Морфологические корреляты синаптической пластичности

Попов, Виктор Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфологические корреляты синаптической пластичности
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Морфологические корреляты синаптической пластичности"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ

РГ6

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ КОРРЕЛЯТЫ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ

03.00.01 - Биофизика

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

На правах рукописи

ОД

ПОПОВ Виктор Иванович .

УДК 577.3

Пушино - 1994

Основная часть работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН (Пущино), а также в Институте физиологии Геттингенского Университета (ФРГ) и в Отделе биоинженерии Университета штата Вашингтон (Сиэтл, США).

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук профессор Я. Ю. Комиссарчик

Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

Доктор биологических наук Щ. в. Годухин Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино

Доктор биологических наук М. А. Костенко Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: кафедра биофизики биологического факультета Санкт-Петербургского Университета

Защита диссертации состоится_ в // часов на заседании специализированного совета Д 200.23.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142292 г. Пушино, Московской области, Институт биофизики клетки РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного Центра Биологических Исследований Российской Академии Наук.

Автореферат разослан

1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

Актуальность темы

Одной из фундаментальных проблем современной клеточной биофизики в области нейробиопогии является выяснение механизмов, обеспечивающих работу мозга, в основе которой лежит пластичность .центральной нервной системы (IIHC) . На норфологическон уровне пластичность ЦНС проявляется в образовании и структурной перестройке межнейрональных связей между отростками нервных клеток (аксонами и дендритами). В этой связи в нейробиология доминирует идея, что структурные перестройки в организации синаптических связей и их число лежат в основе работы мозга и определяют его долговременные и устойчивые изменения.

В настоящее время большинство нейроморфологов считает, что реорганизация синаптических связей является одним из путей развития и обучения мозга млекопитающих (См. последние обзоры: Horner, 1993; Jessel and Kandel, 1993; Jones et al., 1992; Lisman and Harris, 1993; Otani and Ben-Ari, 1993). Хотя идея важности изменений морфологии дендритных шипиков в развитии и обучении, как и в синаптическо* передаче инеет более чей столетнюю историю, начиная с пионерских работ Гольджи (Golgi, 1873) и Кахала (Cajal, 1891), однако, только в последние годы эта идея стала получать прямые экспериментальные подтверждения. Так, например, перестройка дендритов как результат действия нейротрансмиттеров была ясно продемонстрирована в исследованиях in vitro (Brewer and Cotman, 1989; Mattson et al., 1988). Подобные изменения структур нейрональных отростков были выявлены также и в исследованиях in vivo, но, главным образом, в экстраординарных ситуациях таких как восстановление после повреждения и после судоржной активности (Caceres and Steward, 1983; Cotman and Nadler, 1978; Cotman and Nieto-Sampedro, 1984; Cragg, 1975; Crutcher, 1987; Deitch and Rubel, 1984; Geinisman et al., 1991, 1992; Greenough, 1984; Juraska et al., 1989; Keller et al., 1990; Muller, 1993; Muller et al., 1993; Nitsch and Frotscher, 1992; Turner and Greenough, 1985; VolJman and Greenough, 1972). И только небольшое число исследований in vivo продемонстрировали, что изменения в структуре синаптических контактов, включая модификацию-мембранных рецепторов и каналов, могут играть роль в экспериментально индуцированных изменениях эффективности синаптической передачи, а именно, в таких

моделях как посттетаническая потенциацкя, привыкание и длительная потенциация (Иошков и др., 1977; Bailey and Chen, 1989; Chang and Greenough, 1984; Desmond and Leavy, 1988; Keller et al., 1992; Petukhov and Popov, 1986) .

В большинстве случаев выявляемые изменения в структуре синаптических контактов интерпретируются в плане их влияния на распространение электрического ответа в постсинапсе через отвечающие на сигнал рецепторы и каналы. Однако, рассмотрение последствий таких изменений не идет дальше построения биофизических моделей распространения по.стсинаптического потенциала по дендриту. В настоящее время можно говорить только о корреляции каких либо морфологических изменений с изменениями физиологического ответа, так как из всего многообразия структурных перестроек нейрональных связей все еще не возможно вычленить морфологических признаков синапсов, подвергнутых активации. Во многом ясна ситуация о том, что увеличение числа синаптических контактов прямо влияет на эффективность взаимодействия нейронов. В то же время практически нет ясности в вопросе о том, что и каким образом индуцирует образование новых синаптических контактов в мозге взрослых животных.

Практически все существующие работы можно свести к двум альтернативным точкан зрения, отражающий судьбу синаптических контактов:(а) при постоянном числе синаптических контактов их обновление идет тем быстрее, чем активнее они работают (Brewer and Cotman, 1989; Cotman and Nadler, 1978; Cotman and Nieto-Sampedro, 1984) и (б) раз образовавшись синаптические контакты сохраняются на всю жизнь и возножно увеличение только их числа (Greenough, 1984; Turner and Greenough, 1985). Все эти исследования свидетельствуют о ток, что прогресс в понимании механизмов работы мозга взрослых животных зависит от ответа на вопрос, что лежит в основе этих механизмов: полное ли обновление синапсов или только их преобразование за счет модификации синаптических структур.

Цели и задачи исследования.

Целями настоящего исследования являются:

1) Изучение возможности исчезновения (распада) и образования синаптических контактов в мозге взрослых животных в условиях их врожденного стереотипного поведения;

2) Оценка связи между эффективностью синаптической передачи и

количественными изменениями в структуре пре- н постсинаптических элементов;

3) Изучение взаимосвязи между интенсивностью формирования синаптических структур и интенсивностью белкового синтеза в нервных клетках.

4) Изучение роли межкейрональкых связей в дифференцировке нейронов.

В настоящей работе в качестве удобной модели для изучения ЦНС в различных функциональных состояниях был выбран гиппокамп, по крайней мере, по следующим причинам:

1. В эволюционном плане эта структура мозга представляет старую кору с хорошо развитой и упорядоченной системой межнейрональных связей и синапсами легко идентифицированной морфологии (Виноградова, 1975) .

2. Имеется много данных о том, что, в случае частичной деафферентации и обучения, в гиппокампе обнаружены перестройки в синаптических контактах (Horner, 1993; Greenough, 1984; Lisman and Harris, 1993; Otani and Ben-Ari, 1993).

Кроме того, возможно одной из наибольших трудностей в изучении синаптической пластичности является поиск такой популяции нейронов, в которой можно было бы провести статистически достоверный анализ изменений для конкретных пре- и постсинаптических структур. Это связано с тем, что гиппокамп содержат чрезвычайно большое разнообразие по морфологии синапсов, благодаря чему очень трудно точно выделить идентичную группу синапсов, подвергнутых экспериментальному воздействию, например,

электрической стимуляции и т.д. Однако эта проблеиа была нами решена путем выбора для ультраструктурного анализа уникальных гигантских бутонов, представляющих до 5-6 в диаметре ' окончания немиелинизированных мшистых волокон, идущих от нейронов зубчатой фасции и локализованных в полях САЗ/СА4 гиппокампа.

В своей работе мы использовали следующие физиологические модели ЦНС:

1. Зимняя спячка сусликов как 'врожденная форма поведения, при которой можно получить различные функциональные состояния мозга: глубокое торможение электрической активности; быстрое восстановление электрической активности и переход к обычному функционированию мозга у эутермных животных;

2. модель длительной погенциации и других функциональных состояний

пирамидных нейронов попей САЗ/СА4 в переживающих срезах гиппокампа крысыг получаемых путем электрической стимуляции определенных областей среза (мшистых волокон) и отражающих разный уровень эффективности синаптической передачи с мшистых волокон на пирамидные нейроны. Это дает возможность сопоставить уровень активности нейронов и состояние ультраструктуры этих синаптических контактов.

3. Регенерация нейронов обонятельной системы у золотой рыбки. Это позволяет получить удобную модель, позволяющую исследовать in vivo роль синаптических контактов на дифферекцировку специализированных нейронов обонятельной системы.

4. Интраокулярные гомотрансплантаты эмбриональной обонятельной выстилки крысы, позволяющие исследовать в условиях близких к in vitro влияние синаптических контактов на дифференцировку обонятельных нейронов.

Нам представлялось важным ответить на следующие вопросы: -возможен ли, а если да, то в каких условиях распад межнейрональных связей;

-связано ли новообразование синаптических контактов только с обучением животного;

-влияет ли интенсивность функционирования синаптического контакта на его морфологию, а если да, то обратимы ли эти структурные изменения.

Для ответа на эти вопросы были поставлены следующие задачи: -дать качественную и количественную оценку перестроек пре- и постсинаптических ультраструктур в гигантских синапсах полей САЗ/СА4 гиппокампа, находящегося в различных функциональных состояниях

оценить скорость структурных перестроек пре- и постсинаптических элементов в гигантских синапсах полей САЗ/СА4;

провести сравнительный анализ изменений в структуре апикальных дендритов пирамидных нейронов полей САЭ/СА4 методами световой микроскопии с использованием импрегнации нейронов по Гольджи и улыратонких срезов;

провести сравнительный анализ организации цито- и нуклеоскелета пирамидных нейронов в зависимости от их функционального состояния;

провести сравнительный анализ обонятельного рецепторного аппарата, включая роль на его дифференцировку синаптических связей

первичных обонятельных нейронов с нейронами обонятельной луковицы.

Основные положения/ выносимые на защиту.

1. На примере пирамидных нейронов полей САЗ/СА4 гиппокампа сусликов продемонстрированы повторные и обратимые изменения дендритных шипиков и синапсов.

2. Параллельно с обратимыми изменениями в дендритных шипиках происходит повторный и обратимый распад и ресинтез de novo синаптических контактов в козгу взрослых животных.

3. Активация рибосомального белкового синтеза как в случае электрической стимуляции с образованием длительной потенциации в переживающих срезах гиппокампа крыс, так и в течение зимней спячки сусликов сопровождается увеличением числа синаптических контактов и возрастанием эффективности синаптической передачи.

4. В основе механизмов образования длительной потенциации в переживающих срезах гиппокампа крыс после краткой тетанической электрической стимуляции мшистых волокон лежат как пост-, так и пресинаптические перестройки, которые, по крайней мере, сопровождаются изменениями в синаптических контактах, а именно, в числе и форме постсинаптических уплотнений.

5. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в основе механизмов синаптической пластичности в ИНС взрослых животных лежит синаптогенез идущий de novo за счет обновления синапсов.

6. Дифференцировка первичных обонятельных нейронов прямо не зависит от установления синаптических связей этих клеток с нейронами обонятельной луковицы.

Научная новизна работы.

На примере естественной модели зимней спячки сусликов экспериментально доказано, что в основе механизмов синаптической пластичности в ЦНС нормальных взрослых животных лежит обновление синапсов.

Используя два альтернативных функциональных состояния сусликов: холодовое оцепенение и нормотермкю, а также 2,5 ч искусственное пробуждение из состояния оцепенения впервые эксперименатально показано, что быстрые, повторные и обратимые изменения в дендритных шипиках и синаптических контактах указывают на циклический процесс деиннервации и реиннервации гиппокампальных

нейронов мшистыми волокнами в течение врожденного, стереотипного поведения.

Результаты качественного ж количественного ультраструктурного анализа переживающих срезов гиппокампа крыс с параллельной регистрацией спайковых разрядов пирамидных нейронов полей САЗ/СА4 после различных процедур электрической стимуляции мшистых волокон зубчатой фасции показали, что в образовании феномена длительной потенциации наряду с постсинаптическими перестройками важную роль играют и изменения в пресинапсе, по крайней мере, в числе и размерах пресинаптических везикул.

Результаты ультраструктурного анализа обонятельных нейронов позвоночных как при гомотрансплантации в переднюю камеру глаза крысы эмбриональной выстилки, так и состояния обонятельной выстилки золотой рыбки после аксотомии свидетельствуют о том, что наличие прямых синаптических связей между первичными обонятельными нейронами и нейронами ЦНС (обонятельных луковиц) не является необходимый условием дифференцировки обонятельных нейронов, что связано с образованием обонятельных сенсорных цилий.

Практическое значение.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой лабильности синаптических связей в ЦНС млекопитающих, показывая, что даже в случае врожденного поведения имеет место быть образование de novo новых синаптических контактов, наряду с альтернативным процессом ретракции шипиков и дендритных отростков. Эти результаты позволяют глубже понять механизмы синаптогенеза и функционирования нейронов ЦНС, денонстрируя высокую лабильность межнейрональных сетей. В конечном итоге, эти данные могут найти применение в разработке фармакологических препаратов, воздействующих на пре- и постсинаптические элементы синапсов, с целью лечения различных патологий в ЦНС.

Исследования факторов и условий, вызывающих гибернацию у животных, могут иметь важное значение в нейрохирургии при проведении длительных операций на мозге путем создания гипотермии у человека.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на Всесоюзных конференциях по криогенным методам в электронной микроскопии (1974; 1977; 1985; 1989) в г. Пущине; IX, X, XI, XII, XIV Всесоюзных конференций по электронной микроскопии (г. Тбилиси, г. Ташкент, г. Таллин, г. Сумы, г.Черноголовка); I Всесоюзном Биофизическом Конгрессе (г. Москва, 1982); Конференция по электронной микроскопии (г. Дрезден, ГДР, 1977); Европейская международная конференция по замораживанию-травлению (г. йена, ГДР, 1979); ПИ Всесоюзном Симпозиуме Биофизика и биохимия биологической подвижности (Тбилиси, 1987); У Советско-Швейцарский Симпозиум : "Biological membranes: structure and function (Рига, 1988); X Международный Симпозиум : "Olfaction and Taste X" (Осло, Норвегия, 1989); Международный Конгресс: "Molecular changes by microwaves" (Вена, Австрия, 1990); Международный Симпозиум: "Химическая сигнализация и коммуникация" (Москва, 1992); IX Всесоюзный Симпозиум : "Структура и функция клеточного ядра" (Черноголовкаб 1987); Международный Симпозиум: "Molecular organization of biological structures" (Москва, 1989); Всесоюзный Симпозиум: "Механизмы зимней спячки" (Пушино, 1987); Международный Симпозиум: "Signal Molecules and Behaviour" (Пущяио, 1989) X Международный Биофизический конгресс (Ванкувер, Канада, 1990);3 Международный конгресс по сравнительной физиологии и биохимии(г. Токио, Япония, 1991); IX Конгресс Европейского общества по хеморецепции (г. Мюнхен, ФРГ, 1992); на семинарах Института физиологии Геттингенского университета (г. Геттинген, ФРГ), в отделе биоинженерии Университета штата Вашингтон (г. Сиэтл, США) и в Университете Военно-Морских Сил США (г.Бетезда, США). Публикация работ. Основные материалы диссертации отражены в 41 публикации, включая статьи и тезисы докладов. Кроме того, автором опубликовано дополнительно более 60 статей и тезисов, включая 4 авторских свидетельства, которые содержат материалы прямо не связанные с темой настоящего автореферата.

Основные результаты, выносимые на защиту, и их обсуждение.

Глава 1. Количественный анализ ультраструктурных изменений in vitro в синапсах полей САЗ/СА4 в переживающих срезах гиппокампа крыс в различных функциональных состояниях [29-30; 32, 34]

Поперечные срезы гиппокампа крыс (толщиной 250-350 т) были приготовлены по стандартной методике. Для электрофизиологического тестирования того или иного функционального состояния переживающего среза использовались вызванные спайковые разряды пирамидных нейронов в поле САЗ в ответ на стимуляцию мшистых волокон зубчатой фасции. Использовали следующие параметры электрических стимулов: 0,1 мсек - длительность,- 100-200 цА - сила и 0,1 Гц - частота (тестирующая стимуляция). Как для стимуляции, так и для отведения использовали вольфрамовые электроды с 10 цм кончиком. Анализ включал определение числа спайков в вызванной ответе , который был, по крайней мере, стабилен в течение 10-25 мин. Срезы без спонтанной активности отбрасывались. Использовались следующие функциональные состояния (рис. 1) :

"IOOAJV

20 US

Рис.1. Электрофизиологические характеристики вызванных

спайковых разрядов нейронов поля СА 3 в переживающих срезах гиппокампа крысы в процессе последовательного развития 5 функциональных состояний после электрической стимуляции мшистых волокон зубчатой фасции. Где:

1 - контроль;

2 - длительная потенциация 1;

3 - истощение;

4 - восстановление;

5 - длительная потенциация 2.

"Контроль" (control), срезы с хорошо выраженной спонтанной и вызванной активностью через 40-50 мин после помещения в среду инкубации. Эти слайды были использованы для достижения следующих состояний:

"Истощение" (depletion) - это состояние достигалось в течение продолжительной непрерывной стимуляции (1 ч и более) с частотой 30-50 Гц до полного исчезновения вызванной активности, которад не

восстанавливалась в течение 10-20 мин после конца стимуляции.

"Восстановление" (recovery) - подобно "истощению", срезы подвергались длительной продолжительной стимуляции с теми же самыми параметрами. Стимуляция прекращалась тогда, когда вызванная активность исчезала. После чего срезы подвергали тестирующей стимуляции до тех пор, пока, по крайней мере, в течение 10-20 мин не появлялась стабильная вызванная активность. Обычно это состояние достигалось не менее, чем через 5 ч после приготовления слайса.

"1 длительная потенциация" (long-term potentiation 1: LTPl) -это состояние достигалось краткой тетанической стимуляцией (5-15 сек; 50-70 Гц) ншистых волокон в срезах с хорошо выраженной спонтанной и вызванной активностями. Используя тестирующие стимулы (0,1 Гц), LTP1 отслеживалась через 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 сек после тетануса, после чего скорость тестирующих стимулов уменьшалась до 1/30 сек. Для электронно-микроскопического анализа это состояние считалось достигнутым тогда, когда вызванный ответ был стабилен в течение не менее 20 мин.

"Длительная потенциация 2" (long-term potentiation 2: LTP2) -после последовательного развития LTP1, "истощения" и "восстановления" тот же самый срез был подвергнут краткой тетанической стимуляции с параметрами как и для LTP1. После 10-20 мин тестирующего периода как и для LTP1 считалось, что LTP2 достигнуто. Срезы с нестабильными ответами в процессе успешного успешного развития LTP1, "истощения", "восстановления" и LTP2 отбрасывались. Как правило это состояние достигалось не менее чем через 8 ч после приготовления среза.

Пять последовательных состояний для одного и того же среза в течение LTP2 достижения показано на рис. 1. Многочисленные и независимые от электронной микроскопии электрофизиологические эксперименты показали, что в противоположность к другим состояниям, LTE1 и LTP2 характеризуются большим числом спайков в вызванном ответе, который был стабилен в течение более, чем 2-3 ч после подачи тетануса. Следовательно LTP1 и LTP2 резко отличались от кратковременной посттетанической потенциации. Важно отметить, что большая длительность времени (более 8 ч) от начала приготовления среза к по его взятия в состоянии LTP2 для электронной микроскопии указывает на:

1. Хорошее функциональное состояние среза в течение

"восстановления";

2. Высокую стабильность и специфичность (запуск только краткой высоко частотной стимуляцией) механизма генерации и

ЬТР2. В этой связи предсталялось важным сравнить ЬТР2 с другими состояниями, в частности, с 1/ГР1, полученной обычным путем.

Важной особенностью поля САЗ гиппокампа является присутствие в нем уникальных гигантских синапсов, которые образуются между терминалями мшистых волокон, и дендритными шипиками. Некиелинизировааные мшистые волокна идут от нейронов зубчатой фасции и имеют диаметр около 0,1 м». Окончания этих волокон представляют мощное расширение до 4-6 |дго в диаметре с образованием так называемых гигантских бутонов, в которые проникают шипики, идушие от апикального дендрита пирамидных нейронов полей САЗ/СА4. Гигантские бутоны заполнены прозрачными сферическими пресинаптическими везикулами с диаметром около 30-40 нм. Основным типом межклеточных контактов между пресинаптической мембраной бутона и постсинаптической мембраной дендритного шипика являются активные зоны. Активные зоны характеризуется филаментознык материалом или постсинаптическим уплотнением (ПСУ), которое крепится к мембране шипика. Со стороны гигантского бутона к синаптическому контакту подходят пресинаптические везикулы. В срезах со спонтанной активностью очень часто можно обнаружить в области синаптического контакта омега-подобные профили, образованныепресинаптической мембраны, которые интерпретируются как результат высвобождения нейротрансмиттеров (нейромедиаторов) за счет зкзоцитоза.

Лля электронной микроскопии срезы в пяти функциональных состояниях были сгруппированы соответственно в пять групп, каждая из которых содержала не менее 4 слайсов, полученных от разных животных. После достижения одного из пяти состояний срез был немедленно фиксирован в 2,5 % глутаровом альдегиде с последующей постфиксацией в 0,5-1% четырех окиси осмия. Оба фиксатора готовили на 0,1 И На-какодилатном буфере (рН 7,4). Для морфометрического анализа были использованы негативы с хорошо выраженными гигантскими бутонами. Для количественного анализа

ультраструктурных изменений были использованы следующие параметры:

-плотность (й) пресинаптических везикул, определяемая как отношение между числом всех везикул локализованных в гигантском бутоне и площадью этого пресинапса за исключением площади проекций

шипиков, локализованных внутри этого бутона;

-площадь ПСУ;

-длина контакта ПСУ с постсинаптической мембраной (длина активной зоны).

"Контроль" характеризуется плотной упаковкой пресинаптических везикул, которая в ряде случаев приближается к гексагональной. В отличие от "контроля" свеже приготовленные слайсы очень часто содержали омега-подобные профили. Как правило возле этих профилей располагались сферические мембранные компартменты, которые Heuser and Reese (1973)ранее обнаружили в нервно-мышечных синапсах назвали "цистернами" (cisternae). Согласно этим авторам такие ультраструктуры свидетельствуют об экзо-/эндоцитарном механизме обмена везикул. Помимо прозрачных везикул возле синаптических контактов обнаруживаются везикулы с электронно-плотной сердцевиной (dense-core vesicles). Однако, практически невозможно определить какой тип везикул был связан с омега-подобными профилями.

"Истощение". После продолжительной непрерывной электрической стимуляции, когда вызванный ответ полностью исчезал и не восстанавливался в течение, по крайней мере, 20 мин посла окончания стимуляции, число везикул резко уменьшалось. Это уменьшение числа везикул сопровождалось появлением многочисленных мебранных компартментов или "цистерн". Прямых связей между цистернами и пресинаптической мембраной нами не было найдено.

"Восстановление". После периода восстановления число обоих типов везикул возрастало, а число "цистерн" уменьшалось. Это могло указывать на образование везикул из этих "цистерн". Однако увидеть такую конверсию "цистерн" нам не удалось.

LTP1 и LTP2. Ультраструктурные характеристики этих двух состояний практически идентичны. Число везикул было высоким и приближалось к предшествующему состоянию: для LTP1 к "контролю", а для LTP2 к "восстановлениею". основное различие между этими состояниями заключалось в том, что в LTP2 обнаруживалось большое число "цистерн". Важной ультраструктурной характеристикой обоих состояний длительной потенциации являлось появление в апикальных дендритах пирамидных нейронов возле шипиков филаментозного материала, клторый по всем структурным параметрам был очень сходен с прикрепленными постсинаптическими уплотнениями (ПСУ). В этой связи мы интерпретировали этот материал как "свободные" ПСУ. Кроме того, отмечалось увеличение длины и площади прикрепленных ПСУ. В

течение образования длительной потенциацки внутри апикальных дендритов отмечалась аккумуляция митохондрий, мембран шероховатого эндоплазматического ретикулума, обогащенных многочисленными рибосомами, микротрубочек и нейрофиламентов.

В таблице 1 представлены результаты статистического анализа плотности везикул. Как можно видеть максимальное значение

Таблица X. Концентрация пресинаптических везикул в гигантских бутонах поля САЗ переживающих срезов гиппокампа крыс в различных функциональных состояниях.

¿"состояние"

Функциональное состояние N <1 з-<1 Р % = (¡"контроль"

контроль 84 229 10 100

Длительная

потенциация 1 44 155 8 <0, 001 68

Истощение 40 106 12 <0, 001 46

Восстановление 33 195 8 <0, 001 85

Длительная

потенциация 2 74 165 9 <0, 001 72

И, число измеренных гигантских бутонов; 3, средняя плотность

везикул(число везикул на 1 ц® ); в-, стандартная ошибка среднего;

* , уровни значимости (включают различия только к контрольной группе)

плотности везикул соответствует "контролю". При этом необходимо заметить, что высокая плотность везикул в этом состоянии сохраняется даже в течение продолжительной инкубации (6-6 ч) переживающих срезов. В ЬТР1 плотность везикул уменьшается, а эффективность синаптической передачи вырастает. В состоянии "истощения'уменьшение плотности везикул наиболее значимо. При этом следует занетить, что даже при полной блокаде синаптической передач* в этом состоянии гигантские бутоны содержали достаточное число везикул. В состоянии "восстановления" плотность везикул ниже, чем в "контроле", но удваивается по сравнению с "истощением". Плотность везикул в состоянии "восстановления" даже выше, чек в ЬТР1, хотя эффективность синаптической передачи выше в Х/ГР1. Генерация ЬТР2 также ведет к уменьшению плотности везикул по сравнению с предшествующим "восстановлением", которое может считаться в этом случае контролем. Представленные результаты

показывают сходство между. 1ЛР1 и 1/ГР2: увеличение эффективности синапткческой передачи сопровождается уменьшением плотности везикул.

В таблице 2 представлены статистические данные по изменению в ПСУ. Согласно этим данным значения длины и площади ПСУ прямо пропорциональны эффективности синаптической передачи, так эти

Таблица 2. Статистический анализ плошали и длины постсинаптических уплотнений в гигантских синапсах поля САЗ в различных функциональных состояниях.

а ± з- 1 ± s-

Функциональное -4 d * -ZI*

состояние N (xlo pm) Р I (xlO fm) P ♦#

'Контроль" 79 141 + 8

LTP 1" 36 215 + 27

Истощение" 80 116 + 9

Восстановление" 67 132 + 11

'LTP 2" 111 169 + 10

100 27 + 1,4 100

<0 ,001 152 33 4 2,2 <0, 05 123

<0, ,05 82 23 + 1,3 <0, 05 84

N • S. 93 28 + 1,7 N. S. 104

<0, , 05 120 32 + 1,5 <0, 05 119

N, число измеренных постсинаптических уплотнений; а, средняя

площадь постсинаптических уплотнений; 1, средняя длина постсинаптических уплонений; з^ и 3£, стандартные ошибки среднего;

* , уровни значимости (включают различия только против

"контрольной" группы срезов), вытекавшие из t-теста; N.S., статистически не достоверно; #, отношение а" состояние" к а"контроль" в %; #♦, отношение 1 "состояние" к 1 "контроль" в %.

значения максимальны в обоих состояниях длительной потенциации. Практически нет различий между состояниями "контроля" и "восстановления". Количественный анализ измеренных длины и плошали ПСУ показывает: 1. Различия в ПСУ как между LTP1 и LTP2, так и между "контролем" и "восстановлением" не достоверны, тогда как они достоверны среди других состояний. Важно отметить, что увеличению эффективности синаптической передачи соответствуют максимальные значения длины и площади ПСУ, тогда как при полной блокаде синаптической передачи значения этих параметров минимальны.

Все выбранные ультраструктурные параметры прямо коррелируют с функциональным состоянием синапсов. Полученные значения параметров и функциональным состоянием синапсов не всегда очевидны и

логически предсказуемы'. Простейшая связь выявляется между эффективностью синаптической передачи и размерами площади ПСУ. Площадь ПСУ и длина активных зон достигает максимальных значений в случае обеих длительных потенциаций, тогда как в состоянии "истощения" эти значения минимальны. В этой связи необходимо отметить, что увеличение этих двух параметров при длительной потенциации отражает чрезвычайно лабильный процесс, который развивается в течение нескольких секунд или минут.В нашем случае (при взятии образцов для электронной микроскопии) это время было, по крайней мере, 20 мин. В течение относительно короткого времени площадь и длина ПСУ увеличивается на 20% по сравнению с "контролем". Важной ультраструктурной особенностью длительной потенциации является появление в основании дендритных шипиков шероховатого эндоплазматического ретикулума и филаментозного материала, который подобен прикрепленным ПСУ и кот орый мы интерпретируем как "свободное" ПСУ. По-видимому, в течение генерации длительной потенциации происходит активация рибосмального синтеза, который сопровождается образованием de novo новых ПСУ. Согласно нашей точке зрения биосинтез свободных |ПСУ сопровождается последующим их транспортом к постсинаптической мембране шипика с образованием новых активных зон. Образование новых активных зон ведет к возрастанию эффективности синаптической передачи. Плотность пресинаптических везикул связана с функциональным состоянием более сложным путем. Так, например Chang and Greenough (1984), исследуя плотность везикул в синапсах поля CAI гиппокампа крыс, не выявили различий между длительной потенциацией и контролем. Возможно, что отсутствие таких различий связано с высокой гетерогенностью синапсов в поле CAI, когда практически нельзя выявить те синапсы, которые были подвергнуты какой либо электрической стимуляции.

Согласно нашим данным каксикальные значения плотности везикул выявлены в "контроле". Все виды используемой нами электрической стимуляции вызывали уменьшение плотности везикул, что может быть объяснено экзоцитарным кеханиэом выброса нейротрансмиттеров для активаци.и постсинаптических рецепторов, а, с другой стороны, ролью пресинаптических перестроек в образовании длительной потенциации. Вместе с тем, даже в течение полной блокады в состоянии "истощения",когда "восстановление" отсутствует, количество везикул сохраняется на достаточном уровне. Это является результатом

одновременного эндоцитоза пресинаптической мембраны, на что прямо указывают данные по увеличению плотности везикул практически до исходного уровня ("контроль") в состоянии recovery и' исчезновение "цистерн". Согласно нашей точке зрения электрическая тетаническая стимуляция мшистых волокон или пресинаптических терминалей сопровождается выбросом нейротрансмиттеров, которые модифицируют постсинаптическую мембрану с последующей активацией генома нервной клетки, который включает белковый синтез на полирибосомах. Согласно нашей гипотезе большие количества шероховатого ретикулума обогащенного полирибосомами связаны, по крайней мере, с биосинтезом белков ПСУ в основании дендритных шипиков в течение образования длительной потенциации. В результате последующей самосборки этих белков образуются "свободные" ПСУ, которые транспортируются к постсинаптической мембране и, связываясь с ней, образуют de novo в течение короткого времени новые активные зоны с ростом эффективности синаптической передачи. Участие

нейротрансмиттеров в активации постсинаптической мембраны подтверждается уменьшением числа пресинаптических везикул в течение образования как LTP1, так и LTP2.

Переживающие срезы гиппокампа хотя и представляют прекрасную экспериментальную модель для изучения ультраструктурных коррелятов синаптической передачи, тем не менее их недостатком является то, что они позволяют изучать механизмы выброса нейротрансмиттеров и активации рибосомального синтеза ряда синаптических белков через геном нервной клетки в условиях in vitro, которые все же далеки от условий in vivo. В этой связи зимняя спячка сусликов представляет другую уникальную модель изучения ЦНС пластичности в условиях in vivo и даже in situ на целок мозге взрослых животных..

Глава 2. Ультраструктурные изменения в гигантских синапсах полей САЗ/СА4 гиппокаипа сусликов в течение зимней спячки и искусственного пробуждения [4-6, 10-12, 15, 19, 21-22,26-28]

2.1. Световая микроскопия.

Гибернаторы обеспечивают уникальную возможность сравнить морфологию определенных нейронов в мозгу взрослых животных, находящихся в таких альтернативных функциональных состояниях как

я неактивное (состояние

Рис. 2. Условный график, показывающий, что зимняя спячка представляет периодический процесс, разделенный на серию баутов оцепенения, между которыми локализуются короткие эутерми-ческие интервалы. Каждый баут представлен состояниями оцепенения ("спячки") и нормотермки, а также двумя альтернативными функциональными состояниями:"входом" и "выходом" из оцепенения.

нормальное (состояние нормотермии)

О S 10 IS 20 25 30

дни

холодового оцепенения). В течение зимней спячки чрезвычайно низкая электрическая, активность мозга в оцепенении очень быстро сменяется реактивацией после спонтанного или искусственно вызванного пробуждения (BecJcnan and Stanton, 1982; Heller, 1979; Shtark, 1970). Спонтанные пробуждения сусликов встречаются регулярно и, следовательно, зимняя спячка представляет собой серию баутов оцепенения, разделенных короткими эутермическими промежутками (Kayser, 1969). Рис. 2 условно иллюстрирует процесс зимней спячки, представляющую серию баутов оцепенения, длящихся обычно 7-12 дней, которые разделены короткими спонтанными промежутками до 1-2 дней пробуждения, когда температура тела сусликов поднимается до 37°с.

Организация козга у сусликов является типичной для всех грызунов, включая крыс. Структура терминалей мшистых волокон (гигантских бутонов), также как и архитектоника полей CA3/CA4 гиппокампа активных сусликов практически не отличается от таковой

у крыс. Используя импрегнацию нейронов по методу Гольджи-Кокс, согласно организации апикальных дендритов можно выделить два типа пирамидных нейронов: так называемые длинноствольные и короткоствольные нейроны (РдЛзсЬ еЪ а1., 198 9; ¿игазка еЪ а1., 1989). рис. 3 показывает эти типы нейронов в поле САЗ гиппокампа спящих и активных сусликов. Согласно рис.3 различия между этими двумя типами нейронов позволяют легко идентифицировать эти клетки

Рис. 3. Типичный вид импрегниро-

ванных нейронов в полях САЗ/СА4. Где (А) "короткоствольный" нейрон в состоянии нормотермии; (Б) и (В) - "длинноствольные" нейроны в состояниях искусственного пробуждения и оцепенения, соответственно.

с целью проведения количественного анализа картин, получаемых по методу Гольджи-Кокс. В настоящем исследовании для количественного анализа были использованы длинноствольные нейроны с хорошо икпрегнированными апикальными дендритами. Помимо двух альтернативных функциональных состояний: оцепенение и нормотермия, были также использованы суслики через 2-2,5 ч после искусственного пробуждения из состояния холодового оцепенения. Для каждого состояния было проанализировано по 40 беспорядочно выбранных нейронов, по крайней мере, от 4-8 животных. Относительно небольшое число животных, используемых в настоящей работе, объясняется тем, что крайне трудно было отобрать для каждой из трех групп сусликов, физиологические параметры которых: температура крови вблизи головы и температура в прямой кишке- полностью бы совпадали. Для количественной оценки изменений в морфологии пирамидных нейронов был использован подход, предложенный еЬ а1. (1989), который

заключался в том, что от сомы (тела) пирамидного нейрона была проведена серия параллельных (или концентрических) линий через каждые 10 с последующим подсчетом числа пересечений.

На рис. 4 представлены нормированные данные: число пересечений через каждые 10% интервал от обще* длины апикального дендрита. видно, что число разветвлений вдоль дерева,

образованного апикальным дендригон, уменьшается равномерно в состоянии оцепенения. Наибольшое уненьшение (до 50%) было получено в дистальной области этого дерева, тогда как в проксимальной области - разветвления дендрита были минимальны (Рис. 4). Лаже в соседних областях изменения имеют различное выражение: например, между 30-40% и 40-50% общей длины дендрита. Уменьшение числа пересечений апикального дендрита в оцепенении ведет к тому, что апикальные дендриты длинноствольных нейронов имеют меньшее число разветвлений.

Принципиальной особенностью перестройки морфологии дендритов в течение зимней спячки является обратимость и повторяемость

Рис. 4. Гистограмма распределения "длинноствольных" нейронов в поле САЗ в соответствии с числом пересечений их апикальных дендритов с 10 ллп интервалами. Где (1) - состо-ние оцепенения; (2) - через 2,5 ч после искусственного пробуждения и (3) - активное состояние.Абсцисса: число пересечений; Ордината: % нейронов. Р < 0,05.

структурных изменений. Продолжительность эутермических интервалов между баутами обычно не превышает 1-2 дней и, следовательно, скорость структурных перестроек в дендритах должна быть очень высокой. Чтобы оценить скорость таких перестроек мы использовали искусственное пробуждение сусликов. Так уже через 2-2.5 ч после начала искусственного пробуждения средний объем тепа пирамидных

нейронов поля САЗ увеличивается на 70% по сравнению с оцепеневшими

3 3

животными (1445 ± 65 ^ vs 845 ±60 , соответственно) и

превышает средний объем тела пирамидного нейрона у активного

суслика (1235 ± 75 . Длина апикальных дендритов практически не

отличается от таковой у активных животных (304 • 21 |й 'з 291 ± 16

(jm, соответственно), тогда как по сравнению с оцепеневшими

сусликами (222 ± 30 цт) увеличивается почти на 70%. Общее число

дендритных пересечений после 2-2.5 ч от начала пробуждения

удваивается по сравнению с оцепеневшими животными (215 ± 18 vs 107

± 17 jim) и значительно больше, чем у активных животных (165 ± 17) . Распределение ветвей вдоль апикального дендрита после пробуждения значительно отличается от таковой у оцепеневших и близка к активным (Рис. 5). Эти различия в распределениии ветвей также подтверждаются данными количественного анализа (рис. 4), по крайней мере, в 4 из 10 проанализированных областей. Все эти результаты указывают не только на быстрое восстановление, но также на их частичную трансформацию в течение эутеркических интервалов между баутами зимней спячки.

Рис. 5. Распределение дендри- •

тных ветвей вдоль дендритного дерева "длинноствольных" пи-ранидных нейронов поля САЗ. Абсцисса: нормализованная

длина дендрита в %г Ордината: среднее число пересечений апикального дендрита на дендрит. 1, 2 и 3: соответственно, оцепенение, искусственное пробуждение и активное состояние. *, Р < 0,05; ***, Р < 0,001.

Обратимое уменьшение дендритного дерева в состоянии холодового оцепенения косвенно указывает на уменьшение постсинаптических поверхностей вследствии общей ретракции апикального дендрита. Более детальное исследование препаратов подтверждает трансформацию синаптических контактов в течение баутов оцепенения. Рис. 6 показывает примеры частоты встречаемости шипиков на гистальных ветвях апикальных дендритов для всех трех функциональных состояний. Эти данные подтверждают ту же самую тенденцию,что и для дендритных ветвей: их число уменьшается в середине баута и быстро восстанавливается после пробуждения.

Потеря шипиков была обнаружена не только на дистальных ветвях апикального дендрита, но и в других областях. Так основная часть мшистых волокон, идущих от гранулярных клеток зубчатой фасции, заканчивается в проксимальной области апикального дендрита пирамидных нейронов поля САЗ. В этой области шипики имеют

Рис. 6. Организация шипиков (стрелки) в дистальной части

апикального дендрита нейронов поля САЗ у активного (а-е), спящего (<!-£) и искусственно пробужденного (д, Ь) сусликов. бо1д1-Сох метод.

Рис. 7. Шипики в форме "thorny excrescence" в проксимальной части

апикального дендрита пирамидных нейронов поля СЛЗ у активного (а), спящего (Ь) и искусственно пробужденного (с) сусликов. Golgi-Cox метод.

необычную форму в виде "thorny excrescences" ("колючих шишек"). Шипики сильно разветвлены и глубоко проникают в гигантский бутон, являющийся окончанием мшистого волокна (Рис. 7). В оцепенении частота встречаемости "thorny excrescences" резко падает, а оставшиеся шипики уменьшаются в размерах и уплощаются (Рис. 7). Через 2-2.5 ч после начала пробуждения размеры и форма шипиков практически не отличаются от картины, которая наблюдается в активном состоянии (Рис. 7) . Таким образом, падение электрической активности в середине баута и ее восстановление после пробуждения (Heller, 1979; Shtark, 1970) хорошо

коррелируют с ретракцией и восстановлением синаптических структур.

Полученные данные прямо свидетельствуют, что ретракция в состоянии оцепенения и восстановления через 2 ч после пробуждения дендритных ветвей идет параллельно с процессами потери и образования дендритных шипиков, являющихся участками, в которых образуются синаптические контакты.

2.2. Электронная микроскопия.

Результаты ультраструктурного анализа гигантских бутонов полностью подтверждают светомикроскопические данные. На ультраструктурном уровне организация гигантских синапсов в полях САЗ/СА4 гиппокампа сусликов практически не отличается от таковой у крыс. На ультратонких срезах гигантских бутонов у активного суслика "thorny excrescences" обычно представлены 3-5 проекциями шипиков. Каждая такая проекция образована постсинаптической мембраной/ на которой располагаются постсикапткческие уплотнения (ПСУ)/ являющиеся своеобразными "маркерами" активных зон на ультраструктурном уровне. Как правило, внутри проекций шипиков располагаются митохондрии и шипиковый аппарат, представленный цистернами гладкого ретикулума. Важно отметить, что активные эутермические животные между баутами оцепенения принципиально имеют ту же морфологию гигантских синапсов как и летом. В таблице 3 представлены результаты количественного ультраструктурного анализа гигантских бутонов в трех различных функциональных состояниях. Видно, что число проекций шипиков на профиль гигантского бутона в состоянии оцепенения значительно падает, тогда как через 2 ч после пробуждения это число практически восстанавливается до уровня активных животных. Параллельно с уменьшениек числа проекций шипиков происходит также уменьшение средней площади каждой проекции. Эти результаты прямо подтверждают качественные данные полученные с использованием методики Гольджи: в состоянии холодового оцепенения происходит ретракция шипиков с последующим их полным и обратимым восстановлением через 2 ч после искусственного пробуждения.

Важной характеристикой постсинаптических мембран шипиков является присутствие более, чем одного ПСУ на каждую проекцию типика. В состоянии холодового оцепенения происходит достоверное уменьшение количества ПСУ как на одну проекцию шипина, так и на весь гигантский синапс (Таблица 3). После искусственного пробуждения число ПСУ на гигантский бутон даже выше, чем у активных сусликов (Таблица 3). Из этой же таблицы следует, что параллельно с увеличением числа ПСУ увеличиается также и длина их контакта с постсинаптической мембраной. Взятые вместе, эти два фактора через 2 ч после искусственного пробуждения дают

Таблица 3. Изменения постсинаптических структур в гигантских

синапсах мшистых волокон поля САЗ гиппокампа в различных функциональных состояниях сусликов.

Исследуемый Функциональное состояние суслика

параметр активный спящий пробужденга

# Число шипиков на синапс 2 Средняя площадь типика (цт ) 4,0 ± 0,6 * 2,5 ± 0,3 * 3,8 ± 0,5

0,53 ± 0,06 0,39 ± 0,02 * 0,87 ± 0,17

Число ПСУ на типик 1,8 ± .0,17 1,3 ± 0,13 А 2,2 ± 0,20

Средняя длина ПСУ (|лч) Средняя длина всех ПСУ на 0,27 ± 0,02 0,29 ± 0,03 * 0,40 ± 0,04

шипик(/дп) 0,46 1 0,08 0,38 ± 0,07 0,88 ± 0,1. *

Число перфорированных ПСУ (%) 17 ± 2 25 + 3 31 ± 3

Среднее значение ± стандартная ошибка

Р < 0,01 н активнын животным,- данные для спящих к пробуждающимся во всех случаях различаются с Р < 0,01;

* Данные представляют число шипиковых проекций на беспорядочно выбранный срез гигантского синапса (гигантского бутона).

практически двукратное увеличение интегрированной длины ПСУ по сравнению с Холодовым оцепенением и на 65% этот показатель больше, чем у активных сусликов.

Рис. 8 показывает гетерогенность ПСУ в гигантских синапсах в трех различных функциональных состояниях. Во всех состояниях было получено полимодальное распределение ПСУ в соответствии с их длиной. В этих распределениях доминируют два пика ПСУ с длиной 0,15 т и 0,25-0,30 т. ПСУ с длиной более 0,8 т были выявлены только после искусственного пробуждения. Кроне того, был проведен анализ перфорированных ПСУ (Табл. 3) . Наибольшая пропорция перфорированных ПСУ была выявлена в состоянии искусственного пробуждения, тогда как неожиданно малая пропорция перфорированных ПСУ оказалась в активном состоянии (Таблица 3). Очень часто в состоянии искусственного пробуждения можно было выявить скопления филаментозного материала подобного по структуре обычным прикрепленным ПСУ. Как правило, вблизи этого материала можно было выявить мембраны шероховатого ретикулука обильно снабженные полирхбосомами. Практически такая картина наки ранее наблюдалась в

Рис. 8. Характеристики постси-

на'птических уплотнений (ПСУ) в гигантских синапсах поля САЗ гиппокампа в различных

функциональных состояниях: активное (верх), пробужденное (середина) и оцепенения (низ). Где:(А), нормализованная гисто-граммма частоты распределения индивидуальных ПСУ; (Б), то же самое, но для обшей длины всех ПСУ, интегрированных проекцию шипика. Абсцисса: длина

индивидуальных и

интегрированных ПСУ,

соответственно, в ш; Ордината: % индивидуальных и

интегрированных ПСУ.

гигантских синапсах гиппокампа крыс в состоянии длительной потенциацки. В этой связи необходимо дать краткую цитологическую характеристику пирамидных нейронов полей САЗ/СА4 в трех различных функциональных состояниях сусликов:

Активное состояние. Нейроны в этом состоянии имеют типичную ультраструктуру для пирамидных нейронов грызунов. В ядрах, как правило, обнаруживается, одно активное ядрышко. В цитоплазме располагаются мембраны, главным образом, шероховатого ретикулума и реже гладкого ретикулума; рибосомы представлены преимущественно как мембран-связанными полисоиами, так и свободно локализованными в цитоплазме полисомами; типичный аппарат Гольджи представлен системой взаимосвязанных цистерн и пузырьков; выявляются многочисленные митохондрии, а также нейрофиламенты и микротрубочк*. Изредка в цитоплазме встречаются липофусциновые гранулы и нейросекреторные пузырьки.

Холодовое оцепенение. Ядрышко в ядре неактивное и имеет большие вакуоли заполненные фибриллярным материалом. В цитоплазме отсутствует аппарат Гольджи и шероховатый ретикулум; остатки гладкого эндоплазматического ретикулума образуют концентрические фигуры, наблюдается деструкция мембран за счет образования внутри таких концентрических фигур мультиламеллярных структур; наблюдается распад полирибосом на моносомы с изменением

соотношения в клетках моносом и полиркбосом как свободно располагающихся в цитоплазме, так и связанных с зндоплазматическим ретикулумом (Гордон, 1990; Гордон и др, 1989), что показано на рис. 9; также обнаруживаются многочисленные микротрубочки и

Рис. 9. Гистограмны распределения моносом (М), полисом (ПС) и связанных с мембранами эндопла-зматического ретикулума рибосом (СПС) в цитоплазме пирамидных нейронов полей САЗ/СА4 гиппока-мпа сусликов в середине (1) и конце (2) баута оцепенения; через 2 ч после принудительного пробуждения-(3) и в период активности между баутами - (4).

нейрофиламенты; видны многочисленные митохондрии и липофусциновые гранулы. На полутонких срезах окрашенных толуидиновым синим или метиленовым синим и Азуром XI часть пирамидных нейронов гиппокампа сильно прокрашивается с выявлением так называемых "темных" клеток и только очень небольшое число нейронов имеет "светлый" вид. Исследованиям "темных" нейронов как на свето-, так и на ультраструктурном уровнях посвяшено большое количество работ (Cammermeyer, 1961; Stensaas et al., 1972; Friedrich and Mugnaini, 1981). Хотя в этих работах прослеживается сьязь между образованием таких клеток и некоторыми патологическими процессами в мозгу, тем не менее механизм их формирования, включая факторы им управляющие, все еще не ясны. Наиболее частой причиной образования "темных" клеток в гиппокампе является гипоксия в результате экспериментально вызванной ишемии, которая ведет, как правило, к необратимым некротическим изменениям в нейронах с переходом их от "светлого" вида к "темному" (Johansen et al., 1993). Редкая встречаемость "темных" клеток в гиппокампе активных сусликов свидетельствует об обратимости процессов, связанных с образованием "темных" клеток. Следовательно в случае зимней спячки образование "темных" клеток не является некрозом. Последнее важно в том плане, что альтернативой некрозу является апоптоз или программируемая

клеточная снерть (Иу111е еЪ а1., 1993). Лпоптоз гиппокампальных нейронов может быть индуцирован, например, у крыс адреналэктомией (31от1Ъег еЪ а1., 1993). Лпоптоз клеток на ранних этапах характеризуется процессом конденсации хроматина по периферии ядра, дезинтеграцией ядрышка и изменениями цитоплазматических органелл. В нашем случае клетки с морфологическими признаками апоптоза отсутствовали. Следовательно образование "темных" нейронов в состоянии холодового оцепененья не связано ни с некрозом, ни с апоптозон, а отражает все еще не ясный процесс относительно быстрого падения метаболической и синтетической активности таких клеток. По-видимому, состоянии оцепенения в клетках мозга поддерживается уникальный энергетический баланс исключающий гипоксию.

2-2,5 ч принудительное пробуждение. После 2-2,5 ч искусственного пробуждения исчезают вакуоли в ядрышке, которое начинает активно синтезировать рибосомы. Мощно развит аппарат Гольджи и появляется шероховатый ретикулум обильно снабженный полирибосомами, которые также свободно раполагаются и в цитоплазме; митохондрии сильно набухшие; видны многочисленные микротрубочки и нейрофиламенты; в некоторых нейронах обнаруживаются скопления липофусциновых гранул. По сранению с состоянием оцепенения резко уменьшается число "темных" нейронов.

Одновременно с изменениями в постсинаптических частях : дендритные шипики и сомы пирамидных нейронов - происходят изменения и в пресинапсах: гигантские бутоны, являющиеся пресинаптическими терминалями гранулярных клеток зубчатой фасции -Наиболее доступный для количественного анализа параметром, характеризующим пресинапс, является плотность пресинаптических везикул. В таблице 4 представлены результаты количественного анализа плотности пресинаптических везикул в трех функциональных состояниях. Необходимо отметить, что в состоянии холодового оцепенения плотность пресинаптических везикул достоверно выше, чем в активном состоянии. Возможны два объяснения этому факту: во-первых, в состоянии холодового оцепенения в отсутствии электрической активности мозга практически отсутствует обмен за счет экзо-/эндоцитоза везикул; во-вторых, относительно болев высокая плотность пресинаптических везикул может быть за счет присутствия нейронов, которые даже в состояниях) оцепенения имеют относительно высокую плотность везикул, по-видимому, для

поддержания электрической активности в таких синапсах. Согласно ЭЬЬагк (1970) такие синапсы характерны для так называемых "сторожевых" нейронов, которые даже в состоянии оцепенения

Таблица 4. Концентрация пресинаптических везикул в гигантских

бутонах поля САЗ гиппокампа сусликов в различных функциональных состояниях.

Функциональное

состояние N d ± з- d Г * 1

Оцепенение (середина баута) 25 157 ± 32

Через 2 ч после

искусственного пробуждения 21 223 ± 59 <0,01 j

Активный (через

сутки после естественного пробуждения) 22 133 ± 49 <0,05

N, число измеренных гигантских бутонов; d ± з~, средняя плотность

везикул ± стандартная ошибка среднего; * , уровни значимости (включают различия к состоянию спячки).

находятся в активном состоянии и поддерживают минимальный, но достаточный для быстрого включения в работу гиппокампа с последующим запуском остальных структур мозга.

Увеличение плотности везикул в состоянии искусственного пробуждения с учетом уже выше изложенных данных может быть объяснено резким возрастанием скорости синтетических процессов, которые обеспечивают не только восстановление дендритных ветвей и шипиков, de novo образование новых активных зон, но также биосинтез новых порций нейротрансмиттеров, а, следовательно, увеличение плотности пресинаптических везикул. Относительно низкая плотность везикул в активном состоянии легко объясняется постоянным обманом везикул за счет экзо-/эндоцитоза с поддержанием некоторого равновесия между этими двумя процессами.

Уже через 2-2,5 ч принудительного пробуждения из центра баута оцепенения частота встречаемости и форма thorny excrescences; размеры и форма активных зон - все это возвращается практически до уровня активных животных. Именно в этом состоянии наблюдается образование de novo свободного филаментозного электронно-плотного материала, который очень подобен прикрепленным ПСУ. Аналогичная картина нами была выявлена только в случае генерации длительной потенциации в аналогичной области (поля САЗ и СА4) переживающих срезов гиппокампа крыс (См. Главу 1). Следовательно образование de novo новых синаптических ст^гктур, главным образом, активных зон наблюдается в состоянии резкого повышения эффективности синаптической передачи, что характерно для состояния длительной потенциации. В то же время, если между двумя этими состояниями выявляется большое сходство в изменениях постсинаптических структур, то на пресинаптическом уровне, в частности, плотности везикул выявляются различия: в случае искусственного пробуждения плотность везикул резко возрастает, тогда как в состоянии длительной потенциации плотность пресинаптических везикул уменьшается в сравнении как с состоянием холодового оцепенения, так и активным состоянием.

Полученные нами данные прямо связаны с синтетическими процессами, протекающими в нервных клетках, что отражается в изменении соотношения моносом, полисом и мембран связанных полисом (Рис. 9). Регуляция этого процесса остается практически не ясным для дифференцированных неРронов, у которых не только отсутствует клеточный рост, но и меняется электрическая активность (Hadjiolov, 1985). Известно (Koenig, 1971; Stoykova et al., 1983, 1985), что скорость формирования рибосом в нейронах не превышает 5% рибосом в сутки, хотя изменения в количестве рибосомальной РНК в некоторых нейронах может достигать 50% в час (Дьяконова и др., 1965; Иаксимовский, 1970; Кленикова и Малинаускайте, 1980). Ранее в работах (Велик и др., 1972; Демин и др., 1988; Палладии, 1965) обмен РНК и белков в мозге гибернагоров изучался в течение медленных сезонных изменений.

В течение циклов оцепенение-активное состояние улыраструктура как сом (тел), так и дендритов подвергается значительным трансформациям. Только в состоянии холодового оцепенения внутри дендритов и их отростков обнаруживается необычно организованный гладкий ретикулум. Цистерны гладкого ретикулума

располагаются с равным интервалом перпендикулярно оси дендрита. Такой "септальный" ретикулум имеет плотные контакты с тубулиновыми микротрубочкаки. После пробуждения такая структура ретинулума

исчезает. Наиболее вероятно, что образование "септальиого"

„ ++

ретикулума вызвано перераспределением ионов Са внутри мембранных компартментов (Garwthwate et al., 1992; Vila et al., 1992), так как в состоянии холодового оцепенения как это было отмечено выше происходит деструкция эндоплазмагического ретикулума. Такое перераспределение ионов Са , по-видимому, обусловлено тем, что даже в состоянии глубокой зимней спя^и в пирамидных нейронах должны идти процессы внутриклеточного транспорта клеточных метаболитов, на что указывает связь с "септальным" ретикулумом тубулиновых микротрубочек, а в ряде случаев и нейрофиламентов, ответственных за внутридендритную подвижность.

Процесс спячки сопровождается повторными и обратимыми изменениями в организации цито- и нуклеоскелета нейронов, по крайней мере, гиппокампа, сенсомоторной области коры и обонятельной выстилки. Необходимо заметить, что во всех функциональных состояниях нейронов как в их сомах, так и в отростках (аксоны и дендриты) выявляются все три основных элемента цитоскелета: актиновые микрофиламенты <6-8 нм в диаметре); тубулиновые микротрубочки (23-23,5 нм в диаметре) и промежуточные филаменты или нейрофиламенты (10 нм в диаметре). Все эти элементы обнаруживаются и в клетках астроглии независмо от состояния сусликов. Представляется важным остановиться на необычных структурах, выявляемых в нуклеоплазме нейронов у сусликов в состоянии холодового оцепенения. Почти 100 лет назад с помощью светового микроскопа рядом исследователей (Holmgren, 1899; Mann, 18 94; Prenant, 1897 ; Roncoroni, 1895) в ядрах различных нейронов млекопитающих и пгиц были обнаружены необычные в виде прутиков ("rodlets") регулярные структуры. Ramon у Саjal (1909, 1910) назвал эти структуры "тельца Ронкорони". На рисунках эти структуры представляли, идущие из цитоплазмы "прутики", на которых было нанизано ядро нейронов. В 1970 г. американские исследователи (Masurovsky et al., 1970) воспроизвели эти данные с привлечением электронной микроскопии. Было показано, что "rodletB" представляют пучки 10 нм филаментов и локализованы только в пределах нуклеоплазмы, а не пронизывают ядерную оболочку и не выходят в цитоплазму. Исследуя параллельно симпатические нейроны

звездчатого ганглия кошки, Seite et al. (1969, 1970, 1979) показали, что такие пучки имеют регулярную структуру и состоят не только из 10 нм филаментов, но с ними ассоциированы также и тубулиновые микротрубочки. Практически такие же структуры были независимо обнаружены в ядрах коры в случае полной мозговой ишемии у крыс (Pluta, 1.991) . Нами идентичные структуры были обнаружены в мезенхимальных клетках, например, в фибробластах кожи мышей, и уж совсем неожиданно в цитоплазме клеток корешков кукурузы. Следовательно эти структуры имеют универсальное распространение как в животных, так иХ растительных клетках, нутриядерные пучки или тела нами были обнаружены практически только в состоянии холодового оцепенения. При пробуждении сусликов эти структуры исчезают. В этой связи важно отметить, что наиболее быстро реагируют на появление и исчезновение этих структур пирамидные нейроны сенсомоторной области коры. Используя метод электронной иммуногистохими, Welsh and Suhan (1985) с помощью антител к актину провели анализ биохимической природы пучков 10 нм филаментов, выявляемых в ядрах культуральных фибробластов. Ими было показано, что внутриядерные пучки 10 нм филаментов имеют актиновую природу.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют: во-первых, внутриядерные пучки 10 нм филаментов могут быть выявлены в ядрах нейронов, когда их электрическая активность, а, следовательно, функциональная активность минимальна; во-вторых, актиновая природа филаментов, образующих такие пучки, может свидетельствовать о том, что в таких условиях функционального состояния нейронов часть цитоскелетных и нуклеоскелетных белков может депонироваться, по крайней мере, в нуклеоплазме за счет перехода растворенных белков в полимерные формы. Последнее позволяет сформулировать гипотезу, согласно которой депонирование в нуклеоплазме я цитоплазме таких сократительных белков как, например, актин, когда нейрон находится в неактивном состоянии (в случае сусликов: состоянии холодового оцепенения) вызвано тем, что при переходе клетки в активное состояние уже имеется достаточный пул таких белков без необходимости их дополнительного биосинтеза. В таком случае пул сократительных белков пополняется за счет деполимеризации филаментозных структур с переходом в водорастворимую фазу. Регулярная упаковка этих структур, по-вядииоку, обеспечивает возможность упаковки в нинимальном

объеме максимального количества сократительного белка (белков).

Более того, депонирование или аккумуляция сократительных белков прямо коррелирует с изменениями внутриклеточной компартментализации, в частности, например, образование "септального" ретикулума в состоянии холодового оцепенения.

Согласно Kelly (1991) одним из наиболее важных механизмов, участвующих в регуляции нейронапьных функций, является регуляция через каскад вторичных мессенджеров, контролируемых белковыми киназами с последующим фосфорилированием субстратных белков. Последние исследования (Alger, 1991; QSddes et al., 1990; Kelly, 1991; Malenka et al., 1989; McGlade-McCulloh et al., 1993; Mulkey et al., 1993; Nelson et al., 1989; Raymond et al., 1993; Schacher et al., 1990; Swope et al., 1992; Wu and Siekevitz, 1988! показывают, что такой энзим как Са++/кальмодулин-зависимая белковая киназа XI (CaM-kinase II) является наиболее распространненой в мозгу киназой и включена практически во многие процессы такие как эпилепсия, сенсорная депривация, ишения, образование синапсов, синаптическая передача, длительная потенциацияб обучение и память. В течение развития мозга экспрессия CaM-kinase II как на белковом, так и мРНКовом уровнях совпадает с активными периодами образования синапсов и, следовательно, факторы регулирующие гены кодирующие субъединицы этой киназы могут играть важную роль в установлении нормальных синаптических функций в течение зимней спячки сусликов, о чем свидетельствуют полученные нами биохимические данные (Zharikova et al., 1993).

Глава 3. Сравнительный анализ обонятельной системы в норме и при регенерации [1-3, 7-9, 13-14, 16-18, 20, 23-25, 29, 31, 33-41].

Первичные обонятельные нейроны с точки зрения нейрональной пластичности представляют уникальную модель из-за их способности постоянно образовываться из базальных (стволовых) клеток обонятельного эпителия с последующей дифференцировкой. Важно отметить, что первичные обнятельные нейроны дают свои проекции непосредственно в луковицу, представляющую часть ЦНС. При повреждениях обонятельного^ эпителия последующая регенерация обонятельных нейронов с образованием ими синаптических контактов с нейронами ЦНС позволяет понять и расширить каши знания о механизмах и пределах нейрональной пластичности. В этой связи в мы и использовали обонятельную систему.

3.1. Анализ надмолекулярной организации обонятельного рецелторного аппарата с использованием высокоразрешающей просвечивающей электронной микроскопии.

Основная трудность исследования обонятельной системы у большинства животных заключается в огромной изменчивости химических соединений вызывающих ответ. Эта ситуация сильно облегчена для обонятельной системы насекомых, например, бабочек, у которых многие рецепторы отвечают идентично только на одно вещество - феромон или половой атрактант. В последние годы интерес к феромонам резко возрос из-за надежды использовать идентифицированные атарактанты в качестве приманки для контроля численности сельскохозяйственных вредителей, среди которых насекомые представляют самую крупную группу.

Одним из классических объектов в исследованиях обонятельного аппарата насекомых, наряду с тутовым шелкопрядом ВогаЫх mori, является дубовый шелкопряд Antheraea pernyi. обонятельные сенсиллы этих насекомых досконально изучены не только на электрофизиологическом и биохимическом уровнях (Kaiasling, 1986), "но и на морфологическом уровне с использованием криоскалывания (Altner and Prillinger, 1980; Keil, 1988; Keil and Steinbrecht, 1984; Steinbrecht, 1980; 1984; 1989) . В этой связи представляет большой интерес полученная нами информация о поверхностной структуре кутикулы, покрывающей обонятельные чувствительные

волоски (Popov et al., 1994). Показано, что используя нетод замораживание - глубокое травление с вращательным напылением Pt/C можно выявить на поверхности кутикулы не только поры, заполненные веществом поровых трубочек, через которые молекулы различных запахов проникают в рецепторную лимфу и взаимодействуют с дендритом обонятельного нейрона, но и тонкую трехмерную структуру как этих пор, так и других элементов кутикулы. Так нами показано (Popov et al., 1994), что ленточная структура поверхности кутикулы не представляет структуру типа "винтовой лестницы" или "рога нарвала" (Lee and Strausfeld, 1990), каждая "лента", хотя и

располагается под некоторым углом к оси чувствительного волоска, тем не менее не связана с соседними "лентами" (Рис. 11). Кроме того, каждая лента со стороны "ступеньки" ограничена "гребеньком", что не позволяет перетеканию неивестной по природе гидрофобного вещества с одной ступеньки на другую. Нами также показано, что возле порового отверстия располагается структура подобная "гребеньку™. В краткой форме полученные нами данные схематично представлены на рис. 11. Все эти результаты свидетельствуют о том, что поверхностные структуры чувствительного волоска могут выступать в виде своеобразных "рефлекторов", которые повышают эффективность попадания нолекул одоранта в пору. Другими словами, наши данные показывают, что высокая эффективность попадания одиночных молекул феромона в чувствительный волосок зависит также и от уникальной его поверхностной организации.

Обоняние у позвоночных осуществляется через обонятельные рецепторные клетки, представляющие биполярные нейроны. Каждая клетка дает два отростка: дендрит, который выходит в слизь, и аксон. Аксоны обонятельных нейронов с помощью Шванновских клеток образуют первичный немиелинизированный нерв, который идет в обонятельную луковицу. В обонятельном эпителии каждый нейрон отделен от соседних опорными или поддерживающими клетками. В течение жизненного цикла происходит постоянное обновление как нейронов, так и опорных клеток за счет базальных клеток (Farbman, 1986; Graziadei and Monti Graziadei, 1978a,b; Moulton, 1974; Schwöb et al., 1986). структура верхних слоев обонятельного эпителия в настоящее время в достаточной мере изучена (Бронштейн, 1964, 1972, 1976, 1977; Винников и Титова, 1957; Попов и др., 1990; Пяткина, 1984, 1988; Frisch, 1967; Graziadei, 1971; Meneo, 1984, 1988а, b; Moulton and Beidler, 1967; Zeicke et al., 1987).

Рис. 10. Схематические рисунки обонятельного чувствительного

волоска Antheraea pernyi. (А) - поверхности обонятельных чувствительных волосков в их средней части после удаления гидрофобного слоя, покрывающего кутикулу (С, cuticle). (в) тонкие детали поверхности организации чувствительного волоска, включая схематический поперечный разрез через кутикулу с выявлением таки? структур как "ступеньки" (S, steps) и "бугорки" (Н, hillocks); поры (Р, pores) с "гребеньками" (R, ridgelets); и поровые трубочки (РТ, pore tubules). этот рисунок демонстрирует прямой контакт поровой трубочки с мембраной дендрита (DM, dendrite membrane) обонятельного нейрона. Где: F (furrow), "бороздка"; RF (receptor lymph), область локализации рецепторной лимфы.

Основным секреторным элементом обонятельного эпителия являются опорные клетки, апикальная мембрана которых покрыта многочисленными микровиллами длиной около 3-5 цт. эти микровиллы погружены в слой слизи, которая секретируется как опорными клетками, так и клетками Боуменовых желез. Как в клетках Боуменовых желез, так и в опорных клетках выявляются многочисленные гранулы, которые начинают интенсивно секретироваться после стимуляции обонятельной выстилки хлороформом и другими пахучими соединениями (Getchell et al., 1974, 1988; Okano and Takagi, 1974). Секреторный материал опорных клеток имеет гранулярный и везикулярный вид и дает типичные реакции на кислые и нейтральные мукополисахариды (Getchell et al., 1988; Gladysheva et al., 1936). Опорные клетки содержат кислый S-100 белок, который

характерен для гяиальных клеток (Hirsch and Margolis, 1979), что указывает на их необычное происхождение, тогда как клетки Боуменовых желез не дают иммуногистохимической реакции на S-100 белок (Getchell et al., 1987, 1988). Значение слизи, покрывающей обонятельный эпителий очень важно как для поддержания жизнедеятельности рецепторных и опроных клеток, так и для взаимодействия пахучего стимула с обонятельными рецепторами (Сагг et al., 1990). Действительно первым барьером на пути одорантов является слизь, толщина и состав которой определяет времена диффузии пахучих стимулов к peuenTopaM^Getchell et al., 1988). Обонятельная слизь многокомпонентна и содержит относительно высокие концентрации таких ионов как К+ и С1 (Бронштейн и Пяткина, 1969; Минор и др., .1990; Getchell et al., 1988); белков (Королев и Фролов, 1975, 1977); кислые мукополисахариды (Попова, 1968); олигонуклеотиды и нуклеопротеиды (Фесенко, 1981; Фесенко и Фесенко, 1977), а также различные ферменты (Семина, 1977; Cuschieri, 1974; Getchell et al., 1988; Shantha and Nakajima, 1970). Известно (Snyder et al., 1989), что, например, такой гидрофобный одорант как 2-изобутил-З-метоксипиразин (галбазин) улавливается обонянием человека в концентрации около 10 11М. в этой связи возникает вопрос о том, каким образом гидрофобные одоранты в очень низких концентрациях могут преодолеть гидрофильный барьер, в качестве ноторого выступает обонятельная слизь? Предпринятые в этом направлении исследования показали присутствие в слизи семейства -микроглобулиновых белков, которые синтезируются носовыми железами у ряда позвоночных (Getchell and Getchell, 1990; Pelosi and Maida, 1990; Pevsner et al., 1985, 1986). Согласно Carr et al.(1990) эти белки выступают переносчиками таких небольших гидрофобных молекул как ретинол, холестерол и т.д. Поскольку запах-связывающие белки не были обнаружены у трех видов костистых рыб, а также у ската (Carr et al., 1990), то для водных позвоночных предполагается присутствие в слизи в качестве переносчиков гидрофильных соединений. В настоящее время выделяют две функции запах-связывающих белков в слизи: во-первых, повышение эффективности сорбции запахов слизью и,во-вторых, уборка пахучего стимула с рецепторных участков нейронов. Интересно отметить, что у грызунов белки из семейства а -микроглобулинов являются половыми атрактантами. Секреция слизи прямо связана с функционированием обонятельных нейронов. Так

а-адренэргические, холинэргические и пептидэргические соединения влияют как на секрецию слизи, так и на чувствительность самих нейронов (Getchell et al.,1988). В этой связи понятно, что в структуру слизистого слоя помимо спмой слизи включаются также микровилли опорных клеток и апикальные циллиарные или микровиллярные части обонятельных нейронов (булавы), так как первичные процессы обнятельной рецепции разворачиваются именно в этом слое. Полученные н^ми данные с использованием замораживания-глубокого травления и вращательного напыления Pt/C с использованием в качестве ¿^¡тифриза 10-20% метанола или этанола позволили разработать методику для анализа трехмерной структуры слизи (Попов и др., 1990). Так наряду с глобулярными компонентами, в слизи также выявляются пленчатые и филаментозные структуры. Существенно, что эти структуры представляют, по-видимому, единую ваимосвязанную систему, которая по многим параметрам близка к цитозолю, включая ионный состав. Кроме того, сочетание этого метода с неченными коллоидным золотом антителами против запах-связывающих белков позволяет провести иммунологическую локализацию различных компонентов обонятельного рецепторного аппарата.

3.2. Особенности организации гомотрансплантатов в передней камере глаза крысы.

Как было выше отмечено уникальность обонятельных нейронов в нормальной выстилке взрослых животных заключается в постоянном замещении зрелых нейронов базальными стволовыми клетками путем их деления и дифферекцировки. В экстремальных ситуациях при гибели обонятельных нейронов стволовые клетки способны увеличивать скорость деления, восстанавливая за короткое время популяцию дифференцированных сенсорных клеток, аксоны которых достигают ЦНС с образованием синаптическкх контактов (Barber, 1982; Barber and Jensen, 1988; Monti-Graziadei, 1979). Эти необычные особенности обонятельных нейронов вызывают много вопросов, которые связаны не только с пониманием механизмов контролирующих размеры, скорость обмена и функциональную стабильность популяции этих клеток но и способы, по которым ЦНС реагирует на постоянно изменяющуюся популяцию афферентных синапсов. Исследования факторов, обеспечивающих непрерывный рост аксонов и синаптогенез у первичных

обонятельных нейронов, ногут сыграть принципиальное значение в решении такой проблемы как потерн регенеративной способности нервной ткани в других структурах центральной и периферической нервной системы.

Исследования анатомической динаккки в процессе дифференцировки первичных обонятельных нейронов связаны с экспериментами как с полной, так и частичной изоляцией обнятельных нейронов. Эти исследования связаны как с экспериментами in vitro с использованием диссоциированных (Goldstein and Quinn, 1981; lieble et al., 1984) и органотипических культур (Chua and Farbman, 1983;

Farbman, 1977), так и с прямой трансплантацией in vivo (Monti-Graziadei and Graziadei, 1984; Morrison and Graziadei, 1983). Тем не менее, уже само помещение клеток в культуральную посуду создает для них ненормальное окружение, нарушающее процесс дифференцировки сенсорных клеток (Barber and Jensen, 1988). Прямая тканевая трансплантация сопровождается еде большим числом не контролируемых параметров, включая посттравматические эффекты хирургических операций при выделении обонятельной ткани. В этой связи интраокулярная трансплантация предложенная Olson et al. (1981) представляет ряд преимуществ при изучении внутри- и межтканевых взаимодействий для различных нейрональных тканей по следующим причинам: 1) трансплантат удобен для визуального наблюдения; 2) за счет васкуляризации трансплантат обеспечен практически всем необходимым набором питательных веществ и ростовых факторов; 3) благодаря гематоокулярному барьеру долго не отторгается; 4) защищен от инфекции. Исследования (Barber et al., 1982; Heckroth et al., 1983; Monti-Graziadei and Graziadei, 1984; Novoselov et al., 1984) по трансплантации в переднюю камеру глаза как эмбриональной, так и взрослой обонятельных выстилок животных позволили определить на свето-никроскопическом уровне основную последовательность событий в развитии гомотрансплантатов. Результаты этих исследований подробно обобщены в обзоре Barber and Jensen (1988).

В настоящей работе для интраокулярной трансплантации мы использовали как эмбриональные обонятельные выстилки крысы, так и сотрансплантаты («эмбриональная обонятельная выстилка + эмбриональная обонятельная луковица) . Однов'ременная трансплантация эмбриональной обонятельной выстилки и луковицы была необходима для решения такого вопроса как роль синаптичесних связей между

аксонами первичных обонятельный нейронов и нейронами луковиц в дифференцировке сенсорных клеток. Согласно текущим представлениям (см.: Farbman, 1986, 1988) установление синаптических связей обонятельных нейронов с нейронами луковиц необходимое условие дифференцировки первичных обонятельных клеток, что может быть проконтролировано по образованию сенсорных цилий на булавах. Используя одновременно со световой микроскопией метод ультратонких срезов, мы практически во всех трансплантатах обнаружили дифференцированные обонятельные нейроны, булавы которых имели цилии. Одновременно бы^о проденонстрировано, что такие трансплантаты характеризовались нормальной ольфактограммой. Следовательно, трансплантаты эмбриональной обонятельной выстилки содержат дифференцированные нейроны даже в отсутствии синаптических связей с нейронами обонятельной луковицы. В остальном полученные нами свето- и электронно-микроскопические результаты оказались в соответствии с уже ранее полученными данными. Так трансплантаты в спередней камере глаза крысы через 8 недель прикреплялись как к роговице, так и к радужке. Обонятельные нейроны во всех типах трансплантатов имели четко выраженные булавы, покрытые цилиями, а также образовывали аксоны, которые с помощью Шванновских клеток были собраны в пучки. Пропорция сенсорного нейроэпителхя к респираторному сильно варьировала от трансплантатам трансплантату. В ряде случаев отмечалось врастание в трансплантаты, по-видимому, волокон тройничного нерва, идущего из радужки (Barber and Jensen, 1988). Важно отметить, что в трансплантированной эмбриональной луковице полностью практически отсутствовала дифференцировка обонятельных нейронов. Так нам не удалось выявить синаптических связей между аксонами первичных обонятельных нейронов дендритами нейронов луковиц. Практически в течение года интраокулярные трансплантаты обонятельной выстилки содержали дифференцированные обонятельные нейроны, а сами трансплантаты давали типичную ольфактограммы.

3.3. Ультраструктурные особенности регенерации обонятельных нейроно« золотой рыбки '

Подробный анализ различных типов хирургических операций по перерезке первичных обонятельных аксонов (аксотомия), связывающих обонятельную выстилку с луковицей, а также по перерезке

медианапьного и латерального субтрактов, связывающих обонятельные луковицы с Telencephalon у золотой рыбки, дан в обзоре Zippel (1993). Исследования регенерации обонятельной системы у золотой рыбки после различных типов хирургических перерезок отростков обонятельных нейронов представляют во многом уникальную модель для изучения механизмов синаптической пластичности в обонятельной системе и ЦНС. Во многом это определяется высоким регенеративным потенциалом нейронов таких примитивных позвоночных как костистые рыбы и относительной легкостью и доступностью проведения соответствующих хирургических операций tZippel, 1993) .

Наиболее отработанной операцией на. золотой рыбке является аксотомия - перерезка первичных обонятельных нервов, образованных аксонами обонятельных нейронов. Известно (Zippel, 1993; Zippel et al., 1993a, b), что после аксотомии за счет нарушения синаптических связей обонятельных нейронов с ЦНС происходит их дегенерация. Однако уже через неделю вновь образованные нейроны дают аксоны, которые достигают обонятельных луковиц, что согласно Farbman (1986) ведет к дифференцировке этих нейронов с образованием булавы с сенсорными иилиями. Ранее для проведения таких экспериментов использовались взрослые золотые рыбки длиной свыше 10 см. Проведенные Геттингенском Университете совместно с проф. Ниппелем исследования (Grant from DFG Zi-112/3-2) по перерезке первичного обонятельного нерва (второй нерв был использован как контроль) на молодых рыбках размером 5-10 см показали, что после унилатеральной аксотомии в подверженной хирургической операции обонятельная выстилке отсутствовала дегенерация первичных обонятельных нейронов, которые содержали булавы с сенсорными цилиями. Таким образок, подобно результатам по трансплантации в переднюю камеру глаза крысы эмбриональной обонятельной выстилки, когда синаптические связи между обонятельными нейронами и ЦНС (обонятельными луковицами) отсутствовали (См. Главу 3.2), обонятельная выстилка молодых золотых рыбок после аксотомии содержала дифференцированные обонятельные нейроны с сенсорными цилиями. Следовательно полученные результаты не подтверждают необходимость прямых синаптических связей обонятельных нейронов с ЦНС. Все это свидетельствует о высокой синаптической пластичности обонятельных нейронов.

Выводы:

1. Впервые на ультраструктурном и свето-микросокпическом уровнях на примере пирамидных нейронов полей САЗ/СА4 гиппокампа сусликов продемонстрированы повторные и обратимые исчезновение и образование de novo дендритных шипиков и активных зон в дифференцированном мозгу взрослых животных в условиях их врожденного стереотипного поведения.

2. в основе механизмов образования длительной потенциации в переживающих срезах гиппокампа крыс после краткой тетанической электрической стимуляции мшистых волокон лежат как пост-, так и пресинаптические перестройки, которые, по крайней мере, сопровождаются изменениями в морфологии синаптических контактах, а именно, в числе и форме постсинаптических уплотнений.

3. Повышенная эффективность синаптической передачи прямо коррелирует с активацией рибосомального белкового синтеза как в случае краткой тетанической электрической стимуляции с образованием длительной потенциации в переживающих срезах гиппокампа крыс, так и в течение баутов зимней спячки сусликов и сопровождается увеличением числа активных зон.

4. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в основе механизмов синоптической пластичности в ЦНС взрослых животных лежит синаптогенез идущий de novo за счет обновления синапсов. Как морфология и количество синаптических контактов, так и число пресинаптических везикул выступают в качестве ультраструктурных коррелятов синаптической передачи.

5. Установлено, что прямые синаптические контакты первичных обонятельных нейронов с нейронами обонятельной луковицы не являются необходимым условием дифференцировки обонятельных сенсорных клеток, которая обычно характеризуется присутствием на булаве обонятельных цилий.

6. Ультраструктурный анализ поверхности обонятельного аппарата насекомых позволил выявить принципиально новую информацию об упорядоченной структуре кутикулы сенсорных волосков, что прямо указывает на связь поверхностной морфологии и высокой чувствительности этого аппарата, по крайней мере, к половым атрактантам.

7. Показана прямая связь организации цито- (упаковка в дендритах микротрубочек и гладкого ретикулума) и нуклеоскелета

(пучки 10 nm в диаметре филаментов с регулярной структурой) с функциональным состоянием нейронов.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работахЖ

[1] Popov, V.I., Moisseeva, А.А., Zippel,Н.-Р.: Ultrastructure of

lamellar granuless coating glial cell basal lamina in the olfactory bulb and olfactory subtracts of goldfish. J. Hirnforsch.(Article has been accepted for publication from December 1993) 1994

[2] Popov, V.I., Nikonov, A.A., Agafonova, N.K.,and Fesenko,

E.E.: Surface ultrastructure of olfactory receptor sense hairs in silkmoth. J.Microscopy (Article has been accepted for publication from January 7, 1994) 1994

[3] Zharikov, S.I., Zharikova, A.D., Popov, V.X., Potekhina,

N.I., Arkhipov, V.I.: Structural-functional changes in the nerve endings of ground squirrel brain during the .hibernation. J. Neurochera. €1 ^Suppl. 61), S152A, 1993

[4] Popov, V. I,, and Bocharova, L. S.: Hibernation-induced

structural changes in synaptic contacts between mossy fibres and hippocampal pyramidal neurons. Neuroscience 48(1), 53-62, 1992

[5 3 Popov, V. I., Bocharova, L. S., and Bragin, A. G.: Repeated

changes of dendritic morphology in the hippocampus of ground squirrels in the course of hibernation. Neuroscience. 48 (1), .45-51, 1992

[6] Novoselov, V.I., Peshenko, I.V., Nikolaev Yu.V., Bystrova,

M.A., Evdokimov, V.A. , Popov, V.I., Fesenko, E.E.: Specific proteins from olfactory epithelium of vertebrates. In:" Mechanisms of sensory chemoreception of vertebrates", 1992

(7] Николаев Ю.В., Евдокимов В.А., Попов В.И.: Надмолекулярная

организация обонятельного рецепторного аппарата крысы: локализация рецепторных элементов и ГТФ-связывающих белков, ассоциированных с рецепторами. Сенсорные системы, т.6, п.З, 128-130, 1992

IS] Новиков Ю. В ,, Новоселов В.И., Попов В.И., Фесенко Е.Е.:

Трансплантат обонятельного эпителия в передней камере глаза: регуляция специфичности. Сенсорные системы, т.6, п.З, 134-137, 1992

[9J Bocharova, L.S., Gordon, R. Ya., Popov, V. I. : RNA metabolism

in the brain of hibernators.'II. Rapid changes in the neuronal ribosomal RNA content. In:" Mechanisms of Natural Hypometabolic States", pp.125-132, eds. Kolaeva, S., Popova, N., Solomonov, N., Wang, L., Pushchino, 1992

[10] Tskhovrebova; L. A., Popov, V. I., Pavlenko, V. K., and

Lednev, V.V.: The spatial organization of the cytoskeleton in crayfish stretch receptor. Eur. J. Cell Biol. 56(1), 132-138, 1991

[11] Popov, V. I., Bocharova, L.S., Gordon, R. Ya., and Bragin, A.

G. : Remodelling of glutamate synapses in the hippocampus of ground squirrel during hibernation behaviour. In: SIGNAL MOLECULES and BEHAVIOUR, (eds.: Winlow, W., Vinogradova, O.S., and Sakharov, D. A.), Manchester University Press, Manchester and New York, pp.302-305, 1991

[12] Popov, V.I., Nikcfc.ov, A.A., and Agafonova, N.K. :

Ultrastructural organization of sense hairs of an olfactory receptor in Antheraea pernyi аз revealed by freeze-deep etching with Pt/C rotary shadowing .Abstracts of 3 Int.Congr. of Comparative Physiology and Biochemistry, Tokyo, 1991

[13] Khramov, R.N., Popov, V.I., Voronkov, V.N., Zinchenko, V.P.,

Iliasova, E.N., Khutsyan, S.S.: Milimeter wave

irradiation-induced changes in morpholology and function of mast cells in acupoints. Abstracts of the 1 Arab Conf.on Medical Biophysics, Cairo University Cair, Egypt, 1991 [14]

[14] Жариков С.И., Жарикова А.Л., Попов В.И., Пашков В.Н., Гришин

Е.В.-.Влияние а-латротоксина на процессы аккумуляции и высвобождения глутамата в синаптосомах из мозга крысы. Биологические Мембраны, т.7, п.10, 1013-1021, 1990

[15] Popov, V.I., Novoselov, V.I., Alexeev, S.I., Filippova, Т.Ы.:

Changes in ultrastructures of epithelial tissues by microwaves. In:"Molecular changesf by microwaves", Abstracts of Intern. Congr., Vien, Austria, p.39, 1990

[16] Khramov, R.N. , Alexandrov, A.A., Katasv, A.A., Popov, V.I.,

Kobrinsky, E.M., Sosunov, E.A., Khutsyan, S.S., Nikonov, A.A.: Millimeter wave irradiation effects ob excitable cells. Abstracts of 10 Intern. Biophysical Congress, p.14, Vancouver, Canada, 1990

[17] Попов В.И., Хуцян с.е., Новиков Ю.В., Новоселов В.И.,

Аллахвердов Б.Л., Фесенко Е.Е.: Анализ надмолекулярной организации обонятельного нейроэпителия крысы методом замораживания-травления с круговым напылением платины/углерода. Цитология, т.32, 1090-1093, 1990

[18] Popov, V.I., Bocharova, L.S., Gordon, R. Ya. : Periodic

changes in synaptic junctions and cytoarchitecture of CA3/CA4 hippocampal neurons of ground squirrel during hibernation behaviour. Abstracts of Intern Sympos.:"Signal molecules and mechanisms of animal behaviour", Pushchino,1989

[19] Novikov, Yu.N,, Popov, V.X.: Development of olfactory neurons

transplanted into anterior chamber of the eye: fine structure and selectivity. In: "Olfaction and Taste X", Oslo, Norway, p.256, 1989

[20] Tskhovrebova, L.A., Popov, V.I., Iliasova, E.N., Pavlenko,

V.K., Lednev, V.V. : Helical structure of cytoskeleton in the crayfish stretch receptor neurons. Abstracts of Intern Symp. "Molecular organization of biological structures", v.2, p.187(E25), Moscow, 1989

[21] Гордон P.Я., Бочарова П.С., Попов В.И., Каранаухов В.Н.:

Различие в состоянии рибосон нервных клеток, выявляемые при флуорохромировании акридиновым оранжевым. Цитология, т.31, п.1, 1989 у

[22] Novoselov, V.I., Novikov, Yu.V., Popov, V.I.: The

localization, supramolecular organization and metabolism of the receptor apparatus of olfactory neurons. Abstracts of 5 Soviet-Swiss Sympos.:" Biological membranes: structuren and function", Riga, p. 97, 1988

[23] Новиков Ю.В., Николаев Ю.В., Новоселов В.И., Попов В.И.:

Рецепторный аппарат обонятельной клетки: локализация и метаболизм. Депонировано ВИНИТИ, п. 1009-В88, 1988

[24] Попов В.И., Хуцян С.С., Новоселов В.И., Новиков Ю.В.,

Аллахвервов Б.Л.: Исследование надмолекулярной организации слизи к цитоскелета в эпителиальных клетках методом замораживания-скалывания с применением глубокого травления и кругового напыления платины/углерода. Тезисы докладов 13 Всес. конф. по электронной микроскопии., стр. 18, Звенигород, 1988

[25] Гордон Р.Я., Бочарова Л.С., Попов В.И., Карнаухов в.Н.:.

Структурно-функциональные основы метаболизма РНК в мозге зимнеспяших в период зимней спячки. Сб.: "Механизмы зимней спячки", стр. 168-175, г. Пушино, 1987

[26] Попов В.И., Гордон Р.Я., Бочарова л.С.: Внутриядерные

паракристаллические образования из промежуточных и микрофиламентов. Материалы IX Всес. Симп.: "Структура и функции клеточного ядра", стр. 28, Черноголовка, 1987 [27] Бочарова

[27] л.С., Гордон Р.Я., Попов В.И.: Изменения ультраструктуры

нейронов сусликов при выходе из состояния холодового оцепенения Материалы IX Всес. Симп.: "Структура и функции клеточного ядра", стр. 4, Черноголовка, 1987

[28] Petukhov, V.V., Popov, V.I.: Quantitative analysis of

ultrastructural changes in synapses of the rat hippocampal field GA3 in vitro in different functional states. Neuroscience, v.18, n.4, 823-835, 1986

[29] Попов В.И., Аллахвердов Б.Л.: Ультраструктурный анализ роли

цитоскелета в регуляции функций плазматических мембран. Ф-актин , мембранные взаимодействия. Материалы Всес. Симп.:" Криогенные методы в электронной микроскопии", стр. Q-15, Пущино, 1985

[30] Петухов В.В., Попов В.И.: Электронно-кикроскопическое

изучение синапсов ншистых окончаний гиппокаипа в различных функциональных состояниях. Тезисы докладов I Всес. Биофизического Сьезда, т.2, АН СССР, Москва, 1982

[31] Попов в.И., Тагеева С.В.: Исследование методом

замораживания-скалывания субструктуры мембран с помощью кругового напыления Pt/C. Тезисы докладов XII Всес. конф. по электронной микроскопии, стр. 248-249, г. Сумы, Наука, Москва, 1982

[32] Попов В.И., Петухов В.В.: Некоторые особенности

ультраструктурных изменений в синапсах поля САЗ гиппокаипа при разлизных функциональных состояниях in vitro. ЛАН СССР, т. 265, п.4, 1005- 1009, 1982 >

[33] Gukovsky, I.Ia., Gukovskaya, A.S., Saxon, M.E., Popov, V.I.,

Budnitsky, A.A., Vexler, A.M.: Action of phalloidin on the mitotic cycle of Chinese hamster fibroblasts. Naturwissenschaften, v.67, 196-197, 1980

[34] Попов В.И.: Ультраструктурные особенности организации

межклеточных и внутриклеточных контактов. Тезисы докладов XI Всес. конф. по электронной микроскопии, стр. 157, Таллин, Наука, Москва, 1979

[35] Popov, V.I., Allakhverdov, B.L., Shartava, A.S., Saxon, M.E.:

Relation between microfilaments (F-actin) and freeze-fracture particles clastering in mouse lymphocyte plasmamembrane. Abstracts of Intern. Symp. on Freeze-Etching, Kapellendorf Castle- Jena, GDR, 1979

[36] Popov, V.I., Shartava, A.Sh., Saxon, M.E., Allakhverdov,

B.L.: Microfilament-linked alterations of intramembrane structure and permeability of mouse lymphocytes. Naturwissenschaften, v.66, 163-164, 1979

[37] Popov, V. I., Shartava, A.S., Saxon, M.E., Allakhverdov, B.L. :

The role of G-F transitions of the membrane associated actin in a control of lateral mobility of intramembrane particles. In proceedings of the 7 European Conf. on muscle and cell motility, pp. 115-116, Wareawa, Poland, 1978

[38] Кауров B.C., Попов В.И., Финаков Г.З., Тагеева С.В.:

Статистический анализ надмолекулярной организации

фотосинтетяческих мембран на основе электроннограмм, получаемых методом замораживани-скалывания. Тезисы докладов Всес. конф."Статистические свойства микроструктур", стр. 165-166, Москва, 1978

[39] Saxon, М.Е., Popov, V.I., Kirkin, A.N., Kovalenko, V.A.,

Miroshnikov, A.I.: De-novo formation of tight-like junctions induced with phalloidin between mouse lymphocytes. Naturwissenschaften, v.65, 62-63, 1977

[40] Попов З.И., Аллахвердов Б.Л., Тагеева C.B.: Исследование

надмолеуклярной организации фотосинтетических мембран методом замораживания-скалывания. ДАН СССР, т. 231, п.6, 1476-1478, 1976

[41] Попов В.И., Тагеева C.B.: Новые перспективы применения

морфометрии для электронно-микроскопического анализа

надмолекулярной организации мембран, выявляемой методом замораживания-скалыв_ания. В сб.: "методы подготовки сложных объектов и анализ электронно- микроскопических изображений", стр.162-163, Петрозаводск, 1976

15.04.94 г. Зак.ООбОР. Тар.100 экз. Уч.-изд.л. 3,0 Отпечатано на ротапринте в 0НТИ ПШ РАН

Информация о работе

Попов, Виктор Иванович
доктора биологических наук
Пущино, 1994
ВАК 03.00.01

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Морфологические корреляты синаптической пластичности ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Морфологические корреляты синаптической пластичности"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфологические корреляты синаптической пластичности
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология