Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Локализация и функции иммуноактивных участков белка VP1 вируса ящура

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Локализация и функции иммуноактивных участков белка VP1 вируса ящура"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ! ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА

На правах рукописи ГЕЛЬФАНОВ Василий Маргазянович

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ ИММУНОАКТИВНЫХ УЧАСТКОВ БЕЛКА УР, ВИРУСА ЯЩУРА

03. 00,03 Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —1991

Работе выполнена в Институте биоорганиче ской химии им. К.Н.Шемякина АН СССР

Научный руководитель: кандидат химических наук, старший научный сотрудник О.Н.Волыхива

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор И.И. Дозморов

доктор медицинских наук В.П. Карелин

Ведущая организация: Институт икыунологии из СССР.

Зацвта диссертации состоятся 15 января 1892 г. б 10°° час на заседании Специализированного совета та защите ди_сертаций аа соискание ученой степени доктора наук при Институте Сиоорганичес-кой химии им.Ы.и.Шемякина АН СССР по адресу: 117871 ГСП Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно озпякомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.И.Шеиякина АН СССР

Автореферат разослав

1991 г.

Учввай секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В. А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современный уровень развития биотехнологии, молекулярной иммунологии и генной инженерии позволяет моделировать гемунный ответ с помощью искусственно полученных молекул, что создает предпосылки для решения актуальной проблемы современной иммунологии - получения искусственных вакцин. Одним из перспективных направлений исследований в этой области является создание синтетических пептидных вакцин.

В настоящее время достигнуты значительные успехи в разработке синтетической протнвояицгрной вакцины. Однако существующие пептидные препарата менее эффективны, чем вакцина, получаемая традиционным способом. Одним из путей решения проблемы создания высокоэффективной противояцурной вакцины является определение имлуноактив-ных участков белка YP1 вируса ящура, изучение их функций в процессе формирования противовирусного иммунного ответа и анализ воз;,'.окно ста включения фрагментов белка VP^ в состав синтетической вакцины.

Цэли и задачи работы. Целью настоящей работы является локализация участков, содеряацях В- и Т-эпйтош в последовательности белка VP.J вируса яцура штаммов OjK и K^z' определение их роли в стимуляции противоядурного иммунного ответа и выбор фрагментов, использование которых при конструировании синтетической противоя-щурной вакцины о<5вспечило бы ее высокую эффективность. Данное исследование является составной частью работ, ¿гроводамых в проблемно-целевой группе синтетических вакцин ИБХ им. M.U. Шемякина АН СССР по созданию синтетической протиЕояцурной вакцины.

Для локализации В- и Т-эпитопов были изучена свойства синтетических перекрывавдЕсся фрагментов иммунодоминантного района 130160 белка VPj в конкурентном тыуноферлентном анализе с использованием противопептидных и противовирусных сывороток различных ответных, а также в опытах по антигензависимой пролиферации ли?.!фоци-тов in vitro. В ходе работы исследовались антигенные и юдлуноген-ные свойства ряда синтетических фрагментов VP1, не входящих в им-мунодоминантный район, с целыь выявления пептидов, обладающих сои-ственной иммуногенностью, т.е. способных индуцировать образование антител без конъюгации с высокомолекулярным белком-носителем. Для изучения возможности конструирования искусственной вакцшш на основе синтетических ящурных антигенов была исследована вирусная

специфичность иммунного ответа на пептидные фрагменты белка УР,.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной работе получены новые данные относительно локализации В- и Т-эпи-топов иммунодоминантного района белка УР1 вируса ящура штаммов и А22» Впервые показано, что при иммунизации относительно коротким пептидом животных различных видов образующиеся антитела могут быть направлены на разные участки этого пептида. Выявлены новые высоко-иммуногенные в свободном виде фрагменты в И- и С-концевых областях, белка УР1. Показана вирусная специфичность Т-клеточного иммунного ответа, индуцируемого отдельными пептидными фрагментами УР^. Установлено иммунодепрессивное и антипролиферативное действие фрагмента из С-концовой области белка УР1.

На основании анализа свойств изученных синтетических фрагментов УР, вируса ящура даны рекомендации по использованию этих пептидов в качестве компонентов перспективной синтетической противо-, ящурной вакцины. Использованные в настоящей работе методические подходы могут применяться для выявления иммуноактивных участков белков других вирусов с целью моделирования аффективного иммунного ответа на вирусы или другие природные антигены.

Апробация полученид результатов. Результаты исследований, представленные в датой работе, доложены на ряде всесоюзных и международных симпозиумов: на VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Таллинн, 1987), на международном симпозиуме по структуре, биосинтезу и функциям молекулярных олементов иммунной системы (Пущино, 1987), на VI и VII Советско-западногерманских симпозиумах по химии пептидов и белков (Гамбург, 1987 и Диллгаган, 1989), на X Американском пептидном симпозиуме (Сент-Луис, 1987), на исЬА-симпозиуме "Технологические достижения в разработке вакцин" (Парк-Сити, 1988), на симпозиуме по фундаментальным и прикладным аспектам молекулярной биологии пикорнавирусов (Москва, 1988), на 20-м и 21-м Европейских пептидных симпозиумах (Тюбинген, 1988 и Платиа д'Аро, 1990), на I Всесоюзном съезде иммунологов (Дагомыс, 1989), на I Советско-израильском семинаре по пептидам и белкам (Реховот, 1990), на-ИСГА-симпозиуме (Фриско, 1990).

Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, получено положительное решение на выдачу авторского свидетельства.

Объем работы. Диссертация изложена настраницах, состоит из введения, трех глав и выводов, содергсит 20 рисунков и 24 табли-

ш. Список цитированной литературы включает 156 названий! В главе I приводится обзор литературных данных по методам локализации В- и Т-эпитопов вирусных белков, в главе 2 изложены результаты исследований, в главе 3 - экспериментальные методы.

обсуждение результатов

Данные по локализации В- и Т-эпитопов в последовательности белка Ч?], полученные различными группами исследователей с использованием протеолитических фрагментов белка, изолятов вируса, моно-клональных антител и синтетических пептидов, весьма разноречивы. Поэтому представляло интерес провести болев детальное исследование локализации В- и Т-эпитопов основного иммуногенного района с использованием высокоиммуногенных протектив'ных пептидов и ряда их перекрывающихся фрагментов методами конкурентного иммуноферментно-го анализа и антигензависимой пролиферации лимфоцитов мышей.

На начальном этапе были определены В- и Т-эпитопы икмунодоми-нантного района белка УР1 В1фуса ядщза наиболее подробно исследованного штамма - О^К. Затем были проведены исследования по локализации' иммуноактивных участков вируса штамма А22. встречающегося в ряде районов СССР. Работы проводили с использованием синтетических пептидных фрагментов белка УР1, полученных в проблемно-целевой группе синтетических вакцин ИБХ им. М.М.Шемякина АН СССР. Исследования, включающие определение титров вируснейтрализующих антител, проводили совместно с Всесоюзным нау ло-исследовательским ящурным институтом (г.Владимир).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ В- и Т-ЭПИТОПОВ ИЫШОДОШНАНТНОГО РАЙОНА ■ БЕЛКА УР1 ШТАММА ВИРУСА ЯЩУРА.

Для проведения работы по локализации иммуноактивных участков белка УЕ| нами были использованы синтетические перекрывающиеся фрагменты этого белка штамма О^К вируса ящура, представленные на рисунке I. Ранее в работах нашей группы было показано, что фрагменты 136-148 и 136-152 К обладают иммуногек..остью в свободно . виде и протективными свойствами на лабораторных хивотных, что позволяет предположить наличие у этих пептидов не только, протективно-го В-эпитопа, но и Т-хелперного эпитопа.

136 141 145 148 152 159

y-n-r-m-l-v-p-h-l-r-g-d-l-q-v-l-a-q-k-v-a-r-t-ъ

145 159 i_i

145 152

I 1

152 i

148 i

141 148

I i

141 152 i_i

Рис. I. Синтетические фрагменты иммунодоминантного района белка VP1 вируса ящура штамма OjK.

В результате исследования зависимости иммунного ответа на пептид 136-152 OjK от контроля Ir-генов было установлено, что пептид проявляет иммуногешше свойства на мышах линии BALB/c (H-2d) и, в меньшей степени, на CBA/J и СЗН (Н-^). У мышей С57В1 (H-Í) антитела к пептиду образовывались только после иммунизации конъю-гатом пептида с гемоцианином улитки (KLH). На основании полученных данных в последующих опытах для иммушзаций использовались мыши с H-2d.

Определение В-эпитопа пептида 136-152 О^К. Для локализации В-эш1топов в последовательности пептида 136-152 0¡- К была изучена способность перекрывающихся синтетических фрагментов кммунодоми-нантного района белка VP1 вируса яцура штата К: 136-148, 141152, 145-152, I4I-I48, 145-159 (рис.1) и 90-98 (контрольный пептид, рис.7), конкурировать с пептидом 136-152 за связывание с противовирусной кроличьей и противопептидной мышиной сыворотками. Исследование проводилось методом непрямого конкурентного иммуно-ферментного анализа (рис.2). При этом пептиды I4I-I52, 136-148 и I4I-I48 проявляли высокую 1шгибирующую активность, в то время как фрагменты 145-159, 145-152 и 90-98 не ингибировали связывания пептида 136-152 с антителами. Результаты опытов показывают, что как •при иммунизации кроликов вирусом, так и при ю.мугагаации мышей пеп-твдом 136-152 образующиеся антитела направлены к фрагменту 141148.

136

I м ,

136

039

136-152 »4Ы52 too-

1Э«-1*а

141-143 5 I (0 (П

X ч> S 50

£

1.56 6,25 25 пептид нМ

Q1 039 156 625 25 пептид^ нМ

А Б

Рис.2, йтибирование связывания противовирусных кроличьих антител (а) и противопегггидных антител мышей линии ВАХВ/о (б) с пептидом 136-152 01К пептида«! 136-152, 141-152, 136-148, 141-143, 145-153, 145-152. Контрольный пептид - 90-98.

Определение Т-эпитопа пептида I3S-I52 OjK. Тгклеточная активность. пептидных фрагментов была изучена в опытах по антигензависи-мой щюлиферации клеток nep^'opiiiinux лимфоузлов мыпей линзы BALB/c In vitro (рис.3). Лимфатические узя; извлекались через 7 суток после иммунизации животных пептидом 136-152,и изучалась способность лимфоидннх клеток пролифориропать при добавлении различных пептидов.

Рис.3. Антигензависгалая пролиферация лимфоцитов периферийных лимфоузлов мылей BALB/o, прай-мированннх пептидом 136-152 К при стимулировании In vitro пептидами 136-152 136-148 OjK, 136-152 А22 И 90-98 Ag2.

Было установлено, что пептида 1Я6-152 и 136-148 OjK способны индуцировать пролиферацию клеток периферийных лимфоузлов In vitro, однако активность пептида 136-148 значительно ниже и проявляется лишь при концентрации 100 нМ/мл. Пептида последовательности 90-98 и 136-152 VP1 штамма не сткмул1фовали пролиферацию клеток. По-лучешше результаты позволяет идентифицировать Т-эпитоп иммунодо-минантного района бежа YP1 штамма OjK вируса ящура в последовательности 136-152.

На основании совокупности полученных данных можно утверждать, что фрагмент 136-152 VP1 штамма OjK содержит все функционально ваг.зыо участки, обеспечивающие Ш1дукщда этим иептвдом противовирусного и противопептидного иммунного ответа, а именно: В-эпитоп и Т-эпитоп.

итиолктивныв участки белка VPj штамма а22 вируса ящура.

Исследование иммунодоминантного района белка VP^ проводили с использованием следующих синтетических пептидов, соответствуюцих фрагментам последовательности этого района: 136-152, I36-I5I, 140151, I3I-I49, 140-149, 143-149, 135-159, а также укорочешшх с N-и С-ковда аналогов пептида 135-159, а именно: 136-159, 140-159, 142-159, 143-159, 136-156-Рго. 140-156-Рго, Н4-156-Рго (рис. 4). Фрагменты с С-концевым А1а-156 для повышения устойчивости к проте-олизу были удлинены с С-концэ на остаток Pro.

Кммуногеннне свойства синтетических фрагментов иммунодоми-нантного района УР^ штамма Ард вируса ящура. В результате иммунизации кроликов и морских свинок пептвдами 136-152, I36-I5I и 140151 было установлено, что данные фрагменты неиммуногенны на кроликах, однако способна индуцировать образование вируснейтрализуюцих антител у морских сешюк. Ранее в работах нашей группы было показано, что аналогичны;,« свойствами обладают пептиды I3I-I49 и 140149. Для сравнения иммуногенных свойств пептида 135-159 и фрагментов с С-концевыми остатками 149, 151 и 152 из этой группы пептидов был выбран как типичный представитель - фрагмент 136-152.

Изучение иммуногенности пептида 135-159 на лабораторных животных показало, что у мышей линий BALB/c (d-гаплотип) и C57BL/6 (Ь-гаплотип) образуются антитела с высокими титрами на этот пептид, в то время как у мышей CBA/J (К-гаплотип) не происходит образования антител к данному пептиду (табл.1).

131 135 140 143 149 151 156 159

N-c-t-c-k-y-S-a-c-g-u-g-r-r-c-d-ir-e-p-l-a-a-r-v-a-a-q-l-p

136 152

I_I

136 151

I_i

140 151

« i

131 149

1_I

140 149

I_l

143 . 149

135 159

t - 1

136 159 I_I

140 159

1_I

142 159 i_I

143 159

'36__■ 1Г6- Pro

_II6- Pro

'if_If-Pro

Рис. 4. Синтетические фрагменты иммунодоминантного района белка VP1 вируса ящура штамма А22>

В отличие от фрагмента 136-152 01К, пептид 136-152 А22 не индуцировал образования антител ни • у одной из использованных линий мышей. Аналогичные результаты были получены при иммунизации этими пептидами кроликов. Лишь у морских свинок фрагмент 136-152 способен индуцировать образование антител, однако титр их значительна ниже, чем при иммунизации пептидом 135-159. Полученные результаты свидетельствуют о важности С-концевого участка т53-159 УР^ штаммй А22 Для индукции противопептидного иммунного ответа.

Таблица I

Иммуногенность пептидов 135-159 и 136-152 УР1 А22 на лабораторных животных.

Животные Титр противопетидных антител,

Мши

135-159 136-152

линия Н-2

ВАХВ/с й 3,4 <1,0

С57В1/6 Ъ 4,8 <1,0

СВА/^ к <1,0 <1,0

Кролики 3,8 3,4 . <1,0 2,2

Морские свинки

Сравнение иммуногенности фрагментов пептида 135-159 на мышах линии ВАЬВ/с после двукратной иммунизации (табл.2) показало, что уменьшение длины пептидных фрагментов с С-конца до остатка 156 не влияет существенно на их способность индуцировать образование про-тивопептидных антител. В то ко время, снижеше иммуногенности наблюдается при укорочении пептидов с Л-конца до 143 остатка и, затем до полного исчезновения ее у пептида 144-156. Определение титров противопептидных и вируснейтрализующих антител в сыворотках морских свинок, иммунизированных однократно пептидами в дозе по 50 мкг на животное (табл.2), показало, что в ряду фрагментов 135-159, 136-159, 140-159 и 142-159 наблюдается падение титра вируснейтра-лизущих антител. Ступенчато снижаются титры противопептидных антител при уменьшении длины пептидных фрагментов как с Н-конца до 143 остатка, так и с С-конца. Пептид 144-156 полностью лишен им-муногенных свойств. Все пептидные фрагменты, указанные в таблице 2, за исключением пептида 144-156, в той или иной степени обладают протективными свойствами.

а

Таблица 2

Иммуногенность синтетических фрагментов VP1 А22 на лаборатор-1ШХ кивотннх.

Пептид Титр противопептидных антител,-lg Титр вируснейтра-лизупцих антител, -logg

Мыши BALB/c Морские свинки

135-159 3.4 3,4 4,5

136-159 3,4 3,4 3.7

140-159 3,4 3,4 2,2

142-159 3,4 3.4 <1,0

143-159 3,1 3,1 <1,0

136-156 3,1 2,8 <1,0

140-156 3,1 1.7 <1,0

144-156 1,0 <1.0 <1,0

Определение Т-эпитопа пептида 135-159 Ago. Способность пептидных фрагментов индуцировать пролиферацию Т-клеток периферийных лимфоузлов мышей была изучена на "отвечающей" линии мышей BALB/c, иммунизированных пептидом 135-159.

Рис.5. Антигензависимая пролиферация лимфоцитов мышей balb/o, праймированных пептидом 135-159, при стимулировании In vitro пептидами 135-159, 143-159, 140-159, 136-156, 140-156, 144-156, 136-152, 143-149 и 136-152 0ТК.

Как видно из рис.5, лишь пептид" 143-159 и 140-159 способны стимулировать интенсивную пролиферацию клеток. Активность пептидов 136-156 и 140-156 значительно ниже, хотя достоверно превышает фоновые значения.

