Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие сверхмалых и малых доз этанола на активность клеток Пуркинье мозжечка крыс

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Действие сверхмалых и малых доз этанола на активность клеток Пуркинье мозжечка крыс"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

ЗЕРНОВА Ганна Владимировна

УДК 591.8.81

ДЕЙСТВИЕ СВЕРХМАЛЫХ И МАЛЫХ ДОЗ ЭТАНОЛА НА АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ПУРКИНЬЕ МОЗЖЕЧКА КРЫС

(СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.13. — ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ)

АВТОР ЕФ ЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1992

Работа выполнена в лаборатории сравнительной физиологии мозжечка (заведующий—д. б. н., проф. Р. А. Григорьян) Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН (директор — академик В. Л. Свидерский).

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Р. А. ГРИГОРЬЯН ст. н. е., кандидат биологических наук А. Д. ХОРЬКОВ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Б. Ф. ТОЛКУНОВ доктор медицинских наук В. П. ЛЕБЕДЕВ

Ведущая организация—кафедра физиологии человека и животных (зав.— член-корреспондент РАН, профессор А. Н. Ноздрачев) Санкт-Петербургского Государственного Университета.

Защита состоится 17 ноября 1992 г. в часов на заседании

специализированного совета к в Институте эволюционной фи-

зиологии и биохимии ии. И. М. Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭФиБ нме-ни И М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан 16 октября 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета / кандидат биологических наук

Л. В. ЗУЕВА

Г! П fj Г- А'

^ "" 5 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Механизм действия алкоголя (этанола) митральную нервную систему (ЦНС) является предметом длительных шых споров. Хотя поведенческий и когнитивный эффекты действия эта-i в дозах более 2 г/кг хорошо изучены, остаются противоречивыми we о действии сверхмалых и малых доз этанола ( 0,1-1.0 г/кг ). астности, было показано, что этанол, введенный внутривенно за минут до опыта в дозе 0,5 или 0,8 г/кг ( максимальная концентрация рови 50 мг на 100 мл), не оказывает существенного влияния на собность экспериментальных животных (крыс) выбирать оптимальный >иант поведения, но сказывается на скорости выполнения задачи (Grow al.,1989). У людей, систематически не употреблявших алкоголь, )вые признаки алкогольной интоксикации, выражающиеся в незначитель-< нарушениях тонкого контроля движений, задержке времени начала акции, начинают появляться при достижении уровня алкоголя в -крови -30 мг на 100 мл (Schuckit, 1979).

С точки зрения исследования действия этанола, мозжечок заслужи-ет особого внимания среди других отделов ЦНС. Известно, что после рдения этанола (меченого С ), максимальная концентрация обнаружи-шась в мозжечке и гиппокампе (Сытинский, 1979). Кроме того, внешняя фтина двигательных расстройств, наблюдаемая у людей под влиянием редних и больших доз алкоголя,весьма сходна с нарушениями координации вижений у пациентов с диагнозом мозжечковой атаксии. Большинство редшествовавших работ по изучению влияния этанола на импульсную ктивность клеток Пуркинье (КП) мозжечка касались действия средних ,оз этанола, вызывающих заметную алкогольную интоксикацию ( Rogers it al., 1980; Sinclaier et al., 1981; Григорьян, Исмаилов, 1984, 1987; ¡уканидина, 1989 ).

Необходимо отметить, что до настоящего времени не удалось создать более или менее единой картины механизма действия этанола на клеточном уровне. Большинство исследователей предполагает, что этанол изменяет возбудимость нейронов. Б' частности, было показано, что этанол действует угнетающе на токи,вызванные активацией рецепторов глутамата (ГЛУ) (Lovinger et al., 1989' ¡ White et al, 1990) а также потенциирует хлорные токи, активируемые V-аминомасляной

диижлои u'AMKHGonzales, Hoffman, 1991). Эти результаты получег экспериментах, выполненных на клетках гомогенатов мозга ( Allan, Harris, 1987 ) и нейронах культуры ткани мозга (Ticku et al., 1£ Приведенные выше и другие данные о влиянии малых и средни доз этанола на обучение, сенсорные и в особенности на двигательн функции явились предпосылкой для изучения эффектов сверхмалых и доз этанола на клетки Пуркинье мозжечка крыс электрофизиологичес методами,используя статистическую обработку больших объемов инфо; на ЭВМ.

Учитывая особую чувствительность мозжечка к этанолу, a tî что нейрональные связи коры мозжечка хорошо изучены (Ecoles et al 1967 ), КП могут быть одной из наиболее подходящих моделей изучения ответов нейронов к нейромедиаторам в условиях систем действия этанола. Мы решили провести исследование действия этане на импульсную активность КП и ее изменения в ответ на ионофоретич аппликаций возбуждающего - ГЛУ'и тормозного - ГАМК медиаторов в о экспериментах на целом животном.

Проведенное нами исследование на клетках Пуркинье мозжечка представляет интерес для выявления особенностей действия этанола на афферентные системы мшистых и лазящих волокон мозжечка генерирующих разряд простых (ПС) и сложных спайков (СС) соответст1 и контролирующих, протекание тонических(ПС) и фазных(СС) рефлексм скелетной мускулатуры. Таким образом, изучение активности иденткф» рованных КП у животных с развитой системой контроля движений после введения сверхмалых доз этанола, является адекватным подходом и бу во многом способствовать более глубокому пониманию тонких механизм контроля движений и статики.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении особенностей действия сверхмалых и малых доз этанола при его системном введении на спонтанную импульсную активность КП мозжечка крыс и на изменения импульсной активности КП пр-' ионофорети-ческой аппликации ГЛУ и ГАМК.

В задачи исследования входило: зучить влияние сверхмалых и малых доз этанола на активность леток Пуркинье мозжечка крыс, в частности, на рязряды простых и ¡ложных спайков в спонтанной импульсации клеток Пуркинье, соответственно отражающих синаптическую активацию КП по афферентным входам мшистых и лазящих волокон.

Изучить действие ионофоретически апплицируемых глутамата и ^-аминомасляной кислоты на разряды клеток Пуркинье мозжечка наркотизированных крыс.

Изучить влияние этанола на изменения импульсной активности клеток Пуркинье мозжечка наркотизированных крыс, вызываемые микроионо-форетическими аппликациями глутамата и ^-аминомасляной кислоты.

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование шульсной активности КП на целом животном при действии сверхмалых зз этанола, введенного системно. Показано стабилизирующее действие гих доз на разряд клеток Пуркинье мозжечка крыс. Оно выражается упорядочении следования простых спайков в импульсации КП, ¡то отражает стабилизацию синаптической афферентной стимуляции СП по входу мшистых волокон. Впервые на целом организме продемонстрировано ослабляющее действие малых доз этанола на увеличение частот! разряда клеток Пуркинье при ионофоретической аппликации глутамата и усиливающее действие этих доз этанола на эффекты, вызываемые ионофоретической аппликацией ГАМК к КП.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Этанол в сверхмалых дозах оказывает стабилизирующее действ! на разряд клеток Пуркинье мозжечка крыс, заключающееся в упорядочен следования простых спайков, отражающих синаптическую активацию КП п афферентному входу мшистых волокон.

2. Этанол снижает прирост частоты импульсации КП в от! на ионофоретическую аппликацию глутамата по сравнению с контролем причем эффекты малых доз глутамата подавляются почти полностью.'

3. Подавление импульсной активности клеток Пуркинье при ионоф тической аппликации больших доз ^ -аминомасляной кислоты усиливае этанолом.

О

Научно-практическое значение работы. Результаты данной, дования показывают особенности влияния сверхмалых доз эта? контроль клетками Пуркинье и мозжечком в целом тонического ком рефлекса скелетной мускулатуры. Полученные данные об изменении КП на действие возбуждающего - ГЛУ и тормозного - ГАМК медиато] позволяют оценить механизм действия сверхмалых и малых доз эта} ЦНС. Выводы могут быть использованы в нейрофармакологии, нейроф гии, психоневрологии для поиска более эффективных методов профи и лечения алкоголизма, а так же могут внести вклад в объяснение этанола в сверхмалых дозах на координацию движений, работоспосо; и операторские способности человека.

Аппробация работы состоялась на расширенном межлабораторном минаре в Институте эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеч РАН в декабре 1991 г.; результаты были представлены на всесоюзно: конференции "Новые методы практической физиологии", Екатеринбург, декабрь 1991; на заседании Санкт-Петербургского общества физиолох в июне 1992; на Санкт-Петербургской конференции молодых ученых и специалистов "Механизмы регуляции физиологических функций" , Санкт-Петербург, октябрь 1992.

Основные положения исследования отражены в 4 печатных работа) Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литера! описания методических приемов, £ глав собственных исследований, о дения результатов, выводов и списка цитируемой литературы.

Текст диссертации изложен на /?0страницах машинописи, иллюст] рован 20 рисунками и Q таблицами. Библиографический указатель соде 2$ отечественных и ¡10иностранных источника.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Методы исследования

Работа выполнене на 113 крысах-самцах линии Вистар, массой 150 - 250 г. В опытах с исследованием действия сверхмалых доз этанола на спонтанную импульсную активность КП животные наркотизиров; шсь- нембуталом ( 40 мг/кг ). Для экспериментов с микроионофоретичеи ш аппликациями в качестве наркотизирующего вещества использовался ретан ( 1,2 г/кг ).

После трахеотомии стандартными операциоными процедурами жалась поверхность мозжечка над IV—VI долями червя мозжечка шенная часть постоянно орошалась теплым физиологическим свором. После удаления твердой мозговой оболочки и рассечения <ой вводился микроэлектрод и поверхность мозжечка зали-ась 3% раствором агар-агара, приготовленным на физиологическом творе, для предотвращения высыхания поверхности и сглаживания ьсаций, связанных с дыхательной и сердечной деятельностью.

Внеклеточная регистрация спонтанной импульсной активности ток Пуркинье осуществлялась при помощи стеклянных микроэлектро-I, сопротивлением 4-10 мОм, заполненных 2,5 М раствором хлористо-натрия. Микроионофоретические аппликации проводились с использова-гм 4-х канальных стеклянных микроэлекгродов сопротивлением 30-мОм, общим диаметром кончика 2-3 мкм. 2 канала использовались для пликаций и заполнялись глутаматом (мононатриевая соль 1-глутаминовой слоты ) - 0,1 М, гамма-аминомасляной кислотой - 0,1 М; регистрирующий нал заполнялся раствором ЫаС1 - 2,5 М; индифферентный (для пропуская форетического тока) - также 2.5 М раствором ЫаС1. Аппликация ществ осуществлялась толчками тока длительностью 1-5 с, силой >—180 нА. Утечка апплициремого вещества предотвращалась током проти-шоложной полярности, который подбирался для каждого опыта в зависи-зсти от условий и подавался в течение всего периода отведения от четки.

Клетки Пуркинье идентифицировались электрофизиологически по на-ичию в картине разряда простых и сложных спайков, с тормозной паузой осле последних. Продолжительность регистрации импульсной активности т одной и той же КБ была 40-180 мин в зависимости от программы 1ксперимента. Запись импульсной активности КП осуществлялась параллелью на фотопленку и магнитную ленту.После 10-30 минут записи спонтанной шпульсной активности идентифицированной КП вводился этанол в одной 13 следующих доз: 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 г/кг. Введение осуществлялось внутривенно в концентрации 17% в течение 1 мин. После инъекции запись импульсной активности той же КП продолжалась еще 30-90 минут. В ряде опытов через 30 минут после первого введения этанола делали вторую и третью инъекции той же дозы.

Обработка результатов исследований проводилась при помощи вычислительной машины. Рассчитывались: средний межимпульсный интервал (МИ), общая частота импульсации, частота разряда простых . сложных спайков раздельно, длительность тормозной паузы (ТП) после сложного спайка. Результаты представлялись в виде гистограмм норми] ванного распределения межимпульсных интервалов по длительности, тахограмм. Для статистического анализа использовались стандартные расчетные методы.

Определение концентрации алкоголя в крови проводилось в отдел ной серии опытов с воспроизведением экпериментальных условий ( наркотизация, введение этанола ) методом газовой хроматографии на хроматографе PYE 104, М-24 ( Англия ). Условия разгонки: газ-носитель ■ гелий - 50 мл/мин, водород - 50 мл/мин., воздух - 500 мл/мин; температура разгонки - 60 С; носитель - хромосорб W; жидкая фаза - диэти-ленглигольсукцинат; детектор - пламенно-ионизационный.

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ спонтанной импульсной активности КП мозжечка интактных крыс.

В наших опытах была проанализирована частота импульсации 380 идентифицированных КП в 1V-V1 долях червя мозжечка крыс. Средний МИ фонового разряда КП мозжечка при наркотизации нембуталом составлял 48.79±5.31 мс (п=60), значение среднеквадратического отклонения для отдельной КП обычно составляло 4-6% от величины среднего МИ. В условиях наркотизации уретаном средний МИ был достоверно меньше и составлял 37,89i3.5 мс (п=50), значение среднеквадратического отклонения для отдельной КП в этом случае обычно равнялось 0,5-1с величины среднего МИ. Частота СС при каждом типе наркотизации была значительно меньше частоты ПС и составляла 0,66 ± 0,7 тп/с при наркотизации нембуталом и 0,53 ± 0,4 имп/с при наркотизации уретаном Частота СС при обоих способах наркотизации была менее подвержена изменениям с течением времени регистрации, чем длительность ТП, следующей в разряде КП за СС. В соотношении между ПС и ТП одной и той же КП наблюдались реципрокные отношения: чем выше была частота ПС, тем короче становилась тормозная пауза.Среднее значение длительности ТП пр наркотизации нембуталом составляло 308,7 ¿44.3 мс.при наркотизации

ном - 184,3^6,0 мс. Варьирование длительности ТП при продолжи-ой регистрации спонтанной активности одной и той же КП было боль-ри наркотизации нембуталом (около 70%), нем уретаном (около 20%).

образом, импульсная активность КП в условиях наркотизации ном отличается несколько большей частотой ПС, меньшей частотой длительностью ТП, чем при наркотизации нембуталом, характер [да в основном сходен, но отличается большей регулярностью.

{мпульсная активность КП в условиях действия сверхмалых и малых доз этанола .

В результате компьютерной обработки последовательности МИ в яде КП за весь ход опыта было показано, что после введения сверх-х и малых доз этанола резко увеличивается регулярность импульсации. в условиях фоновой активности импульсация КП была крайне вномерной, что является важным специфическим показателем разряда воактивной КП в норме, то через 10-15 мин после инъекции этанола деквадратическое отклонение средней частоты уменьшалось в 1.5-2 ра-После введения этанола в сверхмалых дозах (0.1 и 0.25 г/кг)на фоне :ого упорядочения импульсной активности КП не наблюдалось ;нения средней частоты разряда КП, и мода межспайковых интервалов •истограммах распределения МИ по длительности не менялась по $нению с нормой , а эксцесс, отражающий регулярность разряда, ичивался в несколько раз (рис.1 А,Б). Аналогичное увеличение десса было отмечено в результате обработки данных, полученных в гах с введением малых доз этанола (0.5 и 1.0 г/кг). Однако в этих чаях мода МИ на гистограммах разряда КП через 15-20 мин после екции смещалась в область более коротких интервалов, а значит тога импульсации КП увеличивалась (табл.). Необходимо отметить, концентрация этанола в крови достигала максимума только к 15-20 : и длительное время сохранялася на довольно высоком уровне. :симальные значения концентрации этанола в крови составляли 10-15 мг 100 мл для дезы 0.1 г/кг и 60-90 мг на 100 мл.для дозы 1.0 г/кг. ■улярный характер разряда обычно сохранялся на протяжении всего гмени регистрации, то есть около 75 минут от .момента введения шола в кровь (рис. 1 В). Подобная реакция КП при введении з 0,1-0.25 г/кг наблюдалась в 80% случаев, а для дозы 0.5-1.0 г/кг -

П=1106

48 96 144 НС

1Ы1/С

П=»1289

48 Э6 144 НС

10 А 15 20 25 30 35 1ВН

Рис.1.-Гистограммы межимпульсных интервалов ( А,Б) и тахограмм (В) активности клетки Пуркинье мозжечка крысы до (А) и после С внутривенного введения этанола. По оси абсцисс: гистограмм -величина межимпульсных интервалов (МИ) в мс, тахограммы - врем; регистрации КП в мин; по оси ординат: гистограмм - число одинаковых МИ в тахограммы - текущая средняя частота разряда КП до и после введения этанола (0.1 г/кг). Момент введения обзна-чен стрелкой. На тахограмме отмечены участки (1,2), которые представлены в виде гистограмм А и Б соответственно.

и

Таблица

ЛЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ШТКИНЬЕ МОЗЖЕЧКА КРЫС ПОД ВЛИЯНИЕМ СВЕРХМАЛЫХ И МАЛЫХ ДОЗ ЭТАНОЛА

азатели активное- Доза этанола 0.1 г/кг Доза этанола 1.0 г/кг клеток Пуркинье до введения после вве- до введения после вве-

(ф о н) дения (ф о н) дения

!) мозжечка через 15 мин через 15 мин

36.07±0.31 0.8

29.56±0.76 38.45±0.24 2.6 0.6

:тота ПС в раз- 36.05±1.02 *е КП (имп/с) зднекв. откло- 2.8 те частоты ПС (в %%)

стота СС в раз- 0.10*0.08 0.1810.10 0.71±0.40 0.73±0.64 де КП (имп/с) да (имп/с) стельность ТП (мс)

35-40

35-40

35-40

40-45'

173.1±100.3 129.4±67.2 222.0±165.1 100.1±31.3

1С - простые спайки, СС - сложные спайки, ТП - тормозная пауза после сложного спайка. Даны средние значениьсреднеквадратические отклонения.

90/£. В некоторых опытах через 30-40 мин после первой инъекции елалось повторное введение (до 3 раз) с регистрацией активности дной и той же КП. При этом наблюдался кумулятивный эффект, прояв-яющийся в еще большем упорядочении разряда КП. Например, если осле первой инъекции алкоголя, (0.1 г/кг) при сохранении средней ¡астоты среднеквадратическое отклонение уменьшалось с 4.в фоне до

(через 15 мин после введения),то после повторной инъекции эта ¡еличина составляла уже 1.7%.

Особенностью действия этанола в сверхмалых и малых дозах клялось избирательное влияние на простые спайки в разряде КП и отсутствие достоверных изменений в частоте СС и длительности ТП.

Таким образом, действие сверхмалых доз этанола на импульсную активность КП мозжечка крыс заключалось в увеличении регулярности разряда при сохранении средней частоты импульсации

« иремя регистрации на том же уровне. После введения этанола в малых дозах также наблюдалось упорядочение разряда КП, но частот разряда несколько увеличивалась. Средние дозы (2-4 г/кг), наряду повышением регулярности, вызывали еше большее увеличение частоты (Григорьян, Исмаилов, 1984, 1987). Сравнение данных о влиянии разных доз этанола на импульсную активность КП дает возможность предпологать, что нерегулярнось разряда является наиболее чувствительной к действию этанола характеристикой разряда КП, изменяющейся даже при введении в организм алкоголя в сверхмалых д< которые еще не сказываются на других показателях. По мере увеличе) дозы алкоголя и, следовательно, увеличения концентрации этанола в крови, проявляются все новые стороны его действия. Вероятно, это отражает вовлечение различных молекулярных механизмов реализацт эффектов алкоголя. Из исследований этих механизмов, проведеннь опытах in vitro (Gonzales, Hoffman, 1991) следует, что в низких концентрациях этанол влияет наиболее избирательно и одной и главных "мишений" его эффекта в ЦНС являются ионные каналы активируемые ГЛУ и ГАМК ( Suzdak et al., 1986; Ticku et al., 19 Lovinger et al., 1989; Dildy, Leslie, 1989).

Эффекты микроионофоретических аппликаций глутамата к клеткам Пуркинье в контроле и на фоне действия этанола.

Для .выявления различий действия как ГЛУ, так и ГАМК на разряд КП до и после введения алкоголя проводились эксперименты по следующей схеме. На первом этапе опыта регистрировался разряд фоновоактивной КП и изучались изменения ее импульсации в ответ на микроионофоретические аппликации ГЛУ или ГАМК при разных ионофоре-тических токах. Затем вводился этанол в малых дозах и через каждые 5-10 мин после инъекции проводились повторные аппликации к той же КП (до 80 мин после введения).

При ионофоретической аппликации глутамата к КП до введени, этанола наблюдалось увеличение частоты импульсной активности-1рис.2, зависящее от дозы апплицированного вещества. В этой серии опытов были получены данные на 48 КП, из них отвечали на ГЛУ возбужден! 47 КП. При силе тока 30 нА частота импульсации КП возрастала среднем на 20$, при 80 нА - на 80$, при 180 нА - в 1,5-3 раза. Степ«

6 с

рк 2 ^ „«нения «Ч^^да-»

увеличения частоты КП при аппликации ГЛУ находилась в о зависимости от исходной частоты: при высоком уровне импульсации (более 50 имп/с) ГЛУ увеличивал частоту разряда К чем при относительно низкой фоновой частоте. Например (КП N27i частоте 51 ± 2 имп/с, ГЛУ ( 80 нА ) увеличивал частоту' разряд« на 40$, а при частоте 20 + 1 имп/с ( КП N276 ) - на 1 Особенностью действия ГЛУ на КП являлось увеличение частоты ра за счет ПС, тогда как количество СС менялось слабо, то аппликация ГЛУ имитировала возбуждающее действие на афферентного входа мшистых волокон, вызывающих появление ПС в р КП, Значение длительности ТП после СС уменьшалось пропорциональ личенив частоты ПС (120 ± 45 мс в фоне, 80 ± 29 мс при действии 30 нА ( КП 292 )). Скорость нарастания эффекта не зависила от д< апшшцируемого ГЛУ и максимальное значение частоты импульсации 1 достигалось через 0.6-0.8 с от начала аппликации. После.прекраще аппликации ГЛУ к КП частота плавно уменьшалась и возвращалась к фоновому значению через 0,8 - 1,4 с (рис. 2а).

При аппликации ГЛУ после введения этанола (0.5 - 1.0 г/кг) в 90^ случаев наблюдалось уменьшение прироста частоты разряда 1 (рис. 2А). Максимальное ослабление эффектов ГЛУ, вызванное этане происходило на 15-25 минуте после введения этанола, что соответс ло максимальной концентрации этанола в крови. Б дальнейшем проис постепенное увеличение прироста частоты импульсации КП при действии ГЛУ, а к 70-й мин эффект восстанавливался до значений, наблюдавшихся до введения этанола . Следует отметить, что подавлб этанолом эффектов ГЛУ было сильнее выражено при аппликации ГЛУ сл ионофоретическим током (30 нА), чем сильным (180 нА) (рис. 3). Та в первом случае эффект ГЛУ подавлялся либо полносты либо на 80$, а во втором - только на 20% Подобное уменьшение эффектов ГЛУ в условиях действия этанола, введенногс системно, согласуется с данными о подавлении этанолом возбуждающих ионных токов, активируемых ГЛУ, полученными на срезах мозга ( Lovinger et al., 1989 ) и изолированных нейронах культуры ткани ( White et al., 1990 ).

р р»

30 во 90 120 150 180

нА

Рис. 3. График зависимости частоты разряда клеток Пуркинье коры мозжечка крыс от дозы апплицируемого глутамата (верхние кривые) и ^-аминомасляной кислоты (нижние кривые) в контроле (закрашенные символы) и после введения малой (1.0 г/кг) дозы этанола (полые символы). Средние данные ± среднеквадратические отклонения по 10 КП. По оси абсцисс: микроионофоретический ток в нА; по оси ординат: отношение частоты импульсации КП при максимальной реакции на аппликацию к частоте фоновой активности КП

Эффекты микроионофоретических аппликаций д-аминомасляно кислоты в контроле и на фоне действия этанола.

Изменение импульсной активности КП при ионофоретической аппл] ГАМК изучалось на 52 клетках. Для всех КП наблюдалось уменьшение тоты разряда (рис.2Б), пропорционально дозе апплицируемого вещее вплоть до полного подавления импульсации. При силе тока 30 нА сре частота разряда уменьшалась на 30%, при 80 нА - на 60%, и наконе! токе 180 нА наступало полное торможение. В некоторых случаях (3 1 при аппликации ГАМК током 30 нА наблюдалось увеличение частоты т сации КП без последующего торможения. В большинстве остальных сл} особенно при низких значениях ионофоретического тока (30 нА), в г период, длившийся 0.6-0.8 с, КП обычно реагировала также некоторь увеличением частоты (на 15-30^} и только после этого частота импу сации снижалась. Можно предположить, что начальное увеличение час является следствием пресинаптического действия ГАМК, в результате которого подавляется освобождение медиатора из окончаний интерней оказывающих постоянное тормозное воздействие на КП, и частота раз; КП увеличивается. Было показано, что разряды КП, вызываемые актив; входа мшистых волокон - простые спайки- - более чувствителы к действию ГАМК, чем СС, опосредуемые входом лазящих волокон. Так некоторых случаях ГАМК, апплицируемая к КП током 80-120 нА,полное подавляла разряд ПС в импульсации КП, а частота СС не изменяла Так же как и в опытах с глутаматом, скорость нарастания эффекта при аппликации ГАМК не зависила от дозы апплицируемс вещества и эффект достигал максимума за 2.5-3 с. После выключения ионофоретического тока уровень импульсации КП постепенно возвраща/. к исходному, причем в случае полного торможения разряда, первыми появлялись СС , а затем ПС, при этом восстановление частоты разряд происходило через 1,5-2,5 с (рис. 26).

Влияние этанола на изменение частоты разряда КП при апплика ГАМК было более сложным, по сравнению с влиянием на эффекты ГЛУ. При аппликации ГАМК током 30 нА на фоне действия этанола происходи потенциация начального увеличения частоты и ослабление последующег тормозного эффекта на 30-60$. Аппликации ГАМК током 80-180 нА выяв увеличение в 1.5-2 раза его тормозного действия (рис.2Б), которое

являлось в большем уменьшении частоты разряда КП и более раннем зтижении максимального торможения импульсной активности КП (рис.3), эме того, ГАМК, апплицируемая таким током, уже не вызывала начального эличения частоты ПС. Ммаксимальное влияние этанола на эффекты ГАМК эисходило на 15-25 мин после введения, а восстановление до контроль-го уровня - не ранее 70 мин. В основе такого действия может лежать тенциирование этанолом ГАМК-активируемых хлорных токов, что было казано в электрофизиологических экспериментах на нейронах культуры ани спинного мозга цыпленка (Celaniano et al., 1988) и клетках льтуры гиппокампальных нейронов (по Gonzales, Hoffman, 1991).

Интересной особенностью влияния этанола в сверхмалых и малых зах на импульную активность КП является его более продолжительное ¡йствие, по сравнению со средними дозами (Григорьян, Исмаилов, 1984). то показано отсутствие ослабления эффектов этанола на разряд КП и I ответы к микроионофоретическим аппликациям ГЛУ и ГАМК до 70 мин >сле введения. Тогда как концентрация этанола в крови существенно шжалась к этому времени. Возможно, адаптация организма к действию ганола в сверхмалых и малых дозах занимает большее время, чем это эобщалось для средних доз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование влияния сверхмалых и малых доз этанола на импульсную активность клеток Пуркинье коры мозжечка крыс в условиях острого эксперимента на наркотизированных животных, а также изучение изменения импульсации клеток Пуркинье при микроионофоре-тических аппликациях глутамата и ¿Г -аминомасляная кислоты к этим нейронам в контроле и после введения этанола, свидетельствуют о значительных изменениях в процессах возбуждения и торможения в локальных нейронных цепях мозжечка после введения этанола. Действие сверхмалых доз этанола, в отличие от действия больших доз, ограничивается только стабилизацией разряда без изменений значения моды и средней частоты. Причем этот эффект достигается преимущественно за счет простых слайков в разряде КП, что характеризует увеличение регулярности генерации импульсов, обусловленных входом мшистых волокон, контролирующих тонический компонент двигательных рефлексов скелетной мускулатуры. Эффекты микроионофоретических

- 18

аппликаций ГЛУ ослабляются после системного введения этанола, действие ГАМК-усиливается. Возможно,что именно изменение дейст данных кейромедиаторов после введения сверхмалых и малых доз этанола лежит в основе увеличения регулярности разряда КП, что может являться следствием стабилизации синаптической активации клеток Пуркинье. Поскольку в наших экспериментах основные изме импульсной активности клеток Пуркинье как под воздействием эта так и при ионофоретических аппликациях ГЛУ и ГАМК происходили счет простых спайков, можно полагать, что тоническая компонент в рефлексах скелетной мускулатуры наиболее чувствительна к изменению функциональной активности медиаторных систем коры мозжечка.

ВЫВОДЫ

1. Внутривенное введение этанола в сверхмалых дозах (0,1 и 0,25 г/кг) заметно увеличивает регулярность разряда клеток Пуркинье (КП) мозжечка крыс по сравнению с фоном, о чек свидетельствует резкое увеличение эксцесса при сохранении модь и уменьшение в 1,5-2 раза среднеквадратического отклонения, а повторное введение этанола в той же дозе сопровождается кумулятивным эффектом. В то же время, действие сверхмалых доз этанола не сопровождается статистически достоверным изменением средней частоты импульсной-активности КП мозжечка.

2. Этанол в малых дозах (0,5 и 1,0 г/кг) вызывает небол увеличение (на 20-30/0 частоты разряда КП за счет учащения про опайков (ПС).отражающих сикапгическую активацию КП по афферент входу мшистых волокон, тогда как частота сложных спайков (О отражающих синаптическую активацию КП по афферентному вх лазящих волокон и среднее значение длительности тормозной пау: после сложного спайка не меняются. Так же, как и под влиян: сверхмалых доз, происходит уменьшение в 1,5-2 раза среднеква, тического отклонения средней частоты разряда КП, то есть ра; КП становится более регулярным.

3. Глутамат, ионофоретически апплицируемый к фоновоактивной , вызывает избирательное увеличение частоты простых спайков, ■опорционально силе ионофоретического тока, при этом гательность тормозной паузы сокращается, а частота разряда южйых спайков не меняется.

4. Аппликация глутамата ионофоретическим током силой ) нА вызывает увеличение частоты разряда клетки Пуркинье в реднем на 20$, 80 нА - на 80$ и 180 нА - в 1.5-3 раза, ричем скорость нарастания эффекта не зависит от дозы пплицированного вещества и составляет 0.6-0.8 с, а после рекращения аппликации частота восстанавливается до контроль-ого уровня за 0.8-1.4 с.

5. На фоне действия этанола в малых дозах прирост lacTOTti импульсации КП, вызванный ионофоретической аппликацией .-лутамата ослабляется, начиная с 10 минуты после введения, и возвращается к фоновому уровню через 70 мин. Подавление этанолом эффектов глутамата, апплицируемого током 30 нА происходило на 80-100%, а током 180 нА - только на 20-40%.

6. ГАМК, микроионофоретически апплицируемая к КП, тормозит импульсацию ПС, пропорционально силе ионофоретического тока, при этом частота СС либо несколько увеличивается на фоне отсутствия ПС при токе 30-80нА, либо подавляется при токах превышающих 120нА.

7. После введения этанола в малых дозах происходило усиление как эффекта небольшого.увеличения частоты ПС, вызванного аппликацией ГАМК малым током (30 нА), так и эффекта торможения импульсной активности КП, вызванного аппликацией ГАМК бо'лыпими токами (80-180 нА). Прирост эффектов малой дозы ГАМК составил 30-60 %, а больших - 50-100%.

8. Действие этанола и апплицируемых нами медиаторов (ГЛУ и ГАМК) направлено в основном на частоту простых спайков в разряде клетки Пуркинье, что свидетельствует о большей лабильности тонического компонента двигательных реакций, по сравнению с фазическим.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Зернова Г.В., Григорьян Р.А, Хорьков А.Д. Повышение регулярности в разряде клеток Пуркинье мозжечка крыс при действии сверхмалых доз этанола// В сб. "Новые методы теорет ческой и практической физиологии" (вып. 2), Екатеринбуг, 199 с. 17-18.

2. Зернова Г.В. Подавление эффектов глутамата, апплицир; мого к клеткам Пуркинье мозжечка крыс, в условиях действия э: нола.// Тезисы докладов Санкт-Петербургской конференции мох дых ученых и специалистов "Механизмы регуляции физиологически функций", с'. 122-123, Санкт-Петербург, 1992.

3. Зернова Г.В. Ослабление эффектов ГАМК, апплицируемой клеткам Пуркинье мозжечка крыс, в условиях действия этанола// Тезисы докладов Санкт-Петербургской конференции молодых ученых и специалистов "Механизмы регуляции физиологических функций", с.122-123, Санкт-Петербург, 1992.

4. Григорьян P.A., Зернова Г.В., Хорьков А.Д. Действие малых доз этанола на активность клеток Пуркинье мозжечка крыс.// Доклады академии наук, 1992, Т.325, N 4, с.

формат бумаги 60x04 1/16, ^/печ.л. Бесплатно,

ЬО - 3 "Ленуприздата".

19П04 Ленинград, Литейный пр., дом № 55.

подписано к печати

. Заказ /¿>S£ . Тираж Ш