Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Основные характеристики ГАМК-рецепторного комплекса клеток Пуркинье мозжечка крыс

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Основные характеристики ГАМК-рецепторного комплекса клеток Пуркинье мозжечка крыс"

ОРДЕНОВ ЛЕНИНА И ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ИМ.А. А.БОГОМОЛЬЦА

на правах рукописи

ЧЕРНЕВСКАЯ Наталия Игоревна

ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГАМК- РЕЦЕПТОРНОГО КОМПЛЕКСА КЛЕТОК НУРКИНЬЕ МОЗЖЕЧКА КРЫС.

03.00.02 - Биофизика

Автреферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КИЕВ - 1990

Работа выполнена в Институте ¿изполл ип им. А. А. Богомольца А1

УССР.

Научный руководитель - член-корр.АН СССР КРЫШТАЛЬ О.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

МАГУРА И.С.

доктор биологических наук ЗИМА В. Л. .

Ведущее учереждение: Институт биологической физики АН СССР

г.Пущиио-на -Оке

Защита диссертации состоится

..1990 г.

на заседании специализированного совета Д-016.15.01 при Институте физиологии им. А.А.Богомольца АН УССР по адресу; 252024, Киев-24, ул. Богонольца, 4.

С диссертацией ложно ознакомиться в библиотеке Институт* Физиологии им.А.А.Богомольца АН УССР.

Автореферат разослан

1990 г.

Ученый секретарь

специализированного совета доктор биологических наук

СОРОКИНА-МАРИНА З.А.

ОБЩАП ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. После того, как было показано, что ГАГ1К Су-

анипоиасляиная кислота? способна оказывать угнетающее действие на активность нейронов Щ1С Сцентралыюй нервной смстены) и высказано

предположение о ее участии в процессах торножения [Hayashi 1956], растет поток соответствующих электрофизиологических, 'фарнако-логических, биохимических и клинических исследований. В настоящее вреня доказано, что ГАМК является однин из важнейших нейронедиаторов в ЦПС, под ее контролен находится 20-40* синапсов ГОЛОВНОГО мозга [Bloom,Inerson 1971].

Существуют по крайней нере два популяции ГАМК рецепторов [Guidotti 1979, Histri 1979], различающихся по чувствительности к бикукуллину. Лучше изучен бикукуллин-чувствнтельный ГАМКД рецептор. ГАМКд- рецепторный конплекс состоит из 4 субединиц арг, на которых расположены рецепторы ГАМК и бензодиаэепинов, неста связывания модуляторов и ионофор, способный пропускать ионы хлора [Schofild et al., 1987,Barnard et al., 1987]. Несколько классов веществ действуют на этот конплекс. Барбитураты и бензодиазепины модулируют связывание ГАМК с рецептором. Ряд антагонистов, среди которых бикукуллин, взаимодействуют с ГАМК-узнаюшин центром, другие действуют на ИОННЫЙ канал [Johnston 1904, Sohofild ot al., 1987 Akaike et al., 19851.

ГАМК рецептор имеет столь сложное строение, что, неснотря на интенсивное изучение его Функционирования, не исчезает необходимость более углубленного изучения свойств ГАМК рецепторов и управляемых ини каналов. Даже механизн взаимодействия самой ГАМК с рецепторон нуждается в уточнении, поскольку есть данные как о кооперативном характере взаимодействия ГАМК с рецепторон [Hnttori

et al., 1984 ] , ТЭК И О некООПераТИВИОМ [Hong et al., 1984.]. Появилась только одна работа о роли фосфорилнрования с Функционировании ГАМКд рецептора, [Chen et al., 1990]. Определение типа ГАМК рецептора основано на чувствительности рецепторов к бикукуллину, но он не является селективным антагонистом ГАМК [Barker 1975, Kudo et al, I90tj], это приводит г. необходимости поиска более эффективных блокаторов ГАМК- активированной проводимости. Барбитураты имеют широкий спектр действий, большая часть из которых опосредуется через ГАМК-рецеиторный комплекс. Барбитураты, широко использумые в медицинской практике как успокаивающие, снотворные препараты, иногда вызывают возбуждение [Huang & Barker 1980]. Результаты работ, проведенных на изолированных нейронах сенсорных ганглиев лягушки показали, что барбитураты не только уменьшают константу диссоциации ГАМК с рецепторныи комплексом, но способны и в отсутствие ГАМК активировать хлорную проводимость [Akaike et al., 1985].

Применение таких экспериментальных подходов как внутриклеточная перфузия, Фиксация мембранного потенциала и быстрая аппликация медиаторов к изучению изолированных нейронов мозжечка, значительно расширяет возможности в области изучения ГАМК-активируемых рецепторов. До настоящего времени исследования подобного рода были проведены только на нейронах сенсорных ганглиев [Akaike et al., 1985, Hattori et al., 1984] И Ha культуре спинного иозга.

Цель и задачи исследования. При помощи методов внутриклеточной перфузии, фиксации потенциала и концентрационного скачка исследовать характеристики функционирования ГАМК- рецепторного комплекса изолированных клеток Пуркинье мозжечка. Для достижения этой

цели поставлены следующие задачи:

1. Выяснить основные характеристики взаимодействия ГАМК с рецепторами мембраны изолированных клеток Пуркинье.

2. Исследовать и сравнить действие алкалоидов фталид и'зохинолинового ряда на ионные токи, активируемые ГАМК.

3. Изучить особенности действия пикротоксина на ГАМК-активируемые токи.

4. Исследовать механизм взаимодействия барбитуратов с ГАМК-рецепторным комплексом.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований

получены количественные характеристики взаимодействия ГАМК с рецепторами клеток Пуркинье мозжечка. Показана роль фосфорили-роеания в Функционировании ГАМКД рецептора клеток Пуркинье. Изучен ряд аналогов бикукуллпма и установлено, что из четырех энантиомеров каждого из алкалоидов, антагонистами ГАМК являются соединения со структурой 1п7гс. Показано, что пнкротоксин уменьшает ионные токи, вызванные ГАМК только в присутствии ГАМК. Па рецептор, неактивнрованным ГАМК, ом не действует. При изучении действия нентобарьитада на ГАМК-активируемые токи, установлено, что результат воздействия иентобарбитала на ГАМК рецептор зависит от его концентрации. Низкие концентрации пентобарбитала усиливают действие ГАМК, а высокие блокируют токи, индуцированные ГАМ!' н пептобарбиталои. На основании полученных оксперннентальных данных представлена модель взаимодействия барбитуратов с ГАМК рецептором, учитывающая все разнообразные проявления действия ПБ.

Теоретическое и__п р акт 11 ческое значение работы. Результаты

исследований позволяют лучше понять особенности Функционирования

ГАМК рецепториого комплекса, действия антагонистов и модуляторов. Изучение ряда антагонистов ГАМК, связи между их активностью как 6локаторов ГАМК-индуцированной проводимости и их структурой может служить основой целенаправленного поиска новых более эффективных антагонистов ГАМК. Исследование механизма действия широко используемых в клинике барбитуратов позволяет не только понять механизм их действия, но и учитывать на практике, что разные дозы барбитуратов могут приводить к противоположным эффектам.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на 3

симпозиуме СССР-ФРГ «Возбудимые мембраны» СКиев-1987), на X Международном симпозиуме молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии Сг. Пущино-19085, на заседании Ученого совета Института физиологии им.А.А.Богомольца АН УССР в октябре 1990 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения

обзора литературы, методов исследования, четырех глав, обсуждения, 8 выводов и списка литературы, содержащего 175 наименований. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2В рисунками. Но материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИИ Эксперименты проводились на одиночных изолированных нейронах тригемииального ганглия крыс и свежеизолированных клетках Пуркинье мозжечка крыс. На клетках тригемииального ганглия были выполнены исследования по действию на ГАМК-активируеиые токи бикукуллина и его аналогов. Остальные исследования были выполнены на клетках Пуркинье мозжечка.

Для получения изолированных клеток Пуркинье использовалась следующая методика. Мозжечок 10-12 дневной крысы помещался в охлажденный оксигенированный фосфатно-солевой, забуферениыл NaHC03, раствор, лишенный двухвалентных катионов Сфосфатно-солевой буфер Дюльбеко dpbs sigma?, Лезвием делались тонкие срезы мозжечка С400-500 нкМ?, которые выдерживались в течении 20 минут в dpbs. После этого dpbs заменялся на раствор dpbs +0,5 нМ f'gz+, содержащий 2 мг/мл трипсина Cl:250 Serva? и 0,2 нг/мл коллагеназы Стип iv sigma? и срезы на 40-50 нинут помещались в термостат, поддерживающий температуру 28°С . После ферментативной обработки срезы выдерживались 5 нинут в растворе Хенкса. в который был добавлен трипсиновый ингибитор из сои CrteanaO, несколько раз промывались раствором Хенкса и в нем хранились до последующей работы с ними. Так. как ГАМК-эргические нейроны очень чувствительны к гипоксии CRomijn 19801, то для сохранности клеток Пуркинье, через все растворы, в которых находились срезы периодически пропускался карбоген С5И С0г и 95Z Ор. По мере необходимости срезы переносились во внеклеточный раствор. Молекулярный слой мозжечка пропускался через ряд стеклянных силикопизированных пипеток о уменьшающимся диаметром. В первую очередь при пипетировании отделялось большое число зернистых клеток, которые ложились на дно сплошным слоен. Чтобы избавиться от них кусочки несколько раз переносились в свежий раствор. При длительном пипетировании появлялись и клетки Пуркинье, которые имели характерную грушевидную форму и остатки дендритного дерева.

