Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологическая активность пептидного комплекса печени

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологическая активность пептидного комплекса печени"

УКРАИНСКАЯ АКАДЕМИЯ АГРАРНЫХ НАУК ИНСТИТУТ СВИНОВОДСТВА УААН

РГБ ОД

" • Мя? 2Ш

УДК 612. 35+547. 964. 4

Гаркович Алексей Леонтьевич

ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА ПЕЧЕНИ

03.00. 13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Полтава - 2000

Диссертацией является рукопись.

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Украинской медицинской стоматологической академии

Научный руководитель:

- кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Кайдашев Игорь Петрович, заведующий Центральной научно-исследовательской лаборатории Украинской медицинской стоматологической академии.

Официальные опоненты:

- доктор биологических наук, профессор Лященко Пётр Сергеевич, Научно-исследовательский институт физиологии Киевского национального университета им. Т. Г. Шевченка, директор;

- кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры химии Лазарева Зарина Александровна, Полтавский кооперативный институт.

Ведущее учреждение:

- Национальный медицинский университет им. О. О. Богомольца

Защита состоится Я 2000 года в часов, на

заседании специализированшго ученого совета (К 44.35i.01) при Институте свиноводства УААН, 36006 г. Полтава, Шведская могила.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института свиноводства УААН, по адресу 36006 г. Полтава, Шведская могила.

Автореферат разослано " ^2000 года

Учёный секретарь специализированного ученого

совета, к.б.н. Пидгереба А. И.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Одной из фундаментальных проблем физиологии человека и животных является исследование механизмов регуляции процессов жизнедеятельности организма. Как известно, в живом организме существует несколько типов регуляторных систем, среди которых одно из ведущих мест занимает пептидэргическая система регуляции (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1988). Основными компонентами этой системы являются низкомолекулярные пептиды, которые обеспечивают перенос необходимой информации, координацию, нормальное функционирование, развитие и взаимодействие клеточных популяций.

Последние годы внимание многих учёных привлекает система регуляции и интеграции печёночной деятельности, которая базируется на полипептидных факторах (Вигковський Ю. А., 1990). Выбор темы наших исследований был обусловленный тем, что одной из недостаточно изученных отраслей физиологии обмена веществ является выяснение механизмов регуляции и координации жизнедеятельности организма, в частности, нас заинтересовал вопрос о возможном действии компонентов пептидэргической регуляции на функциональное состояние печени при использовании природного пептидного комплекса из этого органа. Исследование действия полипептидного комплекса печени на процессы, которые происходят в этом органе, важны для фундаментальной физиологии и могут быть использованы как основание для создания новых врачебных препаратов.

Существуют данные о том, что отдельные пептидные вещества, печёночного происхождения, способны влиять на некоторые метаболические процессы в этом органе и системные реакции в крови, однако комплексная физиологическая активность пептидов печени, направленая на регуляцию основных метаболических процессов органа, не исследовалась.

Особенность данного направления исследований состоит в выяснении возможных механизмов пептидэргической системы регуляции, которые обусловливают коррекцию и восстановление нормального функционирования печени, воспроизведение ее физиологического состояния после функциональных нагрузок.

Связь темы с плановыми научными исследованиями. Это исследование является фрагментом НИР МОЗ Украины "Роль дисбаланса пептидэргической системы регуляции в развитии типовых патологических процессов и пути ее восстановления информационными молекулами полипептидной природы № 11А 01001570Р".

Цель н задачи исследования. Целью исследования было изучение

регулягорной активности пептидного комплекса, полученного из печени в условиях действия его на ингакгных животных и при моделировании нарушений основных биохимических процессов, которые обеспечивают физиологические функции этого органа.

В связи с выше указанным были поставлены такие задачи:

1) разработать методику выделения из печени природного комплекса низкомолекулярных пептидов, изучить его физико-химические характеристики;

2) исследовать действие пептидного комплекса печени на состояние углеводного, лшщдного, белкового обменов яри физиологических условиях и функциональных нагрузках;

3) исследовать действие пептидного комплекса печени на функцию детоксикации, состояние перекисного окисления и аштгоксцдангного статуса при физиологических условиях и функциональных нагрузках.

Научная новизна. Впервые при помощи нового метода выделения был получен пептидный комплекс из печени (ГОШ), определен хроматохрафически и за физико-химическими параметрами.

Впервые изучена комплексная регуляторная активность ПКП, которая выявлялась модуляцией параметров углеводного, липидного, белкового обменов, перекисного окисления, антиоксвдантного статуса в печени и крови, функции детоксикации, что обеспечивало нормальное функционирование печени и воспроизведение ее физиологического состояния после функциональных нагрузок.

Получены новые данные о регуляторном действии пептидного комплекса из печени ка ход фенилгидразиновой, алкогольной, тетрахлорметановой, барбшуратной интоксикаций, при нагрузках галактозой и адреналином.

Теоретическая и практическая ценность работы. Исследование является фрагментом научно-исследовательской работы Министерства здравоохранения Украины и углубляет знания о механизме действия пептидэргической системы регуляции в организме.

Доказано, что пептидный комплекс печени влияет на метаболические функции этого органа, особенно при функциональных нагрузках. Выявлено ингибиторное действие ПКП на цитохром Р^о, который модулирует процессы детоксикации и генерацию активных форм кислорода; выявлено усиление синтеза ДНК под действием ПКП, что открывает перспективы использования его, как препарата, влияющего на обмен веществ в печени. Работа является фрагментом доклинической апробации ряда пептидных органоспецифичных препаратов. Разработано экономически целесообразный способ получения

комплекса физиологически активных пептидов из печени, подана заявка на патент.

Внедрение в практику. Результаты работы используются при чтении лекционного курса и проведении лабораторных занятий на кафедрах химии, биологии человека и животных Полтавского государственного педагогического института им В.Г. Короленка; кафедрах биохимии, нормальной физиологии, фармакологии Украинской медицинской стоматологической академии.

Личная декларация автора. Получение пептидного комплекса печени, отбор животных, планировки и проведение экспериментов, проведение анализов, расчеты, ингерпритация полученных результатов, подбор литературы проведено автором самостоятельно на материальной базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Украинской медицинской стоматологической академии. Общая доля диссертационной работы, выполненая непосредственно соискателем, составляет 90%.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на конференции молодых учёных Украинской медицинской стоматологической академии (1997), Карышинских чтениях в Полтавском государственном педагогическом институте им. В.Г. Короленка (1998), на III международной научно-практической конференции "Физика и радиоэлектроника в медицине и биотехнологии" (г. Владимир, 1998), заседании Полтавского отделения биохимического общества Украины (1999), заседании аппробационного совета № 1 Украинской медицинской стоматологической академии (1999), заседании отдела физиологии и биохимии воспроизведения Института свиноводства УААН (Полтава, 1999).

Публикации: По материалам работы опубликовано 5 статей в журналах, 3 тезисов.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, документирована 19 таблицами, иллюстрирована 13 рисунками. Диссертационная работа построена по традиционному плану и состоит из введения, разделов: обзора литературы, материалов и методов исследования, раздела собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы, в котором 121 источник кирилицей и 22 латиницей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Физико-химические свойства пептидов. Анализ состава пептидного комплекса осуществляли за следующими методиками: была проведена

хроматография полученного вещества на приборе "Мшшхром 4 ВУФ" (Россия) с использованием колонки RPC, С2/С18 PC 3.2/3 ("Pharmacia", Швеция), специально адаптированной к этому прибору; хроматотрафический процесс воссоздавал« в режиме ступенчастого градиента. Определение изоэлектрических точек, спектров поглощения, оптической плотности; количество тяжелых металлов, углеводов и пептидных веществ оценивали при помощи общепризнанных методов, которые подробно описаны в "Государственной Фармакопее XI, выпуск 1", (1988).

Методы исследования. Для выполнения заданий были использовании методы, которые характеризовали бы функциональное состояние печени, как главного органа метаболического гомеостаза организма, которые подробно описаны в цитированной литературе и приведенны в таблице 1.

Математические результаты исследований обработаны статистически при помощи критерия Стьюдента и компьютерных офисных программ, которые входят в состав пакета MS OFFICE фирмы MICROSOFT.

Группирование экспериментов. Для решения поставленных в работе заданий были проведены эксперименалыше исследования на 188 животных: белые крысы линии Wistar - (30), золотистые хомяки - (118), морские свинки -(40). Лабораторные животные содержались в условиях вивария на стандартном рационе питания согласно с "Санитарными правилами по упорядочению, оборудованию экспериментально-биологических клиник (вивариев)".

Для изучения действия пептидного комплекса печени были выбраны два режима его введения: однократный и длительный (в течение 5 суток) в дозе 6,5 мг/кг.

Объектами исследования были: цельная кровь, сыворотка, печень экспериментальных животных.

Исходя из цели и задач работы, необходимо было выявить наличие физиологической активности ПКП на интегральные показатели каждого вида обмена в этом органе и предложить на основе этого схему возможных механизмов физиологической регуляции изученных функций печени. Для решения поставленных задач в работе были воспроизведены экспериментальные модели токсичного гепатита, алкогольной нагрузки, талактозной нагрузки, адреналиновой пробы, гемолитической анемии, тиобарбитурового сна (табл. 2).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для осуществления поставленых заданий нами был разработан метод получения полииепгидного комплекса, который включал в себя обработку

экстракта галогенсодержащей кислотой с обязательным присутствием двух валентых металлов.

Таблица 1.

Методы исследования

Показатели Биологический Авторы методик

№ материал

I 2 3 4

1. Глюкоза сыворотка крови V.Chromy, J.Voznidiek, (1981)

2. Гликоген печень Асатиани B.C., (1956)

3. Молочная кислота печень Хмелевский Ю.В., (1985)

4. Пировиноградная кислота печень Хмеяевский Ю.В., (1985)

5. Гемоглобин кров Покровский A.A., (1969)

6. Билирубин сыворотка крови Йепдрашнк Л., Клегчерн Р., (1982)

7. Общие липиды сыворотка крови Меньшиков В.В., (1987)

8. Липопротеиды низкой и сыворотка крови Меньшиков В.В., (1973)

очень низкой плотности

9. Триглицериды сыворотка крови J.Fletcher, (1968)

10. Свободные жирные кислота сыворотка крови Прохоров М.Ю., Тиунов М.П., (1977)

11. Фосфатипиды сыворотка крови D. Glick, (1956)

12. Холестерин сыворотка крови Ilea S., (1962)

13. Электрофорез белков сыворотка крови Сентебова H.A., Медведева Л А (1978)

14. ТБК-реагующие продукты печень Владимиров Б А, Арчаков А.И., (1972)

15. Супероксиддисмутаза (СОД) печень Брусов О.С. и др., (1976)

16. РНК, ДНК печень Трудолюбова М.Т., (1977)

17, Цитохромоксидаза печень Straus Werner, (1954)

18. Ксантиноксидаза печень Westerfeld W.K. et al, (1950)

19. Каталаза печень Архипова О.Г., (1988)

20, Гидроксидазная активность печень Орехович B.H., (1979)

цитохрома Р450

21. Общий беяок сыворотка крови Меньшиков B.B., (1973)

22. Щелочная фосфатаза сыворотка крови Тодоров И., БоданськиЙ А.О., (1963)

23. Мочевина сыворотка крови Marsh W., Miller Н., (1965)

24, АлАТ, АсАТ сыворотка крови Young D.S., Pestaner I.С., (1975)

25. Токоферол, окситокоферол, сыворотка Параннч A.B., Юхнин О.С., (1993)

витамин А, Р-каротин, токо- и печень

феридхипон

26. Жирные кислота, диеновые, сыворотка Гаврилов В.Б., Мишкорудная M.I., (1983)

триеноввые, оксидиеновые, и печень

тетраеновые конъюгаты

27. сен печень Ellman G.L., (1959)

28. ОвН-трансфераза печень Kraus P., Gross В., (1979)

29, СЯН-иерокеидаза печень Mills G.C., (1954)

30, АТФ печень Толстых П.И., Титов А.И., (1991)

31. Аскорбиновая кислота печень Петрунькина Н.И. (1961)

В результате был получен пептидный комплекс печени с минимумом балластных веществ, где пептиды стабилизировались в комплексных соединениях с двухвалентными металлами, повышая тем самим свою растворимость и стойкость. Существенным оказалось наличие восьми пептидных фракций с изоэлектрическими точками при рН=4,28 и рН=10,1.

Максимум поглощения УФ-света раствором комплекса пептидов расположен в границах 210 - 280 нм, что указывает на наличие пептидной связи и остатков ароматических аминокислот. Выход комплекса из сырой печени составлял 1,2%.

Таблица 2.

Схема опытов

Серии опытов Возраст К-во Доза Дозы

животных животных ПКП препаратов

1 2 3 4 5

I серия опытов: галактозная нагрузка (белые крысы)

Шнтактные 4-6 мес. 5 —

2.Котрольные 1 (введение галактозы) 4-6 мес. 5 — 10 г/кг

З.Котролыше 2 (введение ПКП 5 дней) 4-6 мес. 5 6,5 мг/ кг

4.Контролыше 3 (введение ПКП однократно) 4-6 мес. 5 6,5 мг/ кг _

5.Опытные I (введение ПКП за 1 час + галактоза) 4-6 мес. 5 6,5 мг/кг 10 г/кг

б.Опытные II (введение ГОШ 5 дней + галактоза) 4-6 мес. 5 6,5 мг/ кг 10 г/кг

II серия опытов: адреналиновая проба (золотистые хомяки)

7.Интактные 4-6 мес. 5 — —

8.Контролыше 1 (введение адреналина) 4-6 мес 8 — 0,2 г/кг

9 .Контрольные 2 (введение ПКП 5 дней) 4-6 мес. 5 6,5 мг/ кг _

10,Контрольные 3 (введение ПКП однократно) 4-6 мес. 8 6,5 мг/ кг _

11 .Опытные I (введение ПКП за 1 час + адреналин) 4-6 мес. 8 6,5 мг/кг 0,2 г/кг

12.Опытные II (введение ПКП 5 дней + адреналин) 4-6 мес. 8 6.5 мг/ кг 0,2 г/кг

III серия опытов: гемолитическая анемия (золотистые хомяки)

13.Интактные 4-6 мес. 5 — —

14. Контрольные (введение фенилтидразиш) 4-6 мес. 5 — 70 мг/кг

И.Опытные I (введение ПКП за 1 час + 4-6 мес. 5 6,5 мг/кг 70 мг/кг

фенилгидразин)

1 б.Опытные II (введение ГОШ 5 дней + 4-6 мес. 5 6,5 мг/кг 70 мг/кг

фенилгидразин)

IV серия опытов: алкогольная интоксикация (золотистые холмки)

17.Ийтактные 4-6 мес. 6 — —

18.Контрольные (введение зтгнола) 4-6 мес. 6 — 6.0 г/кг

19.0пытаые1 (введениеПКП5дней) 4-6 мес. 6 6,5 мг/ кг ...

20.0пытные II (введение ГОШ 5 дней+этанол) 4-6 мес. 6 6,5 мг/кг 6,0 г/кг 1

V серии опытов: токсический гепатит (морские свинки)

2 Шнтактные 4-6 мес. 10 — ...

22.Кошрольные (введение тетрахлорметана) 4-6 мес. 10 — 4,0 мл/кг

23.Опытные I (введение ПКП 5 дней) 4-6 мес. 10 6,5 мг/кг —

24.0пытные II (введение ПКП 5 дней + 4-6 мес. 10 6,5 мг/кг 4,0 мл/кг

тетрахлормеган)

VI серия опытов: тиобарбптуровый сон (золотистые хомяки)

25.Интактные 4-6 мес. 8 —

2б.Кошродьные (введение тиопентала N8) 4-6 мес. 8 — 200,0 мг/кг

27.0пъпные I (введение ПКП 5 дней) 4-6 мес. 8 6,5 мг/кг —

28.0пытные II (введение ПКП 5 дней + 4-6 мес 8 6,5 мг/кг 200,0 мг/кг

тиопентад№)

Для достижения цели нами были проведены исследования не только при введении препарата здоровым животным, но и на моделях функциональных

нагрузок, которые бы характеризовали отдельные стороны физиологической деятельности печени в поддержании метаболического гомеостаза организма.

В соответствии с этим было изучено регуляторное действие пептидного комплекса печени на углеводный обмен. Введение интактным крысам, золотистым хомякам и морским свинкам однократно ПКП не изменяло концентрации глюкозы в крови; гликогена, пировиноградной и молочной кислот в печени. При длительном введении ПКП, используя непараметрические методы статистической оценки, было выявлено достоверное уменьшение на 10% концентрации гликогена в печени; увеличение на 15% концентрации глюкозы в сыворотке крови; наблюдалось повышение содержания пировиноградной и молочной кислот в печени. Возможно, физиологическое действие ПКП направлено осуществляется через активацию аденилатциклазной системы, содействуя гликогенолизу. Возможность реализации физиологического воздействия ПКП при помощи регуляции аденилатциклазной системы доказана при исследовании других пептидных комплексов из мозга, сердца путем увеличения концетрации цАМФ. Кроме того, можно предположить тормозящее действие ПКП на последующий метаболизм пировиноградной кислоты. Такие функциональные изменения, как правило, свойственны физиологически активным веществам, которые направляют свое действие через рецепторы и каскадное усиление сигналов. Необходимо заметить, что регуляторное действие ПКП при физиологических условиях наиболее чётко выявляется при длительном введении.

Одной из физиологических функций печени есть преобразование углеводов, которые поступают из желудочно-кишечного тракта, в формы, способные усваиваться организмом. Типовым представителем таких углеводов является галактоза.

Галактозная нагрузка была использованна для оценки деятельности углеводного обмена. Введение перорально галактозы уже через два часа повышало концентрацию глюкозы в сыворотке крови как следствие преобразования галактозы в печени, однако, метаболиты галактозы не использовались для синтеза гликогена, а сразу вступали на путь глиолиза, что подтверждалось повышением концентрации пировиноградной кислоты в печени и неизменяемостью содержания гликогена.

Длительное предварительное введение ПКП перед галактозной нагрузкой содействовало резкому повышению гликемии, неизменяемости концентрации гликогена, накоплению пировиноградной кислоты и снижению концентрации молочной кислоты в печени. Эти данные свидетельствуют о том, что ПКП

вызывает активацию метаболических систем, которые принимают участие в преобразовании галактозы на глюкозные метаболиты, практически не влияя на гликогенолиз.

Характерной функцией печени является депонирование гликогена, который под действием адреналина превращается на глюкозу, что и стало нашим следуючим шагом в решении поставленных заданий. Введение адреналина крысам привело к гипергликемии за счет усиления гликогенолиза в печени, накоплению пировиноградной и молочной кислот. Предварительное введение ПКП перед нагрузкой содействовало восстановлению запасов гликогена, сохранению гинергликемии при увеличении концентрации пировиноградной и молочной кислот. Следовательно, в отношении гликогенолиза ПКП тормозит эффект адреналина, но не снижает гйпергликемию. Возникает вопрос об источниках поступления глюкозы в кровоток при совместимом действии адреналина и ПКП, когда уменьшения запасов гликогена в печени не происходит. На наш взгляд, это может быть объяснено активацией ферментов глюконеогенеза. Именно в этих условиях противоположная тенденция гликолиза и глюконеогенеза выливается в накоплении пировиноградной кислоты, что подтверждается резким увеличением концентрации лакгата и пирувата в печени, особенно при длительном введении ПКП.

Следовательно, можно предположить, что продолжительное введение ПКП перед инъекцией адреналина, может блокировать некоторые его эффекты, а влияя на геном, может содействовать активации синтеза ферментов глюконеогенеза.

При исследовании регуляторного действия ПКП на липидный обмен было выявлено, что длительное введение его интактным хомякам не изменяло концентрацию триглицеридов, ЛПНП, ЛПОНП и холестерина. Наблюдалось повышение в 2 раза концентрации свободных жирных кислот и на 30% фосфолипидов в сыворотке крови. Жирные кислоты в сыворотку крови могут поступать из подкожной жировой ткани, где мобилизация триглицеридов активируется через аденилатциклазную систему и из печени где субстратом для их синтеза является ацетил-КоА (создается в митохондриях в результате окисления пирувата). Нами было доказано, что длительное введение ПКП вызывает повышение содержания пирувата, а следовательно, можно предположить, что одним из путей возможного использования пирувата и лакгата является преобразование их через ацетил-КоА в свободные жирные кислоты. Возможно, ПКП регулирует оба пути, причём, второй, печеночный путь, подкрепляется увеличением концентрации фосфолипидов (одним из

су бстратов для их синтеза являются жирные кислоты).

Для воспроизведения модели воздействия на обмен липидов применено длительное введение этанола. Метаболизм этанола в организме происходит в цитозоле печени при участии алкогольдегндрогеназы с преобразованием его в ацетил-КоА и созданием избыточного количества НАДН, который блокирует цикл трикарбоновых кислот. Вследствие окисления этанола избыточное количество ацетил-КоА содействует повышению содержания триглицеридов, свободных жирных кислот, фосфолшидов, холестерина в сыворотке крови, что подтверждается полученными данными и согласовывается с литературой. Кроме того, происходит блокирование окисления жирных кислот и цикла трикарбоновых кислот. А при неизменной концентрации транспортных форм липидов (ЛПНП, ЛПОНП) повышается уровень общих липидов в сыворотке крови.

Длительное введение ПКП перед введением этанола содействовало: уменьшению концентрации холестерина и свободных жирных кислот в сыворотке крови, при этом однако, оставалась высокой концентрация фосфолипидов, что привело к увеличению концентрации общих липидов; увеличение концентрации ЛПНП и ЛПОНП на фоновом уровне высокой концентрации триглицеридов.

Таким образом, длительное введение ПКП при нагрузке этанолом выявляло регулягорное действие на его метаболизм, предотвращало отрицательное действие на липидный обмен; содействовало синтезу фосфолипидов из жирных кислот, вызвало снижение холестерина в крови. Усиление синтеза транспортных форм (ЛПНП, ЛПОНП) в печени содействовало выведению фосфолипидов и триглицеридов из гепатоцитов, предотвращая их повреждение.

При исследовании регулягорной активности ПКП на белковый обмен было установленно, что как однократное, так и длительное его введение при физиологических условиях золотистым хомякам содействовало повышению относительного количества фракции с^-глобулинов при снижении относительного количества альбуминов и а2-глобулинов; неизменность уровня р-глобулинов отвечала неизменному количеству ЛПНП и ЛПОНП. Повышение уровня РНК в печени в условиях введения ПКП свидетельствовало об активации белкового синтеза. Длительное введение ПКП морским свинкам содействовало повышению концентрации общего белка в сыворотке крови, а в печени наблюдалось повышение концентрации РНК.

Таким образом, длительное введение ПКП при физиологических условиях содействовало активации синтеза фракции а] -глобулинов, белкового синтеза в

печени, увеличивало экспорт белка в сыворотку крови.

Для исследования регуляторной активности ПКП проводили нагрузки веществами, которые содействовали распаду белков в печени, вследствие гемолиза, или тормозили их синтез (гепатотоксин).

В условиях введения гемолитического токсина (фенилгидразина) в сыворотке крови резко (в 5 раз) повысилась концентрация свободного гемоглобина, что вызвано развитием гемолиза, который был обусловлен введенным веществом. Увеличение содержания 04-глобулинов привело к увеличению альбумино-глобулинового коэффициента при одновременном снижении фракции а2-глобулинов в сыворотке крови. Уменьшение фракции а2-глобулинов обусловлено тем, что 25% этих глобулинов содержит гаптоглобин, который связывается с свободным гемоглобином сыворотки крови. Гапто-гемоглобиновые комплексы поглощаются ретикуло-эндотелиоцитарной системой, где глобин и гем подвергаются разложению, что предотвращает повреждение почек и препятствует потере железа вместе с мочёй. Наблюдалось уменьшение концентрации РНК в печени как следствие торможения белкового синтеза.

Действие ПКП введенного перед развитием гемоглобинэмии, как однократно, так и длительно, носило однонаправленный характер, однако в последнем случае наблюдались более выразительные изменения по сравнению с первым. Происходило снижение концентрации свободного гемоглобина, корректировки синтеза фракций белков в сыворотке крови через повышение уровня а2-глобулинов, что указывает на усиление синтеза белков (гаптоглобина); повышение уровня РНК в печени (при длительном введении -даже выше уровня шгтакшьк животных). Содержание ДНК в печени, сниженное при введении фенилгидразина, повышалось при однократном введении и продолжало возрастать при длительном предварительном введении ПКП.

При нагрузке гепатотропным токсином (тетрахлорметан) в сыворотке крови наблюдалось снижение на 20% концентрации общего белка, фракций альбуминов, (XI- и а2-глобулкнов. Происходило нарушение белок-синтезирующей функции печени. При этих условиях длительное введение ПКП содействовало восстановлению белкового синтеза, что подтверждалось повышением общего белка, важным было восстановление относительного содержания фракции белков в сыворотке крови, в печени возросли концентрации ДНК и РНК. Наблюдалась повышенная концентрация мочевины в сыворотке крови, однако это может быть объяснено интенсификацией метаболизма белков.

Следовательно, введение ПКП приводит к активации белкового синтеза в печени, предотвращая в условиях интоксикации повреждению белоксинтезирующего аппарата; важным было восстановление относительного содержания белковых фракций и активация синтеза РНК. Принимая в расчет, что при этом происходило также повышение содержания ДНК в печени, есть возможность предположить усиление процессов регенерации, потому что в условиях токсичного гепатита наблюдаются некрозы и апоптозы клеток печени. В работе с нашим участием получены данные, которые свидетельствуют, что введение ПКП при интоксикации тетрахлорметаном снижает количество клеток, которые стали на путь апоптоза (Ножинова О. А., Гейко О. О., Рябенко В. В., и др., 1998).

Таким образом, ПКП влияет на процессы обмена белков, при физиологических условиях и в условиях нагрузки активирует синтез РНК и ДНК (рис. 1), что приводит к стимуляции синтеза белков для сыворотки крови; органоспецифически усиливает деятельность белоксинтезирующего аппарата.

1 ..„ . ______Ц,..,, -I.,- , пЩ 11 ¡т »л т ■> в, в п» в в иГи» и т.н.» * г г *»в.».

|||!1|1|||!||[Ш|||||1|||Й||||111||||||||||||||||||||||

33

О 0,5 1 1,5 2 2,5 3

13 интактные □ введение ПКП 5 дней

□ введение тетрахлорметана

□ введение ПКП + тетрахлорметан

Рис. 1. Действие ПКП на содержание РНК и ДНК при функциональной нагрузке печени тетрахлорметаном.

При анализе показателей энергетического обмена в печени было выяснено, что длительное введение ПКП золотистым хомякам и морским свинкам содействовало существенному повышению активности цитохромоксидазы. Можно предположить, что в условиях интоксикации фенилгидразином и тетрахлорметаном для репарации поврежденых структур клеток необходима продукция АТФ. Действительно, введение ПКП предварительно до интоксикации тетрахлорметаном привело к повышению содержания АТФ в печени. Таким образом, введение ПКП содействовало активации адаптационных и регаративных процессов, которые проявлялись активацией белкового синтеза и усилением деятельности тканевого дыхания, что необходимо для репарации поврежденных структур в условиях действия

токсинов.

Одной из важнейших функций печени есть детоксикация веществ, которые поступают в нее, как из желудочно-кишечного тракта, так и вследствие метаболических процессов самого организма.

При длительном введении ПКП в печени золотистых хомяков гидроксилазная активность цитохрома Р450 и активность GSH-трансферазы не изменялись. У морских свинок в печени происходило снижение гидроксилазной активности цитохрома Р450, уровень активностей GSH-пероксидазы и GSH-трансферазы не изменялся. У обеих видов животных в сыворотке крови оставалась устойчивой концентрация общего билиру бина, кроме того, у морских свинок происходило снижение содержания связаного билирубина.

В условиях функциональной нагрузки фенилгидразином содержание общего билирубина существенно повысилось. Однократное предварительное введение ПКП содействовало снижению этого показателя. А в случае длительного предварительного введения ПКП до функциональной нагрузки произошло активирование функции детоксикации, что подтверждалось уменьшением концентрации общего билирубина и возможным его выведением из организма.

В условиях функциональной нагрузки тиопенталом натрия существенно повышалась гидроксилазная активность цитохрома Р450, понижалась на 30% активность GSH-трансферазы. Длительное предварительное введение ПКП перед нагрузкой урегулировало деятельность цитохрома Р450, однако уровень активности GSH-трансферазы оставался сниженным.

Кроме того, одним из детоксикационных механизмов есть синтез мочевины, а длительное введение ПКП содействовало повышению ее синтеза. В условиях торможения гидроксилазной активности микросом, при предварительном длительном введении ПКП, использование непараметрических методов анализа выявило существенную разницу длины барбитурового сна.

Функциональная нагрузка тетрахлорметаном вызвала повышение гидроксилазной активности цитохрома Р.«о, снижение активности GSH-пероксидазы и GSH-трансферазы в печени. При этом, также происходило повышение концентрации общего и конъюгованного билирубина, активностей щелочной фосфатазы, АлАТ, АсАТ в сыворотке крови. Предварительное длительное введение ПКП содействовало урегулированию показателей детоксикации. Так, в печени происходило повышение активности GSH-пероксидазы, GSH-трансферазы при одновременном снижении

гидроксилазной активности цигохрома Р450. В сыворотке крови понижалась концентрация общего и коньюгованого билирубина, уровень активности щелочной фосфатазы также снизился.

Таким образом, пептидный комплекс печени при длительном предварительном его введении выявил свое регудяторное воздействие, в первую очередь, на активность цигохрома Р450 (рис. 2), что препятствовало увеличению вторичных токсичных продуктов, понижая при этом степень повреждения гепатоцигов вследствие действия токсинов (фенилгидразин, тиопентал натрия, тетрахлорметан); при этом происходила активация систем конъюгации с одновременным уничтожением токсинов. ПКП содействовал снижению гнпербилирубинэмии, предотвращал развитие холестатического синдрома. Торможение гидроксилазной активности цитохрома Р450 и наличие существенного сокращения длины барбитурового сна указывает на возможность существования других путей детоксикации барбитуратов.

Рис. 2. Влияние ПКП на активность цигохрома Р450 при нагрузке тетрахлорметаном.

Исследование регулягорного действия ПКП на состояние свободнорадикального окисления и антиоксидангной защиты доказало, что длительное введение пептидов печени при физиологических условиях не повлияло на активность СОД и ксантиноксидазы, снизило активность цигохрома Р.450. Активность каталазы снизилась в хомяков, а у морских свинок не изменялась, повышался уровень активности цитохромоксидазы. Последнее указывает на утилизацию кислорода ферментативными системами. Длительное введение ПКП интакгным животным не вызвало повышение концентраций в сыворотке крови и печени первичных продуктов перокевдации (диеновых, гриеновых, оксидиеновых коньюгатов), наблюдалось снижение тетраеновых коньюгатов. Оставался неизменным процент прироста МДА. Содержание эсенциальньк антиоксидантов в печени и сыворотке крови (токоферол и его фракции, р-каротин, аскорбиновая

кислота) при длительном введении ПКП не изменялся.

Таким образом, длительное введение ПКП при физиологических условиях выявляет свое регуляторное действие путем экономического использования ферментативных систем, которые принимают участие в процессах свободнорадикального окисления.

При проведении функциональных нагрузок было выявлено, что под действием этанола индуцировалась активность ксантиноксидазы, при неизменной активности кагалазы. Следует отметить, что оба фермента принимают участие в метаболизме этанола. Предварительное длительное введение ПКП перед этанольной интоксикацией резко снизило активность цитохромоксидазы и ксантиноксидазы, при неизменной активности каталазы. Есть возможность предположить, что при этом происходит накопление свободных радикалов и кислород, Вхместо утилизации его цитохромоксидазой, превращается в активные формы. Из литературных источников известно, что свободнорадикальное окисление усиливается активными формами кислорода и ограничивается антиоксидантной системой защиты. Источниками активных форм кислорода являются микросомальное и митохондриальное окисление, стимуляция дыхательного взрыва фагоцитов, активация ксантиноксидазы.

Введение морским свинкам тетрахлорметана приводило к повышению активности ксантиноксидазы, цитохрома Р450, цитохромоксидазы в печени. В сыворотке крови и печени введение тетрахлорметана привело к повышению первичных продуктов пероксидащш (диеновых, триеновых, оксидиеновых и теграеновых коньюгатов). Привлекает внимание резкое снижение активности СОД, каталазы, С5Н-трансфсразы, СБН-пероксидазы, концентрации С5Н в печени. Этот срыв деятельности аншоксидахгткой защиты увязывается, как с истощением этих ферментативных систем, так и блокированием синтеза белка. Зарегистрированно также двукратное снижение эсенциальных антиоксвдантов, что объясняется усиленным их использованием.

Предварительное до тетрахлорметана введение ПКП содействовало снижению активности ксантиноксидазы, цитохромоксидазы, цитохрома Р450. Содержание первичных продуктов пероксидации также снизилось и было в границах данных интактных животных.

Принимая в расчет возможность активации отдельными пептидами аденилатциклазной системы, а также стимуляцию цАМФ-зависимых ферментов глютатионовой системы, можно предположить, что в экстремальных ситуациях ПКП стимулирует антиоксидантную защиту. Есть ряд доказательств, что пептиды мозга, сердца, почек, селезёнки, эритроцитов, слюнных желез регулируют ферментативные системы и обладают

антиоксвдантными свойствами.

На основе више сказанного есть возможность прийти к выводу о том, что полипептидные препараты, выделеные из печени, являются эффективным средством воспроизведения структуры и функций печени.

Анализируя молекулярные механизмы воздействий токсических веществ на изменения в состоянии свободнорадикального окисления и ангиоксидантной защиты, следует сказать, что протекгивное действие пептидов печени связанно с снижением деятельности микросомальных оксигеназ. Однако, на фоновом уровне этого эффекта уменьшалось повреждающее действие токсинов на гепатоциты животных. Мы считаем, что в данном случае основными путями уничтожения свободных радикалов в организме является деятельность: ферментативной системы глутатионпероксвдаза-глутатионтрансфераза и эсенциальных биоантиок-сидантов, которые имеют лабильный атом водорода и, взаимодействуя со свободными радикалами создают неактивные молекулы или атомы. Было доказано, что введение пептидного комплекса печени активирует деятельность этих путей преобразования токсичных соединений.

Таким образом, природный пептидный комплекс печени, полученый по разработанной методике, в условиях нормы и при физиологических нагрузках способен регулировать функциональное состояние печени. Физиологическая деятельность пептидного комплекса печени выявляется выразительно во время пятидневного его введения и является длительной.

ВЫВОДЫ

1. Природный пептидный комплекс печени, полученный по разработанной методике, в условиях нормы, при физиологических нагрузках и функциональной интоксикации способен регулировать функциональное состояние печени. Физиологическая деятельность пептидного комплекса печени выявляется выразительно во время введения его в течение 5 суток и является длительной.

2. Природный пептидный комплекс печени регулирует процессы углеводного обмена: при физиологических условиях он активирует гликогенолиз, повышая уровень глюкозы в крови; в условиях нагрузки галактозой усиливает процессы преобразования ее в глюкозу; блокирует истощение запасов гликогена, вызванных введением адреналина.

3. Природный пептидный комплекс печени выявляет регуляторный эффект на процессы обмена липидов: при физиологических условиях активирует синтез свободных жирных кислот, фосфолипидов, а при нагрузке организма этанолом предотвращает развитие холестеринэмии, содействует

активации синтеза транспортных форм липидов, предотвращая повреждение гепатоцитов.

4. Природный пептидный комплекс печени выявляет регуляторное воздействие на обмен белков: при физиологических условиях и в условиях функциональной нагрузки метаболических систем печени способствует активации синтеза РНК и ДНК, что приводит возрастанию продукции белков гепатоцитами (особенно а2-глобулинов), усиливает деятельность белоксинтезирующего аппарата.

5. Природный пептидный комплекс печени выявляет регуляторный эффект на энергетический обмен в клетках печени, в основном, на митоховдриальное окисление в гепатоцигах, путем активации цитохромоксвдазы и повышением синтеза АТФ.

6. Природный пептидный комплекс печени принимает участие в регуляции процессов детоксикации в этом органе на уровне гидроксилирования, путем торможения гидроксилазной активности цитохрома Р45о, что препятствует накоплению вторичных токсичных продуктов и понижает степень повреждения гепатоцитов вследствие действия токсинов (фенилгидразина, этанола, тиопентала натрия, тетрахлорметана).

7. Природный пептидный комплекс печени при введении прооксидантов регулирует уровень свободнорадикального окисления путем снижения функциональной активности цигохрома Р450, активирует деятельность ферментов глутатионпероксидазы, глутатиотрансферазы и способствует повышению содержания эсенциальных биоантиоксидантов в печени.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.На основании проведенных исследований физико-химических свойств пептидного комплекса целесообразно дальнейшее его изучение и создание синтетического аналога.

2,Пепгидний комплекс печени нуждается в клинической апробации как фактор, который модулирует состояние обмена и ряда функций печени, особенно детоксикации, и предотвращает невозвратимую гибель гепатоцитов при патологиях печени.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1, Действие пептидного комплекса печени на метаболизм этого органа в условиях действия гемолитического токсина // Проблемы экологии и медицины. -1997, т 1, № 1-2. - С. 29 - 31.

2. Регуляторное действие пептидного комплекса, полученного из тканей печени, на некоторые показатели липидного обмена при алкогольной интоксикации // Проблемы экологии и медицины. - 1998, т. 2, № 1-2. - С. 7-10

(Цебржинський О. И., Куценко Л.А.).

3. Влияние пептидного комплекса печени на процессы апоптоза в клетках печени, индуцированных тетрахлорметаном // Проблемы экологии и медицины. - 1998, т. 2. - № 1-2. - С. 4 - 7 (Ножинова О. А., Гейко О. А., Рябенко В. В., Веснина Л. Э., Кайдашев И. П).

4. Влияние пептидного комплекса на показатели углеводного обмена в условиях метаболических нагрузок // Вестник проблем биологии и медицины. - 1999, № 10. - С. 45 - 48 (Звягольская И. Н.)

5. Действие пептидного комплекса печени на показатели углеводного обмена при адреналиновой нагрузке // Проблемы экологии и медицины. -1999, т. 2, № 3-4.-С. 92-93 (Звягольська И. Н„ Кайдашев И. П.)

6. Влияние комплекса низкомолекулярных пептидов, выделенных из печени, на регуляцию углеводного обмена в этом органе И Физиология и патология иммунитета, гемостаза и перекисного окисления липидов. Материалы конф. г. Полтава. - 1997. - С. 16-17

7. Влияние гепалата как непрямого антиоксиданта // Физика и радиоэлектроника в медицине и биотехнологии. Материалы III международной научно-технической конференции. - Владимир, 1998. - С. 6466

8. Действие пептидного комплекса печени на состояние этого органа в условиях химической интоксикации // Пятые Каришинские чтения. Всеукраинская научно-методическая конференция по проблемам естественных наук (сб. стат.). - 1998. - С. 82 - 84

9. Влияние пептидного комплекса, выделенного из тканей печени, на метаболизм глюкозы в этом органе // Пятые Каришинские чтения. Всеукраинская научно-методическая конференция по проблемам естественных наук (сб, стат.). - 1998. - С. 10

Гаркович О.Л. Ф1зюлопчиа актившсть пептидного комплексу печшки. - Рукопис.

Дисертащя на здобуття наукового ступеня кандидата бюлогтчних наук за спещальшспо 03.00.13 - ф1зюлопя людини 1 тварин - Гнститут свинарства УААН, Полтава, 2000.

Дисертащю присвячено вивченню ф13шлопчно1 активносп пептидного комплексу, видаленого з печшки. Пептидний комплекс печшки, я кий екстрагуеться за допомогою оргашчних кислот в присутносп катюш в двовалентних металцв, визначений хроматограф1чно 1 за ф1зико-х1м1чними характеристиками.

Пептидний комплекс печшки володце власною ({лзюлопчною актившспо,

яка спрямована на пщгримку метаболгашх 1 регенераторних процеав в цьому органг

Прнродний пепгидний комплекс печшки, отриманий за розробленою методикою, в умовах норми, при ф1зюлопчних навантаженнях 1 функцюналыйй штоксикаци здатний регулювати функщональний стан печшки. Ф1зюлопчна актившсть пептидного комплексу печшки виявляеться виразно шд час введения його протягом 5 даб 1 е тривалою.

Природний пепгидний комплекс печшки регулюе процеси вуглеводного облпну: за ф1зюлопчних умов вш активуе гл1когенол1з, щдвищуючи р1вень глюкози в кровг, в умовах навангаження галактозою посилюе процеси перетворення й в глюкозу; блокуе виснаження запасов пикогену, викликаних введениям адреналшу.

Природний пептидний комплекс печшки виявляе регуляторний вплив на процеси обм1ну лищцв: за фiзioлoriчниx умов активуе синтез вшьних жирних кислот, фосфохптдав, а при навантаженш оргашзму етанолом запоби-ае розвитку холестеринемп, сприяе активацп синтезу транспортних форм лцпдав, вщвергаючи попгеодження гепатоципв.

Природний пептидний комплекс печшки виявляе регуляторний вплив на обмш бшав: за ф1зюлопчних умов та в умовах функцюнального навантаження метабол1чних систем печшки сприяе активацп синтезу РНК та ДНК, що призводить до зростання продукци бшав гепатоцитами (особливо а2-глобулшв), посилюе актившсть бшоксингезуючого апарату.

Природний пептидний комплекс печшки виявляе регуляторний вплив на енергетичний обмш в клгтинах печшки, в основному, на мггохотщиальне окисления в гепагощпах, шляхом активацп цитохромоксидази 1 гадвшдекняы синтезу АТФ.

Природний пептидний комплекс печшки приймае участь в регуляци процеав детоксикацп в цьому оргаш на р1вш пдроксилювання шляхом гальмування пдроксилазно! аюгивносп цитохрому Р450, що перешкоджае накопиченню вторинних токсичних продукпв та знижуе стушнь пошкодження гепатощгпв внаслщок до токсишв (фешллдразину, етанолу, тюпенталу натрио, тетрахлорметану).

Природний пепгидний комплекс печшки при введеню прооксиданпв регулюе р1вень вшьнорадикального окисления шляхом зниження функщонально! активносп м1кросомальних оксигеназ (цитохром Р45о), активуе даяльшсть ферменпв глутагюнпероксидази, глутатюнгрансферази та сприяе шдвшценню вм1сту есенщальних бюантиоксиданпв в печшщ.

Пептидний комплекс печшки виявляе регуляторний вплив у вигляда

модуляци параметр1в вутлеводного, л1щдного, бшкового облагав, перекисного окисления, антиоксиданпгого статусу в печшщ, забезпечуе нормальне функцюнування печшки та вщновлення ïï стану шсля функцюналышх навантажень, що дозволяе пропонувати йото подальше вивчення як фармаколопчжи речовинн.

KmoHOBi слова: пептвдний комплекс, печанка, ф1з1олопчна актившсть, пептндерпчна регулящя, обмгн речовш.

Garkovith A.L. Physiological activity peptide complex of a liver. -Manuscript.

Dissertation for the scientific degree of the candidate of biological sciences on a speciality 03.00.13 - Human end Animal Physiology, Institute Pig-Brreeding UAAS, Poltava, 2000.

Dissertation devoted to study of physiological activity peptide complex chosen from a liver. Peptide complex of a liver, which was obtained by organic acids extraction at the presence of cations of metals.

Peptide complex of a liver has own physiological activity, which is directed on support metabolic and repair of processes in this organ.

Peptide complex of a liver realizes effect, which is exhibited by modulation ol parameters carbogidrate, lipid, nitrogen exchanges, radikal of oxidation, antioxdante status in a liver, ensures normal operation of a liver and reproduction it of a condition after functional loads, that allows to offer it further study as pharmacological substance.

Key word, peptide complex, liver, physiological activity, peptidergique regulate, exchange of substances.