Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез и изучение свойств пептидов-фрагментов VP1 вируса ящура А22 и Азия1

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Синтез и изучение свойств пептидов-фрагментов VP1 вируса ящура А22 и Азия1"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

' Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных

На правах рукописи

УДК 570,112.083.3:578.835.^:615.371

ПЕТРОВ Владимир Николаевич

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПЕПТИДОВ -ФРАГМЕНТОВ УР1 ВИРУСА ЯПУРА А22 К АЗИЯ 1

СШОб/Зирусолсшл*

Автореферат ои ¿серташ на соискание ученой степени хшвшата Счюйогичгиахнаух

Влапимкр • 1'Ш

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институт зашиты животных

НАУЧНЫЙ РУК.ОВОЛИТсЛЬ: РЫБАКОВ Сергей Сеи'ееан, доктор с дологических наук, старшие научный сотрудник.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

- Макаров Владимир Владимирович, доктор Оиологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ (В^ИВЗ'М. г. Покров);

- Г.греБозчмова Наталья Александровы, кандидат биологических наук, старший научный согрупник (РНИИЗЖ, г. Г ладимир).

БЕДУШАГ ОРГАНИЗАЦИЯ: Всероссийский .шучно-иеследовательский и . те дологический институт (биологической промяишеннссти, г. Щелково Московской области

Защита состоится ^а/у^ 18Рг. в 10 часов « «асеойнии специализированного совета К 120. 60. 01. по ззамге згссертаи'л . на ссискание ученей степени каи- ' ддоата оиологичесш наук . при Всероссийском научнэ-исследоват *льском институте защити жиьотньк по адресу: 600500, г. Владимир, лос.Юрьезеи.ВпИИЗЖ. ' . ■

С диссертацией можно ознакомиться • с Скбя/,отеке Всероссийского ьаучно-ксс ледоьа 1 егьского института заши- . тг животных.

Учении еек<>етаоь специя л жированного совет.} - Уяомоб В.Л. \

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ахтуальиость темы. Ящур опасное заболезание паонохопыт-кых животных, наносящее большой экономический ущерб. Наглая с 20: годов шшего столетия ведутся работы по создам-» инективировеннмх протизоящурных вгкцин. Производимые в настоящее время инактимрованные вакцин являются эффективным средством борьбы о заболеванием. Однако практика изготовления и применения вм-хила ряд существ ;нньк недостатков ин .ктисированнся ■ протисоящуряоп еакцины, Культивирование, кс (центрирование, эчистка и инактивация ' вируса представляют оснозные технологические трудности. Производство иншивировакной вакцины включает наработку большого количества Бирусного материала и сопряжено с опасно лью вынос возбудителя за ¡педели предпритил, Длитель.-ое культк-вихшние вируса может привести к изменению его антигенности по сравнению с исходным штаммом, е балла зткые примеси, остающиеся в вакцинном препарате, вызывают побочные реакции у привитых живопш. Для сохранения эффективности инактивиро-ванную вакцину необходимо перевозить и хранить в опециальш к рефрижераторах. Наиболге серьезнмм недостатком таких озтин является остаточная инф( хционност!», нередко приеошш.ая к есг.ышке ящура.

В пос ледние годы актизно ведутся исследования о созданию прстнзсящурнсй 1;!кци'!ь! на основе антигеное, получена методам-/ химического синтеза или с применением теяюлогии реком-бинантиой ДНК. Производство и использование таких вакцин было .бы лишено некоторых недостатков присущ!« '.«активированной вакциле. Абсолютная нсинфеидаЬшость - главное достоинство вакцин, созданных на основе синтетических антигенов. Химически синтезированные антигены дао» возможность создавать большое разнообразие комплексов, стимулирующих иммунной ответ у прививаемых животных. Включение е сеян

комплекс антигенных детерминант вируса разных штаммов, подтипов и типов пэзеолягт создать поливалентные пептидные противоящурные вакцины. Актуальном также является создание диагностических препаратоЕ на основэ химически синтезированных пептидных фрагментов неструктурны:-: белков или бел-коз оболочки вируса ящура.

Цель и задачи исследований. Основной целью данной раооты являлся синтез пептидов, включающих антигенные детерминанты VP1 спроса ящда А22 № 550 и Азия 1 № и создание на их основе препаратов, обеспечивающих защиту животных от ящура гюи заоажении roiv ологичным вирусом.

Для достижения указавюй цели были поставлены следующие отдачи:

П} оьести компьютерный ячализ первичней сгрук уры белкг 'v/PI вируса ящура А22 № 550 и н?ия 1 № 48 с целью локализации потенциальных антигенных детерминант,

синтезировать пептиды, содержащие аминокислотные последовательности иммунодоминантных участков №1 вируса ящура А22 № 550 и Азия 1 № 43,

получить н? ■ основе синтезированных пептидов иммуногем и гоучить их фмзИяо-уимическнз, антигенные, иммуногекше и протитив^е свойства.

провести _ сравнительный ' анализ иммунобиологические свойств пеп гидов VPI вируса ящура А22 № 550 и Азия i №48.'

Шучтповянт. Впервые1 синтезированы лелгйхы, включение Фрап.-енм VPi вируса ящура А22 № КЮ и Азия 1 ссгдли;.: щсшйы пептидов с природными белками и небеш ыми соешнекилма. Изучены физико-химические, антигеникг иммунсгенные и про гекишике свойства получежьк пептидов t комппексса, показано, что некоторые- из них икауцировали об хсоалние в*русисатрализущй!>. антител и обеспечивала с гад ту лабораторных животных от заболевания пж заражении гомо \

g>

логичным вирулентным вирусом яп ура. Получены еовыо данные о слиянии химического состава пептидных антигенов на аддукцию. антипептидного ответа. В результате сравнения иммунобиологических свойств обнаружены различия в антигеннок, иммуногемноя ч npovei гкенеи актизностг фрагментов VP1 вируса ящура Ац № 550 я Азия 1 № 43.

Практическое значение работы. Разркботг.ны. v реализованы cxün ы синтеза и счистки индивидуальных пептидов. По результатам сравнительного изучения анп.генны>:, иммуногенн&х и протекп-вных свойств серии пептидов в свободной форме и 9 составе кодексов выбраны наиболее перспехткзньге и тез.ологи'шые для создания на их ockoss протиБояшуркых вакцинных г реларатов. Методические подходы, испольеованные в данной работе, могу, быть применены ппя изучения физико-химических свойств искусственных ачти-еноз. и контроля в процессе их синтеза. Предложенные способы по-г.ышенир иммуногенности пептидных фрагментов VP1 вируса ящура А22 N? 550 и Азия 1 № 48 грименимы для других пептидных антигенов л могут быть полезны для создаш:Л синтетической вакцины. Обнаружение анти-rei ности пептидов покззы-BPOi возможность использования их в качестве безопясных агентов з иммунологических и сиагностэтеских исследованиях. Результаты исслеьосанил включи ы сс "Зрег^е'н^ю инструкцию по изготовлению и контроля экспериментальных образцов синтетичен ой противоящурчой вакцины Аутьержпеннух) директором института.

Anpoöaim f.езульшее нсслеиовэчнй- Результаты исследовании по теме диссертации доложены и обсуждены * на конференциях "Актуальнее проблемы зетеринарнол вирусологии' (г. Владимир, 1987 и 13S3), Всесоюзном симпозиума по химии пептидов (г. Юрмала, 1930), научно-теоретическое конференции молодых ученых 'Актуальные вопросы ветеринаркой вирусологи'

(г.' Суздаль, 1990), международной конференции "К новой стратегии борьбы с ящуром* (г. Суздаль, 1291), Всесоюзной конференции "Использование физических и биологических факторсв в ветеринарии и животноводстве" (г. Витебск, 1991), научной конференции "Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии* (л Покров, 1392), ча заседаниях методической комиссии и Учзкого совета ЗНИЯИ (1587-1332 г.г.).

Публикации результата исследований Основн1« положения диссертации огубликованы в 17 леча' ных работах, в том числе 2 за чзках на изобретения.

Структура м объем работы. Диссертация изложена на 153 страница< машинописного текста, содержит разделы: введе-л!12, оО'гор литературн, собственны? исследования, обсуждение результатов, въ1Еоль,;. практические предложения, список литературы и приложение. Список литературы включает 160 цитированных источников. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 10 рисунками.

Положения, выносимые на защиту:

- схемы синтеза фрагментов иммунодоминантных участков белка Ч/Р1 вируса ящура А22 № 550 и Азия 1 № 48, результаты испытаний их физико-химических, антигенных, иммуногенных . сволочь, а также протективной активности, определенной в опытах на лабораторных животных,

- результаты сравнения иммунобиологических свойств фрагментов УР1 сируса ящура А22 № 550 и Азия 1 № 43,

- локализация иммунокомпетентных зпитопов в структуре УР1-{140-153)-пгптида вируса ящура Азия 1 № 18,

способы повышения иммуногенности УР1-{140-153)- ; петица сируса ящура Азия 1 № 48 путем создания сиите- . гичеспи конструкций состава • (Ас-140-1бШ/з^Ч^-^у и

Ра1т-6!уз-140-1Ь3^1уг1у5(Ра1т)-1еи. \

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы .. Б работе были использованы реагенты и производные амк-.нокислот фирм Reanal (Венгрия), Пика (Швейцария), Merck (ФРГ), Sigma (США), «Лор Силков ях маркеров (Signa), хлорметилкро-ванный ссполимер стирола и 1% дивинилбипола Знрм Flu':a и Bio-dad (США). BSA и KLH фирмы CalNotfiem (СШ;\), адь^сант Фрейнда фирмы Difco (США), матеркагы для колоне мной хроматографии фирм Pharnacta (Швеция), B-o-Rad и At!ex (США), Merck (ФРГ), Chemapo! С ¡ехо-Словак.ю), пластины для тонкослойной хром!Топ>афии фирмы Ка .•aller (Чехо-Словакия). Отечественное растворители очищали общепринятыми методами, остальные отечественные реагенты имели квалификацию не ниже 4ia".

Штаммы вируса ящура: Ая № 550, Азии 1 № 48.

Культура клеток: первичная культура клеток свином почки, .-{ырашениай в пенициллиновмх фгакона:.

Животные: морские свинки беспородные массой 400-r>00 г, кролики породы Шиншилла массой 2,0-2,5 кг.

А'злиз вишетюя структуры белы VPÎ вируса ящура. А& Кг Ь50 и Азия 1 № 48 провопили с использованием разработанного во ВНИИЗЖ пгкета программ ANSITE (Гупенкин В.М. и соавт. 1990), составленных па основе методов теоретического анализа коэффициентов гидрофильное™, антигенное™, амфипз-тичносги и экспонирсванности различна участков белка, а также поиска участков с выражемои ссгмектзл,>!гая подш-ж- ~ ностьо. .

Жнпксфазныя синтез пептидов проводили, используй методы актированных эф/гров и .смешанна алгияоипоа чмигюкислот. Концевые амнно- или карбоксильные группы, а также боковые раш-калы трифункшшалькьк аминокислот блокировали защитными группами согласно выбранной схеме синтеза. Все целевые пептид» П9луч5ли путем блочной конденсации фрагментов с заи^-шен^ми

боковыми функциональными группами. Пептиды очищали после кг.ждоа стадии иараишзания цепи.

Твсртфззиый синтез пентипсв осуществляли в ручном варианта последовательным нтращиванием цепи с С-конца. С-конце-вую аминокислоту в виде цезиесой соли присоединяли к полимеру е ялметмлфоршмаде (DMF). Для защиты а-амикофушшии использовали Bov-rpynny, боковые радикалы трифуккииональ-ны~! аминокислот были блокированы временными группами согласно CMdpsr«ш схеме синтеза. Все целевые пептиды no/rpiaw путем блочной конденсации фрагментов с защищенными группами. Кажпопч цикл присоединения аминокислоты проводили в соответ-с .им с олубликояа-гоым фотоколом (Ярое А.9 и солет. 1959).

Дсоло.каржтге псптщсв выполняли по методам Тип J. ел. ICSft t^7;YaJ;rnaH..Fu|il N. Ш.

/-¿.шймслыиш анализ пептидов после (.ислогного гидролиза и приватизации ^ениг.могиоцийнатом выполняли методом В ЭЖХ.

Тоахослащтэ картографию проводили для контроля за протеканием рескции и .'омсгениости счищенных пептиао j.

Молекуляр:-у-х> кассу и гомогенность некоторых пептидов или их комплексов оценивали методом ми:рок< лоночис H жидкостной >^ома гоф.афии,

;Кс:!"юг>;рог,зпж ' подтипов с бслхвш проводили глута-роы*м йль (бгидом по общепринятой методике (Pia.it Е. е.а,

Имуучосп'мупиртши)} юмппш mirmoâ с бычьим снмроточнкм альбумдаом (В§/\) готовил,'/ по -методам Lov :;,гп К. 1287 и Morch В. 1SS7, образов?,кис комплекса' под тьер ксали с ло-лощью онектроиного микроскопа,

- ¡¿м тошных расгеором семгида ь сочетание

с масляным адмоантом йяя бс- • едьгэзанта проводили еьутри м^^с'и'о. Препараты ходили с объема 0,5 мл . Решмушацш сшля |ЛИ общ,о. через 42 тя. ,

Кснтромое заражение < крет свинок пчантарно адап'ти

рзмнмкм к ним зирусок в до:е 50Q-10G0 </Ш;с/0(1 мл проводил; \

обычно на 14 сутки после р<_*имм"чизацки. Ö • течение 7 шее жнЕотнме находились под наблюдением, после чего их понтер-га пи пат ологоанатомическому обследованию.

Определение mpi am теп в сыворотках кроьц а также избенке антгешх сеолств пептидсе илг itx гтыогатс: выполнили как'С помощью предложенного Рыбако;ым С.", и соют. ь 1У83г варианта радис иммунного анализа, так и. общепринятого метод« иммунофернентного анализа (Abu Elzein F'M.E. 1978). Тигры сируснейтрализ^пщих антител огределяли в ргакцж нейтрализации вируса в v/nt туре ¡спето:: свиной почки как описано в работе Павлов;-. А.В и соавт. 1931.

Вир} voeva тичпсх)м активность пептидм оценивали по снижению титра инфекииснностн вируса ящура А22 № 550 *ри репродукции его в первичкой культуре клггек свиной яочки.

2.2Яезультаты собственных исследования

Достижение основной цели диссертационной работы было начато с теоретического поиска антнгешгк детерт^нт основного им.» у.сгсыого бегаа №1 сируса яиурз Азия t № 48 и № Rio. По результатам расчета гидрофшнюсти, амфипатичкости, аь'гиг^'дюсти. подрижногти и экслонирозашюсти отдельных участкоа белка были выязлены ot-лаш аминокислотных new.e-дозатегь^остей 13G-IG0 VP1 обоих с<ротилоа сируса, 193-208 - ееротнта Азия 1 и 197-Р13 - А22, потенциально ответственные за юитуаш) £ир:»ссг.сц;'|фи",гс!11Х антител. На основании результатов компьютерного анализа были выбраны, а оатем синтезированы пептиды специфичности VP1 вируса ящурз А22 550 ;рис. 1) и Азия 1 iv нЗ (рис. 2). *

22, {. Синтез пепттов

Синтез пептидов I - ¡У (рис. 1) проведен с ц»лм? изучения свсйств укороченных фрагментов теоретически предсхазандаго

иммунодоминантного района последовательности 130-160 VP1 вируса яшура А22 № 550- Пептид V синтезировали, учитысая сообщение о взаимодействии фрагмента 168-178 VP1 вируса ящура А)2 с сайташ клеточных рецептсроз (Moore D. е.а. 1989).

145-155 (I) 142-151 (0) 142-155 (¡8) 13&-155 (IV) №178 (V)

Рис. 1. Лминог лслотные п эследователшлти синтезированных фрагментов VP1 вируса ящура А22 № 550

Пептиды I - IV были синтезированы классическим жидчофаз-ным методом путем конденсации защищенкьк промежуточны: блоков, Для синтеза блоков использовали следующие производные, амино-кис ют: сушнимидные эфиру Tyr(Z), Ser(Bá), Aía, Gly. Asp(OBzl), Leu и Glu(OBá) < На-Вомминофдтой, Ala, Pro, '.eu и Val с Na-Z-защигой, а также AlaOBut, GlyOBut, BxCfyOFrr. ВосАгд(МОг), Bo"Ag(Tos) и SocMclONp.

3í пущенный пептид 145-155 получали конденсацией блоков 145-151 и • 152-155, пептид последомтльности 142-151 сиите-сироияи.из Слокос 142-115 и 145-151. Тетрадекапшид 142-155 бия с«пезирс2иН. п,7см дсуст'афШой ксадшкши трзх блокос: чл первой с гйляи ко.чденеяроезли блоки 146-151 и Ш-15Ь, полученнмй пеиид 145-155 ееедил'/ с реакция с пептидом 1/'2-145. П:пт1'д 13в:155 синтезировали конденсацией отделу« фрагменте в е следующем пердпке: Í45-I51 -i- 152-155,; 14М41 + 146-155, 141-142 * 145-155, 133-140 + 141-155. Bcí: промежуточные защищен ие соединения очищали одним или несколькими способами. -

V

ÜDIWVWA

GRRGDŒPLA GPP.GDÍEPLAARVA YSAGGMGRRGDLEPLAAHVA QWTIHELLVR

На рис. 2 представлены аминокислотные последовательности синтезироаанньк нами пептидов, содержащих аминокислотные последовательности VP1 вируса Азия 1 №48.

- 153

ШШШШЯАт) (vi)

• 136 153 .

ygeet^rgd1 ¿амоыдаап) (vii)

132 ./ • 153

; ¡ШШШМЕфш) (Vlíl)

143 157

137 157

gefrsrrnnlaalvobls>íro.c(ton) ■ (x) " 193 203

, dttgdrrkqeiiapek (м)

■ ко 153

ЦАт)ШШШШГРС(Аа.1 (хи)

- 140 ' 163

; pnbgggtsrrgplawqhlggktpb'mjl (xiii)

ш 153

Рис. 2. Аминокислотные последовательности синтезированных пептидов, содержащих фрагменты VP1 вируса ту?? Азия 1 № 48

Пептиды VI-X и X8-X?v помимо фрагментов иммунодоминант-ных участков VP! вируса ящура Азия- 1 № 43 (подчеркнут на Pfíc. 2), содержали не относяи'иеся к ук^заннъм фрагментам остатки аминокислот и-пальмлинсвса кислоты. Их вводили о целью усиления иммуногенности пептидов.

Пептиды V-XÍV были скчгезироеаны твердофазным методом Й ходе синтеза использовали слец-юшие производите Ne-Boc-три-

функциональных ' аминокислот: Arg(Mts), Arg(Tos), Asp(OBzi), ОДАоп), Gîu<OBzi}, His(Tos), LysM, Lys(Zj, Thr(Bzi), Tyr(B7l) и Ser(Bzi).

Реакцию конденсации проводили дзукратно, первоначально мзтодсм симметричных ангидридов, повторно - с использованием окоибензо триазоловых зфироа аминокислот. Полноту протекания реакции контролировали посредством нингидриновего или пикринсеого теста. При неполном протекании реакции проводили трать» конденсацию, -вводя в реакцию оксибгнзотри ■¿шюьыЯ эфир зашипенной аминокислоты, добиваясь присоегч-нения ост«'гК(- аминокислоты к е.мчногруппе пептмдилпогимера н?. глубину более 99%. Остатки BocAsn и 8ocG!n ссодили а релкцио первоначально б виде лара-нитрофснилосых эфиров. а оате,4 - окаИгэнзотриазоловых офиров. Для- предотвращения побочной реакции образования пироглутаминоьоя кислоты присоединение к остаткам Gîu • и G!n провопили с DMF, а не s СНоОг. После введет.« в пептидную цель остатка Ma! удаление Вос-груплы ' проносили в присутствии ДИМЗЛ'ЛСуЛЬфЩО (D.YÎS) со избежание смоления и алхилирогаиия атома серы. цикл

синтеза заканчивали ацилирозамем «enpopsan>po£22m амино-групр уксусным ангидридом, .

СесСгднкй пептид ! получали пшркреваиием над палладием защитен: юго пептида, растзсренмэго в смеси уксусной кислоты и'этанола (2:1), пептид J - обработкой .защищенного пептида "0% фтористым водородом в пир!¡лине с добмуккилм метэ -крезол?, до ко;:цечтр зции 6,25%.

Временные группы длл защиты бохо?ых фуиший пептидез П-XTî/ C-w.u ш5ракы с расч-.-юм ¡-:з кенечиог зебло^роезаи» рнотьорами 1рифтормйга1:зульфокислоты fTFMSA) разной концентрации в трифторуксуской кислоте (TEA). Свобода' целевые пептид»: W-V были получены из соответствующих защиценньк соединений в одну (¡тадию путем деблокирования их 1 M TFMSA и тиогш 301с: в TF^i, в присутствии мета-крезола. 9 данных условиях не

n

удалялась Tos-группа о остатка . поэтому Агд(То5)-содерж-''-uwe пептиды на стсрсй стадии обрабатывали смссь» ТШЗЛ-TFA-мета-крезол (1:9:1). По данной схеме деблокирования был.; , синтезирозамы сеобо/'ные пептмлы Vl-Vlil. Пептид* IX-X/V ■ поя^зли, ушяя защитны:: группы смесмо F-MSA - "¡FA • Df/S •мета-креоол (1:5:3:1) на первой станки и TFMSA - TFA - у.ега--/резол . (1:0:1) - на второй, Am-защитз сстаткоз ииетеина (пептиды V1-X. Xii-Xil') в описанных условиях деблокирования сохранялась.

Все целевые* пептюь; переосаэкдаш из реакционной смеси в дизтилоеом офйрс и очищали методой колоночной хроматографии. Чистоту пептидов подтверждали результатами ТСХ или ВЭЖХ. Состав пептидоз, определенней с помощью. аминокислотного зчамш. совпадал з бслмги:;отсе случаев с теоретическим. Количество Arg для содержащих остатки китроарпшна промежуточных защищенных пептидов было всегда мен&ше теоретического вследствие неполного отщепления- нитрегрупп г условие кислотного гидро-л-ш (Крисаоз В.Ф. и coasr. WO}.

Выход пептидоз 14V, синтезированных жидкофззньм методом, был в пределах от %% (пептид I) до 74% (пептид IV), В ргсчете на пгрсу» гмяь'сг^'.слзту кхед пелтаоз V-XJÜ. сичтезироеач-нок на хлсрметклирсй^км сопз.тимере стирола и пяпягилбензола, сострил от 7% (««пнц V5) м> X« (кшш XI!).' Шгкя euvea йэлярся о>№лене* liooühhöa реакции отщеплении растущей цепи от полтора в условиях ашюлиза So:- группы,. Нслольгоггннг РЛМ-полимера алп к'дтеза. пептида Ш позеоли;ю ¡ш/чить его с выходом 43"/» от теоретического. Лругая приема низкого кы-хода пептида? ■ \>-УУ - потери из-за неполного протыкания реакции г.сидгнс'ц»;-! сстатг.з .аминокисло',"ь< с петидилполимерсм. ' Высокимодехугяри&а фярода' пептида (Лс UÖ-tö-Gfysfe-lys?.

(!У) была показана методом михроколоночней гело-экскля-зиенкоя хроматограф»»« на биогеле Р-ЗО. Значение мояекуг рнои массы пептида, определеннее в ог^те, составило 13,6 кДа. Это

значение больше табличного (14,66 кДа). Возможно, структура пептида отличалась от структуры глобулярных белков, которые использовали для калибровки колонки. С помощью указанного метода определили молекулярную маму некоторых других пептидов и контролировали процесс конъюгации пептидов с белковыми носителями. Протекание реа;<ции конъюгировакий контролировали также методом обращенно-фазоБОй микроколоночной хроматографии.

22£.Аитетсстъ, ющноювюсп, протекттнаяианти- ; прусиаяактигяость фрагментов №1 вируса тура

Сцежу антггеяных свойств синтетических пептидос или кслъюгпоа проводили путем изучения их активности в реакциях с<- специфическими кроличьими имм^ноглобу.шами г^отив 1453 частиц вируса. Антмгеннпсть выражали в логарифмах величины обратного разведения пептида или коньюгата пептида с исходной концентрацией пептида 1 мг/ш при постояшам разведении иммуноглобулина 1:5003. Как видно из таблиц 1, 2 и 3 пептиды обнаруживали заметные антигенные свойства, причем антигенность А^-пептидов была значительна еьшге шттешости пептидоз специфичности УР1вируса ящура Азия 1 № 48.

^бзуьтаты определеюя протехтивиой актиености пептидов в опытах на морских свинках, попали, что двукратное введение конъюгарованного . с гемоцианжом уу.ш (ЯН) УРН145-1'5}-лептид1 вируса ящура Н? 350 в 'дезе 170 мкг зОесчечивало залиту 3 из 4 животных. Протективуаь активность пег.-идоа 142-151, 142-135 и 133-155 и их конъюга-точ была низкой даже ярн ведении больших доз пептида: 200-400 мкг (табл, 1).

Поеденные на кроликах испытания иммукогекных ссойстз Фрагментов основной ан7игенно;г детерминанты вируса ящура Д;2 № 550 показали, что к-нъюгированные с (»елками пептиды индуци-\

Таблица!

Антигенная и прстективная активность фрагментов \/Р1 вируса ящура А22 № 550

Антиген Антигенность в Протективный

РИА, к? эффект*

145-155 3,73 н.о.

• 1',5-155-КШ .. 4,39 3/4

142-151 3,47 1/5

142-151-КШ 4,08 1/5

142-155 , : 4,80 1-5

142-155-В8А и.о. 0«

138-155 3,91 1/5

136-15б-КШ и.о. 05

н,о, не определяли

* ; В числителе указано число морских свинок, у которых не обнаружены признаки генерализованного поражения, в знаменателе - число зараженных живот.1»«.

Таблица 2.

Антигенная и иммуногенноЯ ахтиэность пептидов специфичности УР1 вируса ящура Азия 1Н» 48

Антиген Антигек-

НСС'Ь Им.чуногеияость

в РИА, !д

Титры БНА,* Протест,¿шя

!сд2г!Д.г<уО,1мп оФфект

140-1530/ 5(АС.Т|) Л/) Г 3,00-4,17 5?10

2,32 <1ДН,17 ЙО

|32-153-Суз(Асгп) ■ ' 2,32 <1,00-3,® ' Ш

143-)57-Су${Аса)) 2.60 <1,00 Ж

137-157-€^{%т) 2.80 <1,00 • . 05

133-203 2.32 <1,00 05

* Лоза вируса 100 ШД50.

14 , ,

ровали образование вируснейгрзяизущу« антител (ВНА) б -больших тмтргх,т-1£мсвободные nenniusi.

• В испытаниях на морских свинка--' нами не обнаружено уси- ч лення иммуиогенностм пептидов 142-151, 145-155 и 136-155 за счет коиъюгироваяил с белками. Данный факт ссгла-' суется с имеющимися в литературе сообщениями о том, что вселение ' дополнительных Т-зпитопов белка-носителя усиливает ентипептидный ответ кроликов, ко не морских сви-;_ кок (Сурово-'? Л.Ю, и сопзт. Ш).' Отсутствие 100% прсгек-тиеной активности препаратов, приготозлгккьк на основе он ¡¡тезированных нами фрагментов VP1 вируса ящура А22 № 550 можно объяснить тем, что указанные пептиды не БОСПрСИЗБОДЯТ П0ЛН0ЦС:~М)К олл морских свинок В- и Т-опито-поь (Гелгфаноз В.М, и соат.ШЛ).

Изучение иммукогекной шс.вности свободных фрагментов ' антигенных детерминант VP1 вируса ящура Азия 1 № 48 (табл. 2) показало, что пептиды 143-153-Cyî(Acnr) й 136-153-CysíAcro) проявили примерно одонакоаую иммуногенность и по протектиэной активности заметно превосходили более длинный синтетический антиген î32-t5KVs(Acm). ' Возможно, информация' перськ. дзук пептидов точнее с.'ответстьогапа кашкой. Пептид М'с/тцо-угтьшыту, 140-153 О, $(Аст) Own выбрвч в квчестье проютигв дпя созданий us его основе более йцтивикх искусственных имк/псгсчог, Согласно онуЗликсзамым ткным, иукчение в солтпв neiлилов остатков Цлстажа (Ffwtti» MJ. ел. 1S87), пйлжтиоеой кислоты (Иваиое Б.Б. к. ссчют, 133Î), '"создание ИСКОМ - иммуностимулирующих комплексов (Lovgren К. ел 1988) и синтез пепгкаов • на . лизшггей матрице (Tam ,J. .ШЗ) в&одтив с: особами «специфической стллу-

nsuiw антйедшчого owe к. Результаты испытаний сьоиаь аналогов VPl-(14l«-153)- ..пептида. .. виру-. ей «щура Азия 1 ít прсаст«\сяекм б таблице 3.

Таблица 3.

Аитигеняость и имм/нсгенная активность модифицированных

^Антиген Антиген-ность в РИА. ¡д Иммуксгеинсль

Титры ВНА, !од2НД5О;0,'1мл Протективный эффект

Суз(Аст)-140-133--Р102-Суз(Аэт} 2.00 3.00 1/5

Ра!т-С1уз140-153--&у2-1у?(Ра!т!-1£и 2.95 <1.00 да ?У5

ИС;(0М-Ра!т-€1уз--140-153^1у2-4.уз;Рагп)-1.еи и.о. 3,50 ъъ

(Ас-!40-15:ЧЭДу | 3,00 4/50-8,33й !

4 В качестве адь»с£чта кспельеоЕали чап-зкин, сруш гуьглраты сссср;хаг,;« адьзсгаат Фршша.

* Лоза вируса КЮТЦЛ50,8 остальных случаях - ЮТЦЛз,.

' • Наиболее актизиам. иммуиогеном оказалась. ¡'чспзтружп. ссстстаая из грех уреышя сстатш лизина и с

чср«> тршмишшй спейсер посьмй мо/к.кул псслол:-::-

ть*Я;)!?ссги. 140-Ш \>Р1 еяруса ищура. Азия I К* 43 (рис. С}. Зг-иы;. мереккх свинок, о г Я1.'.';ра шпаяьмитоилиреБакььй пепш Ои-гсп:-чивал с составе, препаратоз, содержащих сапсшн а • адишанха, либо з качестве сферической ячаисусй (как устзпсг-лено методом электронной микроскопии) матрицы ИСКОМ, в сочен-

16' нии с адыовантомфрернда пептид оказался.неахтивнъгм. ; ••

Тот же пептид & тетании с сапонином стимул^фовал защиту от заболевания 4 из 5 животных, но: при этом вирус--нейтрализующие антитела в сыворотке крови' об^аружемл не были. В данном случае удалось повысить протектибнуг активность пептида за счет неспецифической стш^ляшм иммуногенеза, оказываемой сагхшюм. Несоответствие результатов реакции нейтрализации in vito и испытании лротективнои активности в опытах на жив othwx V; о кно объяснить разным механизмом нейтрализации вируса In. v&o и Iri vivo (Суровой AJO. и соавт. 1939, Гельфанов ВМ.. и ссавт.,1991). Важно отметить, что у всех морских овинок контрольной группы, которым вводили сапонин без шпальмитсилирозанного пептида, после за-раже:ш гомологмчш5м е.фуленткым вирусом Оьши обнаружены признаки генерашзованного поражеьйя. \

Иммуногенная и протекжзнзя' актиеность пептида 140-153--Cys(Acm) и его модифицированных аналогов позволила предположить, что участок 140-153 швочает,.специфичные для морских свинок эпитопы, функционально важные для индукции: иммунного стерта. Для проверки предположения изучали методом "РИА актив:.! »ость ентипептидаьос сьвороток в реакциях с вирусом и пептидами 140-153<№т) и 137-157-Cys(/V<ri) (табл. 4).

Поскольку антитела против О^агментов основной антиген ной детерминанты реагировали практически одинаково с пептидами 140-153-Cys(Acm) и í37-157-Cys(Acn¡), можга заключить, что учзс-. ток 140-153 включает е себя В-огсшт. Приняв во внимание высокую активность антилептидных сывороток в реакциях сгомоложчным вирусом, мы сделали вывод о оуш.егтвовании Г-эпитопой в состав фрагмента 140-153. Таким образом, наличие специфичных для морских свинок В- и. Т-опитопо8 в последовательности 140-153 огуелсвяиеает иммуногенную и протекгивну» активность пелкща 14Q-153-Cys(A«ii) и ^екоторьх его модифицированных аналогов

Ac-140-153-Gly-Gly-«jr

I

Ac-140- i.53-Gly-<51y-<Jly Its—31г-<НТ'"1у-153-Н0-Ас

• I : 1

Xc-M-153-Giy-Glj-Glj-Ljs—Ljs

!

Ijj—lys-Oly-OH I

Ac-140-ISC-31у-Gly-Gly-Lya—Ija

t I

te-l';0-153-Gl7-Glr-eir LT«—01у-01у-51у-15М4!>-Ае I

Ae-140-lb2-Gly-Gl)-Cly

Рис. 3. Структура пептида (Ac-140-153-Giy3)a-ly$rG!y

Таблица 4

Активность антипептидаыхсьторогок и реакции с пептидами NO-153-CysCAcm), 137-157-Су^(Лст) и вирусом ащура Мил 1 jfc 43'

Антипептидчые Активность с антигенами, k?

' сыворотки 140-153- 137-157- гсмолегмтал

-Cvs(Aari) -C/sfAcm) bi ipyc

140-153-0/ :(АГ1) 3.14-3.35 3,14-4,15 . ; 2.75-3,19

133-153-Cys(Acrr.) .73-3.13 з,i3-n.es • 2.7M.18

132-;53-Cys(Aan) 2.20-2,79 3,1«,35 2.20-2,73

143-157-C/s(Acm} 2,79-3,14 3,19-4.21 . 2,00-2,20

137-157-Cys(Acm) 2.7Э-3.65 3,65-4,21 2,00-2,20

Из таблиц 2 и 3 вилчо, .что протектисньй аффект, оказываемый пептидами специфичности VP1. вируса ящура Азия 1 II 43, не превышал 80/Ó,даже при наличии в сыворотках крови еирус-неятрализующих антител в титрах от 2,00 до 5,00 localis У0,1м.1. Согласно литературным сообщениям (Гельфанов B.N;. и соавт. 1991, Павлов A.B. и соавт. 1991), 80-100% защита морских свинок при заражении вирусом í.uiypa А22 № 550 была обеспечена : при нали'ии в крови такого же пи даже меньшего количеотвз антител, индуцирование пептидами А^-специфичности. Установленные для пептидов отличия согласуются с межтиповыми отличиями, характерными для микшированных вакцин тех же т.гпоз (Ефимов Н.И. и сзавт. 198?, Шияилоз В.И. и соавт. 1S32).

В опытах по определению ингибирумщеи актиьносп1 пептидов в отношении репродукции вируса ящура Ач? № 550 в первичной культуре кдегок было показано, что пептиаы 140-153 Cys(Ac¡n;, ik-153-Cys(Aom), Paim-Giy3-140-153-Gly2-Ly5(Fvii!n)4.eij и Cys(Acm)--V,0-153 Pt&i.-Cys(Acm) с концентрациях от 0,01 до 0,40 мг/мл слзОо ингибиросали репроя/киио вируса: снижение титра вируса кг превышало 1,43 1дьОЕЛш. Анал,гичиый показатель для фрагментов ангигеннои детерминанты VP1 вируса «щур;. А%> № 550 бып еьаье (Püöökoe -С.С. и соавт. 1991). Оптированный нами \/Р1-{1СМ?8}-пелтид вируса ящура tfc 550 обеспечил снижение тигра вируса на <1¿H ¡сЬОЬ'мл, а №Ц193-208)-пептид снруса ящура Азия. 1ïtiô-на 3,Я1!с1БОБ^л. •

Доза пептида, выбранная дя? обработки культуры клеток, была в каждом отдела' ом случае индашуагьш и определялась значением максимально переносили концентрацией пгг. >ша, которая бУлау:тшювпе.4аопытньк путем. .

T¿ким образом, в результате проведенных исследований показано. чго синтезированные пептиды представляют собой индийи-

дуальнне химические соединения с разной активное гью в серологических, иммукохимических реакциях и в реакции нейтрализации вируса шура ¡п им? либо ю то.

3. ВЫВОДЫ

1. В результате компьютерного анализа антигенной структуры \/Р1 вируса ящура Аи № оЬО и Азия 1 № <Ш по унциальные антигенные детерминанты локализованы на участке аминокислотной последовательности 130-160 и С-концееон области белка. Разработаны схемы синтеза и пэлучеио 14 целевых пептидов, содержащих фрагменты имунодомииштых участков №1.

2. Изучена антигенная актиемость синтезированных пептида;'с РИД и 1/|ФА. Полученные результаты позволили отобрать лептиш, на со ноге которых приготовлено 27 препаратов ш.з испытания на лабораторных животных

3. Проведено сравнительное изучение иммуногек^сй .1ШШ1юсти свободных . пептидов и поттипэз, юиыопфоваи&к с белками-носителем. ¡'пиогати кнауциросаш у цюяихсо Солее сильный иммунный ответ. Иммунный ответ морских сбит усиливался о случай ев?аист гшедтлико^иснок комплгэдон ияч пеппш, косалептнс сепзсшсго с лигюю:ой матрицей.

4. ' Дзукратиая иммунизация. морских' ейнох

гатом УРЦ14:''-1Г5)-пептилл вируса ящура А22 & 550,1 «итн.амч

гг.ецИзи^&оти Ч'Р { еиру&а пцурл А?:-"! '1 43 обеоп-з'^иаг?. ОйОШГ/75-30% ЖОТ!!1..Н Пр!' МраКЙКИ ГОМОЛОГИ'!ЧЬ!М Г.фуссм.

. о. *' Апаш результатов определения антигенной, им?.г;-ногенной ' и . протешыюй активности • Пектинов, содержащих фрагмент последовательности. 140-153 V?! вируса ;'щура

Азия 1 № 48 показа п , что данная последовательности содер- • жгла специфичнме для морских свинок В- и Г-зпитопы.

, 6. ' Проведено сравнение иммунобиологических свойств пептидов - фрагментов VP1 вируса ящура Азия- 1 N 48 и А™" fi. 550. Иммуногенные пептиды специфичности VP1 вируса «щура Азия. 1 № 48 показали меньшую антигенную, прогективную и вирусостатичекую активность по сравнению с А^пе чтидами.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Комплекс методов, с помощью которых были синтезированы фрагменты VP1 вируса ящура № 550 и Азия 1 № 48, применим для синтеза пептидов, вклюиющих фрагменты иммунс генного поли-пгпгида различных им аммоы других типоэ вируса ящура. В лабораторной практике определения молекулярной массы и состава ис-кусстееннь»: антигенов можно использовать методические приемь: аналитической микроколоночкой хроматографии, отработанные в xoie выполнения нашего исследования. Полученные результаты изучения антигенных, иммуногенных и про ектиеных сеойств пептидов в свободной фооме ч в сос "а~е комплексов могут быть исдользоганы в работе по оозданию безопасных иммуногенных препаратов. Ланные о различной иммуногенмости и иротективной активности синтетических пептидов специфичности разнлх типов вирус* ящура необходимо учитывать при разработке. пептидных яротивзкцурных вакцин. Некоторые результаты исследования были вкглчены .в описания двух изобретении, а также во "Временную инструкцию по изготовлению и контролю эксперимента льньк образцов синтетической протизояшурнэа вакцины,"-утвержденную дирторм института.

5.СПИССК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАЛ,-1ЫХ ПО ТЕМЕ ЛWCCEPTAUl'T/

1. Пазлов A.B., ПетроЕ В.Н., Хапаева Л.Д., Челургин A.B., Кожаеса Г.И., Холил ЮА, Переаоотикос 5Л., Рь:бг,ксс С.С., Ивтнющенков В.Н., о\ рдов А.Н. Сшез и изучении соойств пепжца с послеоовательи -лыо аминокислот Но-155 VPÍ вируса ящура А22 /'Акт/а .-и, пробл. вет. вирусол.: Тес. докл. науч). чонф. /ВНУКИ - Владимир, 1937. Ч.1.С.75-76.

2. Сиюкова ОН, Луговссой A.A., Петров В.Н„ Рыбаков С,С., Чепурш A.B., йеаиющенков В.Н. Изучение зооможности использования радиоиммуноанализа (РИА) для характеристик синтетических пептидов и антись.вороток к ним /Актуален, пробл. вет. вирусов: Тез докл научн. конф. /ВНИЯИ -Владимир, 1988. Ч.1.С.19-20.

3. Петров В.Н., Луговской АА, Павлов В.М., Рыбаков С.С., Иалнющенков В.Н. Контроль конъюгирования синтетических пептидов с белком-носителем методом высокоэффективной жидкостной х^тт0графии//Актуальн. пробл. вет. виру-сол.: "ез. докл. научи, конф,/ВН'ИЯИ - Владимир, 1£<Й.Ч.1 .С.24-25.

4. Петров 8.Н., Рыбаков С.С., Чепурш А.8.. Гулеккин В.М., Ивашцегков В,Н„ Кожаева Г.И., Лрдский М.М., Базарове) С .К. Антигенные сзогхтса и и.мцтеген'.тя активность синтетических , пгг.тидоа сируса ' ящура Азия 1 ЛВсесоюз. ■ екмп.

'' по химии пептидов; Тездокл.-Рига,1990. С. 43.

5. Чепуркин A.B., .Павлов A.B., Петреj В.Н., Мудрак. Н.С., Лядский 'М.М.; Рыбаков G.G., Йванющенкоз В.Н., Ирпгалга H.H.,. Бураов А,Н.» Антигенная ч. ■ иммуногемш активность синтетических мультимерных пептидов вируса ящура А22 //Всесош. симп. по химии пептидов:. Тез. дскл. - Pvra, 1890. С. 87.

Д Петров В.Н., Рубеков С.С.,. Луговской АА Иванющенков'. В.Н., Перевозчиков ВА, Мудрак Н.С., Быкова Т.Н.

• Получение и характеристика иммуностимулирующих комплексов,, содержащих синтетический пептяд вируса 'ящур! //Актуален. ■ сопр.. вет. вирусол.: Тез. докл. научно-теоретич. конф. молодых ученых, ноябрь 1990 г. - Владимир, 1990. 3.4-5.

7. Базаров МА, Конюшкина Т.Б., Петров ВЯ, Пузанкова О.С., Атаев ЭК, Мищенко ВА Влияние кэчества глутаро— • вого альдегида на активность юшюгатов антител с беталакта-мазои //Актуальн. сопр. вет. вирусол.: Тез. докл. каучно -теоретич. юнф. молодых ученых, ноябрь 1930 г. - Владимир, 1990. С.23-24. .

8. Петрова О.Н., Рыбаков С.С., Луговской АЛ., Петров. В.Н., Иеан!01ченк08 В.Н. Изучение антигенных свойств синтетических пептидов методом радиоиимуноанализа (РИЛ) //А'.туальн. вопр. еет. вирусол.: Тез. до<л. научно -теоретич. конф. молодых ученых, ноябрь 1990 г. - Владимир, 1Ш С.23-24.

9. Павлов А.В., Рыбаков С.С., Иватаценздэ В.Н., Чепуркпк А.В., Бурдов А.Н., Дрягалин Н.Н., Петров В.Н., Холин ЮА Пспгпд для защиты жтотхх от вируса яшура £¡22 Зиязка на изобретение II 4727257/13 ('СГ2Й9). Дата подачи 07.03.83. Пс ложи тельное решение ЗНИИГПЭ о»28.09.80.

10. Павлов А.В., Рысаков С.С.. Иванющенков ВД, Чепуркин А.В., Петров В.Н., Дрягалин ПЛ., Бурдоз А.Н. :;ащита ст яшура гстествеино-ЕосприкмчиБых ;.;иьотнлх линейным полимером синтетического пептида //ьиоорган. химия, 1331. Т.17, К7. С.953-963, - •

11. Луговской АА. Рыбаков С.С., Чепуркин Л£., Петров В.Н., Лйдскии М.М., Имнюштнксв В.Ч., Дрягалин НИ., Бурдов АЯ Пептид для защиты животных от вируса ящура А.^

на изобретение № 501-Ш13 (077643). Датг. подати 27.Г..31. Положительное реш< ние ВЮТПЭ от 30.03.92.

12 Павлов А.8., Луговсксй A.A., Петров 8.Н., Рыбаков G.G.. Иванющенхов В.Н., Зурдсв А.Н., Холил ЮА Синтез и изучение антигенных свойств пептидов-фрагментов VP1 вируса ящура типов А, О и Азия-Í //К новой стратегии борьбы с ящуром' Между:; пр. конф. - Владим- »р, 1991. С. 93.

13. Рыбаков С.С., Беляева Н.В., Пронин ИА, Павлов A.B., Л/ггвской АА, Петров В.Н. Ингибиция репродукции вируса ящура синтетическими пептидами />К новой стратегии борьбы с ящуром: Междупар. конф. - Владимир, 1991. С. 119-121

14. Петров В.Н., Рыбг.кос С.С.. Пас лов A.B. Лугозсхой АА, Чепуркин A.B., Петрова О.Н.. Лядский М.М., Дрягагин H.H., Кожаива Г.И., Холин :ОА, Савелоев В.Ю., Иванющенков ВН., Бурдов А.Н. Сичтез и изучение анткгешмх и иммуногеннкх ссзйств пептидов - фрагментов VP1 вируса ящура типов О, А и Азия-1 //Ящур (К новой стратегии борьбы с ящуром). -Владимир, 1992. Ч. 2. С. 77-93

15. Петров В.Н., Петрова О.Н., Кожаев-з Г.И., Рыбаков С.С., Чгпурхин A.B., Лядския М.М. Локализация фут атональных эпитопоз в структуре антигенной детерминанты белка VP1 вируса ящура Азия-1 //Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и спиьоотолсгии: Материалы научн. шЛеренш' /ВНЖЕ?Ви.М, - Покров, 1992. Ч. 1, С. 181-182.

16. ' Дудников А.И., Толокнов A.C., Рыбаков С,С., Шоршнев

8.И, Прохоров С,В., Петров В.Н., Михалишин В.В. Распределение различных • антигенов • вируса -ящура Азия-1" .в организме морских.' свинок /Жслопь- ■ физ. ;; биол. фак.ороз в вет. и жньотновод.: Матер. Всесоюз, науч. конф.,.; Витебск, 1Í-12- сш., 1S91. М. 1992. - C.44-Í5.

17. Лугоьскоя.. АА, ; Рыбаков G.G., Msaibuis^cs В,iL, Чш/ркии • A.B.,' Петров OK, Ляжсий М.М., . Др»гал/,н

■ НИ.,. Ьурдоз А.Н, Защита естсствешо-еосприимчибых животных от ящура пептидом, синтезированным из лизинсвои матрице.//Биоорган. химия. 193?. Т. 18. №7, С, 942-950.

ЛЛ. // /№?

J-