Электрофизиологическое исследование механизмов действия эндогенных и экзогенных модуляторов ионотропных рецепторов в нейронах головного мозга

Шаронова, Ирина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Электрофизиологическое исследование механизмов действия эндогенных и экзогенных модуляторов ионотропных рецепторов в нейронах головного мозга
ВАК РФ 03.03.06, Нейробиология

Автореферат диссертации по теме "Электрофизиологическое исследование механизмов действия эндогенных и экзогенных модуляторов ионотропных рецепторов в нейронах головного мозга"

На правах рукописи

ШАРОНОВА Ирина Николаевна

ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ

ДЕЙСТВИЯ ЭНДОГЕННЫХ И ЭКЗОГЕННЫХ МОДУЛЯТОРОВ ИОНОТРОПНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В НЕЙРОНАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА

03.03.06 — нейробиология

2 5 МАР 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2015

005561232

Работа выполнена в Отделе исследований мозга Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр неврологии» (г. Москва)

Научный консультант:

Скребицкий Владимир Георгиевич, член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор (ФГБНУ НЦН)

Официальные оппоненты:

Антонов Сергей Михайлович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией сравнительной физиологии мозжечка Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук

Базян Ара Саакович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией нейрохимических механизмов обучения и памяти Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук

Островская Рита Ушеровна, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, главный научный сотрудник лаборатории психофармакологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова»

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук

Защита диссертации состоится 20 апреля 2015 года в 15:30 на заседании диссертационного ученого совета Д 501.001.93 при Биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет МГУ им. М.ВЛомоносова, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: Москва, Ломоносовский проспект, 27 и на сайте http://www.bio. тт. ги/.

Автореферат разослан 10 марта 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Химическая передача в синапсах признана в настоящее время главным механизмом связи между нейронами, обеспечивающим обработку информации в мозге (Eccles, 1964; Katz, 1966). В нервной системе млекопитающих быстрая синаптическая передача между нейронами осуществляется с помощью медиаторов (нейротрансмиттеров), действующих на лиганд-управляемые ионные каналы (ligand-gated ion channels - LGICs) разного типа. Лиганд-управляемые каналы представляют собой встроенные в липидный мембранный бислой высокоспециализированные протеиновые комплексы, в которых рецептор, связывающий активирующую молекулу (лиганд), и ионный канал являются частью одного и того же протеинового комплекса, в связи с чем LGICs называют также ионотропными рецепторами.

Основная функция лиганд-управляемых каналов состоит в передаче сигнала от нейрона к нейрону и/или к эффекторным клеткам. Исследование механизмов межклеточной передачи электрических сигналов в нервной системе и выявление свойств постсинаптических рецепторов, участвующих в этом процессе, является центральной проблемой современной нейробиологии. Постсинаптические ионотропные рецепторы являются также мишенью действия многих физиологически активных веществ и фармакологических препаратов, используемых при лечении разных форм церебральной патологии (Аничков, 1982; Скребицкий, 1985, Раевский и Георгиев, 1986; Сергеев и др., 1999; Островская и др., 2002, 2005; Воронина, 2005; Скребицкий и др., 2008; Харкевич, 2008; Narahashi, 2000; Korpi et al., 2002, Ostrovskaya et al., 2007; Lemoine et al., 2012). Эти препараты способны модифицировать состояние канал-рецепторного комплекса посредством разных механизмов, понимание которых необходимо для более рационального их использования при коррекции разных форм церебральной патологии и создания новых соединений с заданными свойствами. В этой связи изучение свойств ионотропных рецепторов нейрональной мембраны и механизмов их модуляции эндогенными и экзогенными лигандами является актуальной проблемой современной нейробиологии и клинической фармакологии.

Заметный прогресс в изучении свойств LGICs был достигнут благодаря идентификации генов, кодирующих эти мембранные белки. Эти исследования показали, что некоторые LGICs, несмотря на различия в их функции, имеют сходные аминокислотные последовательности. В соответствии с этим критерием, все LGICs были разделены на три основных суперсемейства: (1) Cys-петельные рецепторы, (2) ионотропные глутаматные рецепторы и (3) АТР-

управляемые пуринорецепторы (Р2Х каналы) (Le Nov£r and Changeux, 2001; Collingridge et al., 2009).

Наиболее изученными в настоящее время являются рецепторы Cys-петельного семейства, к которому принадлежат никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, 5-НТ3 рецепторы, ГАМКа и глициновые рецепторы (Cascio, 2004). Семейство глутаматных рецепторов включает в себя рецепторы, избирательными агонистами которых являются а-амино-З-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовая кислота (AMPА), каинат и N-Memri-D-аспартат (NMDA) (Mayer, 2006; Greger et al., 2007).

Являясь основным возбуждающим медиатором, глутамат участвует практически во всех функциях ЦНС, включая развитие нервной системы, обучение и память, пластические и компенсаторные перестройки (Dingledine et al., 1999; Lemoine et al., 2012). Кроме того, патогенез различных групп неврологических заболеваний связан с избыточной активацией рецепторов возбуждающих аминокислот (Parsons et al., 2005). В связи с этим вопросы, касающиеся регуляции глутаматных рецепторов различными эндогенными и экзогенными факторами, представляют интерес как для теоретической нейронауки, так и практической фармакологии.

Основным тормозным передатчиком в ЦНС является гамма-аминомасляная кислота (ГАМК). Быстрая тормозная передача осуществляется с участием ионотропных ГАМКа рецепторов, сопряженных с хлорным каналом. Интерес к структуре и функции ГАМКд рецепторов определяется тем, что они играют ведущую роль в регуляции возбудимости мозга и синхронизации нейронной активности, а также являются мишенями действия многих фармакологических препаратов, включая такие клинически важные соединения, как бензодиазепины, барбитураты, нейростероидные гормоны, этанол, антиконвульсанты и общие анестетики (Sieghardt, 2006, 2013), что определяет практическое значение исследования свойств этих рецепторов.

Наряду с рецепторами для основных медиаторов возбуждающей и тормозной нейропередачи - глутамата и ГАМК, в мозге довольно широко представлены также рецепторы для АТФ, медиаторные функции которого были выявлены относительно недавно (Burnstock, 1972). Ионотропные рецепторы для АТФ получили название пуринорецепторов второго типа или Р2Х рецепторов. Однако основные данные о Р2Х рецепторах были получены при исследовании периферической нервной системы и на системах экспрессии, их роль в деятельности ЦНС изучена довольно слабо. Вместе с тем, накапливается все больше данных о том, что АТФ может выступать в качестве медиатора или ко-медиатора синаптической передачи (North, 2002), участвовать в развитии нервной системы и в пластических перестройках в ЦНС (Fujii, 2004; Lee et al.,

2012), а также вызывать цитотоксические эффекты, что делает Р2Х рецепторы мишенью для терапевтических воздействий при различных заболеваниях (Franke and liles, 2006, Koles et al., 2007; del Puerto et al., 2013).

Большинство лиганд-управляемых каналов, помимо сайта для связывания нейротрансмитгера, имеют и другие сайты, при взаимодействии с которыми соответствующие вещества могут менять активность канал-рецепторного комплекса. Ионотропные рецепторы модулируются большим числом различных молекул, включая эндогенные вещества, имеющие физиологическое значение и/или играющие роль в патологических процессах, а также экзогенными фармакологическими препаратами. Модуляция активности ионотропных рецепторов может осуществляться с помощью нескольких принципиально различных механизмов, выявление которых имеет значение как для практической нейрофармакологии, так и для понимания общих закономерностей функционирования разных типов ионотропных рецепторов и принципов модуляции их активности.

Среди экспериментальных подходов, применяемых для исследования свойств нейрональных рецепторов и выявления молекулярных механизмов действия фармакологических препаратов, одно из ведущих мест занимает электрофизиологический метод, основанный на регистрации токов в условиях фиксации напряжения - patch-clamp метод, который позволяет регистрировать токи, связанные с активацией определенного типа рецепторов или ионных каналов (Hamill et al., 1981; Sakmann and Neher, 1984; Verkhratsky and Parpura, 2014).

Цель исследования. Используя метод регистрации токов от изолированных нейронов, исследовать биофизические и фармакологические характеристики ионотропных рецепторов глутамата, ГАМК и АТФ в нейронах ЦНС и выявить механизмы взаимодействия с ними ряда эндогенных и экзогенных модуляторов.

Основные задачи исследования

1. Исследовать модуляцию глутаматных рецепторов NMDA типа эндогенными модуляторами (гистамин, спермин) и канальными блокаторами. Выявить влияние некоторых нейропротекторов (такрин, амиридин, этилизопропил амилорид) на активность NMDA рецепторов.

2. Исследовать биофизические и фармакологические свойства глутаматных рецепторов АМРА типа в нейронах разных отделов мозга и выявить особенности эффектов канальных блокаторов и аллостерических модуляторов в этих нейронах.

3. Выявить механизмы и особенности взаимодействия с ГАМКа рецепторами препаратов, обладающих каналоблокирующими свойствами (пенициллин, фуросемид, нифлумат).

4. Исследовать модуляцию ГАМКа рецепторов ионами меди и цинка.

5. Выявить основные характеристики взаимодействия нестероидных противовоспалительных препаратов из группы фенаматов с ГАМКд рецепторами.

6. Описать свойства нативных ионотропных пуринорецепторов (Р2Х) и исследовать их фармакологические характеристики.

Научная новизна работы. В проведенном исследовании выявлены новые модуляторы нативных ионотропных рецепторов в нейронах головного мозга, исследованы особенности этих рецепторов в разных типах нейронов и раскрыты механизмы их модуляции физиологическими активными веществами. В частности, впервые обнаружено, что глутаматные рецепторы ИМБА типа обладают местом связывания для эндогенного биогенного амина гистамина, вызывающего аллостерическую потенциацию активности этого рецептора. Показано, что нейропротектор такрин блокирует ЫМЭА каналы по механизму 'ТооИп-Ше-скюг". Описаны особенности биофизических и фармакологических свойств глутаматных рецепторов АМРА типа в нейронах мозжечка и стриатума.

Впервые показано, что пенициллин, фуросемид и нифлумат блокирует каналы ГАМКд рецепторов по механизму 'ТооЫп-Ле-йоог". Получены экспериментальные подтверждения теоретического предположения о том, что открытая конформация канала препятствует диссоциации агониста.

Впервые выявлено высокоаффинное место связывания для ионов меди на ГАМКд канал-рецепторном комплексе, которое может обеспечивать новый тип модуляции активности ионотропных рецепторов - тоническое торможение следовыми количествами ионов металлов. Описаны механизмы взаимодействия нестероидных противовоспалительных средств с ГАМКд рецепторами.

Впервые описаны фармакологические и биофизические свойства токов, активируемых АТФ в нейронах туберомамиллярного ядра, позволившие идентифицировать субъединичный состав опосредующих их Р2Х рецепторов.

Научно-теоретическое и практическое значение работы. Результаты исследования могут найти применение в теоретической и экспериментальной физиологии и фармакологии. Данные, полученные в диссертационном исследовании, вносят существенный вклад в понимание свойств постсинаптических рецепторов, участвующих в возбуждающей и тормозной

синаптической передаче, и механизмов их модуляции рядом физиологически активных веществ.

Полученные в работе данные о наличии физиологически и фармакологически различных изоформ АМРА рецепторов в разных типах нейронов головного мозга способствуют пониманию функционального значения различий в молекулярном составе нативных ионотропных рецепторов и открывают возможность для избирательного воздействия на определенные типы нейронов.

Данные о взаимодействии канальных блокаторов с ионной порой глутаматных и ГАМКа рецепторов имеют значение для понимания механизмов сопряжения связывания агониста с конформационными перестройками канал-рецепторного комплекса, приводящими к открыванию канала, и для выявления строения канальной поры.

Практическая значимость работы определяется тем, что многие модуляторы, механизмы действия которых были исследованы в настоящей работе, являются фармакологическими препаратами, используемыми в клинической практике. Полученные в ходе исследования данные расширят представления о механизмах действия анксиолитиков и нейропротекторов (абекарнил, такрин, амиридин, этилизопропил амилорид, НПВС) на нейроны ЦНС. Обнаруженные новые свойства некоторых препаратов (такрин, фенаматы) служат экспериментальным обоснованием для разработки на их основе новых лекарственных средств для лечения острых и хронических заболеваний ЦНС.

Работа относится к числу фундаментальных исследований, и ее результаты могут быть включены в курсы по нейрофизиологии и биофизике в высших учебных заведениях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Медиатор гистамин может выступать в качестве модулятора активности глутаматных рецепторов ЫМОА типа, обеспечивая один из механизмов влияния гистаминергической системы на синаптическую пластичность, связанную с ЫМЭА рецепторами.

2. Глутаматные рецепторы АМРА типа, экспрессирующиеся в разных популяциях нейронов, обладают различными биофизическими и фармакологическими свойствами, исследование которых с помощью электрофизиологических и фармакологических методов позволяет получить информацию о субъединичном составе этих рецепторов.

3. ГАМКа рецепторы содержат высокоаффинный участок связывания ионов меди, который может опосредовать тоническое торможение активности этих рецепторов.

4. Нестероидные противовоспалительные средства из группы фенаматов обладают способностью модулировать активность ГАМКЛ рецепторов посредством разных механизмов, определяемых концентрацией модулятора, степенью активации рецептора и уровнем мембранного потенциала.

5. Связывание пенициллина и фуросемида с открытым каналом ГАМКд рецептора предотвращает его закрывание и диссоциацию агониста, что позволяет предположить, что сайты связывания этих блокаторов участвуют в воротном механизме, обеспечивающем открывание/закрывание канала ГАМКа рецептора.

6. Исследование свойств и принципов функционирования лиганд-управляемых каналов с использованием электрофизиологических методов, в отличие от методов их исследования в стационарных условиях (биохимические, иммунохимические и другие), позволяет выявить характер и динамику взаимодействия того или иного препарата с мишенью с учетом ее состояния -уровня активации рецептора, величины мембранного потенциала, степени десенситизации и других факторов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на следующих конференциях, конгрессах и съездах: на XVIII, XIX, XX, XXI, XXII Съездах Физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань, 2001; Екатеринбург, 2004; Москва, 2007; Калуга, 2010; Волгоград, 2013), на Съездах физиологов СНГ (Сочи, 2005; Ялта 2010), Международных конференциях «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007, 2009, 2011), Международных Междисциплинарных Конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, 2006, 2008, 2013), Ежегодных форумах по нейронаукам (SFN) (Вашингтон, 1993, 1996; Лос-Анджелес, 1998; Новый Орлеан, 2000; Орландо, 2002; Сан-Диего, 2001, 2004; Вашингтон, 2005, 2014), Европейских форумах по нейронаукам (FENS) (Брайтон, Великобритания, 2000; Париж, Франция, 2002; Лиссабон, Португалия, 2004; Вена, Австрия, 2006; Амстердам, Нидерланды, 2010; Милан, Италия, 2014) и других.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 64 печатных работах, из которых 24 в журналах, рекомендуемых ВАК (18 в зарубежных и 6 в отечественных журналах).

Структура и объем работы. Диссертация написана на 327 стр., состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», который включает 77J отечественных и иностранных источника.

Материал и методы исследования

Исследование биофизических и фармакологических свойств ионотропных рецепторов и механизмов действия на них модуляторов проводили на изолированных нейронах, выделенных из срезов мозга крысят в возрасте от 14 до 25 дней. Нейроны выделяли из срезов гиппокампа, мозжечка, стриатума и гипоталамуса. Изоляцию нейронов осуществляли методом вибродиссоциации, в большинстве случаев без использования энзиматической обработки (Vorobjev, 1991). Для регистрации токов использовали метод фиксации потенциала на целой клетке (пэтч-кламп метод в варианте "целая клетка"). Подведение агонистов и модуляторов осуществлялось с помощью оригинального устройства для быстрой аппликации (Vorobjev et al., 1996), которое позволяло проводить смену раствора около нейрона с постоянной времени от 4 до 40 мс в зависимости от задач эксперимента. Для активации тока агонист апплицировали в большинстве опытов в течение 1-2 с, интервал между отдельными аппликациями составлял 30-60 с. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программных пакетов Excel (Microsoft) и Prizm (GraphPad Software). Данные в большинстве случаев представлены как средние значения со стандартными ошибками измерения (SEM).

