Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное исследование функциональных свойств рецепторов гамма-аминомасляной кислоты (А типа) в различных типах нейронов центральной нервной системы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование функциональных свойств рецепторов гамма-аминомасляной кислоты (А типа) в различных типах нейронов центральной нервной системы"

на правах рукописи

Колбаев Сергей Николаевич

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ РЕЦЕПТОРОВ ГАММА-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ (А ТИПА) В РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ НЕЙРОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

03.00.02.-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва -2003

Работа выполнена в Институте мозга РАМН

Научные руководители:

Член-корр. РАМН, профессор Владимир Георгиевич Скребицкий. кандидат биологических наук Ирина Николаевна Шаронова.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ара Саакович Базян

кандидат физико-математических наук Евгений Николаевич Тимин

Ведущая организация:

Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино

Защита состоится «16» октября 2003 г. В 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Моск. обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Ученый секретарь диссертационного совета

В.Е. Братия

'¿CO© S-rt

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Гамма аминомасляная кислота (ГАМК) служит основным тормозным нейромедиатором в ЦНС млекопитающих. Главной мишенью для ГАМК на постсинаптической мембране являются ГАМКд рецепторы, на которые также воздействует широкий круг нейротропных препаратов. Это обуславливает ведущую роль ГАМКд рецепторов в регуляции активности нейронов и определяет актуальность исследования их функциональных особенностей в разных типах нейронов.

Благодаря развитию методов молекулярной биологии стали известны основные черты строения ГАМКд рецепторов (Barnard et al. 1998). Согласно современным представлениям, ГАМКд рецептор - это гетероолигомерный белок, состоящий из пяти субъединиц. В настоящее время на основе структурной гомологии выделяют семь различных подтипов субъединиц (а, р, у, 8, 0, я и е), в каждом из которых объединено от одной до шести изоформ (6а, Зр, Зу, 15, 18, 1л и Is), принимающих участие в формировании функциональных рецепторов (Sieghart et al. 1999). Недостаточная изученность принципов структурной организации ГАМКд рецепторов не позволяет выделить устойчивые структурные варианты в рамках всего многообразия этого типа рецепторов. Однако, было показано, что субъединицы ГАМКд рецепторов имеют характерное распределение в ЦНС, которое меняется в ходе развития животного (Brooks-Kayal et al. 1998; Doble et al. 1992; Pirker et al. 2000). Кроме того, в работах на рекомбинантных рецепторах было установлено, что функциональные свойства ГАМКд рецепторов зависят главным образом от композиции субъединиц, входящих в их состав (Sieghait 1995). В совокупности, эти данные позволяют говорить о различной функциональней роли ГАМКд рецепторов в ЦНС, имеющих различное строение и, как следствие, отличающихся по своим свойствам.

Исследование функциональной роли гетерогенности ГАМКд рецепторов является актуальной задачей как для фундаментальной науки, так и для практической нейрофармакологии. Согласно современным представлениям, широкий спектр поведенческих эффектов при введении препаратов, взаимодействующих с ГАМКд рецепторами, связан с функциональной гетерогенностью этих рецепторов. Кроме того, развитие некоторых неврологических и психических заболеваний и расстройств связано с изменениями в количественном и качественном составе ГАМКд рецепторов на различных типах нейронов (Nutt et al. 2001).

Таким образом, изучение функциональной роли гетерогенности ГАМКд рецепторов является основой для понимания процессов регуляции возбудимости и эмоционального статуса в норме и патологии. В свою очередь изучение функциональной роли гетерогенности базируется на изучении структурной и функциональной гетерогенности ГАМКд рецепторов. Между тем, современные методы исследования не позволяют непосредственно изучать структуру и

функциональные свойства ГАМКд рецепторов как < lyfift&cftitffiffiMiAMiAfc >в, локализованных

БИБЛИОТЕКА

на различных типах нейронов. При этом, в лучшем случае, известна лишь совокупность субъединиц ГАМКд рецепторов, экспрессируемых на отдельном типе нейронов.

В данной работе было исследовано действие различных модуляторов активности ГАМКд рецепторов, обладающих селективностью к субъединичному составу этих белковых комплексов. Такой подход позволил исследовать свойства ГАМКд рецепторов, в клетках Пуркинье мозжечка и в ацетилхолинергических интернейронах стриатума крысы, как функциональных единиц. Цель работы - сравнительное исследование функциональных свойств ГАМКд рецепторов, эксперессируемых на поверхности различных типов центральных нейронов - клеток Пуркинье мозжечка (КП) и гигантских холинергических интернейронов (ТИС) из головки хвостатого ядра мозга крысы.

Основные задачи исследования. (1) Используя метод фиксации потенциала на изолированной клетке и систему быстрой аппликации веществ, исследовать биофизические свойства токов, вызываемых ГАМК в клетках Пуркинье мозжечка и гигантских интернейронах стриатума, выделенных из срезов мозга крысы. Дать количественную оценку свойств ответов, вызываемых ГАМК в исследованных типах нейронов. (2) Провести сравнительное исследование в разных типах нейронов модуляции ГАМК-активируемых токов веществами, которые избирательно взаимодействуют с ГАМКд рецепторами, имеющими различный субъединичный состав (фуросемвд, золышдем, хлорид лантана, лореклезол). Выявить особенности модуляции ответов на ГАМК этими препаратами и дать количественную оценку их эффектов для исследуемых типов клеток. (3) Проанализировать полученные результата о различии свойств нативных рецепторов в свете литературных данных по фармакологии рекомбинантных рецепторов. Сопоставить полученные результаты с литературными данными о распределении различных подтипов субъединиц ГАМКд рецепторов в мозге крысы с целью выявления наиболее вероятной субъединичной композиции этих рецепторов в исследованных нейронах.

Научная новизна работы. Методом локальной фиксации потенциала впервые проведено систематическое исследование функциональных свойств ГАМКд рецепторов в двух типах центральных нейронов - клетках Пуркинье мозжечка и гигантских ацетилхолинергических интернейронах стриатума. Сравнительная оценка абсолютных амплитуд ответов на ГАМК в КП и ГИС позволяет утверждать, что количество рецепторов на обоих типах нейронов примерно одинаково.

Впервые проанализирован механизм действия фуросемида на ГАМКд рецепторы КП и ГИС и установлено, что он отличен от такового, описанного в литературе для фуросемид-чувствительных, а«-, сц-содержащих рецепторов. Впервые показано, что фуросемид блокирует токи, вызываемые ГАМК, взаимодействуя с порой канала этого типа рецепторов, и что угнетение токов происходит по механизму последовательного блока. Впервые изучена зависимость блокирующего действия фуросемида от мембранного потенциала. В рамках модели №оос!Ьи11

различия, полученные для КП и ГИС, были связаны с различиями в строении канала ГАМКд рецепторов в обоих типах клеток. Предложена математическая модель, описывающая действие фуросемида на ГАМКа рецепторы КП.

Впервые исследовано модулирующее действие LaCl3 в КП и в ГИС. Совместная аппликация ГАМК и лантана приводила к потенциации ответа. Показано, что ГАМКд рецепторы

La

КП более чувствительны к действию LaCb, чем рецепторы ГИС (ЕС 50 для КП меньше чем для ГИС, а максимальный эффект больше).

Впервые исследовано модулирующее действие лореклезола на токи, вызываемые ГАМК в КП и ГИС. Показано, что в обоих типах клеток лореклезол потенциирует ответы, вызываемые ГАМК ЕС20, при этом, максимальный потенциирующий эффект лореклезола для КП значительно выше, чем для ГИС.

Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют сравнять роль ГАМКергаческих входов в регуляции активности клеток Пуркияъе мозжечка и гигантских холинергических нейронов стриатума крысы. Использование набора селективных модуляторов при исследовании функциональных свойств ГАМКа рецепторов позволило провести систематическое исследование их функциональной гетерогенности. Подобный подход может бьггь распространен и на другие типы нейронов. Изложенные результаты важны для понимания и оценки роли гетерогенности ГАМКа рецепторов в ЦНС и будут полезны при интерпретации экспериментов, проводимых на срезах или на уровне целого организма. Кроме того, потенциально интересным направлением для изучения строения ГАМКд рецепторов является исследование действия канальных блокаторов - структурных гомологов фуросемида. Подобный подход с использованием соответствующих блокаторов позволит ответить на ряд принципиальных вопросов, касающихся механизмов работы каналов этих рецепторов. Предлагаемая модель действия фуросемида является удобным инструментом для проверки и выдвижения новых гипотез, в том числе и о механизмах работы ГАМКа рецептора как такового. Апрпйацш» ряКпты. fVuniшш результаты работы были доложены на 30-ой Международной конференции по нейронаукам (New Orlean 2000); на XVIII Съезде Физиологического общества имени И.П. Павлова (Казань 2001); на заседании Ученого совета НИИ мозга РАМН. Публикации По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Структура и объем диссертации- Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 165 страницах и включает 34 рисунка. Список цитированной литературы включает 273 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на механически изолированных нейронах Пуркинье (КП) и гигантских ацетилхолинергических интернейронах стриатума (ГИС), выделенных из коры мозжечка и головки хвостатого ядра крысы, соответственно. Для этого использовали парасагиттальные срезы мозжечка и фронтальные срезы стриатума 12- 20 дневных крыс Wistar (обоего пола). Нейроны выделяли методом вибродиссоциации не раньше, чем через 1 час после начала инкубации срезов (Vorobjev 1991). Срезы инкубировали при комнатной температуре (~ 19°С) в растворе следующего состава (в мМ): NaCl 125; КС15; СаС)21.5; MgCl21.5; NaH2P04 1.25; NaHCCh 25; глюкоза 10. Раствор непрерывно продувался карбогеном (95% 02, 5% С02). Вьщеление нейронов осуществляли в регистрационной камере в растворе следующего состава (в мМ): NaCI 145; KCI 5; СаС12 2.7; MgCl2 2; HEPES 5; HEPES-Na 5; рН = 7.4. Смену растворов осуществляли методом концентрационного скачка при помощи системы аппликации, аналогичной описанной ранее (Vorobjev et al. 1996). Регистрацию токов проводили при комнатной температуре методом "patch-clamp" в конфигурации "целая клетка" с помощью микроэлектродов, изготовленных из твердого боросиликатного стекла и заполненных "внутриклеточным" раствором следующего состава (в мМ): CsCl 140; СаС12 1; MgCl2 4; HEPES 10; EGTA 5; ATP-Na 4. Сопротивление микроэлектродов составляло 2-5 МОм. Регистрируемые токи оцифровывали с частотой 500 Гц и записывали на жесткий диск компьютера. Обработку данных и статистический анализ проводили с помощью программ Excel (Microsoft Corporation) и Prizm (v3 GraphPad Software, San Diego, CA).

Математическое моделирование основывалось на решении линейных систем дифференциальных уравнений первого порядка в рамках теории, описанной ранее (Colquhoun et al. 1981; Colquhoun et al. 1995). Системы уравнений решали методом Рунге-Кутты 4-го порядка с использованием среды программирования Matlab v5 (MalhWork, Natick, MA) и написанной на языке этой среды программы.

Вещества для приготовления рабочих растворов, а также модуляторы активности ГАМКд рецепторов, за исключением лореклезола, были приобретены в фирме Sigma (St.Louis, МО). Лорекяезол был приобретен в компании Janssen Pharmaceuticals (Beerse, Belgium). Растворы ГАМК и веществ-модуляторов, за исключением фуросемида, приготавливались из маточных растворов с концентрацией 10 мМ. При этом для ГАМК и LaCU в качестве растворителя использовалась диет, вода, для зольпидема - 96% раствор этилового спирта, для лореклезола -диметилсульфоксид (ДМСО). Для приготовления растворов фуросемида использовали маточный раствор, содержащий эквимолярные количества фуросемида и NaOH в концентрации 100 мМ, растворенные в воде.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследование эффектов, вызываемых ГАМК в КП и ГИС. Исследования токов, вызываемых ГАМК в различных типах клеток, проводили при фиксированном мембранном потенциале -70 мВ, в диапазоне концентраций 0.5-1000 мкМ. Во всех исследованных нейронах аппликация ГАМК вызывала входящие токи, которые подавлялись в присутствии 20 мкМ бикукуллина.

Аппликация различных концентраций ГАМК в обоих типах нейронов вызывала, на качественном уровне, одинаковые явления. Последовательное увеличение концентрации ГАМК приводило к монотонному увеличению амплитуды и характерному изменению временного хода ответов (Рис. 1). Так, при аппликации высоких концентраций ГАМК вслед за резким увеличением следовало монотонное уменьшение амплитуды трансмембранного тока, вызываемое переходом рецепторов в десенситизированное состояние (^УейЬгоок е1 а1.1995).

ГАМК (|1М) -

кп

ГАМК <цМ)

гис

Рис* 1

Концентрационная зависимость эффектов, вызываемых ГАМК в КП и ГИС.

Записи токов, произведенные от клеток Пуркинье и нейронов стриатума при разных концентрациях ГАМК (в мкМ: 2, 5, 10, 100 для КП и 5, 15, 50, 100, 1000 для ГИС) и наложенные друг на друга отдельно для каждого типа клеток. Горизонтальной чертой отмечен интервал, в течении которого производилась аппликация

ГАМК.

Результаты исследования концентрационной зависимости амплитуды токов от концентрации ГАМК обрабатывали стандартным образом, аппроксимируя экспериментальную зависимость

уравнением Хилла:

Щ[ГАМК]) =

([ГАМК]]

i ес50 )

(1)

1+

[ГАМК] , ЕС50

Где Щ[ГАМК]) = ЭДГАМ1Ф . относительная амплитуда ответов, [ГАМК] - использованная 'Макс

концентрация ГАМК, ЕС» - концентрация, вызывающая ответ, амплитуда которого в два раза

меньше амплитуды ответа, вызываемого насыщающими концентрациями, Ь - коэффициент Хилла, отражающий крутизну концентрационной зависимости.

Результаты такой обработки, усредненные от нескольких нейронов (п=9 для КП и п=8 для ГИС), а также кривые - результат аппроксимации представлены на Рис. 2. Для клеток Пуркинье величина ЕС50 для ГАМК составила ЕС}о=3.2±0.2, коэффициент Хилла к=1.8±0 2, а для интернейронов стриатума ЕС^28.4М.7, к=1.4±0.2. Различия величин ЕС50 и Ь для двух типов нейронов были приняты значимыми {р<0.0001 для ЕС50 и р=0.0005 для Ь). В дальнейшем, для оценки модулирующего действия различных веществ на токи, вызываемые ГАМК, использовали концентрацию ГАМК, вызывающую ответ, амплитуда которого составляла 20% (ЕС20) от максимального. Концентрация, вызывающая 20% эффект, была рассчитана с помощью уравнения:

ЕС20=ЕсЦт£-)Ь (2)

Где р=0.2 (доля от максимального ответа), а ЕСМ (мкМ) и Ь - параметры уравнения Хилла.

Рис.2

Аппроксимация уравнением Хилла концентрационной зависимости эффектов ГАМК в КП и ГИС.

Зависимость относительной амплитуды ответа от концентрации ГАМК для клеток Пуркинье (треугольники) и для клеток стриатума (квадраты). Наложенные сплошные линии -результат подгонки уравнением Хилла.

Значения величин ЕСго составили: 2мкМ для клеток Пуркинье и 15мкМ для клеток стриатума (по усредненным кривым доза-ответ для каждого типа клеток). Средние значения относительных амплитуд ответов, вызываемых ГАМК - 2 мкМ (КП) и 15мкМ (ГИС), измеренные с использованием более обширных выборок (п=33 для КП, п=15 для КП), несущественно отличались от 20% (р=0.36 для КП, р^0.2 для ГИС). Таким образом, оценки концентрации ЕСго, сделанные с использованием ограниченных выборок и уравнения (2), характерны для данных типов нейронов в целом.

Для сравнения абсолютных величин амплитуд ответов апплицировали ГАМК в концентрации ЕСго на различные типы клеток. Квартили распределения абсолютных величин ответов представлены в Таб. 1.

[ГАМК], (цМ)

Среднее значение амплитуд ответов в исследуемой группе КП из 224 нейронов составило 1,3 нА, среднеквадратичное отклонение 0.62 нА. Аналогичные величины для группы из 168 ГИС в ответ на аппликацию ГАМК ЕС2о (15 мкМ) составили: среднее 1.36 нА, среднеквадратичное отклонение 0.77 нА.

Выявленные различия в средних арифметических абсолютных амплитуд ответов для этих двух популяций стоит считать незначимыми (р=0.49). Поскольку проводимость каналов одинакова для ГЛМКд рецепторов различного субъединичного состава (Chebib et al. 2000), то, видимо, количество рецепторов на КП и ГИС не отличаются существенно.

Временные характеристики ответов, вызванных аппликацией ГАМК ЕСго, сравнивали, используя параметры одноэкспоненциальной подгонки Таити и Тдеютш (Рис. 3 А).

Рис.3

Сопоставление временных характеристик ответов на аппликацию ГАМК ЕС» в КП и ГИС.

А) На рисунке приведены ответы, характерные для КП и ГИС, на аппликацию ГАМК ЕСго- Сплошными линиями изображены

кривые - результаты одноэкспоненциальной подгонки, а также параметры подгонки: т^щ, Тдияив (стрелками указало, к какому именно процессу относятся эти параметры). Прямоугольниками обозначены интервалы, в течение которых

проводилась аппликация ГАМК.

Б) Таблица, в которой сведены данные о временных характеристиках ответов для дайной выборки нейронов.

Таб. 1

КП ГИС

количество нейронов 224 168

размерность (нА) (нА)

Мин. значение 0.34 0.21

нижняя квартиль 0.85 0.84

Медиана 1.15 1.22

верхняя квартиль 1.61 1.85

Макс, значение 3.67 3.93

КП 2 цМ ГАМК

ГИС 15 цМ ГАМК

^ДИКШ в 182 MC

ГИС

КП

среднее

27

17

т«спм(МС) ТдЦВ1)>(МС) ^flaiffHi>(MC)

97.8

170.8

101.1

93.0

ср. кв. откл.

14.4

45.1

7.9

19.6

Границы 95% доверительного интервала

нижняя верхняя

92.1 103.5

152.9 188.6

_97

105.1

83 103.1

Средние значения тмтм составили: 101.Ш.9 мс для КП (п = 17) и 97.6±2.8 мс для ГИС (п = 27). Значения т^^ для этих же групп нейронов составили: 93±4.8 мс для КП и 170.8±8.7мс для ГИС. В ходе сравнительного исследования не было выявлено существенных отличий времен хахтш в КП и ГИС (р=0.35), в то же время отличия тЬеаоти в этих группах были приняты значимыми (р<0.0001, см. Рис. 3 Б).

Исследование действия фуросемида на токи, вызываемые ГАМК. Исследование модулирующего действия фуросемида на токи, активируемые аппликацией ГАМК, проводили в диапазоне концентраций 1-5 мМ. Использование концентраций фуросемида менее 1мМ не приводило к сколько-нибудь заметным изменениям ГАМК-активируемых токов. При этом верхняя граница концентрационного диапазона определялась пределом растворимости фуросемида в физиологическом растворе.

В основной части экспериментов контролем служили ответы клеток на аппликацию ГАМК ЕСго- Под действием фуросемида и в КП и в ГИС замедлялась скорость активации ответов (Рис. 4), уменьшалась амплитуда стационарного компонента ответа, а прекращение совместной аппликации вызывало кратковременное увеличение амплитуды ответа («хвостовые токи») (Рис. 5). Зависимость замедления скорости активации и уменьшения амплитуды стационарного компонента ответов имела монотонный характер: чем выше концентрация фуросемида, тем медленнее скорость активации и меньше амплитуда стационарного ответа (Рис. 4). Зависимость скорости активации от концентрации фуросемида исследовалась только качественно. Влияние фуросемида на амплитуду стационарного ответа на аппликацию ЕСго исследовалось при различных концентрациях фуросемида и разных значениях мембранного потенциала.

Ё ев 2.5-

V*

? £ 2.0-

ш

1

£ 1.5-

Я

V*

1.0

1

- КП, п=6 ГИС, п-5

—

4

Рис.4

Влияние фуросемида на стадии активации ответов в КП и ГИС.

Фуросемид вызывает замедление скорости активации ГАМК вызываемых токов. На графике представлены зависимости относительного времени активации от концентрации фуросемида. Отдельными символами (квадратами для КП и треугольниками для ГИС) обозначены значения относительных времен активации, усредненные для группы нейронов (п=б для

[Фуросемид], (мМ)

КП и п=5 для ГИС) вместе с ошибкой среднего (вертикальные отрезки). Для удобства восприятия отдельные символы на графике были соединены отрезками прямых.

Ограниченная растворимость фуросемида в водной среде не позволила исследовать

концентрационную зависимость эффектов фуросемида в желаемом диапазоне концентраций.

Данное обстоятельство не позволило измерить максимальный процент блока, вызываемого

кп

гис

Рис.5

2 цМГАМК+Фуросюид 15 рМ ГАМК+ Фуросешад

Влияние фуросемида на стадии стационарного ответа в КП и ГИС.

Присутствие фуросемида вызывало концентрационно-зависимое уменьшение

амплитуды стационарного компонента ответа. Записи ответов, произведенные от КП и ГИС при совместной аппликации ГАМК ЕСго и фуросемида, и контрольная запись, наложены друг на друга. Горизонтальными линиями над записями обозначены интервалы времени, в течении которых производилась аппликация веществ.

фуросемидом, а также величину ГС». Для сравнительного исследования вычисляли процент блока ^_1СТ([Фуросемид])\т% ¡СТО) )

ВСТ ([Фуросемид])=

вызываемого 5мМ фуросемида

(1ст([Фуросемид]) - амплитуда стационарного ответа, вызванного аппликацией ГАМК ЕСго и фуросемида, [Фуросемид]- концентрация фуросемида). Процент блока Вст(5мМ) составил: 33.5±1.3%, п=*34 для КП и 56.4±2.8%, п=25 для ГИС (Рис. 6 А). Различия величин Вст{5мМ) были приняты значимыми (р<0.0001).

100-1

£ 75'

-с

1 5<Н «л,

аа

25'

56.4 ± 2.8%

¡Ш

33.5 + 1.3%

А

Рис. 6

КП(2цМ) ГИС (15 цМ)

1.5п

1.0'

| 6

0.5'

О.О'

▼ КП

1С5в-8.9±0.7 —■ ГИС

1С5о=4.7±0.2

0.1

чин

10

[Фуросемид], (мМ)

Концентрационная зависимость эффектов фуросемида на стадии стационарного ответа в КП и ГИС.

А) Сравнение процента блока, вызываемого 5 мМ фуросемида в КП и ГИС. На графике представлены значения процента блока, вызванного совместной аппликацией ГАМК ЕСго и 5мМ фуросемида - Вст(5мМ) в различных нейронах. Отдельными символами (треугольниками для КП и квадратами для ГИС) обозначены значения процента блока - Вст(5мМ), измеренные для отдельных нейронов (всего было использовано п=35 КП и п=24 ГИС). Средние арифметические

процента блока для каждой группы обозначены на графике горизонтальной чертой (численные значения Вст(5мМ) составили: 33.5 ± 1.3% для КП и 56.4 ± 2.8% для ГИС).

Б) Оценка величины ГС50 для фуросемида с помощью уравнения Хилла. На графике представлены значения относительных амплитуд ответов при разных концентрациях фуросемида, а также кривые-результаты подгонки уравнением Хилла. Отдельными символами (треугольниками для КП и квадратами для ГИС) обозначены значения относительных амплитуд ответов, усредненные для каждой группы нейронов (всего было использовано п=6 КП и п=8 ГИС).

Кроме того, при использовании уравнения (3) были получены верхняя (значение параметра Ь = I)

и нижняя (значение параметра Ь^1-Я(5мМ), где Фуросемид])= фУРосемид] ) ) оценки

1ст(°)

параметра ICjo-

bx

Щ[Фуросемид]) = 1 -

'[ФуросемидА

IC50 J

/ (3)

1 + Г [Фуросемид] У*

I IC50 J

По результатам этого анализа значения величин IC50 для КП находились в интервале 2.8 мМ <1С50< 8.9 мМ, а для ГИС в интервале 2.6 мМ < 1С50 < 4.7 мМ (Рис. 6 Б).

Как было показано рядом авторов, степень угнетения фуросемидом ГАМКа рецепторов зависит в основном от природы а субъединицы, входящей в их состав (Korpi et al. 1995; Wafford et al. 1996; Thompson et al. 1999). При этом выделяют группу «чувствительных» (1С5о«1мМ и содержащих щ, а« субъединицы) и «нечувствительных» (ICso>1mM) ГАМКа рецепторов (Thompson et al. 1999). Таким образом, блокирующее действие фуросемида на рецепторы КП и ГИС сопоставимо с его действием на «нечувствительные», рекомбинантные ГАМКа рецепторы.

Полученные данные позволяют оценить долю «чувствительных» рецепторов на поверхности КП и ГИС сверху. Выражения для трансмембранного тока в контрольных условиях (Colquhoun et al. 1981а; Costa 1998) и в присутствии 1мМ фуросемида запишутся следующим образом: lKMnp=(»N+ns)YV; liMMKRN(lMM)n^Rs(lMM)i»s)yV. Где ns- число «чувствительных» и nN- число «нечувствительных» к действию фуросемида ГАМКа рецепторов, активированных аппликацией ГАМК ЕС20; Rn(ImM), Rs(ImM) - доля неблокированных рецепторов при действии 1мМ фуросемида; у- проводимость одиночного канала; V-мембранный потенциал (потенциал реверсии в данных условиях близок к нулю). Величины 1С ¡о для «чувствительных», ограниченны сверху значением 298 мкМ, a h-0.45 (для оиаб рецепторов (Sigel et al. 2000)) отсюда: Rs(1mM)=0J7. Принимая Rn(1mM)=1 (для верхней оценки), подставляя экспериментально полученные значения Щ1мМ) (0.96 для КП и 0.94 для ГИС) и используя

„ ne RN(1mM)-R(1mM) 6 ne

обозначения 8 = —= " „ч „ и Ps = ;—- =-2—-доля «чувствительных»

nN R(1mM)-Rs(1mM) 1 + 9 ns + nN

рецепторов, получим: Ps =0.063 для КП и Ps =0.095 для ГИС.

Зависимость блокирующего действия фуросемида от мембранного потенциала (от -70мВ до +70мВ) исследовалась при совместной аппликации ГАМК ЕСм и 5 мМ фуросемида (Рис. 7А, Б). Сравнение значений потенциалов реверсии (Уг) для токов, полученных в присутствии фуросемида и в контрольных условиях, не выявило существенных отличий (р=0.65 для КП, р=0.99 для ГИС).

кп

ГИС

Рис. 7

2 цМ ГАМК

15 (1М ГАМК

2 цМГАМК

15 цМГАМК

5 мМ Фуросемнд

5 мМ Фуросемнд

1иА

В

*ГИС,Уг«и±1.1 «в

1.9*1.1 мВ

Зависимость действия фуросемида от

мембранного потенциала.

А) Блокирующее действие фуросемида более

выражено при

деполяризующих значениях мембранного потенциала. Оригинальные записи токов,

произведенные от КП и ГИС при аппликации ГАМК ЕСго (верхняя часть) и при совместной аппликации ГАМК ЕСго и 5 мМ фуросемида (нижняя часть рисунка),

иллюстрируют эту

зависимость. Записи в обоих случаях

производились при

различных значениях мембранного потенциала (-70, -50, -30, -10, 10, 30, 50,70 мВ).

Б) На графике представлены зависимости относительных амплитуд

_ 10ТМ(Умем)

1^!пр(-70мВ)

(стационарной компоненты), от

мембранного потенциала. Отдельными символами (треугольниками для КП и квадратами для ГИС) обозначены значения относительных амплитуд ответа, усредненные для исследованных групп нейронов и соединенные отрезками прямых линий. Значения потенциала реверсии Кг для стационарной компоненты ответа в исследованных группах составили: 1.9±1.1 мВ для КП и 1.2*1.1 мВ для ГИС.

В) На графике отдельными символами представлены величины Я(Умем)= ст мем ,

^СТ^^мем)

измеренные при разных значениях мембранного потенциала (треугольники для КП и квадраты для ГИС), а также кривые - результат подгонки уравнением (4).

Было .также показано, что степень угнетения ответов в обоих типах клеток зависит от мембранного потенциала монотонным образом: чем выше степень деполяризации мембраны, тем сильнее угнетение (Рис. 7 А, Б). Исследование зависимости блока от мембранного потенциала проводили в рамках модели Вудхул (А^оосйшН 1973). В рамках этой модели, экспериментальную

^'ст (^мвм) ? у»/ зависимость относительной амплитуды ЩУмем) = —^- (где: ¡гт (Умш) -

тКОНМр /-гт .

*СТ ' умем )

амплитуда ответа, полученного при мембранном потенциале Умем, в присутствии блокатора, а 1™тр(Умем) амплитуда ответа, полученного в тех же условиях) от мембранного потенциала (Рис. 7 В) аппроксимировали зависимостью:

*ОЪем) = ----ч--(4)

[фуросемид ]ехр^- + К(0)

Где К(0)-константа диссоциации иона с места его связывания в канале (размерность - М [моль/литр]), б- безразмерная величина (выражает разность потенциалов между внешней стороной мембраны и местом связывания блокатора в долях от трансмембранной разности потенциалов), ъ-заряд блокирующего иона (безразмерная величина - целое число, в данном случае «-1»), Р-постоянная Фарадея, И-универсальная газовая постоянная, Т-температура окружающей среды, [Фуросемид] - использованная концентрация фуросемида (размерность - М [моль/литр]). Параметры аппроксимации К(0) и 5, усредненные для каждой группы нейронов имели следующее значение К(0)=5.4± 0.6 мМ, 5=0 27± 0.04, п~5 для КП К(0)=].3± 0.2 мМ, 5=0.38± 0.02, п=б для ГИС. При значении мембранного потенциала -70 мВ: К(-70 мВ)=11.7 мМ для КП и К(-70 мВ)=3.9

хЬУ\

мМ (рассчитано по уравнению К( V) = К(0) * ехр(-),см. ЧУоо<Ши111973).

КТ

Для объяснения явлений, вызываемых фуросемидом, была предложена математическая модель, основанная на следующих постулатах:

1) Единственное место связывание фуросемида с ГАМКд рецептором локализовано в канальной поре. Как следствие этого предположения - фуросемид может взаимодействовать только с рецептором, находящимся в открытом состоянии.

2) При связывании со своим местом внутри канальной поры фуросемид, находясь внутри канала, полностью блокирует ток ионов хлора и переводит рецептор в блокированное состояние (предполагаемая стехиометрия взаимодействия - одна молекула фуросемида на один канал).

3) Зависимость констант скорости ассоциации/диссоциации блокатора от мембранного потенциала имеет тот же вид, что и в модели Woodhull (1973). Остальные константы скорости не зависят от мембранного потенциала

4) Конформация рецептора в блокированном состоянии не отличается от конформации рецептора в открытом состоянии, за исключением наличия молекулы блокатора в канале.

5) Переходы из закрытых состояний в открытые и затем в блокированные осуществляются последовательно (т.е. переходы из закрытого состояния в блокированное и обратно, считаются невозможными. См. Рис. 8 и подписи к рисунку).

Рис. 8

Схема последовательного блока.

На приведенной схеме символами С, обозначены закрытые состояния; О, - открытые состояния; В, -состояния, в которых рецептор имеет конформацию открытого состояния, но при этом его пора заблокирована фуросемидом (конкретное число закрытых, открытых и блокированных состояний не имеет принципиального значения); а„ - константа скорости перехода из открытого состояния О, в закрытое С, (размерность с"1); Д - константа скорости перехода из закрытого С| в открытое О, (размерность с" '); Ь, - константа скорости перехода из открытого состояния О, в блокированное ОВ, (размерность М"'с''); иЬ, - константа скорости перехода из блокированного состояния ОВ, в открытое О! (размерность с*1).

1 2 3 4 б

к А 2к! ЯА Т"* 2ь-1 й Э Б ь пь Б ка2в

I..................................................-X...............Л

5

Рис.9

Схема последовательного блока для модели ГАМКд рецептора.

А) Схема активации ГАМКд рецептора. Согласно этой модели, рецептор в любой момент времени находится в одном из пяти состояний, которые обозначены следующим образом: Я - состояние, в котором ионный канал закрыт и места связывания рецептора с ГАМК свободны, ЯА - ионный канал закрыт, одно из мест связывания занято молекулой ГАМК, ИАг - ионный канал закрыт, оба места связывания заняты молекулами ГАМК, ИАг* - ионный канал открыт, оба места связывания заняты молекулами ГАМК, О - канал закрыт, рецептор находится в десенситизированном состоянии. Стрелками на схеме обозначены направления переходов, а символами над стрелками -константы скоростей соответствующих переходов (в скобках указана размерность соответствующей константы): к] - константа скорости ассоциации ГАМК с незанятым местом связывания на ГАМКд рецепторе (мкМ"'с"1), к./ - константа скорости диссоциации ГАМК с места

связывания на ГАМКд рецепторе (с"1), <1 - константа скорости перехода в десенситизированное состояние (с'1), г - константа скорости выхода из десенситизированного состояния (с"'), а -константа скорости перехода из открытого ЯАг* в закрытое состояние ЫАз (с"1), /? - константа скорости перехода из закрытого КАг в открытое состояние ЯА^* (с'1).

Б) Схема блокирования ГАМКд рецептора фуросемидом. Схема Б дополняет схему А и вместе они дают описание предложенной модели последовательного блока. На схеме Б символами обозначено: ЯАгВ - блокированное состояние с конформацией открытого рецептора; Ь — константа скорости перехода из открытого ЯАг состояния в блокированное ЯАгВ (мМ"'с"'); иЬ - константа скорости перехода из блокированного НАгВ состояния в открытое ИАг* (с"1).

Записи токов от КП Фуросемнд 3 мМ

2 цМГАМК

Фуросемнд 5 нМ

2(1МГАМК

1с

Результаты моделирования

Фуросемнд 3 мМ

2цМГАМК

Фуросемнд 5 мМ

2 цМГАМК

модель: 10^=11.6 мМ

КП, эксп. д>аяые:1С;(в8.9 мМ

[Фуроссмвд], (мМ)

В

3.02.51 5 2.0Н

О

** 1.51.0-

данные для КП ♦результата моделнрованяя

[Фуросемнд], (мМ)

Рис. 10

Сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными

А) На рисунке представлены записи токов, нормированные на абсолютную величину контрольного ответа, совместно с кривыми - результатами моделирования. Записи были получены от одного нейрона (КП), эти же записи использовали для процедуры подгонки. Наложение записей ответов и результатов моделирования дает возможность оценить, насколько хорошо модель описывает временной ход реальных ответов. Для удобства восприятия результаты моделирования также представлены на рисунке справа без записей ответов.

Б) Зависимость относительных амплитуд ответа от концентрации фуросемида. На рисунке представлены кривая - результат моделирования и относительные амплитуды ответов для разных нейронов (различные символы, всего на графике представлены данные от п=6 нейронов).

Г) Зависимость величины тотн = Токт(ФУосеми^) от концентрации фуросемида. На графике

Такт(0)

представлены значения т™, полученные экспериментальным путем (квадраты), а также результаты моделирования (круги). Отдельными символами обозначены значения т,™, усредненные для группы нейронов п=б КП (в случае экспериментальных данных).

В литературе механизм взаимодействий веществ с рецепторами, описываемый подобными

схемами, называется механизмом «последовательного блока» (Вепуешзге й а1.1995).

Предложенная схема переходов дает лишь качественное представление о взаимодействии

блокатора с рецепторами. Для вычислений по данной модели, а также для имитации ответов на

ГАМК/ГАМК+фуросемид схема на Рис. 8 была дополнена схемой активации рецепторов (Рис. 9).

В результате подгонки были определены константы скоростей переходов между

различными состояниями: к]=6.5 мкМ'с'; к.,^70 с'; с!=200 с'; г=19 с'; а=200 с'; (1-1800 с';

Ь=18 мМ'с1; иЬ= 32 с1. Результаты моделирования, а также экспериментальные данные

представлены на Рис. 10.

Предложенная модель качественно описывает замедление активации токов в присутствии

фуросемида, появление хвостовых токов, временной ход процента блока и зависимость процента

блока от мембранного потенциала (постулат 3). Величина К(-70мВ), измеренная по результатам

исследования потенциал-зависимости блока, и величина | , вычисленная в рамках

У=-70мВ

предложенной модели, имели близкие значения: 11.7 мМк 11.6мМсоответственно.

Угнетение фуросемидом токов, вызываемых ГАМК, по механизму канального блока не свойственно для «чувствительных» рецепторов, в которых фуросемид действует как аллостерический блокатор (Когр! е1 а]. 1995; Wafford е1 а1. 1996). Таким образом, согласно полученным данным, для «нечувствительных» ГАМК рецепторов КП и ГИС, механизм действия фуросемида принципиально отличен от предложенного ранее для «чувствительных» рецепторов. Изучение модулирующего воздействия зольпидема, лореклезола и ЬаС1з на токи, вызываемые ГАМК в КП и ГИС. Исследование модулирующего действия зольпидема, лореклезола и ЬаС1з проводили в присутствии ГАМК ЕС2о- Аппликация этих модуляторов в отсутствие ГАМК не приводила к активации трансмембранных токов. В то же время, присутствие одного из перечисленных выше модуляторов в апплицируемом растворе приводило к увеличению амплитуды тока по сравнению с контрольным значением. Токи, вызываемые совместной аппликацией ГАМК и одного из модуляторов, селективно подавлялись бикукуллином (20 мкМ).

Исследование действия зольпидема и лореклезола включало в себя изучение концентрационной зависимости эффектов этих веществ и последующего сравнения параметров концентрационной зависимости для КП и ГИС.

Действие зольгщдема на ГАМК активируемые токи для КП и ГИС исследовалось в диапазоне концентраций 10-10000 нМ. Как видно на Рис. 11, последовательное увеличение концентрации золыгадема при совместной аппликации с ГАМК ЕСго, вызывало монотонное увеличение амплитуды ответов.

Зависимость относительной амплитуды ответа от концентрации зольпидема -/ \ 1 Макс ([ Зольпидем])

А([Зольпидем]) =

х.100%, аппроксимировали уравнением (2) для каждого

1Контр

нейрона. Значения относительных амплитуд ответов, усредненные для двух групп клеток (КП и ГИС), полученные при разных концентрациях зольпидема, представлены на Рис, 11.

клетки Пуркинье ЕС5о=61±б пМ, 462±14%

* интернейроны Сгриатума ЕСм=223 ± 29 пМ, 265±21%

58 185 1000 [Зольпидем|, (нМ)

10000

Рис.11

Концентрационная зависимость действия зольпидема на ГАМК-вызванные токи в КП и ГИС.

На графике представлены зависимости относительной амплитуды ответа от концентрации зольпидема для КП (треугольники) и для

ГИС (квадраты). Наложенные сплошные линии - результат подгонки уравнением (2), а также значения параметров ЕС so и А(со), использованные для построения кривых.

Параметры уравнения (2), полученные усреднением соответствующих параметров-результатов подгонки для отдельных нейронов, имели следующие значения: ЕС*°Л' ^=6! ±6 нМ, коэффициент Хилла №±0.1, максимальный процент потенциации А(<х>)=462±14%, для КП (и=70) и ВС* '¡о~223±20 нМ, коэффициент Хилла h=lM,l, максимальный эффект А(°о)=265± 21, (п=б) для ГИС (Рис. 28 В). Отличия значений ВС* зо и А(°о) были приняты значимыми ф=0.0005 для ЕС*™' ¡о и р<0.0001 для A(co)).(aj), Процент потенциации, измеренный при максимальной использовавшейся концентрации зольпидема 10мкМ составил для КП.А(10мкМ)=45б±13 (n=12), а для ГИС А(10тМ)=257±1б (п=12), достоверность отличий составила (р<0.0001).

В исследованиях на рекомбинантных рецепторах было показано, что действие зольпидема зависит от природы а субъединиц, входящих в состав рецептора, при этом величины ВС* 50 ДЛЯ них ранжированы в следующем порядке ai(~10 нМ)<а2,аз(~100 HM)«as (WafFord et al. 1996; Smith et al. 2001). Полученные в данной работе значения ЕС*™'so для рецепторов КП близки к таковым

для рекомбинантных, ¡^-содержащих рецепторов, а Е(?т ¡о Для ГИС близки к таковым для а2, аз рецепторов.

Модулирующее действие лореклезола исследовалось в диапазоне концентраций 0.3-100 мкМ для КП и 0.3-30 мкМ для ГИС. В целом, совместная аппликация ГАМК ЕС2о и лореклезола приводила к потенциации ответов. В целом, эффекты лореклезола развивались в КП значительно медленнее, чем в ГИС. Поэтому, для регистрации длительность аппликации в опытах с КП была увеличена до 4 секунд. При совместной аппликации ГАМК ЕСМ и лореклезола, последовательное увеличение концентрации лореклезола приводило к изменению характера зависимости амплитуды ответа от времени с начла аппликации. С увеличением концентрации лореклезола (начиная с 3 мкМ - для обоих типов клеток), становились более выражены процессы десенситизации. Для обеих групп нейронов, относительная амплитуда ответов

1Макс([ Лореклезол]) ^ IКонтр )

«колоколообразно» (Рис. 12), достигая максимума при концентрациях 30 мкМ (в КП) и 10 мкМ (в ГИС). Дальнейшее увеличение концентрации лореклезола приводило к уменьшению относительной амплитуды ответа - «нисходящая фаза» зависимости доза-ответ, достигая своего минимума на нижних границах исследуемых концентрационных диапазонов А([1 ООмкМ])=239±21 % (п=7)- для КП и А([30мкМ])=107±6% (п=10)-щя ГИС (Рис. 12).

А{[ Лореклезол ])=

х100%, зависела от концентрации лореклезола

Рис.12

нейроны Пуркинье

ЕСяг=2^±0,2цМ

б09±52%

1000 10000 [Лореклезол], (нМ)

Концентрационная зависимость действия

лореклезола на ГАМК-вызванные токи в КП и ГИС.

На графике представлены зависимости относительной амплитуды ответа от концентрации золытдема для »-нейроны стриатума КП (треугольники) и для ГИС ЕСзо=М±0,2цМ (квадраты) в виде пунктирных 138±35% линий. Наложенные сплошные

линии - результат подгонки 100000 уравнением (2), а также

значения параметров ЕС ;о и А(°о), использованные для построения кривых.

В дальнейшем для оценки чувствительности различных типов нейронов к лореклезолу подгоняли восходящий участок зависимости доза-ответ уравнением (2). Результаты подгонки, полученные для отдельных нейронов, усредняли для каждой группы, при этом, параметры уравнения имели

следующие значения: ЕС?0"' so=2.2M,2 мкМ, коэффициент Хилла h=1.6±0.3, максимальный эффект А(х,)=608±52%, для КП (и=7) и Е(?°Р50=1.Ш.З мкМ, коэффициент Хилла h= 1.5 ±0.4, максимальный эффект А(<ю)=138±5%, для ГИС (л=/0). Отличия для А(ао) и ¡о были приняты

значимыми (р<0.0001 для А(<х>) и р=0.005 для ЕС so). Максимальный потенщшрующий эффект, измеренный специально для более многочисленных выборок, при концентрации лореклезола 30 мкМ для КП и 10 мкМ для ГИС составил 566±40% (п-16) и 136±4% (п-П) соответственно 0X0.0001).

Согласно исследованиям на рекомбинантных рецепторах, под действием лореклезола происходит потенциация ответов в рг, Рз - содержащих рецепторах и незначительная потенциация или слабое угнетение в ßi содержащих рецепторах (Waffbrd et al. 1994; Fisher et al. 1997; Neelands et al. 1999). Таким образом, высокий процент потенциации ответов на ГАМК в КП, видимо, связан с высоким уровнем экспрессии ß2, Рз рецепторов. В ГИС уровень экспрессии рг, Рз рецепторов, видимо, не значителен по сравнению с ßi рецепторами.

Действие LaCb на ГАМК активируемые токи исследовалось в диапазонах концентраций LaCb: 10-1000 мкМ для КП и 10-2000 мкМ для ГИС. Совместная аппликация LaCl3 и ГАМК вызывала потенциацию ответов. Результаты этих опытов представлены на Рис. 13 как зависимость

процента потенциации от концентрации LaCb: А{[1аС1з])=

lMaKc(fLaCl3])

IКонтр

х 100%.

883223.8 1000

Рис.13

Концентрационная зависимость действия ЬаС1з иа ГАМК-вызваниые токи в КП и ГИС.

На графике представлены зависимости относительной

амплитуды ответа от концентрации ЬаС1з для КП (треугольники) и для ГИС (квадраты). Наложенные сплошные линии результат подгонки уравнением (2), а также значения 10000 параметров ЕС5о и А(да), использованные для построения кривых.

Экспериментальная зависимость была аппроксимирована уравнением (2).

Результаты подгонки, усредненные для различных групп нейронов, имели следующие значения: для КП - ЕС1*иг 88±б. 7 мкМ, коэффициент Хилла А=1.4М. 1, максимальный процент

потенциации (по результатам подгонки) А(сс)=355±6.8%, (п=5), для ГИС - 5д= 233.8±30мкМ, коэффициент Хилла h=1.1+0.1, максимальный процент потенциации (по результатам подгонки) А(о$=263±7%, (п=7) совместной аппликацией составил: в КП А(1000мкМ)=343±24% (п=5), а в ГИС А(1000мкМ)=24б+21% (п=7). Различия величин EC^so и А(ЮООмкМ) были приняты значимыми (р=0.02 и р~0.005 соответственно).

Действие LaCb на рекомбинантные рецепторы изучено гораздо в меньшей степени, чем зольпидема, лореклезола или фуросемида. Однако известно, что под действием LaCl3 происходит угнетение ответов в оц-аб рецепторах и потенциация в оц (Fisher et al. 1997; Neelands et al. 1999; Saxena et al. 199/). Таким образом, полученные данные позволяют утверждать лишь, что в КП и ГИС уровень экспрессии сц-Об рецепторов достаточно низок, чтобы не влиять на характер ответа в целом.

Следует отметить, что при увеличении концентрации ГАМК величина потенцирующего эффекта LaCb ослаблялась в обоих типах клеток. Так. в КП, при совместной аппликации 2 мкМ ГАМК и 100 мкМ La3+ процент потенциации составлял 220225%, при концентрации ГАМК 5 мкМ 125±5%, а при концентрации ГАМК 100 мкМ 101±1.2% (п-9). Аналогичная зависимость наблюдалась и для ГИС, при концентрации ГАМК 15 мкМ -146±5.6%, 50 мкМ -119+3.3%, 1000 мкМ - 102+1.6% (гг=8). При этом в обоих типах клеток под действием лантана не происходило изменения амплитуды ответа, вызываемог о насыщающими концентрациями ГАМК (100 мкМ для КП и 1000 мкМ для ГИС), т.е. процент потенциации этих ответов для обоих типов нейронов не значимо отличался от 100% (р=0.46 для КП и р=0.87 для ГИС).

Для сравнения степени потенциации LaCb токов, вызываемых ГАМК, при различной поляризации клеточной мембраны, вычисляли процент потенциации

' jrAMK( ЕС20 )+l"(V)

P(V) =

х 100%, при различных значениях удерживаемого потенциала (от -

1ГАШ(ЕС2о)(у) 70 мВ до 70мВ).

Различия в степени потенциации лантаном ГАМК вызванных токов, обусловленные изменением мембранного потенциала были признаны незначимыми: р-0.38 п-5 для клеток Пуркинье ир~0.99 п=5 для интернейронов стриатума.

Сопоставление функциональных свойств рецепторов с данными о распределении субъединиц. При обсуждении изученных нами функциональных свойств нативных ГАМКд рецепторов и сопоставлении их с известными из литературы свойствами рекомбинантных рецепторов был сделан предварительный вывод о субъединичном составе ГАМКА рецепторов в КП и ГИС. Такое соотнесение не предполагает тождественности функциональных свойств нативных и рекомбинантных рецепторов и поэтому множество выделяемых структурных

вариантов a priori шире реально существующего. Для ограничения множества предполагаемых структур, а также для придания большей обоснованности выводам мы сопоставили свои результаты с результатами других авторов, использующих принципиально отличные методики (гибридизация олигонуклеотидов in situ, мечение окрашенными антителами и т.п.). Данные о распределении субъединиц ГАМКд рецепторов позволяют предположить наличие ai, аз, аУргрэ/Тг рецепторов для КП и ai-as/Pi-Jbfyi-Ts для ГИС (Sequier et al. 1988; Laurie et al. 1992; Duncan et al. 1995; Mohler et al. 1995; McClellan et al. 1999;Yan et al. 1997; Marksitzer et al. 1993; Rodriguez-Pallares et al. 2000; Fritschy et al. 1992). Сопоставляя данные различных авторов с результатами представленной работы, можно заключить, что наиболее вероятным для ГАМКд рецепторов КП является субъединичный состав аьРм,Т2, а для ГИС aw,Pi,Yi-3-

ВЫВОДЫ

1. Функциональные свойства ГАМКд рецепторов в двух типах центральных нейронов - клетках Пуркинье мозжечка и гигантских холинергических интернейронах стриатума отличаются по ряду параметров. Число ГАМКд рецепторов на обоих типах клеток отличается незначительно, однако ГАМКд рецепторы клеток Пуркинье более чувствительны к действию ГАМК, чем рецепторы интернейронов стриатума. Временные характеристики ответов, вызываемых аппликацией ГАМК, свидетельствуют о равенстве скоростей процессов активации для клеток Пуркинье и ГНС и о более медленном течении процессов деактивации в ГИС.

2. ГАМКд рецепторы клеток Пуркинье более чувствительны к действию золызддема, чем рецепторы ГИС. Порядок величин ЕС so позволяет сделать вывод о преимущественной экспрессии

02. aj-содержащих ГАМКд рецепторов на поверхности ГИС и ai-содержащих рецепторов на поверхности клеток Пуркинье.

3. Зависимость потенциирующего эффекта лореклезола от концентрации имеет колоколообразный характер. Максимальный потенциирующий эффект для токов в клетках Пуркинье более чем в 6

аолк ктшта ттпяя irno nuxWAfi ti I "IЖС^ fvtvt ттАЧПЛПЛаЧ* ТТ»ЧАТТТТЛТТЛЧПТП ТТТЧЧ DO ТТПВ0ПУПП1>Т11 I '1Л| jJOJ I'f'-j iwm IVAV/O *» t ±X.\J «tV'JiiWUIVl tij^w^iiwwiWMUi ilu 1Ш a

преимущественно экспрессируются pi-содержащие ГАМКд рецепторы, в то время как на поверхности клетках Пуркинье - (Vfti рецепторы.

4. В обоих типах клеток ЬаС1з вызывает потенциацию ответов на ГАМК, однако, ГАМКд рецепторы клетках Пуркинье были более чувствительны к действию ЬаС1з, чем рецепторы ГИС. Характер модулирующего действия LaClj свидетельствует о том, что экспрессия рецепторов, содержащих Об, as и сц субъединицы, на обоих типах нейронов маловероятна.

5. ГАМКд рецепторы в клетках Пуркинье и ГИС в целом имеют низкую чувствительность к фуросемиду. Доля фуросемид-чувствительных, содержащих а«, 04 субъединицы, рецепторов, расположенных на поверхности клетках Пуркинье и ГИС, оцененная сверху, не превышает 10%.

6. Фуросемид вызывает угнетение ответов на ГАМК, что является результатом его взаимодействия с канальной порой ГАМКд рецепторов. Механизм угнетения токов существенно

отличается от такового в клетках, экспрессирующих оц и Об субъединицы. Блокирующее действие фуросемида увеличивается при деполяризации мембраны. Различия параметров потенциалзависимости, трактуемые в рамках модели Woodhull, позволяют утверждать, что место связывания фуросемида в канальной поре ГАМКа рецепторов ГИС более удалено от мембранной поверхности и имеет большее сродство к фуросемиду, чем в ГАМКа рецепторах клеток Пуркинье.

7. Использованная математическая модель последовательного блока для анализа блокирующего действия фуросемида в клетках Пуркинье, на качественном уровне описывает все явления, наблюдаемые при совместной аппликации ГАМК и фуросемида.

8. Сопоставление эффектов аллостерических модуляторов, селективных к структуре ГАМКд рецепторов, с литературными данными по распределению различных субъединиц ГАМКд рецепторов позволило сделать вывод о наиболее вероятной субъединичной комбинации ГАМКд рецепторов в исследованных типах нейронов: 011P2/3Y2 для клеток Пуркинье и am, Рь Yi-з и для ГИС.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Колбаев С.Н., Шаронова И.Н., Воробьев B.C., Скребицкий В.Г. Механизмы модуляции такрином ГАМК-активируемых токов в изолированных нейронах мозжечка. Бюлл. эксп. биол. и мед., 1999, Том 127, N 5, стр. 539-542.

2 Колбаев С.Н., Шаронова И.Н., Воробьев B.C., Скребицкий В.Г. Модуляция лантаном ГАМК-активируемых токов в изолированных нейронах мозжечка крысы. В сб.: "Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга", Москва, 1999, стр. 45.

3 Колбаев С.Н., Шаронова И.Н. Механизмы взаимодействия фуросемида с ГАМК-А рецепторами. Тезисы конференции «Физиология нейротрансмиттеров», посвященной 100-летию со дня рождения Х.С. Коштоянца. Москва, 2000, стр. 42.

4 Skrebitsky V.G., Kolbaev S.N., Sharonova I.N., Vorobjev V.S. Lanthanum modulation of GABAa receptor-mediated currents in acutely isolated cerebellar Purkinje cells of the rat. Europ. J. Neurosci., 2000, Vol. 12, Suppl. 11, p. 41.

5 Skrebitsky V.G., Kolbaev S.N., Kozhemiakin М.В., Sharonova I.N. Lanthanum- induced modulation of GABA-gated currents in rat brain isolated neurons and slice preparation. Abstract Sociiety for Neuroscience, 30lh Annual Meeting, New Orlean, 2000, Part 2, P.1335.

6 Колбаев C.H., Шаронова И.Н., Скребицкий В.Г. Функциональные различия подтипов ГАМК-А рецепторов в нейронах мозжечка и стриатума. XVIII Съезд Физиологического общества имени И.П.Павлова. Тезисы докладов, Казань, 2001, стр. 121-122.

7 Колбаев С.Н., Модуляция лантаном ГАМК-активируемых токов в изолированных нейронах мозжечка крысы. Бюлл. эксп. биол. и мед., 2002, Том 133, N 1, стр. 55-59.

8 Kolbaev S.N., Sharonova I.N., Vorobjev V.S., Skrebitsky V.G. Mechanisms of GABAa receptor blockade by millimolar concentrations of furosemide in isolated rat Purkinje cells. Neuropharmacology, 2002, Vol 42(7), pp 913-921.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ЦД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 10.09.2003 Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,44

Печать авторефератов 730-47-74

2ооз -A P 14 056

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Колбаев, Сергей Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Классификация рецепторов ГАМК в ЦНС млекопитающих.

1.2. Структурная гетерогенность ГАМКд рецепторов в ЦНС млекопитающих. „

1.2.1. Репертуар субъединиц, входящих в состав ГАМКд рецепторов.

1.2.2. Количество субъединиц, входящих в состав одного ГАМКд рецептора.

1.2.3. Субъединичная композиция нативных рецепторов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное исследование функциональных свойств рецепторов гамма-аминомасляной кислоты (А типа) в различных типах нейронов центральной нервной системы"

Актуальность проблемы.

Изучение функциональной роли гетерогенности ГАМКд рецепторов имеет довольно длительную историю. Исследования в этой области стимулированы во многом благодаря тому, что ГАМК является основным тормозным нейромедиатором в ЦНС млекопитающих. Главной мишенью для ГАМК на постсинаптической мембране являются ГАМКд рецепторы, которые являются также местом воздействия широкого ряда нейротропных препаратов. Центральное место в передаче торможения обуславливает ведущую роль ГАМКд рецепторов в регуляции активности нейронов и определяет актуальность исследования функциональных особенностей ГАМКд рецепторов в разных типах нейронов.

Отличительной особенностью ГАМКд рецепторов является высокая степень их структурной гетерогенности. Такая гетерогенность не характерна для глициновых и ацетилхолиновых рецепторов, структурно близких к ГАМКд рецепторам и часто объединяемых в одно суперсемейство наряду ГАМКс рецепторами (Barnard et al. 1998). Различные структурные варианты ГАМКд рецепторов распределены определенным образом в ЦНС. Это обстоятельство вызывает интерес к исследованию структурно-функциональных связей, а также роли функциональной гетерогенности этого типа рецепторов (Doble et al. 1992; Mohler et al. 1995; Nutt et al. 2001; Pirker et al. 2000). Кроме этого, существует еще целый ряд причин, по которым изучение функциональной роли гетерогенности ГАМКд рецепторов является крайне актуальной задачей.

Во-первых, воздействие на ГАМКд рецепторы с помощью некоторых препаратов вызывает на уровне целого организма широкий спектр поведенческих эффектов. Согласно современным представлениям, широкий спектр действия фармакологических препаратов, воздействующих на ГАМКд рецепторы, связан, прежде всего, с функциональной гетерогенностью этих рецепторов, субстратом для которой является их структурная гетерогенн ость.

Во-вторых, развитие некоторых неврологических и психических заболеваний и расстройств, по-видимому, объясняется изменениями в количественном и качественном составе ГАМКд рецепторов на различных типах нейронов (Nutt et al. 2001).

Таким образом, изучение функциональной роли гетерогенности ГАМКд рецепторов является основой для понимания процессов регуляции возбудимости и эмоционального статуса ЦНС в норме и патологии.

Использование современных методов работы с генетическим материалом, применение различных модельных систем позволило достичь определенных успехов в этом направлении. Так, недавние исследования подтверждают предположение о том, что процессы сборки функциональных рецепторов, по-видимому, подчиняются определенным закономерностям (Klausberger et al. 2001b; Klausberger et al. 2001a; Sarto et al. 2002). Сочетание субъединиц в функциональном ГАМКд рецепторе не является произвольным, а детерминировано структурными особенностями каждой субъединицы (Klausberger et al. 2001а; Sarto et al. 2002), при этом каждой субъединице в составе рецептора, по-видимому, отведена своя роль (взаимодействие с агонистом, субклеточная локализация и взаимодействие с «заякоривающими» белками и т.п.) (Chebib et al. 2000). Таким образом, первоначальные оценки структурной гетерогенности ГАМКд рецепторов, сделанные на основе предположения о случайном характере сочетания субъединиц, были явно завышены (Barnard et al. 1998).

Изучение принципов структурной организации ГАМКд рецепторов очень важно для понимания роли гетерогенности этих рецепторов, однако, результаты этих исследований не дают ответа на вопрос, насколько различаются функциональные свойства исследуемых рецепторов. Определенную информацию о свойствах рецепторов можно получить, используя рекомбинантные рецепторы, экспрессированные в гетеро логичных системах. Однако на сегодняшний день отсутствуют методики определения субъединичной композиции ГАМКд рецепторов, экспрессирующихся на определенном типе нейронов, что делает невозможным корректное сопоставление структур рекомбинантных и нативных рецепторов. Кроме того, свойства рекомбинантных рецепторов зависят от использованной системы экспрессии и, по-видимому, отличаются от свойств нативных ГАМКд рецепторов (Hevers et al. 1998).

С другой стороны, при исследовании свойств рекомбинантных рецепторов был выделен целый класс веществ, характер действия которых определяется структурой ГАМКд рецепторов (Barnard et al. 1998; Sieghart 1995). Предполагается (с различной степенью обоснованности), что свое воздействие эти селективные модуляторы оказывают, связываясь с неперекрывающимися местами узнавания, расположенными на ГАМКд рецепторах. Таким образом, действие того или иного селективного модулятора определяется различным набором структурных детерминант рецептора (Mehta et al. 1999).

Использование набора таких веществ при исследовании функциональных свойств рецепторов позволяет наиболее полным и независимым образом оценить их функциональную и, как следствие, структурную гетерогенность. Изучение воздействия того или иного вещества на определенный тип клеток позволяет связать результаты исследований на отдельных нейронах с результатами поведенческих экспериментов (in vivo) и исследований на срезах ткани.

Помимо обозначенной выше теоретической значимости, результаты таких исследований имеют и прикладное значение. Так как некоторые из применяемых селективных модуляторов являются лекарственными препаратами, то данные эксперименты позволяют глубже понять механизмы действия этих веществ (Nutt et al. 2001).

Таким образом, использование набора веществ, способных проявлять селективность к субъединичному составу, позволяет связать функциональные свойства (или, как говорят «фармакологический профиль» данного типа рецепторов) со структурой исследуемых рецепторов. При таком подходе охватывается сразу несколько несовпадающих структурных элементов - мест связывания рецептора, следовательно, полученное описание дает наиболее полное описание функциональных свойств рецепторов. Поэтому в данной работе в рамках проведения сравнительного исследования функциональных свойств нативных ГАМКд рецепторов был использован набор модуляторов селективных к их субъединичному составу. Цель работы.

Целью данной работы являлось сравнительное исследование функциональных свойств ГАМКд рецепторов, эксперессируемых на поверхности различных типов центральных нейронов - клеток Пуркинье мозжечка и гигантских холинергических интернейронов из головки хвостатого ядра мозга крысы. Задачи.

Были поставлены следующие задачи:

1) Используя метод фиксации потенциала на изолированной клетке и систему быстрой аппликации веществ, исследовать биофизические свойства токов, вызываемых ГАМК в клетках Пуркинье мозжечка и гигантских интернейронах стриатума, выделенных из срезов мозга крысы. Дать количественную оценку свойств ответов, вызываемых ГАМК в исследованных типах нейронов.

2) Провести сравнительное исследование в разных типах нейронов модуляции ГАМК-активируемых токов веществами, которые избирательно взаимодействуют с ГАМКд рецепторами, имеющими различный субъединичный состав (фуросемид, зольпидем, хлорид лантана, лореклезол). Выявить особенности модуляции ответов на ГАМК этими препаратами и дать количественную оценку их эффектов для исследуемых типов клеток.

3) Проанализировать полученные результаты о различии свойств нативных рецепторов в свете литературных данных по фармакологии рекомбинантных рецепторов. Сопоставить полученные результаты с литературными данными о распределении различных подтипов субъединиц ГАМКд рецепторов в мозге крысы с целью выявления наиболее вероятной субъединичной композиции этих рецепторов в исследованных нейронах. Научная новизна полученных результатов.

Методом локальной фиксации потенциала впервые проведено систематическое исследование функциональных свойств ГАМКд рецепторов в двух типах центральных нейронов - клетках Пуркинье (КП) мозжечка и гигантских ацетилхолинергических интернейронах стриатума (ГИС). Сравнительная оценка абсолютных амплитуд ответов на ГАМК в КП и ГИС позволяет утверждать, что количество рецепторов на обоих типах нейронов примерно одинаково.

Впервые проанализирован механизм действия фуросемида на ГАМКд рецепторы КП и ГИС и установлено, что он отличен от такового, описанного в литературе для фуросемид-чувствительных, аб-, оц-содержащих рецепторов. Впервые показано, что фуросемид блокирует токи, вызываемые ГАМК, взаимодействуя с порой канала этого типа рецепторов, и что угнетение токов происходит по механизму последовательного блока. Впервые изучена зависимость блокирующего действия фуросемида от мембранного потенциала. В рамках модели Woodhull различия, полученные для КП и ГИС, были связаны с различиями в строении канала ГАМКд рецепторов в обоих типах клеток. Предложена математическая модель, описывающая действие фуросемида на ГАМКд рецепторы КП.

Впервые исследовано модулирующее действие LaCb в КП и в ГИС. Совместная аппликация ГАМК и лантана приводила к потенциации ответа. Показано, что ГАМКд рецепторы КП более чувствительны к действию ЬаСЬ, чем рецепторы ГИС (ЕС^о для КП меньше чем для ГИС, а максимальный эффект больше).

Впервые исследовано модулирующее действие лореклезола на токи, вызываемые ГАМК в КП и ГИС. Показано, что в обоих типах клеток лореклезол потенциирует ответы, вызываемые ГАМК ЕС20, при этом, максимальный потенциирующий эффект лореклезола для КП значительно выше, чем для ГИС. Научно-практическая значимость.

Полученные результаты позволяют сравнить роль ГАМКергических входов в регулировании активности клеток Пуркинье мозжечка и гигантских холинергических нейронов стриатума крысы. Использование набора селективных модуляторов при исследовании функциональных свойств ГАМКд рецепторов позволило провести систематическое исследование их функциональной гетерогенности. Подобный подход может быть распространен и на другие типы нейронов. Изложенные результаты важны для понимания и оценки роли гетерогенности ГАМКд рецепторов в ЦНС и будут полезны при интерпретации экспериментов, проводимых на срезах или на уровне целого организма. Кроме того, потенциально интересным направлением для изучения строения ГАМКд рецепторов является исследование действия канальных блокаторов - структурных гомологов фуросемида. Подобный подход с использованием соответствующих блокаторов позволит ответить на ряд принципиальных вопросов, касающихся механизмов работы каналов этих рецепторов. Предлагаемая модель действия фуросемида является удобным инструментом для проверки и выдвижения новых гипотез, в том числе и о механизмах работы ГАМКд рецептора как такового.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Колбаев, Сергей Николаевич

выводы.

1. Функциональные свойства ГАМКд рецепторов в двух типах центральных нейронов -клетках Пуркинье мозжечка и гигантских холинергических интернейронах стриатума отличаются по ряду параметров. Число ГАМКд рецепторов на обоих типах клеток отличается незначительно, однако ГАМКд рецепторы клеток Пуркинье более чувствительны к действию ГАМК, чем рецепторы интернейронов стриатума. Временные характеристики ответов, вызываемых аппликацией ГАМК, свидетельствуют о равенстве скоростей процессов активации для клеток Пуркинье и ГИС и о более медленном течении процессов деактивации в ГИС.

2. ГАМКд рецепторы клеток Пуркинье более чувствительны к действию зольпидема, чем рецепторы ГИС. Порядок величин ЕС50 позволяет сделать вывод о преимущественной экспрессии (Х2, аз-содержащих ГАМКд рецепторов на поверхности ГИС и оц-содержащих рецепторов на поверхности клеток Пуркинье.

3. Зависимость потенциирующего эффекта лореклезола от концентрации имеет колоколообразный характер. Максимальный потенциирующий эффект для токов в клетках Пуркинье более чем в 6 раз выше, чем для токов в ГИС, что позволяет предположить, что на поверхности ГИС преимущественно экспрессируются pi-содержащие ГАМКд рецепторы, в то время как на поверхности клетках Пуркинье - рг/рз рецепторы.

4. В обоих типах клеток LaCl3 вызывает потенциацию ответов на ГАМК, однако, ГАМКд рецепторы клетках Пуркинье были более чувствительны к действию LaCl3, чем рецепторы ГИС. Характер модулирующего действия LaCl3 свидетельствует о том, что экспрессия рецепторов, содержащих ав, as и а4 субъединицы, на обоих типах нейронов маловероятна.

5. ГАМКд рецепторы в клетках Пуркинье и ГИС в целом имеют низкую чувствительность к фуросемиду. Доля фуросемид-чувствительных, содержащих аб, ад субъединицы, рецепторов, расположенных на поверхности клетках Пуркинье и ГИС, оцененная сверху, не превышает 10%.

6. Фуросемид вызывает угнетение ответов на ГАМК, что является результатом его взаимодействия с канальной порой ГАМКд рецепторов. Механизм угнетения токов существенно отличается от такового в клетках, экспрессирующих сц и аб субъединицы. Блокирующее действие фуросемида увеличивается при деполяризации мембраны. Различия параметров потенциалзависимости, трактуемые в рамках модели Woodhull, позволяют утверждать, что место связывания фуросемида в канальной поре ГАМКд рецепторов ГИС более удалено от мембранной поверхности и имеет большее сродство к фуросемиду, чем в ГАМКд рецепторах клеток Пуркинье.

7. Использованная математическая модель последовательного блока для анализа блокирующего действия фуросемида в клетках Пуркинье, на качественном уровне описывает все явления, наблюдаемые при совместной аппликации ГАМК и фуросемида.

8. Сопоставление эффектов аллостерических модуляторов, селективных к структуре ГАМКд рецепторов, с литературными данными по распределению различных субъединиц ГАМКд рецепторов позволило сделать вывод о наиболее вероятной субъединичной комбинации ГАМКд рецепторов в исследованных типах нейронов: aiJ32/372 для клеток Пуркинье и (Х2/3, Рь Yi-з и для ГИС.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Колбаев, Сергей Николаевич, Москва

1. Валеев, А. Е., Врублевский, С. В., Черневская, Н. И. (1986). ТАМК АКТИВИРУЕМАЯ ПРОВОДИМОСТЬ НЕЙРОНОВ МОЗЖЕЧКА МЛЕКОПИТАЮЩИХ." Нейрофизиология. 18(6), 836-839.

2. Колбаев С.Н., Шаронова И.Н., Воробьев B.C., Скребицкий В.Г. (1999). "Механизмы модуляции такрином ГАМК-активируемых токов в изолированных нейронах мозжечка." Бюлл. эксп. биол. и мед. 127(5), 539-542.

3. Шульговский, В. В. (1997). "Физиология центральной нервной системы"., М.: МГУ, 397с.

4. Angelotti, Т. P. and MacDonald, R. L. (1993). "Assembly of GABAA receptor subunits: alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S subunits produce unique ion channels with dissimilar single-channel properties." J.Neurosci. 13(4), 1429-1440.

5. Antonov, S. M., Gmiro, V. E., and Johnson, J. W. (1998). "Binding sites for permeant ions in the channel of NMD A receptors and their effects on channel block." Nat.Neurosci. 1(6), 451-461.

6. Anwyl, R. (1991). "Modulation of vertebrate neuronal calcium channels by transmitters." Brain Res.Brain Res.Rev. 16(3), 265-281.

7. Arbilla, S., Allen, J., Wick, A., and Langer, S. Z. (1986). "High affinity 3H.zolpidem binding in the rat brain: an imidazopyridine with agonist properties at central benzodiazepine receptors." Eur.JPharmacol. 130(3), 257-263.

8. Armstrong, С. M. and Gilly, W. F. (1992). "Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping." Methods Enzymol. 207, 100-122.

9. Bahring, R., Bowie, D., Benveniste, M., and Mayer, M. L. (1997). "Permeation and block of rat GluR6 glutamate receptor channels by internal and external polyamines." J.Physiol. 502 (Pt 3), 575-589.

10. Banks, M. I., Li, Т. В., and Pearce, R. A. (1998). "The synaptic basis of GABAA,slow." J.Neurosci. 18(4), 1305-1317.

11. Banks, M. I., White, J. A., and Pearce, R. A. (2000). "Interactions between distinct GABA(A) circuits in hippocampus." Neuron. 25(2), 449-457.15.