Для регистрации изменений ионных нроводимостей. вызываемых аппликациями медиаторов, применялись методы внутриклеточной перфузии и фиксации потенциала [Kostyuk et 19811 с

использованием стеклянных никропипеток, изготовленных по методу Хенилла и др. [нелип et ai., 1981]. Диаиетр кончика подбирался в соответствии с диаметром клетки и после оплавления колебался от 5 до 10 нкм. стеклянная микропипетка заполнялась раствором следующего состава в ИМ: Tris-II PO -60, Tris С1-Ч0, ЭГТА-Tris-lO, СаС1г-1, MgS04-2, АТФ Снатриевая сольЗ-1 мМ, сАМФ-0,05 мМ. Внеклеточный раствор содержал Tris ci-120, CsCi-5 нМ, c«ci -з мМ. Посредством инкроманппулятора заполненная внутриклеточным раствором мнкропипетка подводилась к выбранной клетке, лежащей на дне чашки Петри, установленной на столике инвертированного микроскопа. При уменьшении давления в микропнпетке клетка прикреплялась к кончику и некоторая ее часть засасывалась в микропмпетку, что через 3--5 минут приводило к прорыву мембраны и перфузии клетки внутриклеточным раствором, содержащимся в микропнпетке.

В экспериментах использовались клетки с сопротивлением порядка 1 ГОи. Поддерживаемый потенциал равнялся -90 мВ и менялся только при измерениях вольт-амперных характеристик. Эксперименты проводились при комнатной температуре 20-22°С.

Для того, чтобы предохранить ГАМК рецепторы от "глубокой" десеиснтизацни била разработана и использована специальная система для кратковременного приложения тестируемых растворов. Эта система позволяла не только быстро прикладывать тестируемый раствор, но и через заданный промежуток времени удалять его от клеточной мембраны. Система состоит из двух частей; 1. Устройство для смены растворов, аналогично описанному в работах [Марченко и др., 1987), состоит из двух вставленных одна в другую трубочек, присоединенных к резервуарам, расположенным на разной высоте относительно трубочек. Трубка большего диаметра предназначалась для засасывания

медиатора, меньшего для его отнывкн. В отверстие на боковой стороне засасывющей трубки вставлялась иикропипетка с клеткой на кончике. Аппликация медиатора происходила при при срабатывании электромагнитного клапана пережимавшего трубку большего диаметра. 2-. Устройство для перемещения тестируемых растворов относительно трубки, засасывающей раствор. Тестируемые растворы помечались в ячейки специальной кассеты с боковыми направляющими. Перемещение кассеты относительно засасывающей трубки осуществлялось при помощи механизма, связанного с шаговым двигателем. При подаче команды с компьютера кассета ' с тестируемым раствором поднималась, и засасывающая трубка контактировала с тестируемым растворон, при этом срабатывал первый клапан и происходило засасывание раствора. Через заданный промежуток времени открывался второй клапан и кассета опускалась. Так как в это время клапан не пережимал засасывающую трубку, то часть внеклеточного раствора попадала в нее, удаляя медиатор подальше от нейрона. Затем оба клапана закрывались. Такая систена позволяла производить быструю Сненее 10 не? смену внеклеточного раствора медиатором. Отмывка медиатора производилась после достижения максимального для данной концентрации медиатора значения ГАМК -активируемого тока.

Временное согласование работы электромагнитных клапанов, перемещения кассеты с раствором, а также контроль за работой электромагнитных клапанов и шагового двигателя и одновременная запись данных в память ЭВМ осуществлялась программой, разработанной для ЭВМ В7.

Сигнал с выхода усилителя тока поступай на каскад последующего усиления с переменным коэффициентом передачи, а далее па однокаскадный фильтр низких частот с частотой среза 2 кГц. С

- а -

выхода Фильтра сигнал поступал на аналого-цифровой преобразователь ЭВМ В7, а затеи после преобразования в оперативную нанять машины. Данные с ЭВМ В7 передавались в ЭВМ "Муегип" для обработки и хранения на твердом диске. Обработка данных производилась программой, написанной на языке "Паскаль".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ 1.0бщан характеристика ГАМК-акпшнруемих рецепторов клеток Нуркннье

При аппликации ГАНК к нейронам Пуркипье мозжечка в концентрации ьыше 1 икМ наблюдалось появление транспембрамного тока. Длительные аппликации медиатора к поверхности нейрона требовали, и длительной в течении 2-3 минут отмывки нейрона внеклеточным раствором. Чтобы избежать этого мы использовали кратковременную аппликацию медиатора. Аплигуда ГАМК активируемых токов в процессе эксперимента уменьшалось. Падение амплитуды увеличивалось при увеличении временного интервала нежду двуия следующими друг за другом аппликациями ГАМК. Возможно мри перфузии нейрона вымывались внутриклеточные компоненты, необходимые для нормального функционирования ГАМК рецептора: связывания [АПК, перехода в активированное состояние, открывания канала, выхода из десенситизи-роианного состояния и т.д.

Ecj¡¡: во внутриклеточный раствор добавить сАМФ и АТФ, то стабильность повторных ответов улучшалась. При длительных аппликациях ГАМК в концентрации 10 нМ С2 сеО и отмывке в течении двух минут, ответ на приложение ГАНК восстанавливался и иногда даже слегка возрастал, но затем происходило все же постепенное снижение ГАМК ответа со временем.

При поддерживаемых потенциалах, изменявшихся от -120 до -25 мЕ возникал входяший ионный ток, а при более положительных чем -24 мЕ

выходящий. Вольт-амперные характеристики ГАМК -активируемых ионных токов были линейны в диапазоне поддерживаемых потенциалов от -120 до +30 мВ. Потенциал, при котором нгблюдалась реверсия ГАМК-индуцированных токов составлял -24,2+ 2,2 мВ Срис.45. При замене 20 мМ внутриклеточного фосфата на фтор потенциал реверсии составлял -24,6^3,4 мВ, то есть практически не менялся. -Если же концентрация ионов хлора во внутриклеточном растворе падала с 46 мМ до 26 мМ, то потенциал реверсии уменьшался до -38,5+2,1 мВ. Эти величины потенциалов реверсии совпадают с равновесныни потенциалами хлорного электрода, вычисленными по уравнению Нернста. Таким образом основным переносчикон тока через каналы, активируемые ГАМК являлись ионы хлора.

При увеличении концентрации ГАМК в апплнцируеном растворе амплитуда ГАМК-активируеных токов возрастала. Кривая зависимости доза-эффект ГАМК описывается уравнением

2

А + К

т-т ^

1 — 1 max - —

А-концентрация ГАМК, К константа равная 3,2 нкМ, 1-ток, вшываемый аппликацией ГАМК.

Агонист ГАМК0 рецепторов - баклофен в высокой 1 мМ концентрации не вызывал активацию трансмембранного тока. Антагонист ГАМКД рецептора бикукуллин в концентрации 100 нкМ практически полностью блокировал ГАМК ответ, вызванный 100 нкМ ГАМК. Другой блокатор ГАМК^рецепторов пикротоксин С100 нкЮ также блокировал ГАМК-ответы.

Исходя из этих данных, ни считаен, что при аппликации ГАМК активировались в основной ГАМКД рецепторы, вклад ГАМКд рецепторов, з ГАМК-активируемый ток если и был, то крайне незначительный.

2. Блокирование ионных токов, активируемых ГАМК, фталнд--изохинолшювымн алкалоидами.

Известно,- что как антагонисты ГАМК действуют С-О стереонеры фталид - изохинолиновых алкалоидов, к которым принадлежит бику-куллин, тогда как С-5 стереонеры неактивны [Johnston 1976]. В молекулах фталид -изохинолиновых алкалоидов по два оптически -активных центра, и позтону существует четыре энантиомера каждого соединения, два из которых являются СО и два С-5. Проверка действия всех четырех энаптионеров гидрастина выявила, что только один из них конфигурации C1S9FO оказался эффективным блокаторон ГАМК- активируемых токов Срис 1C.D5. Остальные три активируемую ГАМК проводимость не блокировали.

Рис.1. Влияние алкалоидов фта

а - —

лид- изохинолпнового ряда на ГАМК-активируемую проводимость. 1-контрольная аппликация 10 икМ ГАМК, 2-ГАМК-активируемые токи, полученные в присутствии алкалоидов. Концентрации алкалоидов 10 нкМ. Поддерживаемый потенциал -90 нВ. л-С1б9к? -бику-

¿00 (пс

Uw\ куллин, D- C1S9EO- корлуиин, с-C1S9FO- гидрастин, о- С1г;9:0-гидрастин.

Кривая заон'гимосги доза-эффект ГАМК, полученной d присутствии 10 нкМ ClRQf'O yt уллнма сднигалась параллельно зависимости доза-эффект I АПК '.) сторону больших шпчсниП концентраций ГАМК. без

изменения максимальной величины тока. Кривая зависимости доза-эффект ГАМК в присутствии 10 мкМ C1S9RD- гидрастина находилась правее аналогичной зависимости для ГАМК, полученной в присутствии такой же концентрации бикукуллина. Гидрастнн также как и бикукуллин действовал конкурентно, но являлся более сильным антагонистон ГАМК рецептора, чем бикукуллин.

Для того, чтобы выяснить как влияют на эффективность блокирования изменения в структуре молекулы алкалоидов вдали от оптически активных центров молекулы было проведено сравнение действия на ГАМК активируемые токи 3 алкалоидов: бикукуллина, кор-луннна и гидрастина в конфигурации 3S9R Срис.1 А,В,С?. Наибольшим блокирующим действием обладал гидрастин.

3. Действие пикротоксина на ГЛМК-активируемые токн клеток Пуркинье.

Пикротоксин известен как неконкурентный блокатор ГАМК рецептора [Johnston 1976]. Пикротоксин в концентрации выше 10 нкМ вызывал не только падение амплитуды ГАМК ответа, но и значительное ускорение кинетики спада С рис 2А5. Приложения высоких концентраций пикротоксина С10-100 нкМ5 одновременно с ГАМК к. немб-ране в течении короткого промежутка времени С200-300 мсЭ приводило к тону, что амплитуда последующего ГАМК ответа была значительно меньше амплитуды ГАМК ответа, полученного до аппликации пикротоксина Срис 2ВЭ. Длительная отмывка нейронов внеклеточным раствором в течении 3 минут приводила к очень незначительному восстановлению амплитуды ГАМК- активированного ответа, по всей види-ности для полной отнывки потребовалось бы вреня превышающее эреня "жизни" перфузированного нейрона в эксперименте.

А

В

ГАИ К

ПКР

ГАМК ГАМ К ГДМК ГАМК

Рис.2. Действие пикротоксина на ГАМК-активируеные токи. Поддерживаемый потенциал -90 н13. а-Влияние различных концентраций пикро-токсина на анплнтуду и кинетику токов, вызванных аппликацией ГАМК. в- Аппликации ГАМК С100 мкМЗ на Фоне пикротоксина С100 икМ5 вызывает уменьшение амплитуды последующих ГАМК ответов.

Если аппликация пикротоксина производилась в промежутке времени между аппликациями ГАМК, то даже длительное приложение пикротоксина С100 мкМ в течении 1 минуты? не приводило к снижению амплитуды ГАМК-активированных токов, тогда как при аппликации пикротоксина вместе с ГАМК для полной блокады ГАМК ответа было достаточно 300 мс.

Та-', как считается, что пикротокспн является канальный блока-торон [Ака1ке 1985], то ножно предположить, что пикротоксин связывается с открытым каналом и вынывается только при открывании канала. Это предположение не подтвердилось, многократное приложение к мембране ГАМК, не приводило к восстановлению аиплитуды ГАМК ответов, заблокированных иикротоксином, что должно было бы быть при деблокировании открытого канала.

Из радиолнгандных исследований, известно, что пентобарбитал

натрия уменьшает действие пикротоксииа, как вытесняя его из нест связывания, так и действуя аллостерически [ТЧски 1966]. На этом основано утверждение о существовании барбитурат-пик.ротоксинового места связывания на ГАМК-активируеном рецепторном конплексе. В наших экспериментах приложение даже на короткое вреня 100 не высокой концентрации СЮ иЮ ПБ Спентобарбптала натрия), который в такой концентрации активирует проводимость, способствовало восстановлению ГАМК ответов.

1. Взаимодействие барбитуратов с ГАМК реиепториым комплексом клеток Пуркннье.

Результат воздействия различных концентраций ПБ на амплитуду ГАМК -активированного тока зависил от концентраций ГАМК и пен-тобарбитала. Низкие концентрации ПБ от 1 икМ до 100 нкМ практически не оказывали влияния на ответы, вызываемые концентрациями ГАМК в 100 нкМ, активирующими максимальный ответ. Но если ПБ прикладывался виесте с меньшими концентрациями ГАМК СЮ нкМЭ. то при увеличении концентрации ПБ от 10 нкМ до 100 мкМ происходило увеличение амплитуды ответов. Пентобарбитал в концентрации 100 нкМ производил максимальное усиление амплитуды токов, активируемых ГАМК. При использовании более высоких концентраций ПБ его потенциирующая способность падала. Концентрация ПБ 3,2 мМ оказывала блокирующее действие на ГАМК ответы, вызываемые как концентрациями ГАМК, вызывающими максимальный ответ, так и низкими ее концентрацияни.

Зависимость доза-эффект ГАМК в присутствии 100 мкМ ПБ Сконцен-трации, максимально усиливающей ГАМК ответ), сдвигается в сторону меньших концентраций ГАМК без изменения нак.синальноП величины

ответа.

Рис.3. А-ПБ-актнвируеиые токи и дополнительные, возникающие при отмывке ИБ. D о-зависимость доза- эффект ГАМК. Кривая coo'i вет ствует уравнению

Y=CA/A-iK3z, К=3,2 11 кМ. ' • -зависимость доза-эффект ГAiiK полученная в присутствии 100 икМ пентобарбитала. *-зависи-мость доза-эффект пентобарбитала. зависимость величины токов, возникающих при отмывке пентобарбитала от его концентрации. х-кривая получена в результате сложения двух предыдущих.

Низкие концентрации ПБ С1-10 икМ5 не меняли кинетику спада ГАМК-активнруеиого тока, а вот концентрации 11Б СО,1-5 нМЗ, блокирующие ГАМК ответы, значительно ускоряли его спад.

Аппликация к поверхности нейронов Пуркинье ПБ в концентраци выше чей 18 икМ вызывала появление трансмембранного тока, величина которого нарастала, а затем, достигнув максимального значения, спадала до некоторого постоянного уровня. Величина пика этого тока росла при увеличении концентрации ПБ от 100 мкМ до 1мМ, а при более высоких концентрациях ПБ падала. График зависимости величинь тока, активированного ПБ, от его концентрации имеет колоко-лообразную форму С рис 35. Мы получили, что на клетках Пуркинье между ИБ и ГАМК существует перекрестная десенситизация.

О 'J2inM ПБ OS.mMilb |тМПБ 32гчМПБ

Если к поверхности нейрона был приложен ПБ в концентрации превышающей 56 мг.М, то при быстрой отиывке вещества в нонент времени, когда еще не все рецепторы десенситизированы появлялся кратковременный дополнительный ток. Амплитуда этого тока быстро н-арастала и, достигнув максимального значения быстро спадала до нуля. Кинетика спада тока, возникающего при отмывке ПБ описывалась одной экспонентой. Величина дополнительного тока, возникающего при отиывке ПБ, зависила от времени приложения ПБ и от его концентрации Срнс 35. При врененах аппликации больше, чен время от начала аппликации вещества до нонента времени, когда ток имеет максимальное значение, величина пика дополнительного тока уменьшалась по сравнению с амплитудой дополнительного тока, измеренной при отмывке ПБ на пике тока..

С увеличением концентрации ПБ величина пика дополнительного тока увеличивалась и при концентрации ПБ выше чен 1 нМ превосходила величину ПБ -активируемого тока, если отмывка тестируемого вещества происходила на наксинуне тока Срис 33.

Кроне того, что дополнительный ток возникал при отмывке высоких концентраций ПБ от мембраны нейронов, при отмывке совместно приложенных ГАИК и высоких концентраций ПБ С1 мМЗ также возникал дополнительный ток. Величина этого тока была больше, чен величина тока, возникающего при отиывке ПБ, приложенного в той же концентрации.

При изменении поддерживаемого потенциала на мембране в диапазоне от -90 мВ до +20 мВ, ток, вызванный аппликацией ПБ реверсировал при потенциале -24,3+0,8 мВ. Потенциал реверсии для ПС совпадал с потенциалом реверсии для ГАИК. При изменении поддерживаемого потенциала реверсировал и дополнительный ток.

Рис 4.Ионные токи, полученные при различных значениях поддерживаемого потенциала, л-концен-трация ГАМК 10 нкМ. в-концен-трация пентобарбитала 1 иМ. ' с-Вольт-анперные характеристики пиковых значений токов, показанных выше. о-ГАМК- активируемого, •-пентобарбитал- активируемого, о-тока, возникающего при отмывке пентобарбитала.

возникающий при быстрой отмывке ПБ Срис. 4?.

В наших экспериментах не только ПБ, но и ряд других барбитуратов, таких как барбамил, барбитал Сснотворные препараты?, гексанал Санестетик? и Фенобарбитал Сантиконвульсантный препарат? вызывали появление транснембранного тока, а при их отмьюке возникал кратковременный дополнительный ток. Порог возникновения и величина барбитурат-активированного тока и тока, возникающего при отмывке, его величина зависили от вида барбитурата и его концентрации,

Аппликации ПБ на Фоне антагонистов ГАМКД рецептора бикукул-лина 1100 нкМ? и пикротоксина С100 нкМ? приводила к значительному падению анплитуды и [1В-активированного тока и тока, возникают..'! о при огныоке ПБ.

ОБСУЖДЕНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Использование ш-онистов и ант/п оиистов ГАМК позволило

установить, что при аппликации ГАМК к соне клеток Пуркннье активировались ГАИКД рецепторы. Действие ГАМК на ненбрану нейронов связано с изиененией хлорной проводииости. Агонист ГАМКд рецепторов -баклофен не вызывал появление транснембранных токов. Возможно, что это связано с тем, что используемые растворы не содержали ионов калия, а постсинаптическое действие баклофена связывают с увеличением калиевой проводимости [Апс)гас1е 1986].

Зависимость доза-эффект ГАМК соответствует связыванию ГАМК с двумя независимыми центрами. Открывание канала происходит при связывании двух молекул лиганда. То, что во многих работах коэффициент Хнлла не является целой величиной, а изменяется от 1,5 до 2,3 связано скоре всего с тем, что процесс связывания ГАМК на этих объектах не соответствует в точности уравнению Хилла.

Исследование действия блокатсров ГМК рецепторов из рода фталид нзохннолимовых алкалоидов на нейронах сенсорных ганглиев показало, что из четырех знаитиомеров каждого соединения активными в качестве блокаторов ГАМК-актпвированных токов являются только соединения, имеющие конфигурацию 1591*, это относится и к бикукуллпну и к гидрастину. Модификация групп в молекуле алкалоидов далеко отстоящих от оптически активных атомов углеродов в положениях 1 и 9 пеняла сродство этих активных энантионеров к рецептору, при этом их блокирующая способность не терялась. Из проверенных 3 алкалоидов Сбикукуллина, корлумина и изокорина) наиболее сильным антагонистов ГАМК оказался С139Ю-гидрастин. В литературе ны не обнаружили сведений об активности этого бикукуллин-подобного соединения по отношению к ГАМК рёцепторан различных возбудиных образований. Такин образом этот препарат ножно рассматривать как нсвий внокоэффективный блог.атор

ГАМК-нндуцированной ионной проводимости.

В отличии от обратимого действия пикротоксина на нейроны сенсорного гаиглия лягушки, на нейроны спинальных ганглиев кошки и нейроны гиппоканпа, в наших экспериментах пикротоксин действоал необратимо. Возможно это связано с необходимостью более длительной отнывки, но такой возможности ны не имели из-за падения ГАМК-активированных токов во времени. Блокада ГАМК рецептора не снималась последующими аппликациями ГАМК, которые приводили к открыванию канала, т.е. деблокирования при открывании канала не происходило. Выдержка нейрона в растворе, содержащем пикротоксим, в течении 1 минуты, с последующей его отмывкой ме приводила к существнному падению ГАМК ответов. Можно предположить, что наиболее эффективно пикротоксин взаимодействует только с активированным рецептором. Даже кратковременная аппликация высоких концентраций ПБ, вызывающих появление трансмембранного тока, восстанавливала ГАМК ответ, блокирований пнкротоксином, несмотря на то, что высокие концентрции ПБ десенситизировали ГАМК рецептор.

Так как предполагается, что пикротоксин взаимодействует с каналон, то действие высоких концентрации ПБ, вызывающих появления тока, ножнт быть связано с тем, что время жизни ПБ активируемых каналов в 3-6 раз выше, чей ГАМК-активируеиых и попытается вероятность выхода пикротоксина из открытого канала.Вторая возможность, что С-ПБ действует на связывание пикротоксина аллостерически, ускоряя его диссоциацию, а С-О-ПБ вытесняет его из пест связывания, такой механизм действия ПБ был установлен в радиолигаидных исследованиях [Тгски 19Я6].

Так пак потенциал реверсии для ПБ тот же, что и дл! ГАМК-актипнруеиого тока и антагонист ГАМК бикукуллии блокироиа.

токи, возникающие при аппликации и отнывке ПБ, а кроне того между 11Б и ГАМК существовала перекрестная десенситиацня, то ПБ действовал на ГАМК-активируемый рецепторный комплекс. Возникновение тока при отмывке ПБ также связано с действием ПБ на ГАМК рецептор.

Как уже было показано, ГАМК связывался с двумя независимыми центрами па рецепторе. Коэффициент Хилла, вычисленный для доза-зависимости, построенный с учетом дополнительного тока, возникающего при отмывке Г1Б больше 2, поэтому можно предположить существование по крайней мере двух связывающих центров для ПБ на рецепторе.

Так как ГАМК состоит из двух идентичных субъеднниц с местами связывания для ГА1*!К то возможно, на каждую субъдиницу приходится по одному месту связывания ПБ. Можно предположить, что действие ПБ распространяется только на одну субьединнцу, неняя ее конфориацию и аллостерически ее сродство к ГАМК. Если даже сродство второй субъединицы к ГАМК остается нензненнын, то будет наблюдаться сдвиг доза-зависимости для ГАМК в сторону иеньших коцентраций ГАМК. Вероятно при низких концентрациях ПБ происходит связывание ПБ с одним центрон и действие ПБ потенциирующее, при увеличении концентрации ПБ количество рецепторов с одним занятым центрон увеличивается, проходит через максимум, а затем уменьшается, а с двумя занятыми центрами увеличивается. Можно предположить, что по аналогии с ГАМК, открывание канала происходит при связывании двух нолекул ПБ. Если мы прикладываем к нейрону раствор.содержащий и ПБ и ГАМК, то для открывания канала достаточно чтобы или две молекулы ГАМ или две молекулы ПБ связались с рецепторон. Последующая оккупация оставшихся мест связывания не вносит изменений в состояние открытого канала.

Чтобы объяснить появление тока при отмывке высоких

концентраций ПБ и колоколообразную форму кривой зависимости

доза-эффект ПБ, ны предположили существование еще одного неста

связывания для ПБ в дополнение к вышеупомянутым двум, связывание с

которым ПБ приводит к блокированию ответов, индуцированых как ГАМК

так и самим ПБ. Так как высокие концентрации ПБ ускоряли кинетику

спада ГАМК-активируемого тока, то , возможно, ПБ связывается с

открытым каналом. Следующая схема представляет это:

К К кь

М + й- = НГ( + м = = мгн* + м = = ман*,

ь

К,Кь-константы диссоциации, М-концентрация ПБ, М2К*-активированный

Э *

рецептор, М к -блокированный. В такой модели соотношение между ПБ- активированным током и его концентрацией будет следующим:

ГМ] кь

1=1

тах-

3 ? 2

[И] + [НГКЬ + [Н] к Кь + КЬК

Из этого соотношения видно, что с увеличением концентрации ПБ, ПБ-индуцированный ответ первоначально растет, а затем падает, что приводит к колоколообразной форне зависимости доза-эффект ПБ.

При отмывке ПБ возникает дополнительный ток, это значит, растет число активированных рецепторов, причем при увеличении коьаентрацни ПБ число таких рецепторов увеличивается. Рассмотрим как изменяется число активированных рецепторов при быстрой удалении лаганда.

л [и'к'' |

<) г.

и А*..- обратные константы скорости. Предположим, что в первый

момент отмывки правильным остается следующее соотношение верное для

равновесных условий:

, * СН2Я*] [М]

см3н*ь]= _

"ь

Число активированных рецепторов растет и появляется

кратковременный ток, если

а [Мгк*] [М ]/гь+ _ > о _ > 1

с1 Ь К_

константа скоости. При высоких концентрациях лиганда это соотношение выполнятся и при отмывке ПБ в первый момент возникает кратковременный ток.

Было показано что отношение I /I при отмывке ПБ на фазе

9 о

активации тока больше этого отношения, полученного при отмывке ПБ после достижения током максимума. Из предложенного механизма получается, что это отношение можно рассматривать как отношение числа активированных заблокированных рецепторов к числу активированных рцепторов. Если между этими состояниями установлено равновесие, то тогда это отношение должно быть постоянным, что мы и наблюдали при отнывке ПБ после достижения током максимума.

Из результатов радполигандных исследований известно, что конвульсантные барбитураты конкурируют с пнкротоксинон за участок связывания, а депрессантные аллостерически уненьшают сродство пикротоксина к пикротоксиновому рецептору и ускоряют его диссоциацию. Показано также, что С+) стереонер ПБ обладает возбуждающим действиен, а С-) стереонер депрессантнын. Так как в экспериментах использовался раценат, то, воножно, что С-.» стереонер ПБ связыватся с активирующим проводимость центром, а СО стереонер с блокирующим, и с этин же центрон связывается

пикротоксин. Так как связывание каждого из барбитуратов с рецептором характеризуется своими константами скорости, то порог возникновения .дополнительного тока у них различный.

Для конвульсантной активности барбитуратов существенно наличие гидрофобной части молекулы и поэтому считается, что конвульсантными являются барбитураты, которые имеют в положении С-5 заместители с более длинными цепями, чем у этила или насыщенное кольцо. У барбамила в положении С-5 стоит этиловая группировка, и то что даже при отмывке высоких концентраций не возникает значительного дополнительного тока связано с тем, что барбаиил плохо связывается с блокирующим центром.

Таким образом предложенная модель позволяет качественно описать совокупность полученных экспериментальных данных.

выводи.

1. На клетках Пуркинье активация ГАИК рецепторов приводит к изменению проницаемости для ионов хлора. Данные о действии агонистов ГАИК- иусцииола и баклофена, а также антагонистов ГАИК-бикукуллина и пикротоксина позволяют сделать вывод, что на соне клеток Пурккнье расположены ГАМКд рецепторы.

2. Экспериментально полученная зависииость доза-эффект ГАИК описывается уравнением, соответствующим независимому связыванию двух молекул ГАИК с рецептором.

3. Конкурентными блокатораии ГАМК- активируемых токов являются алкалоиды фталид-изохинолинового ряда конфигурации остальные

энантиомеры неактивны. Группы атомов в молекуле алкалоидов, далеко отстоящие от углеродов в положениях 1 и 9, влияют на эффективность блокирования ионных токов, активируемых ГАИК.

4. Антагонист ГАИК, рецептора пикротоксин необратимо блокирует

ионные токи, активируемые ГАМК. Его действие проявляется только в присутствии ГАМК. Приложение пикротоксина к поверхности нейрона в промежутках времени между аппликациями ГАМК не влияет на амплитуду следующих аппликаций ГАМК. Приложение высоких концентраций пенто-барбитала натрия к мембране приводит к деблокированию рецептора.

5. Низкие концентрации ПБ С10-100 мкГО увеличивают ГАМК-активированные токи, а высокие СО,1-5 мЮ вызывают появление токов, и в то же время блокируют токи, вызванные аппликациями как ГАМК, так и ПБ. Отмывка ПБ, приложенного к мембране нейрона в высоких концентрациях, сопровождается возникновением кратко-врененного дополнительного тока.

6. Между ПБ и ГАМК существует перекрестная десенситизация. Потенциал реверсии токов, вызванных ПБ и ГАМК, и тока, связанного с отмывкой ПБ, приложенного в высоких концентрациях, один и тот же. Антагонист ГАМК бикукуллин блокирует и ПБ-активируеный и дополнительный токи. Поэтому можно считать, что ПБ и ГАМК действуют на один и тот же тип ГАМК рецепторов. Дополнительный ток связан с воздействием ПБ на ГАМК рецептор.

7. Вид заместителя при 5 атоме углерода в молекуле барбитуровой кислоты в значительной мере определяет порог возникновения и величину дополнительного тока, возникающего при отнызке барбитуратов.

8. Предложена модель взаимодействия ПБ с ГАМК-активированным рецепторнын комплексом. Предполагается, что существуют три неста связывания ПБ на рецепторе ГАМК, два из которых ответственны за потенциирование ГАМК ответов и активацию ПБ тока, а третий за блокирующий эффект ПБ.

Список основных работ, опубликованных по тене диссертации.

1.Валеев А.Е. , Врублевскнй С.В., Черневская II.И. ГАМК-активируеная проводимость нейронов мозжечка нлекопитающих// Нейрофизиология. -1986.-т. 18, N 6. -С. 836-839.

2.Валеев А.Е., Черневская II. И. ГАИК-активируемая проводимость изолированных нейронов нозжечка и сенсорных ганглиев крыс// Нейрофизиология. -1988.-т.20, N 5. -С.645-652.

3.Валеев А.Е., Крышталь О.А., Черневская Н.И. Взаимодействие пентобарбитала с ГАМК -активируеными ионньшн каналами нейронов нозжечка крыс // Нейрофизиология. -1990.-т.22, и 2. -С. 93-98.

4.N.I.Chenevskaja, О.А.Кгishtal, A.Y.Valeyev. Inhibition of the GABA-induced currents of rat neurons by the alkaloid isocoryne fron the plant Corydalis Pseudoadunca.//Toxicon.-1990.-v.28. -P.727-730.

Элк. 34Т Формат МхсД/!/,. Уч. -ипд. л. 1,ЗУ

Подписано к печати ¿>.11.90 г.____Тираж 100.____

Полиграфический участок Института теоретической физики ЛИ УССР