При работе с животными соблюдались правила, сформулированные в Приказе Минздрава РФ № 267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации». Протокол исследования, выполняемого в рамках диссертационной работы, одобрен этическим комитетом Научного центра неврологии РАМН (протокол № 04/09 от 07.04.09).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Модуляторы постсинаптических глутаматных рецепторов

1.1.Модуляция глутаматных рецепторов NMDA типа гистамином и

спермином

Гиппокамп является структурой, тесно связанной с процессами памяти. Активация NMDA рецепторов в этой структуре участвует в индукции длительной потенциации (Collingridge et al., 1983), а функционирование самих NMDA рецепторов модулируется большим числом агентов, действующих преимущественно через системы вторичных посредников (Coultrap et al., 2012; Lisman et al., 2012). На обработку информации в гиппокампе в числе прочих влияют сигналы, поступающие из подкорковых структур. В данном разделе работы мы изучали влияние нейромедиатора гистамина на NMDA токи в изолированных пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа.

ЫМОА ответы вызывали аппликацией Ь-аспартата или ЫМОА в безмагниевых растворах, содержащих 1 мкМ глицина. Гистамин в концентрации 0.5-100 мкМ обратимо увеличивал амплитуду ЫМЭА токов. Средняя величина возрастания ЫМЭА токов под действием 2-5 мкМ гистамина составляла 15±9% (и=55). Потенцирующий эффект гистамина не требовал преинкубации и не зависел от мембранного потенциала (МП) в диапазоне от -75 до +30 мВ. Другие агонисты гистаминовых рецепторов (импромидин, 2-3-бромфенил-гистамин и Я-а-метил-гистамин) не воспроизводили эффектов гистамина, а антагонисты Н1 и Н2 рецепторов не предотвращали его, что свидетельствует о том, что модуляция КМЭА рецепторов гистамином не связана с активацией известных гистаминовых рецепторов. В эффекте гистамина не участвовали вторичные посредники, поскольку его развитие не требовало преинкубации, сам эффект наблюдался даже после 30-40 мин регистрации, а использование ВАРТА в качестве буфера внутриклеточного Са2+ не влияло на развитие эффекта. Все эти наблюдения свидетельствуют о том, что гистамин действует непосредственно на ЫМОА рецепторный комплекс. Гистамин облегчал ИМЭА токи, начиная с субмикромолярных концентраций, достигая максимума при концентрации 10-100 мкМ (Рис. 1 А, Б). Концентрации гистамина выше 0.2 мМ уменьшали ЫМЭА токи. Величина ЕС50 составила 1.7 мкМ, коэффициент Хилла 0.74, а максимальная относительная потенциация

Рис. 1. Концентрационная зависимость эффектов гистамина. (А) Ответы на 50 мкМ Ь-аспартата при ко-аппликации с различными концентрациями гистамина (НА), указанными рядом с соответствующими записями. Контрольные ответы были получены до (слева) и после (справа) аппликаций гистамина. Момент аппликации препаратов отмечен чертой над записями. (Б) Усредненные по 7 клеткам изменения ЫМ£)А токов при действии разных концентраций гистамина. Представлены амплитуды токов, нормированные к контролю. Амплитуду ответа измеряли через 0.8 с после начала аппликации. Точки - средняя величина для каждой концентрации, отклонения - БО. Кривая -результат аппроксимации произведением двух уравнений Хилла. МП -75 мВ.

Эффект гистамина зависел от концентрации агониста - он слабо повышал ответы, вызываемые 20 мкМ ЫМЭА, в то время как ответы на 50 мкМ ЫМЭА 8

1.35 (и=7).

Ь-аспвртат 50 мкМ С-аспартат 50 МкМ

С 1-аспартат 50 мкМ, Фу 1 мкМ

1.5

е 1.0

10-6 ю-5 ю-4 10*3 Гистамин {М)

возрастали значительно сильнее (Рис. 2 В), то есть зависимость носила

колоколообразный характер. А Б Рис. 2. Зависимость вызываемой гистамином

потенщ1ации от концентрации ЫМЭА агонистов. (А) Наложенные друг на друга ответы на ко-аппликацшо 5 мкМ гистамина (НА) и 20 мкМ или 50 мкМ ИМИА. (Б) Ответы на ко-аппликацию 5 мкМ гистамина и 200 мкМ NMDA. (В) Относительные амплитуды ответов в присутствии гистамина. Открытые символы - ответы на аппликацию 2 мкМ гистамина и Ь-аспартата; заполненные символы - клетки, в которых апплицировали 5 мкМ гистамина и ЫМОА (концентрация ИМОА вдвое больше концентрации Ь-аспартата, показанной на оси абсцисс). Точки, представляющие собой значения для отдельных клеток (л=7), соединены между собой для наглядности.

1-4 -,

1.2 •

1.0 J

1_-аспартат(М)

10-5

10"4

С целью выявления сайта связывания гистамина исследовали возможность его взаимодействия с описанными ранее Одним из таких сайтов является сайт 1991), а гистамин способен

сайтами на NMDA рецепторах, связывания полиаминов (Williams et al., взаимодействовать с сайтом распознавания полиаминов (Kremzner and Pfeiffer, 1965). В наших исследованиях спермин дозо-зависимым образом потенцировал NMDA ответы (Рис. 3). Величина ЕС50 для потенциации спермином составляла 137 мкМ (п=6) при коэффициенте Хилла 1.1. Амплитуда ответа при максимальном увеличении под действием спермина превосходила контрольный ответ примерно в 2 раза.

Рис. 3. Взаимодействие эффектов гистамина и спермина на NN10 А рецепторах. (А) Наложенные пары ответов на ко-аппликацию 50 мкМ Ь-аспартата и 0, 50, 100, 500 и 1000 мкМ спермина (меньший по амплитуде ответ) плюс 20 мкМ гистамина (больший по амплитуде ответ). Последняя запись -контрольный ответ. (Б) Зависимость вызываемого спермином облегчения ИМБА токов от концентрации спермина (заполненные кружки); открытые кружки - то же в присутствии 20 мкМ гистамина, п=6.

Для исследования возможного взаимодействия эффектов спермина и

гистамина сравнивали ответы, вызываемые совместной аппликацией L-аспартата и меняющихся концентраций спермина с ответами, полученными после добавления 20 мкМ гистамина к тем же растворам (Рис. 3). Обнаружили, что степень потенциации NMDA токов гистамином снижается при повышении концентрации спермина. Анализ зависимости ингибирующего влияния спермина на потенциацию, вызываемую 20 мкМ гистамина, дает величину 1С50 145 мкМ и коэффициент Хилла 1.23. Очень близкие величины ЕС50 и 1С50 для спермина позволяют предполагать, что сайт, занимаемый спермином для вызова потенцирующего эффекта NMDA ответов, может быть тем же самым, что и сайт, который занимает спермин для предотвращения облегчения NMDA ответов под действием гистамина.

Сходство эффектов и окклюзия потенцирующих эффектов гистамина насыщающими концентрациями спермина позволяют предположить, что гистамин взаимодействует с сайтом связывания полиаминов на NMDA рецепторе. В пользу этого предположения свидетельствуют также полученные позже данные о сходных молекулярных детерминантах гистамин- и полиамин-вызываемой потенциации. Было показано, что потенцирующий эффект гистамина, наблюдаемый на рекомбинантных NMDA рецепторах, также как и эффект спермина, селективен для рецепторов, содержащих субъединицу NR2B (Williams et al., 1994), которые играют центральную роль в синаптической пластичности. Показано также сходство зависимости эффектов гистамина и спермина от pH (Saybasili et al., 1995; Yanovsky et al., 1995). Однако имеются полученные недавно данные, которые позволяют предположить, что гистамин взаимодействует с собственным сайтом на NMDA рецепторе, который аллостерически связан с полиаминовым сайтом (Burban et al., 2011).

Гистаминовые нейроны образуют протяженную и разветвленную систему иннервации, берущую начало от туберомамиллярного ядра в заднем гипоталамусе и проецирующуюся диффузным образом в различные области мозга. Участие этих нейронов в модуляции таких физиологических процессов как arousal или когнитивные функции хорошо документировано (Haas et al., 2008; Lin et al., 2011). Посредством обнаруженного нами эффекта гистаминергическая система может специфическим образом модулировать события, опосредуемые NMDA рецепторами, в структурах-мишенях - коре и гиппокампе. Одновременно с усилением возбудимости нейронов в результате блокады аккомодации и длительной следовой гиперполяризации эта аминная система, которой долго не уделялось достаточного внимания, может воздействовать на пластические перестройки и процессы формирования памяти. Активация NMDA рецепторов через сайт связывания гистамина может представлять потенциальный терапевтический интерес. Современная гипотеза

шизофрении предполагает дефицит глутаматергической передачи и рассматривает активаторы NMDA рецепторов как возможный новый класс антипсихотических препаратов (Menniti et al., 2013).

1.2. Механизмы блокады NMDA рецепторов такрином

Ведущая роль глутаматных рецепторов NMDA типа в повреждениях нейронов, вызываемых при многих патологических состояниях повышением концентрации внеклеточного глутамата, диктует необходимость поиска эффективных и нетоксичных блокаторов этих рецепторов, которые могут быть использованы для снижения эксайтотоксичности. К таким потенциально значимым нейропротекторам относятся, прежде всего, канальные блокаторы (Rogawski, 2000; Khodorov, 2004; Ehrnhoefer et al., 2011).

Препарат такрин используется при лечении болезни Альцгеймера (Ballard, 2002; Minarini et al., 2013). Показано, что он защищает нейроны от нейротоксического действия NMDA (Davenoprt et al., 1988). Мы исследовали влияние такрина на токи, вызываемые активацией NMDA рецепторов в изолированных нейронах поля СА1 гиппокампа. NMDA рецепторы активировали аппликацией L-аспартата в безмагниевом растворе, содержащем 1 мкМ глицина. Обнаружили, что при отрицательных значениях мембранного потенциала ко-аппликация L-аспартата и такрина вызывает подавление NMDA тока и замедление его деактивации, проявляющиеся уже при концентрации такрина 10 мкМ (Рис. 4). Дальнейшее повышение концентрации такрина до 50100 мкМ приводило к усилению блокирующего эффекта и появлению кратковременного возрастания входящего тока - так называемого «хвостового тока». Временной ход деактивации тока описывался одной экспонентой с постоянной времени спада (т0£г) около 60 мс в контроле и 200 мс после блокады 100 мкМ такрина. Полу максимальная блокирующая концентрация для такрина (1С50) составляла 25±5 мкМ, коэффициент Хилла 2±0.2 (и=4).

Эффекты, сходные с эффектами такрина, наблюдались при ко-аппликции L-аспартата и амиридина, препарата, который также как и такрин является ингибитором ацетилхолинэстеразы и используется при лечении болезни Альцгеймера. Однако эффект амиридина обнаруживался при более высоких концентрациях этого препарата (Рис. 4 В).

Эффекты такрина имели выраженный потенциалозависимый характер (Рис. 5). При положительных поддерживаемых потенциалах блокирующий эффект был пренебрежимо мал даже при концентрации такрина 200 мкМ. Эта же концентрация практически полностью блокировала входящие токи. Усиление блокады при гиперполяризации сопровождалось увеличением времени спада хвостового тока (Рис. 5).

ЬАвр 50 мкМ; 01у 1 мкМ

о*тафин02мМ • юнтропк

Рис. 4. Влияние такрина и амиридина на ЫМОА токи. (А) Ответы на аппликацию 50 мкМ Ь-аспартата в контроле и при ко-аппликации с различными концентрациями такрина. Постоянные времени спада ответов составили 58 мс в контроле и 93, 130, 178 и 202 мс для 10, 20, 50 и 100 мкМ такрина, соответственно. МП -80 мВ. (Б) Структурные формулы такрина и амиридина. (В) Графики концентрационной зависимости блокирующих эффектов такрина (о) и амиридина (•). Параметры блока для такрина: 1С5о=25±6 мкМ (п=4), для амиридина 1С5о=201±43 мкМ (и=4).

Рис. 5. Потенциалозависимость блока ЫМЭА токов такрином. (А) Слева - наложенные друг на друга записи токов на 50 мкМ Ь-аспартата, блокированные 100 мкМ такрина при различных мембранных потенциалах. Диапазон МП от -95 до +45 мВ с шагом 20 мВ. Справа записи токов на 50 мкМ Ь-аспартата в той же клетке в контроле. (Б) Кривые зависимости от потенциала ИМОА токов в контроле (•) и при блокаде 0.2 мМ такрина (о) в представленном нейроне.

Хвостовой ток полностью подавлялся блокатором NMDA каналов - ионами магния - (1 мМ), когда его вводили в перфузирующий раствор. Ко-аппликации 30 мкМ магния или 30 мкМ такрина вместе с агонистом вызывала сходное подавление Ы№ГОА ответа - примерно на 70% (Рис. 6), однако магний, вводимый в перфузирующий раствор, подавляя амплитуду ответа, не влиял на кинетику хвостового тока, развивающегося после аппликации 100 мкМ такрина, в то время как сам такрин вызывал заметное его замедление (Рис. 6 Б). Постоянная времени спада хвостового тока в присутствии 30 мкМ такрина в перфузирующем растворе составляла 645±63 мс, в то время как в контроле эта величина была 197±39 мс (п=6).

Для количественной оценки эффектов такрина вычисляли интегральный ток или заряд, входящий в клетку во время генерации хвостового тока. Поскольку ни магний, ни такрин не меняют проводимость ЫМБА каналов, заряд, входящий в клетку, пропорционален общему времени открытого состояния

NMDA каналов. Эти вычисления показали, что в контрольных условиях (временной интервал /1-/2) величина заряда, входящего в клетку во время генерации хвостового тока, составляет 980 фк (fC). Вызываемый магнием блок уменьшал эту величину в 3.2 раза - до 360 фк. В то же время 30 мкМ такрина, которые вызывали сходное уменьшение амплитуды NMDA ответа, уменьшали заряд, входящий в клетку во время хвостового тока, только на 41% (580 фк).

Рис. 6. Блокада хвостового тока блокаторами открытого NMDA канала. (А) Ответы на 50 мкМ L-аспартата в контроле (1), +30 мкМ такрина (2), +30 мкМ Mg2+(3). (Б) Ответы на 50 мкМ L-аспартата+ЮО мкМ такрина (1), то же в присутствии 30 мкМ такрина (2) или 30 мкМ Mg2+ в перфузирующем растворе. (В) Наложение записей,

представленных на Б (1) и контрольного ответа (2).

Описанные свойства блока NMDA каналов такрином свидетельствуют о том, что такрин является блокатором открытого ионного канала. Однако, в отличие от таких блокаторов как кетамин, МК-801 и других, которые, связываясь с каналом, не препятствуют его закрыванию, то есть действуют по механизму «ловушки» (Honey et al., 1985; Halliwell et al., 1989; Antonov and Johson, 1996), такрин удерживает канал в открытом состоянии до тех пор, пока он не уйдет из канала, действуя по механизму последовательного блока или "foot-in-the-door", о чем свидетельствует появление хвостового тока после прекращения совместной аппликации агониста и такрина.

Кинетика и амплитуда хвостового тока не менялись под действием конкурентного антагониста NMDA рецепторов APV и антагониста места узнавания глицина кинурената. Описанные свойства хвостового тока позволяют рассматривать его как результат пролонгирования активности NMDA каналов, которая начиналась во время аппликации агониста. Модель последовательного блока предсказывает, что блокатор, быстро диссоциирующий из канала, должен вызывать заметное удлинение времени открываний от первого открывания до финального закрывания в отдельной пачке (Colquhoun and Hawkes, 1982, 1983). Для NMDA рецепторов было показано, что однократное связывание агониста вызывает длинный кластер открываний канала, которые заканчиваются, когда рецептор возвращается в

покоящееся, несвязанное состояние (Gibb and Colquhoun, 1991; Lester and Jahr, 1992). Только после конца одиночной активации NMDA канал может быть реактивирован. В контрольных условиях длительность активационного цикла не превышает времени спада NMDA ответа, которое в наших экспериментах составляло около 60 мс. Блок такрином замедляет спад NMDA тока до 650 мс и может в этом случае увеличивать время одиночной активации до 10 раз, а, следовательно, уменьшать вероятность повторной активации NMDA рецептора. Таким образом, уменьшение NMDA тока под действием такрина происходит двумя путями. Во-первых, он уменьшает общее время открытого состояния во время одиночной активации, как это происходит и при блокаде магнием. Во-вторых, он снижает вероятность повторной активации NMDA канала.

1.3. Функциональные свойства глутаматных рецепторов АМРА типа в разных популяциях нейронов

Глутаматные рецепторы АМРА типа, опосредующие быструю синаптическую передачу, представляют собой катион-проводящий комплекс, образованный различными комбинациями 4-х субъединиц - GluAl-4 (Collingridge et al., 2009; Traynelis et al., 2010). Исследования рекомбинантных АМРА рецепторов показало, что их биофизические и фармакологические свойства зависят от композиции субъединиц, альтернативного сплайсинга и редактирования РНК, а использование иммуногистохимических и радиолигандных методов выявило различное распределение в мозге субъединиц АМРА рецептора (Mayer, 2006; Traynelis et al., 2010). Разный паттерн экспрессии субъединиц АМРА рецепторов обеспечивает разнообразие их свойств, к которым относятся проницаемость для Са2+, кинетика деактивации и десенситизации, чувствительность к блокаторам и модуляторам.

Вместе с тем, особенности функционирования нативных АМРА рецепторов в разных типах нейронов и их композиция изучены крайне слабо. Такие данные имеются в отношении нейронов гиппокампа (Geiger et al., 1995) и новой коры (Jonas et al., 1994; Lambolez et al., 1992). Другие структуры мозга в этом плане практически не исследованы.

Цель настоящего раздела работы состояла в выявлении свойств АМРА рецепторов, представленных в функционально различных типах нейронов. Мы исследовали биофизические и фармакологические особенности АМРА рецепторов в трех типах нейронов - клетках Пуркинье (КП) мозжечка, гигантских интернейронах (ГИН) и проекционных нейронах стриатума. Известно, что рецепторы, в состав которых наряду с другими субъединицами входит субъединица GluA2, практически непроницаемы для кальция и имеют линейную вольт-амперную характеристику. При отсутствии этой субъединицы

канал приобретает способность пропускать ионы кальция, а его вольт-амперная характеристика нелинейна (Burnashev, 1996). Для выявления кальциевой проницаемости каналов мы проанализировали изменения потенциала реверсии ответов при замене одновалентных катионов в наружном растворе на ионы кальция. Для активации АМРА рецепторов использовали каинат, который при взаимодействии с АМРА рецепторами вызывает недесенситизирующийся ток.

Было обнаружено, что вольт-амперные характеристики ответов на каинат линейны в КП и проекционных нейронах стриатума, в то время как в ГИН стриатума в области положительных потенциалов наблюдали входное выпрямление (Рис. 7). Каналы, сопряженные с АМРА рецепторами, имели низкую проницаемость для Са2+ в КП и проекционных нейронах стриатума, но были высокопроницаемы для Са2+ в интернейронах (Pca/PNa 0.04, 0.04 и 1.01, соответственно).

Ранее было показано, что некоторые положительно заряженные полиаминовые токсины из яда паука, а также спермин избирательно блокируют токи через каналы АМРА рецепторов, в составе которых отсутствует GluA2 (Гришин и др., 1986; Jackson and Usherwood, 1988; Antonov et al., 1989). Обнаружено также, что дикатионовое производное адамантана, синтезированное в Институте экспериментальной медицины в Санкт-Петербурге - ИЭМ-1460, ранее описанное как блокатор NMDA каналов, также вызывает специфичный к субъединичному составу блок рекомбинантных АМРА рецепторов (Magazanik et al., 1997). В нашей работе мы сравнили способность этого препарата блокировать АМРА каналы с их кальциевой проницаемостью и свойствами выпрямления (Рис. 7). Обнаружили, что АМРА рецепторы в клетках Пуркинье и проекционных нейронах стриатума имеют низкую чувствительность к блокатору. Токи, вызываемые аппликацией 100 мкМ каината, уменьшались при действии 100 мкМ блокатора на 4±1% (п=4) в клетках Пуркинье и на 12±1% (л=20) в проекционных нейронах стриатума. Гигантские интернейроны стриатума имели высокую чувствительность к блокатору: величина блока составляла 95±6%, a IC50 блока 2,6+0,4 мкМ (и=16). Эти данные позволяют сделать вывод о том, что ИЭМ-1460 может быть использован в качестве маркера нативных АМРА рецепторов, не содержащих субъединицы GluA2 и обладающих высокой проницаемостью для ионов Са2+.

Гетерогенность АМРА рецепторов связана не только с различиями в их субъединичном составе, но и с тем, что каждая из 4-х субъединиц может существовать в двух молекулярных формах - flip и flop (Sommer et al., 1990). Какой из двух модулей будет входить в состав рецептора, контролируется через посредство альтернативного сплайсинга.

Рис. 7. Свойства АМРА рецепторов в нейронах стриатума и КП мозжечка. Левая колонка - токи, вызываемые аппликацией 100 мкМ каината в контроле и при совместной аппликации с 100 мкМ ИЭМ (ŒM)-1460 в гигантских интернейронах стриатума (ГИН) (А), в проекционных нейронах стриатума (Б) и в КП (В). Правая колонка - вольт-амперные характеристики (ВАХ) токов, активируемых каинатом, в контроле (•) (140 мМ Na+ и 2.7 мМ Са2^ и при замене одновалентных катионов на ионы кальция (100 мМ, о). В контроле ВАХ линейная в КП, имеет небольшое выходящее выпрямление в проекционных клетках стриатума, у ГИН ВАХ с входным выпрямлением. В растворе, содержащем 100 мМ Са2+, потенциал реверсии токов в проекционных нейронах и КП смещался до — 60 мВ. Данные нормированы к ответу на аппликацию 100 мкМ каината при -70 мВ. Усреднение по 6-7 клеткам.

Как показано на рекомбинантных рецепторах, модули flip и flop по-разному влияют на свойства глутаматных каналов: flip формы имеют более медленную кинетику и большую амплитуду стационарного компонента ответа на аппликацию глутамата (Sommer et al., 1990). При исследовании свойств АМРА рецепторов в нейронах стриатума мы обнаружили, что при активации этих рецепторов глутаматом (1 мМ) десенситизация ответов в гигантских интернейронах происходит примерно в 5 раз быстрее, чем в проекционных нейронах, что дало основание предполагать, что flip и flop варианты субъединиц АМРА рецепторов по-разному представлены в этих типах нейронов. Фармакологическим инструментом для выявления flip и flop форм рецепторов является препарат циклотиазид, который сильнее потенцирует токи через АМРА рецепторы в flip форме, чем во flop сплайс варианте (Partin et al., 1995). Мы обнаружили, что циклотиазид по-разному действует на токи, опосредуемые АМРА рецепторами в двух исследовавшихся популяциях нейронов стриатума (Рис. 8).

Циклотиазид вызывал увеличение амплитуды ответа на каинат (200 мкМ) в 6.77±1.1 раз в проекционных нейронах (и=4) и только в 1.65±0.1 раза в интернейронах (и=4). Величина ЕС50 составляла 21±4.9 мкМ для проекционных нейронов и 30±4.0 мкМ для гигантских интернейронов. Таким образом, циклотиазид обладает значительно большей эффективностью в отношении потенциации ответов в проекционных клетках, чем в интернейронах, хотя

100 мкМ КА +/-д 100 мкМ IEM-1406

\ i отмь

отмыв контроль

1 Г

отмыв контроль

-80 . о

-0-0-0 ° О. . , _

+4(1

величины ЕС5о заметно не отличаются. Циклотиазид вызывал сильное и сопоставимое увеличение пика ответа и на глутамат в обоих типах клеток (Рис. 8 В, Г), однако в проекционных клетках при этом увеличивалось и плато, т.е. при высоких концентрациях циклотиазида десенситизация снималась почти полностью, в то время как в интернейронах ответ спадал после прекращения действия циклотиазида.

А Б Рис. 8. Влияние циклотиазида на каинат- и

Проекционный нейрон Гигантский интернейрон ГЛутаМат-активируеМЫе ТОКИ В проекционных

нейронах и гигантских интернейронах стриатума. (А-Г) Преаппликация циклотиазида в течение 20

с показана прямоугольниками перед соответствующими кривыми, цифры - концентрации циклотиазида. (Д) Концентрационные кривые для потенциации циклотиазидом ответов на 200 мкМ каината в проекционных нейронах и интернейронах. Токи нормированы к ответу в контроле.

Анализ зависимости эффектов циклотиазида от концентрации агониста показал, что максимальный ответ потенцируется в обоих типах нейронов, однако повышение кажущейся

аффинности к каинату наблюдали только в проекционных нейронах. Так, величина ЕС5о для каината, составлявшая в этих нейронах в контроле 183±12 мкМ, под действием циклотиазида снижалась до 19.7±1.6 мкМ («=10). В гигантских интернейронах циклотиазид увеличивал максимальный ответ на каинат примерно в

2 раза, но сдвига кривой при этом не происходило (п=1).

При анализе кинетических характеристик взаимодействия циклотиазида с АМРА рецепторами в двух типах нейронов (Рис. 9) обнаружили, что временной ход развития потенциации сходен в обоих типах клеток и описывается одной экспонентой с постоянной времени (топ) 2.3±0.21 с (п=3) для проекционных клеток и 1.9±0.17 с (л=3) для интернейронов при воздействии 50 мкМ циклотиазида. Однако кинетика восстановления токов после отмыва циклотиазида (т0(Т) была значительно медленнее в проекционных клетках (47±3 с, и=3), чем в интернейронах (6.95±1.1 с, п=4).

Циклотиазид ,_, Каинат 200 мкМ

3 10 30 100 200

Каинат 200 мкМ

о 10 30 100 200

Глутамат 1 мМ

1 3 10 30 100 Циклотиазид (мкМ)

Гигантский интернейрон

50 мкМ циклотиазида 100 щМ кайната

-——" Т„,«7с

100 мкМ циклотиазида 100 мкМ каината

200 мкМ циклотиазида 100мкМк

Проекционный нейрон

20 мкМ циклотиазида 100 мкМ каината

БО^мкМ циклотиазида 100 мкМ каината

----------Toff = 23 с

200 мкМ циклотиазида 100иМкэшата

Рис. 9. Кинетика развития эффектов циклотиазида в двух типах нейронов стриатума. Пояснения в тексте.

Заметные различия в кинетике диссоциации циклотиазида в двух типах клеток были обнаружены и при оценке скорости падения ответа на глутамат (1 мМ) после прекращения аппликации циклотиазида. В проекционных нейронах T0ff составляла 40±4 с (и=4), а в интернейронах — 0.54±0.006 с (я=7). Кроме того, скорость отмыва циклотиазида в проекционных нейронах почти не зависела от присутствия глутамата (Рис. 10), в то время как в интернейронах она сильно ускорялась в присутствии агониста (Рис. 11).

А , Циклотиазид 100 мкМ У Глутамат 1 мМ

-------т = 45 с

2 НА I

Рис. 10.

Проекционый нейрон. После аппликации циклотиазида ответ падает с той=45 с (А). В присутствии циклотиазида амплитуда ответа на глутамат не падает (Б).

« Циклотиазид 100 мкМ jf

_ _Глутамат 1 мМ

2 " 1 -

т2 = 14.3 с 2 с

Рис. 11.

Гигантский, интернейрон. Постоянная времении спада т0(г= 0.52 с в условиях активации рецептора (А) и замедляется в отсутствие его

активации (т0гг =14.3 с) (Б).

Эти наблюдения позволяют предположить, что механизмы взаимодействия циклотиазида с разными типами АМРА рецепторов различны. В проекционных нейронах сродство циклотиазида к рецептору не зависит от активации рецептора, а в интернейронах связывание агониста или переход канала в открытое состояние уменьшают сродство рецептора к циклотиазиду.

Таким образом, это исследование показывает, что два типа нейронов стриатума — проекционные и гигантские интернейроны — экспрессируют глутаматные рецепторы АМРА типа, которые могут быть разделены на основании их чувствительности к циклотиазиду, и позволяет предположить,

что субъединицы АМРА рецепторов в проекционных нейронах экспрессируются преимущественно в flip форме, а в интернейронах - в flop.

Это предположение нашло подтверждение в проведенном нами анализе мРНК в отдельных нейронах с помощью метода RT-PCR (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией). Анализ показал наличие субъединиц GluAl, GluA2 и GluA3 в обоих сплайс вариантах в проекционных нейронах и GluAl и GluA4 только в flop форме в интернейронах. Таким образом, молекулярно-биологические исследования подтверждают наши электрофизиологические данные о преимущественной экспрессии flop форм АМРА рецепторов в интернейронах стриатума, учитывая, что при наличии субъединиц в обоих сплайс вариантах, в определении функциональных свойств рецепторного комплекса доминирует flip вариант.

Результаты, полученные в настоящем разделе работы с использованием селективных блокаторов и модуляторов АМРА рецепторов, свидетельствуют о различии функциональных свойств этих рецепторов, представленных в разных нейрональных популяциях. Хотя физиологическое значение специфичной для определенного типа клеток экспрессии АМРА рецепторов до конца непонятно, можно ожидать, что регуляция композиции рецепторов определяет кинетику и силу передачи в глутаматергических синапсах.

2. Влияние эндогенных и экзогенных модуляторов на ГАМКд рецепторы

2.1. Влияние p-карболина абекарнила на активность ГАМКа рецепторов ГАМКд рецепторы центральных нейронов являются мишенью действия анксиолитических препаратов, наиболее известными из которых являются бензодиазепины, в частности, диазепам. Бензодиазепины осуществляют эффекты, связываясь с бензодиазепиновым сайтом ГАМКд рецептора и аллостерически модулируя ответы на ГАМК. Однако, помимо анксиолитических свойств, эти препараты имеют ряд побочных эффектов, включающих сонливость, миорелаксацию и возможное развитие зависимости. Поэтому усилия фармакологов направлены на поиск избирательных анксиолитиков, лишенных этих побочных эффектов. Предполагалось, что одним из таких препаратов может быть абекарнил - не-бензодиазепиновый лиганд бензодиазепинового сайта ГАМКд рецептора. Обладая выраженной анксиолитической активностью в экспериментах на животных, этот препарат не имел атаксиогенных свойств (Turski et al., 1990; Stephens et al., 1990). Эти наблюдения позволили предположить, что абекарнил может являться либо частичным агонистом бензодиазепиновых рецепторов, либо селективным агонистом для их субпопуляции (Stephens et al., 1990). Однако данных поведенческих исследований не достаточно, чтобы выбрать между этими

вариантами. Одним из путей оценки действенности (intrinsic efficacy) агониста является выявление функциональных изменений в тех мишенях, на которые направлено действие данного препарата. Наиболее прямым следствием активации бензодиазепиновых рецепторов является модуляция ГАМК-активируемых токов. Нами было проведено исследование модуляции абекарнилом ГАМК-активируемых токов в изолированных клетках Пуркинье мозжечка и сопоставлены эффекты этого препарата с эффектами диазепама.

При поддерживаемом потенциале -75 мВ быстрая аппликация ГАМК (1-50 мкМ в течение 1-3 с) вызывала во всех зарегистрированных нейронах входящий ток, амплитуда и временной ход которого зависели от концентрации ГАМК. Ко-аппликация ГАМК (1-10 мкМ) и 100 нМ абекарнила вызывала потенциацию ответов и сдвиг влево кривой доза-ответ для ГАМК. Величина ЕС50 для ГАМК в присутствии абекарнила снижалась с 4.1±0.3 мкМ в контроле до 3.5±0.2 мкМ (и=3-5; ¿><0.05) (Рис. 12).

Рис. 12. Концентрационные зависимости ответов на ГАМК в контроле (•) и в присутствии 100 нМ абекарнила (♦). Каждая точка - усредненная амплитуда ответа для 3-5 клеток. Вставка - примеры записей токов на аппликацию ГАМК в концентрации 1,2, 5 и 10 мкМ. Момент аппликации показан горизонтальной чертой над записью токов.

При совместной аппликации 2 мкМ ГАМК и диазепама наблюдали концентрационно-зависимое и

обратимое увеличение амплитуды ГАМК-активируемого тока, которое достигало почти максимальной величины при концентрации диазепама 1 мкМ. Абекарнил, также как и диазепам, вызывал увеличение амплитуды ГАМК-активируемого тока, но в отличие от диазепама, эффекты абекарнила развивались очень медленно. При повторных аппликациях ГАМК и абекарнила ответ достигал максимальной величины через 2-3 минуты после начала аппликации абекарнила и не спадал в течение последующих 10 мин после прекращения действия препарата.

Диазепам в концентрации 1 мкМ увеличивал амплитуду тока, активируемого 2 мкМ ГАМК, до 217±14%, в то время как 0.1 мкМ абекарнила облегчали ответ до 241±12% (я=8). Эффекты диазепама и абекарнила были не-аддитивны, что было обнаружено в экспериментах, сходных с проиллюстрированным на Рис. 13. Это указывает на то, что оба препарата взаимодействуют с одним и тем же аллостерическим регуляторным сайтом на ГАМКд рецепторном комплексе.

[ГАМК] (мкМ)

Рис. 13. Эффекты диазепама (DZ) и абекарнила не-аддитивны. Регистрация от одной клетки, 1-е аппликации с интервалом 0.5 мин 2 мкМ ГАМК и ГАМК с модуляторами. (А) Серия суперпозиций трех последовательных ответов: на ГАМК и ГАМК+DZ в начале регистрации (левый блок, 1-й ромб на графике Б), на ГАМК и ГАМК+DZ после развития потенциации ответов под действием 10 нМ абекарнила (центральный и правый блоки, 2-й и 3-й ромбы на графике). (Б) График изменений амплитуды ответа на 2 мкМ ГАМК при ко-аппликации с модуляторами. Кружки -изолированная аппликация ГАМК, ромбы -ГАМК+1 мкМ DZ, треугольники - ГАМК+10 нМ абекарнила, треугольник вершиной вниз -ГАМК+100 нМ абекарнила.

Полученные данные свидетельствуют о том, что для ГАМКд рецепторов в клетках Пуркинье мозжечка абекарнил является полным агонистом бензодиазепиного сайта, вызывая эффекты, сходные по величине с эффектами полного агониста диазепама. Медленная кинетика эффектов абекарнила не позволила нам корректно оценить величину ЕС50 для этого препарата, однако из представленных данных ясно, что абекарнил был более действенным агонистом - пороговая концентрация, вызывающая потенциацию ГАМК-тока, составляла 50-100 нМ для диазепама и 2 нМ для абекарнила.

Прототип лигандов бензодиазепиновых рецепторов диазепам обладает не только анксиолитическими, но и седативными свойствами. Полученные недавно данные свидетельствуют о том, что седативные эффекты опосредуются преимущественно ГАМКд рецепторами, содержащими субъединицу al, а анксиолитические - а2- и/или аЗ-содержащими рецепторами (Atack, 2011). Тип ГАМКд рецепторов в клетках Пуркинье (с субъединичным составом alß2/3y2) наиболее часто встречается в центральных нейронах. В наших исследованиях абекарнил обнаружил свойства полного агониста этих рецепторов. Возможно, именно с этим обстоятельством связан тот факт, что, как показали более поздние клинические исследования, анксиолитические и седативные свойства у абекарнила, как и у диазепама, выражены примерно в равной степени (Rickels at al., 2000). Поэтому этот препарат в настоящее время не рассматривают как селективный анксиолитик (Whiting, 2006; Gale and Millichamp, 2011). Однако как седативный препарат он имеет преимущество перед диазепамом, поскольку, в отличие от последнего, не меняет уровень экспрессии мРНК субъединиц ГАМКд рецептора при длительном применении (Holt et al., 1996).

2.2. Модуляция ГАМКЛ рецепторов нестероидными противовоспалительными средствами из группы фенаматов

Нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) широко используются в клинической практике как препараты, оказывающие жаропонижающее, анальгезирующее, кардиопротективное и противовоспалительное действие (Green, 2001). Основные эффекты НПВС связаны с их способностью угнетать синтез простагландинов путем ингибирования циклооксигеназного пути. НПВС хорошо проникают через гематоэнцефалический барьер, с чем связывают ряд центральных эффектов этих препаратов. Было показано, что они обладают нейропротекторными свойствами при нейродегенеративных заболеваниях (McGeer and McGeer, 2007) и в экспериментальных моделях с глутаматной токсичностью (Chen et al. 1998), а также вызывают аналгезию при прямом введении их в ЦНС (МсСогшас, 1994). Наиболее выражены центральные эффекты у НПВС, относящихся к группе фенаматов. Было обнаружено, что фенаматы способны блокировать или потенцировать ответы, вызываемые ГАМК, в ооцитах Xenopus (Woodward et al., 1994; Halliwell et al., 1999). В то же время механизмы, лежащие в основе этих эффектов, недостаточно ясны. Задача настоящего раздела работы состояла в исследовании механизмов взаимодействия фенаматов с ГАМКа рецепторами центральных нейронов. На изолированных клетках Пуркинье мозжечка были исследованы механизмы действия трех препаратов из группы фенаматов: нифлумовой (НФК), толфенамовой (ТФК) и мефенамовой (МФК) кислот.

При поддерживаемом потенциале -70 мВ одновременная аппликация ГАМК в концентрации 2 мкМ (около ЕС2о) и исследуемого препарата вызывала двухфазную модуляцию ГАМК-активируемого тока. В диапазоне от 1 до -100 мкМ фенаматы потенцировали ответы до 600% с ЕС50 40.0±3.7 мкМ для НФК, 10.1±3.2 мкМ для ТФК и 15.5±5.0 мкМ для МФК. При концентрациях фенаматов более 300 мкМ наблюдали угнетение ответов (Рис. 14).

Помимо влияния на амплитуду стационарного компонента ответа, ТФК и МФК заметно удлиняли время деактивации токов (т0п), вызываемых ГАМК. В записях, приведенных на Рис. 14 Б и В, при совместной аппликации 2 мкМ ГАМК и ТФК T0ff возрастала с -50 мс в контроле до 140, 240 и 360 мс при аппликации ГАМК с 3, 10 и 30 мкМ ТФК. МФК (3, 10 и 30 мкМ) увеличивала время деактивации до 240, 430 и 610 мс, соответственно. В среднем, время деактивации возрастало в 8.28+1.29 раз (п=6) под действием 100 mkMD ТФК и 12.5+1.5 раз (п=3) под действием 100 мкМ МФК.

10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 [Ф«наматы ] мкМ [Фенаматы ] (мкМ)

Рис. 14. Влияние фенаматов на ГАМК-активируемые токи. (А-В) Примеры модуляции токов, вызываемых 2 мкМ ГАМК, нифлумовой (НФК) (А), толфенамовой (ТФК) (Б) и мефенамовой (МФК) (В) кислотами. Потенцирующие эффекты представлены на верхних панелях, ингибирующие - на нижних панелях записей. Поддерживаемый потенциал -70 мВ. (Г) Концентрационные зависимости эффектов фенаматов. (Д) Влияние фенаматов на скорость деактивации токов, вызываемых 2 мкМ ГАМК.

При активации рецепторов разными концентрациями ГАМК обнаружили, что потенцирующее действие фенаматов ослабляется при возрастании концентрации ГАМК. Для диапазона концентраций ГАМК 1-10 мкМ наблюдали сдвиг влево кривой доза ответ с уменьшением ЕС50 для ГАМК с 4.26±3.7 мкМ в контроле до 3.15±0.40 мкМ в присутствии 30 мкМ НФК (и=4, р<0.05), до 2.1Ш.23 мкМ в присутствии 10 мкМ ТФК (и=4, р<0.01), до 1.59±0.25 мкМ в присутствии 30 мкМ МФК (п=4, р<0.01). Такая зависимость эффектов препаратов от концентрации агониста указывает на аллостерический механизм потенцирующего эффекта. При концентрации ГАМК выше 10 мкМ потенцирующий эффект сменялся ингибирующим.

С целью исследования способности фенаматов взаимодействовать с закрытым ионным каналом НФК, ТФК или МФК апплицировали в разных концентрациях непосредственно перед изолированной аппликацией ГАМК. При использовании этого протокола НФК потенцировала ответы на ГАМК с ЕС5о=311±153 мкМ, ТФК с ЕС50=20.9±3.6 мкМ, МФК с ЕС50=30±12 мкМ (п=4-

5). Блокирующий эффект при этом не развивался. Эти наблюдения свидетельствуют о том, потенцирующий эффект фенаматов опосредуется их взаимодействием с сайтом, локализованном вне канальной поры. Исследование потенциалозависимости эффектов фенаматов показало, что потенцирующие эффекты при деполяризации мембраны ослабляются, а блокирующие усиливаются. Зависимость блокирующих эффектов фенаматов от мембранного потенциала указывает на то, что место их связывания, опосредующее блокирующий эффект, находится в канальной поре. Подробнее блокирующие эффекты НФК будут описаны в следующем разделе работы.

Полученные результаты позволяют предположить, что на ГАМКа рецепторе существуют, по крайней мере, два места связывания для фенаматов: (1) сайт с более высокой аффинностью, опосредующий потенцирующий эффект, и (2) низкоаффинный сайт, вызывающий блокирующий эффект. В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что модулирующие эффекты фенаматов определяются совокупностью факторов - уровнем активации ГАМКа рецепторов, мембранным потенциалом и концентрацией модулятора.

При исследовании возможного участия известных модуляторных сайтов на ГАМКЛ рецепторном комплексе в потенцирующих эффектах фенаматов мы обнаружили, что они не связаны с взаимодействием фенаматов с бензодиазепиновым сайтом, поскольку антагонист бензодиазепинового места связывания флумазенил не предотвращал их развитие. Потенцирующие эффекты фенаматов были не-аддитивны с эффектами противосудорожного препарата лореклезола, что позволяет предполагать, что место связывания фенаматов может совпадать или частично перекрываться с местами связывания лореклезола и, возможно, анестетиков, поскольку описано совпадение или аллостерическое взаимодействие этих сайтов (Olsen and Li, 2011).

Исследования на свежеизолированных нейронах дают возможность оценить влияние фенаматов и на синаптическую активность, опосредуемую ГАМКд рецепторами. На соме этих нейронов сохраняются синаптические бутоны, из которых происходит спонтанное выделение медиатора, приводящее к развитию миниатюрных постсинаптических токов (мПСТ). Блокада подавляющего большинства мПСТ антагонистом ГАМКд рецепторов габазином (10 мкМ) свидетельствует о том, что они связаны с выделением ГАМК из пресинаптических терминалей и представляет собой тормозные ПСТ (мТПСТ).

В контроле спад мТПСТ был двухфазным и аппроксимировался двумя экспонентами - быстрой (i]=4.4±0.03 мс) и медленной (т2=29.3±7.4 мс). В присутствии 10 мкМ фенаматов амплитуда мТПСТ не менялась заметным образом, однако длительность мТПСТ сильно возрастала. Величина i; в присутствии 10 мкМ ТФК была такой же, как и в контроле (4.6±0.04 мс), а т2

возрастала и достигала величины 59.1±0.2 мс (Рис. 15 А-В). В присутствии 100 мкМ ТФК амплитуда мТПСТ уменьшалась, а кинетика спада становилась еще медленнее. Величина т, не отличалась от контроля (4.6±0.9 мс), а т2 возрастала до величины 258.1± 25.1 мс (Рис. 15 А-В). В присутствии 10 мкМ МФК хх составляла 3.7±0.3 мс, а т2 775±58 мс. Эффекты фенаматов развивались быстро и были полностью обратимыми. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в ГАМКергических синапсах на клетках Пуркинье фенаматы заметно увеличивают длительность постсинаптических токов. Учитывая описанное ранее значительное увеличение времени деактивации ГАМК-индуцируемых токов под действием фенаматов, мы можем рассматривать обнаруженные изменения кинетики мТПСТ как результат взаимодействия этих препаратов с постсинаптическими рецепторами. Поскольку увеличение длительности мТПСТ происходит при концентрациях фенаматов, которые могут достигаться в плазме крови при их клиническом использовании, можно ожидать, что описанные изменения параметров мТПСТ имеют место и при синаптической передаче в условиях in vivo.

Время (сек.)

Рис. 15. Влияние ТФК на спонтанные мТПСТ в изолированных нейронах Пуркинье. (А) Записи мТПСТ в контроле и в присутствии 10 и 100 мкМ ТФК. (Б) Диаграммы, представляющие величины постоянных времени спада (т) мТПСТ в контроле и в присутствии ТФК. Светлые столбики - величины для быстрой компоненты (т0, заштрихованные - для медленной компоненты (т2). Каждый столбик - средняя величина ± стандартные ошибки среднего (120 событий, 5 клеток), ** - /?<0.01, *** - ¿><0.001. (В) -усредненные кривые спада мТПСТ в контроле и в присутствии ТФК и биэкспоненциальная подгонка этих кривых (сплошные линии).

2.3. Механизмы действия блокаторов на каналы ГЛМКА рецепторов

Блокаторы ионных каналов широко используются для изучения свойств и функциональной архитектуры ионных каналов. В настоящем разделе работы было проведено исследование механизмов взаимодействия с канальной порой ГАМКд рецептора трех препаратов - фуросемида, пенициллина и нифлумовой кислоты.

2.3.1. Взаимодействие фуросемида с ГАМКа рецепторами

Диуретик фуросемид является антагонистом ГАМКд рецепторов, эффективность которого примерно в 100 раз выше в отношении а6(52у2 и а4Р2у2 рецепторов, чем для aip2y2 рецепторов (Korpi et al., 1995; Wafford et al., 1996). Однако механизм, посредством которого фуросемид подавляет токи, опосредуемые ГАМКд рецепторами, не ясен. Мы исследовали механизм взаимодействия фуросемида с нативными ГАМКд рецепторами, экспрессирующимися в клетках Пуркинье мозжечка. Эти рецепторы не содержат ни аб, ни а4 субъединиц, что предполагает низкую аффинность к этому препарату.

Рис. 16. Фуросемид блокирует ГАМК-активируемые токи дозо-зависимым образом. (А) Токи на 2 мкМ ГАМК (более светлая кривая) наложены на |с токи, вызванные ко-аппли-кацией ГАМК с фуросемидом. Постоянные времени активации токов (топ) показаны справа от кривых. (Б) Зависимость блока от концентрации фуросемида. Индивидуальные величины, полученные от 6 клеток, нормированы к токам в контроле; сплошная линия -

[Фуросемид! (мМ) [ФуросемчНиМ) уСреДНвННЫв ДЭННЫв,

полученные аппроксимацией уравнением: ЬюкДттп.- l/(l+([FURO]/ ICso)"11), где Ьтк. - ток, вызванный ко-аппликацией ГАМК (2 мкМ) и фуросемида, 1КОИт. — амплитуда стационарного компонента тока в контроле, IC50 - полумаксимальная блокирующая концентрация фуросемида, пн - коэффициент Хилла. Параметры блока: IC50 8.9±0.7 мМ и пд 1.5±0.1. Амплитуду тока измеряли в момент, отмеченный вертикальной пунктирной линией. (В) Соотношение между относительным временем активации (Хоп(блок/топ(контроль)) и концентрацией фуросемида.

Обнаружили, что при поддерживаемом потенциале -70 мВ совместная аппликация ГАМК и фуросемида (1-5 мМ) подавляет ответы на ГАМК дозо-зависимым образом (Рис.16). Эффект фуросемида развивался быстро и был полностью обратим. Преинкубация клетки в растворе фуросемида не влияла ни на кинетику начальной фазы контрольного ответа, ни на величину блока, вызываемого его ко-аппликацией с ГАМК. Эти свойства блока указывают на отсутствие взаимодействия фуросемида с закрытым каналом и позволяют предполагать, что место связывания блокатора находится в канальной поре.

Величина блокирующего эффекта фуросемида возрастала при сдвиге мембранного потенциала в сторону деполяризации (Рис. 17). В концентрации 5 мМ фуросемид подавлял стационарный компонент ГАМК тока на 32.4±1.3%

при -70 мВ и на 76.7±5.0% при +70 мВ. Окончание ко-аппликации ГАМК и фуроеемида сопровождалось кратковременным увеличением входящего тока (хвостовой ток) (Рис. 17А), начало которого совпадало с началом перфузии контрольным раствором. Амплитуда и кинетика хвостового тока зависели от концентрации блокатора и поддерживаемого потенциала (Рис. 17,18).

Рис. 17. Блокада ГАМК-активируемых токов фуросемидом зависит от потенциала. (А) Ответы на 2 мкМ ГАМК при потенциалах -70, -50, -30, -10, 10, 30, 50 и 70 мВ в контроле (слева) и при ко-аппликации с 5 мМ фуроеемида (справа). (Б) Графики зависимости от потенциала контрольных ответов (о), токов, блокированных 5 мМ фуроеемида (о) и хвостового тока (А) (п=4). Ответы нормированы к ответу при -70 мВ в контроле. (В) Анализ блока по модели \Voodhull (пояснения в тексте).

Для анализа потенциалозависимости блока использовали модель, предложенную \Voodhull (1973), позволяющую вычислить фракцию трансмембранного поля, которую заряженная блокирующая частица проходит в канале до достижения места связывания. В соответствии с этой моделью (Рис. 17 В), соотношение амплитуд стационарного компонента ГАМК токов в контроле и в присутствии фуроеемида В (Л=/6локиров//кш,троль) при разных мембранных потенциалах (У) аппроксимировали уравнением (1):

5= 1/1 + ([Блокатор] /АЪ(0))*ехр(г5ГК//?7) (1),

где А"о(0) - константа диссоциации для связывания фуроеемида на ГАМКа рецепторе при потенциале 0 мВ, 6 - величина, отражающая разность потенциалов между внешней стороной мембраны и местом связывания блокатора в долях от трансмембранной разности потенциалов, с - заряд фуроеемида (=-1), F, Я и Т имеют свои стандартные значения. [Блокатор] -концентрация фуроеемида (5 х 10° М). При аппроксимации получили величины .Ко(0)= 5.3±0.3 мМ и 8=0.27±0.03. Величина Кв (-70 мВ) составила 11.7 мМ, что находится в соответствии с величиной, полученной в эксперименте.

Таким образом, наше исследование позволило впервые показать, что фуросемид ингибирует ГАМК токи в клетках Пуркинье по механизму блока открытого канала, а место связывания фуроеемида находится в верхней трети канальной поры (5=0.27).

Д 2 мкМ ГАМК

?,51 9 (1.0 5 0.5 1С

30 70

в -1.0 У<мв)

-1.5

-70 -30 30 70

2.3.2. Угнетение ГАМК-активируемых токов пенициллином Способность вызывать блок открытого канала ГАМКд рецептора была описана для антибиотика пенициллина (Т\уушапп е1 а1., 1992). Однако механизмы взаимодействия пенициллина с канальной порой ГАМКд рецептора изучены недостаточно. В настоящем разделе работы мы исследовали свойства блокады ГАМК-активируемых токов пенициллином в изолированных клетках Пуркинье мозжечка.

Во всех исследованных нейронах (я=46) совместная аппликация ГАМК и пенициллина (0.1-10 мМ) приводила к уменьшению амплитуды ГАМК токов, степень которого возрастала при увеличении концентрации блокатора (Рис. 18 А). При активации рецепторов 5 мкМ ГАМК величина 1С50 для пенициллина составила 1.12±0.12 мМ, коэффициент Хилла - 0.84±0.05 (и=6). Эффект пенициллина развивался быстро и был легко обратим. Присутствие пенициллина в омывающем растворе не влияло на время развития эффекта, что указывает на то, что пенициллин не взаимодействует с закрытым каналом.

Рис. 18. Блокада пенициллином 5 мкМ ГАМК + ПЦН (мМ) ГАМК-активируемых токов в клетках

А —1- -- о Пуркинье мозжечка. (А) Изменения

амплитуды токов, вызываемых аппликацией 5 мкМ ГАМК, при совместной аппликации агониста и возрастающих концентраций

пенициллина (ПЦН). МП -70 мВ. (Б) Кривая зависимости блокирующего действия пенициллина от концентрации, полученная при активации токов 5 мкМ ГАМК.

Величина блока возрастала при увеличении концентрации

0.01 0.1 1 10 [пенициллин] (мМ)

ГАМК (Рис. 19). Так, при мембранном потенциале -70 мВ стационарный компонент ответов на 3 мкМ ГАМК при ко-аппликации с 1 мМ пенициллина уменьшался до 75±6.1% от контроля, ответов на 10 мкМ ГАМК - до 49±2.7%, а ответов, вызываемых 100 мкМ ГАМК, - до 36±6.2% (и=4). Стационарный компонент ответов, вызываемых низкими концентрациями ГАМК (1-2 мкМ) практически не изменялся под действием пенициллина, однако при этом наблюдалось удлинение ответа (Рис. 19 А).

[ГАМК] мкМ

Рис. 19. Зависимость эффектов пенициллина от концентрации ГАМК. (А) Токи, регистрируемые при аппликации разных концентраций ГАМК в контроле (черные кривые) и в присутствии 1 мМ пенициллина (красные кривые). (Б) Кривые доза-ответ для ГАМК в контроле (м) и при совместной аппликации ГАМК с 1 мМ пенициллина (А).

В концентрации 1 мМ пенициллин оказывал двойственное влияние на кривую концентрационной зависимости для ГАМК: он уменьшал амплитуду максимального ответа и сдвигал влево кривую доза-ответ для ГАМК (Рис. 19 Б). В контроле величина ЕС50 для ГАМК составляла 15.5+0.2 мкМ, а при аппликации с пенициллином -6.02+0.21 мкМ (п=4). Такая зависимость блока от концентрации агониста находится в соответствии с блокадой открытого ионного канала.

При деполяризации мембраны величина блока, вызываемого пенициллином, возрастала (Рис. 20). Так, при поддерживаемом потенциале -110 мВ величина блока 1 мМ пенициллина составляла 49±6%, а при потенциале +30 мВ - 87±2%.

Рис. 20. Зависимость эффектов пенициллина от мембранного потенциала. (А) Токи на аппликацию 5 мкМ ГАМК при разных поддерживаемых потенциалах в контроле (левая панель) и при ко-аппликации с 1 мМ пенициллина (ПЦН, правая панель). (Б) Вольтамперные характеристики ответов на ГАМК в контроле (■) и при ко-аппликации с 1 мМ пенициллина (Ж). Амплитуды ответов при разных потенциалах нормированы к амплитуде ответов при -70 мВ. (В) Анализ блока с помощью модели Вудхулл. Показана зависимость величины блока от мембранного потенциала.

Потенциалозависимость блока указывает на то, что место связывания препарата находится в канальной поре. Анализ потенциалозависимости блока с использованием модели Вудхулл (Рис. 20 В, уравнение 1) показал, что величина 5 для молекулы пенициллина составляет 0.39±0.03, а Ко(0)=200±20 мкМ.

5 м»м ГАМК ♦ 1 мМ пцн

После окончания совместной аппликации ГАМК и пенициллина, также как и после аппликации фуросемида, наблюдали появление хвостового тока, амплитуда и кинетика которого зависели от концентрации блокатора и поддерживаемого потенциала (Рис. 18 А, 20 А). Хвостовой ток не регистрировался, когда пенициллин присутствовал в наружном растворе (Рис. 21 Б).

2.3.3. Механизмы блокирующего действия фуросемида и пенициллина Описано два основных механизма канального блока для лиганд-управляемых каналов: «ловушка» и последовательный блок (или "foot-in-the-door"). Канальные блокаторы, действующие по механизму ловушки, позволяют каналу закрываться и агонисту диссоциировать, когда блокатор продолжает быть связанным с каналом. Это приводит к «запиранию» блокатора в канале (Blanpied et al., 1997; MacDonald et al., 1991; Samoilova et al., 1999). В ситуации, когда блокатор заперт в канальной поре, выход из блока происходит только в присутствии агониста. В схеме последовательного блока канал не может закрыться, пока находится в блокированном состоянии (Adams, 1976; Neher and Steinbach, 1978; Neher, 1983; Antonov and Johnson, 1996; Benveniste and Mayer, 1995; Sobolevsky et al., 1999).

Кинетическая схема модели последовательного блока предполагает, что агонист (А) не может диссоциировать от места связывания на рецепторе (R), пока канал находится в открытом состоянии: R+->AR<-»...<->AnR<->AnROXKp.-<->A„^oKHp./oTKp.-Эта схема также предполагает, что переход открытого блокированного канала в закрытое происходит через открытое состояние. В этом случае можно ожидать появления хвостовых токов, развивающихся после отмывания агониста и блокатора. Описанные выше свойства блока каналов ГАМКа рецепторов фуросемидом и пенициллином позволяют предполагать, что механизмом их блокирующего действия является последовательный блок, о чем свидетельствуют: (1) быстрая деблокада, не требующая присутствия агониста, и (2) генерация хвостового тока по окончании ко-аппликации блокаторов с агонистом.

Модель последовательного блока предполагает, что во время генерации хвостового тока агонист находится на рецепторе. Для проверки этого предположения конкурентный блокатор ГАМКа рецепторов бикукуллин апплицировали только во время генерации хвостового тока. Обнаружили, что бикукуллин не влияет ни на кинетику, ни на амплитуду хвостового тока после блокады ответа фуросемидом или пенициллином (Рис. 21 Б), что указывает на то, что бикукуллин не может связываться с рецепторами, участвующими в

генерации этого тока, и позволяет предположить, что ГАМК остается связанной с этими каналами в течение всего времени его генерации. В то время сам пенициллин препятствует развитию хвостового тока (Рис. 21 Б).

А Б Рис. 21. Свойства хвостового тока,

бикукуллин га1ик swu вызванного ко-аппликацией ГАМК и

пенициллина (ПЦН). (А) Бикукуллин, апплицируемый в момент деактивации тока, вызванного 5 мкМ ГАМК, не влияет на кинетику деактивации тока (синяя кривая). (Б) Тот же нейрон. Красная кривая - ответ на ко-аппликацию 5 мкМ ГАМК и 5 мМ ПЦН. Бикукуллин не влияет на хвостовой ток после ко-аппликации ГАМК и ПЦН (синяя кривая), а сам ПЦН блокирует его (зеленая кривая). Для аппликации использовали две пипетки.

Однако эти эксперименты не исключают возможности того, что спад хвостового тока отражает кинетику закрывания открытого, но не связанного с агонистом рецептора, и поэтому связывание конкурентного антагониста не оказывает влияния на этот процесс. Согласно модели последовательного блока открытого канала (Benveniste and Mayer, 1995), временной ход хвостового тока будет зависеть от скорости диссоциации как блокатора, так и агониста, и поэтому должна существовать связь-между. кук'щ^убяма хвостового тока и аффинностью агониста. Это предположение мы проверяли с помощью трех агонистов ГАМКд рецепторов - ß-аланина, ГАМК и мусцимола, аффинность которых определяет временной ход деактивации вызываемых ими токов (Jones et al., 1998).

Рис. 22. Зависимость времени деактивации хвостового тока от аффинности агониста. Для активации ГАМКд рецепторов использовали ß-аланин (Ala), ГАМК и мусцимол. Контрольные ответы - черные кривые, наложенные на них красные кривые - при ко-аппликации с пенициллином (ПЦН). Все записи от одного нейрона. Постоянные времени деактивации тока после ко-аппликации с пенициллином (т) указаны слева от кривых.

Обнаружили, что, в соответствии с

предсказанием модели, время деактивации

хвостового тока было наименьшим при активации

ГАМКд рецепторов агонистом с низкой

аффиннностью - ß-аланином и больше, чем для

, , ГАМК, при активации агонистом с более высокой

2 нА 1 / ,с=142 мс ' г

о.5с \/ аффинностью - мусцимолом (Рис. 22).

i V

♦МЦМ 9

1 мМ Ala/ +1мМ ПЦН

5 мкМ ГАМК / +1мМ ПЦН

Молекулярный механизм, обеспечивающий запирание агониста на рецепторе во время развития блока открытого канала, не ясен, однако этот эффект свидетельствует о тесном сопряжении между конформационными изменениями рецептора во время открывания/блокады и диссоциацией агониста.

Эксперименты с канальными блокаторами, которые предотвращают закрывание канала, могут быть полезными для выявления механизмов гейтинга лиганд-управляемых каналов, включая ГАМКа рецепторы. Полученные нами данные о локализации мест связывания блокаторов позволяют предположить, что области канальной поры, с которыми они взаимодействуют, участвуют в воротном механизме, обеспечивающем открывание/закрывание канала.

2.3.4. Блокада ГАМКа рецепторов нифлумовой кислотой

Описанные выше эффекты фенаматов свидетельствуют о двойственном характере влияния этих препаратов на ГАМК-активируемые токи - они вызывают потенциацию при низких концентрациях и блокаду при более высоких. Наиболее выражены блокирующие эффекты у нифлумовой кислоты (НФК), которые более детально будут описаны в настоящем разделе работы. В большинстве экспериментов анализ свойств блока проводили с использованием протокола «двойного скачка» (Рис. 23 А, Б). Аппликация 1 мМ НФК на фоне активации рецепторов 2 мкМ ГАМК выявила двухфазный характер взаимодействия блокатора с канальной порой: первая фаза блока развивалась в течение нескольких миллисекунд, для развития второй требовались сотни миллисекунд (Рис. 23 А, Б). При сдвиге поддерживаемого потенциала в сторону деполяризации величина блока возрастала. При этом потенциалозависимость быстрого и медленного компонентов блока была различной.

Зависимость блокирующих эффектов НФК от потенциала указывает на локализацию сайтов связывания модулятора в канальной поре. При анализе глубины залегания места связывания блокатора с использованием модели Вудхулл (Рис. 24 В) обнаружено, что для первой фазы блока величина 5= 0.19±0.04 и К(0)=569±47 мкМ. Для поздней фазы блока эти параметры имели величину К(0)=103±61 мкМ, 5=0.72±0.22 (Рис. 24 Г). Различия параметров потенциалозависимости позволяют предполагать, что в канальной поре существует два места связывания НФК, расположенных на разной глубине. Поверхностное место связывания имеет более низкое сродство к НФК, чем более глубокое.

Два предполагаемых места связывания для НФК отличались не только по потенциалочувствительности, но и по характеру взаимодействия с воротным механизмом ГАМКа рецептора. При относительно коротких (250-600 мс)

воздействиях блокатора наблюдалось преимущественно развитие быстрого блока, а прекращение совместной аппликации ГАМК и НФК, так же как и в случае блокады ГАМКа рецепторов фуросемидом и пенициллином, сопровождалось появлением хвостового тока (Рис. 24), что указывает на последовательный механизм блока. В пользу этого свидетельствует и тот факт, что конкурентный антагонист ГАМКд рецепторов габазин не влиял на развитие хвостового тока, а канальный блокатор пенициллин (2 мМ) полностью подавлял его (Рис. 24). Присутствие ГАМК на рецепторе в момент генерации хвостового тока не препятствовало развитию эффектов препаратов, взаимодействующих с бензодиазепиновым сайтом (Рис. 24).

Скад ЕЗ" \\1

—Аппроксимация по№оойЬи1

* 'км«11|Г< МК *н« "гд мк — Аппроксимация по\Voodbul

Рис. 23. Влияние мембранного потенциала на эффекты, вызываемые НФК. (А) Токи на аппликацию 2 мкМ ГАМК и 1мМ НФК на фоне ГАМК при различных мембранных потенциалах (МП) (от -90 до +50 мВ). (Б) Графики зависимости от МП отношений измеренных токов к абсолютному значению тока на 2 мкМ ГАМК при -50 мВ. На графике — относительные амплитуды токов для: 1) ГАМК (красные квадраты), 2) для начальной точки аппликации НФК (зелёные треугольники), 3) для максимальных токов при совместной аппликации ГАМК и НФК (синие треугольники), а также 4) для конечной точки аппликации НФК (голубые ромбы). Измеряемые точки отмечены пронумерованными стрелками на А. (В) Графики зависимости от МП отношений токов в присутствии НФК к току на 2 мкМ ГАМК (синие квадраты). Рассчитаны отношения для токов при ко-аппликации ГАМК и НФК для начальной точки аппликации НФК (зелёные треугольники) и для конечной точки аппликации НФК (голубые кружки). Результаты аппроксимаций по модели \Voodhull — голубая и зелёная кривые, которые отражают соответствующие блоки (медленный и быстрый). (Г) Диаграмма, отражающая параметры быстрого и медленного блока.

Однако следует отметить, что описанный механизм приложим только к начальному компоненту блока, развивающегося при совместной аппликации ГАМК и НФК, длительность которой не превышала 500-600 мс. При более длительных аппликациях или/и при положительных поддерживаемых потенциалах мы наблюдали развитие блока, свойства которого отличались от блока при коротких аппликациях.

Медь является одним из важнейших незаменимых элементов, входящим в состав многих ферментов и участвующим в системе антиоксидантной защиты. Однако при повышении содержания меди, вызванном мутацией, приводящей к снижению концентрации в крови белка-переносчика меди церулоплазмина, развивается заболевание, известное как болезнь Вильсона-Коновалова, сопровождающееся развитием неврологических симптомов, включая брадикинезию, тремор, атаксию и когнитивные нарушения.

Во время синаптической передачи медь высвобождается вместе с медиатором, и ее концентрация в синаптической щели может достигать сотен микромолей. Концентрация свободной меди в нормальных условиях значительно ниже и составляет десятки наномолей. В настоящем разделе работы было исследовано влияние низких (наномолярных) концентраций ионов меди (Си2+) на ГАМК-активируемые токи. Обнаружено, что введение Си2+ в наномолярных концентрациях в перфузирующий раствор приводит к дозо-зависимому и обратимому уменьшению амплитуды ГАМК токов в изолированных клетках Пуркинье. Блок ионами меди обнаруживался уже при концентрации 10 нМ, возрастал при увеличении их концентрации и не зависел от активации ГАМКд рецепторов (Рис. 25 А). Полумаксимальная блокирующая концентрация (1С50) составляла 35±4 нМ, коэффициент Хилла 1.5±0.3 (и=4-8) (Рис. 25 Б). Максимальный блок, достигавшийся при 200 нМ Си2+, составлял 0.68±0.04.

гдмкгмкм +НФА1 мМ

Пенициллин 1 мМ

НФК1мМ

Золпидем 1 мкМ

Габазин 20 мкМ ГАМК 2 мкМ

Рис. 24. Влияние габазина и модуляторов ГАМКд рецепторов на хвостовой ток, возникающий после прекращения совместной аппликации ГАМК и НФК. Слева - суперпозиция ответов на ГАМК+НФК при отмыве контрольным раствором (красная кривая), при отмыве растворами, содержащим габазин (синяя кривая), пенициллин (черная кривая), золпидем (зеленая кривая) или НФК (оранжевая кривая). Справа контрольный ответ на ГАМК.

2.4. Модуляция ГАМКд рецепторов ионами меди и цинка

0.8

о.б

О.

0.4

Рис. 25. Cu2+ блокирует ГАМК токи дозо-зависимым образом. (А) Примеры записей токов на 2 мкМ ГАМК в клетках Пуркинье в контроле (1), в присутствии в перфузирующем растворе 10 нМ Си2+ (2), 50 нМ Си2+(3) и после отмыва Си2+(4)- МП -70 мВ. (Б) Концентрационная зависимость блокирующего эффекта Си2+. Точки на графике -усредненные величины (среднее ± SEM.) для 6 клеток, нормированные к величине тока в контроле.

Время, необходимое для развития блока, зависело от концентрации Си2+ и составляло 0.5-1 мин при концентрации 200 нМ и 5-10 мин при концентрации 10 нМ. Время восстановления ответов на ГАМК после окончания аппликации Си2+ составляло несколько минут. В присутствии 100 нМ Си2+ происходил сдвиг вправо кривой доза-ответ и небольшое снижение амплитуды

максимального тока. Величина ЕС50 для ГАМК возрастала с 7.2±0.4 мкМ в контроле до 12.7±3.4 мкМ в присутствии 100 нМ Си2+ (и=8; р<0.05), что позволяет предположить аллостерический механизм наблюдаемого блока. Эффекты Си2+ не зависели от поддерживаемого потенциала, и потенциал реверсии хлорного тока также не изменялся, что говорит об отсутствии влияния на ионную селективность канала ГАМКа рецептора.

Описываемый блок ГАМКд рецепторов ионами меди легко устранялся при использовании хелаторов ионов металла. Поскольку данный эффект может иметь значение для регуляции этого блока как в нормальных условиях работы мозга, так и при лечении некоторых заболеваний, мы исследовали эффекты хелаторов более детально. Одним из эндогенных хелаторов меди является аминокислота гистидин, которая образует комплексы с Си2+ с высокой константой стабильности (logK=10.4) (O'Sullivan, 1969). Когда 10 мкМ гистидина апплицировали вместе с ГАМК в присутствии 100 нМ Си2+ в перфузирующем растворе, подавленный ответ восстанавливался в течение ~ 5 с (Рис. 26 А). Этот эффект можно было также наблюдать, когда 10-с аппликация гистидина предшествовала активации ГАМКд рецептора и заканчивалась за 1 с до неё (Рис. 26 В). Степень восстановления ГАМК ответов зависела от используемой концентрации хелатора (Рис. 26 Б). Величина ЕС50 для восстановления ответа на ГАМК, блокированного 100 нМ Си2+, составляла для гистидина 0.75±0.05 мкМ, коэффициент Хилла 1.5±0.2 (и=6). Аппликация гистидина в контрольных условиях не влияла на ГАМК ответы. После

однократной аппликации высоких концентраций гистидина в присутствии Си2+ восстановленный ответ со временем снова подавлялся этими ионами (Рис.26 Г). При этом блокада происходила тем быстрее, чем выше была концентрация Си2+

Рис. 26. Гистидин устраняет блок ГАМК токов ионами меди. (А) Ко-аппликация гистидина (His, 10 мкМ) восстанавливает ответ на ГАМК, подавленный 100 нМ Си2. (Б) Концентрационная зависимость восстановления ГАМК тока, подавленного 100 нМ Си2+, под действием 10-с перфузии гистидина. (В) Восстановление ответов на 2 мкМ ГАМК (1 с, раз в 30 с) после пре-аппликации в течение 10 с 10 мкМ гистидина. 100 нМ Си2+ присутствовало в перфузирующем растворе. (Г) Временной ход блокады ГАМК тока при введении в перфузирующий раствор 100 нМ Си2+ (горизонтальная линия) и влияние введения гистидина в интервалах между аппликациями ГАМК в присутствии Си2+ и в контроле. Показана амплитуда ответа на 2 мкМ ГАМК (1с, раз в 30 с). Стрелки — моменты 10-с перфузии 50 мкМ гистидина.

В связи с тем, что хорошо изученным и описанным модулятором ГАМКа рецепторов являются ионы цинка (Zn2+), мы исследовали возможность совпадения мест связывания Си2+ и Zn2+ на ГАМКа рецепторе. В контроле аппликация Zn2+ вместе с 2 мкМ ГАМК вызывала дозо-зависимое подавление ответа с IC50 36±5 мкМ и коэффициентом Хилла 1±0.2 (п=5) (Рис. 27 А,Б). Введение в перфузирующий раствор 100 нМ Си2+, вызывавшее уменьшение амплитуды ГАМК тока примерно на 40%, заметно изменяло кривую доза-ответ для Zn2+ (Рис. 27 Б). Угнетение ГАМК тока цинком не только заметно ослаблялось в присутствии Си2+, но при концентрации Zn2+ 10 и 30 мкМ амплитуда ответа была больше, чем в присутствии только Си2+ (Рис. 27 А,В), в связи с чем кривая доза-ответ для цинка носила двухфазный характер. Предположив, что ионы цинка ослабляют ингибирующее действие Си2+, исследовали влияние пре-аппликации Zn2+ на угнетение ГАМК ответов, вызванное Си2+. В контроле пре-аппликация 10-300 мкМ Zn2+ в течение 10 с не влияла на амплитуду последующего ответа на ГАМК. Когда же ГАМК ответы были подавлены в присутствии 100 нМ Си2+, такая же пре-аппликация, в отличие от угнетающих эффектов ко-аппликации, вызывала увеличение амплитуды ГАМК ответа. Усиление ответов на ГАМК

ГАМК 2 мкМ + His 10 мкМ

"1 Г

-»-His

0.2 1

10 50

10 мкМ His Юс

Г ) г ) f

и »

0.5 НА 2с

0.5

0.1 мкМ Cua* в перфуз. р-ре

50 мкМ His

Т Г т т

оаР"воое

10 15 20 время (мин)

было связано с вытеснением Си2+ из рецепторной молекулы, поскольку при устранении вызываемого медью блока гистидином пре-аппликация Zn2+ уже не вызывала дальнейшего роста ГАМК тока.

Рис. 27. Блокирующие эффекты Си2+ и Zn неаддитивны. (А) Примеры блокады тока на 2 мкМ ГАМК при ко-аппликации с возрастающими концентрациями Zn2+ в контроле. (Б) Концентрационные зависимости эффектов цинка в контроле (о) и в присутствии 100 нМ Си2+ (•). Данные нормированы к ответам на 2 мкМ ГАМК в контроле (л=6). (В) Записи токов на ГАМК и ГАМК+Zn2* в присутствии 100 нМ Си2+. Аппликации ГАМК обозначены тонкими линиями, ко-аппликации с Zn2+ — заштрихованными прямоугольниками. После ко-аппликации ГАМК и 100 мкМ Zn2+ наблюдалось частичное снятие блока, вызываемого Си2+.

Полученные данные позволяют предположить, что ингибирующие эффекты Си2+ и Zn2+ являются результатом взаимодействия этих ионов с различными, но конформационно связанными сайтами на ГАМКд канал-рецепторном комплексе. Описанный высокоаффинный блок ГАМКа рецепторов ионами меди был обнаружен впервые. Хотя блок развивался медленно и был трудно обратим, он легко снимался хелаторами двухвалентных катионов, что свидетельствует о локализации места связывания Си2+ на экстраклеточном домене рецептора. Высокоаффинное место связывания для Си2+ может участвовать в регуляции уровня тонического торможения в условиях нормального функционирования мозга. Степень угнетения активности ГАМКд рецепторов ионами меди будет определяться как концентрацией свободной меди, так и наличием и концентрацией эндогенных хелаторов и ионов цинка. Кроме того, описанное ингибирование ГАМКд рецепторов ионами меди может вносить вклад в неврологические симптомы при болезни Вильсона-Коновалова. Терапевтические эффекты хелатирующих агентов и ионов цинка, используемых для лечения этого заболевания, частично могут быть связаны со снятием блокады ГАМКд рецепторов, вызываемой ионами меди.

3. Исследование свойств пуринорецепторов Р2Х

Среди лиганд-управляемых каналов, экспрессирующихся в центральных нейронах, ионотропные пуринорецепторы (Р2Х) изучены в наименьшей степени. Несмотря на то, что экспрессию этих рецепторов наблюдают в разных

Д Перфуэирующий р-р без Си*

3 10 30 100 мкМ Zn:*

1 Г 1 г \ г* с \ Г * '

¡Mi I \ i W Чо.е.

! U ^

В В пврфузирующам р-ре 0.1 мкМ Си*

3 10 30 t00 мкМ Zn"

3 10 30 100 [Zn''] (мкМ)

Г 1 г\ г

структурах мозга, из всех исследовавшихся нами типов нейронов вызываемые аппликацией АТФ токи нам удалость зарегистрировать только в нейронах, изолированных из туберомамиллярного (ТМ) ядра.

Активность гистаминергических клеток ТМ ядра заднего гипоталамуса тесно связана с уровнем бодрствования (Lin et al., 1988). Поскольку гомеостатическая теория сна рассматривает снижение уровня АТФ и аккумуляцию аденозина в мозге в качестве одного из факторов развития этого состояния (Huston et al., 1996; Arrigoni et al., 2001), исследование свойств рецепторов АТФ в структуре, регулирующей состояние бодрствования, представляет интерес для понимания механизмов этого процесса.

3.1.Фармакологические свойства и субъединичный состав Р2Хрецепторов в

ТМ нейронах

Р2Х рецепторы представляют собой катион-селективные каналы, которые практически в равной степени проницаемы для ионов Na+ и К+ и имеют значительную проницаемость для Са2+ (Evans et al., 1996; Samways et al., 2013). P2X рецепторы являются тетрамерами, свойства которых определяются разной комбинацией семи субъединиц (P2Xi-7) (North and Surprenant, 2000; Browne et al., 2010). Используя селективные агонисты, антагонисты и модуляторы пурин'орецепторов и анализ субъединичного состава этих рецепторов с помощью метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией от одной клетки (single-cell RT-PCR - scRT PCR), мы провели структурно-функциональный анализ Р2Х рецепторов -в идентифицированных гистаминергических нейронах. Опыты проводили на нейронах, изолированных из срезов гипоталамуса крыс в возрасте 18-25 дней. Все нейроны, изолированные из вентрального ТМ ядра (л=69), при поддерживаемом потенциале -60 мВ отвечали на аппликацию АТФ в концентрации от 3 мкМ до 1 мМ быстрым недесенситизирующимся током (ЕС5о=54.0±1.6 мкМ .и коэффициент Хилла Пн=1.6±0.07, и=15) и не отвечали на уридиндифосфат, что указывает на активацию Р2Х пуринорецепторов.

При анализе субъединиц Р2Х рецептора, экспрессирующихся в отдельных нейронах, один или несколько типов субъединиц Р2Х рецепторов были выявлены в 17 из 35 нейронов (Рис. 28). Все PCR-позитивные нейроны экспрессировали субъединицу Р2Х2, а рецептор Р2Х7 никогда не выявлялся в отдельном нейроне. Другие субъединицы Р2Х рецептора были выявлены менее чем в 35% клеток.

Рис. 28. Паттерн экспрессии семи субъединиц Р2Х рецептора в ТМ ядре и отдельном нейроне. (А)

Микрофотография гистаминерги-

ческого ТМ нейрона (слева, масштаб 20 мкм), идентифицированного на основании экспрессии гистидин-декарбоксилазы (Н), и окрашенные этидиумом бромидом агарозные гели, демонстрирующие экспрессию Р2Х субъединиц в целом ТМ ядре (положительный контроль — ТМ, whole) и отдельном типичном нейроне. М - маркер молекулярных размеров, шкала 100 b.p.(base pairs), 500 b.p. -наиболее интенсивно окрашенная ' 10 5М,00° линия. Цифры над фото - номера

субъединиц. (Б) Ответы на АТФ в этом нейроне при МП -60 мВ и кривая доза-ответ (В). Пиковые амплитуды токов нормированы к амплитуде максимального ответа, ЕС.ю 61 мкМ и коэффициент Хилла 1.96.

Для выявления различных функциональных субпопуляций Р2Х рецепторов в соме ТМ нейронов мы протестировали агонисты и антагонисты, обладающие селективностью к подтипам рецепторов. Селективный агонист гомомерных Р2Х1, Р2ХЗ и гетеромерных Р2Х2/3 рецепторов aß-meATP в концентрации до 300 мкМ не вызывал никаких токов в ТМ нейронах (и=3), что указывает на отсутствие рецепторов с таким субъединичным составом в ТМ нейронах. Обнаруженная сходная эффективность АТФ и 2-метилтиоАТФ (2MeSATP) в активации Р2Х рецепторов в ТМ нейронах делает маловероятным наличие Р2Х4 (Jones et al., 2000).

Во всех нейронах ответы на АТФ блокировались сурамином (1С5О=4.2±0.3 мкМ) и PPADS (1 мкМ, блок ~50%), в то время как в гетерологичных системах Р2Х4 рецепторы и Р2Х6 рецепторы нечувствительны или слабо чувствительны к этим блокаторам в концентрации 100 мкМ (Khakh et al., 2001), что указывает на отсутствие функциональных гомомерных Р2Х4 или Р2Х6 рецепторов в соме ТМ нейронов. Относительно слабая чувствительность АТФ ответов к селективному антагонисту Р2Х2/3 рецепторов TNP-ATP (1С50=7.1±0.5 мкМ) позволяет исключить формирование этих гетеромеров.

Показано, что активность Р2Х2 рецепторов усиливается в условиях закисления наружной среды (Ding and Sachs, 1999). В отличие от этого, Р2Х1, Р2ХЗ и Р2Х4 рецепторы угнетаются при снижении pH (Stoop et al., 1997). Мы обнаружили, что закисление наружного раствора до величины pH 6.6 вызывает увеличение АТФ-индуцируемых токов на 179±29% (и=5).

Таким образом, проведенный анализ фармакологических свойств АТФ ответов ТМ нейронов указывает на преимущественное участие Р2Х2 рецепторов в генерации АТФ-активируемых токов.

3.2. Модуляция А ТФ-активируемых токов ионами цинка

Ответы, опосредуемые Р2Х рецепторами, модулируются двухвалентными катионами, среди которых особое место занимают ионы цинка, поскольку они высвобождаются из пресинаптических терминалей, что позволяет предполагать функциональное значение модуляторных эффектов этих ионов. Данных о модулирующем действии цинка на нативные Р2Х рецепторы в ЦНС в литературе нет. В нашем исследовании во всех зарегистрированных ТМ нейронах (я=59) токи, вызываемые аппликацией АТФ, модулировались цинком, при этом величина и направленность наблюдаемых эффектов зависели от концентрации как агониста, так и модулятора (Рис1. 29). При активации Р2Х рецепторов низкими концентрациями АТФ (10-30 мкМ) зависимость эффектов цинка от концентрации была колоколообразной: 2п2+ вызывал потенциацию в концентрации 3-30 мкМ и ингибирование при более высоких концентрациях (Рис. 29 А). Ко-аппликация 10 или 30 мкМ АТФ и 30 мкМ Ъх?* вызывала максимальную потенциацию (до 11 раз для 10 мкМ АТФ и до 3.3 раз для 30 мкМ АТФ). Величина ЕС50 для цинка составляла 14±1.3 мкМ для ответов на 10 мкМ АТФ (и=6) и 5.4±2.1 мкМ для 30 мкМ АТФ (и=3). В отличие от сильной потенциации ответов на 10 и 30 мкМ АТФ, Zn2+ оказывал преимущественно ингибирующее действие при активации токов 300 мкМ АТФ (1С50 178±23 мкМ, и=5) (Рис. 29 В-Д).

В концентрациях 5 и 50 мкм цинк вызывал параллельный сдвиг влево кривой доза-ответ для АТФ без изменений величины максимального ответа. В контроле величина ЕС50 для АТФ составляла 48.8±1.5 мкМ, а при ко-аппликации с 5 и 50 мкМ цинка величина ЕС50 снижалась до 15.0±0.5 и 4.8+2.4 мкМ, соответственно (п=7; /><0.01). При концентрации 1000 мкМ, цинк повышал кажущуюся аффинность для АТФ (ЕС50 24.7+1.5 мкМ, л=4; р<0.01), но уменьшал максимальный ответ до 0.42±0.01 от контроля (и=4).

Полученные данные свидетельствуют о том, что цинк является эффективным модулятором нативных Р2Х рецепторов в ТМ нейронах, который может усиливать ответ на микромолярные концентрации АТФ до величины, вызываемой его насыщающей концентрацией. Учитывая тот факт, что во время нейрональной активности концентрация цинка во внеклеточном пространстве может достигать сотен микромолей, мы полагаем, что он может выступать в качестве физиологического регулятора взаимодействия АТФ с Р2Х рецепторами в нейронах гипоталамуса.

10 мсМАТ«+0.3,10и ff

ЮиМАТФЧОО» Э00»М2п*

ъс

Рис. 29. Модуляция АТФ-активируемых токов ионами цинка. (А) Токи, вызываемые 1-е аппликацией 10 мкМ АТФ в контроле (верхняя кривая) и при ко-аппликации с возрастающими концентрациями Zn^L*. (Б) Сравнение токов, вызванных 1 мМ АТФ, с токами в ответ на ко-аппликацию 10, 30, 300 мкМ АТФ и гп2*. (В) Модуляция АТФ-активируемых токов под действием 1 мМ Zn2+. (Г) Концентрационные зависимости для модуляции цинком токов, вызванных 10 (•), 30 (о) и 300 (■) мкМ АТФ. Пунктирная линия - экстраполяция кривой для потенцирующего эффекта цинка ответов на 10 мкМ АТФ. (Д) Те же данные, что на Г, нормированные к ответу на 1 мМ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное электрофизиологическое исследование свойств нативных ионотропных рецепторов, экспрессирующихся в нейронах головного мозга, позволило выявить особенности этих рецепторов в разных типах нейронов и раскрыть механизмы их модуляции рядом физиологически активных веществ, многие из которых имеют клиническое значение. Было проведено детальное исследование фармакологических свойств и особенностей функционирования ионотропных рецепторов, относящихся к трем основным классам лиганд-управляемых каналов - ионотропных рецепторов глутамата, ГАМКд рецепторов и пуринорецепторов Р2Х типа.

Одним из наиболее важных свойств глутаматных рецепторов NMDA типа, обнаруженных нами, является модуляция активности NMDA рецепторов гистамином. Это свойство NMDA рецепторов может играть важную роль в регуляции возбудимости и пластических свойств синаптической передачи в связи с участием гистаминергической системы мозга в регуляции цикла сон-бодрствование, циркадных ритмов, обучении и памяти.

Изучение блокады каналов NMDA рецептора такрином, каналов ГАМКа рецептора фуросемидом, пенициллином и нифлуматом показало, что связывание этих препаратов с открытым каналом рецепторов предотвращает их закрывание и препятствует диссоциации молекулы агониста. Эти наблюдения указывают на тесную связь процессов связывания агониста и открывания/закрывания канала и являются экспериментальным подтверждением теоретического предположения о том, что всякая открытая

конформация канала (как связанная, так и не связанная с наличием блокатора в поре канала) удерживает агонист на рецепторе, и лишь при переходе канала в закрытое состояние происходит диссоциация агониста. Таким образом, исследования с использованием канальных блокаторов позволяют изучать механизмы сопряжения связывания агониста с открыванием ионного канала, что является ключевой проблемой в исследовании функционирования лиганд-управляемых ионных каналов.

Исследование взаимодействия фуросемида и пенициллина с каналом ГАМКд рецептора указывает на то, что при связывании этих блокаторов происходит взаимодействие с воротным механизмом канала, препятствующее его зарыванию.

Детальное исследование эффектов фенаматов показало, что эти препараты могут взаимодействовать с ГАМКд рецепторами и модулировать их активность, вызывая потенциацию или угнетение активности ГАМКд ионофора в зависимости от соотношения концентрации агониста и модулятора. Концентрации фенаматов, вызывающие потенцирующий эффект, сопоставимы с теми, которые достигаются в мозге при их клиническом использовании, что позволяет объяснить некоторые терапевтические эффекты этих препаратов, не связанные с их способностью угнетать синтез простагландинов. Обнаруженные свойства фенаматов могут служить экспериментальным обоснованием для разработки на их основе новых фармакологических препаратов для лечения острых и хронических заболеваний ЦНС, связанных с нарушением функции тормозной системы.

Модуляторами многих лиганд-управляемых ионных каналов являются ионы переходных металлов - меди и цинка. Наши исследования показали, что ионы цинка являются эффективными модуляторами пуринорецепторов Р2Х"в гистаминергических нейронах туберомамиллярного ядра. Мы обнаружили, что характер модуляции этих рецепторов ионами цинка зависит как от концентрации ионов металла, так и от степени активации самого рецептора.

Обнаруженное нами угнетение ГАМКд рецепторов наномолярными концентрациями ионов меди и устранение его хелаторами ионов двухвалентных металлов позволяет предположить, что в условиях нормального функционирования мозга ГАМКд рецепторы находятся в условиях тонического угнетения ионами меди, уровень которого может определяться не только концентрацией самой меди, но и наличием и концентрацией эндогенных хелаторов, таких как аминокислота гистидин. Описанный блок ГАМКд рецепторов может вносить вклад в неврологические симптомы при болезни Вильсона-Коновалова, а терапевтические эффекты хелатирующих агентов и

цинка, используемых для лечения этого заболевания, частично могут быть связаны со снятием блокады ГАМКд рецепторов.

Таким образом, исследование свойств и принципов функционирования лиганд-управляемых каналов с использованием электрофизиологических методов, в отличие от других методов их исследования (биохимических, иммунохимических), выявляет характер и динамику взаимодействия того или иного препарата с мишенью с учетом «контекста» этих взаимоотношений и свидетельствует о том, что эффекты и механизмы действия модуляторов определяются совокупностью факторов - концентрацией модулятора, длительностью его воздействия и состоянием мишени (уровень активации рецептора, мембранный потенциал, степень десенситизации и другие факторы).

Разнообразие типов и изоформ лиганд-управляемых каналов, выявленное в последние десятилетия благодаря достижениям молекулярной биологии, сделало актуальной задачу понимания роли этого разнообразия для функционирования нервной системы. Решение этой задачи невозможно без детального исследования типов и изоформ лиганд-управляемых каналов в разных популяциях нейронов и выявления функциональных свойств этих каналов. Проведенное в настоящей работе электрофизиологическое исследование свойств нативных ионотропных рецепторов глутамата позволило обнаружить их особенности в разных типах нейронов головного мозга и выявить механизмы их модуляции некоторыми физиологическими активными веществами, что имеет значение не только для выяснения роли этих особенностей в работе мозга в целом, но и для поиска способов избирательного воздействия на те или иные функциональные типы рецепторов.

Поскольку эффективность синаптической передачи в значительной мере определяется функциональными свойствами постсинаптических рецепторов, а также изменениями их активности под действием различных модуляторов, полученные в настоящей работе новые данные о строении, механизмах функционирования и регуляции работы лиганд-управляемых ионных каналов имеют значение для понимания принципов обработки информации в мозге в целом.

ВЫВОДЫ

1. В пирамидных нейронах поля CAI гиппокампа нейромедиатор гистамин в диапазоне концентраций 0.5-100 мкМ вызывает потенциацию токов, связанных с активацией глутаматных рецепторов NMDA типа, которая не опосредуется известными рецепторами гистамина и системами вторичных посредников, а является результатом его взаимодействия с полиаминовым сайтом NMDA рецептора.

2. Нейропротектор такрин вызывает потенциалозависимую блокаду открытых каналов NMDA рецептора по механизму последовательного блока, при котором блокатор препятствует закрыванию канала, а возвращение канала в закрытое состояние после диссоциации блокатора Происходит через открытое состояние канала.

3. Вольтамперные характеристики и проницаемость для ионов кальция АМРА рецепторов в нейронах разного типа тесно коррелируют с чувствительностью к препарату ИЕМ-1460, блокирующему АМРА рецепторы, не содержащие субъединицу GluA2. Блокада этим препаратом проницаемых для кальция АМРА рецепторов в гигантских интернейронах стриатума свидетельствует об отсутствии в их составе субъединицы GluA2, тогда как нечувствительность к нему непроницаемых для кальция АМРА рецепторов в клетках Пуркинье мозжечка и проекционных нейронах стриатума - о наличии GluA2 в составе этих рецепторов.

4. Глутаматные рецепторы АМРА типа в гигантских интернейронах стриатума образованы субъединицами в flop сплайс-варианте, а в проекционных нейронах преимущественно в flip форме, о чем свидетельствуют результаты исследования чувствительности АМРА рецепторов к циклотипазиду, дискриминрующему flip и flop сплайс-варианты субъединиц АМРА рецептора, в сочетании с анализом мРНК в отдельном нейроне.

5. ГАМКд рецепторы имеют высокоаффинный сайт связывания ионов меди, наномолярные концентрации которых вызывают ингибирование ответов на ГАМК с медленной кинетикой их восстановления, причем это ингибирование быстро устраняется хелатирующими субстанциями. Ионы меди и цинка взаимодействуют с конформационно связанными сайтами на ГАМКа канал-рецепторном комплексе, о чем свидетельствует ослабление ионами цинка угнетения ГАМК тока, вызываемого ионами меди.

6. В зависимости от соотношения концентраций агониста и модулятора нестероидные противовоспалительные средства из группы фенаматов могут вызывать как потенциацию, так и угнетение активности ГАМКд рецепторов. Потенциация ГАМКд рецепторов может происходить в отсутствие активации рецептора, что указывает на локализацию вне канальной поры места связывания фенаматов, опосредующего усиление функции рецептора. Угнетение ГАМКд рецепторов фенаматами связано с блокадой канальной поры. Наряду с этим, фенаматы удлиняют время деактивации токов, вызываемых ГАМК, и время спада тормозных постсинаптических токов.

7. Диуретик фуросемид, антибиотик пенициллин и нестероидное противовоспалительное средство нифлумовая кислота потенциалозависимым образом блокируют каналы ГАМКд рецепторов по механизму

последовательного блока - связывание этих препаратов с открытым каналом ГАМКд рецептора предотвращает его закрывание и препятствует диссоциации молекулы агониста. Выявлена локализация сайтов связывания этих блокаторов в ^канальной поре. Эти данные расширяют представления о функциональной архитектуре ГАМКд каналов и механизмах сопряжения связывания агониста с открыванием канальной поры.

8. Анализ фармакологических свойств АТФ-активируемых токов в гистаминергических нейронах туберомамиллярного ядра указывает на то, что основным типом ионотропных пуринорецепторов, локализованных в этих нейронах, являются гомомерные Р2Х2 рецепторы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ СТАТЕЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Воробьев В.С, Шаронова И.Н., Ходоров Б.И., Скребицкий В.Г. Потенциалозависимая блокада NMDA канала изолированного гиппокампального нейрона этилизопропиламилоридом // Биологические мембраны. 1992. Т. 9. № 10-11. С. 1059-1062.

2. Воробьев В.С, Шаронова И.Н., Ходоров Б.И. Ферроцианид - новый блокатор NMDA рецепторов в нейрональных мембранах // Биологические мембраны. 1992. Т. 9. № 10-11. С. 1062-1064.

3. Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Walsh I.B., Haas H.L. Histamine potentiates N-methyl-D-aspartate responses in acutely isolated hippocampal neurons // Neuron. 1993. V. 11. P. 837-844.

4. Vorobjev V.S., Sharonova I.N. Tetrahydroaminoacridine blocks and prolongs NMDA receptor-mediated responses in a voltage-dependent manner // Eur. J. Pharmacol. 1994. V. 253. N 1-2. P. 1-8.

5. Haas H.L., Sergueeva O.A., Vorobjev V.S., Sharonova I.N. Subcortical modulation of synaptic plasticity in the hippocampus // Behav. Brain Res. 1995. V. 66. N 1-2. P. 41-44.

6. Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Skrebitsky V.G., Schneider H.H., Stephens D.N. Abecarnil enhances GABA-induced currents in acutely isolated cerebellar Purkinje cells // Neuropharmacology. 1995. V. 34. N 2. P. 157-163.

7. Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Haas H.L. A simple perfusion system for patch-clamp studies // J. Neurosci. Methods. 1996. V. 68. N 2. P. 303-307.

8. Sharonova I.N., Vorobjev V.S., Skrebitsky V., Haas H.L. Histamine and NMDA-receptors in the hippocampus: polyamines and intracellular binding site // Inflammation. Res. 1996. V. 45, Supplement 1. S58-59.

9. Sharonova I.N., Vorobjev V.S., Haas H.L. High-affinity copper block of GABA(A) receptor-mediated currents in acutely isolated cerebellar Purkinje cells of the rat // Eur. J. Neurosci. 1998. V. 10. N2. P. 522-528.

10. Buldakova S.L., Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Samoilova M.V., Magazanik L.G. Characterization of AMPA receptor populations in rat brain cells by the use of subunit-specific open channel blocking drug, IEM-1460 // Brain Res. 1999. V. 846. N 1. P. 52-58.

11. Samoilova M.V., Buldakova S.L., Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Magazanik L.G. The open channel blocking drug, IEM-1460, reveals functionally distinct alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptors in rat brain neurons // Neuroscience. 1999. V. 94. N1. P. 261-268.

12. Колбаев C.H., Шаронова И.Н., Воробьев B.C., Скребицкий В.Г. Механизмы модуляции такрином ГАМК-активируемых токов в изолированных нейронах мозжечка // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1999. Т. 127. № 5. С. 539-542.

13. Sharonova I.N., Vorobjev V.S., Haas H.L. Interaction between copper and zinc at GABA(A) receptors in acutely isolated cerebellar Purkinje cells of the rat // Br. J. Pharmacol. 2000. V. 130. N4. P. 851-856.

14. Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Haas H.L., Sergeeva O.A. Differential modulation of AMPA receptors by cyclothiazide in two types of striatal neurons // Eur. J. Neurosci. 2000. V. 12. N 8. P. 2871-2880.

15 Kolbaev S.N., Sharonova I.N., Vorobjev V.S., Skrebitsky V.G. Mechanisms of GABA(A) receptor blockade by millimolar concentrations of furosemide in isolated rat Purkinje cells // Neuropharmacology. 2002. V. 42. N7. P. 913-921.

16. Isaev N.K., Stelmashook E.V., Dirnagl U., Andreeva N.A., Manuhova L., Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Skrebitsky V.G., Victorov I.V., Katchanov J., Weih M., Zorov D.B. Neuroprotective effects of the antifungal drug clotrimazole // Neuroscience. 2002. V. 113. N1. P. 47-53.

17. Sergeeva O.A., Eriksson K.S., Sharonova I.N., Vorobjev V.S., Haas H.L. GABA(A) receptor heterogeneity in histaminergic neurons // Eur. J. Neurosci. 2002. V. 16. 1472-1482.

18. Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Haas H.L., Sergeeva O.A. Expression and function of P2X purinoceptors in rat histaminergic neurons // Br. J. Pharmacol. 2003. V.138. N 5. P. 1013-1019.

19. Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Sergeeva O.A., Haas H.L. Modulation of ATP-induced currents by zinc in acutely isolated hypothalamic neurons of the rat // Br. J. Pharmacol. 2003. V.139. N5. P. 919-926.

20. Шаронова И.Н., Воробьев B.C., Скребицкий В.Г., Галенко-Ярошевский А.П., Туровая А.Ю., Анисимова В.А. Потенциация ГАМК-активируемых токов производным имидазобензимидазола РУ-353 в изолированных клетках Пуркинье мозжечка. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2005. Т. 140. №9. С. 311-315.

21. Шаронова И.Н., Дворжак А.Ю., Воробьев B.C. Гадолиний блокирует протон-активируемые токи в изолированных клетках Пуркинье мозжечка. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2008. Т. 145. №3. С. 275-279.

22. Шаронова И.Н., Дворжак А.Ю. Блокада канала ГАМКд рецепторов нифлумовой кислотой препятствует диссоциации агониста // Биологические мембраны. 2012. Т. 29. №6. С. 414-421.

23. Bukanova J.V., Sharonova I.N., Skrebitsky V.G. Amyloid (3 peptide (25-35) in picomolar concentrations modulates the function of glycine receptors in rat hippocampal pyramidal neurons through interaction with extracellular site(s) // Brain Res. 2014. V. 1558. P. 1-10.

24. Rossokhin A.V., Sharonova I.N., Bukanova J.V., Kolbaev S.N., Skrebitsky V.G. Block of GABAa receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights towards the mechanism // Molecular and Cellular Neuroscience. 2014. V. 63. P. 72-82.

Тезисы докладов и статьи в сборниках

1. Haas Н. L„ Sharonova L N., Stevens, D. R., Uteshev V., Vorobjev V. S„ Walsh I. В. Histamine modulates NMDA-currents in hippocampus // SFN Abstracts. 1993. V. 19. P. 1531.

2. Haas H.L., Sharonova I.N., Luhmann H.L., Vorobjev V.S. Modulation of GABA-activated currents by redox reagents in in cereballar Purkinje cells may be related to their chelating properties // SFN Abstracts. 1996. V. 22. N 1-3. P. 339.

3. Skrebitsky V.G., Kolbaev S.N., Sharonova I.N., Vorobjev V.S. Lanthanum modulation of GABAa receptor-mediated currents in acutely isolated cerebellar Purkinje cells of the rat // Europ. J. Neurosci. 2000. V. 12. Suppl. 11. P. 41.

4. Skrebitsky V.G., Kolbaev S.N., Kozhemiakin M.B., Sharonova I.N. Lanthanum-induced modulation of GABA-gated currents in rat brain isolated neurons and slice preparation // SFN 30th Annual Meeting, New Orleans, 2000. Presentation Number 500.10.

5. Sergeeva O.A., Sharonova I.N., Vorobjev V.S., Eriksson K.S., Haas H.L. GABA potency and expression patterns of GABAa receptor subunits in rat histaminergic neurons. // SFN 31th Annual Meeting, San Diego, 2001. Presentation Number 490.2.

6. Skrebitsky V.G., Kolbaev S.N., Sharonova I.N. , Draghum A. Comparison of GABA-A receptor properties in acutely dissociated Purkinje cells and striatal interneurons II Abstracts of the 3d FENS Forum, Paris. 2002. FENS Abstr. Vol 1. A011.15.

7. Skrebitsky V.G., Kolbaev S.N., Sharonova I.N. Cell type-specific differences in pharmacological properties of GABAa receptors // SFN 32th Annual Meeting, Orlando, 2002. Presentation Number 117.10.

8. Колбаев C.H., Шаронова И.Н., Скребицкий В.Г. Кинетика блокады каналов ГАМКд рецепторов фуросемидом // В сб. «Пластичность и структурно-функциональная взаимосвязь коры и подкорковых образований», Москва, 2003. С. 46.

9. Колбаев С.Н Шаронова И.Н., Соколова С.Н., Скребицкий В.Г. Различия чувствительности к фуросемиду ГАМКд рецепторов в нейронах мозжечка и стриатума // Там же, С. 47.

10. Шаронова И.Н., Воробьев B.C. Функциональные свойства пуринорецепторов в гистаминергических нейронах крысы // Там же, С. 54.

11. Amberger В., Sergeeva О.А., Erikkson K.S., Chepkova A.N., Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Haas H. Expression of NCKX but not NCK correlated with the kinetics of glutamate responses and expression of AMPA receptors in rat histaminergic neurons. Proceedings of the 29th Gottingen Neurobiology Conference, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 2003. P. 824.

12. Воробьев B.C., Шаронова И.Н. Механизмы модуляция цинком токов, вызываемых АТФ, в изолированных нейронах гипоталамуса // Материалы международной конференции «Проблемы интеграция функций в физиологии и медицине. Минск,15-16 июня 2004. с. 74-75.

13. Колбаев С.Н, Шаронова И.Н. Механизмы действия неконкурентных блокаторов ГАМКд рецепторов // Рос. Физиол. журн. 2004. Т. 90. №8. С. 161-162.

14. Воробьев B.C., Колбаев С.Н., Шаронова И.Н. Влияние нифлюмовой кислоты на активность ГАМКд рецепторов клеток Пуркинье мозжечка // В сб.: Материалы Всероссийской конференции «Механизмы синаптической передачи», М. 2004. С. 26.

15. Сергеева О.А., Андреева Н.А., Шаронова И.Н., Чепкова А.Н, Воробьев B.C., Хаас Х.Л. Молекулярные корреляты чувствительности к ГАМК и пропофолу гипоталамических нейронов, участвующих в регуляции цикла сон-бодрствование // Там же. С.84.

16. Skrebitsky V.G., Kolbaev S.N., Sharonova I.N. Functional heterogeneity of GABAa receptors in different types of central neurons // FENS Abstr., Vol. 2. A080.10, 2004.

17. Skrebitsky V.G., Kolbaev S.N., Chechulina A.A., Sharonova I.N. GABAa receptor properties in different types of central neurons // SFN 34th Annual Meeting, San-Diego. 2004. Presentation Number 625.6.

18. Воробьев B.C., Шаронова И.Н. Взаимодействие мефенамовой кислоты с ГАМКд рецепторами клеток Пуркинье мозжечка // В сборнике: «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Материалы международной конференции). Пущино. 2005. С. 117-120.

19. Воробьев B.C., Дворжак Ю.А., Шаронова И.Н. Механизмы блокады ГАМКд рецепторов пенициллином // Научные труды I Съезда физиологов СНГ, Сочи, Дагомыс, 1923 сентября 2005 г. Т. 1, С. 50-51.

20. Шаронова И.Н., Воробьев B.C., Соколова С.Н. Механизмы взаимодействия неконкурентных блокаторов с ГАМКд рецепторами //Там же. С. 53.

21. Воробьев B.C., Шаронова И.Н., Соколова С.Н. Пенициллин как инструмент для изучения свойств ГАМКд рецепторов // В Сб. «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга», М., 2005, С. 98-101.

22. Skrebitsky V.G., Vorobjev V.S., Sharonova I.N. Multiple action of mefenamic acid on GABAA receptor channels in cerebellar Purkinje cells // 35th SFN Meeting, Washington, 2005. Presentation Number 956.8.

23. Sharonova I.N. Vorobjev V.S., Kolbaev S.N., Kozhemyakin M.B., Skrebitsky V.G. Electrophysiological characteristics of single neuron responses to anxiolitic drugs in different brain structures // Eur. Neuropsychopharm. 2005., V.15. Suppl.2. S153-154.

24. Шаронова И.Н., Воробьев B.C., Дворжак А.Ю. Несгероидные противовоспалительные средства как модуляторы ГАМКд рецепторов центральных нейронов // В сб. Материалов Второго Международного Междисциплинарного Конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым, Украина. 2006. С. 182-184.

25. Dvorzhak A.Y., Vorobjev V.S.; Sharonova I.N. Potentiation, blockade and activation of GABAa receptors by fenamates in cerebellar Purkinje cells // In: International Symposium "Hippocampus and Memory", Pushchino. 2006. P. 69.

26. Sharonova I.N., Vorobjev V.S. Blockers of ion channels as a tool for study of GABAa receptor channel gating // In: International Symposium "Hippocampus and Memory", Pushchino. 2006. P. 104.

27. Sharonova I. N., Vorobjev V. S., Dvorzhak A. Y. Two different modes of niflumic acid action at GABAA receptors in cerebellar Purkinje neurons // 5th FENS Forum Abstracts, V. 3. A221.15, Vienna, 2006.

28. Skrebitsky V. G., Vorobjev V. S., Dvorzhak A. Y., Sharonova I. N. The nonsteroidal antiinflammatory drug mefenamic acid slows deactivation of GABA receptors in the rat cerebellar Purkinje neurons // 5th FENS Forum Abstracts. V. 3. A119.23. Vienna, 2006.

29. Дворжак А.Ю., Воробьев B.C., Шаронова И.Н. Модуляция толфенамовой кислотой спонтанных постсинаптических токов в изолированных клетках Пуркинье мозжечка // В сб. «Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга. М. 2007. С. 222-225.

30. Дворжак А.Ю., Шаронова И.Н. Спонтанные постсинаптические токи в изолированных клетках Пуркинье мозжечка и их модуляция фенаматами // В сб. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». М., 2007. С. 115-117.

31. Шаронова И.Н., Воробьев B.C., Дворжак А.Ю., Скребицкий В.Г. Механизмы взаимодействия нестероидных противовоспалительных средств с ГАМКа рецепторами центральных нейронов // XX Съезд физиологов России. М. 2007. С. 105.

32. Шаронова И.Н., Воробьев B.C., Россохин А.В. Механизмы взаимодействия фенаматов с ГАМКа рецепторами центральных нейронов // В сб. Материалов Шестого Международного Междисциплинарного Конгресса «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина. 2010. С. 307-308.

33. Россохин А.В., Шаронова И.Н. Молекулярные механизмы взаимодействия нифлумовой кислоты с ГАМКд рецепторами в клетках Пуркинье мозжечка // Научные труды III съезда физиологов СНГ. Ялта, Украина. 2011. С. 54.

34. Шаронова И.Н. Модуляция ГАМК-активируемых токов синтетическим производным стероидов в изолированных клетках Пуркинье мозжечка // В сб. Материалов Седьмого Международного Междисциплинарного Конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым, Украина. 2011. С. 461-462.

35. Шаронова И.Н., Дворжак А.Ю. Блокада канала ГАМКд рецепторов нифлумовой кислотой препятствует диссоциации агонисга // В сб. «Рецепторы и внутриклеточная сигнализации». Пущино. 2011. С. 319-323.

36. Россохин А.В., Шаронова И.Н., Буканова Ю.В. Механизмы блокады ГАМКа рецепторов бета-лактамным антибиотиком пенициллином // Материалы X Всероссийского съезда неврологов. Нижний Новгород. 2012. С. 682.

37. Россохин А.В., Шаронова И.Н., Буканова Ю.В. Бета-лактамный антибиотик пенициллин G блокирует пору ГАМКА рецептора в клетках Пуркинье мозжечка // В сб. Материалов Восьмого Международный Междисциплинарного Конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым, Украина. 2012. С. 342.

38. Скребицкий В.Г., Шаронова И.Н. Гиппокамп как мишень действия разных биологически активных веществ // II Всероссийская конференция с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология». Пущино: 2012. С. 65-66.

39. Шаронова И.Н., Дворжак А.Ю., Россохин А.В. «Механизмы блокады канала ГАМКа рецепторов нифлумовой кислотой» Материалы XXII Съезда Физиологического общества им. И.П.Павлова. Волгоград. 2013. С. 590-591.

40. Rossokhin A.V., Sharonova I.N. Electrophysiolodical and modelling study of the mechanisms of GABAA receptor block by penicillin // 9lh FENS forum. Milan. 2014. Abstract Number: FENS-0290.

Подписано в печать: 15.01.2015 Тираж: 100 эю. Заказ№ 1347 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru

Информация о работе

Шаронова, Ирина Николаевна
доктора биологических наук
Москва, 2015
ВАК 03.03.06

Автореферат

Электрофизиологическое исследование механизмов действия эндогенных и экзогенных модуляторов ионотропных рецепторов в нейронах головного мозга - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы