Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Математическое моделирование и прогнозирование процесса деградации пептидных соединений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Математическое моделирование и прогнозирование процесса деградации пептидных соединений"

}

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ Институт биоорганической химии

РГВ од

УДК577Л 21^1)1)

ТОНКОВИЧ ИРИНА НИКОЛАЕВНА

МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА ДЕГРАДАЦИИ ПЕПТИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

03.00.04 -биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Минск - 2000

Работа выполнена в лаборатории биоорганической химии Института биоорганической химии Национальной академии наук, г. Минск

Научный руководитель: доктор биологических наук

В.П. Голубович

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Д.И. Метелица

доктор биологических наук, член-корреспондент, профессор А.Г. Мойсеенок

Оппонирующая организация: Белорусский государственный

университет

СО

Защита состоится " 16." ноября_2000 г. в часов

на заседании Совета по защите диссертаций Д 01.21.01 в Институте внпоргянической химии HAH Беларуси по адресу: 220141, г. Минск, ул. Купревича, 5/2; тел. 264-85-53.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии НАН Беларуси.

Автореферат разослан "14" октября 2000 г.

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций,

кандидат химических наук Литвинко

ЕМ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

JIT - РГ5.8 - тетрапептидный фрагмент люлиберина

АКТГ - кортикотропин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

УРАИ - условная реакция активного избегания

ЭЭДХ - 1-этоксикарбонил, 2-этоксидигидрохинолин

АОК - антителообразующие клетки

Gly (G) - глицин

Ala (А) - аланин

Val (V) - ватин

Leu(L) - лейцин

Ile (I) - изолейцин

Ser (S) - серин

Thr (Т) - треонин

Cys (С) - цистеин

Met (M) - метионин

Pro (Р) - пролин

Lys (К) - лизин

Arg (R) - аргинин

His (H) - гистидин

Asp (D) - аспарагиновая кислота

Asn (N), Asp(NH2) - аспарагин Glu (E) - глутаминовая кислота

Gin (Q), G1u(NH2) - глутамин Phe (F) - фенилаланин

Туг (Y) - тирозин

Tip (W) - триптофан

SP - вещество P

FTS - сывороточный фактор тимуса

LET - одномерный массив, предназначенный для хранения аминокислотной последовательности пептида MPROT - одномерный массив, предназначенный для хранения номеров пептидаз, действующих на данную пептидную связь SAK - одномерный массив, предназначенный для хранения номеров пептидных связей, подверженных специфичному действию ферментов для данного фрагмента MVR - двумерный массив, предназначенный для хранения путей

деградации пептида Frag.exe, Sort.exe - программный комплекс

ВВЕДЕНИЕ

Пептиды представляют собой уникальную группу природных биорегуляторов, образующихся в тканях человека и животных. Соединения этого типа отличаются высокой специфичностью, способностью функционировать в очень низких концентрациях, многообразием биологических эффектов.

В то же время многофункциональность пептидов, кратковременность действия, сложность структуры являются серьезным препятствием к их практическому применению. Актуальной задачей является изучение механизмов действия пептидов, причем центральное место занимают вопросы исследования принципов передачи информации этими соединениями.

Современное понимание процессов действия пептидных биорегуляторов показывает, что, наряду с самими пептидами, самостоятельной биологической активностью обладают их фрагменты, образующиеся в процессе ферментативной деградации.

Однако на сегодняшний день возможность образования различных фрагментов пептидных биорегуляторов изучена недостаточно:

- не существует методов, позволяющих наблюдать поэтапность расщепляющих процессов, приводящих к полной деградации пептидных молекул под действием ферментов;

- не проводились исследования по выявлению возможных путей деградации пептидных биорегуляторов, что, несомненно, важно для понимания интегральных эффектов природных пептидов;

- не проводились исследования по выявлению различных фрагментов пептидных биорегуляторов, которые могут присутствовать в биологической жидкости в результате процесса деградации пептидов под действием ферментов, что позволило бы анализировать эти фрагменты как в смеси, так и по отдельности.

В настоящее время ведется поиск модифицированных аналогов пептидных биорегуляторов, обладающих селективным действием, устойчивостью к энзиматической деградации (пролонгированное действие). Актуальной задачей является изучение возможности получения новых аналогов на основе фрагментов, образующихся в результате деградации пептидного биорегулятора под действием ферментов.

Рассмотрение указанных выше аспектов действия пептидных биорегуляторов потребовало теоретического изучения процесса деградации этих соединений под действием ферментов, что и было сделано нами в данной работе.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Изучение функционирования биологических молекул, среди которых пептиды занимают, несомненно, важное место, является одной из актуальных задач биохимии и молекулярной

биологии. Одно из важнейших направлений, развиваемых в настоящее время, связано с представлениями о том, что регуляция и координирование функций организма может осуществляться за счет фрагментов, образующихся в результате ферментативного метаболизма. В связи с этим данная работа, посвященная теоретическому исследованию процесса деградации пептидных соединений, является актуальной. Изучение возможности ферментативного образования фрагментов и их дальнейшего расщепления позволит прогнозировать соединения, обладающие монофункциональной биологической активностью и устойчивостью к действию ферментов (пролонгированное действие), что в дальнейшем может быть использовано для создания лекарственных препаратов.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертационная работа выполнена в 1988 - 2000 гг. в лаборатории биоорганической химии Института биоорганической химии НАН Беларуси в рамках одного из разделов Государственной программы "Биооргсинтез" -"Исследование роли белков, нуклеиновых кислот и липидов в функционировании клетки" по темам: "Изучение влияния пептидов на гомеостаз человека, включающее пептид - рецепторное взаимодействие, мембранный транспорт и другие механизмы" (номер госрегистрации 19961102) и "Изучение межмолекулярных взаимодействий биологически активных пептидов и белков при сорбционной детоксикации с целью создания -искусственных органов" (номер госрегистрации 19961103).

Цель и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы являлось прогнозирование процесса деградации пептидных соединений с помощью методов математического моделирования. Для достижения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

• разработать теоретические подходы к моделированию процесса деградации пептидных биорегуляторов под действием ферментов крови;

• провести моделирование процесса деградации пептидов с помощью разработанных подходов для следующих природных биорегуляторов: вещество Р, вазопрессин, люлиберин, литорин, сывороточный фактор тимуса;

• использовать результаты моделирования для прогнозирования фрагментов и их аналогов, обладающих селективным действием, более высокой биологической активностью и пролонгированным действием;

• создать базу данных по ферментам крови;

• разработать программное обеспечение для моделирования процесса деградации пептидов.

Объект и предмет исследования. Объекты исследования: природные пептиды различных классов - гипоталамические гормоны (люлиберин), нейрогипофизарные гормоны (вазопрессин), бомбезиноподобные пептиды

(литорин), тахикинины (вещество Р), пептиды с иммунологическим действием (сывороточный фактор тимуса).

Предмет исследования: процессы биологической трансформации природных соединений человека и животных.

