Действие адреналина, цАМФ и АТФ на образование пептидов возрастными фракциями эритроцитов человека

Кленов, Роман Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Действие адреналина, цАМФ и АТФ на образование пептидов возрастными фракциями эритроцитов человека
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Действие адреналина, цАМФ и АТФ на образование пептидов возрастными фракциями эритроцитов человека"

На правах рукописи

КЛЕНОВ РОМАН ОЛЕГОВИЧ

ДЕЙСТВИЕ АДРЕНАЛИНА, цАМФ И АТФ НА ОБРАЗОВАНИЕ ПЕПТИДОВ ВОЗРАСТНЫМИ ФРАКЦИЯМИ ЭРИТРОЦИТОВ

ЧЕЛОВЕКА

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004Ы* А ои

Уфа - 2010

2 5 НОЯ 2010

004614160

Работа выполнена на кафедре биохимии ГОУ ВПО Самарский государственный университет

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Клёнова Наталья Анатольевна

Официальные оппоненты: д.б.н. Гарипова Маргарита Ивановна

Башкирский государственный университет (г. Уфа) д.м.н. Радомская Виктория Марковна Самарский государственный медицинский университет Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и

биохимии им. И.М.Сеченова РАН (г. Санкт-Петербург)

Защита состоится » K.ClC ¿jti-C 2010 г. в «-/(-» » часов

на заседании Объединенного Диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Учреждении Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71 ИБГ УНЦ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71), с текстом автореферата - на сайте ИБГ УНЦ РАН www.ibg.anrb.ru/dissov.html e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «<-1 » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Многие биологически активные соединения имеют пептидную природу. Регуляция биологических процессов с помощью олигопептидов и пептидов является одной из самых сложных и многофункциональных систем в живых организмах.

Работами отечественных и зарубежных ученых [Slemmon, Flood, 1994; Карелин с соавт. 1997, 1998, 2000, 2005, 2008] установлено, что образование пептидных молекул различной молекулярной массы тканеспецифично и представляет собой результат протеолитической деградации функционально важных белков: гемоглобина, актина, ряда внутриклеточных ферментов. Это привело к формированию положения о существовании тканеспецифических пептидных пулов, играющих существенную роль в процессах регуляции как на уровне клеток, так и на уровне всего многоклеточного организма.

По мнению исследователей [Карелин, Иванов, 2005] основной функцией тканеспецифического пептидного комплекса служит контроль трансформации, пролиферации и элиминации клеток соответствующей ткани. Исключительная важность регуляторов пептидной природы предполагает наличие сложного механизма деградации функциональных белков в клетках, в свою очередь, тонко регулируемого.

Карелиным с соавторами (1998, 2005, 2008) получены и изучены пептидные соединения, образующиеся в культурах эритроцитов человека, предшественниками которых является гемоглобин и некоторые другие белки клеток. Точная локализация, состав, а также механизмы действия комплекса протеолитических ферментов в эритроцитах в настоящее время не изучены. По одной из гипотез, пептиды образуются внутри эритроцитов, а затем выводятся из клеток, по другой, из эритроцитов экскретируются длинные фрагменты, из которых затем в плазме с помощью плазменных протеаз образуются короткие пептиды. Существует также точка зрения, по которой образование коротких пептидов из длинных предшественников связано с действием на них мембраноассоциированного ферментативного комплекса при их прохождении через мембрану [Clark, 1983, Галактионов, 1984, Карелин и др., 1998]. Установлено также, что этот процесс зависит от наличия в среде энергоресурсов (глюкозы) [Карелин и др. 1998]. Открытая эндокринная функция эритроцитов

требует выяснения механизмов образования биологически активных пептидов этими клетками, так как, во-первых, молекулы поступают непосредственно в кровь и оказывают генерализованное действие, а во-вторых, данные клетки не имеют внутриклеточных мембранных структур для локализации активных протеаз. Соответственно, в этих клетках комплекс ферментов, расщепляющих белки, должен иметь механизмы активации и ингибирования. Возможно, этот процесс генерации пептидов в эритроцитах подвергается сложной регуляции с помощью сигнальных молекул, действующих как извне, так и образующихся внутри клеток. Однако сведений о действии сигнальных молекул на образование пептидов в эритроцитах человека нет. Наиболее значительно на эритроцитах человека представлена р-адренорецепция. Известно, что эритроциты эффективно связывают лиганд р-адренорецепторов - адреналин [Голенда, 1994], что сопровождается увеличением содержания цАМФ в данных клетках. Эффективность реализации регуляторных механизмов через клеточную рецепцию зависит от функционального состояния клеток, что в свою очередь определяется их возрастом и уровнем образования АТФ.

Цель работы. Целью настоящего исследования стало изучение образование пептидных соединений различными возрастными фракциями эритроцитов человека в условиях действия адреналина, цАМФ и АТФ.

Задачи исследования:

1. Осуществить разделение гетерогенной популяции эритроцитов человека на молодые и старые клетки без использования чужеродных компонентов для создания градиента плотности.

2. Провести верификацию состава фракций эритроцитов по биохимическим и реологическим показателям.

3. Изучить процесс образования пептидных соединений популяцией молодых и старых клеток в условиях активации и блокирования р-адренорецепции.

4. Выявить различия в генерации пептидов фракциями молодых и старых клеток под действием экзогенных цАМФ, АТФ и ингибиторов фосфодиэстераз цАМФ.

5. Провести сравнение пептидных соединений, полученных при действии на эритроциты цАМФ, АТФ, адреналина и полученных при расщеплении гемоглобина под действием пепсина.

Научная новизна. Впервые предложен способ верификации функциональной полноценности фракций эритроцитов по степени эластичности мембраны, определенной методом оптического пинцета. Впервые исследовано образование пептидных соединений различными возрастными фракциями эритроцитов человека в условиях активации и блокирования р-адренорецепции. Установлено, что в присутствии адреналина происходит увеличение генерации и выхода пептидов из эритроцитов в плазму. Обнаружено, что в молодых клетках этот эффект выше. Выявлено также увеличение скорости образования пептидных соединений эритроцитами человека в условиях действия цАМФ, АТФ и при ингибировании фосфодиэстеразы цАМФ. Установлено, что среди пептидных соединений, образуемых эритроцитами, присутствуют фрагменты гемоглобина молекулярной массой 0,7-3,0 кДа (группа коротких пептидов) и 3-20 кДа (группа длинных пептидов). Обнаружено появление группы коротких пептидов только при действии адреналина на клетки.

Практическая значимость. Предложенный метод «оптического пинцета» может быть использован для экспресс-диагностики способности эритроцита к изменению формы, от которого зависит функциональная полноценность клетки. Обнаруженное изменение количества и спектра пептидных соединений при действии адреналина, а также увеличение количества пептидов внутри эритроцитов при действии АТФ, цАМФ и ингибиторов фосфодиэстераз цАМФ на клетки указывает на наличие сигнального пути активации продукции пептидных соединений эритроцитами человека. Дальнейшее изучение механизмов образования пептидных соединений позволит оценить высвобождение пептидов с определенной биологической активностью из эритроцитов в кровь в различных физиологических и патологических состояниях (стрессовые воздействия, гиперадреналинемия различной этиологии).

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Самарских областных научных конференциях студентов (2006-2009 гг.), на I Всероссийской конференции «Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты» (Самара, 2007), V международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в системе образования» (Тамбов, 2007), международной конференции молодых ученых «Ломоносов», секция «Биология» (Москва, 2008, 2009, 2010),

международной конференции, посвященной 90-летию Ереванского государственного университета и 75-летию факультета биологии, секция «Биохимия» (Ереван, 2009), IV международной конференции молодых ученых «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution» (Одесса, 2009), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009).

В 2008 г. в ходе работы выполнены совместные исследования с сотрудниками Самарского филиала Физического института им. П.Н. Лебедева РАН бюджетной темы № 01200805602 при частичной финансовой поддержке РФФИ (проект № 07-02-01280-а).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 1 монография, 6 работ опубликованы в рецензируемых журналах по перечню ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследований, главы данных собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложений, содержащих абсолютные величины полученных данных. Работа изложена на 133-х страницах машинописного текста, иллюстрирована 45-ю рисунками, содержит 18 таблиц и 9 приложений. В работе использовано 186 источников, из них 142 отечественных и 44 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили с использованием образцов цельной свежей крови человека, предоставленных Самарской областной станцией переливания крови. Средний возраст доноров (184 человека) составил 24,5±5 лет. Объектом исследования служили эритроциты человека, которые делили по возрасту на молодые и старые клетки без использования чужеродных компонентов для создания градиента плотности [Авраамова и др., 1975]. Фракции эритроцитов очищали с помощью трехкратной отмывки 0,154 M раствором хлористого натрия (рН 7,2, при 4°С) с режимом центрифугирования и упаковки 600 g в течение 10 минут.

Методы определения реологических и биохимических показателей эритроцитов

Индекс фильтруемости эритроцитов [Tannert, 1981] рассчитывали как отношение времени растекания (ti) 0,2 мл 0,154 M раствора NaCl (рН 7,2), и (t2) 0,03 мл суспензии эритроцитов с 50%-ным гематокритом в растворе Рингера-

Локка по ровной горизонтальной поверхности фильтров с размером пор 3-6 мкм, которые укреплялись в установке наподобие пялец - (t]/t2) * 100%.

Показатель деформируемости мембран измеряли методом оптической ловушки [Коробцов и др., 2009]. В суспензию эритроцитов помещались сферы латекса диаметром 6,1 мкм, которые приклеивались к подложке и эритроцитам одновременно. Такие эритроциты захватывались лазерным пучком оптической ловушки с силой 85±6 пН, и при перемещении подложки, оболочка эритроцитов начинала деформироваться. Процент деформации измеряли по отношению изменения диаметра клетки к первоначальному.

Степень гликозилированности мембран эритроцитов определяли по способности гликозилированных остатков белков восстанавливать нитросиний тетразолий в щелочной среде [Фельдкорен и др., 1991], проницаемость мембраны для мочевины по Кадывкиной [Кадывкина, 1987] и осмотическую резистентность - по Петрову [Петров, 1985], соотношение форм гемоглобина - по Заводник [Атауллаханов и др., 1984, Заводник и др., 1992], и содержание мембраносвязанного гемоглобина - по Токтамысовой [Токтамысова, 1990]. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяли по методу Конберга [Beutler, 1963].

Методы активации и блокирования p-адрснорецепции эритроцитов in vitro

Полученные фракции эритроцитов помещали в среду Рингера-Локка в отношении 1:1. Активацию и блокирование (З-адренорецепции эритроцитов проводили растворами адреналина и пропранолола (неселективного антагониста адреналина) в конечной концентрации 2 мкг/мл и 10 мкг/мл, инкубируя фракции эритроцитов при 37°С в течение 20 мин. и 2 мин. Действие экзогенного цАМФ на эритроциты человека изучали, инкубируя фракции клеток в среде Рингера-Локка с добавлением раствора цАМФ в конечной концентрации 60, 100 и 200 мкг/мл при 37 С 10 мин. с добавлением 20 мкг/мл тритона Х-100 для формирования пор [Барсуков, 2004]. Внутриклеточную концентрацию цАМФ повышали, инкубируя фракции эритроцитов с АТР в конечной концентрации 60, 100 и 200 мкг/мл, а также за счет ингибирования фосфодиэстеразы цАМФ имидазолом (15, 43 и 72 мкг/мл) или 1,3-диметилксантином (20 мкг/мл) при 37°С в течение 10 мин.

Деградацию гемоглобина под действием пепсина проводили по методу Асатиани [1969], инкубируя препараты гемоглобина и пепсина в течение 4 часов в термостате при 37 С.

Гемоглобин и другие белки эритроцитов осаждали 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ). В надосадочной жидкости определяли содержание пептидных соединений по методу Лоури [Lowry et al., 1951] и по УФ-поглощению (Я=254 нм) [Малахова, 1995].

ТХУ-центрифугаты проб исследовали с помощью ионообменной хроматографии, гель-хроматографии (G-10, G-25) и электрофореза (7,5%-ном гюлиакриламидном геле в щелочной боратной буферной системе рН 9,2).

В работе использовали спектрофотометр СФ-46, охлаждающую центрифугу РС-6 (Россия), центрифугу Mechanica Precyzyjna typ 317 (Poland), ультратермостат УТ-15 (Россия), а также реактивы фирм Serva (GmBH), Sigma-Aldrich (U.S.A.), Boeringer (U.K.), 1CN Biomedicals (U.S.A.), Fermentas (U.K.).

Для статистической обработки результатов использовали критерий Стыодента. Правомерность использования критерия Стыодента была проверена с помощью оценки эмпирических выборок на соответствие нормальному распределению по критерию Пирсона, коэффициенту асимметрии и эксцесса; а также сравнения дисперсий выборок по критерию Фишера [Леонов, 1997]. Расчеты проводили с использованием пакета программ SPSS 14.

Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность главному врачу и сотрудникам Самарской областной станции переливания крови за предоставление образцов свежей донорской крови для исследований, а также сотрудникам оптической лаборатории ФИАН им. Лебедева, филиал в г. Самара за возможность проведения определения деформируемости эритроцитов с помощью метода оптической ловушки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Реологическая н биохимическая характеристика фракций молодых и старых эритроцитов

По данным исследователей по мере старения эритроцитов происходит изменение состояния системы оксигенации-дезоксигенации гемоглобина, мембраны и ферментных систем клеток, что снижает их функциональную полноценность [Бурчинский, 1985, Маслова, 1994, Выборнова и др., 1997].

Разделенные на возрастные фракции эритроциты должны отличаться по биохимическим и реологическим показателям. Результаты наших исследований подтверждают это положение. Измерение индекса фильтруемости фракций эритроцитов показало, что скорость прохождения молодых клеток через горизонтальную пористую поверхность фильтра была в два раза больше по сравнению со скоростью прохождения старых клеток (р<0,01, табл.1).

Определение процента и модуля деформируемости эритроцитов с помощью однопучковой оптической ловушки показало, что процент деформации молодых эритроцитов был в два раза больше, чем у старых клеток, а модуль деформируемости почти в два раза меньше (табл.1, р<0,01).

Таблица I

Индекс фильтруемости и измерения однопучковой оптической ловушкой

деформируемости молодых и старых клеток

Фракция эритроцитов Индекс фильтруемости, % Изменение длины,мкм Деформация, % Модуль деформируемости, мкН/м

Молодые клетки 83,2±5,0* 2,7+0,5* 38 32±6*

Старые клетки 41,0±0,5 1,2±0,3 18 70±17

* - достоверность отличий р<0,01.

Осмотическая резистентность молодых эритроцитов выше на 10% (р<0,05), чем у старых клеток. Проницаемость мембраны старых эритроцитов для молекул мочевины на 3% выше, чем мембраны молодых клеток (р<0,01). Это свидетельствует об ухудшении состояния мембраны, увеличении чувствительности к осмотическому лизису и механическим воздействиям с возрастом клеток, связанное со снижением энергообеспечения и уменьшением доли фосфолипидов по отношению к содержанию холестерина [Козлов, 1986, Казенное, Маслова, 1987, 1991, Викулов, 2001,3инчук, 2001].

Степень гликозилированности мембран старых эритроцитов оказалась на 14% больше, чем мембран молодых клеток (р<0,05). Это свидетельствует о значительном росте неспецифического (неферментативного) гликозилирования мембранных белков эритроцитарных клеток с возрастом. Изменение гликокаликса мембран является одним из сигналов утилизации старых клеток в

селезенке [Уайт, 1981, Clare et al., 1983, Викулов, 2001, Кленова, 2003, Миндукшев, 2009].

Наши исследования по анализу соотношения форм гемоглобина в возрастных фракциях эритроцитов не выявили различий в содержании оксигемоглобина (табл. 2). Содержание дезоксигемоглобина в старых клетках было на 1% меньше, чем в молодых клетках (р<0,01). Старые клетки также характеризовались более высоким (на 38%) содержанием метгемоглобина (р<0,01), что свидетельствует о превращении части дезоксигемоглобина в окисленную форму по мере старения эритроцитов (табл. 2). Это объясняется тем, что в старых клетках при меньшей интенсивности гликолиза и пентозофосфатного пути, снижается эффективность действия метгемоглобинредуктаз, зависящих от концентрации НАДН и НАДФН, что приводит к увеличению доли метгемоглобина.

Различий в содержании мембраносвязанного гемоглобина в старых и молодых клетках в наших экспериментах выявлено не было.

Таблица 2

Соотношение форм гемоглобина во фракциях молодых и старых эритроцитов

Молодые клетки Старые клетки

Оксигемоглобин (%) 47,87±0,07 47,94±0,09

Дезоксигсмоглобин (%) 51,63±0,08 51Д9±0,10

Метгемоглобин (%) 1,75±0,14 2,41 ±0,16

Определение активности глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы во фракциях эритроцитов выявило более низкий её уровень у старых клеток на 26-27% (р<0,01) по сравнению с молодыми. Высокая активность этого фермента во фракции молодых эритроцитов, показатели состояния мембраны и цитоскелета, а также низкий уровень метгемоглобинобразования свидетельствуют о качественном разделении исходной популяции эритроцитов на фракцию, содержащую преимущественно молодые и преимущественно старые клетки.

2. Влияние активации и блокирования р-адренорецепцин на образование пептидных соединений эритроцитами человека

По данным некоторых исследователей [Галактионов и др., 1984, Карелин и др., 1998, Аксенова, 1998] неспецифическое накопление пептидных соединений в крови человека происходит в ходе ряда патологических процессов и в условиях

стресса. Большая часть этих пептидов - результат ограниченного протеолиза плазменных белков. Возможно, часть биологически активных пептидных соединений может поступать в плазму из эритроцитов, являясь результатом процесса расщепления гемоглобина. По данным Карелина (1998, 2005), Филипповой (1997), Иванова (1992) генерация пептидов эритроцитами происходит с постоянной скоростью в физиологических условиях. Однако нельзя исключить того, что этот процесс может подвергаться многоуровневой регуляции различными соединениями через сигнальные системы эритроцита, например, аденилатциклазную систему.

Нами было изучено более длительное (20 мин.) и кратковременное (2 мин.) действие адреналина и пропранолола на фракции эритроцитов. Полученные результаты инкубации молодых эритроцитов в течение 20 минут при 37 С в присутствии повышенных концентраций (10 мкг/мл) лиганда р-адренорецептора (адреналина) и антагониста (пропранолола) не показали достоверных отличий в содержании пептидных соединений от контрольных проб (табл. 3).

Таблица 3

Содержание пептидных соединений в ТХУ-центрифугатах эритроцитов при долговременном и кратковременном воздействии адреналина и пропранолола (мкг/мл)

Контроль Адреналин Пропранолол Адреналин+Пропранолол

При инкубации 37иС 20 мин. с концентрацией 10 мкг/мл

Молодые клетки 565 ± 20 524 ± 42 606 ± 44 453 ± 37

При кратковременном воздействии концентрации 10 мкг/мл

Молодые клетки 200±11 300±15 198±26 240±26

Старые клетки 220±14 234±16 210±20 232±15

При кратковременном воздействии концентрации 2 мкг/мл

Молодые клетки 200±11 254±15 190±9 234±5

Старые клетки 220±14 240±9 215±7 230±9

При совместном инкубировании клеток с адреналином и пропранололом пробы отличались достоверно (р<0,05) более низким (на 20%) содержанием пептидных соединений по сравнению с контролем.

Взаимодействие гормона с рецептором сопровождается активацией фосфолипаз, увеличением скорости перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также частичным повреждением мембран за счет потери гормон-рецепторных комплексов с поверхности мембран внутрь клеток, что приводит к увеличению проницаемости эритроцитарных мембран и выходу части пептидных соединений из клеток [Борисенко, 1982, Выборнова и др., 1997, Макшанова, 2003].

Выход части пептидных соединений подтверждается увеличением их содержания в плазме почти вдвое при инкубации эритроцитов в плазме крови с адреналином (10 мкг/мл) при 37С 10 мин. (на 94%, р<0,001). Гель-хроматография (0-25) полученных пентрифугатов из плазмы с эритроцитами показала наличие одного пика коротких пептидов как в контрольной, так и в адреналиновой пробе. При действии адреналина УФ-поглощение пика было на 53% выше. Это подтверждает увеличение скорости образования пептидов в присутствии адреналина, а также ускорение выхода пептидных соединений в плазму.

Двухминутная активация [З-адренорецспции приводит к меньшим, по сравнению с двадцатиминутной, повреждениям мембраны эритроцита и позволяет зафиксировать повышение содержания пептидов внутри клеток. Активация р-адренорецепции молодых клеток адреналином сопровождалась увеличением содержания пептидов внутри эритроцитов на 50% при повышенной (10 мкг/мл) концентрации лиганда (р<0,001) и на 27% при действии физиологической концентрации (2 мкг/мл, р<0,05) по сравнению с контрольными пробами (табл. 3).

Повышение УФ-поглощения ТХУ-центрифугатов пептидов фракции молодых эритроцитов составило 23% (р<0,001) и 19% (р<0,01) соответственно при действии 10 и 2 мкг/мл адреналина (табл. 4).

Блокирование Р-адренорецепции пролранололом не приводило к изменению содержания пептидов по сравнению с контролем. При совместном добавлении адреналина и пропранолола, конкурентный характер их действия на рецепторы молодых клеток проявлялся в меньшей скорости образования пептидов по сравнению с воздействием только адреналина. Снижение содержания пептидных молекул составило 20% (р<0,05, табл.3) и УФ-поглощения 11% (р<0,05, табл. 4) при действии 10 мкг/мл лиганда и блокатора. Снижение скорости образования пептидных соединений при действии 2 мкг/мл пропранолола проявлялось в

уменьшении УФ-поглощения пептидных центрифугатов по сравнению с центрифугатами адреналиновой пробы на 11% (р<0,001, табл. 4). Таким образом, ответная реакция на кратковременную активацию Р-адренорецепции имела дозозависимый эффект.

Таблица 4

УФ-поглощение ТХУ-центрифугатов пептидных соединений эритроцитов при 2-х

минутном воздействии адреналина и пропранолола (^=254 нм, ОПхЮОО)

1 Контроль Адреналин Пропранолол Адреналин+Пропранолол

При воздействии концентрации 10 мкг/мл

Молодые 400±16 492±10 410±12 437±14

клетки

Старые 386±15 458±15 384±16 422±18

клетки

При воздействии концентрации 2 мкг/мл

Молодые 400±16 474±7 405±9 420±8

клетки

Старые 386±15 432±10 380±12 410±11

клетки

Ухудшение состояния рецепции мембраны и уменьшение энергоресурсов у старых клеток сопровождалось меньшей степенью повышения УФ-поглощения центрифугатов пептидов при активации Р-адренорецепции. При действии высокой концентрации адреналина увеличение поглощения у старых клеток составило 19% (р<0,01, табл. 4), и 12% при действии физиологических концентраций (р<0,05).

Активация р-адренорецепции эритроцитов не только увеличивает образование пептидов внутри клеток, но и изменяет их спектр. Данные ионообменной и гель-хроматографии показывают, что при действии адреналина удается обнаружить два пика (рис. 1). Пик, характерный для всех проб, показал достоверное (р<0,001) увеличение содержания пептидных соединений в пробах с воздействием адреналина по сравнению с контрольными пробами; а предшествующий ему, меньший в количественном отношении пик, имеется только в пробах с адреналином и адреналином + пропраналол (рис. 1,4).

буфер рН 8,0, >.=254 нм).

Для подтверждения гемоглобиновой природы внутриэритроцитарных пептидов нами была проведена ионообменная хроматография пептидных центрифугатов из инкубационной среды гемоглобина с пепсином (4 часа инкубации). Хроматограмма показала также наличие двух, четко разделенных пиков: на 18 мл и на 27-33 мл элюата (рис. 2). Присутствие подобных пиков на хроматограммах эритроцитарных пептидов указывает на то, что преимущественно эти пептиды имеют гемоглобиновую природу.

ОПхЮОО

350 -

300 - .4-4 -0ч.

1...... _.......

250 - ( \ ' ' л' ' \ * П N. ----1ч.

200 - !Г\ 1'/ \ •\'Г\ ......2 ч.

150 - $ \ V/ ----3 ч.

г л \ / / Л. \

100 - / .'Я \ ----4 ч.

/ \' / * V.' -. \

50 - % / V / \1 \ л.

/ ' -г- Г......1----1 1 -Г- 1

0 п-----1---------1-----г..... 1 1

0 6 12 18 24 30 36 42 48 мл

Рис. 2. Хроматограмма пептидных соединений, полученных деградацией гемоглобина пепсином в течение 4 ч. инкубации (ДЭАЭ-целлюлоза, 0,1М трис-буфер рН 8,0, Х=254 нм).

Электрофорез пептидных соединений показал наличие одной полосы соединений в контрольных пробах как молодых, так и старых эритроцитов. Полоса характеризовалась Rf = 0,63 (Mr = 16 кДа) для молодых и 0,59 для старых клеток (рис. 3), что свидетельствует о наличии в них сходных пептидных соединений. Маркерные соединения для электрофореза фирмы Fermentas (U.K.) характеризовались Rf = 0,25 (альбумин Mr = 47 кДа), Rf = 0,31 (карбоангидраза Mr = 34 кДа) и Rf = 0,73 (лизоцим Mr = 20 кДа). Электрофореграммы адреналиновых проб (АД) характеризуются наличием полосы с Rf = 0,95 (Mr = 3 кДа), что свидетельствует о наличии более коротких пептидов, чем в контрольных пробах. На электрофореграммах пептидных соединений старых эритроцитов при действии адреналина присутствуют две полосы Rf = 0,95 и 0,51 (Mr =16 кДа).

Rf 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Рис. 3. Электрофореграмма пептидных соединений (7,5%-ный ПААГ, 1 - четыре часа инкубации гемоглобина с пепсином, 2 - АД (молодые.), 3 - АД (старые), 4 - имидазол (мол.), 5 - имидазол (стар.), 6 - контроль (мол.), 7 -контроль (стар.), 8 - маркерные соединения (лизоцим, карбоангидраза, яичный альбумин).

Электрофореграммы пептидных соединений, полученных четырехчасовой инкубацией гемоглобина с пепсином при 37 С, также содержат две полосы Rf = 0,63 (Mr = 15 кДа) и 0,71 (Mr = 13 кДа) (рис. 3). Электрофореграммы подтверждают изменение спектра пептидных соединений (появление более коротких молекул) при действии на клетки адреналина.

3. Действие экзогенного цАМФ на образование пептидных соединений эритроцитами человека

Формирование лиганд-рецепторных комплексов p-адренорецепторов сопровождается активацией аденилатциклазной системы и возрастанием

внутриклеточной концентрации цАМФ. Как показали наши исследования, действие экзогенной цАМФ не приводило к достоверному увеличению содержания пептидных соединений по методу Лоури (табл. 5). Возможно, это обусловлено не усилением расщепления гемоглобина и других эритроцитарных белков, а укорочением уже имеющихся внутри клетки более длинных пептидов на пути выхода их из эритроцитов. Это подтверждается измерением УФ-поглощения центрифугатов пептидных соединений, которое показало достоверное увеличение оптической плотности на 16% (р<0,05) и на 42% (р<0,001) при внесении в среду цАМФ соответственно в концентрациях 100 и 200 мкг/мл (табл. 5).

Добавление цАМФ в инкубационную среду в концентрации 100 и 200 мкг/мл во фракцию старых эритроцитов приводило к увеличению УФ-поглощения соответственно на 13% (р<0,01) и 38% (р<0,001, табл. 5). Результаты, полученные на фракции молодых и старых эритроцитов сравнимы, поскольку при добавлении сигнальной молекулы извне энергоресурс и состояние мембраны играют малую роль.

Таблица 5

Содержание пептидов и УФ-поглощение пептидных центрифугатов фракций эритроцитов при действии разных концентраций экзогенного цАМФ

Контроль 60 мкг/мл цАМФ 100 мкг/мл цАМФ 200 мкг/мл цАМФ

Содержание пептидных соединений (мкг/мл)

Молодые клетки 200±11 213±14 226±16 230±15

Старые клетки 220±14 223±20 235±17 237±18

УФ-поглощение пептидных центрифугатов (А.=254 нм, ОПхЮОО)

Молодые клетки 400±16 437±18 465±15 568±10

Старые клетки 386±15 415±12 43б±13 532±12

Исследование спектров пептидных соединений с помощью гель-хроматографии также показало увеличение пептидных соединений во фракции молодых эритроцитов при добавлении 200 мкг/мл цАМФ на 36%. Кроме того, пик характерный для всех проб приходился на первые 6 мл элюирования, что свидетельствует о присутствии коротких пептидных соединений сходной длины. Хроматограммы пептидных соединений, полученные при добавлении цАМФ во

фракцию старых эритроцитов, имели сходство с хроматограммами проб молодых эритроцитов, и УФ-поглощение пиков составило 22% и 34% соответственно от контроля при добавлении 100 и 200 мкг/мл цАМФ.

4. Действие экзогенного АТФ на образование пептидных соединений эритроцитами человека

Предшественником цАМФ в клетках является АТФ. Образование цАМФ из АТФ в небольших количествах - процесс постоянный даже без внешних сигналов. Синтез АТФ в эритроцитах ограничен процессом гликолиза и повышение его содержания в клетках увеличивает концентрацию цАМФ, что может привести к повышению уровня генерации пептидных молекул. 10 минут инкубации при 37 С фракции молодых эритроцитов с 100 и 200 мкг/мл АТФ повышало содержание пептидных соединений на 25% и 27% (р<0,01) соответственно (табл. 6). Увеличение УФ-поглощения центрифугатов пептидов фракции молодых эритроцитов составило 12% (р<0,05) и 28% (р<0,001) соответственно.

Во фракции старых эритроцитов достоверно наблюдалось лишь увеличение УФ-поглощения пептидных соединений при действии 200 мкг/мл АТФ на 26% (табл.6).

Таблица б

Содержание пептидов и УФ-поглощение пептидных центрифугатов фракций

эритроцитов при действии разных концентраций экзогенного АТФ

Контроль 60 мкг/мл АТФ 100 мкг/мл АТФ 200 мкг/мл АТФ

Содержание пептидных соединений (мкг/мл)

Молодые клетки 200±11 230±13 249±12 254±14

Старые клетки 220±14 234±16 241±15 250±13

УФ-поглощение пептидных центрифугатов (Х=254 нм, ОПхЮОО)

Молодые клетки 400±16 418±13 447±14 512±15

Старые клетки 386±15 398±14 420±12 486±17

Гель-хроматография (в-10) полученных ТХУ-центрифугатов показала наличие пептидных соединений, сходных по молекулярной массе с соединениями при действии цАМФ. Пик приходился также на 6 мл элюата. УФ-поглощение

пиков фракции молодых эритроцитов увеличивалось на 21% при концентрации АТФ 200 мкг/мл по сравнению с контрольными пробами. Хроматограммы полученные в пробах с молодыми и старыми эритроцитами не различались. УФ-поглощения пиков во фракции старых эритоцитов отличались от контрольных на 24% при действии 200 мкг/мл АТФ.

5. Влияние ингибирования фосфодиэстсразы цАМФ эритроцитов на образование клетками пептидных соединений

Молекулы цАМФ являются одними из главных вторичных посредников. Поэтому длительное поддержание высоких концентраций цАМФ может негативно сказаться на сохранении гомеостаза биохимических процессов в клетках. Фосфодиэстераза цАМФ расщепляет молекулы вторичного посредника через некоторое время после их образования до нециклического АМФ. Блокирование фосфодиэстеразы цАМФ увеличит время существования сигнальных молекул внутри клетки, что может сопровождаться активацией протеаз и увеличением скорости генерации пептидных соединений. Наши исследования показали, что блокирование фосфодиэстеразы цАМФ имидазолом увеличивало содержание пептидных соединений внутри молодых эритроцитов на 24% и на 52% (р<0,01) при действии 43 и 72 мкг/мл имидазола соответственно (табл. 7).

Увеличение содержания пептидных соединений во фракции старых эритроцитов составило 14% (р<0,05) при действии 43 мкг/мл и 27% (р<0,01) при действии 72 мкг/мл. УФ-поглощение пептидных центрифугатов увеличивалось на 19% и 29% (р<0,01) соответственно при действии 43 мкг/мл и 72 мкг/мл имидазола на молодые клетки (табл. 7). В старых клетках блокирование фосфодиэстеразы цАМФ имидазолом в концентрации 43 мкг/мл и 72 мкг/мл привело к увеличению УФ-поглощения пептидных центрифугатов на 26% и 30% (р<0,001).

Таблица 7

Содержание пептидов и УФ-поглощение пептидных центрифугатов фракций эритроцитов при действии различных концентраций имидазола

Контроль 15 мкг/мл имидазола 43 мкг/мл имидазола 72 мкг/мл имидазола

Содержание пептидных соединений (мкг/мл)

Молодые клетки 200±11 230±11 260±14 320±27

Старые клетки 220±14 230±7 250±7 280±13

УФ-поглощение пептидных центрифугатов (Х=254 нм, ОПхЮОО)

Молодые клетки 400±16 420±19 460±20 500±24

Старые клетки 386±15 417±15 486±18 502±21

УФ-поглощение пиков хроматограмм (С-10) центрифугатов пептидных соединений молодых и старых клеток не имели больших различий. Действие 43 мкг/мл имидазола на молодые эритроциты повышает УФ-поглощение пика на 13% (рис. 4), и на 21% при действии на старые эритроциты по сравнению с контрольными пробами.

ОПхЮОО

Рис. 4. Гель-хроматограмма (в-10) окситоцина (1000 Да) и пептидных соединений, полученных при действии адреналина (10 мкг/мл), имидазола (43 мкг/мл), АТФ и 1,3-диметилксантина на молодые эритроциты.

Добавление к пробам, содержавшим 43 мкг/мл имидазола, раствора адреналина в концентрации 10 мкг/мл приводило к увеличению как содержания

пептидных соединений, так и УФ-поглощения центрифугатов. У молодых клеток содержание пептидов повышалось на 37% по сравнению с пробами, содержавшими только имидазол и на 19% по сравнению с пробами, на которые воздействовали только адреналином (р<0,01, рис. 4).

Добавление в среду 72 мкг/мл имидазола повышает УФ-поглощение пиков на 36% во фракции молодых эритроцитов и на 49% во фракции старых эритроцитов.

Электрофореграммы полученных при действии 43 мкг/мл имидазола пептидных соединений содержат одну полосу. Электрофореграммы молодых эритроцитов имеют полосу с Rf = 0,81 (Mr = 10 кДа) (рис. 3). Полоса пептидных соединений старых эритроцитов при действии имидазола характеризовалась Rf = 0,73 (Mr = 13 кДа).

Для изучения образования пептидных соединений внутри эритроцитарных клеток, мы провели также инкубацию эритроцитов с добавлением 1,3-диметилксантина при 37°С в течение 10 минут. Известно, что 1,3-диметилксантин (1,3-ДМК) блокирует пуриновые рецепторы и Са2+-каналы L-типа, а также ингибирует все виды фосфодиэстераз циклических нуклеотидов эритроцитов (Мазур, 1988). Инкубация фракций эритроцитов с 20 мкг/мл 1,3-диметилксантином приводит к увеличению содержания пептидных соединений внутри молодых клеток на 37% (р<0,001) и на 21% (р<0,05) внутри старых клеток (табл.8).

Таблица 8

Содержание пептидов и УФ-поглощение пептидных центрифугатов фракций эритроцитов при действии 1,3-диметилксантина и 200 мкг/мл АТФ

J Контроль 1,3-ДМК 1,3-ДМК + АТФ

Содержание пептидных соединений (мкг/мл)

Молодые клетки 200±11 274±10 312±18

Старые клетки ' 220±14 267±14 292±17

УФ-поглощение пептидных центрифугатов (>.=254 нм, ОПхЮОО)

Молодые . клетки 400±16 472±12 514±15

Старые клетки 38б±15 480±16 526±21

Совместное инкубирование эритроцитов с 1,3-диметилксантином и 100 мкг/мл АТФ повышает содержание пептидных соединений по сравнению с контролем внутри молодых эритроцитов на 56% (р<0,001) и внутри старых эритроцитов на 33% (р<0,01), что свидетельствует о действии АТФ не только через пуриновую рецепцию, но и после проникновения внутрь клетки,

УФ-поглощение пептидных центрифугатов молодых эритроцитов повышается при действии 1,3-диметилксантина на 18% (р<0,01) и при совместном действии 1,3-ДМК с АТФ на 29% (р<0,001) по сравнению с контролем. УФ-поглощение пептидов во фракции старых эритроцитов возрастает на 24% (р<0,001) при действии 1,3-ДМК и на 36% (р<0,001) при совместном инкубировании с АТФ по сравнению с контролем.

Хроматограммы (С-10) полученных пептидных соединений при инкубации эритроцитов с 1,3-диметилксантином и АТФ, показали увеличение УФ-поглощение пиков на 20% и 29% при действии 1,3-ДМК отдельно и совместно с АТФ на молодые клетки соответственно. На старые клетки действие 1,3-ДМК и АТФ отдельно и совместно сопровождается увеличением УФ-поглощения пиков хроматограмм на 21% и 31% соответственно.

Гель-хроматография (С-10) полученных соединений подтверждает достоверное увеличение УФ-поглощения пиков пептидных центрифугатов молодых эритроцитов при действии адреналина, 1,3-диметилксантина и АТФ по сравнению с контрольными пробами. Дополнительный пик адреналиновой пробы выходит позже пика окситоцина (1000 Да, рис. 4).

Сравнение полученных нами данных гель-хроматографии и электрофореза пептидных центрифугатов, с учетом различий в скорости элюции пептидных соединений через поры разных сорбентов, позволяет предположить, что общий пик, характерный для всех эритроцитарных центрифугатов, содержал пептидные соединения молекулярной массы более 3000 Да (от 3 кДа до 20 кДа). Дополнительный пик соединений, регистрируемый как в эритроцитах, так и в плазме при действии адреналина на клетки характеризуется наличием пептидных соединений 700-3000 Да. Это согласуется с данными о массе пептидных соединений, регистрируемых в плазме крови при «экстремальных» ситуациях другими исследователями [Малахова, 1995, Аксенова, 1998].

Данные хроматографии и увеличение содержания пептидных соединений при действии сигнальных молекул свидетельствуют о частичном протеолизе гемоглобина до молекул средней массы. Регистрация увеличения содержания пептидных соединений в плазме крови и появление более коротких пептидов при действии на эритроциты адреналина свидетельствуют об укорочении пептидных соединений и выходе части пептидов в плазму при активации адренорецепции. Это согласуется с предположениями других исследователей об укорочении пептидных соединений гемоглобиновой природы при прохождении через мембрану эритроцитов в плазму [Карелин и др., 1998, Филиппова и др., 2008].

Таким образом, процесс генерации эритроцитами человека пептидных соединений, обладающих высокой биологической активностью (антипролиферативной, рилизинговой, эритропоэтиновой, опиоидной и др.), может регулироваться сигнальными молекулами. Повышение внутриклеточной концентрации цАМФ как через ¡}-адренорецепторы, так и ингибированием фосфодиэстеразы цАМФ сопровождается увеличением содержания пептидных соединений в эритроцитах.

Действие лиганда Р-адренорецепторов адреналина, активация аденилатциклазы и увеличение синтеза цАМФ в клетках сопровождается появлением еще одного пика пептидов, меньшего по величине и молярной массе соединений.

ВЫВОДЫ

1. Верификация по реологическим и биохимическим характеристикам эритроцитов, разделенных методом сепаратного центрифугирования без использования системы создания градиента плотности, показала качественное деление их на фракции молодых и старых клеток.

2. Установлено, что при 20-минутной инкубации эритроцитов в плазме в присутствии 10 мкг/мл адреналина происходит увеличение генерации и выхода пептидных соединений из эритроцитов в плазму. Уровень пептидных соединений в плазме повышается в два раза по сравнению с контролем.

3. Выявлено, что действие адреналина (2 и 10 мкг/мл) в течение 2-х минут на фракции чистых клеток увеличивает скорость образования пептидных соединений в эритроцитах. В молодых функционально полноценных клетках этот эффект выше, чем в старых. Блокирование р-адренорецепции эритроцитов

пропанолсшом не сопровождается увеличением скорости генерации пептидов клетками по сравнению с контролем.

4. Действие экзогенных цАМФ и АТФ (100 и 200 мкг/мл) на эритроциты увеличивает скорость образования пептидов как в молодых, так и в старых клетках дозозависимо. Функционально полноценные клетки более чувствительны к действию данных сигнальных молекул.

5. Повышение концентрации внутриклеточной цАМФ за счет ингибирования фосфодиэстераз цАМФ эритроцитов имидазолом (43 и 72 мкг/мл) и 1,3-диметилксантином (20 мкг/мл) увеличивает скорость генерации пептидов. Во фракции молодых клеток увеличение выше, чем в старых.

6. Установлено, что среди пептидных соединений, образуемых эритроцитами, присутствуют фрагменты гемоглобина. Молекулярная масса полученных групп пептидных соединений колеблется в пределах 0,7-3,0 кДа для коротких пептидов и 3-20 кДа для длинных молекул. Более короткие пептиды (0,7-3,0 кДа) обнаруживаются в условиях действия адреналина на клетки.

7. Количество пептидных соединений внутри эритроцитов увеличивается в условиях повышения концентрации цАМФ и АТФ в клетках, что свидетельствует о регулируемости процесса протеолитической деградации гемоглобина в эритроцитах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах нз перечня ВАК

1. Кленова H.A., Кленов P.O. Механизмы генерации пептидов эритроцитами человека // Вестник Самарского госуниверситета. Ест.науч. серия. Биология. - 2006. -№7(47).-С. 75-79.

2. Кленов P.O. Содержание и спектр внутриэритроцитарных пептидов в условиях повышения концентрации цАМФ // Известия Самарского Научного Центра РАН. - 2009. -№ 1(4).-С. 737-740.

3. Кленов P.O., Кленова H.A. Сигнальный механизм образования пептидных соединений эритроцитами человека // Вестник Тверского госуниверситета. Серия «Биология и экология». - 2009. - Вып. 11, №2. - С. 65-69.

4. Кленов P.O., Кленова H.A. Спектры внутриэритроцитарных пептидных соединений в условиях действия эндогенного и экзогенного цАМФ // Вестник Тверского госуниверситета. Серия «Биология и экология». - 2009. - Вып.13, №14. - С.91-95.

5. Коробцов А.В., Котова С.П., Лосевский Н.Н., Майорова А.М., Кленов Р.О., Кленова Н.А. Применение лазерного пинцета для изучения механических свойств эритроцитов И Известия Самарского Научного Центра РАН. - 2009. -№3(11). - С 76-82.

6. Кленов Р.О.. Кленова Н.А. Действие цАМФ на образование пептидов в эритроцитах человека в зависимости от возраста клеток // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2010.-Т.149, № 6. - С.644-648.

Монография

7. Кленова Н.А., Кленов Р.О. Строение, метаболизм и функциональная активность эритроцитов человека в норме и патологии ! Самара: Самарский университет. - 2009. -116 с.

Публикации в других журналах

8. Кленова Н.А., Кленов Р.О. Механизм образования пептидных соединений в эритроцитах человека // Естествознание и гуманизм. Сборник научных трудов. - Томск, 2006. - Т.З, №4. - С. 16-17.

9. Кленова Н.А., Кленов Р.О. Изучение механизма образования пептидных соединений эритроцитами человека // Сборник научных трудов по материалам 5-й Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в системе образования» - Тамбов: Изд-во Першина Р.В. - 2007. - С. 109111.

10. Кленов Р.О., Чернова Е.В., Кленова Н.А. Спектры пептидных соединений в эритроцитах разного возраста в условиях действия экзогенного АТФ // Вестник СамГУ. Ест.науч.серия. Биология. - 2009. -№2 (68). - С.155-160.

Публикации в сборниках статей по материалам конференций

11. Кленов Р.О. Образование пептидов в эритроцитах человека при действии эндогенного и экзогенного цАМФ // Сборник статей по материалам международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино. - 2009. - С.224-229.

12. Klenov R.O., Klenova N.A. Peptides génération in the human erythrocytes at increasing of endocellular cAMP concentration // Proceedings of the IV international young scientists conférence «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution» - Odessa: Pechatniy dom, 2009.-P. 148-149.

Подписано в печать 11.10.2010. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Бумага книжно-журнальная. Гарнитура Times New Roman. Тираж 100 экз. Заказ № 97 / 552

Отпечатано с оригинал-макета в Издательском центре Ульяновского государственного университета 432000, г. Ульяновск, ул. JI. Толстого, 42

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кленов, Роман Олегович

Введение.

Глава 1. Строение, метаболизм и функциональная активность эритроцитов человека (обзор литературы).

1.1. Структурно-функциональная организация эритроцита человека.

1.2. Метаболические процессы эритроцитов человека.

1.3. Сигнальная система эритроцитов человека.

1.4. Апоптоз эритроцитов млекопитающих.

1.5. Генерация пептидных соединений эритроцитами человека.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Методы определения реологических и биохимических показателей эритроцитов.

2.2. Методы изучения действия адреналина, цАМФ, АТФ и ингибиторов на возрастные фракции эритроцитов in vitro.

2.3. Методы хроматографических исследований и электрофореза пептидных соединений.47t!

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Реологическая и биохимическая характеристика фракций молодых нестарых эритроцитов.

3.1.1. Показатели состояния мембран молодых и старых клеток.

3.1.2. Содержание различных форм гемоглобина в молодых и старых эритроцитах.

3.1.3. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы молодых и старых эритроцитов.

3.2. Генерация пептидных соединений эритроцитами человека при увеличении внутриклеточной концентрации цАМФ.

3.2.1. Действие долговременной активации и блокирования |3-адренорецепции на образование пептидных соединений эритроцитами человека.

3.2.2. Действие кратковременной активации и блокирования р-адренорецепции на образование пептидов эритроцитами человека.

3.2.3. Действие экзогенного цАМФ на образование пептидных соединений эритроцитами человека.

3.2.4. Действие экзогенного АТФ на образование пептидных соединений эритроцитами человека.

3.2.5. Образование пептидных соединений в условиях ингибирования фосфодиэстеразы цАМФ и частичного блокирования пуриновой рецепции эритроцитов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Действие адреналина, цАМФ и АТФ на образование пептидов возрастными фракциями эритроцитов человека"

Работами отечественных и зарубежных ученых [Иванов и др., 1992, 1997, 1998, 2005, Slemmon, 1994, Карелин и др., 1998, 2005, Филиппова и др., 2008, Шатаева и др., 2003] установлено, что образование пептидных молекул различной молекулярной массы тканеспецифично и представляет собой результат протеолитической деградации функционально важных белков: гемоглобина, актина, ряда внутриклеточных ферментов. Это привело к формированию положения о существовании тканеспецифических пептидных пулов, играющих существенную роль в процессах регуляции как на уровне клеток, так и на уровне всего многоклеточного организма.

По мнению ученых [Карелин и др., 2005, Иванов и др., 2005] основной функцией тканеспецифического пептидного комплекса служит контроль трасформации, пролиферации и элиминации клеток соответствующей ткани. Исключительная важность регуляторов пептидной природы предполагает наличие сложного механизма деградации функциональных белков в клетках, в свою очередь, тонко регулируемого.

В институте Биоорганической химии РАН им. М.М. Шемякина работами [Иванов и др., 1992, Карелин и др., 1998, 2005, Иванов и др., 1997, 1998, 2005, Филиппова и др., 2008] получены и изучены пептидные соединения, образующиеся в культурах эритроцитов человека, предшественниками которых является гемоглобин и некоторые другие белки клеток. Точная локализация, состав, а также механизмы действия комплекса протеолитических ферментов в эритроцитах в настоящее время не изучены. По одной из гипотез, пептиды образуются внутри эритроцитов, а затем выводятся из клеток, по другой, из эритроцитов экскретируются длинные фрагменты, из которых затем в плазме с помощью плазменных протеаз образуются короткие пептиды. Существует также точка зрения, по которой образование коротких пептидов из длинных предшественников связано с действием на них мембраноассоциированного ферментативного комплекса при их прохождении через мембрану [Галактионов и др., 1984, Карелин и др., 1998, Иванов и др., 2005]. Установлено также, что процесс зависит от наличия в среде энергоресурсов (глюкозы). Открытая эндокринная функция эритроцитов требует выяснения механизмов образования биологически активных пептидов этими клетками, так как, во-первых молекулы поступают непосредственно в кровь и оказывают генерализованное действие, а во-вторых, данные клетки не имеют внутриклеточных мембранных структур для локализации активных протеаз. Соответственно, в этих клетках комплекс ферментов, расщепляющих белки, должен иметь механизмы активации и ингибирования. Возможно, этот процесс образования пептидов в эритроцитах подвергается тонкой регуляции' с помощью сигнальных молекул, действующих как извне, так и образующихся внутри клеток. Однако сведений о действии сигнальных молекул на образование пептидов в эритроцитах человека нет. Наиболее значительно на эритроцитах человека представлена {3-адренорецепция. Известно, что эритроциты эффективно связывают лиганд р-адренорецепторов - адреналин [Голенда, 1994], что сопровождается увеличением содержания цАМФ в данных клетках. Эффективность реализации регуляторных механизмов зависит от функционального состояния клеток, что в свою очередь определяется их возрастом и уровнем образования АТФ.

Цель работы. Целью настоящего исследования стало изучение образования пептидных соединений различными возрастными фракциями эритроцитов человека в условиях действия адреналина, цАМФ и АТФ. Задачи исследования:

2. Провести верификацию состава фракций эритроцитов по биохимическим и реологическим показателям.

3. Изучить процесс образования пептидных соединений популяцией молодых и старых клеток в условиях активации и блокирования (3-адренорецепции.

5. Провести сравнение спектров пептидных соединений, полученных при действии на эритроциты цАМФ, АТФ, адреналина и спектров, полученных при расщеплении гемоглобина под действием пепсина.

Практическая значимость. Предложенный метод «оптического пинцета» может быть использован для экспресс-диагностики способности эритроцита к изменению формы, от которого зависит функциональная полноценность клетки. Обнаруженное изменение количества и спектра пептидных соединений при действии адреналина, а также увеличение количества пептидов внутри эритроцитов при действии АТФ, цАМФ и ингибиторов фосфодиэстераз цАМФ на клетки указывает на возможность сигнального пути активации продукции пептидных соединений эритроцитами человека. Дальнейшее изучение механизмов образования пептидных соединений позволит оценить высвобождение пептидов с определенной биологической активностью из эритроцитов в кровь в различных физиологических и патологических состояниях (стрессовые воздействия, гиперадреналинемия различной этиологии).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кленов, Роман Олегович

выводы

3. Выявлено, что действие адреналина (2 и 10 мкг/мл) в течение 2-х минут на фракции чистых клеток увеличивает скорость образования пептидных соединений в эритроцитах. В молодых функционально полноценных клетках этот эффект выше, чем в старых. Блокирование Р-адренорецепции эритроцитов пропранололом не сопровождается увеличением скорости генерации пептидов клетками по сравнению с контролем.

5. Повышение концентрации внутриклеточной цАМФ за счет ингибирования фосфодиэстераз цАМФ- эритроцитов имидазолом (43 и 72 мкг/мл) и 1,3-диметилксантином (20 мкг/мл) увеличивает скорость генерации пептидов. Во фракции молодых клеток увеличение выше, чем в старых.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные, их анализ и сопоставление с данными литературы, позволяют высказать несколько обобщенных положений об участии адреналина и цАМФ в генерации пептидных соединений эритроцитами человека, а также зависимости этого процесса от возраста (различий в состоянии мембран, активности ферментных систем и биохимических характеристик) красных кровяных клеток.

Эффективное функционирование эритроцита зависит от возможности поддержания реологических и биохимических характеристик на высоком уровне. Это определяется как соотношением компонентов мембран, отвечающих за способность к деформации и рецепции, так и активностью ферментных систем, отвечающих за метаболические процессы в клетках, транспорт газов по крови и другие функции.

Снижение каталитических функций ферментов пентозофосфатного пути окисления глюкозы и гликолиза сопровождается ослаблением функционирования метгемоглобинредуктазных систем из-за снижения образования НАДН и НАДФН, необходимых для ферментативной- редукции гемоглобина. Уменьшение производства АТФ ведет к постепенному нарушению АТФ-зависимых транспортных путей и нарастающему ионному дисбалансу клетки. Повышающийся процент метформы гемоглобина способствует заглублению триптофановых остатков белка в мембрану в области анкирина и приводит к снижению эффективности функционирования спектрин-актиновых комплексов и белка полосы 3. Это способствует неблагоприятному изменению белок-белковых и белок-липидных взаимодействий в мембране клетки [Бондаренко и др., 1985, Казеннов и др., 1991, Tillmann et al., 1980, Taylor, 1999].

Процесс старения эритроцита завершается сферизацией клетки и экспрессией на поверхность мембраны специфических антигенных структур, являющихся сигналом для уничтожения клетки [Clare, 1983, Сторожок и др., 1997].

Наши исследования подтверждают ухудшение реологических свойств эритроцитов при старении, а именно снижение деформируемости и осмотической резистентности старых клеток, и увеличение мембранной проницаемости для молекул мочевины. Также проведенные эксперименты подтверждают ухудшение состояния ферментных систем клеток при старении, сопровождающееся увеличением скорости метгемоглобинобразования и уменьшением активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы старых эритроцитов, полученных методом поэтапного центрифугирования с выделением возрастных фракций клеток.

В конце XX века появились сведения о формировании в клетках тканеспецифических пептидных соединений, обладающих широким спектром биологической активности. Изучение аминокислотной последовательности пептидов показало, что они являются фрагментами ряда функциональных белков и некоторых ферментов. Предшественником значительного количества биологически активных пептидов являются глобиновые цепи гемоглобина. Было показано, что пептидные соединения формируются также и внутри эритроцитарных клеток и экскретируются в плазму крови [Иванов и др., 1998, 2001, Карелин и др., 2005, Филиппова и др., 2008].

По одной из гипотез, олигопептиды образуются внутри эритроцитов, а затем выводятся из клеток (причем образование коротких пептидов из длинных предшественников связано с действием на них мембраноассоциированного ферментативного комплекса специфических протеаз при их прохождении через мембрану), по другой, из эритроцитов экскретируются длинные фрагменты, из которых затем в плазме образуются короткие пептиды. В дальнейшем было установлено, что внутри эритроцитов происходит интенсивный протеолиз гемоглобина, приводящий к образованию нескольких групп родственных пептидов. Затем они подвергаются дальнейшей деградации с N- и С-концов

Иванов и др., 1997, 2005, Филиппова и др., 2008]. Изучение биологической активности пептидных соединений генерируемых эритроцитами обнаружило наличие внутри клеток молекул, стимулирующих пролиферацию и секрецию в окружающую среду ингибиторов пролиферации, что позволило авторам предположить основную роль пула данных пептидов — поддержание равновесия клеток в культуре [Карелин и др., 2005].

Очевидно, что процесс образования биологически активных пептидных соединений в эритроцитах должен подвергаться регуляции. Однако, регуляторные механизмы процесса генерации пептидных соединений эритроцитами в настоящее время не выяснены. Есть данные о зависимости данного процесса от наличия в среде глюкозы — основного источника энергии эритроцитов [Карелин и др., 1998]. Активация протеолитических ферментов типа калпаина, каспаз и ряда других цистеиновых и аспартиловых протеаз происходит в условиях гиперосмотического шока и окислительного стресса [Миндукшев и др., 2010]. Увеличение содержания пептидных соединений в гетерогенной популяции эритроцитов в условиях окислительного стресса, созданного действием Fe2+ в сочетании с желточными липопротеидами, наблюдали [Кленова, 2004].

Возможно, что существуют различные механизмы активации протеолитических ферментов в эритроцитах, большая часть которых реализуется в экстремальных ситуациях при действии повреждающих факторов и является проявлением реализации программы апоптоза, другие осуществляются в физиологических условиях и направлены на образование специфических пептидных соединений с определенной регуляторной активностью. Регуляция может осуществляться с помощью различных сигнальных молекул извне и образующихся внутри клеток.

Мы исследовали процесс генерации пептидных соединений эритроцитами человека в условиях активации аденилатциклазной системы через p-адренорецепторы. Долговременное (10-20 минут) > действие адреналина

10 мкг/мл) на молодые функционально полноценные эритроциты сопровождалось выделением пептидных соединений в плазму, что подтверждалось как увеличением их содержания в плазме, так и отсутствием накопления их в клетках.

Кратковременное (2 минуты) действие как повышенных (10 мкг/мл), так и физиологических (2 мкг/мл) концентраций адреналина на эритроциты сопровождалось увеличением скорости образования пептидных соединений внутри клеток и их частичном укорочением. Эффект хорошо обнаруживается у функционально полноценных клеток, возможно, это обусловлено интакностью рецепторного аппарата молодых клеток. Хроматографически и электрофоретически регистрировались два пика пептидных соединений: один, характерный для эритроцитов как подвергнутых воздействию адреналина, так и контрольных. В случае действия адреналина этот пик просто увеличивался в размерах. Другой пик, значительно меньшей величины, обнаруживался только в присутствии адреналина. Пептидные соединения данного пика имеют меньшую молекулярную массу.

Нами было изучено также и действие увеличения содержания цАМФ внутри клеток на образование пептидных соединений. Повышение содержания цАМФ внутри клеток за счет инкубации эритроцитов с экзогенным цАМФ (100 и 200 мкг/мл) и его предшественником в клетках - АТФ (100 и 200 мкг/мл) привело к увеличению скорости образования пептидов эритроцитами человека. Эффект наблюдается как во фракции молодых, так и во фракции старых клеток, хотя наблюдается снижение чувствительности стареющих клеток к действию данных сигнальных молекул. Так как экзогенное действие как цАМФ, так и АТФ может осуществляться через пуриновую рецепцию без проникновения внутрь клетки, нами было осуществлено блокирование пуриновых рецепторов 1,3-диметилксантином. В условиях действия 1,3-диметилксантина, а также при комбинированном воздействии 1,3-диметилксантина и АТФ наблюдается увеличение содержания пептидных соединений в эритроцитах, более значительное увеличение регистрируется у молодых эритроцитов, причем при комбинированном воздействии он усиливается. Это можно объяснить тем, что 1,3-диметилксантин является одновременно и ингибитором фосфодиэстераз, разрушающих циклические нуклеотиды.

Молекула цАМФ в клетке разрушается с помощью фосфодиэстераз цАМФ, которые катализируют реакцию превращения этого соединения в нециклическую форму, не обладающую сигнальными функциями. Так как в отсутствии сигнала активность аденилатциклазы низка, а образующийся цАМФ постоянно разрушается фосфодиэстеразой цАМФ, уровень цАМФ в клетках можно временно повысить, ингибируя фосфодиэстеразу цАМФ. Мы провели изучение образования пептидных соединений в различных фракциях эритроцитов в условиях ингибирования фосфодиэстераз цАМФ имидазолом (43 и 72 мкг/мл) для увеличения концентрации цАМФ в клетке засчет увеличения времени ее существования. Это также привело к повышению, скорости образования пептидных соединений внутри как молодых, так и старых эритроцитов, хотя процент повышения у стареющих клеток меньше.

Таким образом, увеличение содержания пептидных соединений внутри эритроцитов происходит в условиях повышения количества цАМФ в клетках. Регуляторная роль цАМФ в эритроцитах может реализоваться через цАМФ-зависимые протеинкиназы (протеинкиназы А) [Мушкамбаров, 2003], дальнейшие пути развития эффекта могут быть многообразными. Активация протеолиза гемоглобина и, возможно, некоторых других функциональных белков может осуществляться за счет фосфорилирования белков кальциевых каналов или неселективного катионного канала (NSC-channel) и входа Са в клетку. Те же каналы активируются в условиях окислительного стресса [Lang et al., 2003]. Большинство же протеаз являются Са -зависимыми [Зварич, 1991, Альберте, 1994, Horga et al., 2000]. Нельзя исключить и непосредственное фосфорилирование некоторых протеаз цАМФ-зависимыми протеинкиназами, которые могут осуществлять активацию других протеолитических ферментов с помощью частичного протеолиза [Альберте, 1994, Мартынов и др., 1999, Мушкамбаров, 2003].

Активированные протеазы осуществляют деградацию гемоглобина до пептидных соединений молекулярной массы предположительно от 3 кДа до 20 кДа. Активация же через р-адренорецепторы приводит к укорочению пептидных соединений до пептидов молекулярной массы предположительно 700-3000 Да, а длительное действие адреналина позволяет зафиксировать выход коротких пептидов из эритроцитов в плазму.

Скорость образования пептидных соединений в условиях повышения внутриклеточной концентрации цАМФ в старых эритроцитах ниже, чем в молодых. Это указывает на зависимость регулируемого процесса генерации пептидов от состояния мембраны и активности ферментных систем клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кленов, Роман Олегович, Самара

1. Авраамова Т.В., Боровкина Т.И., Титова И.М. Анализ регуляции в системе красной крови Красноярск, 1975. - С. 175-180.

2. Аксенова В.М., Старкова A.B. Диагностическая ценность определения уровня веществ средней молекулярной массы в плазме новорожденных детей, перенесших внутриутробную гипоксию // Пермский медицинский журнал. 1998. -Т. 15. -№ 1. - С.25-28.

3. Антонов В.Ф. Структура биомембран // Соровский образовательный журнал. 1998.-№Ю(35).-С. 1-13.

4. Апуховская Л.И. Структурные особенности интегрального белка 3 мембран эритроцитов крыс при D-гиповитаминозе // Укр. биохим. Журнал. — 1991. — Т.63. — №3. С. 77-80.

5. Асатиани B.C. Ферментные методы анализа. М.: Наука, 1969. - 740 с.

6. Атауллаханов Ф.И., Буравцев В.Н., Жаботинский A.M. Взаимодействие пути Эмбдена-Мейергофа и гексозомонофосфатного шунта эритроцитов // Биохимия. 1981. —Т.46. — Вып.4. - С. 723-725.

7. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Жаботинский A.M. Влияние гликолиза на метаболизм аденилатов в эритроцитах человека // Биохимия. — 1984. — Т.49. — Вып.1. С. 104-110.

8. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Комарова C.B. Энергозависимые процессы и метаболизм аденилатов в эритроцитах человека // Биохимия. — 1996. -Т.61. Вып.2. - С. 266-274.

9. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Княткин А.Б., Пичугин A.B. Регуляция объема эритроцитов человека. Роль калиевых каналов, активируемых кальцием // Биофизика. 1998. — Т.38. — Вып.5. - С. 809-822.

10. Атауллаханов Ф.И., Корунова Н.О., Спиридонов И.С. и др. Как регулируется объем эритроцита, или что могут и чего не могут математические модели в биологии // Биологические мембраны. 2009. - №3. - С. 163-179.

11. Балашова Т.С. Перекисное окисление липидов и антиокислительная защита эритроцитов у больных сахарным диабетом 1-го типа // Тер. архив. — 1993. -№Ю.-С. 23-27.

12. Балмуханов Б.С., Булеганов К.Е., Басенова А.Т. Влияние содержания холестерина в мембранах эритроцитов на скорость оседания, электрофоретическую подвижность и скорость восстановления феррицианида калия // Биофизика. — 1990. — Т.35. — №2. С. 293-296.

13. М.Бароненко В.А., Тупиневич Г.С. Поверхностные свойства эритроцитарной мембраны показатель адаптации организма к стрессу //'. Физико-химические процессы исследования в медицине. - Уфа: Наука, 1985. - С. 4852.

14. Барсуков Л.И. Как собрать мембрану (Солюбелизация и реконструкция мембран) // Соросовский образовательный журнал. 2004. - Т.8. — №1. — С. 10-16.

15. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия /- М.: Медицина, 1990. -544 с.

16. Биохимия человека. Пер. с англ. / Р. Марри и др.; пер. с англ. М.: Мир, 1993.-Т.1.-384 с.

17. Биохимия человека. / Р. Марри и др.; пер. с англ. М.: Мир, 1993. — Т.2. -415 с.

18. Блюменфельд Л.А. Гемоглобин // Соровский образовательный журнал. — 1998.-№4(29)-с. 33-38.

19. Бондаренко C.B., Ушакова И.П., Левин Л.Ф. Изучение взаимодействия гемоглобина с фосфолипидными мембранами различного состава // Биоорганическая химия. 1985.-Т.П.-№10.-С. 1385-1389.

20. Борисенко Г.М. Особенности ß-адренергического рецептора при гипертонической болезни и спонтанной гипертензии у крыс // Кардиология.- 1982.-Т.22.-№3.-С. 120-125.

21. Буланова A.B., Полякова Ю.Л. Хроматография в медицине и биологии. -Самара: Самарский университет. 2006. - 116 с.

22. Бурчинский С.Г., Кульчицкий O.K. Возрастные аспекты рецептор-эффекторных реакций и регуляции активности аденилатциклазы // Укр. биохим. журнал. 1985. Т.57. - №4. - С. 24-27.

23. Быкова И.А. Морфологические особенности эритроцитов периферической крови в норме и патологии // Гематология и трансфузиология. 1991. - Т.36.- №6. С. 466-469.

24. Варламова C.B. Методы сепарации возрастных фракций эритроцитов // Лаб. дело. 1989. - №9. - С. 32-35.

25. Васильев А.П. Определение индекса фильтруемости эритроцитов // Лаб. дело. 1991. - №9. - С. 44-46.

26. Взаимодействие гормонов с рецепторами / под ред. Дж. Леви. М.: Мир, 1979.-564 с.

27. Викулов А.Д., Осетров И.А., Мельников A.A. Активность Na, К-АТФазы эритроцитов у физически активных лиц // Физиология человека. — 2001. — Т.27. — №3. С. 129-132.

28. Витриченко Е.Е. Состояние эритроцитов крыс при эмоциональном стрессе // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 1985. — №12. С. 675-677.

29. Выборнова И.И., Епифанов С.Ю., Каданцев В.Н., Кононенко K.M. Исследование механизмов влияния температурного и химического факторов на функционирование биологических мембран // Физиология человека. — 1997. -Т.23.-№1.-С. 70-80.

30. Галактионов С.Г., Цейтин В.М., Леонова В.И. Пептиды группы «средних молекул» // Биоорганическая химия. — 1984. — Т.10. — №1. С. 5-17.

31. Гауко Г.Г., Мажуль М.М.,. Позднякова Е.А. Перекисное окисление липидов в тканях крыс различного возраста в норме и при старении // Бюлл. экспер. биол. и мед. -1982. №4. - С. 30-32.

32. Голенда И.Л., Голенда А.И., Галлеев А.Р. Кинетический способ исследования адренорецепторов в эритроцитах // Физиология человека. — 1994. — Т.20. — №3. — С. 151-155.

33. Голенок В.А., Ханыкина И.В. Гликозилированные протеиды и реологические свойства эритроцитов при нарушениях углеводного обмена // Тер. архив. 1991. - №12. - С. 113-117.

34. Гологорский В.А., Петухов Е.Б., Александрова Н.П. Ухудшение деформируемости эритроцитов как один из факторов, определяющих тяжесть состояния больных // Анастезиол. и реаниматолог. — 1982. — №1 -С. 38-41.

35. Гончарова Е.И., Пинаев Г.П. Белки цитоскелета эритроцитов // Цитология. — 1988. — Т.ЗО. — №1. С. 5-18.

36. Гончаренко М.С., Катков И.И. Влияние холестерина на устойчивость мембраны // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1985. - №3. - С. 441-445.

37. Дамбинова С.А., Гурчин Ф.А., Шевченко К.А., Громов И.А. Влияние эндогенных пептидов на состояние медиаторных систем и компенсациюдвигательных расстройств при паркинсонизмах // Физиология человека. -1995. — Т.21. -№1. С. 10-16.

38. Дубинина Е.Е., Туркин В.В., Бабенко Г.А. Выделение и свойства супероксиддисмутазы плазмы крови человека // Биохимия. 1992. - Т.57. — №12.-С. 1892-1900.о

39. Дудиньска В., Хлынчак А.И., Скотницка Е., Суска М. Метаболизм пуринов в эритроцитах человека // Биохимия. 2006. - Т.71. - Вып.5. - С. 581-591.

40. Ермаков Г.Л. Надмолекулярная регуляция гликолиза эритроцитов. I. Состав цитоплазмы // Биохимия. 1995. - Т.60. - №4. - С. 560-567.

41. Иванов В.Т., Карелин A.A., Михайлова И.И. Выделение, структура и свойства новых эндогенных пептидов // Биоорганическая химия. 1992. -Т.18. №Ю-11.-С.1271-1311.

42. Иванов Г.П. Современные представления о транспорте кислорода // Усп. физиол. наук.-2001.-Т.32.- №4.-С. 15-18.

43. Иржак Л.И. Буферные свойства гемоглобина и его сродство к кислороду // Докл. АН СССР. 1984. - Т.387. - №4. - С. 925-927.

44. Иржак Л.И. Состав и функции крови // Соровский образовательный журнал. -2001.- №2.-С. 11-19.

45. Кадывкина З.М., Колмаков В.М., Радченко В.Г. Проницаемость эритроцитарных мембран у больных с хроническими заболеваниями печени // Клиническая медицина. 1987. - №8. - С. 157-159.

46. Казеннов A.M., М.Н. Маслова Структурно-биохимические свойства мембраны безъядерных эритроцитов // Физиологический журнал им. Сеченова. 1987. - №12. - С. 1587-1598.

47. Казеннов A.M., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Исследование активности АТФ-зы эритроцитов млекопитающих // Биохимия. 1984. - Т.46. - Вып.7. — С. 1089-1095.

48. Казеннов A.M., Маслова М.Н. Влияние мембранного скелета безъядерных эритроцитов на свойства транспортных АТФ-аз // Цитология. 1991. - Т.ЗЗ. -№11.-С. 32-41.

49. Карабанов Г.Н. Деформируемость эритроцитов // Анестезиология и реаниматология. 1984. -№1. - С. 71-73.

50. Карелин A.A., Филиппова М.М., Яцкин О.Н. Протеолитическая деградация гемоглобина в эритроцитах приводит к образованию биологически активных пептидов // Биоорганическая химия. 1998. - Т.24. - №4. - С. 271-281.

51. Карелин A.A., Иванов В.Т. Пептидомика новое направление постгеномных технологий // Вестник Российской академии наук. - 2005. - Т. 75. - № 2. - С. 139-148.

52. Катюхин Л.Н. Реологические свойства эритроцитов. Современные методы исследования // Физиологический журнал им. Сеченова. 1995. - №6. — С. 122-129.

53. Кирпичева А.Г., Зимин Ю.В. Влияние молекул средней массы на альдегиддегидрогеназную систему печени и эритроцитов в эксперименте // Успехи современного естествознания. 2004. - №4. — С. 21-23.

54. Кленов P.O. Содержание и спектр внутриэритроцитарных пептидов в условиях повышения концентрации цАМФ // Известия Самарского Научного Центра РАН. 2009. - № 1(4). - С.737-740.

55. Кленов P.O., Кленова H.A. Сигнальный механизм образования пептидных соединений эритроцитами человека // Вестник Тверского госуниверситета. Серия «Биология и экология». 2009. - Вып.11, №2. - С.65-69.

56. Кленов P.O., Кленова H.A. Спектры внутриэритроцитарных пептидных соединений в условиях действия эндогенного и экзогенного цАМФ // Вестник Тверского госуниверситета. Серия «Биология и экология». 2009. -Вып.13, №14. - С.91-95.

57. Кленов P.O., Кленова H.A. Действие цАМФ на образование пептидов в эритроцитах человека в зависимости от возраста клеток // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2010. - Т. 149, № 6. - С.644-648.

58. Кленова H.A. Изменения метаболических процессов в эритроцитах практически здоровых мужчин в ходе физических нагрузок. М., 1997. -Юс. - Деп. в ВИНИТИ, №2090-В97.

59. Кленова H.A. Биохимические механизмы дезинтеграции эритроцитов человека в разных условиях функционирования: автореф. дисс. доктора биол. наук. Тюмень, 2003. - 45с.

60. Кленова H.A. Механизмы дестабилизации эритроцитарных клеток в условиях лактоацидоза и действия нитрозотиолов // Вест. СамГУ. Ест.науч. серия, 2002. №2(24). - С. 158-163.

61. Кленова H.A., Елистратова О.Ю., Полякова Ю.Л. Образование пептидных соединений в эритроцитах в условиях окисл. стресса // Вест. СамГУ. Ест.науч. серия. 1-й специальный выпуск, 2004. С. 163-170.

62. Кленова H.A., Кленов P.O. Механизм образования пептидных соединений в эритроцитах человека // Естествознание и гуманизм. Сборник научных трудов. Томск, 2006. - Т.З. - №4. - С. 16-17.

63. Кленова H.A., Кленов P.O. Механизмы генерации пептидов эритроцитами человека // Вест. СамГУ. Ест.науч. серия. Биология, 2006. №7 - (47). - С. 75-79.

64. Кленова H.A., Кленов P.O. Строение, метаболизм и функциональная активность эритроцитов человека в норме и патологии. Самара: Самарский университет. - 2009. - 116 с.

65. Козлов М.М., Маркин B.C. Мембранный скелет эритроцита: теоретическая модель // Биол. мембраны. 1986. - Т.З. - №4. - С. 404-422.

66. Козлова Н.М. Транспорт пирувата и глюкозы через эритроцитарные мембраны и роль спектрина в этом процессе // Биофизика. 1983: - Т.28. -Вып.5. - С. 826-827.

67. Козлова Н.М., Черницкий Е.А. Зависимость активности метгемоглобинредуктазы эритроцитов человека от температуры // Биохимия. 1994. - Т.56. - Вып.2. - С. 342-345.

68. Козловский В.А., Шмалий В.И. АТФ как мессенджер и мессенджер как мишень терапевтического воздействия // Лжи Украши. 2008. - №3 (119). -С.48-51.

69. Колобова Е.В., Дворянский С.А., Циркин В.И. Оценка ß-адренореактивности эритроцитов у рожающих женщин // Физиология человека. 1998. - Т.24. -№3. - С. 134-142.

70. Коробцов A.B., Котова С.П., Лосевский H.H., Майорова A.M., Кленов P.O., Кленова H.A. Применение лазерного пинцета для изучения механическихсвойств эритроцитов // Известия Самарского Научного Центра РАН. 2009. -№3(11).-С 76-82.

71. Кузнецова Н.П., Гудкин JI.P., Мишаева Р.Н. Повышение кислородтранспортной эффективности гемоглобина при его химической модификации // Биохимия. 1996. - Т.61. - Вып.4. - С. 680-689.

72. Леонов В.П., Ижевский П.В. Об использовании прикладной статистики при подготовке диссертационных работ по медицинским и биологическим специальностям // Бюлл ВАК РФ. 1997. - №5. - С. 56-61.

73. Локшина Л.А., Былинкина B.C. Протеолитические ферменты в процессинге белков // Усп. совр. биологии. 1990. - Т.109. - Вып.2. - С. 219-237.

74. Лукьянова Л.Д., Балуханов Б.С., Уголев А.Т. Кислородзависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние. М.: Наука, 1982. - 301 с.

75. Лурье Б.Л., Фель Ф.М. Среднемолекулярные пептиды крови больных с психическими нарушениями сосудистого генеза // Лаб. дело. 1986. - №3. -С. 192.

76. Луцик Е.Г., Попичев М.И., Коношеноко C.B. Активность внутриэритроцитарных ферментов и сродство гемоглобина к кислороду у спортсменов при воздействии физ. нагрузок // Физиология человека. 2001. -Т.27. -№2. - С. 140-142.

77. Мазур H.A. Основы клинической фармакологии и фармакотерапии в кардиологии. М.: Медицина, 1988. - 304 с.

78. Макшанова Г.П., Устьянцева И.М. Изменение проницаемости эритроцитарных мембран и показателей липидного обмена у больных с политравмой при раннем и отсроченном оперативном лечении // Физиология человека. 2003. - Т.29. - № 1. - С. 95-99.

79. Малахова М.Я. Метод регистрации эндогенной интоксикации. СПб. -1995.-33 с.

80. Малахова М.Я. Методы биохимической регистрации эндогенной интоксикации // Эфферентная терапия. 1995. - Т.1. - №2. - С.61-64.

81. Маринов Б.А., Резнева Р.Х. Противоположно направленная донорами и акцепторами регуляция сродства кислорода к гемоглобину // Биохимия. -1990. Т.55. -Вып.9. - С. 1616-1623.

82. Маркин B.C., Козлов М.М. Механические свойства мембранного скелета эритроцитов // Биологические мембраны. 1986. - №5. - С. 519-525.

83. Маслова М.Н. Активность мембранных ферментов эритроцитов при различных стрессорных воздействиях // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1994. - Т.80. - №7. - С. 76-80.

84. Маслова М.Н. Молекулярные механизмы стресса // Рос. физиол. журн. им И.М. Сеченова. 2005. - Т.91. -№11. - С. 1320-1328.

85. Матус В.К. Влияние ионов кальция на проникновение глюкозы в розовые тени эритроцитов // Цитология. 1979. - Т.24. - Вып.2. - С. 242-243.

86. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна, 1996. - Т.2. -685 с.

87. Миндукшев И.В., Кривошлык В.В., Добрылко И.А. и др. Нарушение деформационных и транспортных характеристик эритроцитов при развитии у них апоптоза // Биологические мембраны. 2010. - Т.27. - № 1. - С. 28-3 8.

88. Моисеева О.И. Транспорт кислорода кровью (роль эритроцитов) // Физиол. журнал СССР им. И.М.Сеченова. 1986. - Т.72. - №1. - С. 93-103.

89. Молекулярная биология клетки. / Б.Альберте и др.; пер. с англ. М.: Мир, 1994.-Т.1.-520 с.

90. Молекулярная биология клетки. / Б.Альбертс и др. пер. с англ. М.: Мир, 1994.-Т.2.-538 с.

91. Молекулярная структура мембран эритроцитов и их механические свойства / P.A. Сторожок, А.Г. Санников, Ю.М. Захаров. Тюмень: ТюмГУ, 1997.- 140 с.

92. Молчанова Т.П. Основы молекулярной организации белков мембраны эритроцитов и их дефекты, приводящие к гемолитическим анемиям // Гемат. и трансфузиология. 1989. - Т. 134. №7. - С. 32-41.

93. Морозова В.Т. Лабораторная диагностика гемолиза эритроцитов // Лаб. дело. 1988. -№3. - С. 77-79.

94. Муравьев A.B., Муравьев A.A. Вне- и внутриклеточные механизмы изменения агрегации эритроцитов // Физиология человека. 2005. - Т.31. -№4.-С. 108-112.

95. Мушкамбаров H.H. Кузнецов С.Л. Молекулярная биология. М.: ООО «Медицинское информационное агентство». - 2003. - 544 с.

96. Ю9.Мышкин А.Е. Окисление гемоглобина // Успехи химий. 1984. - Т.53.-Вып.б.-С. 1045-1071.

97. ПО.Мышкин А.Е., Богданова Л.Д. Феррицианидный способ тестирования препаратов гемоглобина // Гематология и трансфузиология . 1990. - №9. -С. 33-35.

98. Основы физиологии человека / под ред. Б.И. Ткаченко. СПб.: Международный фонд истории науки, 1994. - Т.1. - 567 с.

99. Парахонский А.П. Роль гормонов и рецепторов в адаптационных стратегиях при неблагоприятных условиях // Усп. совр. естествознания. -2005.-№4.-С. 65-68.

100. Пестов Н.Б., Дмитриев Р.И., Шахпаронов М.И. Регуляция Са2+-АТР-азы плазматических мембран И Усп. биол. химии. 2003. - Т.43. - С. 99-138.

101. Петров В.К. Взаимодействие некоторых вазоактивных веществ с фосфолипидами и эритроцитарными мембранами // Фармакология и токсикология. 1985. - №2. - С. 72-76.

102. Петруняка В.В., Панюшкина Е.А. Взаимодейсивие кальция и протеинкиназ в регуляции ионотранспортирующих АТФаз плазматических мембран // Биологические мембраны. 1991. - Т.8. - С. 1138-1142.

103. Попичев М.И., Коношенко С.В., Толкачева Н.В. Внутриэритроцитарный метаболизм и сродство гемоглобина к кислороду у спортсменов различной квалификации при воздействии интенсивных нагрузок II Физиология человека. 1999. - Т.25. - №6. - С. 123-125.

104. Постнов Ю.В., Орлов С.Н., Покудин Н.И. Транспорт кальция и распределение кальмодулина в эритроцитах при первичной артериальной гипертонии // Кардиология. 1982. - Т.22. - №12. - С. 63-66.

105. Пушкарь Н.С. Теория и практика криогенного сублимационного консервирования. Киев: Наукова думка, 1984. - 252 с.

106. Розен В.Б. Основы эндокринологии. -М.: Изд-во МГУ, 1994. 384 с.

107. Руководство по гематологии: в 2 томах. Т.1 / под ред. А.И. Воробьева. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1985. - 448 с.

108. Самуилов В.Д., Олескин A.B., Лагунова Е.М. Программируемая клеточная смерть // Биохимия. 2000. - Т.65. - №8. - С. 1029-1046.

109. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л. Рецепторы физиологически активных веществ. М.: Медицина, 1987. - 400 с.

110. Сим Э. Биохимия мембран. М.: Мир, 1985. - 112 с.

111. Титов В.Н. Экзогенные и эндогенные патологические факторы (патогены) как причина воспаления // Клиническая лабораторная диагностика. 2004. -№5.-С. 3-10.

112. Тихомирова И.А., Муравьев A.B., Михайличенко JI.A., Голубкова Е.В. Анализ взаимосвязи электрофоретической подвижности и агрегационных свойств эритроцитов человека // Физиология человека. — 2006. Т.32. - №6. -С. 133-135.

113. Ткачук В.А., Авакян А.Э. Молекулярные механизмы сопряжения G-белков с мембранными рецепторами и системами вторичных посредников // Рос. физиол. журн. им И.М. Сеченова. -2003. Т.89. - №12. - С. 1478-1490.

114. Токтамысова З.С., Биржанова Н.Х. О мембраносвязанном гемоглобине // Биофизика. 1990. - Т.35. - №6. - С. 1019-1020.

115. Торосян Л.Г. Гликолизированный гемоглобин: методологические приемы и диагностическое значение (обзор литературы) // Лаб. дело. 1988. - №2. -С. 3-8.

116. Туликова З.А. Среднемолекулярные уремические токсины (обзор литературы) // Вопросы медицинской химии. 1983. - №1. - С.2-10.

117. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. Основы биохимии, пер. с англ. М.: Мир, 1981.-Т.1.-536 с.

118. Ушакова И.П., Василенко И.А., Серебренникова Г.А. Изучение взаимодействия гемоглобина с фосфолипидными везикулярными мембранами различного состава // Биоорганическая химия. 1981. — Т.7. — №4.-С. 613-617.

119. Фельдкорен Б.И., Осипова Е.И., Коцедуб Т.П. Исследование параметров метода определения гликозилированных белков сыворотки крови // Лаб. дело.-1991.-№5.-С. 56-58.

120. Физиология эритропоэза: руководство по физиологии / О.И. Моисеева и др. . Л.: Наука, 1979. - 360 с.

121. Физиология человека /под ред. Г.И. Косицкого. М.: Медицина, 1985. -560 с.

122. Филиппова М.М., Карелин А.А., Яцкин О.Н., Иванов В.Т. Фрагменты функциональных белков в переживающей культуре эритроцитов человека // Биоорганическая химия. 2008. - Т.34. - №2. -С. 160-170.

123. Чаленко В.В. Возможные причины повышения концентрации молекул средней массы при патологии // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1991. - №4. - С. 13-14.

124. Черницкий Е.А., Воробей А.В. Структура и функции эритроцитарных мембран. Минск: Наука и техника, 1981. - 216 с.

125. Шатаева Л.К., Хавинсон В.Х., Ряднова И.Ю. Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы). СПб.: Наука. - 2003. - 222 с.

126. Шишкина Г.Т., Дыгало Н.Н. Молекулярная физиология адренергических рецепторов // Усп. физиол. наук. 1997. — №1. - Т.28. - С. 61-69.

127. Яцкин О.Н., Карелин А.А., Иванов В.Т. Пептидомы мозга, сердца, легких и селезенки крысы: сходство и различия // Биоорганическая химия. 2009. -35(4).-С. 471-482.

128. Angelats M.G., Bortner C.D., Cidlowski J.A. Protein Kinase С (PKC) Inhibits Fas Receptor-induced Apoptosis through Modulation of the Loss of K1 and Cell Shrinkage // The Journal of Biological Chemistry. 2000. - V.275. - №26. - P. 19609-19619.

129. Baranowska-Bosiacka I., Hlynczak A.J., Wiszniewska В., Marchlewicz M. Disorders of Purine Metabolism in Human Erythrocytes in the State of Lead Contamination // Polish Journal of Environmental Studies. 2004. - V.13. - №5. -P. 467-476.

130. Baskurt O.K., Meiselman H.J. Blood rheology and hemodynamics // Semin. Thromb. Hemost. 2003. - V. 29. - № 5. - P. 435-450.

131. Bennett V. Beochemistry of blood in health and disease // J. Biol. Chem. -1992. V.267. - P. 8703-8706.

132. Beutler E. Glucose-6-phosphate-dehydrogenase deficioncy // Am. J.Clin. Pathol, and Clin. Med., -1963. -V.63. -N3. P. 203.

133. Beutler E. Red cell metabolism a monul biochemical methodes. N-Y; L., 1971.-P. 63.

134. Brecher A.S., Rosen M., Burkholder D.E. Membrane protease interaction III. A consideration of the difference in binding potential of pancreatic protease erythrocytes and erythrocyte ghost // Digestive Diseases and Sc. 1999. - №9. -P. 1774-1779.

135. Brookes P.S., Land J.M., Clark J.B., Heales S.J. Stimulation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by oxyhemoglobin // FEBS Lett. 416. 1997. - P. 9092.

136. Clare M.R., Mohandas N., Shohet S.B. The Red Cell Production, Metabolism, Destruction//Blood. 1983.-V.610.-P. 899-910.

137. Fung Y.C. Tsang W.C., Patitucci P. Hing-resolution data on the geometry of red blood cells //Biorheology. 1981. -V. 18. -№ 3-6. -P. 369-385.

138. Glaser R., Leitmannova A. Mathematical modelling of human echinocytes and the membrane bending discocytes, stomatocytes and echinocytes // Acta. Biol. Med. Ger. 1977. - v. 36. - № 5-6. - P. 1-19.

139. Grimes A.G. Human Red Cell Metabolism. Oxford: Blackwell, 1980 - 384 p.

140. Horga J.F. Gisbert J., De Agustin J.C. A beta-2-adrenergic receptor activates adenilate cyclase in human erythrocyte membranes at physiological calcium plasma concentrations // Blood Cells. Molecules and Diseases. 2000. - V.26. -№3. - P. 223.

141. Hilario S., Saldanha C., Martins-Suva J. The effect of adrenaline upon human erythrocyte properties. Sex-related differences // Bioreology. 1999. - V.36. -№1/2.-P. 124.

142. Ivanov V.T., Karelin A.A., Philippova M.M. et al. Hemoglobin as a source of endogenous bioactive peptides: the concept of tissue-specific peptide pool // Biopolymers. 1997. - V.43. - №3. - P. 171- 188.

143. Ivanov V.T., Karelin A.A., Blischenko E.Yu., Philippova M.M. and Nazimov I.V. Proteolytic degradation of hemoglobin in vivo. Role in formation of tissue specific peptide pool // Pure & Appl. 1998. - Vol. 70. - P. 67-74.

144. Ivanov V.T., Karelin A.A., Yatskin O.N. Generation of peptides by human erythrocytes: facts and artifacts // Biopolymers. 2005. - V.80. - №2-3. - P. 332346.

145. Kaiser G., Quiring K., Gauger D. Occurence of adenylate cyclase activity in human erythrocytes // Blood. 1974. - V.29. - P. 115.

146. Lang F., Lang K.S., Wieder T., Myssina S., Birka C., Lang P.A., Kaiser S., Kempe D., Duranton C., Huber S.M. Cation channels, cell volume and the death of an erythrocyte // Pfliigers Arch. 2003. - V. 447. - № 2. - P. 121-125.

147. Lang K.S., Lang P.A., Bauer C., Duranton C., Wieder T., Huber S.M. and Lang F. Mechanisms of Suicidal Erythrocyte Death II Cell Physiol Biochem. 2005. -V.15.-P. 195-202.

148. Lefkowitz R.J. Indentefication and regulation of alpha- and beta-adrenergic receptors // Fed. Proc. 1978. - V.37. - P. 123.

149. Linderkamp O., Meiselman H.J. Geometric, osmotic, and membrane mechanical properties of density-separated human red cells // Blood. 1982. - V.59. - №6. -P. 1121-1127.

150. Lionetti F.J., Rapoport S.M. Cellular and molecular biology of erythrocytes. -Tokyo: University of Tokyo Press, 1974. P. 143-166.

151. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. - V. 193.-P. 265-275.

152. Mant C.T., Hodges R.S. High-Perfomance Liquid chromatography of Peptides and Proteins: Separation, Analisis and Conformation. CRC, 1991. - 938 p.

153. Mannini L., Cecchi E., Fatini C., Marcucci R., Liotta A.A., Matucci-Cerinic M., Abbate R., Gensini G.F. Clinical haemorheology and microcirculation // Ann 1st Super Sanita. 2007. - V. 43. - №2. - P. 144-155.

154. Martinov M.V., Vitvitsky V.M., Ataullakhanov F.I. Volume stabilization in human erythrocytes: combined effects of Ca2+-dependent potassium channels and adenylate metabolism // Biophysical Chemistry. 1999. - V.80. - №3. - P. 199215.

155. Markin V.S. Lateral organization of membranes and cell shapes // Biophys. J. -1981. -V. 36. -№1. P. 1-19.

156. Michalak K. Integration of red blood cell spectrin with lysophospholipids // Biophys. Membr. Transp. 11 SCH. Biophys. Membr. Transp., Koscielisko-Zakopane, 4-13 May, 1992/ Sch. Proc. Pt. Wroslaw, 1992. - P. 307.

157. Mohandas N., Chasis J.A., Shohet S.B. The influence of membrane skeleton on red cell deformability, membrane material properties, and shape // Semin. Hematol. 1983. - V. 20. - P. 225-242.

158. Mueller T. J., Jackson C.W., Dokter M.E., Morrison M. Membrane skeletal alterations during in vivo mouse red cell aging. Increase in the band 4.1a:4.1b ratio // J.Clin.Invest. 1987. - V. 79. - P. 492-499.

159. Nach G.B., Mesielman H.J. Alteration of the cell membrane viscoelasticity by heat treatment: effect on cell deformability and suspension viscosity // Biorheology. 1985. - V. 3. -№2. - P. 73-84.

160. Podrasky E., Xu D., Liang B.A. A novel phosphoolipase-C and cAMP-independent positive inotropic medanis via a P2-purinoreceptor // Amer. J. Physiology. 1997. - Vol. 273. - №5. - Pt 2. - P. 2380-2387.

161. Rapoport J. The regulation of glicolisis in mamalian erythrocytes // Essays in Biochemistry. 4. London; N.Y. - 1968. - P. 69-104.

162. Rapoport S.M., Muller M. Cellular and Molecular Biology of erythocytes. -Tokyo: University of Tokyo Press. 1974. - P. 167-179.

163. Sager G., Jacobsen S. Effect of plasma on human erythrocyte beta-adrenergic receptors // Biochem. Pharmacol. 1985. - V.343. - P. 767.

164. Schneider J., Nicolay J.P., Foller M., Wieder T., Lang F. Suicidal Erythrocyte Death Following Cellular K+ Loss // Cell Physiol, and Biochem. 2007. - V.20. -P. 35-44.

165. Slemmon J.R., Hughes C.M., Campbell G.A., Flood D.G. Increased levels of hemoglobinderived and other peptides in Alzheimer's disease cerebellum // Journal Neuroscience. 1994. - V.14. - P. 2225-2235.

166. Tannert T.C., Lux K. Spreading of red cell blood suspensions on paper as a simple test of cell deformability // Acta biol.med.germ. 1981. - V.40. - P. 739742.

167. Taylor A.M., Boulter J. et al. Hydrodynamic Properties of human erythrocyte band 3 solubilized in reduced triton X-100 It Biophysical Journal. 1999. - V.76. -P. 2043-2055.

168. Tillmann W., Levin C., Prindull G. et al. Rheological properties of young and aged human erythrocytes // Klin. Wochenschr. 1980. - V. 58. - №1. - P. 569574.

169. Tuvia S., Moses A., Gulayev N. Beta-adrenergic agonists regulate cell membrane fluctuations of human erythrocytes // J.Physiol. 1999. - V.516. - P. 781.

170. Wijk R., Solinge W. The energy-less red blood cell is lost: erythrocyte enzyme abnormalities of glycolysis // Blood 2005. - V. 106. - №.13. - P. 4034-4042.

171. Winterbourn C.C. Oxidative Reactions of Hemoglobin // Methods in Enzymology.-1990.-Vol. 186.-P. 104-107.

Информация о работе

Кленов, Роман Олегович
кандидата биологических наук
Самара, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Действие адреналина, цАМФ и АТФ на образование пептидов возрастными фракциями эритроцитов человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы