Получение рекомбинантных антигенов вируса ящура О/Тайвань/99, перспективных для разработки противоящурных вакцин, с использованием бактерий и растений

Андрианова, Екатерина Павловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение рекомбинантных антигенов вируса ящура О/Тайвань/99, перспективных для разработки противоящурных вакцин, с использованием бактерий и растений
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантных антигенов вируса ящура О/Тайвань/99, перспективных для разработки противоящурных вакцин, с использованием бактерий и растений"

На правах рукописи

АНДРИАНОВА Екатерина Павловна

Получение рекомбинантных антигенов вируса ящура О/Тайвань/99, перспективных для разработки противоящурных вакцин, с использованием бактерий и растений

Специальность: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 ДЕК 2012

Москва-2012

005047476

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии и в группе молекулярной биологии вирусов растений федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра «Биоинженерия» РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук Эльдаров Михаил Анатольевич

Официальные оппоненты:

Соколова Надеища Львовна - доктор биологических наук, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко», заместитель директора по инновационной деятельности.

Розанов Михаил Николаевич - кандидат биологических наук, ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова», Министерства здравоохранения РФ, доцент кафедры биологии.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова».

Защита состоится «» делс-сьЯ^А- 2012 г. в ч. на заседании дис-

сертационного совета Д.220. 042 .01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел. (495) 37793-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

2012 года и размещен на сайте

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Грязнева Т.Н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Начиная с двадцатого столетия животноводство многих экономически развитых стран мира несет большие убытки от эпидемических вспышек ящура. Недавние инфекционные вспышки ящура в Тайване (1997) и Великобритании (2001) существенно усилили обеспокоенность производителей и потребителей мяса сельскохозяйственных животных во многих странах мира. Основным способом контроля возникновения вспышек заболевания ящуром в настоящее время является вакцинация сельскохозяйственных животных вакцинами на основе инактивированного вируса. Несмотря на то, что иммунизация препаратами инактивированного вируса достаточно эффективна, такие вакцины имеют ряд существенных недостатков. Наиболее серьезные из них - проблемы безопасности, связанные с возможной утечкой не полностью инактивированного вируса, а также сложность достоверного диагностического различия вакцинированного животного от заболевшего, необходимость использования специальных лабораторий для их получения и недостаточно высокая скорость получения в условиях возникновения очага заболевания.

В связи с этими недостатками предпринимаются попытки разработать альтернативные вакцины против вируса ящура. В настоящее время разрабатываются методы использования в качестве вакцины фрагментов структурных и неструктурных белков вируса, например структурного белка VP1 или пустых вирусных капсидов, ослабленных вирусов, например с делецией участка капсид-ного белка VP1 или протеиназы Lpro. Такие вакцины не имеют некоторых недостатков традиционных вакцин, однако на сегодняшний день они менее эффективны по сравнению с вакцинами, созданными на основе инактивированного вируса. Поэтому задача получения альтернативной вакцины против ящура остается актуальной.

сутствия у растений и животных общих патогенов. Рекомбинантные белки в растениях могут быть получены двумя методами: с помощью генетической трансформации или транзиентной экспрессии с помощью вирусных векторов. Создание трансгенного растения, а значит и получение белка из него, требует значительных временных затрат. Уровень экспрессии целевых белков трансгенными растениями обычно низок, что определяет высокую стоимость продукта вследствие сложности его очистки. Получение белка с использованием фитовирусной системы транзиентной экспрессии в растениях имеет ряд преимуществ; в первую очередь более высокий уровень экспрессии, биобезопасность и короткое время, необходимое для создания и тестирования экспресси-онной системы.

Настоящая работа посвящена получению вакцинных белков вируса ящура, способных индуцировать иммунитет против заболевания ящуром у лабораторных животных, и разработке систем экспрессии этих белков в бактериях и растениях.

Цель и задачи исследований.

Целью работы является конструирование рекомбинантных вакцинных белков вируса ящура и разработка систем их экспрессии в бактериях и растениях.

Для этого в работе решались следующие задачи:

1. Создание систем транзиентной экспрессии предшественника капсидных белков Р1 и ЗС-протеазы или отдельных капсидных белков вируса ящура (изо-лята О/Тайвань/99) в клетках растений Nicotiana benthamiana с помощью фито-вирусных векторов;

2. Конструирование рекомбинантного гена, кодирующего искусственный белок НРЕ, содержащий набор иммуногенных В- и Т-клеточных эпитопов вируса ящура О-серотипа

3. Создание систем экспрессии белка НРЕ в клетках Escherichia coli и в растениях Nicotiana benthamiana',

4. Проверка иммуногенных свойств выделенных из клеток бактерий и растений препаратов белка НРЕ на лабораторных животных.

Научная новизна.

Впервые получен рекомбинантный вакцинный белок, содержащий комбина-

цию В- и Т-клеточных эпитопов вируса ящура в составе одной полипептидной цепи. Разработаны методы конструирования и получения такого полиэпитопно-го белка НРБ, состоящего из фрагментов структурных (УР1, УР4) и неструктурных (2С, ЗЭ) белков вируса ящура изолята О/Тайвань/99, в бактериальной системе экспрессии, а также методы его выделения и очистки.

Разработаны методы получения высокоочищенных препаратов белка НРБ из растений Ы.ЪеШкатгапа в количествах, достаточных для проведения биологических испытаний.

Высокая иммуногенность белка НРБ, его способность обеспечивать полную защиту лабораторных животных от инфекции вирусом ящура серотипа О, определяют перспективность использования белка НРБ в качестве основы для разработки рекомбинантных противоящурных вакцин.

Научная новизна подтверждена положительным решением о выдаче патента Российской Федерации.

Практическая значимость работы.

Разработанные методы конструирования и получения вакцинного белка НРБ могут быть использованы для создания новых недорогих эффективных рекомбинантных противоящурных вакцин. Показано, что такой вакцинный белок можно получать на достаточно высоком уровне в различных гетерологичных системах. По мере изучения антигенных сайтов вируса возможно включение эпитопов, находящихся в этих сайтах, в последовательность полиэпитопного белка. Такой подход к созданию полиэпитопного белка, предполагающий соединение наиболее иммуногенных эпитопов в составе одной полипептидной цепи, может быть использован для разработки подходов к созданию противоящурных вакцин против других серотипов вируса, других вирусных инфекционных патогенов человека и животных.

Личный вклад соискателя заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация результатов диссертации.

Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих

международных и российских конференциях: Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва - Пущино, 2009), 16-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2012), конференции «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород, 2009).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, входящем в перечень ВАК. Получен 1 патент на изобретение РФ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста и включают 25 рисунков и 3 таблицы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Цель и задачи работы", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список публикаций по теме диссертации", "Список цитируемой литературы", который содержит 1 отечественный и 217 иностранных источника.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Изучена возможность получения пустых капсидов и отдельных капсид-ных белков VP0, VP1 и VP3 вируса ящура серотипа О в растениях N. benthamiana.

2. Сконструирован ген, кодирующий последовательность рекомбинантного белка НРЕ, содержащего набор В- и Т-клеточных эпитопов капсидных белков VP1, VP4, 2С и 3D вируса ящура изолята О/Тайвань/99.

3. Созданы системы экспрессии и очистки рекомбинантного белка НРЕ из клеток бактерий Е. coli и растений N. benthamiana, позволяющие получать белок, в количествах достаточных для иммунологических испытаний.

4. Полученный рекомбинантный белок НРЕ обладает высокой иммуноген-ностью и способен индуцировать протективный иммунный ответ, обеспечивающий полную защиту лабораторных животных от инфекции вирусом ящура О/Тайвань/99.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии и в группе моле-

кулярной биологии вирусов растений Федерального Государственного Бюджетного Учреждения науки Центра «Биоинженерия» РАН в период с 2009 по 2012 гг.

Эксперименты по определению иммунологических характеристик препаратов очищенных белков были выполнены в Федеральном Центре Охраны Здоровья Животных (ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир).

Все манипуляции с ДНК - субклонирование в плазмидные вектора, ПЦР-амплификацию, выделение плазмидной ДНК из клеток, электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле, обработку ДНК эндонуклеазами рестрикции, лигирование фрагментов ДНК и т.п. проводили согласно общепринятым методикам (Sambrook, 1989).

Приготовление белковых образцов и электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле проводили по стандартному методу (Sambrook, 1989). Для получения компетентных клеток A. tumefaciens и их трансформации использовали стандартную методику (Sambrook, 1989).

Для оценки достоверности полученных результатов иммунизации использовали биноминальный тест с уровнем значимости (а) равным 0,005.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Одним из перспективных подходов к созданию альтернативных вакцин против ящура является получение пустых вирусных капсидов - ВПЧ. Иммуноло-гически такие частицы идентичны полноценным вирионам, поскольку пустые капсиды содержат полный набор поверхностных антигенов вируса (Rweyemamu et al., 1979). Также известно, что индивидуальные капсидные белки вируса ящура могут формировать пустые капсиды или капсидные интермедиа™ (пентамеры) in vitro (Grubman et al., 1985). Поэтому задачей первого этапа пашей работы по получению вакцинных белков вируса ящура, было получение пустых капсидов ящура в растениях N. benthamiana методом тран-зиентной экспрессии. Для получения ВПЧ ящура необходимо было экспресси-ровать участки генома вируса, ответственные за синтез, протеолиз и сборку капсида: последовательности, кодирующие белок-предшественник структурных белков Р1 с автокаталитическим пептидом 2А и вирусную протеазу ЗСрго.

1. Изучение возможности получения пустых капсидов вируса ящура в растениях.

Для получения предшественника капсидных белков была создана конструкция на основе бинарного вектора pA7248AMV, полученного на основе X вируса картофеля (ХВК) (Марданова и др., 2009), кодирующая последовательности предшественника капсидных белков Р1 и автокаталитического пептида 2А вируса ящура изолята О/Тайвань/99. Для визуальной оценки количества зараженных клеток и локализации предшественника Р1-2А в клетках растений соответствующая ему последовательность была слита с геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белок (GFP) Zoanthus sp. (конструкция pA7248AMVPluGFP, рис. 1). Для оценки уровня экспресии предшественника в качестве контроля использовали конструкцию pCCauGFP, экспрессирующую свободный GFP.

В областях листьев растений, инокулированных смесью суспензий агробак-терий, трансформированных плазмидами pA7248AMVPluGFP и полученной ранее в нашей лаборатории конструкцией рССар24, кодирующей супрессор РНК-сайленсинга р24 вируса ассоциированного с скручиванием листьев винограда 2 (GLRaV-2), с помощью флуоресцентной микроскопии можно было видеть, что количество зараженных клеток лишь незначительно ниже количества клеток, экспрессирующих свободный GFP. Однако, в отличие от свободного белка GFP, GFP, слитый с предшественником Р1-2А, в большей части клеток накапливался в виде телец включений, что могло свидетельствовать о его нерастворимости. Вестерн-блот анализ суммарных белковых экстрактов агрои-нокулированных листьев растений выявил наличие «шлейфа» (рис. 2), что могло являться свидетельством экспрессии предшественника Р1 с пептидом 2А, слитого с GFP в растениях в нерастворимом виде.

LB " RB

I W репликаза - РИА I uGFP - З'-NTR ■ I

35S 1 I NosT

AMV leader линкер

Рис. 1. Схема конструкции pA7248AMVPluGFP

Для процессинга предшественника PI с образованием отдельных капсидных белков VP1, VP0 и VP3 необходима вирусная протеаза ЗСрго. С целью коэкс-прессии предшественника PI-2А (конструкция pA7248AMVPluGFP) и протеа-зы в растениях была получена конструкция pA7248AMV3CintR, кодирующая синтетический ген протеазы с встроенным интроном гена ADK1 (Adenosine kinase 1) из Arabidopsis thaliana. Такой подход позволяет преодолевать возможную токсичность критической экспрессии гена ЗСрго на клетки A.tumefaciens и Е. coli.

При коэкспрессии предшественника Р1-2А, слитого с GFP, и протеазы ЗСрго уровень экспрессии предшественника (при оценке экспрессии по уровню накопления GFP с помощью флуоресцентной микроскопии) был существенно ниже, чем при экспрессии предшественника без протеазы - были обнаружены лишь одиночные флуоресцирующие клетки. Также на листьях в местах инокуляции уже на третий день появлялись видимые некрозы, а на шестой день некротизи-ровалась большая часть клеток (более 90%), что можно было видеть по специфической желто-зеленой флуоресценции, характерной для мертвых клеток. На вестерн-блоттинге с образцами листьев, в которых были экспрессированы предшественник и протеаза, сигнала, соответствующего индивидуальным кап-сидным белкам, выявить не удалось. Таким образом, свободная ЗС протеаза, видимо, довольно токсична для растений, что может являться причиной пониженного уровня экспрессии предшественника.

Рис. 2. Вестерн-блоттинг образцов нерастворимых белков, полученных из листьев, экс-прессирующих белок PluGFP.

Сыворотка против белка VP0; 1 - Маркер молекулярного веса; 2 - препарат инактивированно-го вируса ящура; 3, 4 - образцы белков ткани листа, полученные путем фракционирования листового материала с применением 8М мочевины, из зоны, агроинокулированной культурой клеток С58С1/рССар24 (отрицательный контроль) и С58С1 /рА7248AMVP1 uGFP и С58С1/рССар24, соответственно;

120 кДа

86 кДа

47 кДа

34 кДа

26 кДа

20 кДа

12 3 4

Таким образом, для того, чтобы произошла сборка капсидов вируса ящура необходимо экспрессировать в одной клетке отдельные капсидные белки вируса УРО, УР1 и УРЗ. Однако, единовременная экспрессия нескольких белков с помощью векторов на основе ХВК, часто ведет к потере целевых генов, что является причиной очень низкого уровня накопления белков. Поэтому для экспрессии в растениях отдельных капсидных белков вируса ящура с автокаталитическим пептидом 2А или без него была использована векторная конструкция на основе генома вируса тристецы цитрусовых (ВТЦ) - рССаС<Ж1иСРР, позволяющая экспрессировать множественные гены даже под последовательностями идентичных промоторов (РоНтопоу е/ а1., 2007).

Для экспрессии индивидуальных капсидных белков вируса ящура в клетках растений на основе клостеровирусной плазмиды были получены две конструкции (рССаСс!ЗСР2аиОРР и рССаСёЗСРиОРР), кодирующие последовательности капсидных белков вируса ящура под контролем индивидуальных субгеномных промоторов мажорного капсидного белка ВТЦ с автокаталитическим пептидом 2А и без него. Для визуальной оценки количества зараженных клеток в листьях растений в конструкции была включена последовательность, кодирующая белок ОБР, с субгеномным промотором капсидного белка ВЖС.

В областях листьев, инокулированных суспензией агробактерий, трансформированных плазмидами, кодирующими отдельные капсидные белки, и плаз-мидой кодирующей супрессор РНК сайленсинга р24 на четвертый день после агроинокуляции можно было наблюдать экспрессию свободного ОБР. Однако, на вестерн-блоттинге в растворимых фракциях образцов листьев, проинокули-рованных смесями агробактерий, трансформированных клостеровирусными конструкциями, кодирующими капсидные белки ящура, удалось детектировать только белок УРО, что могло означать, что белок УРО экспрессировался в растениях в растворимом виде. Отсутствие сигнала, соответствующего белкам УР1 и УРЗ, могло указывать на то, что они могли экспрессироваться в нерастворимом виде и/или в небольшом количестве. Поэтому с помощью вестерн-блоттинга были проанализированы фракции нерастворимых белков образцов из листьев, инокулированных культурами агробактерий, трансформированных конструкциями, кодирующими капсидные белки ящура (рССаСс13СР2аиОРР и

pCCaCd3CPuGFP), приготовленные путем фракционирования листового материала с экстракцией белков растения мочевиной. На вестерн-блоттинге с такими образцами с антителами против белка VP1, присутствовал сигнал в виде «шмера», что является косвенным подтверждением экспрессии белка VP1 в растениях на низком уровне и в виде нерастворимого белка. На вестерн-блоттинге с антителами против белка VP3 сигнал отсутствовал, что могло означать, что этот белок экспрессировался на очень низком уровне или же не экспрессировался вовсе.

Таким образом, были предприняты попытки транзиентной экспрессии в растениях компонентов, необходимых для сборки пустых капсидов вируса ящура - предшественника капсидных белков Pic автокаталитическим пептидом 2 А и протеазы ЗСрго или отдельных структурных белков вируса ящура. Однако добиться получения ВПЧ ящура в растениях методом транзиентной экспрессии не удалось. Одной из основных причин низкого уровня накопления предшественника Р1-2А и отдельных капсидных белков было, вероятно, отсутствие оптимизации кодонового состава последовательностей генов, кодирующих эти белки, для их экспрессии в растениях.

Несмотря на то, что использование ВПЧ или предшественника капсидных белков Р1 в качестве основы для вакцины против ящура является важным направлением исследований, получение таких белков в количествах, позволяющих их выделение и практическое применение, остается достаточно трудоемкой задачей. В настоящее время на достаточно высоком уровне в растениях возможно получение белков только небольшого размера. Например, в работах, посвященных получению капсидного белка VP1 или его отдельных эпитопов (Carrillo et al., 2001; Wang et al., 2008; Wu et al., 2003), уровень их накопления в растениях был выше, чем уровень экспрессии предшественника (до 2% от растворимых белков клеток). В то же время, иммуногенность и протективность препаратов таких белков значительно уступает традиционным вакцинам, что связано, в том числе, и с ограниченным антигенным репертуаром белка VP1 по сравнению с общим набором распознаваемых эпитопов вириона.

Необходимость оптимизации кодонового состава экспрессируемого целевого белка, минимизации его размера для обеспечения эффективной экспрессии

в клетках растений учитывали на следующем этапе работы, посвященном получению искусственного рекомбинантного белка НРЕ, несущего комбинацию известных В- и Т-клеточных эпитопов вируса ящура в составе одной полипептидной цепи.

2. Получение полиэпитопного белка вируса ящура в бактериях

При дизайне синтетического гена искусственного полиэпитопного белка НРЕ были использованы аминокислотные последовательности известных В-клеточных эпитопов структурных белков и Т-клеточных эпитопов неструктурных белков вируса ящура серотипа О/Тайвань/99, перечисленные далее. В-клеточные эпитопы: VP4 (21-40 а.о.) (Zhang et al., 2007), VP1 (135-160 a.o.) (Zamorano et al., 1994) и (200-213 a.o.) (Van Lierop et al., 1992); и Т-клеточные эпитопы: 2C (68-76 a.o.) (Barfoed et al., 2006), 3D (1-115 a.o.) и (421-460 a.o.) (Garcia-Briones et al., 2004). Последовательности эпитопов были разделены «гибкими» глицин-богатыми линкерами G4S2. Нуклеотидная последовательность гена НРЕ с оптимизированным для экспрессии в клетках N.benthamiana кодоновым составом была синтезирована компанией Евроген (Россия). Для удобства последующего субклонирования в 5'-и 3'-концевые последовательности гена были введены сайты рестрикции Asel и Ndel, Xhol и Xmal, между последовательностями, кодирующими В- и Т-эпитопы, был введен сайт EcoRI. При помощи метода ПЦР и олигонуклеотидов на N-конец такой химерной последовательности была добавлена аминокислотная последовательность шести аминокислотных остатков гистидина. Введенная N-концевая гексагистидиновая последовательность обеспечивала возможность последующей очистки рекомбинантного белка НРЕ методом металл-хелатной аффинной хроматографии. Схема синтетического гена НРЕ представлена на рис. 3.

Для создания штамма E.coli -продуцента белка НРЕ, ген НРЕ был клонирован в вектор рЕТ23а(+) (Novagen), содержащий промотор фага Т7 обеспечивающий высокую экспрессию гетерологичных генов в штаммах E.coli, синтезирующих Т7 полимеразу. Полученной рекомбинантной плазмидой рЕТ23а-НРЕ трансформировали штамм E.coli Rosetta 2 (DE3). Выбор данного штамма в качестве реципиента для продукции белка НРЕ обусловлен тем, что он синтезирует РНК- полимеразу фага Т7, а также содержит дополнительную плазмиду

pRARE2, обеспечивающую эффективную трансляцию редких кодонов.

Asel EcoRI Xhol

I Ndel I IXmal

-L-1— I ■ 1 I ■ J—L

6His VP4 VP1 VP1 2C 3D 3D

(21-40) (135-160) (200-213) (68-76) (1-115) (421-460)

Рис. 3. Схема синтетического гена Н-РЕ.

Черным показаны глицинбогатые линкеры.

Уровень экспрессии белка НРЕ при культивировании полученного штамма при +37°С в условиях автоиндукции (Studier, 2005) составил порядка 50% от общего клеточного белка (рис. 4а). При таком высоком уровне продукции в штаммах E.coli целевые белки, как правило, образуют нерастворимые агрегаты — «тельца включения». Понижение температуры культивирования полученного штамма до +28°С и +21 "С не приводило к повышению растворимости белка НРЕ.