Методология и методы проведенного исследования. В диссертационной работе успешно использованы следующие методы исследования:

- методы математического моделирования (создание моделей биологических процессов, разработка и создание алгоритмов для моделирования этих процессов - деградации пептидных соединений под действием ферментов крови, создание программного обеспечения для реализации разработанных алгоритмов);

- методы теории вероятности (определение вероятностных характеристик метаболизма);

- методики синтеза (синтез пептидов в растворе);

- аналитические методы идентификации соединений (тонкослойная хроматография и хроматография высокого разрешения на аналитическом жидкостном хроматографе ХЖ-1309);

- методы исследования различных видов активности (анальгетической активности - метод "tail-flick"; поведенческой активности - измерение двигательной активности на приборе "Оптоваримекс" (США), изучение ориентировочно-исследовательской реакции в норковой камере, исследование выработки условной реакции активного избегания; метод локального гемолиза - для определения антителобразующих клеток в агарозе и в сыворотке - титр гемагглютининов).

Научная новизна и значимость полученных результатов. Впервые разработаны теоретические основы прогнозирования процесса деградации пептидных соединений.

Разработанная нами методика позволит:

- рассматривать процесс деградации пептидных соединений до отдельных аминокислот;

- определять различные фрагменты, образующиеся в процессе деградации под действием ферментов крови.

В настоящее время активно ведется поиск модифицированных аналогов пептидных биорегуляторов, обладающих селективным действием, устойчивостью к ферментативной деградации. Проведенное нами исследование возможности ферментативного расщепления пептидов и их фрагментов позволит выбирать пути модифицирования природных биорегуляторов с целью их защиты от расщепления пегстидазами, а значит пролонгирования их функционального действия.

Дан прогноз фрагментов, отвечающих за проявление определенного вида активности для ряда пептидных биорегуляторов: вещество Р, вазопрессин, люлиберин, литорин.

Практическая значимость полученных результатов. Разработанный подход может быть использован для изучения процесса деградации пептидных соединений под действием различного набора ферментов в зависимости от предполагаемой среды их локализации. Данная методика прошла проверку при прогнозировании процесса деградации следующих пептидов: вещество Р, вазопрессин, люлиберин, литорин, сывороточный фактор тимуса.

На основании полученных прогнозов синтезированы аналоги пептидных биорегуляторов, имеющие монофункциональную активность. Полученные аналоги значительно превосходят по активности природные биорегуляторы и оказывают свое действие в дозах в несколько раз, а иногда на несколько порядков меньших, чем для природных соединений.

В настоящее время проводятся углубленные биологические испытания аналогов вазопрессина.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Теоретическое моделирование процесса деградации пептидных биорегуляторов.

2. Программный комплекс для моделирования процесса деградации пептидных соединений и созданная база данных по ферментам крови.

3. Результаты прогнозирования фрагментов, образующихся с наибольшей вероятностью, для следующих пептидных соединений: вещества Р, вазопрессина, люлиберина, литорина, сывороточного фактора тимуса.

4. Прогноз возможных модификаций природных биорегуляторов с целью их защиты от действия пептидаз.

5. Новые аналоги пептидных биорегуляторов.

Личный вклад соискателя. Лично автором выполнено следующее:

- разработаны теоретические подходы к моделированию процесса деградации пептидных соединений под действием ферментов крови;

- проведено моделирование процесса деградации пептидов с помощью разработанных подходов для вещества Р, вазопрессина, люлиберина, литорина, сывороточного фактора тимуса;

- получены наборы фрагментов, образующиеся с наибольшей вероятностью;

- дан прогноз возможных модификаций природных биорегуляторов с целью их защиты от расщепления пептидазами;

- создана база данных по ферментам крови;

- разработан программный комплекс для моделирования процесса деградации пептидных соединений.

Синтез веществ, использовавшихся в работе, проведен сотрудниками Института биоорганической химии HAH Беларуси - к.х.н. Егоровой C.B., к.х.н. Галюк E.H., к.х.н. Мартинович В.П. Биологическое тестирование вещества Р и

его фрагментов на спазмогеннуто активность выполнено сотрудницей Института биоорганической химии Пташкиной Л.П.; вазопрессина и его фрагментов (на поведенческую активность), люлиберина и его фрагментов (на аналгетическую активность) - коллегами из МГУ им. М.В. Ломоносова (кафедра академика РАМН И.П. Ашмарина); литорина и его фрагментов на терморегуляционную активность выполнено коллегами из Института химической физики РАН (под руководством к.б.н. Емельяновой Т.Г.); сывороточного фактора тимуса и его аналогов на иммунотропнуто активность -коллегами из Санкт-Петербургского госуниверситета.

Тема работы и планы ее проведения предложены научным руководителем, который принимат также участие в обсуждении результатов и их оформлении в виде статей.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы докладывались на VII Республиканской конференции молодых ученых - химиков ЭССР (Тарту, 1987), на XX школе по автоматизации научных исследований (Чолпон - Ата, 1987), на II Международном симпозиуме по молекулярным аспектам химотерапии (Гданьск, 1988), на 9 Молодежной конференции по синтетическим и природным физиологически активным соединениям (Ереван, 1988), на Всесоюзном симпозиуме с участием иностранных специалистов "Структура иммунорегуляторных пептидов" (Москва, 1988), на Межреспубликанской научно - практической конференции "Синтез, фармакология и химические аспекты новых психотропных и сердечно - сосудистых веществ" (Волгоград, 1989), на Всесоюзной научной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы" (Москва, 1989), на VI Межуниверситетской конференции "Биологические мембраны в норме и патологии" (Кутаиси, 1989), на Республиканской научной конференции "Математическое моделирование и вычислительная техника" (Гродно, 1989), на II Международном конгрессе теоретической органической химии (Торонто, 1990), на 1 Международной научной конференции "Социально - экономическое развитие Республики Беларусь на рубеже XX и XXI веков: анализ, перспективы" (Гродно, 1997), на III съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1998), на IV съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск,2000).

Опубликованность результатов. Основные результаты диссертации отражены в 5-ти статьях, тезисах 11-ти докладов и авторском свидетельстве. Общее количество страниц опубликованных материалов -38.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы (глава 1), основной части, содержащей теоретическое исследование процесса деградации пептидных соединений различных классов под действием ферментов крови (главы 2 - 4),

анализа результатов прогноза на основе экспериментальных данных (глава 5), заключения, списка литературы и приложения.

Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка, 40 таблиц, библиография составляет 249 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Пептиды и их роль в организме человека и животных. Пептиды, являясь переносчиками оперативной информации, образуют в организме самостоятельную систему регуляции, в значительной степени обеспечивающую интеграцию основных процессов жизнедеятельности. Эти соединения участвуют в регулировании различных видов обмена веществ, гормональной секреции, иммунных реакций, деятельности внутренних органов (сердца, почек, легких, органов пищеварительной системы) и множестве других процессов. Большой интерес к пептидам обусловлен тем, что они влияют на важнейшие функции центральной нервной системы и, как следствие, всей центральной нервной деятельности (в процессах обучения, памяти, сна, бодрствования и Т.д.).

Изучение многочисленных данных о действии фрагментов пептидных биорегуляторов (вещество Р, вазопрессин, люлиберин, литорин) на различные функции организма приводят к заключению, что наряду с самими природными пептидами самостоятельной биологической активностью могут обладать фрагменты, образующиеся в результате деградации пептидов под действием ферментов.

Показано, что на основе фрагментов, образующихся в процессе ферментативной деградации пептидных биорегуляторов, возможно целенаправленное изыскание селективно действующих, пролонгированных соединений. Информация, имеющаяся в литературе, касается в основном ферментативного образования отдельных фрагментов из природного биорегулятора, а данные о процессе дальнейшего ферментативного расщепления метаболических фрагментов отсутствуют. Актуальной задачей является изучение устойчивости пептидов к ферментативному расщеплению.

В настоящее время идет накопление экспериментальных материалов по изучению процессов ферментативной деградации пептидных биорегуляторов, которые судя по литературным данным, не столь многочисленны (рассмотрена только возможность образования некоторых отдельных фрагментов пептидов). Нет теоретических работ, позволяющих прогнозировать различные метаболические фрагменты природных пептидов. Недостаточно изучена роль фрагментов олигопептидов в проявлении биологических эффектов.

Решение этих вопросов потребовало теоретического изучения процесса деградации пептидных биорегуляторов протеолитическими ферментами.

Моделирование процесса деградации пептидов. Одним из возможных подходов к изучению процесса деградации под действием ферментов является математическое моделирование. Ставя задачу теоретического исследования деградации пептидов под действием ферментов крови, нами предложена модель, представляющая собой "кровь" с локализованными в ней ферментами [1,4,5,8,9,11-16].

В исследованиях процессов метаболического образования фрагментов мы руководствовались следующим:

1. в крови локализовано 20 ферментов, известных в настоящее время;

2. специфичность протеаз кровяного русла определяется по виду атакуемой связи:

Б

А5 - А4 - Аз - А2 - Ар - А'г А'г

где

А;, А^ - аминокислоты, Р - фермент, действующий на пептидную связь. Условия специфичности ферментов представлены в табл.1.

Таблица 1

Специфичность ферментов, использовавшихся для исследования _деградации пептидов_

Название фермента Условия специфичности

Катепсин G А, = {F,L,Y}, А 2= {P,A,L}, А3 * {Р} Aj, As- любая амк-та

Плаз мин Ai = |R,K) ,А i Ф {Р}

Тромбин А,= {R,K}, А2= {AP,V,L,I,G,S,D} А ',= ÍAG,V,I,S,T,D,H,C}

Эластаза А, = {V>I>A>T}, А2= {P>A>L}, Аз = {Р,А}

Аминопептидаза А Ai = {D,E}, кг - должна отсутствовать ,A'i ^ {Р}

Аминопептидаза В Aj = {L,M,G,K,R,F}, А2 - должна отсутствовать А',*Р

Аминопептидаза М А, = {A,L,M,K,C,F,G>P}, A', * Р Аг - должна отсутствовать, А\ = {A,L,M,G,F,K}

Аминопептидаза N Ai={R>L>M>F>D>K>V»G} Аг- должна отсутствовать

Leu-аминопептидаза Ai = {AL,M,F,R,Y,K}, А2- должна отсутствовать А',*{Р}

Ар иламино пептидаза Ai = {Y,W,F}, А2 - должна отсутствовать A'i * {P¡,A'2 - наличие обязательно

Пептидилдипептидаза А Ai- любая аминокислота, A'i (Р} А'з - должна отсутствовать

_Продолжение табл. 1

Дипептидиламинопептидаза I А1 - любая аминокислота кроме Р Аз - должна отсутствовать, А'1 * {Р}

Дипептидиламинопептидаза II А2 = {К>К>Ь>А,М,8,0} А5 - должна отсутствовать

ДипептидиламинопептидазаШ А2 = {Ъ,А,У,11,ДН}

Дипептидиламинопептидаза IV А[ = {А,Р}, А2 - любая аминокислота кроме С Ад - должна отсутствовать, А'1 * (Р}

Карбоксипептидаза А А] = (Р},А'1 * {РД,К},А'2 - должна отсутствовать

Карбоксипептидаза В А1 = {Р}, А'| = {ЦКД,Р),А'2 - должна отсутствовать

Карбоксипептидаза С А, = {Р},А',= {АЛ,Ь>Р}и А', * {Р} А'г - должна отсутствовать

Карбоксипептидаза N А = ¡Ь,КД,Р) ,А - должна отсутствовать

Пролил эндопептидаза А, = {А,Р}, А', * {Р}

Основная идея моделирования заключается в следующем. Пептид, попадая в кровь, подвергается действию ферментов. Возможность расщепления пептидной связи определяется специфичностью ферментов. Процедура проверки условий специфичности действия ферментов проводится для всех пептидных связей в молекуле биорегулятора. Выбор ферментов из базы данных осуществляется их последовательным перебором. В результате

фрагменты. Процедура определения дальнейшей возможности образования метаболических фрагментов из фрагментов-предшественников повторяется. Конкретный фрагмент может образовываться на разных этапах деградации. Под этапом деградации будем понимать единичный акт расщепления пептидной связи.

Процесс деградации пептида считается завершенным, если пептид распадается на отдельные аминокислоты или фрагменты, не подлежащие дальнейшему расщеплению.

Описанная выше методика моделирования позволяет представить процесс деградации пептидов в виде графической модели, изображенной на рис. 1.

Как видно из этой модели, весь процесс возможного образования фрагментов ,1=1,п-1, j=l,m (п - число этапов деградации, т - число фрагментов) на каждом этапе деградации Б; , 1=1 ,п-1 строится на основе анализа возможности расщепления фрагментов, полученных на предыдущем этапе деградации Бм (¡=1,п-2).

Для пептида длиной п аминокислотных остатков максимальное число этапов деградации (Мэт) определяется формулой:

N„=11-1

(1)

Рис. 1. Процесс деградации пептидов под действием ферментов где

Р- пептидный биорегулятор;

Р'з - _)-тый метаболический фрагмент, образующийся на ¡-том этапе деградации (¡=1 ,р; j=l,m; р- число этапов деградации; т-число фрагментов на ¡-том этапе деградации);

Е^ - набор ферментов, участвующий в образовании фрагментов Р'к и Б^и

Разработанная методика теоретического моделирования процесса деградации пептидов под действием ферментов позволяет:

1. определять все возможные пути расщепления пептида ;

2. определять возможные фрагменты пептида, образующиеся в результате ферментативной деградации;

3. представлять картину образования фрагментов на каждом этапе деградации;

4. определять все возможные пути образования и расщепления каждого фрагмента;

5. для данного фрагмента определять пути его протеолитического образования из фрагментов-предшественников;

6. для данного фрагмента определять условия его протеолитического расщепления (установление ферментативных актов, приводящих к расщеплению данного фрагмента).

Полученная информация (пункт 6) важна при получении соединений пролонгированного действия, для проведения исследований по ингибированию протеаз.

Знание всех путей образования и расщепления данного фрагмента имеет значение для последующего синтеза пептидов. Возможен план синтеза вещества с учетом получения требуемых фрагментов, что в конечном итоге позволяет уменьшить затраты на проведение синтеза и сократить время его проведения.

Проведенное нами исследование процесса деградации пептидов под действием протеолитических ферментов крови позволяет не только устанавливать возможность образования метаболических фрагментов, но и давать количественную оценку вероятности такого образования.

Решение поставленной задачи возможно в терминах теории вероятности. Анализ вероятностных характеристик метаболизма предполагает определение:

1) вероятности разрыва той или иной пептидной связи в структуре молекулы как величину:

т

п = ——

(2)

,т>

/=1

-где-----

Р, - вероятность разрыва связи ш, - число пептидаз, действующих на 1 - ю связь, п - число пептидных связей в молекуле.

2) вероятности появления определенного фрагмента в результате

действия ферментов как величину:

= <3>

где

N - число различных вариантов расщепления молекулы пептида, N у - число вариантов расщепления пептида, в которых появился данный фрагмент (к,1).

3) вероятности образования фрагмента на данном этапе деградации как величину:

* К

(4)

где

Р к,11 - вероятность появления фрагмента (к,1) на ¡-том этапе деградации (к,1 -соответственно номер аминокислоты на N и С - конце последовательности), Му1 - число вариантов расщепления пептида, в которых появился интересующий нас фрагмент пептида на данном этапе деградации,

N - число вариантов ферментативного расшепления молекулы биорегулятора.

Формулы (2)-(4) позволяют определять фрагменты, образующиеся в процессе деградации, с наибольшей вероятностью.

Описание программного комплекса, разработанного для моделирования процесса деградации пептидных соединений. Разработанное программное обеспечение для моделирования процесса деградации пептидов под действием ферментов крови, потребовало создания базы данных о специфичности экзо- и эндопептидаз, принимающих участие в расщеплении пептидов и комплекса специальных и поисковых процедур, позволяющих проанализировать метаболизм пептидных соединений и дать анализ их вероятностных характеристик [1,9,12,13,15,16].

База данных о специфичности действия ферментов содержит информацию о 20 пептидазах крови. Основу работы с базой данных составляет программный модуль, который предназначен для определения пептидаз, действующих на данную пептидную связь.

Основу комплекса программ, предназначенного для моделирования процесса деградации пептидов, составляет набор модулей, осуществляющих следующие стадии анализа:

1. выявление фрагментов пептидного биорегулятора, образующихся в процессе деградации пептидного соединения на каждом этапе деградации;

2. исследование условий ферментативного образования фрагментов, что предполагает определение для каждого метаболического фрагмента его предшественников и выявление набора пептидаз, действие которых приводит к появлению данного фрагмента;

3. исследование условий ферментативного расщепления фрагментов, что предполагает выявление пептидных связей, подверженных специфичному действию ферментов и установление пептидаз, принимающих участие в этом процессе;

4. определение вероятностных характеристик фрагмента: вероятность образования фрагмента на каждом этапе деградации; общая вероятность образования этого фрагмента в процессе деградации пептидного биорегулятора, вероятность расщепления определенной пептидной связи;

5. определение всех возможных путей деградации пептида.

Все программные модули написаны на языке программирования Фортран и реализованы на персональном компьютере. Блок-схема программного комплекса, разработанного для моделирования процесса деградации пептидов представлена на рис.2.

Прогнозирование фрагментов, образующихся в процессе деградации под действием ферментов крови, для пептидных соединений различных классов. Материал этой главы посвящен теоретическому исследованию возможности образования метаболических фрагментов пептидных биорегуляторов различных классов и выяснению их роли в проявлении

Рис.2 Блок-схема анализа деградации пептидов под действием ферментов крови

различных видов биологической активности: вещества Р -спазмогенной, вазопрессина - поведенческой, люлиберина - аналгетической, литорина - терморегуляционной, сывороточного фактора тимуса иммунотропной.

Вещество Р (SP) - пептидный биорегулятор с последовательностью Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met, играет важную роль в проявлении спазмогенного действия на гладкую мускулатуру.

Моделирование процесса расщепления вещества Р ферментами крови позволило выявить существование для этого пептида нового пути расщепления (наряду с 3-мя известными в настоящее время: Arg-Pro-* -Lys- Pro-* - Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-^ -Leu-Met), связанного с действием аминопептидазы N на пептидную связь между Arg и Pro. До сих пор считалось, что вещество Р

устойчиво в отношении аминопептидаз в связи с малой реакционной способностью связи Arg1 - Pro2. Исследование этих путей расщепления с целью установления возможности образования метаболических фрагментов показало, что в процессе деградации вещества Р возможно образование 46 фрагментов [9]. Теоретические результаты не противоречат литературным данным.

Биологические испытания свидетельствуют о важности С-концевого участка в молекуле SP для проявления спазмогенной активности. Нами выявлено, что в процессе деградации возможно образование 14 С-концевых фрагментов: F3.n, F4.u, F5.n, F6.n, F7.u, F8.ibF9.11, Fio-u, F9.10, F4.9, F5.9, F6.9, F7.9, Fs.9 [ИД2].

Проведенное нами изучение возможности появления этих фрагментов на различных этапах деградации и исследование путей их протеолитического образования из фрагментов-предшественников позволило предположить, что наибольшее число С-концевых фрагментов образуется на 3-ем и 4-ом этапах расщепления. Это позволяет говорить о возможности образования с наибольшей вероятностью следующих С-концевых фрагментов вещества Р: F4. и, F5.11, F6.il, F7.11, Fg-n, F9.11, Fio-n, F9.10, F4.9, F5-9, Fm, F7.9, F8-9- Предполагается из экспериментальных данных, что С - концевые фрагменты способны проявлять спазмогенное действие.

В качестве оценки величины прогнозируемого спазмогенного действия F4.11, F5.11, F6-u, F7.11, Fg.11, F9.11, Fio-u, F9.10, F4-9, F5.9, FM, F7-9, Fg.9 фрагментов использовались вероятности образования фрагментов на различных этапах расщепления. Для этих фрагментов проведено исследование зависимости вероятности их образования от этапа расщепления (см. рис.3,4).

Форма кривых, полученных для фрагментов F6.n, Fg.ibF9.10, F6.9 аналогична форме кривых для фрагментов F4.n,F5.ii, F7_u, у которых на основе экспериментальных данных установлено наличие значимой спазмогенной активности. Это позволяет говорить о том, что фрагменты Fg-ц, Fe-n, F9.10, F6.9, вероятно, могут проявить значимую спазмогенную активность. С целью определения минимально активного фрагмента [2] среди F4.11, F5.11, F6.U, F7.11, F8_n, Fg_5 были отобраны наиболее короткие (по числу аминокислотных остатков) и наиболее близкие по виду модельной зависимости (см. рис.3-4) к фрагментам F5.11 и F7.n. Таковым оказался фрагмент F6.9. Мы полагаем, что на основе этого фрагмента возможно получение аналогов, устойчивых к действию пептидаз [10] . В связи с этим для этого фрагмента были определены ферментативные условия его деградации: расщепление фрагмента F6.9 связано с действием пептидилдипептидазы А(3.4.15.1) и дипептидиламинопептидазы I (3.4.14.1) на пептидную связь между РЬе7.и Phe8.

Вероятность

0,08

0,07

0,06

0,05

0,04-

0,03 ■

0,02

0,01 •

0

Р 4 -11 F5.11

Г »-11

Г 4-11

Вероятность

Г 10-11

0,4

0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

Ft.lt

4 5 6 7

Эгапдирщацни

Этап деградации

Рис. 3 Зависимость вероятности Рис.4 Зависимость вероятности

образования фрагментов Р^ц^.п^б-и^.п, образования фрагментов Fio.ii, Р8.9, F8.ii, Гб-9, Р9.10 от этапа деградации Г^Рз^-м^-и от этапа деградации

Вазопрессин- гипофизарный нейрогормон с последовательностью: СуБ-Туг-РЬе-ОЬ-АБп-Суз-Рго-А^-Иу играет важную роль в функционировании центральной нервной системы. Исследования этого пептида проводились с целью выявления возможных фрагментов, образующихся в процессе деградации под действием ферментов и выяснения их роли в проявлении поведенческой активности [15].

Исследование возможных мест расщепления молекулы вазопрессина показывает существование для данного пептидного гормона 2 -х основных путей протеолиза, связанных с расщеплением И- и С-конца аминокислотной последовательности, что приводит к тому, что молекула вазопрессина может распадаться 41 способом. При этом возможно образование 29 метаболических фрагментов, что не противоречит сведениям о метаболических фрагментах вазопрессина, полученным в ходе экспериментальных исследований. Следует отметить, что в литературе имеется информация о появлении лишь отдельных фрагментов вазопрессина в результате ферментативной деградации.

Литературные данные свидетельствуют, что функционально важным участком в молекуле вазопрессина для проявления поведенческих эффектов является его С - концевая последовательность. В связи с этим нами было проведено исследование возможности образования в процессе ферментативной деградации С-концевых фрагментов вазопрессина - и в первую очередь, цистеин - содержащих С - концевых фрагментов, как фрагментов, для которых в литературе почти нет данных о поведенческой активности. Нами выделено восемь цистеин- содержащих С-концевых фрагментов: Рз.^.?, р5.9,Р6.9,Рз-8,Р4.8,

Среди фрагментов Р3.9, Р4.9, Р5_9, ¥(,.% Р3.8> Р4.8, Р5.8, Р6-в, определены фрагменты, образующиеся с наибольшей вероятностью. Таковыми являются:

^4-9» Р5.9, Р6-9, (см. табл. 2).

Таблица 2

Вероятность появления фрагментов Р3.8, Р4_3, Р5.8, Рб-я, образующихся в процессе деградации молекулы вазопрессина под действием ферментов крови

Фрагмент Вероятность

F<M) 0.05

F4.9 0.06

F5.9 0.05

Fe-g 0.1

Представляет интерес испытать эти фрагменты на поведенческую активность. Считаем, что они могут быть эффективно использованы для получения ряда модифицированных аналогов, обладающих поведенческой активностью, устойчивых к действию пептидаз и быть полезными для структурно-функциональных исследований [16]. Для фрагментов Рз_9, Рб_8 нами определена возможность их расщепления ферментами крови (см. табл.3). Таблица 3

Деградация цистеин- содержащих С-концевых фрагментов вазопрессина

Фрагмент Атакуемая пептидная связь

f3.8 7,9, 10,11 13 5,18.20 1 + 1 Phe3 - Gin4 - Asn5-Cys6-Pro7-Arg8

F4-8 ^ 13 5,18.20 Gin4 - Asn5 - Cys6-Pro7 - Arg8

Fj-8 15,18.20 Asn5-Cys6-Pro7 - Arg8

f6-s j 5,18.20 Cys6-Pro7-Arg8

Примечание . Цифры при | указывают номера пептидаз, участвующих в гидролизе данной связи: 5-Пролил эндопептидазаЛ-аминопептидаза В, 9-аминопептидаза N. Ю-Ьеи-аминопептидаза, 11-ариламинопептидаза,13-дипептидиламинопеш'идаза I, 18-карбоксипептидаза В, 20-карбоксипептидаза N.

Люлиберин- декапептид с последовательностью: Ир-йз-Тгр-Бег-Туг-Иу-Leu-Arg-Pro-Gly интересен тем, что наряду с гормональными эффектами способен проявлять противоболевую активность. Проведенное теоретическое исследование образования возможных фрагментов в процессе деградации люлиберина под действием ферментов позволило выявить возможное образование 47 фрагментов [5], что не противоречит экспериментальным данным.

Пептидные фрагменты серединного участка молекулы люлиберина мало изучены на проявление противоболевых эффектов (проводились исследования аналгетической активности только для 2-х фрагментов серединного участка: F4.5 (Ser-Tyr) и I'Vg (Leu-Arg)). Результаты конформационного анализа лей-энкефалина и фрагментов серединного участка молекулы люлиберина показали их взаимное сходство (касается фрагментов F3.s, F5.g люлиберина). При рассмотрении процесса деградации этих фрагментов нами выявлена возможность образования следующих фрагментов серединного участка гормона люлиберина^з.бДм.Рз-вЛ-бД^-тЛ^з-з-

Изучение ферментативных условий образования и расщепления для фрагментов F_v6,F3-7,F3_g,F4.G,F"t-7,F5-?,F5.« совместно с применением вероятностного подхода их образования позволило выделить среди фрагментов серединного участка гормона люлиберина Fj^Fi.v.Fj.sJ^F^Fj.v.FYü фрагменты, образующиеся с наибольшей вероятностью. Таковыми являлись: F3. 8 (0.09), F« (0.08), F5.7 (0.06), F5.8 (0.06). -

. Для фрагментов F3.6,F3_7,F3_8,F.i-6,F.i-7,F5-7,F5_s были определены ферментативные условия их дальнейшего расщепления. Результаты таких исследований приведены в табл. 4. Это позволяет дать рекомендации по защите пептидных фрагментов от действия пептидаз, что важно при получении соединений пролонгированного действия.

____Таблица 4_

_Деградация фрагментов серединного участка молекулы люлиберина

гТл^чог"» TO-ri-r itlvill Атакуемая пешнаная связь

F3-6 1 11 I12"13 Trp3 - Ser4 - Tyr-Gly

F3-7 ^11 ^ 13 ^ 12 ^ 20 Trp3 - Ser4 -Тут5 -Gly6 -Leu7

F3-8 11 13 12 12 i ; i 1 Trp3 - Ser4 -Tyr-Gly6-Leu7 -Arg8

F4-6 ;12 j. 13.14 Ser4-Tyr5 -Gly6

F4-7 12.13,14 20 Ser-Tyr-Gly3-Leu6

F5-7 ,11.12 13,20 A i Tyrs-Gly6 - Leu7

F5-8 10,11 12.13 20 i ; i Tyr5-Gly6-Leu7-Arg8

Примечание. Цифры при | указывают номера пептидаз, участвующих в гидролизе данной связи: 10-Ьеи-аминопептидаза, П-ариламинопептидаза, 12- пеггтидилдипептидаза А, 13-дипептидиламинопептидаза1, Н-дипептидиламинопептидазаИ, 20-карбоксипептидаза N.

Литорин- нонапептид с последовательностью: Glp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Met. Одно из наиболее важных свойств этого пептида - влияние на систему терморегуляции.

Обобщение экспериментальных данных позволяет сделать предположение, что в структуре литорина имеются фрагменты, которые могут проявлять терморегуляторную активность. Мы полагаем, что эти фрагменты могут образовываться в процессе деградации литорина под действием ферментов крови с наибольшей вероятностью.

Проведенное теоретическое исследование процесса деградации литорина позволило выявить 48 способов возможного расщепления этого пептида, в результате чего возможно образование 29 фрагментов (6 N -концевых, 11 С-концевых, 4 фрагмента серединного участка молекулы литорина и 8 отдельных аминокислот). Экспериментальные данные о деградации литорина немногочисленны и в основном относятся к С-концевым участкам этой молекулы.

Результаты биологических испытаний демонстрируют важность наличия в молекуле литорина N-концевых аминокислотных остатков (Glp1, Gin2, Trp3, Ala4, His7) для проявления терморегуляторной активности. Нами показано, что в процессе деградации возможно образование 6-ти N-концевых фрагментов: F1.2, Fi_j, F|_7, Fi_5, Fi-з, F2.3 [3], содержащих эти аминокислоты. Мы предполагаем, что эти фрагменты могут обладать терморегулирующим свойством.

Для фрагментов Fi_2, Fi_*, F1.7, F1.5, F1.3, F2-3 нами проведено изучение ферментативных условий их образования и дальнейшего расщепления. С учетом этого определены N-концевые фрагменты литорина, образующиеся с наибольшей вероятностью: F^ (0.98), F,.3 (0.1), FM (0.1), F,.5 (0.05), F,.7 (0.09).

На основе полученных нами данных о ферментативном расщеплении фрагментов Fu, F1.3, Fm, Fi_5, Fi_7 возможно проведение их структурных модификаций. Это может позволить получить высокоактивные аналоги или конкурентные ингибиторы.

Сывороточный фактор тимуса-эндогенный иммуномодулятор пептидной природы Glx-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn, играющий важную роль в процессах управления функциями клеточного иммунитета.

Исследована роль отдельных аминокислот в проявлении иммунотропной активности этого пептида и его аналогов. Нами получены оценки относительной иммунотропной активности аналогов[1]. Представляет интерес сравнить полученные теоретические оценки иммунотропной активности аначогов сывороточного фактора тимуса с экспериментатьными сведениями. Анализ результатов прогноза на основе экспериментальных исследований.

По результатам теоретических исследований, выполненных нами, был проведен синтез и биологические испытания отобранных фрагментов.

Результаты теоретического прогноза фрагментов, образующихся в процессе деградации пептидных биорегуляторов, полностью совпадают с литературными данными по деградации рассматриваемых в работе пептидных соединений [Andren РегЕ., Caprioli R.M., 1995, Марьянович А.Т. и др., 1996].

Биологические испытания прогнозируемых фрагментов подтвердили наше предположение о том, что фрагменты, образующиеся с наибольшей вероятностью в процессе деградации, обладают заметной активностью.

По данным прогноза проведены модификации ряда фрагментов пептидных биорегуляторов [2,3,9,11,17] и получены аналоги, обладающие селективным биологическим действием и устойчивостью к ферментативному расщеплению.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное моделирование процесса деградации пептидных биорегуляторов позволяет устанавливать различные пути деградации пептида; все возможные фрагменты, образующиеся в ходе ферментативного расщепления; давать количественную оценку вероятности образования фрагментов. Полученные в ходе исследования результаты позволяют проводить целенаправленный синтез и биологические испытания прогнозируемых фрагментов, а также указывать пути их модификации с целью получения новых аналогов, обладающих селективным и пролонгированным действием. Основные выводы диссертационной работы:

1. Разработаны основы теоретического моделирования процесса деградации пептидных биорегуляторов и создано программное обеспечение [1,4,5,8,9,11-16J. Программное обеспечение состоит из базы данных по специфичности ферментов крови [1,9,12,13,16] и комплекса специальных и поисковых

—процедур, позволяющих прогнозировать процесс деградации пептидных соединений и определять вероятностные характеристик;; образования фрагментов [1,9,12,13,15,16].

2. В результате теоретического анализа процесса деградации олигопептидов прогнозируются следующие наборы фрагментов, образующиеся с наибольшей вероятностью:

а) для вещества Р - фрагменты F4.11, F5.ib F6-ii, F7.lb Fg.n, F6_9 [2,9,10-12]. Для вещества P выявлен минимально активный фрагмент [2,11];

б) для вазопрессина - фрагменты F4-9, F5.9, F6.9, F6.g [17];

в) для люлиберина - фрагменты Fj.g, F+6, Fj.7, Р5.8 [5];

г) для литорина - фрагменты Fi.2, F1.3, Fw, F1.5, F1.7 [3].

Для полученных фрагментов даны рекомендации по способам их защиты от действия пептидаз [9,17].

Спектр фрагментов рекомендован для синтеза и биологических испытаний [9,3,5-7,9,10-12,17].

3. Результаты теоретического прогноза фрагментов [2,3,5,9,10,12], образующихся в процессе деградации пептидных биорегуляторов, сопоставлены с имеющимися в литературе экспериментальными данными по

деградации рассматриваемых в работе пептидных соединений и получено их полное подтверждение. Биологические испытания фрагментов, образующихся с наибольшей вероятностью в процессе деградации под действием ферментов, показали, что такие фрагменты обладают заметной активностью.

4. По данным прогноза проведены модификации ряда фрагментов пептидных биорегуляторов. Получены аналоги селективного действия, обладающие устойчивостью к ферментативному расщеплению:

• аналоги С - концевого фрагмента аргинил-вазопрессина Ас-Б-МеЬРго-А^-С1у-ЫН2 и В-Ме1-Рго-А^, превосходящие по активности известный поведенческий пептид - вазопрессин и его концевые фрагменты и оказывающие свое действие в дозах в 10-100 раз меньших при интраназальном способе введения. Результаты защищены авторским свидетельством № 1623166 от 22.09.1990 г. "Нейропептиды, обладающие поведенческой активностью" [17];

• выявлен минимально активный фрагмент вещества Р, на основе которого возможно проведение модификаций с целью получения аналогов с высокой спазмогенной активностью [2,11];

• найден модифицированный аналог литорина С!р-01п-01и(0Ме)-С)Н, гипотермический эффект которого при интраназальном способе введения превысил эффект бомбезина [3];

• обнаружена аналитическая активность фрагментов серединного участка молекулы люлиберина [5].

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Осипович (Тонкович) И.Н., Фигловский В.А., Голубович В.П., Ахрем A.A. Анализ молекулярных механизмов действия на иммунную систему организма сывороточного фактора тимуса и его фрагментов // Итоги науки и техники. Сер. иммунология,- 1988,- Т. 26, - С. 17 - 25.

2. Голубович В.П., Егорова C.B., Осипович (Тонкович) И.Н., Лазакович Е.М., Кирнарский Л.И., Ахрем A.A. Минимальный фрагмент вещества Р, сохраняющий свойства этого пептида // ДАН СССР - 1989,- Т. 309, № 4,- С. 1000-1001.

3. Голубович В.П., Кирнарский Л.И., Гатюк E.H., Дрбоглав В.В., Осипович (Тонкович) И.Н., Ахрем A.A. Теоретический конформационный анализ молекулы литорина // Известия АН БССР. Сер. хим. наук.- 1989,- Ле 4,- С. 36-39.

4. Тонкович И.Н., Фигловский В.А., Голубович В.П. Математическое моделирование метаболизма пептидных биорегуляторов в организме // Итоги и перспективы развития биоорганической химии в республике Беларусь: Сб. ст.-Гродно, 1998,-С. 102-106.

5. Голубович В.П., Тонкович H.H. Разработка методов получения новых биоактивных веществ в рядах пептидов и изучение их структурно-функциональных аспектов действия Н Ученые записки,- 1999,- № 3,- С. 49-53.

6. Осипович (Тонкович) И.Н. Планирование синтеза пептидных соединений // Биоорганическая и органическая химия (Часть I): Тез. докл. VII респ. конф. молодых ученых-химиков, Таллин, 1987 г. / Ин-т химии АН ЭССР,-Татлин,

—1987.- С .49.-

7. Осипович (Тонкович) И.Н., Фигловский В.А., Голубович В.П. Построение системы для поиска оптимальных путей синтеза пептидных соединений И Автоматизация научных исследований: Тез. докл. XXI Всес. школы, Чолпон-Ата, сент. 1987 г. / Совет по автоматизации науч. иссл . при Президиуме АН СССР, Ин-т автоматики АН Кирг. ССР - Фрунзе, 1987,- С. 116.

8. Kirnarsky L.I., Golubovich V.P., Drboglav V.V., Osipovich (Tonkovich) I.N., Akhrem A.A. Drug design of the peptide bioregulator analogs with prolonged action // International Society of Chemotherapy: In Abs. 2-nd International Symp. of molecular aspects of chemotherapy, Gdansk-Poland, 5-8 July 1988 / Commite of Drug Research, Polish Academy of Sciences, Technical University of Gdansk.-Gdansk, 1988,- P. 108.

9. Егорова C.B., Осипович (Тонкович) И.Н. Исследование возможных путей метаболизма вещества Р и его аналогов в крови (математическое моделирование). Целенаправленный синтез аналогов вещества Р и их биологическое исследование И IX Молодежная конференция по

синтетическим и природным физиологически активным соединениям: Тез. докл., Ереван, 20-24 сент. 1988 г. / ЦК ЛКСМ Армении, Акад. наук Арм. ССР, Ин-т тонкой орг. хим. АН Арм. ССР,- Ереван, 1988,- С. 17.

Ю.Егорова C.B., Кирнарский Л.И., Лазакович Е.М., Осипович (Тонкович) И.Н., Голубович В.П. Целенаправленный поиск активных аналогов вещества Р // Синтез, фармакология и клинические аспекты новых психотропных и сердечно-сосудистых веществ: Тез. докл. науч. конф., Волгоград, 24-26 мая 1989 г. / Волгоградский политехнический ин-т, Волгоградский медицинский ин-т, Киевский НИИ фармакологии и токсикологии, Волгоградский Дом науки и техники,- Волгоград, 1989,- С.24-25.

П.Осипович (Тонкович) И.Н. Егорова C.B., Лазакович Е.М., Голубович В.П. Анализ структурных особенностей вещества Р, необходимых для взаимодействия с его рецептором // Оценка фармакологической активности химических соединений: Принципы и подходы (Часть II): Тез. докл. Всесоюз. науч. конф., Москва, 15-19 нояб. 1989 г. / Мин-во медицинской промышленности СССР, Всесоюз. научный центр по безопасности биологически активных веществ.- Москва, 1989.- С. 238.

12.0сипович (Тонкович) И.Н., Егорова C.B., Пташкина Л.П., Голубович В.П.., Николайчик Л.В. Исследование закономерностей ряда фрагментов вещества Р на гладкую мускулатуру // Биологические мембраны в норме и патологии: Труды VI Межуниверситетской конф., Кутаиси, 1-6 нояб.1988 г. / Мин-во нар. образования ГССР, Тбилисский гос. университет,- Кутаиси, 1988,- С. 173-175.

1 З.Осипович И.Н. (Тонкович И.Н) Математическое моделирование процессов метаболизма белково-пептидных соединений // Математическое моделирование и вычислительная математика: Тез. докл. Республ. науч. конф., Гродно, 17-22 сентября 1990 г. / Науч. Совет Академии наук БССР, Мин-во народ, образования БССР, Ин-т математики АН БССР, Гродненский гос. ун-т им. Я.Купалы,-Гродно, 1990.- С. 103-104.

14.Тонкович И.Н., Голубович В.П. Математическое моделирование пептидных биорегуляторов в организме // Социально-экономическое развитие Республики Беларусь на рубеже XX и XXI веков: анализ, перспективы: Материалы докл. I науч. конф.препод, и студ., Гродно, 1997 г. / Мин-во обр. Респ. Беларусь, Гродн. фил. ИСЗ.- Гродно, 1997,- С. 213-214.

15.Тонкович И.Н., Голубович В.П., Фигловский В.А. Исследование возможных путей метаболизма пептидных биорегуляторов: // Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем: Тез. докл. Третьего съезда Бел. общ. фотобиологов и биофизиков, Минск, 1998 г. / Бел. общ. фотобиологов и биофизиков.-Минск, 1998,-С. 211.

16.Тонкович И.Н. Теоретическое математическое моделирование процесса деградации пептидных соединений под действием протеолитических ферментов // Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем: Тез. докл. Четветого съезда Бел.общ. фотобиологов и биофизиков, Минск, 2830 июня 2000 г. / Бел. общ. фотобиологов и биофизиков.- Минск, 200.- С. 288.

17.А.С. 1623166 СССР, МКИ3 С 07 К 5/08, 5/10, А 61 К 37/02. Нейропептиды, обладающие поведенческой активностью / В.П.Мартинович, В.П.Голубович, С.А.Титов, О.Г.Воскресенская, И.П.Ашмарин, Л.К.Слободчикова, И.Н.Осипович (Тонкович), А.А.Ахрем. (СССР).- №4709625/04; Заявлено 03.04.89; Зарегистрировано в Гос. реестре изобретений СССР 25.09.90.

РЕЗЮМЕ Тонковнч Ирина Николаевна "Математическое моделирование и прогнозирование процесса деградации

пептидных соединении " Ключевые слова: пептид, пептидный биорегулятор, деградация пептидов, фрагмент пептидного биорегулятора, ферменты крови, программный комплекс, вещество Р, вазопрессин, люлиберин, литорин, сывороточный фактор тимуса, биологическая активность.

Разработаны основы теоретического моделирования процесса деградации пептидных биорегуляторов и создано программное обеспечение. Программное обеспечение состоит из базы данных по специфичности ферментов крови и комплекса специатьных и поисковых процедур, позволяющих прогнозировать процесс деградации пептидных соединений и определять вероятностные характеристики образования фрагментов под действием ферментов.

В результате теоретического анализа деградации олигопептидов прогнозируются следующие наборы фрагментов, образующиеся с наибольшей вероятностью: для вещества Р - F4.11, F5.11, F6.ii, ?7-пД^-п, Рб-э, для вазопрессина

- Р4.9, Р5.9, Р6_9, Р6-8; для люлиберина - Р3.8, F4.fi, Р5.7, Р5.в; для литорина - Р^, Рю,

Р-1_7 Для этих фрагментов даны рекомендации по способам их защиты от действия пептидаз.

На основании прогноза:

- синтезированы аналоги фрагментов пептидных биорегуляторов, обладающие селективным действием и устойчивостью к ферментативному расщеплению: аналоги С - концевого фрагмента аргинил-вазопрессина Ас-О-МеЬРго-Агу-Оу-ЫНг и В-Ме^го-Аг§, превосходящие по активности известный поведенческий пептид - вазопрессин и его фрагменты; модифицированный аналог литорина 01р-01п-С1и(0Ме)-0Н, гипотермический эффект которого при интраназальном способе введения превысил эффект бомбезина;

- получены фрагменты серединного участка молекулы люлиберина, обладающие аналгетической активностью;

- выявлен минимально активный фрагмент Рб_9 вещества Р. На основе этого фрагмента возможно проведение модификаций с целью получения аналогов с высокой спазмогенной активностью.

РЭЗЮМЕ TohkobÍ4 1рына Мшалаеуна "Матэматычнае мадэляваннс i прагназаванне працэсу деградацьи пептыдных злучэнняу " Ключавыя словы: пептыд, пептыдны б1ярэгулятар, дэградацыя пептыдау, фрагмент пептыднага б1ярэгулятара, ферменты крыв1, праграмны комплекс, рэчыва Р, вазапрэсш, люл^берын, лггарын, сьгеаратачны фактар тымусу, б^ялапчная актыунасць.

Распрацаваны асновы тэарэтычнага мадалявання працэсу дэградацьп пептыдных б1ярэгулятарау i створана праграмнае абяспячэнне. Праграмнае абяспячэнне складаецца з базы даных па спецьк}лчнасш ферментау крыв1 i з комплексу спецыяльных i пашуковых працэдур, яюя дазваляюць прагназаваць працэс дэградацьп пептыдных злучэнняу i устанаул1ваць магчымасныя характэрыстьш утварэння фрагментау пад дзеяннем ферментау.

У вышку тэарэтычнага анализу дэградацьп ашгапептыдау прагназуюцца наступныя наборы фрагментау, утвораныя з на1большай магчымасцю: для рэчыва Р- F^.n, F3.n, F6.n, F7.ii,F8-ii, F6.9; для вазапрэсшу- F4.9, F5.9, F6-9, F6.s; для лкхпберыну- F3.8, F4-6, F5.7, F5-8 ; для лггарыну - F^, F,.3, FM, F1.5, F1.7. Для гэтых фрагментау дадзены рэкамендацьп па спосабах ix абароны ад дзеяння пептыдаз.

На аснове прагнозу:

- сштэзфаваны аналаг! фрагментау пептыдных б1ярэгулятарау, валодуючыя селектыуным дзеяннем i устошпвасцю да ферментатыунага расчаплення: аналап С-канцавога фрагмента аргшш-вазапрэсшу Ac-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH2 i D-Met-Pro-Arg, якш пераувышаюць па актыунасщ вядомы паводзшны пептыд-вазапрэсш i яго фрагменты; мадыфщыраваны аналаг лпгарыну Glp-Gln-Glu(OMe)-OH, гшатэрм^чны эфект якога пры штраназальным спосабе увядзення перавыЫу эфект бамбезшу;

- найдзены фрагменты сярэдзшнага участка малекулы люлЛерыну, валодуючыя аналгетычнай акгыунасцю;

- выяулены м1шмальна актыуны фрагмент F6-9 рэчыва Р. На аснове гэгага фрагменту магчыма правядзенне мадыфжацый з мэтай атрымання аналагау з высокай спазмагеннай акгыунасцю.

THE SUMMARY Tonkovich Irina N.

"Mathematical modeling and prediction of peptide compound degradation"

Key words: peptide, peptide bioregulator, peptide degradation, fragment of peptide bioregulator, blood enzymes, package of computer programms, substance P, vasopressin, luliberin, litorin, factor thymus of serum, biological activity.

The theoretical method for computer modeling of degradation of peptide bioregulators and a necessary software have been developed. The software includes the data on blood enzyme specificity, procedures that prognose peptide degradation and compútate the probability characteristics of metabolic fragment formation.

The theoretical analyses of oligopeptide degradation gives the following fragments that are characterized by the highest probabilities of formation: fragments F4-11, F5.11, F5.11, F7.11, Fg.n, F6-9 for substance P, fragments F4.9, F3.9, F^, F6.s for vasopressin, fragments F3.8, F4.6, F5-7, F5.8 for luliberin, fragments F1-2, Fi_3, FM, F1.5, F1.7 for litorin. Possible ways of protection of these fragments against peptidases have been proposed.

The following procedures have been carried out on the basis of mathematical modeling:

- analogs of the fragments of peptide bioregulators, which are characterized by selective action and enzymatic stability against peptidases have been synthesized. It has been revealed that analogs Ac-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH2 and D-Met-Pro-Arg of C-terminal fragments of arginyl-vasopressin demonstrate higher activity than well known behavioral vasopressin peptide and its fragments; modified analog Glp-Gln-Glu(OMe)-OH of litorin demonstrate higher hypothermic affect than bombesin if intranasal administration is used;

- central fragments of luliberin, which are characterized by analgetic activity, have been obtained;

- minimal active fragment F6.9 of substance P has been obtained. Modifications of this fragment give analogs with high spasmogenic activity.