Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аденилатциклазный сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аденилатциклазный сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных"

На правах рукописи

ПЛЕСНЁВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДОВ ИНСУЛИНОВОГО СУПЕРСЕМЕЙСТВА У ПОЗВОНОЧНЫХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

Биохимия 03.00.04

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биолог»-

□0315ЭВ89

Санкт-Петербург

2007

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М Сеченова, Российской Академии наук (зав лабораторией д.б.н., проф М.Н Перцева)

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор, Перцева М.Н.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, Аврова Н.Ф.

Доктор биологических наук, Пучкова Л.В.

Доктор биологических н!аук, Авдонин П.В

Ведущее учреждение

Физиологический Институт им. А.А. Ухтомского Санкт-Петербургского Государственного Университета

Защита состоится 23 октября 2007 года в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002 127 01 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им И.М. Сеченова РАН по адресу 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М Сеченова РАН

Автореферат разослан^- сентября 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д Q02.127.01

доктор биологических наук, профессор // ..

иАусМ-^й^у

М Н Маслова

Актуальность проблемы

Изучение гормональных сигнальных систем, участвующих в регуляции жизненно важных для организма клеточных процессов, является одной из актуальных проблем современной молекулярной эндокринологии и биохимии К числу систем, осуществляющих реализацию регуляторного действия веществ гормональной и негормональной природы, относится аденилатциклазная сигнальная система (АЦС), которая представлена в клетке сложным трансмембранным комплексом, состоящим, по крайней мере, из трех молекулярных блоков Необходимыми компонентами АЦС являются рецепторы, способные воспринимать внеклеточные сигналы, гетеротримерные ГТФ-связывающие белки (О-белки) стимулирующего (Ов) или ингибирующего (йО типа, состоящие из трех субъединиц - а, р, у и обеспечивающие сопряжение между рецепюром и третьим компонентом системы - ферментом аденилатциклазой (АЦ), катализирующей образование универсального внутриклеточного посредника - циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) При его участии осуществляется реализация целого ряда регуляторных эффектов в клетке (пролиферация, дифференцировка, апоптоз, синтез белка и др)

К настоящему времени в литературе накоплен значительный объем данных, свидетельствующих об участии АЦС и цАМФ в трансдукции сигналов группы гормонов не пептидной природы (серотонин, адреналин, норадреналин и др), осуществляющих свой эффект на клетку через рецепторы серпантинного типа, семь раз пронизывающие мембрану В рамках настоящего исследования мы предприняли попытку выяснить возможность участия АЦС в реализации действия пептидов инсулинового суперсемейства, обладающих рецепторами тирозинкиназного типа, один раз пронизывающими мембрану клетки. До исследований, проведенных нами, участие системы АЦС-цАМФ в реализации действия гормонов инсулиновой природы практически отрицалось В литературе имелись лишь отдельные сведения о влиянии инсулина, бомбиксина, релаксина на активность АЦ (РеПвеуа е1 а1, 2003, РаСе1, 2004) Несмотря на успехи, достигнутые за последние десятилетия в изучении молекулярных механизмов действия инсулина и инсулиноподобных пептидов, многие аспекты плейогрогшого действия этого гормона и родственных ему пептидов до сих пор остаются невыясненными (РеАзеуа е1 а1, 2003, Телкова, 2005) В связи с этим изучение ранее неизвестных молекулярных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства,

насчитывающего в настоящее время около 50 представителей, относится к числу актуальных проблем современной эндокринологии Согласно современным представлениям, инсулин и родственные ему пептиды играют ключевую роль в регуляции ряда клеточных процессов - клеточный рост, апоптоз, метаболизм Эти пептиды имеют общее эволюционное происхождение, так как возникли в ходе эволюции из общего анцестрального гена в результате дупликации и последующей дивергенции образовавшихся генетических линий, сохранив при этом структурное и функциональное сходство (Murray-Rust et al, 1992, Chan et al, 1992)

К изучению участия АЦС в реализации действия гормонов и ростовых факторов инсулиновой природы лаборатория приступила в начале 90-х годов Отправной точкой послужили данные, впервые полученные нами, о способности инсулина и родственных пептидов активировать ГТФ-зависимым образом АЦ в мышечных тканях млекопитающих и моллюсков (Plesneva et al, 1994) Мы использовали эволюционный подход, предложенный JIA Орбели (1958) применительно к эволюционной биохимии, который включал исследования в филогенезе, онтогенезе и при патологии Было изучено 1) влияние на АЦС инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) позвоночных и инсулиноподобного пептида (ИПП) беспозвоночных (моллюск Anodonta cygnea; 2) влияние на АЦС пептидов в тканях-мишенях животных разного филогенетического уровня (позвоночные - крысы, птицы и беспозвоночные - моллюски); 3) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС в онтогенезе (в тканях куриных эмбрионов разного возраста и у цыплят), 4) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС при экспериментальном диабете у позвоночных и беспозвоночных

Цель работы. Доказать участие аденилатциклазной сигнальной системы в реализации регуляторных эффектов инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска в клетке и расшифровать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма их действия в тканях позвоночных и беспозвоночных, а также установить роль АЦ сигнального механизма в регуляции фундаментальных клеточных процессов - клеточный рост, апоптоз

Задачи исследования

1 Исследовать действие инсулина, ИФР-1 и ИПП, выделенного из висцеральных органов моллюска Anodonta cygnea (Русаков и др., 1991), на АЦС в мышечных тканях

позвоночных и беспозвоночных Охарактеризовать зависимость эффекта от времени и концентрации исследуемых пептидов, а также от присутствия гуаниновых нуклеотидов для подтверждения вовлеченности в АЦ сигнальный механизм гетеротримерных О-белков

2 Исследовать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма, опосредующего эффекты пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных и выяснить последовательность этапов передачи регуляторных сигналов этих пептидов на АЦС С этой целью а) установить тип рецепторов и в-белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия пептидов, используя ингибиторы рецепторных тирозинкиназ и метод АДФ-рибозилирования бактериальными токсинами, б) выявить участие фосфатидилинозитол-3 киназы (ФИ-З-К), используя специфичный ингибитор вортманнин, в) идентифицировать изоформу протеинкиназы «С» (ПКС), используя ингибиторы ПКС и моноклональные антитела к изоформам ПКС

3 Исследовать участие АЦ сигнального механизма действия инсулина и ИФР-1 в регуляции процессов клеточного роста и апоптоза, исхода из гипотезы о важной роли цАМФ в регуляции фундаментальных процессов в клетке (Перцева, 2000)

4 Исследовать функциональные нарушения в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства при эндокринной патологии - сахарный диабет 1-го и 2-го типов

Научная новизна.

Впервые обнаружено стимулирующее действие инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска А су^пеа на активность АЦ Показано участие рецепторной тирозинкиназы и установлена вовлеченность О-белков (01) и (вя) типа в реализацию активирующего действия этих пептидов на АЦ Впервые показано, что в проявлении АЦ стимулирующих эффектов инсулина и ИФР-1 участвуют ФИ-З-К и изоформы ПКС - ПКС£ и возможно ПКСб

В мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных обнаружен ранее неизвестный АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 и установлена его структурно-функциональная организация, представленная в клетке следующей сигнальной цепью рецептор тирозинкиназного типа => 0г1-белок фу-димер) => ФИ-З-К => ПКС£ (позвоночные) или ПКСе (беспозвоночные) => Св-белок АЦ => цАМФ протеинкиназа «А» (ПКА) => эффекгорные системы Этот механизм отличается по числу

сигнальных блоков от известного АЦ сигнального механизма действия гормонов, обладающих рецепторами серпантинного типа, представленного в клетке следующей цепью рецептор серпантинного типа => в-белок (<31 или Се) АЦ => цАМФ ПКА => эффекторные системы

Следует отметить, что действие пептидов инсулиновой природы на АЦ в мышечной ткани моллюска осуществляется через АЦ сигнальный механизм, сходный с таковым позвоночных, но имеющий на пострецепторных этапах трансдукции гормонального сигнала отличие на уровне ГОСС Исходя из результатов нашего исследования, в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных принимает участие ПКС£, а у беспозвоночных (моллюски), как предполагается, - ПКСе

Экспериментально подтверждена, выдвинутая нами гипотеза, о важной роли АЦ-цАМФ в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на фундаментальные процессы в клетке Показано участие АЦ-цАМФ системы в способности ИФР-1 и инсулина стимулировать клеточный рост и ингибировать апоптоз в культурах фибробластоподобных клеток

Обнаружены нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина при патологии (сахарный диабет 1-го и 2-го типов) Теоретическое и практическое значение работы.