Таким образом, наблюдается корреляция между иммуногенностыо синтетических фрагментов на мышах BALB/c, их способностью индуцировать пролиферацию лимфоцитов тех жо животных In vitro и иммуногенностыо на морских свинках. Минимальный фрагмент - 140-156, способный индуцировать пролиферацию лимфоцитов, проявляет ишуноген-ные свойства на мышах и морских свинках. В то же Еремя, это наиболее короткий из фрагментов, обеспечивающих частичную защиту морских свинок от заболевания. Несмотря на одинаковую способность фрагментов 135-159, 136-159, 140-159 и 142-159 индуцировать образование противопептидных антител у морских свинок й мышей BALB/c (табл.2), а также сходную активность первых трех пептидов в опытах по антигензависимой пролиферации лимфоцитов мышей (рис.5), для индукции эффективного противовирусного иммунного ответа предпочтительнее использовать пептид 135-159, способный индуцировать у морских свинок образование вируснейтрализующих антител с наибольшими титрами (табл.2).

Локализация В-эпитопов в последовательности 135-159 УР^ штамма Аод вируса ящура. С целью определения участка пептидной цепи, ответственного за связывание с антителами, была изучена способность перекрываицихся фрагментов иммунодоминантного района конкурировать с пептидом 135-159 за связывание с противопептидной и противовирусной сиворотками различных животных. В случае конкурента! за связывание пептида 135-159 с противопептидной сывороткой мышей BALB/c минимальным фрагментом, обладающим ингибирукадей активностью, был пептид 144-156 (рис.6а). Аналогичное исследование противопептидной сыворотки кроликов показало несколько иные результаты (рис.66). В данном случае ингибируюцей активностью обладают пептида 143-159 и 136-152. Все остальные изученные пептиды не активны в этом тесте. Интересно, что пептид 136-152 проявляет ин-гибирующую активность, в то врем'я как отличащийся от него одним аминокислотным остатком фрагмент I36-I5I полностью лишен способности ингибировать связывшше пептида 135-159 с антителами. Изучение противопептидной сыворотки морских св1Шок позволило сделать вывод, что большинство противопептидных антител связывается с участком 143-159 (рис.бв).

1М-1У О,* 1М-1Я иэ-и! ка-м? « 1*1-1 <9 9Ч-9Ч

136-152 МСМ51

печыд им пептид^ нМ

в Г

Рис.6. Ингибирование связывания противопептидных (анти-135-159) антител мышей вахв/о (а), кроликов (0), морских свинок (в) и противовирусных кроличьих антител (г) с пептидом 135-159 синтетическими пептидамй:135-159, 140-159, 143-159, 136-156, 140-156, 144-156, 136-152, 136-151, 131-149, 140-151, 140-149, 143-149, 136-152 0^, И 90-98.

Изучение ингибирования пептидными фрагментами связывания пептида 135-159 с противовирусной сывороткой кроликов (рис.бг) позволило установить основной участс . связывания с аьгителами -140-143. Мы предположили, что аналогично межвидовым различиям мокет наблюдаться дисперсия спектра образующихся антител и внутри популяции естественновосприимчивых к ящуру животных. Изучение противопептид-

них сывороток группы крупного рогатого скота, состоящей из 7 животных, подтвердило это предположение. При иммунизации пептидом 135-159 у пяти коров происходило образование антител против участка 143-159, а у двух других животных антитела образовывались против более короткого фрагмента - 144-156 (табл.З). Необходимо отметить, что эти эксперименты позволяют определять лить участок связывания большинства антител, при этом минорные В-эпитопы в последовательности пептида не выявляются. Таким образом, при иммунизации животных различных видов пептидом 135-159 большинство образующихся антител направлены на различные участки пептидной цепи.

Из приведенных дашшх видно, что пептид 135-159 содержит помимо Т-эпитопа также набор В-эпитопов иммунодоминантного района УР^ А£2» на которые направлены антитела различных видов животных. Вместе с тем, в некоторых случаях пептид не способен вызывать образование антител (например у мышей СВА/М). Мы полагаем, что при широких испытаниях на естественновосприимчивых к ящуру животных будут выявлены еще большие различия в способности пептида индуцировать образование антител. Отсюда следует, что синтетическая про-тивоящурная вакцина должна включать набор В- и Т-эпитопов не только иммунодоминантного района, но и других участков белка УР1.

Таблица 3

В-энитопы пептида 135-159, определенные с использованием противопептидных сывороток различных видов животных

Вид животного В-эпитоп

Кролики Морские свинки Мыши ВАЬВ/о Коровы I (5 жив.) 2 (2 жив.) 136 152 |-1-1 143 159 I-1-1 144 156 I-1-1-1 143 159 1-1-1 144 156 I-Ь-1-1

Функции фрагментов белка УР1 штамма Ago вируса ящура, не входящих в иммунодоминантный район. Для выявления иммуноактивных участков вне иммунодоминантного района последовательности белка VP^ штамма к.^ вируса ящура нами были изучены иммуногенныа и антигенные свойства ряда синтетических пептидных фрагментов данного белка: 10-24, 39-61, 50-69, 90-98, 175-189, 170-189 и 197-213 (рис.7).

1 50 100 150 200 213

I_I_I_I_I_I

10_24 50_69 90^98 175 199 197 213

39_61 170_189

10 24

р-у-т-т-т-у-е-и-у-с-с-в-т-з-у

39 61

р-у-к-1-0-н-ь-м-р-1-н-у-1-1>-1^м-<}-т-н-0-н-с-1.

50 69

у-1-1)-ь-м-0-т-н-«-н-с-1г-у-с-а-ь-ь-к-а-а

90 98

р-н-с-а-р-е-а-а-ь

170 189

т-т-1-н-в-1/-ь-у-р-м-к-н-а~е-1г-у-с-р-я-р

175 189

197 213

8-0-1)-н-н-к-0-к-1-1-а-р-а-к-<1-ь-ь

Рис. 7. Синтетические фрагменты белка УР1 штамма А22 вируса ящура.

Антигенные свойства пептидов оценивали по связыванию в ИФА противовирусной кроличьей сыворотки, полученной посла двукратной иммунизации животных инактивироваиным вирусом штамма к^, с пептидами, сорбироваипши на плате. Противовирусные антитела связывались с пептидами 136-159 и 197-213. Все остальные пептиды, использованные в данном опыте, не проявляли антигенных свойств.

Иммуногенные свойства синтетических фрагментов УР^ исследовали, дважды иммунизируя ими мышей различных линий, а также кроликов и морских свинок (табл.4). Анализ титров противопептидаых антител лабораторных животных при связывании с соответствующими пептидами, сорбированными на плате, позволил установить следующие иммуноген-

ннв фрагменты белка УР1: 39-61, 50-69, 175-189, 170-189 и 197-213.

Таблица 4

Иммуногенность фрагментов белка УР^ штамма А22 вируса ящура на лабораторных животных.

Пептид Титр противопептидных антител,

Мыши Кролики Морские свинки

ВАЬВ/с СВА/Д С57В1/6

10-24 1.0 <1,0 <1,0 <1.0 <1.0

39-61 5,5 3,1 <1,0 5.0 4,1

50-69 <1,0 <1.0 <1.0 3,1 2.5

90-98 <1,0 <1,0 <1,0 <1.0 <1.0

175-189 2,6 3,2 2,8 4.9 <1.0

170-189 5,8 5,8 5,5 5,2 4.1

197-213 <1,0 <1,0 <1,0 3,5 2.8

135-159 3,4 <1,0 4,8 3.8 3.4

Сравнение иммуногенных свойств перекрывающихся фрагментов 3961 и 50-69 свидетельствует о значительном расширении границ 1г-генного контроля над иммунным ответом при смещении границ синтетического пептида в Л-концевую область: пептид 39-61 индуцирует образование антител с высокими титрами у мышей линий ВАЬВ/с (Н-2й), СВА/^ (Н-2к), кроликов и морских свинок, в то время как пептид 5069 проявляет иммуногенные свойства только на кроликах и морских свинках.

Сопоставление титров антител, индуцируемых пептидами 175-189 и 170-189,также указывает на значительное повышение иммуногенности при удлинении пептида с Н-конца на пять аминокислотных остатков. При этом наблюдается как увеличение числа видов "отвечающих" на пептид животных, так и возрастание титров противопептидных антител. Антитела кроликов и морских свинок против пептидов 39-61, 5069, 175-185 и 170-189 не обладают способностью нейтрализовать вирус.

Таким образом, фрагменты 39-61, 50-69, 175-189 и 170-189 по-

следовательности VP1 не включают в себя вируснейтрализующие В-эпитопы, но содержат Т-эпитопы, обеспечивающие проявление этими пептидами иммуногеншх свойств. При этом способность пептидов 3961 и 170-189 вызывать образование антител у ряда животных выше, чем у фрагмента 135-159. По этой причине пептиды 39-61 и 170-189 представляют интерес для использования в синтетической противоя-щурной вакцине в качестве Т-эпитопов, однако окончательное решение этого вопроса возможно лишь после установления вирусной специфичности индуцируемого пептидами Т-клеточного иммунного ответа.

Как видно из таблицы 4, пептид 197-213 также проявляет имму-ногешше свойства на кроликах и морских свинках„ однако, антитела, направленные на данный пептид, неспособны нейтрализовать вирус. Этот пептид неиммуногенен на мышах. Согласно литературным данным иммунизация животных К1Н-конъюгатом пептида 200-213 приводит к образованию вируснейтрализуадих антител. Таким образом, отсутствие вируснейтрализуицих антител у кроликов, иммунизированных свободным пептидом 197-213, может быть обусловлено индукцией в этом случае антител, направлешшх к участку, отличному от вируснейтрализуюцего эпитопа. Мы предполагаем, что расширение границ 1г-генного контроля над иммунным ответом на пептид 197-213 позволит получить антитела, направленные к вируснейтрализукхцему В-эпитопу как у кроликов, так и у других животных. В этом плане перспективным представляется использование фрагмента 197-213 в синтетической конструкции, включаицей вирусспецифичные Т-эпитопы, усиливающие противо-пептидный иммунный ответ.

Иммунодепрессивное и антипролиферативное действие пептида 175-189 последовательности УТ^ штамма А22 вируса ящура. В процессе изучения иммуногенных свойств синтетических пептидов последовательности VP^ штамма Agg вируса ящура было установлено, что указанные пептиды обладают иммунодепрессивным и антипролиферативным действием.

Для выявления воздействия пептида 175-189 А22 на образование антител к другим фрагментам белка VP1 были использованы иммуноген-ше пептиды 136-152 OjK (рис. I) и 136-159 А22 (рис. 4). Животных иммунизировали пептидами 136-152 OjK и 136-159 А22 либо смесью пептидов: 136-152 OjK + 175-189 Ag2 и 136-159 А22 + 175-189 А^ (табл.5).

Результаты определения титров противопептидных антител в сы-

воротках животных свидетельствуют о частичном подавлении иммунного ответа на пептиды 136-152 OjK и 136-159 Agg при введении их животным совместно с фрагментом 175-189 Agg. Титр антител, направленных к пептиду 136-152 OjK, снижался в сыворотках кроликов и мышей BALB/c соответственно с 4,4 до 2,5 и с 3,4 до 2,5. Титр противо-пептидных антител в сыворотках животных, иммунизированных фрагментом 136-159 Agg, составлял для кроликов 3,3; мышей BALB/c 3,1 и морских свинок 3,5. При иммунизации этих животных смесью пептидов 136-159 Agg и 175-189 Agg соответствующие значения составляли: 2,0; 2,6; 2,8.

Таблица 5

Иммунодепрессивное действие пептида 175-189 Agg

Иммуноген Антиген Титр противопептидных антител,-lg

кролики мыши BALB/c морские свинки

136-152 OjK 136-152 OjK 4,4 3,4 -

136-152 0ТК + х 136-152 OjK 2,5 2,5 -

175-189 Agg 175-189 Agg 4,5 2,8 -

136-159 Agg 136-159 A22 3,3 3,1 3,5

136-159 Agg 136-159 Agg 2,0 2,6 2,8

175-189 Agg 175-189 Agg 4,5 2,8 <1,0

Необходимо отметить, что снижение титров противопептидных антител в сыворотках животных, иммунизированных смесью пептидов, не связано с образованием антител на пептид 175-189 А22, поскольку иммунодепрессивное действие этого пептида наблюдается и в том случав, когда антитела к самому пептиду 175-189 не образуются, как например в случае морских свинок.

Для изучения механизма иммунодепрессивного действия пептида 175-189 А22 было изучено влияние этого фрагмента на пролиферацию лимфоцитов мышей 1п и Иго.'Добавление к культуре лимфоцитов пептида 175-189 или 170-189 в концентрации 100 рМ (табл.6) снижало ско-

рость роста клеток в десятки раз.

Аналогичный эффект наблюдался при добавлении к культурам клеток пептида в смеси с различными стимуляторами (конканавалин А (Кон А) - 2 мкг/мл, липополисахарид (ЛПС) - 10 мкг/мл, фитогемаг-глютинин (ФГА) - 10 мкг/мл), вызывающими интенсивную пролиферацию клеток. При этом пептид 175-189 подавлял пролиферацию клеток в 302000 раз. Степень ингибирования роста клеток прямо пропорциональна концентрации пептида. Причем в присутствии стимуляторов требуется большее количество пептида, чем для клеток без стимуляторов, чтобы снизить скорость роста клеток до определенного уровня.

Таблица 6

Ингибирование пролиферации лимфоцитов неиммунных мышей ВАЬЁ/с пептидами 175-189 и 170-189 в присутствии стимуляторов роста клеток

Пептид ймп/мин

0 10 цМ 50 pM 100 pM

175-189 9321+499 43Ci7±4II 182+14 122+18

175-189 + Кон А 184933*35303 131780i9270 116605+26589 6109±2619

175-189 + ЛПС III720±I3939 36560±I524 822+223 54+18

175-189 + ФГА 3I600i5988 10097+1658 646+61 85+17 .

170-189 9321±499 7465+86 3525+387 I89±43

170-189 + ЛПС III720±I3939 67102+5527 28082±II06 830+230

136-152 Азз 9321+499 9219+327 9415+474 9577±9I3

« - концентрация пептида

При использовании клеток селезенки в аналогичных опытах также наблюдалось дозозависимое подавление пролиферации спленоцитов, как в присутствии стимуляторов, так и без них. Однако в ходе изучения влияния пептидов 175-189 и 170-189 на рост клеток шеломы Х-63 ци-тостатическое действие пептидов не проявлялось. Использованный в качестве контроля пептид 136-152 А22 110 оказывал влияния на пролиферацию клеток лимфатических узлов и селезенки мышей.

В тесте in vitro на цитотоксичность было установлено, что ан-типролиферативное действие пептидов 175-189 и 170-189 А22 не является следствием токсичности пептида для клеток.

Фрагменты основного иммуногенного района вируса ящура штаммов OjK (рисЛ) и А22 (рис.4), а также другие пептиды последовательности VP1 штамма А22 вируса (рис.7), за исключением фрагментов 175189 и 170-189, не проявляют антипролиферативного действия. Ингиби-торнзя активность последних не различается, поэтому здесь в основном приводятся данные по более короткому фрагменту - 175-189. Сопоставление аминокислотных последовательностей перечисленных пептидов позволило предположить, что способность пептидов ингибиро-вать рост лимфоидных клеток обусловлена наличием сульфгидрильной группы цистеина в структуре пептидов 175-189 и 170-189. В последовательности прочих пептидов цистеин отсутствует. Для проверки этого предположения рост In «tiro лимфоцитов мышей изучали в присутствии различных цистеинсодержащих пептидов: 272-279 последовательности gp2 вируса Ласса (KDTPGGYC), 82-94 gp41 вируса иммунодефицита человека (HIV) (LGLWGCSGfüJC) и 36-42 фибриногена человека (GPRWERC), синтезированных в лаборатории химии пептидов КБХ им. М.М.Шемякина АН СССР, а также низкомолекулярных цистеинсодержащих соединений: цистеина, цистина, ацетилцистеина, трет-бутилоксикар-бонилцистеина, глутатиона окисленного и восстановленного. Из перечисленных соединений лишь фрагменты 82-94 gp41 HIV и 36-42 фибриногена обладали антипролиферативной активностью. Все остальные использованные соединения не были способны оказывать ингибируицее действие на рост ли?.»!оцитов и пролиферацию этих клеток, стимулированную ЛПС. Изучение антипролиферативной активности пептидов 170189 VP1 и 175-189 VP,, а также 82-94 gp41 HIV и 36-42 фибриногена, модифицированных по SH-rpynne цистеина ацетамидометильной (Аст) группой показало, что блокирование SH-группы приводит к исчезновению способности пептида ингибировать пролиферацию клеток.

На основании анализа полученных результатов можно заключить, что антипролиферативным действием обладают только цистешсодерка-щие пептиды со свободной SH-группой. Вместе с тем это условие не является достаточным для достижения эффекта ингибирования роста клеток, поскольку не все соединения, содержащие цистеин или сульф-гидрилъную группу, подавляют рост клеток в культуре. По видимому, существенное значение для проявления пептидами антипролиферативной активности имеют особенности аминокислотной последовательности ближайшего окружения цистеина в молекуле.

Несмотря на недостаточность информации для глубокого понимания механизма иммунодепреесии, локализация участка, обладающего

иммунодепрессивным действием в последовательности белка УР^ вируса ящура имеет принципиальное значение для выяснения механизмов формирования противовирусного иммунного ответа и для создания искусственной противоящурной вакцины.

Вирусная специфичность Т-клеточного иммунного ответа на синтетические фрагменты VP1 Ago- Способность пептидов 39-61, 135-159, 175-189 и 197-213 белка VP^ птамма A22 вируса ящура индуцировать функциональную Т-холперную активность определяли по увеличению титров индуцируемых вирусом антител у кроликов в опытах In utuo. Для этого животных иммунизировали сначала пептидом, затем, на 28 сутки, вирусом в субиммунизирущей дозе. Контрольной группе животных вместо пептида вводили полный адьювант Фрейнда. Через 42 суток после первой иммунизации определяли титры противопептидных и ви-руснвйтрализуюцих антител (табл.7). Такой подход позволяет выявлять участие Т-клеток, активированных пептидами, в процессе образовать вируснейтрализуодих антител.

В сыворотках всех групп животных, иммунизированных пептидами и затем вирусом, были обнаружены высокие титры противопептидных антител.

Результаты определения титров вируснейтрализувдих антител свидетельствуют о значительном различии в способности пептидов стимулировать вирусспецифичный Т-клеточный иммунный ответ. Так иммунизация пептидами 135-159 и 175-189 с последующим введением малой дозы вируса приводит к образованию у животных антител, способных нейтрализовать вирус in vitro с титрами соответственно 4,4 и 4,5. В случае пептидов 39-61 и 197-213 эти значения гораздо ниже -1,2 и 1,5 соответственно - что близко к значениям, полученным для контрольной группы .тавотных. Иммунизация кроликов фрагментом 175189 без последующего введения вируса не приводит к образованию виру снейтрализущих антител.

Таким образом, способностью индуцировать Т-клеточный иммунный ответ обладает пептид 175-189. Фрагмент 135-159 индуцирует ойразо-вагою вируснейтрализуодих антител независимо от введения вируса, однако титр антител в этом случае гораздо ниже, чем в сыворотках животных, иммунизированных пептидом с последующим введением малой дозы вируса.

Таблица 7

Способность синтетических пептидов усиливать образование ви-руснейтрализующих антител у кроликов.

Иммунизации Титр противопептидаых антител, -1& Титр вируснейтрализуицих антител, -logg

I II

39-61 вирус 4.4 1.2

39-61 - 4,4 <1,0

135-159 вирус 3,4 4,4

135-159 - 3,4 1.6

175-189 вирус 4,5 4.5

175-189 - 4,5 <1,0

197-213 вирус 3,6 1.5

197-213 - 3,6 <1,0

ПАФ* вирус - 1.3

* - ПАФ - полный адыовант Фрейнда

Поскольку пептид 175-189 обладает мммунодепроссивным действием и включение его в состав синтетической вакцины может вызвать подавление иммунного ответа, представляло интерес провести аналогичное исследование для пептида, модифицированного то БН-группе цистеина, который лнтви антинролифератнвяоА активности.

В следующем опыте то индукции противовирусного Т-холперного иммунного ответа был использован пептид 170-189, обладавший более высокой иммуногенностью по сравнению с пептидом 175-189, а также его аналог, модифицированный Аст-грушюй по остатку цистеина (табл.8). В результате было установлено, что введение животным, иммунизировашшм либо 170-189, либо 170-189Аст субимыунизирующей дозы вируса приводит к образованию уже на 32 сутки после первой иммунизации вируснойтрализукцдх антител, титры которых значительно превышают значения полученные для контрольной группы животных. Полученные результата свидетельствуют о способности пептидов 170-189 и 170-18ЭАсл) индуцировать шрусспецкфичный шмуилый ствет, однако, как следует из сопостсплогшя титров вяруснойтрализущих и противо-

пептидных антител, пептид 170-189Аст является более эффективным.

Таким образом, модификация остатка цистеина в пептиде 170-189 не только позволяет избежать нежелательного имлунодепрессивного действия но и дает возможность повысить способность пептида стимулировать противовирусный иммунитет.

Таблица 8

Способность пептидов 170-189 и I70~I89Acm усиливать образование вируснейтрализукцих антител у кроликов.

Иммунизации Титр противопептидных антител, -lg Титр вируснеПтрализующих антител, -Logg

I II

170-189 вирус 4,9 4,0

170-189 - 4,9 1.0

I70-I89Acm вирус 5,4 4,8

I70-I89Acm - 5,4 1,0

ПАФ* вирус - 2,8

ПАФ - полный адьгаант Фрейнда

Вирусная специфгшость иммунного ответа на синтетические фрагменты белка VP^ штамма Agg В1фуса ящура была исследована также in vitro в опытах по антигензавясимой пролиферации лтфэцитов мышей BALB/c. В результате было установлено, что клетки лимфоузлов кивотних, иммунизированных пептида;® 135-159 и I70-I89Acm cnocoöiw интенсивно пролиферировать в культуре в присутствии как самих пептидов, так и вируса. При использовашш в аналогичном опыте лимфоцитов мышей, иммунизированных пептидом 39-61 пролиферация клеток наблюдалась лишь в присутствии пептида, но не вируса. В контрольных экспериментах с клеткам неиммунных мышей ни вирусные частицы, ни пептиды не индуцировали пролиферацию лимфоцитов.

Такш образом, результаты опытов in vitro согласуются с данными, полученными in vivo по индукции пептидами 135-159 и I70-I89Acm противовирусного Т-хелперного иммунного ответа.

Из совокупности полученных данных следует, что пептиды 135159, 197-213 и 170-189Аст УР} являются необходимыми компонентами эффективной синтетической противоящурной вакцины. Пептид 135-159 обладает наилучшей способностью индуцировать образование у животных вируснейтрализующих антител, содержит весь набор видоспецифич-ных В-эпитопов иммунодоминантного района и вирусспецифичный Т-хелперный эпитоп. Согласно лит ратурным данным 1В1Ше .1.1,. е1 а1., 19821, фрагмент 200-213 УР1 содержит минорный В-эпитоп и способен в виде конъюгата с КШ обеспечивать частичную защиту животных от заболевания. Изученный в данной работе фрагмент 197-213, в отличие от описанного ранее, обладает иммуногенностью в свободном виде и может быть использован в составе вакцины совместно с ;оуги-ми высокоиммуногенными пептидами, способными расширить границы 1г-генного контроля над иммунным ответом на пептид 197-213. Возможность включения пептида 170-189Асш в состав вакцины обусловлена способностью данного фрагмента УР1 копировать вирусспецифичный Т-хелперный иммунный ответ и отсутствием у него, благодаря моди$и-кации остатка цистеина, антипролиферативной активности. Этот пептид может служить Т-клеточным "носителем" протективных В-эпитопов.

вывода

1. Определены В- и Т-эпитопы иммунодоминантного района белка УР^ вируса ящура штамма О^К.

2. Определены В- и Т-эпитопы иммунодоминантного района белка УР| вируса ящура штамма А£2-

3. Выявлены новые иммуногенные фрагменты белка УР^ вируса ящура штампа А^; 39-61, 50-69, 175-189, 170-189, 197-213.

4. Показана вирусная специфичность Т-хелперного иммунного ответа на пептиды 136-159 и 170-189 УР1 А^-

5. Впервые показало, что белок УР, вируса ящура штамма А^ содержит иммунодепрессивный участок 170-189, активность которого обусловлена наличием свободной БН-группы.

6. Показана целесообразность включения фрагментов УР^: 136159, 197-213 и модифицированного по БН-группе пептида 170-189 в состав синтетической противоящурной (нтамм к^) вакцины.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Surovoy A.Yu., Volplna O.K., Gelfanov V.M., Ivanov V.T. Mimicking protective epitopes of foot-and-mouth disease virus with synthetic peptides. - In: Peptides: chemistry and biology/Eds G.R. Marshall. ESCOtt, Leiden, 1988, p. 553-554.

2. Vol'pina O.M., Surovoy A.Yu., Gelfanov V.M., Khan E.S., Ivanov V.T. Novel foot-and-mouth disease protective peptides: mechanism of lmnunostiinulatlon. In: Tecnological advances in vaccine development J Ed.L.Laskly, New York, Alan R. Ыяв Inc., 1988, p.391-400.

3. Surovoy A.Yu., Gelfanov V.M., Grechaninova 1.А., Yarov A.V., Vol'pina O.M., Ivanov V.T. Towards peptide vaccine against the foot-and-mouth disease. - Proceedings of 20th Eur. pept. symp./ eds: G.Jung, E. Bayer, Berlin - New York: Walter de Gryter and Co., 1989, p.692-694.

4. Суровой А.В., Гельфанов B.M., Вольпина O.M., Иванов В.Т., Чепуркин А.В., Иваниценков В.Н., Дрягалин Н.Н., Еурдов А.Н. Антигенная структура вируса ящура III. Иммуногешшв свойства синтетических пептидов последовательности основного иммуно-генного района белка VPj вируса ящура штаммов OjK и А^- -Биоорган. химия, 1989, т.15, » 9, с.1185-1192.

5. Яров А.В., Гельфанов В.М., Гречанинова Л.А., Суровой А.Ю., Вольпина О.Ы., Иванов В.Т., Чепуркин А.В., Луговской А.А., Дрягалин Н.Н., Иваниденков В.Н., Бурдов А.Н. Антигенная структура вируса ящура IV. Синтез и иммуногенные свойства

, новых фрагментов белка VP1 вируса ящура штамма А22- - Биоорган. химия 15, 1989, Л 9, с.1193-1205.

6. Яров А.В. Гельфанов В.М., Гречанинова Л.А., Суровой А.Ю., Вольпина О.И., Иванов В.Т., Чепурккн А.В., Дрягалин Н.Н., Иванщенков В.Н. Антигенная структура вируса ящура V. Защита природновосприимчявых животных от заболевания ящуром с помощью синтетического пептид... - Биоорган, химия 15, 1989, J* 10, с.1313-1317.

7. Vol'plna О.Ы., Surovoy A.Yu., Gelfanov V.M., Kahn E.S., Ivanov V.T. Novel approaches to foot-and-mouth disease protective peptides. - Proceedings of the VI USSR-FRG symp. on chemistry oi peptides and proteins Eds: W.A.Konig, W.Voelter. Tubingen, 1989, vol.4, p.223-228.

8. Gelianov V.H.,Yarov A.V. Synthetic anti-foot-and-mouth disease vaccine development. - Abstr. of VII International conference of Yung Scientists on organic and biological chemistry. Sofia, Bulgaria, 1990, p. 67-69.

9. Гельфанов В.Ы., Гречанинова Л.А., Кан E.C., Яров А.В., Суровой A.D., Вольпина О.М., Иванов В.Т. Антигенная структура вируса ящура VI. Функциональные участки иммунодоминантного района белка VP1 вируса ящура штаммов OjK и А^.- Биоорган, химия 17, 1991, с 596-606.

Усл. печ.л. /.и: Гираж /¿о экз. Бесплатно. Банаа ППП БелНИИНТИ. 220004, Минск, пр. Машерова, 2^.