120 kDa 86 kDa

120 kDa

86 kDa w

47 kDa ЩШ

М 34 kDa

26 kDa

20 kDa

26 kDa 20 kDa «

б)

Рис. 4. а - Экспрессия НРЕ белка в Е. coli. 1 - Маркер молекулярного веса;

2 - Суммарный белок клеток культуры Rosetta2; 3 - Суммарный белок клеток культуры Rosetta2/pET23a-HPE. б - Выделение и очистка НРЕ белка, полученного в Е. coli. 1 - Маркер молекулярного веса; 2 - препарат очищенного белка НРЕ.

Для выделения белка НРЕ использовали металл-хелатную аффинную хроматографию на Ni-NTA сефарозе в денатурирующих условиях. Фракции элюата, содержащие максимальное количество белка, диализовали против буфера G, содержащего 4 М мочевину, 10 мМ Tris-HCl pH 8.0. Степень чистоты получен-

ного препарата составила не менее 85% (рис. 46).

3. Получение полиэпитопного белка вируса ящура в растениях N. ЬеМкштапа.

Для получения НРБ белка в клетках N. ЬеШкат1апа использовали метод транзиентной экспрессии. Синтетический ген НРЕ был клонирован в фитови-русный экспрессионный вектор на основе полноразмерной кДНК ХВК -рА7248АМУ. Полученной плазмидой рА7248АМУ-НРЕ трансформировали штамм А. ^те/аЫепз ЕНА105.

В экстрактах листьев растений, агроинокулированных смесью культур, трансформированных конструкцией рА7248АМУ-НРЕ и конструкцией, кодирующей супрессор РНК сайленсинга НСРго вируса мозайки турнепса, детектировали белок, совпадающий по электрофоретической подвижности с рекомби-нантным белком НРЕ, выделенным из клеток Е.соИ (рис. 5).

120 kDa

—■# —. Рис. 5. Экспрессия белка НРЕ в растениях

1 N. ЬеШкат'шпа. 1 - Маркер молекулярного 86 кОа р- «¡ш; веса; 2 - суммарный белок клеток культуры

Е. соП Козейа2/рЕТ23а-НРЕ, на геле пример-47 кОа но 0,5 мкг белка НРЕ; 3 - образец ткани листа

из зоны, инокулированной культурами 34 кОа * ** НН А105/ р А7248А М V - О и 8 и ЕНА105/НСРго;

4 - образец ткани листа из зоны, инокулиро-*й ванной культурами ЕНА105/рА7248АМУ-

26 кЭа | " НРЕ и ЕНА105/НСРго; 5 -препарат очищен-

20 кОа ного белка НРЕ, выделенный из растений.

1 2 3 4 5

Рис. 6. Вестерн-блот анализ препаратов белка НРЕ. 1 - белок культуры клеток Е. coli Rosetta2/pET23a-HPE, ~ 5 нг белка НРЕ; 2 - белок культуры клеток Е. coli Rosetta2; 3 -образец ткани листа из зоны, инокулированной культурами клеток EHA105/pA7248AMV-HPE

и ЕНА 105/НСРго, на дорожке ~ 5 нг белка НРЕ; 4 - образец ткани листа из зоны, инокулированной культурами EHA105/pA7248AMV-GUS и ЕНА 105/НСРго; 5 - препарат очищен-~> 3 4 5 ного белка НРЕ из растений, 25 нг.

120 kDa

86 kDa

47 kDa _

( 34 kDa -

26 kDa"

20 kDa *

Соответствие антигенных свойств белков НРЕ, полученных в клетках растений и бактерий, подтверждали вестерн-блот анализом с мышиными антителами против выделенного из Е.соИ и очищенного препарата белка НРЕ (рис. 6). Полученные данные также свидетельствуют в пользу того, что синтезируемый в растениях белок НРЕ не подвергается пост-трансляционным модификациям.

Антисыворотка к белку НРЕ была высокоспецифична, поскольку практически полностью отсутствовало взаимодействие антител с хозяйскими белками клеток бактерий и растений.

Для проверки влияния используемого супрессора РНК-сайленсинга на количество нарабатываемого белка в растениях одну половину листа агроинокули-ровали смесью культур, трансформированных конструкциями рА7248АМУ-НРЕ и рССаНСРго (кодирует супрессор РНК-сайленсинга, НСРго, вируса мозаики турнепса), а другую - рА7248АМУ-НРЕ и рССар24 (кодирует супрессор РНК-сайленсинга р24 вируса, ассоциированного с скручиванием листьев винограда 2 (ОЬЯаУ-2)).

Было обнаружено, что уровень экспрессии белка НРЕ при использовании супрессора р24, был выше, чем с супрессором НСРго. Из 120 гр листьев, иноку-лированных смесью культур агробактерий, трансформированных конструкциями рА7248АМУ-НРЕ-3 и рССар24, с помощью аффинной хроматографии выделяли около 8 мг белка НРЕ, что составляло около 67 мг белка на 1 кг свежих листьев. Таким образом, уровень накопления белка в растениях увеличился примерно в 2 раза - около 1,5% от всех белков клетки растения.

5. Схема получения белка НРЕ из клеток бактерий и растений

Разработанные технологические схемы получения полиэпитопного белка НРЕ из клеток бактерий и растений включают стадии получения биомассы, содержащей достаточное количество целевого белка, ее разрушения, фракционирования, аффинной хроматографии. Процесс получения рекомбинантного белка НРЕ приведен на рис. 7.

Основной схеме предшествуют стадии вспомогательных работ.

1. Технологическая схема получения белка НРЕ из клеток Е. соИ.

1.1. Получение культуры бактериального штамма-продуцента (ВР16) Плазмидой рЕТ23а-НРЕ трансформируют компетентные клетки штамма Е. соИ ЯозеМа 2(БЕЗ), ампициллин-устойчивые трансформанты отбирают на чашках с ЬВ агаром, содержащим также 1% глюкозу, 30 мкг/мл хлорамфеникола. Одиночную колонию переносят в 2 мл среды гУР-0.8С с ампициллином и хло-рамфениколом, выращивают в течение ночи при 37°С при постоянном перемешивании.

Белковый препарат

Рис. 7. Схема получения белка НРЕ из клеток бактерий и растений

1.2. Подготовка буферных растворов и сорбента (ВР2).

Готовят буфера для фракционирования клеток и хроматографии белка:

Буфер А: 100 мМ NaH2P04, 10 мМ Tris-Cl, 6 M GuHCl, рН 8.0. Буфер В: 100 мМ NaH2P04, 10 мМ Tris-Cl, 8 M мочевина, рН 8.0. Буфер С: 100 мМ NaH2P04, 10 мМ Tris-Cl, 8 M мочевина, рН 6.3. Буфер D: 100 мМ NaH2P04, 10 мМ Tris-Cl, 8 M мочевина, рН 5.9. Буфер Е: 100 мМ NaH2P04, 10 мМ Tris-Cl, 8 M мочевина, рН 4.5. Буфер F: 6 M GuHCl, 0,2 M уксусная кислота. Буфер G: 4M мочевина, 10 мМ Tris рН 8.0.

Готовят индуцирующий буфер для приготовления суспензии A. tumefaciens

для агроинокуляции растений: 10 мМ MgS04, 10 мМ МЕ8(2-(Ы-Морфолино)-этансульфоновая кислота), 150 мкМ ацетосирингона.

Уравновешивают Ni-NTA сефарозу (Promega) в буфере А.

1.3. Получение биомассы клеток для выделения белка (ТП16).

200 мкл культуры штамм Rosetta 2 (DE3)/pET23a-HPE переносят в 100 мл среды ZYP-5052 с хлорамфениколом, ампициллином, выращивают 48 часов при 28°С в колбах объемом 500 мл, биомассу осаждают центрифугированием.

1.4. Получение грубого экстракта (ТП26).

Полученную биомассу рекомбинантного штамма (2 г) суспендируют в 10 мл буфера А и разрушают ультразвуковой дезинтеграцией. Супернатант собирают после центрифугирования гомогената 15 мин при 14000 об/мин 15 мин, промывают дебрис 5 мл буфера А и дебрис отбрасывают.

1.5. Выделение белка (ТПЗ).

1.5.1. 5 мл суспензии Ni-NTA сефарозы (Promega), уравновешенной в буфере А инкубируют с осветленным клеточным лизатом в течение 30 мин при постоянном перемешивании (ТПЗ. 16).

1.5.2. Переносят суспензию лизата и сорбента в хроматографическую колонку, пропускают лизат через колонку со скоростью 0,5-1 мл/мин (ТПЗ.26).

1.5.3. Промывают сорбент последовательно 4-х кратным избытком буфера А, В, С, D, Е со скоростью 0,5-1 мл/мин, не допуская пересыхания сорбента в колонке (ТПЗ.36.)

1.5.4. Элюируют белок 20 мл буфера F (ТП3.46). Полученный препарат диа-лизуют против буфера G. Выход очищенного таким образом белка НРБ составляет примерно 20 мг из 100 мл культуры.

2. Технологическая схема получения белка НРБ в N. benthamiana:

2.1. Получение культуры агробактерий для агроинокуляции (ВР1р).

Штаммы A. tumefaciens EHA105/pA7248AMV-HPE и A. tumefaciens

ЕНА105/рССар24 выращивают на качалке в 3 мл среды LB с антибиотиками (канамицин, рифампицин, гентамицин) и ЮмМ MES 12 часов при 27°С. Клетки осаждают при 4000 об/мин в течение 5 минут, осадок ресуспендируют в 500 мкл индуцирующего буфера до конечной плотности (ОПбоо)=0,4. Выдерживают 3 часа при комнатной температуре.

2.2. Транзиентная экспрессия белка НРЕ в листьях N. benthaniana (ТП1р).

Суспензии индуцированных клеток штаммов A. tumefaciens

ЕНА105/pA7248AMV-НРЕ и A. tumefaciens ЕНА105/рССар24 смешивают в соотношении 1:1. Полученную смесь вводят шприцом в листья 3-х недельных растений N. benthaniana. Выдерживают растения в оптимальных условиях и при достаточном поливе 5 дней.

2.3. Получение грубого экстракта (ТП2р)

100 г инокулированных агробактериями листьев растирают в жидком азоте в ступке, кашицу суспендируют в 60 мл буфера А, перемешивают на мешалке в течение 30 мин, центрифугируют при 14000 об/мин 15 мин, супернатант отбирают.

2.4. Выделение белка (ТПЗ).

Полученный супернатант инкубируют с 1,3 мл суспензии Ni-NTA сефарозы, уравновешенной в буфере А, в течение 30 мин при постоянном перемешивании.

Рекомбинантный белок выделяют на колонке схеме, разработанной для клеток Е. coli (стадии 1.5.2-1.5.4).

Выход белка составляет примерно 67 мг белка на 1 кг свежих листьев растений.

6. Антигенные и протективные свойства белка НРЕ.

Иммунологические характеристики препаратов очищенных белков из бактерий и растений были определены в опытах на лабораторных животных (морских свинках) в Федеральном Центре Охраны Здоровья Животных (ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир).

Для определения минимальной дозы белка НРЕ, вызывающей иммунный ответ против вируса, группы морских свинок из 8 животных были однократно иммунизированы масляной эмульсией, содержавшей различные количества препаратов белка НРЕ, полученных из клеток бактерий или растений (300, 120 и 40 мкг на животное) в комбинации с масляным адъювантом Montanide ISA 70 (SEPPIC, Франция).

Через 17 сут после иммунизации у животных, иммунизированных бактериальным белком, были отобраны сыворотки крови, которые тестировали с помощью реакции микронейтрализации (Таблица 1). Сыворотки крови свинок,

привитых растительным белком, были протестированы в непрямом варианте ИФА с антигеном вируса ящура О/Тайвань/99 (тест-система ФГУ ВНИИЗЖ) и с использованием набора О РЫБУ АЬ РпоСНЕСК (Рпошсв, Швейцария) (Таблица 2). Через 21 день после иммунизации все группы морских свинок были подвергнуты контрольному заражению адаптированным к этим животным вирусом ящура О/Тайвань/99.

Однократная иммунизация морских свинок препаратами, содержащими 350 и 120 мкг растительного белка НРБ на одно животное, индуцировала выработку антител, определяемых в референтном тесте О РМБУ АЬ РпоСНЕСК (Рпошсв, Швейцария).

Таблица 1. Антигенные и протективные свойства белка НРЕ, выделенного из клеток Е.соИ, при исследовании на морских свинках

Но- Количество Контрольное заражение: количе- Статистиче-

мер вводимого РМН ство защищенных живот- ская значи-

груп- белка на одно ных/количество животных в мость по

пы животное опыте группе (рсл)

1 350 мкг >1:45 8/8 0,004

2 120 мкг >1:32 8/8 0,004

3 40 мкг >1:16 4/8 0,637

4 не вводили <1:16 0/8 -

Таблица 2. Антигенные и протективные свойства белка НРЕ, выделенного из клеток М.ЬеШИат'шпа, при исследовании на морских свинках

Номер группы Количество вводимого белка на одно животное О FMDV АЬ PrioCHECK PI (РІпол>50%) Тест-система ФГУ «ВНИИЗ Ж» Контрольное заражение: количество защищенных животных/количество животных в опыте Статистическая значимость по группе (рсл)

1 350 мкг 78±14,7% >100 8/8 0,004

2 120 мкг 70±22,7% >100 8/8 0,004

3 40 ию- 58,5±19,7% >50 6/8 0,145

4 не вводили 16,3±6,5% <50 0/8 -

Однократная иммунизация морских свинок эмульсионной вакциной, содержавшей в прививном объеме белок НРЕ в количествах 350 и 120 мкг/животное, индуцировала у животных формирование вируснейтрализующих антител к вирусу ящура типа О/Тайвань/99, выявляемых в РМН или ИФА и

Вестерн-блоттинге. У всех иммунизированных этими дозами животных не происходило появления вторичных афт на передних лапах через 7 сут после заражения. При уровне а=0,005 защищенность морских свинок, иммунизированных 350 и 120 мкг белка, была достоверной.

У группы свинок, иммунизированных бактериальным НРБ в количестве 40 мкг/животное, вторичные афты регистрировали у четырех из восьми свинок, у иммунизированных растительным белком — у двух из восьми. Симптомы ящура появлялись у всех неиммунизированных (контрольных) морских свинок.

Результаты оценки иммуногенности бактериального и растительного поли-эпитопных белков НРБ свидетельствуют о том, что при однократной иммунизации морских свинок дозой 120 мкг/животное в комбинации с масляным адъ-ювантом Montanide ISA 70, он способен индуцировать иммунный ответ у животных, детектируемый методами ИФА и РМН, а также вызывать устойчивость к контрольному заражению гомологичным адаптированным вирусом ящура типа О/Тайвань/99.

ВЫВОДЫ

1. Созданы фитовирусные векторы для транзиентной ко-экспрессии в растениях предшественника капсидных белков вируса ящура серотипа О/Тайвань/99 Р1-2А, слитого с геном флуоресцентного белка uGFP и протеазы ЗСрго. Показано, что экспрессия гена предшественника Р1-2А в растениях приводит к образованию нерастворимых телец включения.

2. Сконструирован ген искусственного кандидатного вакцинного белка НРБ, содержащего набор В- и Т-клеточных эпитопов капсидных белков VP1, VP4, 2С и 3D вируса ящура изолята О/Тайвань/99.

3. Разработаны системы экспрессии и очистки белка НРБ в клетках бактерий Е. coli и растений N. benthamiana, обеспечивающие получение высокоочи-щенных препаратов для иммунологических испытаний.

4. Рекомбинантный белок НРБ обладает высокой иммуногенностью и индуцирует у лабораторных животных образование нейтрализующих антител к вирусу ящура О/Тайвань/99.

5. Однократная иммунизация морских свинок белком НРБ индуцирует им-

мунный ответ, обеспечивающий полную защиту лабораторных животных от заражения вирусом ящура О/Тайвань/99.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Отработанный метод получения искусственного вакцинного белка НРЕ путем комбинирования в составе одной полипептидной цепи фрагментов структурных и неструктурных белков вируса ящура серотипа О, несущих им-мунодоминатные В- и Т-клеточные эпитопы, может быть использован для дизайна и разработки экономичных, безопасных, простых в изготовлении канди-датных вакцин и тест-систем для диагностики и иммунопрофилактики заболеваний ящура, вызываемых вирусами других серотипов.

2. Препараты кандидатного вакцинного белка НРЕ могут быть востребованы в научных исследованиях по изучению механизмов клеточного и гуморального противоящурного иммунитета, в качестве стандартного антигена в составе диагностических наборов для определения антител к вирусу ящура серотипа О.

3. Результаты работы могут использоваться в учебном процессе по дисциплинам «биотехнология», «вирусология», «иммунология».

4. Результаты исследований вошли в отчет о научных исследованиях по проекту «Продукция вакцинных белков в растениях», госконтракт № 02.527.11.0002, реализованного консорциумом российских и европейских участников — победителей конкурса FP7-KBBE-2008-2B проектов научного сотрудничества Россия-ЕС.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полиэпитопный белок вируса ящура, полученный в бактериях и растениях, вызывает протективный иммунитет в морских свинках /Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Луговская H.H. и др. // Биохимия. - 2011. - № 3. - Т. 76. -С. 415-424.

2. Состав полиэпитопного белка для индукции иммунного ответа против вируса ящура /Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Борисов В.В., Эльдаров

М.А., Фолимонов A.C. // Патент РФ № 2453557 от 20.06.2012, Бюл. № 17.

3. Андрианова Е.П., Эльдаров М.А., Фолимонов A.C. Полученный в растениях рекомбинантный белок, состоящий из эпитопов вируса ящура, как основа альтернативной вакцины // Биология - Наука XXI Века: Сб. тезисов 16-й Межд. Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино: Пущинский науч. Центр РАН. - 2012. - С. 245-246.

4. Андрианова Е.П., Фолимонов A.C. Получение белка, состоящего из эпитопов вируса ящура, в бактериях и растениях для изучения возможности разработки альтернативного метода вакцинирования //Горизонты нанобиотехноло-гии: сб. тезисов Всеросс. научной школы для молодежи - Звенигород: Центр «Биоинженерия» РАН. - 2009. С. 15-16.

5. Продукция полиэпитопного белка вируса ящура в бактериях и растениях с целью получения потенциальной вакцины / Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Борисов В.В. и др. // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова: сб. тезисов Меж-дунар. научной конф. - М.: ИБХ РАН. - 2009. - С. 7-9.

Заказ № 87-а/11/2012 Подписано в печать 20.11.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:zak@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Андрианова, Екатерина Павловна

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Вирус ящура.

2. Вакцины против ящура.

2.1 Традиционная вакцина.

2.2 ДНК-вакцины.

2.3 Вакцины на основе ослабленных вирусов.

2.4 Пустые вирусные капсиды как основа для вакцины.

2.5 Субъединичные вакцины.

3. Антигенные сайты вируса ящура.

4. Гетерологичные системы экспрессии белков.

4.1 Бактериальная система экспрессии.

4.2 Растительная система экспрессии.

4.2.1 Трансгенные растения как система получения белков.

4.2.2 Получение белков в хлоропластах.

4.2.3 Транзиентная экспрессия белков в растениях.

5. Получение в растениях вакцинных белков вируса ящура.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Изучение возможности получения пустых капсидов ящура в растениях.

1.1 Экспрессия предшественника капсидных белков Р1-2А в растениях N. Ьеп1кат1апа.

1.2 Коэкспрессия предшественника Р1-2А и протеазы ЗСР'° в N. benthamiana.

1.3 Экспрессия индивидуальных капсидных белков вируса ящура в растениях N. Benthamiana.

2. Получение полиэпитопного белка вируса ящура в бактериях и растениях.

2.1 Получение белка CBD-PE в клетках Е. coli.

2.2 Получение полиэпитопного белка НРЕ в Е. coli.

2.3 Получение белка НРЕ в растениях N. benthamiana.

2.4 Схема получения полиэпитопного белка НРЕ из клеток бактерий и растений.

2.5 Оценка иммуногенности НРЕ белка.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение рекомбинантных антигенов вируса ящура О/Тайвань/99, перспективных для разработки противоящурных вакцин, с использованием бактерий и растений"

В связи с этими недостатками предпринимаются попытки разработать альтернативные вакцины против вируса ящура. В настоящее время разрабатываются методы использования в качестве вакцины фрагментов структурных и неструктурных белков вируса, например структурного белка УР1 или пустых вирусных капсидов, ослабленных вирусов, например с делецией участка капсидного белка УР1 или протеиназы Ьрго. Такие вакцины не имеют некоторых недостатков традиционных вакцин, однако на сегодняшний день они менее эффективны по сравнению с вакцинами, созданными на основе инактивированного вируса. Поэтому задача получения альтернативной вакцины против ящура остается актуальной.

В настоящее время перспективной и представляющей огромный интерес для биотехнологических компаний системой получения белка является растение. Главными преимуществами использования растений для получения белка являются низкая конечная стоимость и биобезопасность продукта вследствие отсутствия у растений и животных общих патогенов. Рекомбинантные белки в растениях могут быть получены двумя методами: с помощью генетической трансформации или транзиентной экспрессии с помощью вирусных векторов. Создание трансгенного растения, а значит и получение белка из него, требует значительных временных затрат. Уровень экспрессии целевых белков трансгенными растениями обычно низок, что определяет высокую стоимость продукта вследствие сложности его очистки. Получение белка с использованием фитовирусной системы транзиетной экспрессии в растениях имеет ряд преимуществ; в первую очередь более высокий уровень экспрессии, биобезопасность и короткое время, необходимое для создания и тестирования экспрессионной системы.

Настоящая работа посвящена получению вакцинных белков вируса ящура, способных индуцировать иммунный ответ у лабораторных животных, способный защищать их от заболевания ящуром, и разработке систем экспрессии этих белков в бактериях и растениях.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью работы являлось конструирование рекомбинантных вакцинных белков вируса ящура и разработка систем их экспрессии в бактериях и растениях.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Создание систем транзиентной экспрессии предшественника капсидных белков Р1 и ЗС-протеазы или отдельных капсидных белков вируса ящура (изолята О/Тайвань/99) в клетках растений Nicotiana benthamiana с помощью фитовирусных векторов;

3. Создание систем экспрессии белка НРЕ в клетках Escherichia coli и в растениях Nicotiana benthamiana-,

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Вирус ящура

Первое письменное упоминание о болезни, похожей на ящур, появилось в шестнадцатом веке в Италии, где описывается заболевание крупного рогатого скота. На заре становления вирусологии, в конце девятнадцатого века, было показано, что, инфекционным агентом ящура является патоген, способный проходить через бактериальный фильтр. Впоследствии, было показано, что этим патогеном является вирус, названный вирусом ящура.

Серологическими методами удается различить семь серотипов вируса: А, О, С, Азия-1, SAT (Территории Южной Африки) -1, -2 и -3. Также установлено более 60 подтипов вируса. На территории стран СНГ обычно встречаются вирусы серотипов О и А.

Вирус ящура является типовым представителем семейства Picornaviridae, рода Aphtovirus. Его геном представлен одпонитевой линейной (+) РНК размером около 8500 нуклеотидов (схема генома вируса представлена на Рис. 1). Вирус имеет икосаэдрический капсид, составленный из четырех структурных белков - VP1, VP2, VP3 и VP4.

Ранние исследования вируса ящура с использованием обработанного трипсином вируса или химически очищенных вирусных белков показали важность капсидного белка VP1 в антигенной и иммуногенной активности вируса (Wild et al., 1969; Bachrach et al., 1975). В 80-х годах было установлено, что иммунизация морских свинок (Bittle et al., 1982; Pfaff et al., 1982) и крупного рогатого скота (Di Marchi et al., 1986) фрагментами белка VP1, которые соответствуют 141-160 (или 141-158) аминокислотным остаткам и находятся в так называемой G-H-петле, приводила к выработке антител и в некоторых случаях к защите от заболевания. Позднее было показано, что G-H-петля белка VP1 присутствует у всех серотипов вируса ящура (Borrego et al., 1995; Mateu et al., 1995), но является высоковариабельным участком, что объясняет низкую кросс-реакгивность между разными серотипами вируса (Feigelstock et al., 1992; Mateu et al., 1994). Эти данные позволили сформулировать утверждению, что G-H-петля белка VP1 является иммунодоминантным антигенным сайтом. Однако, системный иммунный ответ, вызываемый заболеванием или вакцинацией, никогда не исследовался достаточно тщательно, чтобы подтвердить это.

Для проникновения в клетку вирус использует два класса рецепторов на ее поверхности. Инициация трансляции вирусной РНК происходит на последовательности внутреннего сайта посадки рибосом (TRES) (Belsham et al., 1990; Kuhn et al., 1990). В результате трансляции образуется белок-предшественник 240-250 кД, который подвергается последовательному расщеплению до функционально активных структурных и неструктурных белков. Протеаза Lpro автокаталитически выщепляется из полипротеина-предшественника. После этого Lpro участвует в подавлении синтеза хозяйских белков в инфицированной клетке путем протеолиза клечочного фактора инициации трансляции, подавляя таким образом са/7-зависимую трансляцию (Devaney et al., 1988; Kirchweger et ai, 1994).

Область PI кодирует белки оболочки вируса: VP4, VP2, VP3 и VP1. Предшественник PI процессируется протеазой ЗСрГ0 с образованием 3 белков: VPO, VP3 и VP1. Расщепление VPO на VP4 и VP2 происходит при сборке капсида. Для этого необходимо взаимодействие структурных белков с вирусной РНК. Расщепление VPO на VP4 и VP2 происходт автокаталитически и необходимо для образования инфекционного вируса. Белки VP1, VP2 и VP3 стыкуясь между собой, образуют поверхность капсида, в то время как миристилированный по N-концу белок VP4 погружен внутрь капсида. Сборка капсида начинается с образования протомеров белками VPO, VP1 и VP3. 5 протомеров формируют пентамеры, а 12 пентамеров образуют капсид вируса. Вирус ящура, как и ряд других пикориовирусов, способен формировать пустые капсиды, идентичные по своим антигенным свойствам интактным не содержащим РНК вирионам. Такие частицы менее стабильны, при этом в составе капсида содержится непроцессированный белок УРО вместо белков УР2 и УР4 (Яшеуетати е1 а/., 1979; Ваэауарра ег а\., 1994).

3UTR

U 1 A(VP4j

2А звт t«*® 1B<VP2) 1C(VP3) 1D<VP1) 28 [ 2C ЗА

ЗО"01

ЛЛ

Р1

-А

РЗ ро?у f % J

0 Сантрасщепления и>к Структурные0елкн

О Фактор расщепления не установлен д Сантрасщепления ЗС«"0

Сантрасщепления 2А

И естр. ►турнмс: телки VP3 VP1 Шх^Щ

Рис. 1. Схема генома вируса ящура

Область Р2 кодирует неструктурные белки 2В и 2С и пептид 2А. Пептид 2А автокаталитически выщепляется из состава полипротеина Р2 и остается связанным с предшественником капсидных белков PI. Функция белка 2В достоверно не установлена, а белок 2С имеет нуклеозидтрифосфат-связывающие (Klein et al., 1999; Pfister et al., 1994) и хеликазные мотивы (Klein et al., 2000).

Область РЗ также кодирует ряд неструктурных белков, в числе которых протеаза ЗСргои РНК-зависимая РНК-полимераза вируса 3Dpo1.

После трансляции вирусная РНК служит матрицей для образования (-) цепи РНК, синтез которой происходит при помощи 3Dpo1. Затем происходит синтез (+) цепей РНК и образование вирионов (Harber et aL, 1991; Nugent et al., 1999). Зрелые вирионы освобождаются из клетки при ее разрушении путем лизиса.

Основной причиной распространения ящура является международная торговля домашними животными. Вспышки заболевания происходят во всех странах мира, где в сельском хозяйстве используется крупный рогатый скот. Болезни подвержены все домашние парнокопытные животные. Наиболее восприимчив к заболеванию ящуром крупный рогатый скот, менее восприимчивы свиньи, овцы, козы, более 70 видов диких животных и человек. Вирус передается от заболевших животных к здоровым воздушно-капельным путем. Первые признаки заболевания могут появляться через 2-3 дня после заражения. У зараженных животных появляется жар, нарушение походки, хромота, афтозное поражение слизистой оболочки ротовой полости, кожи, вымени и межкопытной щели конечностей. Несмотря на то, что заболевание ящуром не приводит к высокому уровню смертности среди взрослых животных, оно проявляется в потери веса, резком понижении молочной продуктивности. Смертельный исход чаще происходит у молодых животных с ослабленным иммунитетом. У них наблюдаются нарушения функций сердечно-сосудистой системы и скелетной мускулатуры. Крупный рогатый скот, а также овцы и козы могут быть бессимптомными носителями вируса, приобретая при этом способность заражать других животных в течение 2-3 лет.

Вспышки ящура наносят большой экономический ущерб промышленности и сельскому хозяйству. По данным Федерального Центра Охраны Здоровья Животных (Институт Ящура, г. Владимир) при эпизоотии вируса серотипа О на Тайване в 1997 г. возникло более 6 тыс. очагов заболевания, пало или было забито свыше 4 млн. свиней, общий экономический ущерб составил около 10 млрд. долларов США (http://www.zzr.ru/archives/200l/06/article3/article3.html). При возникновении очагов ящура А-22 в балканских странах в 1996 г. экономический ущерб превысил 300 млн. долларов. Ликвидация очага этого заболевания в Московской области в 1995 г. обошлась в 14,6 млрд. руб. в ценах того периода (около 3,2 млн. долларов), в Приморском крае в 2000 г. — в 8,7 млн. руб. (свыше 300 тыс. долларов).В результате вспышки ящура ссротипа А в 2010 году в Южной Корее, названной самой сильной в истории этой страны, уничтожено около 30% или 10 млн. голов свиней и 5% или более 3 млн. голов крупного рогатого скота. Стоит отметить что, Южная Корея счи талась свободной от ящура страной после последней вспышки ящура серотипа О в 2002 году. Эта эпидемия ящура стоила Южной Корее больше 1,8 млрд. долларов США. Япония в 2010 году также понесла многомиллионные убытки вследствие вспышки ящуре серотипа О, в ходе которой было забито около 300 тыс. животных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Андрианова, Екатерина Павловна

ВЫВОДЫ

3. Разработаны системы экспрессии и очистки белка НРЕ в клетках бактерий Е. coli и растений N. benthamiana, обеспечивающие получение высокоочищенных препаратов для иммунологических испытаний.

4. Рекомбинантный белок НРЕ обладает высокой иммуногенностью и индуцирует у лабораторных животных образование нейтрализующих антител к вирусу ящура О/Тайвань/99.

5. Однократная иммунизация морских свинок белком НРЕ индуцирует иммунный ответ, обеспечивающий полную защиту лабораторных животных от заражения вирусом ящура О/Тайвань/99.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полиэпитопный белок вируса ящура, полученный в бактериях и растениях, вызывает протективный иммунитет в морских свинках / Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Луговская H.H. и др. // Биохимия. -2011. -№ 3. - Т.76. - С. 415-424.

2. Состав полиэпитопного белка для индукции иммунного ответа против вируса ящура / Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Борисов В.В., Эльдаров М.А., Фолимонов A.C. // Патент РФ № 2453557 от 20.06.2012, Бюл. № 17.

4. Андрианова Е.П., Фолимонов A.C. (2009). Получение белка, состоящего из эпитопов вируса ящура, в бактериях и растениях для изучения возможности разработки альтернативного метода вакцинирования // Горизонты нанобиотехнологии: сб. тезисов Всеросс. научной школы для молодежи - Звенигород: Центр «Биоинженерия» РАН. - 2009. С. 15-16.

5. Продукция полиэпитопного белка вируса ящура в бактериях и растениях с целью получения потенциальной вакцины / Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Борисов В.В. и др. // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова: сб. тезисов Междунар. научной конф. -М.: ИБХ РАН. - 2009. - С. 7-9.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Андрианова, Екатерина Павловна, Москва

1.Wild Т. F., Burroughs J. N., Brown F. Surface structure of foot-and-mouth disease virus //J. Gen. Virol. 1969. Apr. №4(3). P. 313-320.

2. Bachrach H. L., Moore D. M., McKercher P. D., Polatnick J. Immune and antibody responses to an isolated capsid protein of foot-and-mouth disease virus // J. Immunol. 1975. Dec. № 115(6). P. 1636-1641.

3. Pfaff E., Mussgay M., Bohm II. O., Schulz G. E., Schaller H. Antibodies against a preselected peptide recognize and neutralize foot and mouth disease virus // EMBO J. 1982. № 1(7). P. 869-874.

4. Di Marchi R., Brooke G., Gale C., Cracknell V., Doel Т., Mowat N. Protection of cattle against foot-and-mouth disease by a synthetic peptide // Science. 1986. № 232. P. 639-641.

5. Borreg O.B., Camarero J. A., Mateu M. G., Domingo E. A highly divergent antigenic site of foot-and-mouth disease virus retains its immunodominance // Viral. Immunol. 1995. № 8. P. 11-18.

6. Mateu M. G., Camarero J. A., Giralt E., Andreu D., Domingo E. Direct evaluation of the immunodominance of a major antigenic site of foot-and-mouth disease virus in a natural host // Virology. 1995. № 206. P. 298-306.

7. Devaney M. A., Vakharia V. N., Lloyd R. E., Ehrenfeld E., Grubman M. J. Leader protein of foot-and-mouth disease virus is required for cleavage of the p220 component of the cap-binding protein complex // J. Virol. 1988. № 62. P. 44074409.

8. Rweyemamu M. M., Terry G., Pay T. W. Stability and immunogenicity of empty particles of foot-and-mouth disease virus // Arch. Virol. 1979. № 59(1-2). P. 69-79.

9. Klein M., Eggers H. J., Nelsen-Salz B. Echovirus 9 strain Barty non-structural protein 2C has NTPase activity // Virus Res. 1999. № 65. P. 155-160.

10. Pfister T., Jones K. W., Wimmer. E. A cysteine-rich motif in poliovirus protein 2C (ATPase) is involved in RNA replication and binds zinc in vitro // J. Virol. 2000. №74 P. 334-343.

11. Klein M., Hadaschik D., Zimmermann H., Eggers H. J., Nelsen-Salz B. The picornavirus replication inhibitors HBB and guanidine in the echovirus-9 system: the significance of viral protein 2C //J. Gen. Virol. 2000. № 81. P. 895-901.

12. IIarber J. J., Bradley J., Anderson C. W., Wimmer E. Catalysis of poliovirus VPO maturation cleavage is not mediated by serine 10 of VP2 // J. Virol. 1991. № 65. P. 326-334.

13. Nugent C. I., Johnson K. L., Sarnow P., Kirkegaard K. Functional coupling between replication and packaging of poliovirus replicon RNA // J. Virol. 1999. № 73. P. 427-435.21 .http P. //www.zzr.ru/archives/2001/06/article3/article3.html 1

14. Rweyemamu M. M., Leforban Y. Foot-and-mouth disease and international development // Adv. Virus Res. 1999. № 53. P. 111-126.

15. Lewis P. J., Babiuk L. A. DNA vaccines: a review // Adv. Virus Res. 1999. № 54. P. 129-188.

16. Yang N. S., Wang J. IL, Lin K. F. Comparative studies of the capsid precursor polypeptide PI and the capsid protein VP1 cDNA vectors for DNA vaccination against foot-and-mouth disease virus // J. Gene Med. 2005. № 7(6). P. 708-717.

17. Ward G., Rieder E., Mason P. W. Plasmid DNA encoding replicating foot-andmouth disease virus genomes induces antiviral immune responses in swine // J. Virol. 1997. № 71(10). P. 7442-7447.

18. Bachrach H. L. Foot-and-mouth disease virus: properties, molecular biology and immunogenicity // Beltsville Symp. Agric. Res. 1977. № l.P. 3-32.

19. Brooksby, J. B. Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus // Intervirology. 1982. № 18. P. 1-23.

20. Mowat G. N., Brooksby J. B., Pay T. W. Use of BHK 21 cells in the preparation of mouse attenuated live foot-and-mouth disease vaccines for the immunization of cattle//Nature. 1962. № 196. P. 655-666.

21. Martin W. B., Edwards L. T. A field trial in south africa of an attenuated vaccine against foot-and-mouth disease // Research in Veterinary Science. 1965. № 6. P. 196-201.

22. Zhidkov S. A., Sergeev V. A. A study of the properties of attenuated cold variant of type O foot-and-mouth disease virus // Veterinariia. 1969. № 10. P. 29-31.

23. Mowat G. N., Barr D. A., Bennett J. H. The development of an attenuated foot-and-mouth disease virus vaccine by modification and cloning in tissue cultures of BHK21 cells // Archiv fur die gesamte Virusforschung. 1969. № 26(4). P. 341— 354.

24. McKenna T. S., Lubroth J., Rieder E., Baxt B., Mason P. W. Receptor binding site-deleted foot-and-mouth disease (FMD) virus protects cattle from FMD // J. Virol. 1995. № 69. P. 5787-5790.

25. Chinsangara M. J., Mason P. W., Grubman M. J. Protection of swine by live and inactivated vaccines prepared from a leader proteinase deficient serotype A12 foot-and-mouth disease virus//Vaccine. 1998. № 16. P. 1516-1522.

26. Mason P. W., Piccone M. E., McKenna T. S., Chinsangaram J., Grubman M. J. Evaluation of a live-attenuated foot-and-mouth disease virus as a vaccine candidate // Virology. 1997. № 227. P. 96-102.

27. Segundo F. D., Weiss M., Pérez-Martin E., Dias C. C., Grubman M. J., Santos T. L. Inoculation of swine with foot-and-mouth disease SAP-mutant virus induces early protection against disease//J Virol. 2012. Feb. № 86(3). P. 1316-1327.

28. Grubman M. J., Lewis S. A., Morgan D. O. Protection of swine against foot-and-mouth disease with viral capsid proteins expressed in heterologous systems // Vaccine. 1993. № 11(8). P. 825-829.

29. Roosien J., Belsham G. J., Ryan M. D., King A. M., Vlak J. M. Synthesis of foot-and-mouth disease virus capsid proteins in insect cells using baculovirus expression vectors//J. Gen. Virol. 1990. №71. P. 1703-1711.

30. Chinsangaram J., Beard C., Mason P. W., Zellner M. K., Ward G., Grubman M. J. Antibody response in mice inoculated with DNA expressing foot-and-mouth disease virus capsid proteins // Journal of Virology. 1998. № 72(5). P. 4454-4457.

31. Li Z., Yi Y., Yin X., Zhang Z., Liu J. Expression of foot-and-mouth disease virus capsid proteins in silkworm-baculovirus expression system and its utilization as a subunit vaccine // PloS One. 2008. № 3(5). P. e2273.

32. Sanz-Parra A., Blasco R., Sobrino F., Ley V. Analysis of the B and T cell response in guinea pigs induced with recombinant vaccinia expressing foot-and-mouth disease virus structural proteins // Archives of Virology. 1998. № 143(2). P. 389398.

33. Berinstein A., Tami C., Taboga O., Smitsaart E., Carrillo E. Protective immunity against foot-and-mouth disease virus induced by a recombinant vaccinia virus // Vaccine 2000. № 18(21). P. 2231-2238.

34. Ma M., Jin N., Shen G., Zhu G., Liu H. J., Zheng M., Immune responses of swine inoculated with a recombinant fowlpox virus co-expressing P12A and 3C of FMDV and swine IL-18 // Veterinary Immunology and Immunopathology. 2008. № 121. P. 1-7.

35. Mayr G. A., Chinsangaram J., Grubman M. J. Development of replication-defective adenovirus serotype 5 containing the capsid and 3C protease codingregions of foot-and-mouth disease virus as a vaccine candidate // Virology 1999.263(2). P. 496-506.

36. Abrams C. C., King A. M., Belsham G. J. Assembly of foot-and-mouth disease virus empty capsids synthesized by a vaccinia vims expression system // J. Gen. Virol. 1995. № 76. P. 3089-3098.

37. Grubman M. J., Moraes M. P., Schutta C., Barrera J., Neilan J., Ettyreddy D. Adenovirus serotype 5-vectored foot-and-mouth disease subunit vaccines: the first decade//Future Virol. 2010. № 5(1). P. 51-64.

38. Zhang Y. L, Guo Y. J., Wang K. Y, Lu K., Li K., Zhu Y, Sun S. H. Enhanced immunogenicity of modified hepatitis B virus core particle fused with multiepitopes of foot-and-mouth disease virus // Scand J Immunol. 2007. № 65(4). P. 320-328.

39. Strohmaier K., Franze R., Adam K. H. Location and characterization of the antigenic portion of the FMDV immunizing protein // J. Gen. Virol. 1982. № 59. P. 295-306.

40. Kit M., Kit S., Little S. P., Di Marchi R. D., Gale C. Bovine herpesvirus-1 (infectious bovine rhinotracheitis virus) -based viral vector which expresses foot-and-mouth disease epitopes // Vaccine. 1991. № 9(8). P. 564-572.

41. Taboga O., Taini C., Carrillo E. A large-scale evaluation of peptide vaccines against foot-and-mouth disease: lack of solid protection in cattle and isolation of escape mutants //J. Virol. 1997. № 71(4). P. 2606-2614.

42. Wang C. Y, Chang T. Y, Walfield A. M. Effective synthetic peptide vaccine for foot-and-mouth disease in swine // Vaccine. 2002. № 20(19-20). P. 2603-2610.

43. Beignon A. S., Brown F., Eftekhari P. A peptide vaccine administered transcutaneously together with cholera toxin elicits potent neutralising anti-FMDV antibody responses // Vet. Immunol. Immunopathol. 2005. № 104(3-4). P. 273280.

44. Mulcahy G., Gale C., Robertson P., lyisan S., DiMarchi R. D., Doel T. R. Isotype responses of infected virus-vaccinated and peptide-vaccinated cattle to foot-and-mouth disease virus // Vaccine. 1990. № 8, P. 249-256.

45. Mulcahy G., Pullen L. A., Gale C., DiMarchi R. D., Doel T. R. Mouse protection test as a predictor of the protective capacity of synthetic foot-and-mouth disease vaccines//Vaccine. 1991. №9, 19-24.

46. Cartwright B., Chapman W. G., Brown F. Serological and immunological relations between the 146S and 12S particles of foot-and-mouth disease virus // J. Gen. Virol. 1980. № 50(2). P. 369-375.

47. Rowlands D. J., Sangar D. V., Brown F. A comparative chemical and serological study of the full and empty particles of foot-and mouth disease virus // J. Gen. Virol. 1975. № 26(3). P. 227-238.

48. Pay T. W. F., Hingley P. J. Con-elation of 140S antigen dose with the serum neutralising antibody response and the level of protection induced in cattle by foot-and-mouth disease vaccines // Vaccine. 1987. № 5, P. 60-64.

49. Dunn C. S., Samuel A. R., Pullen L. A., Anderson J. The biological relevance of virus neutralisation sites for virulence and vaccine protection in the guinea pig model of foot-and-mouth disease // Virology. 1998. № 247. P. 51-61.

50. McCullough K. C., Desimone F., Brocchi E., Capucci L., Crowther J. R., Kihm U. Protective immune response against foot-and-mouth disease virus // J. Virol. 1992. №66. P. 1835-1840.

51. Aktas S., Samuel A. R. Identification of antigenic epitopes on the foot and mouth disease virus isolate O/Manisa/Turkey/69 using monoclonal antibodies // Revue Scientifique et Technique Office International des Epizooties. 2000. № 19. P. 744753.

52. Baxt B., Vakharia V., Moore D. M., Franke A. J., Morgan D. O. Analysis of neutralising antigenic sites on the surface of type-A12 foot-and-mouth disease virus//J. Virol. 1989. № 63. P. 2143-2151.

53. Bolwell C., Clarke B. E., Parry N. R., Ouldridge E. J., Brown F., Rowlands D. J. Epitope mapping of foot-and-mouth disease virus with neutralizing monoclonal-antibodies // J. Gen. Virol. 1989. № 70. P. 59-68.

54. Mahapatra M., Seki C., Upadhyaya S., Barnett P. V., La Torre J., Paton D. J. Characterisation and epitope mapping of neutralising monoclonal antibodies to A(24) Cruzeiro strain of FMDV // Veterinary Microbiology. 2011. № 149. P. 242247.

55. Thomas A. A. M., Woortmeijer R. J., Puijk W., Barteling S. J. Antigenic sites on foot-and-mouth disease virus type-AlO // J. Virol. 1988a. № 62. P. 2782-2789.

56. Crowther J. R., Rowe C. A., Butcher R. Characterization of monoclonal antibodies against a type SAT 2 foot-and-mouth disease virus // Epidemiol. Infect. 1993a. № 11 LP. 391-406.

57. Klein J. Understanding the molecular epidemiology of foot-and-mouth-disease virus//Infect. Genet. Evol. 2009. № 9(2). P. 153-161.

58. Knowles N. J., Samuel A. R. Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus //Virus Res. 2003. № 91(1). P. 65-80.

59. Rweyemamu M., Roeder P., Mackay D., Sumption K., Brownlie J., Leforban Y, Valarcher J. F., Knowles N. J., Saraiva V. Epidemiological patterns of foot-and-mouth disease worldwide // Transbound Emerg. Dis. 2008. № 55(1). P. 57-72.

60. Doel T. R., Williams L., Barnett P. V. Emergency vaccination against foot-and-mouth disease: rate of development of immunity and its implications for the carrier state // Vaccine. 1994. № 12(7). P. 592-600.

61. Xie Q. C., McCahon D„ Crowther J. R., Belsham G. J., McCullough K. C. Neutralization of Foot-and-Mouth-Disease Virus Can Be Mediated through Any of at Least 3 Separate Antigenic Sites // J. Gen. Virol. 1987. № 68. P. 1637-1647.

62. Fowler V. L., Paton D. J., Rieder E., Barnett P. V. Chimeric foot-and-mouth disease viruses: Evaluation of their efficacy as potential marker vaccines in cattle // Vaccine. 2008. № 26. P. 1982-1989.

63. Fowler V. L., Knowles N. J., Paton D. J., Barnett P. V. Marker vaccine potential of a foot-and-mouth disease virus with a partial VP1 G-H loop deletion // Vaccine. 2010. №28. P. 3428-3434.

64. Rieder E., Baxt B., Lubroth J., Mason P. W. Vaccines prepared from chimeras of foot-and-mouth disease virus (FMDV) induce neutralizing antibodies and protective immunity to multiple serotypes of FMDV // J. Virol. 1994. № 68. P. 7092-7098.

65. Samuel A. R. Genetic and antigenic studies on foot-and-mouth disease virus type O. PhD Thesis. University of HertfordshirE. UK, 1997.

66. Aggarwal N., Barnett P. V. Antigenic sites of foot-and-mouth disease virus (FMDV): an analysis of the specificities of anti-FMDV antibodies after vaccination of naturally susceptible host species // J. Gen. Virol. 2002. № 83. P. 775-782.

67. Thomas A. A. M., Woortmeijer R. J., Barteling S. J., Meloen R. H. Evidence for more than one important neutralising sites on foot-and-mouth disease virus // Archives of Virology. 1988b. № 99. P. 237-242.

68. Mahapatra M., flamblin P., Paton D.J. FMD virus epitope dominance in the antibody response of vaccinated animals // J. Gen. Virol. 2012. № 93. P. 488-493.

69. Collen T. Cell mediated immunity in ruminants: Foot-and-mouth disease (aphthovirus): viral T cell epitopes / CRC Press Inc.; B. M. L. Goddeevis and I. Morrison (ed.): Boca Raton Fla. 1994. PP. 173-197.

70. Collen T., Doel T. R. Heterotypic recognition of foot-and-mouth disease virus by cattle lymphocytes//J. Gen. Virol. 1990. № 71. P. 309-315.

71. Garcia-Briones M. M., Blanco E., Chiva C., Andreu D., Ley V., Sobrino F. Immunogenicity and T cell recognition in swine of foot-and-mouth disease virus polymerase 3D // Virology. 2004. № 1.322(2). P. 264-275.

72. Cox S. J., Barnett P. V., Dani P., Salt J. S. Emergency vaccination of sheep against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission//Vaccine. 1999. № 17. P. 1858-1868.

73. Parida S., Fleming L., Mahapatra M., Hamblin P., Gloster J., Paton D. J. Emergency vaccination of sheep against foot-and-mouth disease: significance and detection of subsequent sub-clinical infection // Vaccine. 2008. № 26. P. 34693479.

74. Francis M. J., Hastings G. Z., Syred A. D., McGinn B., Brown F., Rowlands D. J. Non-responsiveness to a foot-and-mouth disease virus peptide overcome by addition of foreign helper T-cell determinants // Nature. 1987. № 12-18.330(6144). P. 168-170.

75. Collen T., Di Marchi R., Doel T. A., A T cell epitope in VP1 of foot-and-mouth disease virus is immunodominant for vaccinated cattle // J. Immunol. 1991. № 146. P. 749-755.

76. Rodn'guez A., Dopazo J., Sa'iz J.C., Sobrino F., Immunogenicity of nonstructural proteins of foot-and-mouth disease virus: differences between infected and vaccinated swine//Arch. Virol. 1994a. № 136, P. 123-131.

77. Rodrfguez A., Sa'iz J. C., Nombela I. S., Andreu D., Sobrino F., Antigenic specificity of porcine T cell response against foot-and-mouth disease virus: identification of T helper epitopes in YP1 // Virology. 1994b. № 205. P. 24-33.

78. Glass E. J., Oliver R. A., Collen T., Doel T. R., Di Marchi R., Spooner R. L. MHC Class II restricted recognition of FMDV peptides by bovine T cells // Immunology. 1991. № 74. P. 594-599.

79. Beck E., Feil G., Strohmaier K. The molecular basis of the antigenic variation of foot-and-mouth disease virus // EMBO J. 1983. № 2. P. 555-559.

80. Gerner W., Hammer S. E., Wiesmuller K. H., Saalmiiller A. Identification of major histocompatibility complex restriction and anchor residues of foot-and-mouth disease virus-derived bovine T-cell epitopes // J. Virol. 2009. № 83(9). P. 40394050.

81. Blanco E., Garcia-Briones ML, Sanz-Parra A., Gomes P., De Oliveira E., Valero M. L., Andreu D., Ley V., Sobrino F. Identification of T-cell epitopes in nonstructural proteins of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. 2001. № 75(7). P. 3164-3174.

82. Berger H. G., Straub O. C., Ahl R., Tesar M., Marquardt O. Identification of foot-and-mouth disease virus replication in vaccinated cattle by antibodies to nonstructural virus proteins // Vaccine. 1990 № 8(3). P. 213-216.

83. Studier F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures //Protein Express Purif. 2005. № 41. P. 207-234.

84. Fischer R., Hoffmann K., Schillberg A., Emans N. Antibody production by molecular farming in plants // J Biol Regul Hemeost Agents. 2000. № 14. P. 8392.

85. Liénard D., Sourrouille C., Gomord V., Faye L. Pharming and transgenic plants // Biotechnol Ann. Rev. 2007. № 13. P. 115-147.

86. Streatfield S. J. Mucosal immunization using recombinant plant-based oral vaccines // Methods. 2006. № 38(2). P. 150-157.

87. Tacket C. O. Plant-derived vaccines against diarrheal diseases // Vaccine. 2005. № 23 P. 1866-1869.

88. Bevan M. W., Flavell R. B., Chilton M. D. A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation // Nature. 1983. № 304. P. 184— 187.

89. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants // Nature. 1989. № 342. P. 76-78.

90. Barta A., Sommengruber K., Thompson D., Hartmuth K., Matzke M. A., Matzke A. J. M. The expression of a napoline synthase human growth hormone chimeric gene in transformed tobacco and sunflower callus tissue // Plant. Mol. Biol. 1986. № 6. P. 347-357.

91. Hood E. E., Witcher D. R., Maddock S., Meyer T., Baszczynski C., Bailey M. Commercial production of avidin from transgenic maize: characterization of transformant production, processing, extraction and purification // Mol. Breed. 1997. №3 P. 291-306.

92. Mason H. S., Warzecha H., Mor T., Arntzen C. J. Edible plant vaccines: applications for prophylactic and therapeutic molecular medicine // Trends Mol. Med. 2002. № 8 P. 324-329.

93. Tiwari S., Verma P. C., Singh P. K., Tuli R. Plants as bioreactors for the production of vaccine antigens // Biotechnol. Adv. 2009. № 27(4). P. 449-467.

94. Horn M. E., Woodard S. L., Howard J. A. Plant molecular farming: systems and products // Plant Cell Rep. 2004. № 22. P. 711-720.

95. Sijmons P. C., Dekker B. M., Schrammeijer B., Verwoerd T. C., van den Elzen P. J., Hoekema A. Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants//Biotechnology. 1990. № 8. P. 217-221.

96. Edelbaum O., Stein D., Holland N., Gafni Y., Livneh O., Novick D., Rubinstein M., Sela I. Expression of active human interferon-b in transgenic plants // J. Interferon Res. 1992. № 12. P. 449-453.

97. Kusnadi A. Production of recombinant proteins in transgenic plants: practical considerations // Biotechnology and Bioengineering. 1997. № 56. P. 473-484.

98. Nandi S., Yalda D., Lu S., Nikolov Z., Misaki R., Fujiyama K., Huang N. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain // Transgenic Res. 2005. № 4(3). P. 237-249.

99. Rybicki E. P. Plant-produced vaccines: promise and reality // Drug Discov. Today. 2009. № 14(1-2). P. 16-24.

100. Meyers B., Zaltsman A., Lacroix B., Kozlovsky S. V., Krichevsky A. Nuclear and plastid genetic engineering of plants: comparison of opportunities and challenges // Biotechnol. Adv. 2010. № 28(6). P. 747-756.

101. Molina A., Veramendi J., Herväs-Stubbs S. Induction of neutralizing antibodies by a tobacco chloroplast-derived vaccine based on a B cell epitope from canine parvovirus // Virology. 2005. № 25.342(2). P. 266-275.

102. Bally J., Nadai M., Vitel M., Rolland A., Dumain R., Dubald M. Plant physiological adaptations to the massive foreign protein synthesis occurring in recombinant chloroplasts // Plant Physiol. 2009. № 150. P. 1474-1481.

103. Singh A. K., Verma S. S. Plastid transformation in eggplant (Solatium melongena L.) // Transgenic Res. 2010. № 19. P. 113-119.

104. Kapila J., De Rycke R., van Montagu M., Angenon G. An agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves // Plant Sci. 1997. № 122. P. 101-108.

105. Marillonnet S., Thoeringer C., Kandzia R., Klimyuk V., Gleba Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants //Nat. Biotechnol. 2005. № 23. P. 718-723.

106. Gleba Y, Klimyuk V., Marillonnet S. Viral vectors for the expression of proteins in plants // Curr. Opin. Biotechnol. 2007. № 18(2). P. 134-141.

107. Turpen T. IT, Reinl S. J., Charoenvit Y, Hoffman S. L., Fallarme V., Grill L. K. Malarial epitopes expressed on the surface of recombinant tobaccomosaic virus // Biotechnol. 1995. № 13. P. 53-57.

108. Klimyuk V., Marillonnet S., Knaeblein J., McCaman M., Gleba Y. Modem Biopharmaceuticals: Production of recombinant proteins in plants / Edited by Knaeblein J; WILEY-VCH P. Verlag: GmbH & Co. KGaA, 2005.PP. 893-917.

109. Gils M., Kandzia R., Marillonnet S., Klimyuk V., Gleba Y. High-yield production of authentic human growth hormone using a plant virus-based expression system // Plant Biotechnol. J. 2005. № 3. P. 613-620.

110. Dorokhov Y. L., Sheveleva A. A., Frolova O. Y., Komarova T. V., Zvcreva A. S., Ivanov P. A., Atabekov J. G. Superexpression of tuberculosis antigens in plant leaves//Tuberculosis (Edinb). 2006. №61. P. 342-541.

111. Yusibov V., Hooper D., Spitsin S., Fleysh N., Kean R., Mikheeva T., Deka D., Karasev A., Cox S., Randall J., Koprowski H. Expression in plants and immunogenicity of plant virus-based experimental rabies vaccine // Vaccine. 2002. №20. P. 3155-3164.

112. Massa S., Franconi R., Brandi R., Muller A., Mett V., Yusibov V. Anti-canccr activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine // Vaccine. 2007. № 25. P. 30183021.

113. Yusibov V., Rabindran S., Commandeur U., Tvvyman R. M., Fischer R. The potential of plant virus vectors for vaccine production. Drugs R. D. 2006. № 7(4). P. 203-217.

114. Brennan F. R., Gilleland L. B., Staczek J., Bendig M. M., Hamilton W. D., Gilleland II. E. Jr. A chimaeric plant virus vaccine protects mice against a bacterial infection//Microbiology. 1999. № 145. P. 2061-2067.

115. Franconi R., Massa S., Illiano E., Mullar A., Cirilli A., Accardi L. Exploiting the plant secretory pathway to improve the anticancer activity of a plant-derived HPV16 E7 vaccine // Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 2006. № 19. P. 187-197.

116. Pogue G. P., Lindbo J. A., Garger S. J., Fitzmaurice W. P. Making an ally from an enemy: plant virology and the new agriculture // Annu. Rev. Phytopathol. 2002. № 40. P. 45-74.

117. Hamilton A. J., Baulcombe D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants // Science. 1999. № 286. P. 950-952.

118. Kasschau K. D., Carrington J. C. A counterdefensive strategy of plant viruses: suppression of posttranscriptional gene silencing // Cell. 1998. № 95. P. 461-470.

119. Rouwendal G. J., Mendes O., Wolbert E. J. II., Boer A. D. Enhanced expression in tobacco of the gene encoding green fluorescent protein by modification of its codon usage // Plant Mol. Biol. 1997. № 33(6). P. 989-099.

120. Kawabe A., Miyashita N. T. Patterns of codon usage bias in three dicot and four monocot plant species. // Genes Genet Syst. 2003. № 78(5). P. 343-352.

121. Sullivan M. L., Green P. J. Post-transcriptional regulation of nuclear-encoded genes in higher plants: the roles of mRNA stability and translation // Plant Mol. Biol. 1993. № 23 (6). P. 1091-1104.

122. Mishra S., Yadav D. K., Tuli R. Ubiquitin fusion enhances cholera toxin B subunit expression in transgenic plants and the plant-expressed protein binds GM1 receptors more efficiently // J. Biotechnol. 2006. № 127. P. 95-108.

123. Usha R., Rohll J. B., Spall V. E., Shanks M., Maule A. J., Johnson J. E., Lomonossoff G. P. Expression of an animal virus antigenic site on the surface of a plant virus particle//Virology. 1993. № 197(1). P. 366-374.

124. Wu L., Jiang L., Zhou Z., Fan J., Zhang Q, Zhu H., Han Q, Xu Z. Expression of foot-and-mouth disease virus epitopes in tobacco by a tobacco mosaic virus-based vector//Vaccine. 2003. № 1.21(27-30). P. 4390-4398.

125. Carrillo C , Wigdorovitz A , Oliveros J. C. Protective immune response to foot-and-mouth disease virus with VP1 expressed in transgenic plants // J. Virol. 1998. №72. P. 1688-1690.

126. Wigdorovitz A., Carrillo C., Trono K. Induction of a virus-specific antibody response to foot and mouth disease virus using the structural protein VP1 expressed in transgenic potato plants // Virol. Immunol. 2001. № 14. 49-57.

127. Wang D. M., Zhu J. B., Peng M., Zhou P. Induction of a protective antibody response to FMDV in mice following oral immunization with transgenic Stylosanthes spp. as a feedstuff additive // Transgenic Res. 2008. № 17. P. 63-70.

128. Li Y., Sun M., Liu J., Yang Z., Zhang Z., Shen G. High expression of foot-and-mouth disease virus structural protein VP1 in tobacco chloroplasts // Plant Cell Rep. 2006. № 25(4). P. 329-333.

129. Sun M., Qian K., Su N., Chang IT, Liu J., Shen G. Foot-and-mouth disease virus VP1 protein fused with cholera toxin B subunit expressed in Chlamydomonas reinhardtii chloroplast // Biotechnol Lett. 2003. № 25(13). P. 1087-1092.

130. Wang Y., Shen Q., Jiang Y., Song Y., Fang L., Xiao S., Chen FI. Immunogenicity of foot-and-mouth disease virus structural polyprotein PI expressed in transgenic rice//J. Virol Methods. 2012. № 181(1). P. 12-17.

131. Folimonov A. S., Folimonova S. Y., Bar-Joseph М., Dawson W. О. A stable RNA virus-based vector for citrus trees //Virology. 2007. № 10.368(1). P. 205-216.

132. Grubman M. J., Morgan D. O., Kendall J., Baxt B. Capsid intermediates assembled in a foot-and-mouth disease virus genome RNA-programmed cell-free translation system and in infected cells//J. Virol. 1985. №56(1). P. 120-126.

133. Chayen N. E. Turning protein crystallisation from an art into a science // Curr. Opin. Struct. Biol. 2004. № 14(5). P. 577-583.

134. Schein C. PI. Production of soluble recombinant proteins in bacteria // Biotechnology. 1989. №7. P. 1141-1148.

135. Arnau J., Lauritzen C., Petersen G. E., Pedersen J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins // Protein Expr. Purif. 2006. № 48(1). P. 1-13.

136. Определение протективного действия полученного в растительной системе экспрессии рекомбинантного полиэпитопного белка вируса ящура на морских свинках.1. Тестируемый препарат

137. Препарат кандидатной вакцины ГПЭ растворен в 10 мл буфера A4 (10 мМ Tris-HCl pH 8.0; 4M мочевина) в концентрации 0,8 мг/мл. Визуально кандидатная вакцина представляет собой прозрачную жидкость. Условия хранения температура минус 20°С.

138. Способ введения препарата и доза

139. Четвертая группа из 8 морских свинок, которым белок не вводили, была контрольной. Морских свинок иммунизировали однократно.

140. Заражение морских свинок вирусом ящура

141. Для оценки достоверности полученных результатов иммунизации использовали биномиальный тест с уровнем значимости (а) равным 0,005.1. РЕЗУЛЬТАТЫ

142. Однократная иммунизация морских свинок выделенным из растений препаратом рекомбинантного полиэпитопного белка вируса ящура обеспечивает защиту животных от заражения вирусом ящура О/Тайвань/99 при использовании дозы препарата 120 и 350 мкг.

143. Тестирование протективного действия полученного в бактериальной системе экспрессии рекомбинантного полиэпитопного белка вируса ящура на морских свинках.1. Тестируемый препарат

144. Препарат кандидатной вакцины ГПЭ растворен в 5 мл буфера А4 (10 мМ Tris-HCl рН 8.0; 4М мочевина) в концентрации 1,4 мг/мл. Визуально кандидатная вакцина представляет собой прозрачную жидкость. Условия хранения температура минус 20°С.

145. Способ введения препарата и доза

146. Четвертая группа из 8 морских свинок, которым белок не вводили, была контрольной. Морских свинок иммунизировали однократно.

147. Заражение люрских свинок вирусом ящура

148. Для оценки достоверности полученных результатов иммунизации использовали биномиальный тест с уровнем значимости (а) равным 0,005.1. РЕЗУЛЬТАТЫ

149. ГД5о -доза, вызывающая гибель 50% чувствительных клеток in vitro7

Информация о работе

Андрианова, Екатерина Павловна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Получение рекомбинантных антигенов вируса ящура О/Тайвань/99, перспективных для разработки противоящурных вакцин, с использованием бактерий и растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы