Морфофункциональные свойства разных типов нейронов и их синаптические связи в префронтальной коре макаки и крысы

Зайцев, Алексей Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфофункциональные свойства разных типов нейронов и их синаптические связи в префронтальной коре макаки и крысы
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные свойства разных типов нейронов и их синаптические связи в префронтальной коре макаки и крысы"

На правах рукописи

Зайцев Алексей Васильевич

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА РАЗНЫХ ТИПОВ НЕЙРОНОВ И ИХ СИНАПТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ В ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЕ МАКАКИ И КРЫСЫ

03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

13 НАР гщ

Санкт-Петербург - 2014

005545934

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук

Научный консультант:

Магазаник Лев Гиршевич

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор (ИЭФБ РАН).

Официальные оппоненты:

Никольский Евгений Евгеньевич

академик РАН, доктор медицинских наук, профессор (Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН).

Отеллин Владимир Александрович

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор (Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН).

Кривой Игорь Ильич

доктор биологических наук, профессор (СПбГУ).

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита состоится <?апреля 2014 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д002.127.01 по присуждению ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИЭФБ РАН, с авторефератом — на сайте ВАК РФ.

Автореферат разослан 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Маслова Марина Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Префронтальная кора - важнейший интегративный центр нервной системы млекопитающих. К префронтальной коре относят часть лобной коры, тесно связанную с ассоциативным медиодорсальным ядром таламуса и получающую многочисленные дофаминергические проекции от стволовых ядер. Эта область мозга также связана с большинством вторичных и третичных сенсорных и моторных областей коры, многими ядрами таламуса, покрышки мозга, гипоталамуса, бледного шара, амигдалы, гиппокампа, ретикулярной формации среднего мозга, черной субстанции среднего мозга, мозжечка и ряда других структур (Fuster, 2008). Префронтальная кора обеспечивает организацию целенаправленных действий во времени, удержание в памяти недавних событий (сенсорных стимулов), концентрацию внимания на целевых стимулах и подготовку к выполнению будущих действий. Важную роль префронтальная кора играет в регуляции эмоций, социальном поведении, контроле вегетативных функций.

Префронтальная кора значительно увеличивается в размерах в ходе эволюции млекопитающих, достигая наибольшего размера у приматов. У человека она составляет до 29% от общей поверхности коры. В онтогенезе развитие префронтальной коры идет в течение длительного времени: у человека созревание префронтальной коры продолжается до 20-летнего возраста (Paus, 2005, Toga et al., 2006, White et al., 2010). Префронтальная кора напрямую задействована в патогенезе многих психических заболеваний, включая шизофрению, депрессию и другие (Lewis and Levitt, 2002, Puig and Gulledge, 2011).

Исходя из исключительно важной роли префронтальной коры в организации психической деятельности человека и ее вовлеченности в ряд патологических процессов, в настоящее время во многих лабораториях мира ведется изучение нейрофизиологических механизмов ее функционирования. Одно из ведущих направлений - это исследование свойств структурных элементов коры (нейронов) и особенностей их взаимодействий.

Часто предполагается, что нейронные сети внутрикорковых модулей состоят из сходных структурных элементов и построены по единому каноническому принципу у всех видов млекопитающих (Douglas and Martin, 2004, Nelson et al., 2006). Межвидовые различия в корковых функциях возникают в основном из-за различий в количестве этих модулей и особенностей их внешних связей. Так как срезы коры грызунов существенно доступнее для изучения, то большинство сведений о нейронных механизмах работы коры были получены именно на этом объекте. Однако сейчас накоплено большое количество данных, указывающих на то, что сами структурные компоненты корковых модулей могут различаться у различных видов (Letinic et al., 2002, Butt, 2005). Поэтому остается дискуссионным вопрос, насколько правомерно использование этих результатов для выяснения функций префронтальной коры приматов и в том числе человека. Вместе с тем экспериментальных работ, непосредственно посвященных изучению свойств нейронов префронтальной коры приматов, в особенности ГАМКергических тормозных интернейронов крайне мало. Это делает необходимым проведение комплексного физиологического изучения нейронов префронтальной коры приматов.

и дать описание их характеристик, определить свойства их синаптических связей, а также провести сравнение свойств нейронов префронтальной коры крысы и макаки, и тем самым приблизиться к пониманию особенностей механизмов работы префронтальной коры и роли отдельных типов нейронов в осуществлении функций.

Основные задачи исследования.

1. Изучить электрофизиологические свойства популяции пирамидных нейронов 2-3-го слоев префронтальной коры макаки и выявить основные физиологические классы пирамидных нейронов, используя методы многомерного статистического анализа; определить возможную роль разных классов пирамидных клеток в функционировании префронтальной коры.

2. Изучить и проанализировать морфологические, электрофизиологические и биохимические свойства гетерогенной популяции ГАМКергических интернейронов 2-3-го слоев префронтальной коры макаки и разработать их классификацию; предсказать возможную функциональную роль каждого из изученных типов интернейронов.

3. Провести сравнение электрофизиологических и морфологических свойств сходных типов интернейронов префронтальной коры крысы и макаки и тем самым установить, насколько схожи и насколько различаются гомологичные элементы нейронных сетей у двух видов, стоящих на разных ступенях эволюционного развития.

4. Изучить и сопоставить свойства возбуждающих постсинаптических ответов у разных типов нейронов префронтальной коры крысы и макаки. В частности, исследовать свойства миниатюрных и вызванных постсинаптических возбуждающих ответов. Выявить функциональное значений различий в постсинаптических ответах у разных типов нейронов, их роль в реализации упреждающего дисинаптического торможения. Исследовать особенности синаптических связей между пирамидными нейронами и тормозными быстроразряжающимися корзинчатыми клетками в префронтальной коре крысы.

5. Выявить специфические особенности формирования долговременной синаптической пластичности у пирамидных клеток префронтальной коры крысы. Изучить роль и механизм действия некоторых нейромодуляторов на синаптическую пластичность.

6. Определить, есть ли связь между массовой элиминацией глутаматергических кортикальных синапсов и их функциональным созреванием в подростковом возрасте у приматов. Для этого исследовать особенности функционального созревания возбуждающих синапсов пирамидных клеток 2-3-го слоя префронтальной коры макаки, выявить пресинаптические (вероятность освобождения медиатора) и постсинаптические (соотношение вклада АМРА и ИМОА рецепторов, субъединичный состав рецепторов) изменения в ходе онтогенеза.

Научная новизна. На основе репрезентативной серии экспериментов и статистического анализа результатов впервые выявлено, что пирамидные клетки 2-3-го слоев коры приматов по своим электрофизиологическим свойствам подразделяются на 4 класса. Эти результаты существенно отличаются от данных, полученных ранее при изучении коры грызунов, где почти все пирамидные клетки 2-3 слоев относятся к одному классу регулярноразряжающихся нейронов.

Впервые проведено комплексное исследование ГАМКергических интернейронов префронтальной коры макаки, включающее изучение морфологических, электрофизиологических и биохимических характеристик, на основе чего была разработана классификация интернейронов коры макаки. Впервые обнаружены и охарактеризованы типы интернейронов, не встречающиеся в коре грызунов.

Впервые проведено прямое сравнение свойств некоторых типов интернейронов префронтальной коры крысы и обезьяны, выявлено, что, морфологически сходные интернейроны крысы и обезьяны могут относиться к разным функциональным типам, что обнаруживается при электрофизиологическим исследовании. Впервые показано, что интернейроны у обезьяны характеризуются большей возбудимостью, чем у крысы.

Впервые всесторонне изучены и сопоставлены возбуждающие постсинаптические ответы пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов префронтальной коры крысы и макаки. Выявлено, что у обоих видов постсинаптические ответы быстроразряжающихся интернейронов характеризуются более быстрой кинетикой, большей амплитудой и при суммации раньше вызывают потенциалы действия, чем у пирамидных клеток. При изучении синаптически связанных пар интернейронов и пирамидных клеток крысы впервые показано, что латеральное торможение в префронтальной коре, реализуемое через быстроразряжающиеся интернейроны, слабее, чем возвратное торможение.

Впервые обнаружено, что в префронтальной коре крысы при использовании синхронизирующих протоколов наблюдается нарушение правила Хэбба о знаке долговременной синаптической пластичности: протоколы с негативной задержкой и позитивной задержкой вызывают долговременную депрессию в отличие от других областей коры. Впервые установлено, что подавление медленной следовой гиперполяризации позволяет восстановить выработку долговременной потенциации при использовании синхронизирующего протокола с позитивной задержкой. Выявлен возможный механизм действия нейромодуляторов на синаптическую пластичность через ингибирование медленной следовой гиперполяризации.

Впервые показано, что функциональное созревание возбуждающих синапсов пирамидных клеток префронтальной коры макак завершается до подросткового возраста, и что массовая элиминация возбуждающих синапсов в подростковом возрасте происходит через механизмы, не связанные с их функциональной зрелостью.

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенное комплексное электрофизиологическое и морфологическое изучение гетерогенной популяции нейронов дорсолатеральной префронтальной коры макаки позволяет лучше понять клеточные механизмы работы префронтальной коры и предсказать роль отдельных типов нейронов в осуществлении функций в норме и при патологиях ЦНС. Использованные в работе методы многомерного статистического анализа позволили выявить фундаментальные закономерности в проявлении электрофизиологических свойств нейронов, полученные результаты прямо свидетельствуют в пользу существования ограниченного числа классов нейронов с определенным набором свойств.

Межвидовое сравнение некоторых типов интернейронов выявило, что ряд их электрофизиологических характеристик существенно отличается у крысы и обезьяны, что свидетельствует о различиях в функционировании префронтальной коры у этих

видов. Проведенное исследование позволяет лучше понять ход основных изменений в филогенетическом развитии префронтальной коры у млекопитающих. Результаты исследования показывают, что экстраполяцию данных, полученных на грызунах, к приматам, и, в конечном счете, к людям надо делать очень осторожно.

Новые данные об особенностях функционального становления синаптической передачи в онтогенезе, а также синаптической пластичности в префронтальной коре важны для понимания механизмов развития психических функций в норме, также они будут полезны при изучении патогенеза ряда заболеваний ЦНС, связанных с нарушениями в развитии. Важное практическое значение имеют результаты, полученные при изучении субъединичного состава синаптических рецепторов у разных типов нейронов, они позволяют разрабатывать фармакологические подходы с избирательным воздействием на целевые группы нейронов.

Положения, выносимые на защиту

1. Методы многомерного статистического анализа позволяют идентифицировать непересекающиеся группы нейронов коры и выявить наиболее важные критерии для классификации и идентификации типов нейронов.

2. Морфологически сходные интернейроны префронтальной коры крысы и макаки могут различаться по электрофизиологическим свойствам, что свидетельствует о функциональных различиях в организации работы префронтальной коры грызунов и приматов.

3. Различия в свойствах синаптических входов у пирамидных клеток и интернейронов имеет важное функциональное значение для обеспечения работы коры.

4. В префронтальной коре крысы, в отличие от других областей коры и гиппокампа, протоколы с синхронизацией пре- и постсинаптической активности независимо от их последовательности вызывают долговременную депрессию синаптической передачи.

5. Функциональное и морфологическое созревание возбуждающих синапсов в префронтально коре приматов происходит в онтогенезе в разное время.

Личный вклад автора. Планирование и выполнение экспериментов, обработка, анализ и подготовка результатов к публикации проводилось лично автором или совместно с сотрудниками Питтсбургского университета (США), университета Тринити-Колледж (Ирландия), ИЭФБ РАН (Россия) Н.В. Повышевой; D.A. Lewis; R. Anwyl, L.S. Krimer; G. Gonzalez-Burgos; D. Rotary; Л.Г. Магазаником, Д.Б. Тихоновым, К.Х. Ким. Техническую помощь оказывали сотрудники Питтсбургского университета О. Krimer и J. Kosakowski.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Annual Meetings of Society for Neuroscience (Новый Орлеан, 2003; Сан-Диего, 2004; Вашингтон, 2005; Атланта, 2006; Вашингтон, 2008; Чикаго, 2009), FENS Forums of Neuroscience (Амстердам, 2010; Барселона, 2012), WPIC's Fourth Annual Research Day (Питгсбург, 2004), WPIC's Sixth Annual Research Day (Питтсбург, 2006), 3rd Annual Neuroscience Ireland Conference (Дублин, 2008), III съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011), XIV Международного совещания и VII Школы по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011), Восьмом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Ялта, 2012), II Всероссийская конференция с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология»

(Пущино, 2012), XXII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), FENS Featured Regional Meeting (Прага, 2013) и др.

Публикации. Основные результаты диссертации представлены в 49 печатных работах, в числе которых 16 статей в журналах, включенных в систему цитирования Web of Science.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 278 страницах и состоит из введения, обзора литературы, характеристики методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, изложенных в 9 главах, заключения, выводов и списка литературы, включающего 590 источников. Диссертация иллюстрирована 125 рисунками и 22 таблицами.

Материалы и методы исследования

Эксперименты были сделаны на переживающих срезах префронтальной коры мозга яванских макак {Macaca fascicularis) и на переживающих срезах медиальной префронтальной (прелимбической и инфралимбической) коры мозга крысы (самцы линии Вистар). Все эксперименты проводились в соответствии с правилами по работе с лабораторными животными. Эксперименты включали в себя регистрацию и анализ электрофизиологических характеристик отдельных нейронов и их синаптических связей, определение ряда гистохимических маркеров и морфологическую реконструкцию нейронов. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программных пакетов Excel MS Office, Origin, Statistica. Данные в большинстве случаев приводятся как средние значения со стандартными ошибками измерения.

Результаты и обсуждение

Пирамидные нейроны префронтальной коры обезьян

Ранее было показано, что префронтальная кора играет ключевую роль в сложных когнитивных функциях, в том числе в обеспечении оперативной памяти. Предполагается, что постоянно поддерживаемая спайковая активность нейронов префронтальной коры в период отставленного ответа представляет собой нейронный механизм удержания информации в оперативной памяти, необходимой для правильного выполнения задачи (Goldman-Rakic, 1995). Способность пирамидных нейронов поддерживать спайковую активность в ходе отставленного ответа во многом определяется электрофизиологическими свойствами мембран этих клеток. Например, сильная частотная адаптация в ходе пачечного ответа существенно ограничивает возможность участия такого нейрона в реверберации нервных импульсов по нервным цепочкам (Pinto and Ermentrout, 2001). В компьютерных моделях было показано, что клетки с сильной частотной адаптацией могут снижать эффективность хранения информации в кратковременной памяти (Carter and Wang, 2007).

Данное исследование было сфокусировано на изучении электрофизиологических свойств пирамидных нейронов 2-3-го слоев, так как считается, что отставленная активность именно этих нейронов является клеточным механизмом оперативной памяти (Goldman-Rakic, 1995). Были проанализированы более 20 электрофизиологических характеристик у 77 пирамидных нейронов с целью выделения основных классов нейронов. Для классификации нейронов использовался алгоритм иерархической кластеризации Уорда в многомерном Евклидовом

пространстве. Полученная дендрограмма показывает, что существует 4 класса пирамидных нейронов (Рис. 1). Эти классы различаются по многим электрофизиологическим свойствам.

« 30

Рис. 1. Дендрограмма, полученная на основе кластерного анализа, указывает на наличие 4 различных электрофизиологических классов пирамидных нейронов.

Классы 1 (п=27) и 2 (п=13) включают в себя в основном регулярноразряжающиеся пирамидные нейроны. Эти нейроны при действии порогового деполяризующего тока генерируют потенциалы действия с небольшой частотой, при этом в течение ответа частота спайков слегка уменьшается (Рис. 2).

ЯЭ (А2009)

Х-

Рис. 2. Типичные примеры ответов пирамидных нейронов из 2-3-го слоев префронталыюй коры макаки: (А) регулярноразряжающийся нейрон, (В) залповый нейрон, (С) нейрон с промежуточным паттерном. Показаны записи ответов при применении деполяризующих токов равных соответственно 1.0, 1.5 и 2.0 реобазам.

Частота потенциалов действия и степень частотной адаптации возрастают с увеличением силы деполяризующего тока, однако амплитуда и порог генерации потенциалов действия практически не изменяются. Регулярноразряжающиеся пирамидные нейроны из 1-го класса характеризуются существенно меньшим входным сопротивлением, чем из 2-го и поэтому требуют для активации больших токов.

В 4-й класс (п = 13) входят в основном низкопороговые залповые нейроны. Эти клетки в отличие от регулярноразряжающихся нейронов отвечают на пороговый деполяризующий ток не одиночными потенциалами действия, а пачками (залпами) из 2-5 высокочастотных спайков (Рис. 2). В пачке порог потенциалов действия несколько

возрастает, а их амплитуда снижается. После начального залпа потенциалов действия нейроны продолжают отвечать одиночными спайками. Частота потенциалов действия уменьшается в течение ответа, а их амплитуда и порог остаются неизменными, как и у регулярноразряжающихся нейронов.

В класс 3 (п = 24) входят нейроны, которые при околопороговой силе деполяризующего тока ведут себя как регулярноразряжающиеся нейроны, однако при увеличении силы тока отвечают как залповые нейроны. Эти клетки названы нами нейронами с промежуточными свойствами (Рис. 2).

Таким образом, выявлено, что во 2-3-ем слоях префронтальной коры обезьяны примерно от 1/3 до 1/2 популяции пирамидных клеток не является регулярно разряжающимися. Эти результаты существенно отличаются от данных, полученных при изучении коры грызунов, где почти все пирамидные клетки 2-3 слоев относятся к регулярноразряжающимся; пирамидные клетки с другими мембранными свойствами находят только в глубоких слоях коры грызунов (Degenetais et al., 2002, Otsuka and Kawaguchi, 2011). Тем не менее, разнообразные по электрофизиологическим свойствам пирамидные нейроны были обнаружены во 2-3-ем слоях коры человека (Foehring et al., 1991). Таким образом, кора головного мозга обезьяны, как и кора мозга человека, отличается от коры грызунов по электрофизиологическим свойствам пирамидных клеток.

В исследуемой популяции пирамидных клеток не было найдено быстро адаптирующихся клеток, у которых спайки полностью прекращаются при длительной деполяризации. Хотя эти клетки описаны у многих видов животных в разных отделах коры (Nunez et al., 1993, Chang and Luebke, 2007, Otsuka and Kawaguchi, 2008). Более того, частотной адаптации спайкового ответа практически не наблюдалось у пирамидных клеток с регулярным паттерном ответа при малой интенсивности деполяризующего тока. При большей силе деполяризующего тока частота потенциалов действия быстро стабилизировалась после короткого периода частотной адаптации: у низкопороговых клеток и регулярноразряжающихся пирамидных клеток с высоким входным сопротивлением период адаптации обычно не превышал 100-200 мс (3-6 начальных потенциала действия), а у регулярноразряжающихся клеток с низким входным сопротивлением и клеток промежуточного типа этот период был еще короче. Анализ характеристик ответов разных классов пирамидных клеток, описанных в данном исследовании, позволяет предположить, что регулярноразряжающиеся клетки обладают наиболее подходящими электрофизиологическими свойствами для поддержания рециркуляции нервных импульсов в префронтальной коре.

Нейронная активность в префронтальной коре приматов имеет решающее значение для координации сенсорной и моторной деятельности, памяти и других психических процессов, необходимых для достижения конкретной цели (Miller and Cohen, 2001). Когнитивный контроль, осуществляемый префронтальной корой, обеспечивается сложными формами обработки информации в нейронных сетях префронтальной коры, специфичных для этого отдела коры. Следует отметить, что нейроны с залповой активностью, не типичные для поверхностных слоев коры грызунов, могут играть уникальную роль в передаче информации, а кроме того участвовать в некоторых формах кратковременной синаптической пластичности. Например, залпы спайковой активности могут усиливать сигнал при передаче информации по цепочке нейронов (Lisman, 1997), могут изменять частоту передачи сигнала (Abbott et al., 1997), или передавать возбуждение на определенные типы

нейронов (Berger et al., 2010). Важно отметить, что в то время как низкопороговые клетки генерируют залпы спайковой активности независимо от силы деполяризующего стимула или их мембранного потенциала, то характер спайкового ответа клеток промежуточного типа зависит от этих двух параметров. При одних условиях эти клетки будут разряжаться регулярно, а в других условиях залпами спайковой активности. Таким образом, соотношение регулярноразряжающихся клеток и клеток с залповой активностью может меняться в зависимости от функционального состояния и общего уровня активности в нейронных сетях коры обезьян.

Различная возбудимость пирамидных клеток, разные зависимости между силой деполяризующего тока и частотой потенциалов действия, выявленные в данной работе для разных классов пирамидных клеток, могут играть важную роль в функционировании корковых нейронных сетей. Например, низкопороговые пирамиды и регулярноразряжающиеся пирамидные клетки с высоким входным сопротивлением будут вовлекаться в спайковую активность при меньшей силе синаптической стимуляции, кроме того, так как у этих пирамидных клеток обычно большая постоянная времени мембраны, то они могут более эффективно суммировать приходящие возбуждающие синаптические потенциалы. Напротив, пирамидные клетки промежуточного типа и клетки с регулярным паттерном и низким входным сопротивлением будут активироваться только сильными раздражителями.

Полученные результаты показывают, что выявленная неоднородность электрофизиологических мембранных свойств пирамидных клеток может влиять на особенности обработки информации в префронтальной коре. Дополнительные исследования необходимы, чтобы понять, как конкретные электрофизиологические особенности отдельных нейронов префронтальной коры определяют их поведение при действии различных внутренних и внешних факторов в ходе когнитивной деятельности.

Интернейроны префронтальной коры обезьян

Важную роль в осуществлении функций префронтальной коры играют ГАМКергические интернейроны, однако в коре приматов они были мало изучены. Нами предложена классификация интернейронов 2-3-го слоев префронтальной коры обезьян и дается систематическое описание морфологических, электрофизиологических и некоторых биохимических свойств у выделенных классов интернейронов.

Всего в выборку было включено 194 морфологически реконструированных и электрофизиологически охарактеризованных интернейрона. В основе предложенной морфологической классификации лежат два морфофункциональных критерия: (1) распределение отростков аксона по слоям и колонкам коры, что отражает функциональную роль интернейрона в корковых сетях; (2) особенности паттернов аксонной арборизации, форма терминальных окончаний аксона и расположение пресинаптических бутонов, что помогает понять, с каким доменом постсинаптических нейронов синаптически связан данный интернейрон. На основе этих критериев были выделены 8 морфологических типов интернейронов (рис. 3).

Вертикально-ориентированные корзинчатые клетки

окончания аксона формирует петли

вокруг постсинаптических нейронов

Клетки Мартинотти

аксон формирует густое сплетение в 1 слое

|Интернейроны 2-3 слоев коры

Аксоны идут к глубоким слоям

Аксоны расположены в основном в том же слое, что и тело

Клетки с двойным букетом

Аксон ные коллатерали тонкие, ветвятся незначительно

Аксоны без явных специализированных терминалей

Большие корзинчатые клетки

ветви аксона практически не имеют | изгибов, идут на большие расстояния

Аксон с извилистым паттерном арборизации

Нейроглиаформные клетки

аксон многократно ветвится и формирует густую сеть из тонких многократно переплетенных веточек, много радиальных дендритов

Специализированные терминали аксона

Гнездчатые корзинчатые клетки

мало первичных дендритов

Малые корзинчатые клетки

аксон формирует петли вокруг нейронов

Клетки-канделябры

аксон формирует картриджу

Рис. 3. Схема определения морфологических типов интернейронов 2-3-го слоя дорсолатеральной префронталыюй коры обезьяны. Все нейроны были 3D реконструированы с помощью компьютерной программы Neurolucida Neuron Tracing. Линейка = 100 мкм. Слои отмечены арабскими цифрами.

Согласно полученным результатам в префронтальной коре макаки преобладают большие и гнездообразные корзинчатые интернейроны (Таблица 1). Найденное нами соотношение разных морфологических типов интернейронов в коре макаки не совпадает с тем, что описано в коре крысы (Магкгат & а1., 2004). В коре макаки по сравнению с корой крысы выявлен существенно больший процент нейроглиформных клеток (10% и 1%) и клеток-канделябров (7% и 2%), тогда как клетки Мартинотти встречаются реже (7% и 16%). Более того, вертикальноориентированные корзинчатые

клетки и клетки с двойным букетом вероятно не являются полными аналогами колончатых интернейронов из коры крысы.

Таблица 1.

Основные характеристики интернейронов префронтальной коры обезьяны

Морфологический тип Молекулярный маркер Длительность спайка Частотная адаптация

Большие корзинчатые клетки (30%, п=59) Парвалъбумин Быстрый Без адаптации

Клетки-канделябры (7%, п=13) Парвальбумин Быстрый Без адаптации

Нейроглиаформные клетки (10%, п=19) Кальбиндин (и нейропептид У) Медленный С быстрой адаптацией

Клетки Мартинотти (7%, п=14) Соматостатин (и кальбиндин) Медленный С медленной адаптацией

Гнездообразные корзинчатые клетки (21%, п=41) Кальбиндин или кальретинин в некоторых клетках, другие маркеры (?) Медленный С медленной адаптацией

Клетки с двойным букетом (11%, п=21) Кальретинин (или кальбиндин в некоторых клетках) Медленный С медленной адаптацией

Вертикальноориентированные корзинчатые клетки (7%, п=13) Кальретинин Промежуточный С медленной адаптацией

Малые корзинчатые клетки (7%, п=14) Кальретинин (или кальбиндин в некоторых клетках) Промежуточный С медленной адаптацией

У каждого интернейрона было измерено 20 электрофизиологических свойств, которые описывают: 1) мембранные ответы нейрона на подпороговые стимулы; 2) характеристики потенциала действия; 3) ритмическую активность нейрона. Проведенный однофакторный дисперсионный анализ показал, что морфологические группы интернейронов отличаются друг от друга по большинству электрофизиологических свойств. Post-hoc анализ с использованием теста Фишера парных сравнений выявил, что каждый морфологический тип обладает уникальным набором электрофизиологических признаков.

Разные по морфологии нейроны характерным образом отвечают на гиперполяризутощий и подпороговый деполяризующий токи (Рис. 4).

Рис. 4. Типичные примеры подпороговых ответов интернейронов. (А) Пример рамповой деполяризации у клетки-канделябра

(B) Подпороговые ответы нейроглиаформного интернейрона. (Си й) Подпороговые ответы гнездообразной корзинчатой клетки

(C) имеют меньшие амплитуды горба (стрелка), спада потенциала при гиперполяризации (треугольник) и возвратной деполяризаг^и (звездочка), чем у малой корзинчатой клетки (О).

Длительность потенциала действия оказалась одним из наиболее важных различительных признаков. По результатам дисперсионного анализа было выделено 3 группы интернейронов: (1) Интернейроны с быстрыми спайками: клетки-канделябры (0.32 ± 0.06 мс) и большие корзинчатые клетки (0.38 ±0.11 мс); это типичные значения длительности спайка для быстроразряжающихся интернейронов. (2) Интернейроны со средней продолжительность спайков: вертикальноориентированные корзинчатые клетки (0.53 ± 0.12 мс) и малые корзинчатые клетки (0.52 ± 0.09 мс). (3) Интернейроны с медленными спайками. Это нейроглиаформные интернейроны - 0.62 ±0.13 мс, клетки Мартинотти- 0.68 ±0.17 мс, гнездообразные корзинчатые клетки - 0.68 ± 0.12 мс и клетки с двойным букетом - 0.74 ± 0.19 мс.

Ритмическая активность интернейронов на деполяризующий ток сильно различалась по величине начальной и полной частотной адаптации у разных типов. Согласно двум этим характеристикам выделяются 3 основных паттерна ритмической активности интернейронов коры макаки.

1. Спайковый ответ без частотной адаптации. Интернейроны практически не изменяют частоту своих разрядов во время действия деполяризующего тока, максимальные изменения в частоте спайков не превышают 25%. Такой паттерн ответа характерен для классических корзинчатых клеток и клеток-канделябров (рис. 5А).

2. Спайковый ответ с медленной частотной адаптацией. Частота спайков постепенно понижается в течение действия деполяризующего тока. Величина адаптации у таких нейронов практически не зависит от силы деполяризации. Этот паттерн ответа характерен для клеток Мартинотти, клеток с двойным букетом, малых, гнездообразных и вертикальноориентированных корзинчатых клеток (рис. 5В).

3. Спайковый ответ с быстрой частотной адаптацией. Данный тип паттерна выявлен только у нейроглиаформных нейронов. Частотная адаптация этих клеток сильно

зависит от силы деполяризующего тока. При околопороговой деполяризации наблюдается паттерн без частотной адаптации. При увеличении деполяризации частотная адаптация резко возрастает, при этом изменение частоты потенциалов действия происходит за очень короткий промежуток времени (рис. 5С).

А ВС

10 т 20 33

Порядковый номер потенциала действия в ответе

Рис. 5. Основные типы ритмической активности: (А) без адаптации (клетка-канделябр), (В) с медленной адаптацией (гнездообразная корзинчатая клетка) и (С) с быстрой частотной адаптацией (нейроглиаформная клетка). Ток равен одной и двум реобазам. Внизу частотная адаптация в этих клетках при разных значениях деполяризующего тока (шаг - 10 пА).

Среди выделенных типов ритмической активности интернейронов только первые два были также описаны у грызунов. Спайковый ответ с быстрой частотной адаптацией нетипичен для интернейронов грызунов. И наоборот, некоторые типы ответов, характерные для грызунов, не были найдены.

Также 106 интернейронов коры макаки были проверены на наличие калъцийсвязывающих белков (парвальбумина, кальретинина и кальбиндина) и нейропептидов (соматостатина-14 и нейропептида У). Было обнаружено, что парвальбумин часто экспрессируется в клетках-канделябрах и больших корзинчатых клетках, кальбиндин - в нейроглиаформных клетках и клетках Мартинотти, кальретинин - в вертикальноориентированных корзинчатых клетках (Таблица 1).

Каждый интернейрон, как правило, одновременно проверялся на наличие двух маркеров. Нами не было выявлено колокализации двух калъцийсвязывающих белков в одном интернейроне, тогда как такая колокализация показана для интернейронов грызунов (Магкгат е1 а1., 2004). В то же время колокализация нейропептидов и калъцийсвязывающих белков была обнаружена: нейроглиаформные клетки могли одновременно экспрессировать кальбиндин и нейропептид У, а клетки Мартинотти — кальбиндин и соматостатин.

Электрофизиологические свойства интернейронов, экспрессирующих разные кальцийсвязывающие белки, существенно различались (Таблица 2). Парвальбумин-

положительные нейроны представляли собой довольно однородную популяцию быстроразряжающихся интернейронов без частотной адаптации. Интернейроны, содержащие кальбиндин или кальретинин, были более разнообразны по своим свойствам, однако при ритмической активности все эти клетки обычно показывали частотную адаптацию, а длительность их потенциалов действия была обычно больше, чем у парвальбумин-положительных интернейронов.

Таблица 2

Электрофизиологические свойства интернейронов, экспрессирующих разные кальцийсвязывающие белки

Электрофизиологические характеристики Группы интернейронов, содержащих Статистический анализ

РУ (п=14) СВ (п=8) СЯ (п=16) АИОУА Роэ^Ьос тесты

Потенциал покоя (мВ) -70 ±7 -68 ±9 -71 ±9 р=0.54 (РУ, СВ, СЯ)

Входное сопротивление (МОм) 235 ±68 585 ± 137 582 ± 195 р<0.001 (РУ), (СЯ, СВ)

Постоянная времени мембраны (мс) 8.5 ± 1.9 15.8 ± 3.8 18.9 ± 4.0 р<0.001 (РУ), (СЯ, СВ)

Коэффициент адаптации 0.80 ± 0.11 0.64 ± 0.12 0.61 ± 0.17 р=0.07 (РУ, СВ), (СЯ, СВ)

Порог потенциала действия (мВ) -42 ±4 -46 ±4 -41 ±5 р=0.26 (РУ, СВ, СЯ)

Длительность потенциала действия (мс) 0.35 ± 0.06 0.65 ± 0.08 0.68 ± 0.15 р<0.001 (РУ), (СЯ, СВ)

Амплитуда потенциала действия (мВ) 50 ±8 67 ±8 62 ± 11 р<0.01 (РУ, СВ), (СВ, СЯ)

Амплитуда следовой гиперполяризации (мВ) 21 ±3 15 ± 2 19 ± 7 р<0.05 (РУ, СВ), (СЯ, СВ)

Данные представлены как среднее ± доверительный интервал

РУ- парвальбумин, СВ - кальбиндин, СЯ — кальретинин. Группы интернейронов в

скобках не отличаются друг от друга.

Таким образом, проведенное исследование показывает, что в префронтальной коре приматов существует несколько высокоспециализированных классов интернейронов, различающихся по морфологическим, электрофизиологическим и биохимическим свойствам. Некоторые из интернейронов, например, вертикальноориентированные корзинчатые клетки, могут быть уникальными для коры приматов. Другие классы интернейронов, такие как большие корзинчатые клетки, клетки-канделябры, нейроглиаформные клетки, клетки Мартинотти описаны в коре многих видов млекопитающих. Чтобы выяснить, насколько схожи и насколько различаются гомологичные интернейроны коры крысы и обезьяны было проведено специальное экспериментальное исследование.

Сравнительное исследование интернейронов крысы и обезьяны

Мы сравнили свойства нейроглиаформных и корзинчатых интернейронов префронтальной коры крысы и обезьяны. Нейроглиаформные клетки обладают весьма характерными морфологическими особенностями, такими как округлое тело с

большим количеством коротких радиально расходящихся первичных дендритов, сильноветвящийся аксон, формирующий густую сеть. Поэтому эти клетки хорошо отличимы от других типов интернейронов у многих видов млекопитающих (Lund and Lewis, 1993, Kawaguchi, 1995). Парвальбумин-положительные быстроразряжающиеся корзинчатые клетки - одни из самых распространенных интернейронов в коре млекопитающих. Они отличимы от других интернейронов по характерной совокупности признаков: наличию кальцийсвязывающего белка парвальбумина, высокочастотному спайковому ответу без адаптации и морфологическим особенностям.

Выявлено, что, несмотря на схожесть большинства морфологических признаков, оба типа интернейронов крысы имеют больше разветвлений аксонов и большую суммарную длину аксона, чем соответствующие типы интернейронов обезьяны. Многие электрофизиологические характеристики этих двух типов интернейронов у крысы и обезьяны также различаются. Входное сопротивление выше у клеток обезьяны: у корзинчатых клеток обезьяны 251 ± 21 МОм (п = 39), крысы - 182 ± 15 МОм (n=31, р <0.05); у нейроглиаформных клеток обезьяны 370 ± 37 МОм (п = 30), крысы - 238 ± 18 МОм (п = 19, р <0.01). Из-за этого вольт-амперная характеристика интернейронов обезьян обладает большим наклоном, чем у крыс. Кроме этого, у многих нейроглиаформных и корзинчатых клеток обезьяны во время действия гиперполяризующего тока отмечается спад мембранного потенциала, сдвигающий его к потенциалу покоя, а после снятия тока появляется возвратная деполяризация. Эти явления нехарактерны для интернейронов крысы (Рис. 6).

Рис. 6. Типичные примеры ответов корзинчатых нейронов обезьяны (слева) и крысы (справа) на гиперполяризующий ток (спад потенциала показан стрелками, возвратная деполяризация наконечниками стрелок). Временная шкала -150 мс.

При действии подпорогового деполяризующего тока у большинства нейроглиаформных нейронов крысы наблюдается дополнительный медленный деполяризационный сдвиг мембранного потенциала (ramp), что считается отличительной чертой нейроглиаформных клеток крысы (Kawaguchi, 1995). Однако он полностью отсутствовал у нейронов обезьяны, более того у небольшого числа клеток наблюдалось даже уменьшение величины деполяризации мембраны в ходе действия тока (Рис. 7).

Рис. 7. Ответы на пороговую стимуляцию нейроглиаформных нейронов крысы (слева) и обезьяны (справа). Стрелкой указан медленный деполяризационный сдвиг.

Monkey Rat

cell 1 --""У',

- ,

cell2 t- -I те"2 Г"*

—J, trrd.15m

cell 3 Л---1

U^r

1100 pA

У нейроглиаформных нейронов крысы потенциал действия при пороговой стимуляции возникает с большим латентным периодом (209 ± 28 мс). Такая задержка с ответом при пороговой деполяризации послужила основой для выделения нейроглиаформных клеток грызунов в отдельный электрофизиологический класс поздноразряжающихся (late-spiking) нейронов (Kawaguchi, 1995). Нейроглиаформные клетки обезьяны при околопороговой стимуляции отвечают с коротким латентным периодом (59 ± 7 мс, р <0.001). Задержанный спайковый ответ на синаптическую стимуляцию может играть определяющую роль в выполнении функций в нейронной сети. Нейроглиаформные клетки коры крысы при пороговой синаптической активации будут отвечать только при длительной активации, тогда как транзиентное возбуждение будет отфильтровываться. Для нейроглиаформных клеток обезьяны характерна быстрая частотная адаптация (глава 4), поэтому эти нейроны, наоборот, будут генерировать спайки чаще в начале действия стимула.

Для оценки возбудимости нейроглиаформных клеток коры крысы и обезьяны была измерена частота спайков в пачечных ответах. Так как частота спайков нейроглиаформных клеток уменьшается в ходе пачки, то сравнивались начальная и стабильная частоты при деполяризующем токе кратном двум реобазам. Оба показателя были выше у нейроглиаформных клеток обезьяны (начальная частота у обезьяны 50 ± 6 Гц, у крысы 26 ± 3 Гц, р <0.01; стабильная частота 24 ± 3 Гц и 17 ± 2 Гц, р <0.05). Дополнительно были изучены зависимости начальной и стабильной частоты спайков от величины деполяризующего тока У обезьяны эти графики имели больший

тангенс угла наклона, чем у крысы (для начальных частот: 1.30 ±0.12 Гц/пА (п = 17) и 0.30 ± 0.03 Гц/пА (п = 19), р <0.001; для стабильных частот: 0.24 ±0.16 Гц/пА и 0.10 ± 0.04 Гц/пА, р <0.05; рис. 8). Таким образом, нейроглиаформные клетки обезьяны обладают более высокой возбудимостью и генерируют большее количество спайков при широком диапазоне стимуляций, чем нейроглиаформные клетки крысы.

Рис. 8. Зависимости начальной (слева) и стабильной (справа) частоты спайков от силы деполяризующего тока. При всех значениях тока частота спайков была больше у клеток обезьяны (треугольники), чему крысы (кружки).

Межвидовые различия в ответах на деполяризацию были выявлены и для корзинчатых интернейронов. Потенциала действия возникал у клеток обезьяны при более низких значениях мембранного потенциала (-41 ± 2 мВ), чем крысы (-34 ± 3 мВ, р <0.001). При высокой силе стимуляции паттерны ответов у клеток крысы и обезьяны были очень похожи, однако при небольшой силе надпорогового деполяризующего тока у корзинчатых клеток крыс часто наблюдались периоды «молчания» (рис. 9), в результате которых паттерн ответа был иррегулярным. Периоды «молчания» и

40 60 80 100 120

Current above threshold, рА

■so во ее wo 120 Current above Ihfeshdd. pA

иррегулярность паттерна ответов полностью устранялись блокадой Ку1 каналов с помощью а-дендротоксина.

Чтобы сравнить возбудимость клеток крысы и обезьяны было подсчитано количество потенциалов действия в ответ на ступеньки надпорогового деполяризующего тока (0 - 100 пА выше порога). Было выявлено, что количество потенциалов действия выше у клеток обезьяны, чем у крысы во всем диапазоне применяемых токов (р <0.05).

Рис. 9. Примеры записей ответов корзинчатых нейронов обезьяны (слева) и крысы (справа) при разной силе деполяризующего тока.

Проведенное межвидовое сравнение выявило ряд морфологических и электрофизиологических различий между нейроглиаформными и быстроразряжающимися корзинчатыми интернейронами крысы и обезьяны. Для интернейронов обезьяны характерны большее входное сопротивление и меньший порог возникновения потенциала действия, чем у крысы. При пороговой стимуляции потенциалы действия у клеток обезьяны возникают с существенно меньшим латентным периодом. При надпороговой стимуляции число спайков (и их частота) при сходной силе стимуляции больше у нейронов обезьяны, чем у нейронов крысы. Эти показатели свидетельствуют о большей возбудимости корзинчатых и нейроглиаформных клеток обезьяны.

Выявленные электрофизиологические различия между гомологичными типами интернейронов позволяют лучше понять различия в функционировании префронтальной коры, обнаруженные в экспериментах in vivo при изучении оперативной памяти. Например, «клетки памяти» префронтальной коры, остающиеся активными в течение периода задержки в тестах на оперативную память, генерируют потенциалы действия с меньшей частотой у крысы, чем у обезьяны, это справедливо как для пирамидных клеток, так и для интернейронов (Wilson et al., 1994, Jung et al., 1998, Constantinidis and Goldman-Rakic, 2002).

Полученные результаты свидетельствуют, что даже морфологически схожие интернейроны, по крайней мере, по ряду электрофизиологических свойств, различаются у разных видов, что указывает на необходимость более осторожной экстраполяции данных от грызунов к приматам, и, в конечном счете, к людям.

Функциональные характеристики возбуждающих синоптических входов у

различных нейронов префронтальной коры обезьяны и крысы

Основной задачей данного исследования стало сравнение свойств возбуждающих входов к пирамидным клеткам и быстроразряжающимся интернейронам в префронтальной коре обезьяны и крысы, а также выявление межвидовых различий. Для этого регистрировали миниатюрные ВПСП/ВПСТ, ВПСП, вызванные внеклеточной стимуляцией и ВПСП в соединенных парах пирамидных клеток и интернейронов. Также были изучены механизмы, лежащие в основе упреждающего дисинаптического торможения.

У быстроразряжающихся интернейронов миниатюрные ВПСП и ВПСТ были больше по амплитуде, чем у пирамидных клеток, что справедливо как для крыс, так и обезьян. У миниатюрных ответов, зарегистрированных в интернейронах, были короче время нарастания и постоянная времени спада, чем у пирамидных клеток (рис. 10).

Рис. 10. (А) Типичные примеры записей миниатюрных ВПСТ и (В) усредненные ВПСТ у пирамидных клеток (слева) и больших корзинчатых клеток (справа) крысы.

Межвидовое сравнение свойств миниатюрных ответов показывает, что амплитуды и кинетика ответов у клеток одного типа схожи у крысы и обезьяны. В то же время выявлено, что частота миниатюрных ВПСП у быстроразряжающихся интернейронов крысы в 8 раз выше, чем у обезьяны (24±7 Гц и 3±1 Гц соответственно). Данные различия нельзя объяснить разницей в качестве срезов, полученных из коры крысы и обезьяны или какими-то иными экспериментальными артефактами, так как частоты ВПСП у пирамидных клеток крысы и обезьяны, записанные в тех же экспериментальных условиях, не различались. Скорее всего, различия в частоте ВПСП обусловлены различным числом возбуждающих синапсов, приходящих к одному интернейрону у крысы и обезьяны. Эти различия ведут к важным функциональным последствиям. Известно, что уменьшение числа возбуждающих синаптических входов через некоторое время приводит к увеличению возбудимости нейронов, обусловленное включением долговременных гомеостатических механизмов или механизмов метапластичности. Например, было показано, что если в культуре нейронов полностью блокировать синаптическую передачу в течение 48 часов, то возбудимость нейронов существенно возрастает: понижается порог возникновения потенциалов действия и требуется гораздо меньший деполяризующий ток, чтобы вызвать потенциалы действия в нейроне (Desai et al., 1999). И, наоборот, если увеличить возбуждающую синаптическую передачу путем блокирования торможения в нейронных сетях, через некоторое время компенсаторно происходит увеличение порогов возбуждения (Turrigiano and Nelson, 2004).

Следовательно, если существует разница в числе возбуждающих синапсов между интернейронами крысы и обезьяны, то, чтобы равноэффективно осуществлять торможение в нейронных сетях, быстроразряжающиеся интернейроны обезьяны должны обладать большей возбудимостью по сравнению с интернейронами крысы. И, действительно, как было рассмотрено в предыдущей главе, быстроразряжающиеся интернейроны обезьяны имеют более высокое входное сопротивление, меньшую реобазу и порог возникновения потенциала действия, чем у крысы. Кроме того, у них больше длительность постоянной времени мембраны, что облегчает суммацию приходящих ВПСП. Все вместе эти биофизические особенности ведут к большей возбудимости интернейронов обезьяны.

Вызванные ВПСП в синаптически соединенных парах, записанные у быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток крысы и обезьяны, различаются по тем же параметрам, что и спонтанные миниатюрные ВПСП. Длительность постоянной времени спада у пирамидных клеток была примерно в 2.5 раза дольше, чем у интернейронов, что справедливо как для крысы (25 ± 7 мс, п = 14 и 11 ± 4, п = 6), так и обезьяны (31 ± 9 мс, п = 9 и 14 ± 9 мс, п = 4). Это позволяет пирамидным нейронам в течение более длительного времени суммировать приходящие ВПСП.

Другой важный момент, это различие в соотношении амплитуд ответов между пирамидными клетками и интернейронами. Если миниатюрные ВПСП интернейронов превышали ответы пирамидных клеток всего в 2 раза, то суммарные ответы в соединенных парах различались в 3-4 раза. Эти различия могут быть обусловлены одной или несколькими причинами: пирамидные клетки при контакте с интернейронами могут формировать большее число синапсов, чем с пирамидными клетками, либо эти синапсы в среднем содержат большее число активных зон, либо имеют более высокую вероятность выброса медиатора. Чтобы установить, какая из этих причин верна, необходимо проведение дополнительных исследований.

Для сравнения свойств суммарных вызванных ВПСП в пирамидных клетках и интернейронах были проведены дополнительные эксперименты. Стимуляция в этих экспериментах осуществлялась с границы белого вещества и 6 слоя, интенсивность стимуляции постепенно увеличивали с шагом 5-10 мкА, регистрировали зависимость амплитуды ВПСП от силы стимуляции у пирамидных нейронов и быстроразряжающихся интернейронов. Для сопоставления данных, полученных от разных нейронов, силу стимуляции, при которой возникал минимальный ВПСП, принимали за 0. Зависимость между амплитудой ВПСП и интенсивностью стимуляции хорошо аппроксимировалась линейной функцией как для быстроразряжающихся интернейронов, так и для пирамидных клеток (Рис. 11). Тангенс угла наклона прямой был значительно выше для быстроразряжающихся интернейронов (0.23 мВ/мкА), чем для пирамидных клеток (0.06 мВ/мкА). Таким образом, при увеличении силы стимуляции амплитуда ответа в интернейронах нарастала почти в 4 раза быстрее, чем у пирамидных клеток, что примерно соответствует данным, полученным нами в соединенных парах. Данный результат показывает, что различия между пирамидными клетками и интернейронами сохраняются и для суммарных вызванных ВПСП.

Одна из причин найденных различий в свойствах ВПСП и ВПСТ между интернейронами и пирамидными клетками может быть обусловлена различиями в субъединичном составе синаптических рецепторов АМРА типа. Свойства рецептора существенно зависят от наличия в его составе субъединицы С1иА2. Так, АМРА

рецепторы, не содержащие в своем составе субъединиц 01иА2, в отличие от остальных вариантов АМРА рецепторов, проницаемы для ионов Са2+ и имеют более высокую ионную проводимость. Было проверено наличие кальцийпроницаемых АМРА (Са-АМРА) рецепторов в синапсах пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов.

-ю о 10 20 30 40 60 60 ЭКтиМоп сигтегП, цА

Рис. 11. Диаграмма, показывающая зависимость величины амплитуды вызванных ВПСП от силы стимуляции у пирамидных клеток (треугольники) и интернейронов (кружки).

Блокаду Са-АМРА глутаматных рецепторов, не содержащих С1иА2-субъединицу, вызывали аппликацией 100 мкМ препарата ИЭМ-1460, который обладает высокой селективностью по отношению к Са-АМРА рецепторам. ИЭМ-1460 не влиял на амплитуду одиночных ВПСП в пирамидных клетках (7.6 ±1.1 мВ в контроле; 7.2 ± 1.3 мВ после применения ИЭМ-1460, /-тест парных сравнений = 0.82, р = п.в, п - 6). Эффект ИЭМ-1460 отсутствовал также при регистрации амплитуды суммарных ВПСП, вызванных пачечной стимуляцией (6.4 ± 1.4 мВ в контроле; 6.2 ± 1.5 мВ после применения ИЭМ-1460, /-тест парных сравнений, р = п.б, п = 5). Напротив, блокирующее действие ИЭМ-1460 на быстроразряжающиеся интернейроны было выраженным. Амплитуда одиночных и суммарных ВПСП уменьшилась примерно на 40% (одиночные ВПСП 11.8 ± 3.4 мВ в контроле, 7.1 ± 2.0 мВ после применения ИЭМ-1460, /-тест парных сравнений = 2.7,р < 0.05, п = 8; суммарные ВПСП в контроле 13.1 ± 3.0 мВ в контроле, 8.0 ± 3.0 мВ после применения ИЭМ-1460, /-тест= 3.3, р < 0.05, п = 4). Таким образом, различия в субъединичном составе АМРА рецепторов позволяют объяснить различия свойств ВПСП и ВПСТ у интернейронов и пирамидных клеток.

Различия в свойствах ВПСП у быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток, а именно более быстрая кинетика и большая амплитуда, ведут к тому, что возбуждение быстроразряжающихся интернейронов наступает при меньшей силе стимуляции и с более коротким латентным периодом, чем у пирамидных клеток. В результате этого интернейроны коры активируются раньше соседних с ними пирамидных клеток и могут дисинаптически вызывать упреждающее торможение.

В эксперименте небольшая по силе стимуляция вызывала только подпороговые ВПСП у пирамидного нейрона и быстроразряжающегося интернейрона, тогда как большая по силе стимуляция приводила к возникновению в пирамидных клетках комплексного ответа, состоящего из ВПСП и следующего за ним ТПСП (Рис. 12).

ТПСП были более изменчивы по форме и латентному периоду, чем предшествующие им моносинаптические ВПСП. Одновременно с дисинаптическим торможением в пирамидных клетках мы регистрировали потенциалы действия в соседних быстроразряжающихся интернейронах (в семи из девяти зарегистрированных пар у крыс и в одной паре, записанной у обезьян). Потенциал действия генерировался интернейроном до появления ТПСП в пирамидной клетке.

Рис. 12. Ответы пирамидной клетки (верхние записи) и интернейрона (нижние записи) при разной силе внеклеточной стимуляции в условиях одновременной записи. Треугольником указан момент внеклеточной стимуляции. Стрелкой указан дисинаптический ТПСП.

Так как быстроразряжающиеся интернейроны и пирамидные клетки различаются по субъединичному составу АМРА рецепторов, то мы дополнительно исследовали, как повлияет на упреждающее дисинаптическое торможение избирательная блокада Са-АМРА рецепторов. Эти эксперименты были проведены на срезах префронтальной коры крысы. Блокада Са-АМРА рецепторов (ИЭМ-1460, 100 мкМ) не изменяла амплитуду ВПСП пирамидных клеток, но снижала амплитуду дисинаптического ТПСП с -2.8 ± 1.3 мВ до -0.4 ±0.8 мВ. Таким образом, избирательная блокада Са-АМРА рецепторов существенно ослабляет дисинаптическое торможение в коре мозга крысы и может приводить к парадоксальному эффекту растормаживания в нейронных сетях, смещая баланс возбуждения и торможения в сторону возбуждения. Это явление должно учитываться при анализе действия фармакологических препаратов, избирательно действующих на Са-АМРА рецепторы, и использовании их в качестве инструментов исследования. Так как дисинаптическое упреждающее торможение ограничивает временной промежуток, в течение которого передается сигнал по нейронной сети, то избирательная блокада Са-АМРА рецепторов может приводить к нарушению временных параметров передачи сигналов в коре, а с точки зрения теории информации повышать величину шума при передаче сигнала, так как суммация подпороговых ВПСП будет происходить в течение более длительного времени.

60 цА

-> 120 цА

-52 тУ-

_|15тУ

25 п«

Особенности синоптического взаимодействия быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток

Так как взаимодействие быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток в префронтальной коре до сих мало изучено, то нами было проведено дополнительное исследование, посвященное изучению синаптически соединенных пар пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов. Записи в соединенных парах - это достаточно сложный вид экспериментов, требующий больших трудозатрат и значительного количества срезов. Это делало невозможным систематическое изучение большого количества соединенных пар в коре обезьяны. Поэтому данные эксперименты проводились на срезах коры крысы. Были детально изучены свойства синаптических соединений между пирамидными клетками и быстроразряжающимися интернейронами 2-3-го слоев медиальной префронтальной коры 19 - 21-дневных самцов крыс линии Вистар. Синаптическую связь выявляли по наличию постсинаптических потенциалов с коротким латентным периодом (< 2 мс) в нейроне в ответ на потенциалы действия, вызванные короткими импульсами деполяризующего тока в другом нейроне (рис. 13).

Рис. 13. Физиологические (А) и морфологические (В) свойства быстроразряжающегося интернейрона (Уф и пирамидной клетки (РС), образующих синоптически соединенную пару. (С) Пара нейронов заполнена биоцитином и визуализирована с помощью комплекса стрептавидин-А1еха 633, парвальбумин с помощью комплекса антитела с А1еха 488. Интернейрон (указан стрелкой) содержит парвальбумин. Примеры ВПСП (Л) и ТПСП (Е), вызванных в паре взаимно соединенных интернейрона (верхние записи) и пирамиды (нижние записи). ТПСП вызывает деполяризацию мембраны, так как для пирамидных клеток использовался внутриклеточный раствор с высоким содержанием С/'.

Всего была протестирована 51 пара нейронов. Среди них 13 пар (25%) имели только возбуждающие связи, 12 пар (24%) имели только тормозные связи, 8 пар (16%) имели реципрокные соединения. Следует отметить, что паттерны синаптических взаимодействий различаются в разных отделах коры. Так, в зрительной коре крысы вероятность существования тормозной связи между интернейроном и пирамидной клеткой сильно повышается в том случае, если пирамидная клетка образует возбуждающую связь с интернейроном в данной паре (Yoshimura and Callaway, 2005), то есть каждая пирамидная клетка в зрительной коре получает возвратное торможение.

По всей вероятности, такой тип синаптической организации благоприятствует обработке быстро меняющегося потока зрительной информации. Однако такой зависимости не было выявлено в соматосенсорной коре мыши (Avermann et al., 2012) и крысы (Holmgren et al., 2003, Packer and Yuste, 2011). В нашей выборке пар нейронов из префронтальной коры, вероятность нахождения тормозной связи не зависела от наличия возбуждающей связи между этими нейронами в паре. Согласно нашим данным формирование тормозных и возбуждающих связей в префронтальной коре происходит независимо друг от друга. Такая организация синаптических связей, возможно, благоприятствует реверберации нервных импульсов в префронтальной коре, нейронному механизму оперативной памяти.

Мы также обнаружили, что в префронтальной коре свойства реципрокных синаптических связей отличаются от свойств односторонних связей. Так, амплитуда ТПСП была в 4 раза больше, а пропусков при тормозной синаптической передаче было в 8 раз меньше в парах с реципрокными связями по сравнению с парами, где была только односторонняя связь между интернейроном и пирамидной клеткой (рис. 14).

Рис. 14. Сравнение свойств реципрокных и односторонних пар. (А и В) сравнение амплитуд и (С и О) доли пропусков при синаптической передаче. Обозначения: кружки — ВПСП, треугольники - ТПСП, белые фигуры -реципрокные, черные -односторонние связи, *Р <0.05, **Р<0.01.

Эти данные свидетельствуют о том, что тормозные интернейроны оказывают свое воздействие в первую очередь на те пирамидные клетки, от которых получают возбуждающие входы. Таким образом, возвратное торможение в префронтальной коре оказывается более выраженным, чем латеральное. Интересно, что в соматосенсорной коре такой закономерности не было выявлено, так у мыши амплитуда ТПСП не различалась в парах с односторонними и реципрокными связями (Ауегтапп е1 а1., 2012). Характеристики возбуждающих ответов в парах зависели от наличия тормозных обратных синаптических связей от интернейронов. Разница в ответах между реципрокными и односторонними связями была более выраженной, если использовалась пачечная стимуляция. Вместе взятые, эти результаты свидетельствуют о наличии особых нейронных подсетей между быстроразряжающимися интернейронами и пирамидными клетками префронтальной коры крыс.

О- 2 £

ш о-

ш 0.6

§ 0.4

'та

£ 0-2 «

Ш 0.0-

9 Unidirectional -О-Reciprocal

1 2 3 4 5 Response number

Unidirectional -О-Reciprocal

1 2 3 4 5 Response number

CL CO Q-

ш 0.6

th 0.0-

1 2 5 4 5

Response number

A Unidirectional -&-Reciprocal

1 2 3 4 5

Response number

Тормозные и возбуждающие синапсы характеризовались кратковременной депрессией синаптической передачи, при этом уровень пропусков оставался невысоким. Обычно, синапсы с низкой вероятностью выброса медиатора при синаптической передаче характеризуются большим количеством пропусков и фасилитацией ответов при ритмической стимуляции, и, наоборот, синапсы с высокой вероятностью выброса медиатора характеризуются низким процентом пропусков при передаче и депрессией амплитуды постсинаптических ответов в пачке (Логоу й а1., 2001). Это позволяет считать, что возбуждающие и тормозные синапсы между пирамидными клетками и корзинчатыми интернейронами характеризуются высокой вероятностью выброса медиатора.

Тормозные и возбуждающие синапсы различаются по некоторым свойствам кратковременной синаптической динамики (рис. 15). Например, мы наблюдали большую величину депрессии и большее увеличение числа пропусков во время ритмической стимуляции в возбуждающих синапсах, чем в тормозных. Мы обнаружили ряд корреляций между характеристиками синаптической передачи для возбуждающих синапсов: 1) обратная корреляция между амплитудами первого и второго ВПСП, 2) положительная корреляция между величиной кратковременной депрессии и вероятностью пропусков при синаптической передаче и 3) обратная корреляция между коэффициентом вариации амплитуд (СУ) и средним значением амплитуды ВПСП (М). Интересно, что таких корреляций не было выявлено для тормозных синапсов.

А ВС

|о.6 | 0.4.

5 021

\ \ \

1 2 3 4 5

Ревропве питЬег

а.

0.8-| 0.6

1 2 3 4 5 5 питЬег

Рис. 15. Величина депрессии в возбуждающих и тормозных синапсах с различной частотой пропусков при синаптической передаче. (А) и (В) Примеры кратковременной динамики ВПСП в синоптических соединениях (А) без пропусков и (В) с высокой частотой пропусков. Вверху показаны усреднённые ответы по записям приведенным внизу. Стрелками указаны потенциалы действия в пресинаптическом пирамидном нейроне. Диаграммы, показывающие изменение нормализованных амплитуд ВПСП (С) и ТПСП (Б) в синоптических соединениях без пропусков (черные кружки и треугольники соответственно) и с частотой пропусков выше 0.2 (белые фигуры).

Отрицательная корреляция между первым и вторым постсинаптическими ответами была описана ранее в центральных синапсах с относительно низким числом релиз-сайтов (п) и с высокой вероятностью выброса медиатора (р) из-за истощения

быстро доступного пула везикул (Thomson, 2000). Модель депрессии на основе истощения пула везикул также обеспечивает наиболее простое объяснение положительной корреляции между величиной кратковременной депрессии и вероятностью пропусков при нейротрансмиссии (Zucker and Regehr, 2002). В синапсах с высокой вероятностью выброса медиатора (низкой начальный процент пропусков при передаче) происходит быстрое истощение пула везикул медиатора и, следовательно, уменьшение амплитуды ВПСП в ходе ритмической активности происходит сильнее (рис. 15). Большое CV при низком среднем значении амплитуды ВПСП может возникать в результате небольшого и, в частности, когда величина кванта (q) является достаточно большой, что справедливо для возбуждающих синапсов между пирамидными клетками и корзинчатыми интернейронами (Beierlein et al., 2003, Bremaud et al., 2007).

Эти результаты показывают, что в пресинаптическом окончании возбуждающего синапса находится небольшое число релиз-сайтов, а пул везикул, непосредственно доступный для выброса, мал и быстро истощается при ритмической стимуляции. В противоположность этому, в тормозном пресинаптическом окончании число релиз-сайтов и пул везикул с медиатором могут быть больше. Этот вывод хорошо согласуется с морфологическими данными. Пирамидные клетки образуют один или несколько синаптических контактов с постсинаптическими тормозными нейронами, а каждый синапс имеет один или 2-5 релиз-сайтов (Buhl et al., 1997; Gulyas et al., 1999). В отличие от пирамидных нейронов, каждый корзинчатый интернейрон образуют более десяти синаптических контактов с пирамидной клеткой (Tamas et al., 1997). Пресинаптические окончания аксонов корзинчатых клеток больше по размеру, чем у пирамидных клеток и содержат больше везикул и митохондрий (Somogyi et al., 1998, Thomson, 2000).

Мы выявили, что величина коэффициента вариации латентного периода ВПСП, которая отражает синхронность синаптического выброса, коррелирует со многими параметрами постсинаптических ответов. Например, низкая вариативность латентного периода ВПСП была характерна для синапсов с большой амплитудой ответов, низким коэффициентов вариации амплитуды, малым числом пропусков при нейротрансмиссии и более выраженной кратковременной депрессией при ритмической стимуляции. Все вместе эти данные указывают на наличие двух функциональных типов возбуждающих синапсов. Первый тип синапсов с низким коэффициентом вариации латентного периода ВПСП ответственен за быструю и точную по времени активацию быстроразряжающихся интернейронов, в то время второй тип соединений с большей вариативностью латентного периода ВПСП за счет меньшей синаптической депрессии может быть более эффективным при ритмической стимуляции.

Свойства синапсов между пирамидными клетками и быстроразряжающимися интернейронами, описанные выше, позволяют лучше понять роль данных клеток и их взаимодействий в организации работы нейронных сетей. Так биофизические свойства мембран и быстрая кинетика ВПСП у быстроразряжающихся интернейронов не позволяет этим клеткам быть надежными временными интеграторами, поэтому чтобы достичь порога потенциала действия эти клетки должны иметь несколько возбуждающих входов активируемых практически одновременно (Angulo et al., 1999). Временная интеграция поэтому ограничивается очень узким временным окном, в ходе которого эффективное суммирование может произойти. Принимая во внимание существенную величину депрессии возбуждающих синаптических ответов, можно предположить, что активация интернейронов критически зависит от синхронной активности в нескольких пирамидальных клеток.

Наличие эффективных взаимных связей между популяциями возбуждающих пирамидных и тормозных интернейронов считается основой для гамма-ритмов в различных нейронных сетях (Buzsaki and Wang, 2012). В модельных исследованиях показано, что циклы возбуждения и торможения в таких сетях могут существовать в течение длительного времени. Наличие сильных реципрокных взаимодействий между пирамидами и интернейронами значительно повышает способность нейронной сети к синхронных колебаниям (Brunei and Wang, 2003). Таким образом, полученные данные указывают, что нейронная организация префронтальной коры хорошо подходят для генерации гамма-ритма, который является одной из важнейших форм синхронизации нейронной активности в коре головного мозга при бодрствовании и играет важную роль в реализации когнитивных процессов, в том числе таких как оперативная память (Fries, 2009).

Особенности выработки и механизмы долговременной синоптической пластичности нейронов префронтальной коры крысы

Выявлено, что в префронтальной коре, в отличие от сенсорных отделов коры, синхронизирующие протоколы (рис. 16) как с позитивной, так и негативной задержкой вызывают долговременную синаптическую депрессию.

Рис. 16. Примеры синхронизирующих протоколов с позитивной задержкой. Вверху пример записи с нейрона во время действия протокола. Внизу схема,

показывающая активацию

пресинаптических аксонов (pre) и постсинаптического нейрона (post). При негативной задержке активация «post» предшествует «рге».

Протоколы с позитивной задержкой вместо потенциации приводили к небольшой, но устойчивой долговременной депрессии, в среднем амплитуда ВПСТ после индукции составляла 0.91 ± 0.05 от контрольных значений (р <0.05, п = 24, рис. 17А). В протоколах с негативной задержкой, как и ожидалось по правилу Хэбба, наблюдалась депрессия синаптической передачи (0.87 ± 0.05, р <0.01, п = 10, рис. 17В). Так как способность к выработке долговременной потенциации может теряться со временем из-за потери каких-то цитоплазматических факторов (Malinow and Tsien, 1990), то были проделаны дополнительные эксперименты по выработке долговременной потенциации с помощью высокочастотного протокола. В данном протоколе применялись 10 пачек стимулов, повторяющихся каждые 0.5 с, в каждой пачке было по 8 стимулов с частотой 100 Гц. Этот протокол применялся через тот же промежуток времени после прорыва мембраны нейрона, что и синхронизирующий протокол. В целом во всей популяции нейронов долговременная потенциация после этого протокола составила 1.22 ± 0.07 (р <0.05, п = 16, рис. 17С).

50 times at 0.1 Hz

J_PU

Jj_I_Lp5S

20 tines at 0.1 Hz

I I I I I Pre

I I I I И

10 ms 20 ms

5 ms 20 ms

.10 Ô 1'0 20 30 40 50 °'-20 -10 0 10 20 3C 40 50 Tima altar STDP (rrin) T¡™ ate ™ägS TDP (itin)

o.a i . i . -- . . . , ■ ,

-20 -1D 0 10 20 30 40 60 Time after HFS (min)

Pue. 17. Долговременная ешшптическая пластичность после разных протоколов. Синхронизирующие протоколы с позитивной (А) и негативной (В) задержками вызывают депрессию. (С) Высокочастотный протокол - потенциацию.

На выработку долговременной пластичности может влиять медленная следовая гиперполяризация (Fuenzalida et al., 2007). Она избирательно уменьшает амплитуду NMDA компонента ВПСП (Fernandez de Sevilla et al., 2007) и, соответственно, уменьшает кальциевый вход через NMDA каналы. Таким образом, блокада медленной следовой гиперполяризации в течение синхронизирующего протокола ведет к большей деполяризации мембраны и большему току кальция внутрь нейрона, что в свою очередь ведет к понижению порога для долговременной потенциации. Поэтому эффект блокады медленной следовой гиперполяризации был изучен в данной работе. Для этого был использован селективный ингибитор медленной следовой гиперполяризации UCL2077 (10 мкМ) (Shah et al., 2006). Применение UCL2077 существенно влияло на выработку синаптической пластичности синхронизирующим протоколом. Протокол с позитивной задержкой вызвал долговременную потенциацию со средним значением 1.22 ± 0.09 (р <0.05 п = 14) (рис. 18), а протокол с негативной задержкой по-прежнему вызывал долговременную депрессию (0.85 ± 0.06, п = 7, р <0.05). Таким образом, блокада медленной следовой гиперполяризации восстановила Хэббову пластичность в пирамидных нейронах префронтальной коры.

Carbacfd Í10[AÍ)

•10 О 10 20 30 40 50 Time aflerSTDP (min)

Isoproaranoi Í10 tiM)

Таг» aäer STDP Íírtn)

0 ÎO 20 30 40 50 Тиле a ter STOP

UCL-20T7 QOpMj

Рис. 18. Долговременная синоптическая пластичность, вызванная синхронизирующим протоколом с позитивной задержкой в присутствии (А) \JCL-2077, (В) изопротеренола и (С) карбахола.

Многие нейромедиаторы уменьшают амплитуду медленной следовой гиперполяризации. Так активация мускариновых рецепторов, р-адренорецепторов, серотониновых, Ш-гистаминовых, метаботропных глутаматных рецепторов через ряд вторичных мессенджеров ведет к блокаде медленной следовой гиперполяризации. В данной работе был проверен эффект 2 разных агонистов: изопротеренола (10 мкМ) -агониста Р-адренорецепторов и карбахола (10 мкМ) - холинергического агониста. Оба агониста оказывали существенное воздействие на медленную следовую

гиперполяризацию, при этом изопротеренол только уменьшал гиперполяризующии ток, а карбахол даже вызывал небольшой следовой деполяризующий ток. Оба агониста - карбахол и изопротеренол значимо воздействовали на синаптическую пластичность. Протокол с позитивной задержкой индуцировал долговременную потенциацию (изопротеренол: 1.18 ± 0.06, п= 14, р = 0.01; карбахол: 1.16 ± 0.08, р = 0.06, п = 12; рис. 18). Таким образом, один и тот же протокол, вызывающий в контроле депрессию, в присутствии любого из двух агонистов вызывал синаптическую потенциацию.

Анализ фармакологических свойств долговременной синаптической пластичности выявил, что все изученные формы пластичности полностью блокируются в присутствии специфического антагониста NMDA рецепторов - D-AP5 (50 мкМ). Синхронизирующий протокол с позитивной задержкой при блокаде рецепторов I типа к эндоканнабиноидам (СВ [) специфическим антагонистом АМ251 (1 мкМ) вызывал долговременную потенциацию (1.13 ± 0.07, п = 12). В то же время применение АМ251 не влияло на пластичность, индуцированную высокочастотным протоколом (Рис. 19). Полученные данные подтверждают участие NMDA рецепторов в синаптической пластичности, вызванной синхронизирующими протоколами, но не позволяют однозначно сказать являются ли они пре- или постсинаптическими NMDA рецепторами. Кроме того, блокада CBi рецепторов выявила постсинаптическую долговременную потенциацию, что позволяет предположить, что пресинаптическая долговременная депрессия и постсинаптическая долговременная потенциация развиваются одновременно или альтернативно после применения синхронизирующего протокола. Синаптическая пластичность, индуцированная частотным протоколом не связана с активацией CBi рецепторов.

Рис. 19. Диаграммы, показывающие эффект воздействия АР5 и АМ251 па пластичность, вызванную синхронизирующим (слева) и высокочастотным (справа) протоколами.

Проведенное исследование также выявило важную роль медленной следовой гиперполяризации для регуляции долговременной синаптической пластичности в префронтальной коре, однако точный механизм этого явления требует дальнейшего исследования. Основываясь на наших результатах, что ингибирование медленной следовой гиперполяризации ведет к восстановлению хеббовой пластичности у пирамидных клеток 2-3 слоев, можно предположить, что в контрольных условиях постсинаптические потенциалы действия активируют медленную следовую гиперполяризацию, которая затем может шунтировать ВПСП и, следовательно, снижать активность постсинаптических NMDA рецепторов. Кроме того, медленная следовая гиперполяризация может уменьшать клеточную возбудимость и распространение потенциалов действия по дендритам (Sah, 1996, Gulledge et al., 2005). Оба эти фактора сильно уменьшают вероятность выработки постсинаптической долговременной потенциации, которая оказывается полностью замаскированной пресинаптической долговременной депрессией. Подавление медленной следовой гиперполяризации ведет к увеличению NMDA тока и улучшает распространение потенциалов действия по дендритам, что, в свою очередь, способствует индукции

долговременной потенциации с помощью синхронизирующих протоколов с позитивной временной задержкой.

Следует отметить, что нарушение Хэббовой пластичности обнаружено нами только в префронтальной коре, тогда как в сенсорных областях коры (зрительной и сенсомоторной) правило Хэбба для определения знака синаптической пластичности выполнялось. Восстановление правила Хэбба в префронтальной коре происходит при блокаде медленной следовой гиперполяризации. Основываясь на полученных данных, можно предположить, что величина медленной следовой гиперполяризации - это важный регулирующий фактор, лежащий в основе механизма синаптической пластичности в пирамидных клетках префронтальной коры. Поскольку амплитуда медленной следовой гиперполяризации находится под контролем нескольких нейромодуляторных систем, то она может являться важным связующим звеном между активностью нейромодуляторных систем и успешностью обучения.

Особенности функционального созревания возбуждающих синоптических входов в префронтальной коре макан

Известно, что в течение подросткового возраста происходят существенные перестройки возбуждающих связей в дорсолатеральной префронтальной коре. У человека и обезьян в этот период происходит массовая элиминация возбуждающих синаптических контактов, в избытке сформированных в течение перинатального периода (Rakic et al., 1986, Huttenlocher and Dabholkar, 1997). Нами было выявлено, что в средняя плотность шипиков в дистапьных отделах апикальных дендритов пирамидных нейронов 3-го слоя у макак значительно сокращается (на 17%) с 15-го по 42 месяц жизни. Так как функциональное созревание синапсов в префронтальной коре приматов может продолжаться длительное время, то элиминироваться могут как функционально незрелые синапсы, так и нормально функционирующие синапсы. Для того чтобы выяснить, какая из этих двух альтернатив верна, были изучены физиологические свойства возбуждающих синапсов в префронтальной коре макаки на разных этапах онтогенеза.

Созревание возбуждающих глутаматергических синапсов сопровождается встраиванием АМРА рецепторов в постсинаптической мембране (Liao et al., 2001, Zhu and Malinow, 2002). Нами выявлено, что соотношение вкладов AMPA/NMDA рецепторов в суммарный ВПСТ значительно возрастает с 3-го по 15-й месяц, но в дальнейшем это соотношение не изменяется (рис. 20). д в Рис. 20. Соотношение вкладов

+40 mv 3 months

АМРАШАЮА рецепторов в суммарный ВПСТ. (А) Примеры регистраций ВПСТ от пирамидных нейронов 3- и 15-месячных животных. (В) Соотношение вкладов АМРАШМЭА рецепторов в разном возрасте (разными буквами отмечены различающиеся значения).

Увеличение вклада АМРА рецепторов свидетельствует о значительном снижении доли функционально незрелых синапсов в возрасте от 3 до 15 месяцев. Также было обнаружено, что происходит ускорение кинетики ЫМОА компонента ВПСТ: уменьшается постоянная времени спада (т) ВПСТ в возрасте от 3 до 15 месяцев. После 15 месяцев т больше не меняется (Рис. 21).

Згло. 15 то. 42 то. S4 то. <n»2S; (0*21) ;e»15>

Рис. 21. Кинетика NKTDA компонента ВПСТ. (А) Примеры регистрации NMDA компонента ВПСТ. (В) Постоянная времени спада ВПСТ у животных разного возраста (разными буквами отмечены различающиеся значения). Регистрация проводилась в присутствии антагонистов ГАМК и АМРА рецепторов.

Кинетика NMDA компонента ВПСТ в гиппокампе и неокортексе зависит от субъединичного состава рецепторного комплекса NMDA. На ранних этапах развития преобладают NMDA-рецепторы с NR2B субъединицей, которая определяет большую продолжительность ВПСТ. И наоборот, NMDA-рецепторы, содержащие NR2A субъединицы, преобладают в зрелой коре и обеспечивают более быстрые NMDA ВПСТ (Monyer et al., 1994). Аппликация ифенпродила, селективного антагониста NMDA рецепторов, содержащих NR2B субъединицы, уменьшала амплитуду ВПСТ у животных всех возрастных групп. Тем не менее, эффект ифенпродила был наиболее выражен на пирамидных нейронах трехмесячных животных. Кроме того, ифенпродил уменьшал продолжительность NMDA компонента ВПСТ только для нейронов трехмесячных животных.

Созревание пресинаптического отдела, как правило, связано с уменьшением вероятности выброса медиатора (Bolshakov and Siegelbaum, 1995, Zhang, 2004). Чтобы сравнить степень зрелости пресинаптических отделов мы сравнили вероятности выброса медиатора в разные возрастные периоды. Для этого была определена скорость блока NMDA компонента ВПСТ селективным, необратимо связывающимся, каналоблокатором МК801. Начальная скорость блока ВПСТ была максимальна для нейронов 3-месячных животных (рис. 22). Полученные данные показывают, что у 3-месячных животных есть субпопуляция синапсов с более высокой вероятностью выброса медиатора, чем у животных других возрастных групп. Соответственно это позволяет предположить, что доля синаптических входов с незрелыми пресинаптическими свойствами уменьшается еще в подростковом возрасте, в период между 3 и 15 месяцами. Все вместе полученные данные свидетельствуют о том, что глутаматергические синапсы макак функционально полностью созревают к 15 месяцам. Таким образом, у приматов в отличие от грызунов в подростковом возрасте элиминируются уже созревшие синапсы. Не исключено, однако, что синапсы, устраняемые в подростковом возрасте, являются незрелыми по ряду молекулярных или

ультраструктурных характеристик, которые не отражены в функциональных свойствах, исследованных в данной работе.

Рис. 22. Кинетика блока ВПСТ описывается двойной экспоненциальной функцией (слева). Справа показано изменение toy F, постоянной времени быстрого экспоненциального спада. Различающиеся столбцы обозначены разными буквами.

Возбуждающие синапсы у 3-месячных животных являются относительно незрелыми. Известно, что в этот возрастной период синаптогенез еще продолжается быстрыми темпами, и многие вновь образованные синапсы возникают на дендритах пирамидных клеток 3-го слоя. В совокупности, наши результаты и результаты предыдущих анатомических исследований показывают, что в этом возрасте у приматов идет функциональное созревание как отдельных синапсов, так и нейронных сетей в целом, что скорее всего является связанными между собой процессами. Созревание возбуждающей синаптической передачи в префронтальной коре приматов происходит до подросткового возраста (2-3 лет), однако реорганизация возбуждающих связей в подростковом возрасте происходит через механизмы, которые не зависят от созревания отдельных синапсов, так как функциональное созревание большинства синапсов происходит на более ранних этапах индивидуального развития.

Заключение

Дорсолатеральная префронтальная кора играет ключевую роль в сложных когнитивных функциях. Одним из базовых механизмов реализации этих функций является постоянно поддерживаемая спайковая активность нейронов префронтальной коры после действия стимулов, что позволяет удержать в оперативной памяти необходимую информацию для правильного выполнения задачи. Проведенная экспериментальная работа выявила целый ряд важных нейрофизиологических особенностей организации префронтальной коры, которые обеспечивают ее особую функциональную роль.

Одной из таких особенностей являются специфические паттерны ритмической активности пирамидных клеток при действии длительного деполяризующего тока. Так, в изученной популяции пирамидных клеток коры обезьяны мы не наблюдали изменений величины порога потенциалов действия и уменьшения амплитуды ответов при ритмической активности, хотя такие изменения описаны в литературе для пирамидных клеток из других областей коры. Также в префронтальной коре обезьяны мы не обнаружили пирамидных клеток с быстрой частотной адаптацией, которые отвечают только на включение деполяризующего тока 2-10 потенциалами действия, описанных в других корковых отделах. Напротив, в префронтальной коре у всех электрофизиологических классов пирамидных клеток частота потенциалов действия оставалась относительно стабильной после короткого периода частотной адаптации: у низкопороговых клеток и регулярноразряжающихся пирамидных клеток с высоким входным сопротивлением частотная адаптация происходила в первые 100-200 мс после

о со о. ш

• 3 то. •©■ 42 то. ■ 15 то. "О" 84 то.

« 20

50 100 150 200 Time (sec)

Ь ь I

3 то. 15 то. 42 то. 84 то. (п=19) (п=17) (п=15) (п=10)

начала импульса тока (3-6 начальных потенциала действия), а у регулярноразряжающихся клеток с низким входным сопротивлением и клеток промежуточного типа частотная адаптация происходила еще быстрее. Таким образом, мембранные свойства пирамидных клеток префронтальной коры обеспечивают возможность рециркуляции нервных импульсов.

Способствовать рециркуляции нервных импульсов может особая организация нейронных сетей в префронтальной коре. В ходе данного исследования мы выявили в префронтальной коре крысы особый паттерн синаптического взаимодействия между пирамидными клетками и быстроразряжающимися корзинчатыми интернейронами, отличный от описанного для сенсорных областей коры. В нашей выборке пар нейронов, регистрируемых одновременно, вероятность нахождения тормозной связи не зависела от наличия возбуждающей связи между этими нейронами в паре. В зрительной же коре вероятность нахождения тормозной связи между интернейроном и пирамидной клеткой сильно повышается в том случае, если пирамидная клетка образует возбуждающую связь к интернейрону в данной паре, то есть каждая пирамидная клетка в зрительной коре получает возвратное торможение. Мы также обнаружили, что в префронтальной коре свойства реципрокных синаптических связей отличаются от свойств односторонних связей. Так, амплитуда ответов была больше, а пропусков при синаптической передачи было меньше в парах с реципрокными связями по сравнению с парами, где была только односторонняя связь между нейронами. Разница в ответах между реципрокными и односторонними связями была более выраженной, если использовалась пачечная стимуляция. Вместе взятые, эти результаты свидетельствуют о наличии особых нейронных подсетей между быстроразряжающимися интернейронами и пирамидными клетками префронтальной коры крыс. Такая организация синаптических связей, возможно, благоприятствует реверберации нервных импульсов в префронтальной коре.

В префронтальной коре крысы, в отличие от других корковых отделов и гиппокампа, выявлено нарушение правила Хэбба о долговременной синаптической пластичности: синхронизирующие протоколы с позитивной задержкой не вызывали долговременной потенциации. Правило Хэбба восстанавливалось в том случае, если медленная следовая гиперполяризация в пирамидных клетках подавлялась специфическими антагонистами, либо одним из нейромодуляторов. Можно предположить, что этот феномен является важной функциональной особенностью префронтальной коры, так как предотвращает избыточную синаптическую пластичность при рециркуляции нервных импульсов, характерной для префронтальной коры. Дополнительная регуляция долговременной пластичности через нейромодуляторные системы обеспечивает тонкую настройку эффективности синаптической передачи в этой области коры.

В ходе эволюции префронтальная кора значительно увеличивается в размерах, достигая наибольшего размера у приматов. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что морфофункциональная организация префронтальной коры приматов отличается от коры крысы по ряду характеристик. Мы выявили, что пирамидные клетки 2-3 слоев префронтальной коры обезьяны более разнообразны по мембранным электрофизиологическим свойствам, чем пирамидные клетки крысы. Если все пирамидные клетки поверхностных слоев коры крысы относятся к регулярноразряжающимся нейронам, то в коре макаки регулярноразряжающиеся клетки составляют лишь половину от общего числа пирамидных клеток. В коре макаки также найдены низкопороговые клетки с залповой активностью (17%) и клетки с

промежуточным паттерном (31%). Важно отметить, что в то время как низкопороговые клетки генерируют залпы спайковой активности независимо от силы деполяризующего стимула или их мембранного потенциала, то характер спайкового ответа клеток промежуточного типа зависит от этих двух параметров. При одних условиях эти клетки будут разряжаться регулярно, а в других условиях залпами спайковой активности. Таким образом, соотношение регулярноразряжающихся и клеток с залповой активностью может меняться в зависимости от функционального состояния и общего уровня активности в нейронных сетях коры обезьян. Наличие дополнительных классов пирамидных клеток у приматов, а также возможность модуляции свойств клеток с промежуточным паттерном может существенно расширять функциональные возможности префронтальной коры по переработке информации. Например, залпы спайковой активности могут усиливать сигнал при передаче информации по цепочке нейронов (Lisman, 1997), могут изменять частоту передачи сигнала (Abbott et al., 1997), или передавать возбуждение на определенные типы нейронов (Berger et al., 2010).

В коре приматов, по сравнению с корой крысы, выше доля наиболее высокоспециализированных ГАМКергических нейронов, таких как клетки-канделябры, формирующих аксо-аксональные синапсы с пирамидными клетками, и нейроглиаформные клетки. В коре макаки нами описан тип вертикальноориентированных корзинчатых клеток, формирующий контакты с телами многих нейронов внутри одной колонки коры, этот тип интернейронов не встречаются в коре грызунов. Эти морфологические данные свидетельствуют о более сложной организации коры приматов. Гомологичные интернейроны обезьяны и крысы различаются по своим элекгрофизиологическим свойствам: у интернейронов обезьяны больше входное сопротивление мембраны и меньше порог возникновения потенциала действия, чем у крысы. При пороговой стимуляции потенциал действия у клеток обезьяны генерируется с существенно меньшим латентным периодом, при надпороговой стимуляции число спайков (и их частота) при сходной силе стимуляции больше, чем у клеток крысы. Эти показатели свидетельствуют о большей возбудимости корзинчатых и нейроглиаформных клеток обезьяны. Возможно более высокая возбудимость интернейронов обезьяны по сравнению с крысой обусловлена различиями в синаптической организации у этих двух видов, так частота спонтанных возбуждающих ответов, записанных у быстроразряжающихся интернейронов крысы в 8 раз выше, чем у интернейронов обезьяны. Эти электрофизиологические характеристики интернейронов обезьяны обеспечивают их более раннее вовлечение в процесс переработки информации в префронтальной коре и возможно лучшее соотношение сигнала к шуму при передаче информации.

Таким образом, в данной работе выявлен целый ряд существенных нейрофизиологических особенностей организации префронтальной коры, важных для понимания механизмов ее работы, также установлено, что префронтальная кора макаки отличается по своим морфофункциональным свойствам от коры крысы, что указывает на необходимость более осторожной экстраполяции данных от грызунов к приматам, и, в конечном счете, к людям.

Выводы

1. Пирамидные клетки 2-3 слоев коры макаки по своим электрофизиологическим свойствам подразделяются на 4 класса: нейроны с регулярным паттерном и низким входным сопротивлением, нейроны с регулярным паттерном и высоким входным сопротивлением, нейроны с промежуточным паттерном, низкопороговые

пирамидные нейроны. Установлено, что характер ритмической активности у пирамидных нейронов с промежуточным паттерном может изменяться в зависимости от мембранного потенциала покоя, тогда как у остальных типов он более постоянен.

2. Интернейроны префронтальной коры макаки подразделяются на 8 морфофункциональных типов на основе распределения аксонного дерева по слоям и колонкам коры, особенностям паттернов аксонной арборизации, форме терминальных окончаний аксона и расположению пресинаптических бутонов. Идентифицированы и описаны свойства клеток-канделябров, нейроглиаформных клеток, клеток Мартинотти, клеток с двойным букетом, вертикальноориентированных, малых, гнездообразных и классических корзинчатых клеток.

3. Одинаковые по морфологическому типу интернейроны префронтальной коры крысы и макаки различаются по электрофизиологическим свойствам. Большие корзинчатые клетки и нейроглиаформные клетки обезьян характеризуются большей возбудимостью, чем интернейроны крысы, что проявляется в большем входном мембранном сопротивлении и более низком пороге генерации потенциалов действия. При пороговой стимуляции потенциал действия у клеток обезьяны генерируется с меньшим латентным периодом, при надпороговой стимуляции число спайков (и их частота) при сходной силе стимуляции больше, чем у клеток крысы.

4. Возбуждающие постсинаптические ответы быстроразряжающихся интернейронов характеризуются более быстрой кинетикой и большей амплитудой, а потенциалы действия в интернейронах возникают при меньшей синаптической стимуляции, чем в пирамидных клетках как у крыс, так и у обезьян. Более легкое и раннее возбуждение интернейронов лежит в основе механизма упреждающего торможения. Показано, что быстроразряжающиеся интернейроны содержат в основном кальцийпроницаемые АМРА рецепторы, тогда как пирамидные нейроны -кальцийнепроницаемые АМРА рецепторы, поэтому фармакологическая блокада кальцийпроницаемых АМРА рецепторов нарушает упреждающее торможение и ведет к растормаживанию в нейронных сетях.

5. Большинство быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток 2-3 слоев префронтальной коры синаптически связаны. Синаптические соединения между ними характеризуются высокой надежностью и эффективностью. Выявлено, что амплитуда ответов больше, а пропусков при синаптической передачи меньше в парах с реципрокными связями по сравнению с парами, где была только односторонняя связь между нейронами.

6. В префронтальной коре крысы при использовании синхронизирующих протоколов наблюдается нарушение правила Хэбба о долговременной синаптической пластичности: протоколы с негативной задержкой и позитивной задержкой вызывают долговременную депрессию. Впервые установлено, что подавление медленной следовой гиперполяризации позволяет восстановить выработку долговременной потенциации при использовании синхронизирующего протокола с позитивной задержкой. Выявлен новый механизм действия нейромодуляторов на долговременную синаптическую пластичность через ингибирование медленной следовой гиперполяризации.

7. Функциональное созревание возбуждающих синапсов пирамидных клеток префронтальной коры макак происходит до периода их массовой элиминации в

подростковом возрасте. Таким образом, реорганизация возбуждающих связей в префронтальной коре в подростковом возрасте происходит через механизмы, которые, не зависят от созревания отдельных синапсов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

Список статей в рецензируемых изданиях

1. Krimer L.S., Zaitsev A.V., Czanner G., Kroner S., Gonzalez-Burgos G., PovyshevaN.V., Iyengar S., Barrionuevo G., Lewis D.A. Cluster analysis-based physiological classification and morphological properties of inhibitory neurons in layers 2-3 of monkey dorsolateral prefrontal cortex // JNeurophysiol. 2005. Vol. 94. P. 3009-3022.

2. Zaitsev A. V., Gonzalez-Burgos G., Povysheva N. V., Kroner S., Lewis D. A., Krimer L.S. Localization of calcium-binding proteins in physiologically and morphologically characterized interneurons of monkey dorsolateral prefrontal cortex // Cereb Cortex.

2005. Vol. 15. P. 1178-1186.

3. Povysheva N.V., Gonzalez-Burgos G., Zaitsev A.V., Kroner S., Barrionuevo G., Lewis D.A., Krimer L.S. Properties of excitatory synaptic responses in fast-spiking interneurons and pyramidal cells from monkey and rat prefrontal cortex // Cereb Cortex.

2006. Vol. 16. P. 541-552.

4. Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Kroner S., Krimer O.A., Rotaru D.C., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A., Krimer L.S. Electrophysiological differences between neurogliaform cells from monkey and rat prefrontal cortex // J Neurophysiol. 2007. Vol. 97. P. 1030-1039.

5. Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Lewis D.A., Krimer L.S. P/Q-type, but not N-type, calcium channels mediate GABA release from fast-spiking interneurons to pyramidal cells in rat prefrontal cortex // J Neurophysiol. 2007. Vol. 97. P. 3567-3573.

6. Gonzalez-Burgos G., Kroener S., Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Krimer L.S., Barrionuevo G., Lewis D.A. Functional maturation of excitatory synapses in layer 3 pyramidal neurons during postnatal development of the primate prefrontal cortex // Cereb Cortex. 2008. Vol. 18. P. 626-637.

7. Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Rotaru D.C., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A., Krimer L.S. Parvalbumin-positive basket interneurons in monkey and rat prefrontal cortex IIJ Neurophysiol. 2008. Vol. 100. P. 2348-2360.

8. Gonzalez-Burgos G., Rotaru D.C., Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Lewis D.A. GABA transporter GAT1 prevents spillover at proximal and distal GABA synapses onto primate prefrontal cortex neurons IIJ Neurophysiol. 2009. Vol. 101. P. 533-547.

9. Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Gonzalez-Burgos G., Rotaru D., Fish K.N., Krimer L.S., Lewis D.A. Interneuron diversity in layers 2-3 of monkey prefrontal cortex // Cereb Cortex. 2009. Vol. 19. P. 1597-1615.

10. Zaitsev A.V., Kim K.K., Fedorova I.M., Dorofeeva N.A., Magazanik L.G., Tikhonov D.B. Specific mechanism of use-dependent channel block of calcium-permeable AMPA receptors provides activity-dependent inhibition of glutamatergic neurotransmission IIJ Physiol. 2011. Vol. 589. P. 1587-1601.

11. Fish K.N., Gonzales-Burgos G., Zaitsev A.V., Lewis D.A. Histological characterization of physiologically determined fast spiking interneurons in slices of the primate dorsolateral prefrontal cortex. In: Isolated Central Nervous System Circuits. Ballanyi K. (Ed.) // Neuromethods. 2012 Vol.'73. P. 159-181.

12. Zaitsev A.V., Anwyl R. Inhibition of the slow afterhyperpolarization restores the classical spike timing-dependent plasticity rule obeyed in layer 2/3 pyramidal cells of the prefrontal cortex // J Neurophysiol. 2012. Vol. 107. P. 205-215.

13. Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A. Electrophysiological classes of layer 2/3 pyramidal cells in monkey prefrontal cortex // J Neurophysiol. 2012. Vol. 108. P. 595-609.

14.3айцев A.B., Ким K.X., Магазаиик Л.Г. Роль кальций-проницаемых АМРА рецепторов в механизме дисинаптического торможения в префронтальной коре крысы // Биол. мембраны. 2012. Т. 29. С. 114-122.

15.Zaitsev A.V., Lewis D.A. Functional properties and short-term dynamics of unidirectional and reciprocal synaptic connections between layer 2/3 pyramidal cells and fast-spiking interneurons in juvenile rat prefrontal cortex // Eur J Neurosci. 2013. Vol. 38. P. 2988-2998.

16. Зайцев A.B. Классификация и функции ГАМКергических интернейронов новой коры млекопитающих // Биол. мембраны. 2013. Т. 30. С. 253-270.

17. Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A. Electrophysiological Heterogeneity of Fast-spiking Interneurons: Chandelier Versus Basket Cells // PLoS One. 2013. Vol. 8. e70553.

Список тезисов докладов

1. Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A., Krimer L.S. Localization of Ca2+-binding proteins in interneurons of different physiological and morphological classes in monkey dorsolateral prefrontal cortex // SfN 33'h Annual Meeting. New Orleans, LA. 2003. Program No. 377.9.

2. Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A., Krimer L.S. Involvement of different types of interneurons in disynaptic inhibition of pyramidal cells in prefrontal cortex II SfN 33,h Annual Meeting. New Orleans, LA. 2003. Program No. 374.17.

3. Gonzalez-Burgos G., Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Krimer L.S., Lewis D.A. Postnatal maturation of excitatory synapses in the dorsolateral prefrontal cortex // WPIC's Fourth Annual Research Day. Pittsburgh, PA. 2004. P. 10.

4. Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A., Krimer L.S. Inhibition of pyramidal cells by different types of interneurons in prefrontal cortex of monkey and rat // WPIC's Fourth Annual Research Day. Pittsburgh, PA. 2004. P. 17.

5. Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A., Krimer L.S. Localization of calcium binding proteins in interneurons of layers 2-3 in monkey dorsolateral prefrontal cortex // WPIC's Fourth Annual Research Day. Pittsburgh, PA. 2004. P. 24.

6. Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A., Krimer L.S. Differential electrophysiological characteristics of neurogliaform cells in rat and monkey prefrontal cortex // SfN 34,h Annual Meeting. San Diego, CA. 2004. Program No. 516.17.

7. Gonzalez-Burgos G., Kroener S., Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Krimer L.S., Barrionuevo G., Lewis D.A. Postnatal maturation of excitatory synaptic function in primate dorsolateral prefrontal cortex // SJN 34'h Annual Meeting. San Diego, CA. 2004. Program No. 613.8.

8. Gonzalez-Burgos G., Kroener S., Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Krimer L.S., Barrionuevo G., Lewis D.A. Functional maturation of excitatory synapses during postnatal development of the primate prefrontal cortex // SJN 35'h Annual Meeting. Washington, DC. 2005. Program No. 26.14.

9. Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Rotaru D.C., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A., Krimer L.S. Fast-spiking interneurons of prefrontal cortex: comparison of electrophysiological membrane properties between rat and monkey // SJN 35th Annual Meeting. Washington, DC. 2005. Program No. 736.6.

10. Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Rotaru D.C., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A., Krimer L.S. Fast-spiking interneurons in monkey and rat prefrontal cortex // WPIC's Sixth Annual Research Day. Pittsburgh, PA. 2006. P. 41.

11. Zaitsev A. V., Povysheva N.V., Lewis D.A., Krimer L.S. P/Q- but not N-type of Ca2+ channels mediate synaptic transmitter release from fast-spiking interneurons to pyramidal cells in rat prefrontal cortex II WPIC's Sixth Annual Research Day. Pittsburgh, PA. 2006. P. 55.

12. Gonzalez-Burgos G., Rotaru D.C., Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Krimer L.S., Lewis D.A. Modulation of inhibitory transmission by GABA transporter 1 in primate dorsolateral prefrontal cortex // SJN 36'H Annual Meeting. Atlanta, GA. 2006. Program No. 728.13/D82.

13. Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Rotaru D.C., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A., Krimer L.S. Interneurons in monkey and rat prefrontal cortex: Comparison of electrophysiological membrane properties // SJN 36,h Annual Meeting. Atlanta, GA. 2006. Program No. 237.13/E36.

14. Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Lewis D.A., Krimer L.S. P/Q-type Ca2+ channel mediates synaptic transmitter release from fast-spiking interneurons to pyramidal cells in rat prefrontal cortex properties II SJN 36th Annual Meeting. Atlanta, GA. 2006. Program No. 337.6/J3.

15. Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Rotaru D.C., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A., Krimer L.S. Interneurons in monkey and rat prefrontal cortex: Comparison of electrophysiological membrane properties // WPIC's 7th Annual Research Day. Pittsburgh, PA. 2007. P. 39

16. Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Gonzalez-Burgos G., Rotaru D., Krimer L.S., Lewis D.A. Interneurons in monkey and rat prefrontal cortex: Comparison of electrophysiological membrane properties II WPIC's 7th Annual Research Day. Pittsburgh, PA. 2007. P. 48

17. Rotaru D.C., Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Krimer L.S., Lewis D.A., Gonzalez-Burgos G. Functional properties of inhibitory synapses onto different interneuron classes in the monkey dorsolateral prefrontal cortex II SJN37'h Annual Meeting. San Diego, CA. 2007. Program No. 786.14/G54.

18. Zaitsev A.V., Anwyl R. Investigation of the induction of LTP and LTD in the rat prefrontal cortex II SJN 38th Annual Meeting. Washington, DC. 2008. Program No. 39.8/L6.

19. Rotaru D.C., Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Krimer L.S., Lewis D.A., Gonzalez-Burgos G. Functional properties of GABA synapses onto different interneuron classes in the monkey dorsolateral prefrontal cortex II SJN 38,h Annual Meeting. Washington, DC. 2008. Program No. 531.19/D20.

20. Zaitsev A.V., Anwyl R. STDP induces mainly presynaptically expressed LTD in layer 2/3 rat prefrontal cortex II SJN 39h Annual Meeting. Chicago, IL. 2009. Program No. 41.4/C70.

21.Zaitsev A.V., Anwyl R. STDP induces mainly LTD in rat prefrontal cortex and LTP in somatosensory cortex. Irish Journal of Medical Science. 2010. Vol. 179. P. S146-S146.

22. Zaitsev A.V., Kim K.K., Fedorova I.M., Dorofeeva N.A., Magazanik L.G., Tikhonov D. B. Frequency-dependent inhibition of calcium-permeable AMPA receptor currents in rat brain synapses and at fly neuromuscular junctions by use-dependent channel blocker // 7th FENS forum of neuroscience. Amsterdam. 2010. Presentation Code: 131.29. Abstract Number: B120.

23. Ким K.X., Зайцев A.B., Малкин C.JI., Тихонов Д.Б., Магазаник Л.Г. Роль кальций-проницаемых АМРА рецепторов в поддержании баланса возбуждения и торможения в префронтальной коре крысы // Научные труды III съезда физиологов СНГ. Ялта. 2011.С. 43-44.

24. Ким К.Х., Зайцев А.В., Федорова И.М., Малкин C.J1. Ингибирование глутаматергических синапсов производными фенилциклогексила в зависимости от частоты стимуляции // Тезисы докладов XIVМеждународного совещания и VII Школы по эволюционной физиологии. Санкт-Петербург. 2011. С. 93-94.

25. Зайцев А.В. Особенности механизма выработки долговременной потенциации в префронтальной коре крысы in vitro II Восьмой международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» / Судак, Крым, Украина. 2012. С. 173.

26. Малкин С. JI., Ким К.Х., Тихонов Д.Б., Зайцев А.В. Соотношение АМРА и NMDA глутаматных рецепторов в разных типах нейронов префронтальной коры мозга крыс // Цитология. 2012. Том 54, № 4. С 347-348.

27. Зайцев А.В. и Магазаник Л.Г. Функциональные особенности глутаматергической передачи в интернейронах мозга // II Всероссийская конференция с международным участием "Гиппокамп и память: норма и патология". Пущино. 2012. С. 24-25.

28. Малкин С. Л., Ким К.Х., Тихонов Д.Б., Зайцев А.В. Вклад кальций-проницаемых АМРА рецепторов в ВПСТ различных интернейронов префронтальной коры крысы // II Всероссийская конференция с международным участием "Гиппокамп и память: норма и патология". Пущино. 2012. С. 35-37.

29. Malkin S.L., Kim K.Kh., Sibarov D.A., Antonov S.M., Tikhonov D.B., Zaitsev A.V. Contribution of NMDA and calcium-permeable AMPA receptors to EPSCs in pyramidal cells and different types of intemeurons in rat prefrontal cortex // 8th FENS forum of neuroscience. Barcelona. 2012. Presentation Code: 27.05 Abstract Number: 673.

30. Zaitsev A.V., Lewis D.A. Properties of synaptic connections between pyramidal cells and fast-spiking intemeurons // FENS Featured Regional Meeting. Prague. 2013. P. 117.

31. Malkin S.L., Kim K.Kh., Tikhonov D.B., Zaitsev A.V. Effects of Ca2+-permeable AMPAR antagonists on mEPSCs in rat cortical fast spiking intemeurons // FENS Featured Regional Meeting. Prague. 2013. P. 167.

32. Зайцев A.B., Малкин С.Л., Ким K.X., Магазаник Л.Г., Тихонов Д.Б. Функции ГАМКергических интернейронов коры в норме и патологии // XXII Съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. Волгоград. 2013. С. 175.

Подписано в печать 21.02.14 Формат 60х84'/]б Цифровая Печ. л. 1.6 Тираж 100 Заказ 14/02 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Зайцев, Алексей Васильевич, Санкт-Петербург

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук

На правах рукописи

0 5 2 014 5 07 '1 -

Зайцев Алексей Васильевич

морфофункциональные свойства разных типов нейронов и их синаптические связи в префронтальной коре

макаки и крысы

03.03.01 - Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

чл.-корр. РАН, д.б.н., проф., Магазаник Лев Гиршевич

Санкт-Петербург - 2014

Содержание

Введение 6

Глава 1. Нейрофизиология префронтальной коры и ее функции (литературный обзор) 12

1.1. Критерии для определения префронтальной коры.........................................................12

1.2. Функции префронтальной коры.......................................................................................13

1.3. Эволюция префронтальной коры. Сравнительная анатомия префронтальной коры у крыс и обезьян....................................................................................................................16

1.4. Развитие и инволюция префронтальной коры в онтогенезе..........................................19

1.5. Цитоархитектоника префронтальной коры обезьян.......................................................21

1.6. Афферентные и эфферентные связи префронтальной коры у приматов.....................23

1.7. Нейроны префронтальной коры и их основные характеристики..................................27

1.8. Заключение по литературному обзору.............................................................................37

Глава 2. Методы исследования 39

2.1. Приготовление переживающих срезов коры мозга макаки и крысы............................39

2.2. Регистрация и анализ электрофизиологических свойств нейронов префронтальной коры.....................................................................................................................................41

2.3. Гистологические методы и морфологическая реконструкция нейронов.....................52

2.4. Статистическая обработка данных...................................................................................54

Глава 3. Пирамидные нейроны префронтальной коры обезьяны 55

3.1. Электрофизиологическая классификация пирамидных клеток на основе многомерного статистического анализа..........................................................................55

3.2. Электрофизиологические свойства пирамидных клеток разных классов....................62

3.3. Особенности электрофизиологии пирамидных клеток обезьян....................................76

3.4. Функциональная роль пирамидных клеток разных электрофизиологических классов в коре обезьян.......................................................................................................79

Глава 4. Интернейроны префронтальной коры обезьяны 82

4.1. Морфологические группы интернейронов 2-3 слоев дорсолатеральной префронтальной коры мозга макаки................................................................................83

4.2. Электрофизиологические характеристики интернейронов...........................................92

4.3. Иммуногистохимические характеристики интернейронов префронтальной коры макаки................................................................................................................................107

4.4. Функциональная роль разных типов интернейронов префронтальной коры макаки 116

Глава 5. Сравнение свойств нейроглиаформных и корзинчатых интернейронов префронтальной коры крысы и обезьяны 126

5.1. Характеристики нейроглиаформных нейронов префронтальной коры у обезьяны и крысы.................................................................................................................................127

5.2. Характеристики быстроразряжающихся парвальбумин-положительных корзинчатых нейронов префронтальной коры у обезьяны и крысы...........................138

5.3. Функциональное значение межвидовых различий в морфологических и физиологических свойствах нейроглиаформных и корзинчатых клеток крысы и обезьяны............................................................................................................................148

Глава 6. Функциональные особенности возбуждающих синаптических входов у различных нейронов префронтальной коры обезьяны и крысы 151

6.1. Свойства миниатюрных ВПСП и ВПСТ пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов у обезьян и крыс............................................152

6.2. Свойства вызванных ВПСП пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов крыс и обезьян.......................................................................................157

6.3. Субъединичный состав глутаматных АМРА рецепторов различается у интернейронов и пирамидных клеток............................................................................164

6.4. Функциональное значение различий в свойствах ВПСП у интернейронов и пирамидных клеток: механизм упреждающего дисинаптического торможения в коре....................................................................................................................................166

6.5. Значение различий в организации возбуждающих входов для функционирования префронтальной коры крысы и обезьяны......................................................................171

Глава 7. Особенности взаимодействия быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток префронтальной коры крысы 173

7.1. Свойства синаптических соединений между пирамидными нейронами и быстроразряжающимися интернейронами....................................................................175

7.2. Краткосрочная динамика синаптической передачи в возбуждающих и тормозных синапсах............................................................................................................................180

7.3. Реципрокные синаптические соединения имеют более высокую эффективность и надежность, чем односторонние.....................................................................................183

7.4. Пресинаптические потенциалзависимые кальциевые каналы.....................................185

7.5. Функциональное значение..............................................................................................188

Глава 8. Особенности долговременной синаптической пластичности пирамидных клеток префронтальной коры крысы 193

8.1. Синаптическая пластичность во 2-3 слоях префронтальной коры, вызванная синхронизирующим протоколом, не подчиняется правилу Хэбба.............................194

8.2. Ингибирование кальцийзависимого калиевого тока, обеспечивающего медленную следовую гиперполяризацию, восстанавливает хэббову пластичность.....................198

8.3. Нейромодуляторы, подавляющие медленную следовую гиперполяризацию, восстанавливают хэббову пластичность........................................................................201

8.4. Сайт экспрессии синаптической пластичности в префронтальной коре....................204

8.5. Фармакологические свойства пластичности в префронтальной коре........................206

8.6. Функциональное значение..............................................................................................209

Глава 9. Особенности функционального созревания возбуждающих синапсов пирамидных клеток префронтальной коры макаки 211

9.1. Плотность шипиков на дендритах пирамидных нейронов 3 слоя префронтальной коры макаки значительно уменьшается в возрасте от 15 до 42 месяцев....................212

9.2. Функциональное созревание глутаматергической передачи в префронтальной коре

макаки в возрасте от 3 до 84 месяцев: постсинаптические изменения.......................214

9.3. Функциональное созревание глутаматергической передачи в коре макаки: пресинаптические изменения..........................................................................................219

9.4. Функциональные значение выявленных изменений в работе возбуждающих синапсов префронтальной коры макаки в ходе постнатального развития.................223

Заключение 227

Выводы 231

Список литературы 233

Введение

Актуальность. Префронтальная кора - важнейший интегративный центр нервной системы. Эта область мозга необходима для организации целенаправленных действий во времени, она обеспечивает удержание в памяти недавних событий (сенсорных стимулов), концентрацию внимания на целевых стимулах и подготовку к выполнению будущих действий. Важную роль префронтальная кора играет в регуляции эмоций, социальном поведении, контроле вегетативных функций.

Под префронтальной корой в настоящее время понимают участок лобной коры, имеющий наиболее тесные связи с ассоциативным медиодорсальным ядром таламуса и получающим многочисленные дофаминергические проекции от стволовых ядер [1]. Префронтальная кора также имеет тесные двусторонние связи с большинством вторичных и третичных сенсорных и моторных областей коры, восходящие и нисходящие проекции от многих ядер таламуса, покрышки мозга [2], гипоталамуса [3-6], бледного шара [7], амигдалы [5, 8-10], гиппокампа [11], ретикулярной формации среднего мозга [12,13], черной субстанции среднего мозга [14], мозжечка и ряда других структур.

Префронтальная кора значительно увеличивается в размерах в ходе эволюции млекопитающих, достигая наибольшего размера у приматов. У человека она составляет до 29% от общей поверхности коры. Развитие префронтальной коры в онтогенезе продолжается длительный период, у человека созревание префронтальной коры продолжается до 20-летнего возраста [15-19]. Эти нейробиологические данные хорошо соотносятся с тем, что высшие психические функции, напрямую связанные с работой префронтальной коры, такие как принятие решений, планирование, языковые навыки достигают своего полного развития примерно в этот же возраст [1]. Префронтальная кора задействована в патогенезе многих психических заболеваний, включая шизофрению, депрессию и другие [20, 21].

Исходя из исключительно важной роли префронтальной коры в организации психической деятельности человека и ее вовлеченности в ряде патологий, в настоящее время ведутся интенсивные исследования клеточных нейрофизиологических механизмов осуществления функций префронтальной корой, а также изучается специфический вклад разных типов нейронов. Для понимания механизмов работы префронтальной коры необходимо доскональное изучение свойств структурных элементов коры (нейронов) и особенностей их взаимодействий.

В настоящее время широко распространено предположение, что нейронные сети внутрикорковых модулей у всех видов млекопитающих состоят из сходных структурных элементов и построены по единому каноническому принципу [22, 23]. Межвидовые различия возникают в основном из-за различий в количестве этих модулей и особенностей их внешних связей. Поэтому большинство сведений о нейронной организации коры были получены при работе со срезами коры грызунов, так как этот объект существенно удобнее для изучения. Однако к настоящему времени накоплено большое количество данных, указывающих, что сами структурные компоненты корковых модулей могут отличаться у различных видов [2426], поэтому остается дискуссионным вопрос: насколько правомерно использование этих результатов для выяснения функций префронтальной коры приматов? Вместе с тем экспериментальных работ, посвященных изучению свойств нейронов префронтальной коры приматов, в особенности ГАМКергических тормозных интернейронов, крайне мало. Это делает необходимым проведение комплексного изучения нейронов префронтальной коры приматов.

Цель работы. Провести комплексное электрофизиологическое и морфологическое изучение гетерогенной популяции нейронов дорсолатеральной префронтальной коры макаки (Macaca fascicular is), выявить основные типы нейронов и дать описание их характеристик, определить свойства их синаптических связей, а также провести сравнение свойств нейронов префронтальной коры крысы и макаки, и тем самым приблизиться к пониманию особенностей механизмов работы префронтальной коры и роли отдельных типов нейронов в осуществлении функций.

Основные задачи исследования.

1. Провести изучение электрофизиологических свойств популяции пирамидных нейронов 23 слоев префронтальной коры макаки и выявить основные физиологические классы пирамидных нейронов, используя методы многомерного статистического анализа. Определить возможную роль разных классов пирамидных нейронов в функционировании префронтальной коры.

2. Изучить и проанализировать морфологические, электрофизиологические и биохимические свойства гетерогенной популяции ГАМКергических тормозных интернейронов 2-3 слоев префронтальной коры макаки и разработать их классификацию;

предсказать возможную функциональную роль каждого из изученных типов интернейронов.

4. Изучить и сопоставить свойства возбуждающих постсинаптических ответов у разных типов нейронов префронтальной коры крысы и макаки. В частности, исследовать свойства миниатюрных и вызванных постсинаптических возбуждающих ответов, изучить субъединичный состав постсинаптических глутаматных рецепторов. Выявить функциональное значений различий в постсинаптических ответах у разных типов нейронов, их роль в реализации упреждающего дисинаптического торможения. Исследовать особенности синаптических связей между пирамидными нейронами и тормозными быстроразряжающимися корзинчатыми клетками в префронтальной коре крысы.

5. Выявить специфические особенности формирования долговременной синаптической пластичности у пирамидных клеток префронтальной коры крысы и определить факторы, влияющие на возникновение пластичности. Изучить роль и механизмы действия некоторых нейромодуляторов на синаптическую пластичность.

6. Определить, есть ли связь между массовой элиминацией глутаматергических кортикальных синапсов и их функциональным созреванием в подростковом возрасте у приматов. Для этого исследовать особенности функционального созревания возбуждающих синапсов пирамидных клеток 2-3 слоя префронтальной коры макаки, выявить пресинаптические (вероятность освобождения медиатора) и постсинаптические (соотношение вклада АМРА и ЫМБА рецепторов, субъединичный состав рецепторов) изменения в ходе онтогенеза.

Научная новизна. На основе статистически репрезентативной серии экспериментов и кластерного анализа результатов впервые выявлено, что пирамидные клетки 2-3 слоев коры приматов по электрофизиологическим свойствам подразделяются на 4 класса: регулярноразряжающиеся нейроны с низким и высоким входным сопротивлением, залповые низкопороговые нейроны и нейроны с промежуточным паттерном. Эти результаты

существенно отличаются от данных, полученных ранее при изучении коры грызунов, где почти все пирамидные клетки 2-3 слоев относятся к регулярноразряжающимся нейронам.

Впервые проведено прямое сравнение свойств интернейронов префронтальной коры крысы и обезьяны, выявлено, что, морфологически сходные интернейроны крысы и обезьяны могут относиться к разным электрофизиологическим типам. Впервые показано, что интернейроны у обезьяны характеризуются большей возбудимостью, чем у крысы.

Впервые обнаружено, что в префронтальной коре крысы при использовании синхронизирующих протоколов наблюдается нарушение правила Хэбба о знаке долговременной синаптической пластичности: протоколы с негативной задержкой и позитивной задержкой вызывают долговременную депрессию в отличие от других районов коры. Впервые установлено, что подавление медленной следовой гиперполяризации позволяет восстановить выработку долговременной потенциации при использовании синхронизирующего протокола с позитивной задержкой. Выявлен возможный механизм действия нейромодуляторов на синаптическую пластичность через ингибирование медленной следовой гиперполяризации.

Впервые показано, что функциональное созревание возбуждающих синапсов пирамидных клеток префронтальной коры макак завершается до подросткового возраста, и что

массовая элиминация возбуждающих синапсов в подростковом возрасте происходит через механизмы, не связанные с их функциональной зрелостью.

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенное комплексное электрофизиологическое и морфологическое изучение гетерогенной популяции нейронов дорсолатеральной префронтальной коры макаки, идентификация основных типов нейронов, описание их характеристик и синаптических свойств позволяет приблизиться к пониманию клеточных механизмов раб�

Информация о работе

Зайцев, Алексей Васильевич
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2014
ВАК 03.03.01

Диссертация

Морфофункциональные свойства разных типов нейронов и их синаптические связи в префронтальной коре макаки и крысы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы