозга миноги было показано, что эта аминокислота активирует бикукуллин-чувствительные ГАМКд-рецепторы и ассоциированные с ними хлорные каналы, за счет чего оказывает тормозное действие на эти клетки (Ногшпа & Rovainen, 1978; Сафронов и др., 1989). В начале 90-х годов были получены первые факты об участии ГАМК в модуляции локомоторной активности спинного мозга миноги (Alford et al., 1990) и сделано предположение, что модулирующее действие этой аминокислоты связано с активацией пресинаптических ГАМК-рецепторов (Alford et al., 1991). Основанием для такого предположения явились следующие факты. Было показано, что ГАМК, баклофен и мусцимол, вызывают деполяризацию аксонов интернейронов и модулируют активность, связанную с локомоторным ритмом (Alford et al., 1991). ГАМК подавляет Са2+-компонент потенциалов действия (ПД) в соме (Leonard & Wickelgren, 1985; 1986) и отростках первичных афферентных

клеток (Alford & Grill пег, 1991), которые в спинном мозге миноги представлены дорсальными чувствительными клетками (ДЧК) (Martin & Wickelgren, 1971). Показано также, что ГАМК и баклофен уменьшают амплитуду моносинаптических ВПСП, вызванных в интер- и мотонейронах стимуляцией ДЧК. При этом мембранный потенциал (МП) и входное сопротивление в поетсинаптических клетках не изменялось (Christenson & Grillner S, 1991). Позднее бьшо показано депрессирующие влияние баклофена (агониста ГАМК) на Са2+ -ток в мотонейронах и интернейронах спинного мозга миноги (Matsushima et al., 1993). В пользу предположения о возможности пресинаптического торможения в спинном мозге круглоротых и участии в этом процессе ГАМК свидетельствовали также данные морфологов, поскольку методами иммуноцитохимии бьшо показано, что ГАМК локализована в основном в дорсальных отделах спинного мозга (Batueva et al., 1990) и что ГАМК-иммунопозитивные терминали контактируют с волокнами дорсальной колонны, в которой находятся, в основном, ДЧК и их отростки (Rovainen, 1967; Christenson et al., 1991 Christenson et al., 1993).

Несмотря на то, что данные, полученные в перечисленных работах, свидетельствуют о возможности пресинаптического торможения в спинном мозге круглоротых, до сих пор отсутствуют четкие экспериментальные доказательства того, что ГАМК действует именно на npe-, а не на постсинаптический элемент сенсомоторных синапсов; не достаточно понятен механизм этого влияния и его рецепторное обеспечение, не исследована также роль ГАМКд- и ГАМКБ-рецепторов в этом процессе. Между тем вопрос о механизме пресинаптического торможения у круглоротых важен, так как исследования его деталей позволят сопоставить особенности этого механизма у круглоротых и млекопитающих, и тем самым выявить возможные пути совершенствования этого механизма в процессе эволюции.

Учитывая все вышесказанное, мы поставили целью настоящей работы исследование механизма влияния ГАМК на электрические параметры и ионные

токи первичных механосенсорных афферентов (ДЧК) сгашного мозга миноги. Поскольку литературные данные свидетельствуют о том, что ГАМК-опосредованное торможение первичных афферентов может быть связано со снижением поступления кальция внутрь клетки (Щп1ар & ИзсЫэасЬ, 1981; ОеБагтешеп е1 а!., 1984), основное внимание в настоящей работе бьшо сосредоточено на исследовании трансмембранного Са -тока в ДЧК и его модуляции агонистами и антагонистами у-ам иномас ляной кислоты.

Для достижения указанной выше цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) В условиях препарата изолированного мозга исследовать действие ГАМК на электрические параметры мембран сомы и отростков ДЧК. Выяснить, вызывает ли аппликация ГАМК деполяризацию сомы или отростков ДЧК, которая может свидетельствовать о наличии первичной афферентной деполяризации (ПАД), наблюдаемой во время пресинаптического торможения в спинальных нейронах высших позвоночных животных.

2) Исследовать трансмембранные ионные токи

(№а+, К+, Са2+)

полностью изолированных ДЧК и изучить влияние на них у-аминомасляной кислоты.

3) Исследовать влияние агонистов и специфических антагонистов ГАМК на трансмембранный кальциевый ток в ДЧК и на основании фармакологических свойств определить тип ГАМК-рецепгоров, обеспечивающих модуляцию Са2+-тока.

4) На основании полученных данных сформулировать представление о возможном механизме пресинаптического торможения в афферентных путях спинного мозга круглоротых.

Научная новизна исследований. В условиях препарата изолированного спинного мозга миноги на основании того, что ГАМК не изменяет амплитуду ПД ДЧК, не влияет на уровень МП и на входное сопротивление мембран этих

клеток, было сделано заключение об отсутствии ГАМКд-рецепторо в на мембранах ДЧК. Обнаруженные в большинстве ДЧК изменения длительности ПД были неодназначными и столь незначительными, что не позволяли сделать достоверный вьюод относительно подавления ГАМК одного из компонентов ПД. На полностью изолированных ДЧК впервые исследованы кинетические параметры и фармакологические свойства основных потенциал-образующих токов (ТМа!, К+, Са2+). Показано, что несмотря на большую разницу в уровне эволюционного развития между круглоротыми и высшими позвоночными животными, свойства потенциал-акти виру емых каналов для ионных токов, определяющих функциональные характеристики нервных клеток, являются сходными. Исследование фармакологических характеристик трансмембранного Са -тока в изолированных ДЧК подтвердило, что ГАМК уменьшает пиковую амплитуду входящего Са2-тока, следствием чего может быть уменьшение выделения медиатора в сенсо-моторных и сенсо-интернейрональных синапсах. Показано, что действие ГАМК на

Са2+ -ток опосредуются Г АМКБ-реце пторами. Агонисты ГАМК для ГАМКд-рецепторов не влияют на амплитуду Са -тока. Антагонисты ГАМК для ГАМКБ-рецепторов (2-гидросаклофен и 6-амино-п-валериановая кислота) блокируют эффекты ГАМК и баклофена (агониста ГАМК для ГАМКБ-рецепторов). При использовании метода иммуногистохимического выявления ГАМК в сочетении с методикой внутриклеточной окраски ДЧК пероксидазой хрена, впервые на электронно-микроскопическом уровне показано, что ГАМК-иммунопозитивные терминали образуют контакты (типа "прилегания") с меченными пероксидазой хрена отростками ДЧК. Эти прилегания могут быть морфологическим субстратом пресинаптического торможения первичных сенсорных афферентов у миног.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты проведенного исследования представляют интерес для общей нейрофизиологии, нейробиологии и физиологии нервной клетки. Они вносят существенный вклад в понимание механизма пресинаптического торможения в спинном мозге

круглоротых и расширяют имеющиеся представления о принципах функциональной организации межнейронных синалтических связей в центральной нервной системе позвоночных, в частности, у миног. Полученные результаты имеют существенное значение для понимания механизмов регуляции активности сенсорных афферентов спинного мозга миноги, которая как известно, играет важную роль в координации работы локомоторной сети, обеспечивающей движение у миног. Результаты настоящей работы могут быть использованы для дополнения и уточнения, имеющихся нейрон альных моделей генератора локомоторного ритма у миног и могут быть полезны для понимания процессов сенеомоторной координации движений у других позвоночных животных.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на следующих научных собраниях; Конференции молодых физиологов и биохимиков "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций" (Санкт-Петербург, 1995 г.); на 1(Х1) Международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996 г.); на XXXIII Международном Конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997 г.); на 17- Европейской зимней конференции по нейронаукам (Мюнхен, 1997 г.)

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Батуева И.В., Судеревская Е.И., Цветков Е.А., Веселкин Н.П. Исследование влияния гамма-аминомасляной кислоты на дорсальные чувствительные клетки изолированного спинного мозга миноги, Ж. эвол. биох. и физиол. 1995, Т.31, С.286-291.

2. Батуева И.В., Цветков Е.А., Бьюкенен Дж.Т., Веселкин Н.П. Исследование поте нциал-активируемых токов в изолированных нейронах спинного мозга речной миноги Lampetra fluviatilis, Ж. эвол. биох. и физиол. 1996, Т.32, С.267-283.

3. Цветков Е.А. Потенциал-зависимые токи в нейронах спинного мозга миноги. Мат. Конф. Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций. Санкт-Петербург, Россия, 19-21 сентября 1996, С. 190.

4. Батуева И.В., Бьюкенен Дж.Т., Цветков Е.А., Веселкин Н.П. Модуляция токов кальциевых каналов в дорсальных чувствительных клетках спинного мозга миноги, Сб. тезисов 1(Х1) Межд. совещ. по эвол. физиологии. Санкт-Петербург, Россия 1996, С. 16-17.

5. Батуева И.В., Бьюкенен Дж.Т., Цветков Е.А., Сагателян А.К., Веселкин Н.П. Кальциевый ток и ГАМКБ рецепторы в дорсальных чувствительных клетках спинного мозга миноги, Росс. Физиол. Журн. 1997, Т.83, С.79-90.

6. Батуева И.В., Бьюкенен Дж.Т., Цветков Е.А., Сагателян А.К., Веселкин Н.П. Влияние баклофена на ток кальциевых каналов в дорсальных чувствительных клетках спинного мозга миноги, Росс. Физиол. Журн. 1997, Т.83, С.92-104.

7. Vesselkin N.P., Batueva I.V., Buchanan J.T., Kurchavyi G.G., Tsvetkov E.A., Sagatelyan A.K., Suderevskaya E.I., Reperant J., Rio J.-P., Adanina V.O. Different

functional properties of different types of neurons in spinal cord of lower vertebrates, In Abstr. of 33 Internat. Congr. of Physiol. Sci IUPS Abstr. L072.05. St. Peterburg, Russia Congress, St.Peterburg 1997.

8. Vesselkin N.P., Reperant J., Batueva I.V., Buchanan J.T., Adanina V.O., Rio J.-P., Tsvetkov E.A. GABA-imunopositive boutons contact the prymary afferent terminals in the lamprey spinal cord, In Abstr. of 17th Eur.Winter Conference of Brain Research, Arc 2000 (France) 1997, P.73.

9. Сагателян A.K., Судеревская Е.И., Батуева И.В., Бьюкенен Дж.Т., Веселкин Н.П., Цветков Е.А. ГАМК-активируемый хлорный ток в изолированных нейронах спинного мозга миноги, Ж. эвол. биох. и физиол. 1998, Т.34, С.419-429.

10. Batueva I.V., Tsvetkov Е.А., Sagatelyan А.К., Buchanan J.T., Vesselkin N.P., Adanina V.O., Suderevskaya E.I., Rio J.-P., Repfirant J. Physiological and morphological correlates of presynaptic inhibition in primary afferents of the lamprey spinal cord // Neuroscience, 1998, V. <5<f, pt ylS'-fflJ

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Изложена на 169 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 рисунком и 3 таблицами. Библиография включает 298 наименований.

Работа выполнена при финансовой поддержке NIH Fogarty International Research Collaboration Awards (США, грант № 1 R03 TW00245-01), Российского фонда фундаментальных исследований (Россия, РФФИ, гранты № 93-04-7461, № 96-04-50611 и N 96-15-97650) и гранта 1997 года для студентов, аспирантов и молодых ученых Санкт-Петербурга № М97-2.4К-547

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Химический синапс и роль ионов кальция в его работе.

Деятельность нервной системы неразрывно связана с передачей сигналов как в области контактов между нейронами, так и между нейронами и клетками исполнительных органов. В связи с этим, выяснение механизмов синаптической передачи имеет первостепенное значение для анализа основных нервных функций и действия самых различных нейротропных веществ. По современным представлениям, передача сигналов в ЦНС с клетки на клетку может осуществляться с помощью двух независимых и принципиально различных механизмов. В одном случае проведение происходит чисто электрическим путем, в другом - посредством химической передачи (Хухо, 1990). Электрический тип передачи наиболее часто встречается у беспозвоночных и низших позвоночных животных, в то время как у высших позвоночных животных, синаптическая передача опосредуется, в основном, за счет химических синапсов (Шаповалов, 1997). Поэтому наибольший теоретический и практический интерес представляет именно медиаторный механизм синаптического проведения.

Морфологически химический синапс представляет собой структурно организованный контакт мембран пре- и постсинаптических элементов. Ширина синаптической щели у этого типа синапсов варьирует в пределах 20-30 нм, зона контакта в поперечнике не превышает обычно 1-2 мкм (Хухо, 1990). Характерной ультраструктурной особенностью химического синапса является наличие еинаптических везикул в его пресинаптическом элементе. Везикулы, в зависимости от типа синапса, имеют различную форму и содержат разные нейротрансмиттеры (или медиаторы). Данные морфологии свидетельствуют о том, что все Многообразие химических синапсов с незначительными вариациями и отклонениями может быть разделено на два основных типа (Учизоно, 1980; Шеперд, 1987). Первый отличается большой постсинаптической зоной контакта

(1-2 мкм в поперечнике), асимметричным утолщением мембраны и синаптической щелью шириной примерно около 30 нм. Второй тип химических синапсов характеризуется сравнительно небольшой зоной контакта (менее 1 мкм в поперечнике), симметричными пре- и постсинаптическими мембранами и шириной синаптической щели около 20 нм. Во многих отделах мозга первый тип синапсов ассоциируются с наличием больших сферических везикул (диаметром примерно 30-60 нм), которые обычно присутствуют там в больших количествах. В отличие от него, второй тип синапсов характеризуются небольшими (диаметром 10-30 нм) везикулами, которые не столь многочисленны и, что важно, принимают различные эллипсовидные и утолщенные формы (Учизоно, 1980; Шеперд, 1987). В зависимости от того, какой медиатор находится в синаптических везикулах, химический синапс может выполнять тормозную или возбуждающую роль (Шаповалов, 1997).

Последовательность и природа явлений, происходящих при осуществлении синаптической передачи, первоначально была исследована на модели нервно-мышечного соединения (Eccles et al., 1941; Fatt & Katz, 1951; Castillo et al., 1957; Katz, 1957) и моносинаптических контактов мотонейронов (Brock et al., 1952; Eccles, 1953). Кратко этот механизм может быть изложен следую