Теоретическое и практическое значение работы определяется важной ролью инсулина и других пептидов инсулинового суперсемейства в организме высших и низших животных Обнаружение новых сигнальных механизмов действия пептидов этой группы, в частности инсулина и ИФР-1, расширяет современные представления о спектре сигнальных систем, участвующих в регуляторном действии пептидов инсулинового суперсемейства.

Применение эволюционного подхода (изучение ряда эволюционно-родственных пептидов и использование представителей позвоночных и беспозвоночных) позволило выявить консервативность обнаруженного АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулиновой природы

Данные, полученные на беспозвоночных, могут быть полезны для понимания сигнальных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и для разработки моделей эндокринной патологии у человека (сахарный диабет) в рамках нового направления - «эволюционная биомедицина» (Перцева, 2006)

Полученные данные о молекулярных механизмах действия инсулина и ИФР-1 имеют фундаментальное значение и могут применяться при чтении курса лекций в университетах и медицинских ВУЗах как в России, так и за рубежом

Результаты исследования имеют важное практическое значение в плане выявления молекулярных основ этиологии и патогенеза сахарного диабета, а также в создании новых подходов для диагностики этого заболевания Обнаруженный нами АЦ сигнальный механизм действия инсулина, может служить основой для разработки биохимического теста, позволяющего проводить диагностику нарушения отдельных звеньев в молекулярном механизме действия инсулина Положения, выносимые на защиту

1 Впервые установлено, что пептиды инсулинового суперсемейства (инсулин, ИФР-1 и ИПП моллюска Апос1оМа суцпеа) ГТФ-зависимым образом активируют АЦ в тканях позвоночных (млекопитающие, птицы) и беспозвоночных (моллюски) животных

2 Реализация АЦ активирующего действия пептидов инсулиновой природы осуществляется через обнаруженный нами АД сигнальный механизм, включающий следующую сигнальную цепь рецептор-тирозинкиназа => выбелок (|3у-димер) => ФИ-З-К => ПШ; => Ов-белок => АЦ

3 С участием АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, осуществляется регуляторное действие пептидов инсулиновой природы на фундаментальные клеточные процессы - стимулируется клеточный рост и ингибируется апоптоз

4 При эндокринной патологии (сахарном диабете 1-го и 2-го типов) нарушается функционирование АЦ сигнального механизма действия гормонов инсулиновой природы в основном на уровне вв-белка и его сопряжения с АЦ

5 Сходство структурно-функциональной организации АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных животных свидетельствует об его эволюционной консервативности

Апробация работы

Основные результаты и положения работы были представлены и доложены на следующих конференциях и съездах 17-я, 19-я, 20-я, 21-я Конференции Европейского Общества Эндокринологов (Кордова, Испания, 1994, Нидерланды, 1998, Фаро, Португалия, 2000, Бонн,, Германия, 2002), 4-й Симпозиум по нейробиологии моллюсков (Амстердам, Нидерланды, 1994), Симпозиум по инсулину, ИФР-1 и инсулиноподобным

пептидам (Испания, Барселона,, 1997), ХХХП1 Международный конгресс физиологов (Санкт-Петербург, 1997), 2-й съезд Биохимического Общества РАН (Москва, 1997), XVII съезд физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998), конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 1998), Съезд Биохимического общества Университета Глазго (Глазго, Великобритания, 1999), 18-ый Международный конгресс биохимиков и молекулярных биологов (Бирмингем, Англия, 2000), 3-я и 4-я Международные конференция по релаксину и родственным пептидам (Брум, Австралия, 2000, Виоминг, США, 2004), XVIII Съезд Физиологического Общества имени И П Павлова, Казань, 2001), XI, XII и ХШ Международные совещания по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996, 2001, 2006), Международная Европейская конференция (Люксембург, 2002), Вторая конференция "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии", посвященная 80-летию со дня рождения МГ Колпакова (Новосибирск Октябрь, 2002), 1-й съезд Общества Клеточных Биологов (Санкт-Петербург, 2003), Физиологический съезд (Екатеринбург, 2004); 1-й Съезд физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005),

Публикации. По теме диссертации опубликовано 75 работ, в том числе 36 статей в рецензируемых отечественных и международных изданиях

Личный вклад автора - Экспериментальные данные получены лично автором или при его непосредственном участии

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 259 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 285 источников Работа иллюстрирована 43 рисунками и 35 таблицами

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили 1) представители позвоночных - крысы Ratus norvegicus линии Wistar, 2) куры породы русская белая «Леггорн»; 3) представители беспозвоночных - пресноводный двустворчатый моллюск Anodonta cygnea, 4) культура клеток миобластов куриных эмбрионов, 5) фибробластоподобная культура клеток линии Swiss ЗТЗ, 6) культура клеток, трансформированная из нормальных фибробластов линии ElA+cHa-ras (клетки, впадающие в апоптоз) и Е1А+Е1В (клетки, не впадающие в апоптоз)

Методы В работе использован широкий спектр физиологических, биохимических и фармакологических методов

- выделение фракций плазматических мембран мышечной ткани позвоночных и беспозвоночных животных с использованием метода дифференциального центрифугирования (Kidwai et al, 1973 с нашими модификациями),

- выделение частично очищенных мембранных фракций культуры клеток миобластов куриных эмбрионов, фибробластоподобных клеток линии Swiss ЗТЗ, ElA+cHa-ras, El А+Е1В (Плеснёва и др , 1999,2003),

- выделение фракции, содержащей примембранную форму цАМФ-ФДЭ (Houslay, 1985)

- определение активности АЦ с использованием радиоактивного субстрата АЦ реакции -[а32Р]АТФ (Salomon et al, 1974 с некоторыми модификациями),

- определение активности цАМФ-ФДЭ, с использованием радиоактивного субстрата [3Н]цАМФ (Ткачук и др , 1978),

- АДФ-рибозилирование гетеротримерных G-белков холерным и коклюшным токсинами (Pertseva et al, 1992),

- электрофорез в ПААГ

- иммуноблотинг с использованием моноклональных антител для идентификации изоформы ПКС£,

- определение ростстимулирующей активности действия инсулина, ИФР-1, ЭФР и цАМФ по включению [14С] тимидина в ДНК культуры клеток Swiss3T3 (Баркан и др 1992, Плеснева и др, 1997,1999),

- использование модели апоптоза на трансформированных клетках, полученных из нормальных эмбриональных фибробластов введением пары комплементирующих онкогенов ElA+cHa-ras, обладающих высокой проапототической чувствительностью к удалению ростовых факторов (Bulavin etal, 1999) и ее характеристика (Плеснёва и др, 2003),

- оценка антиапоптотического действия инсулина, ИФР-1 и цАМФ с использованием метода клоногенной выживаемости культуры клеток ElA+cHa-ras (Плеснёва и др, 2003),

- определение активности цАМФ-зависимой ПКА (Кузнецова, Плеснева, 2001),

- определение активности ферментов углеводного метаболизма - гликогенсинтетазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Кузнецова, 1998, Кузнецова и др , 2004),

- определения содержания белков методом Лоури,

- создания моделей экспериментального диабета 1-го и 2-го типов у позвоночных (Ping et al, 1999 с нашими модификациями) и диабетоподобного состояния у беспозвоночных (Плеснева и др, 2006, Кузнецова и др , 2007) с использованием стрептозотоцина

- статистические методы обработки данных по программам (Statgraph и Anova)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе представлены экспериментальные доказательства активирующего действия инсулина, ИФР-1 и ИПП на АД, установлена структурно-функциональная организация АЦ сигнального механизма в клетке и его роль в регуляции пептидами инсулиновой природы клеточного роста и апоптоза Основные этапы работы состояли в исследовании:

- действия пептидов инсулиновой природы на активность АЦ при разном времени и разной концентрации m vitro и ir, vivo,

- участия примембранной цАМФ-ФДЭ в функционировании АЦ сигнального механизма действия инсулиноподобных пептидов,

- звеньев АЦ сигнального механизма (от рецептора до эффекторных систем),

- роли АЦ сигнального механизма, как в регуляции клеточных процессов, так и его функционального применения в условиях патологии,

Влияние in vitro инсулина, ИФР-1 и ИПП на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных и в культурах клеток в разные временные сроки.

Проведено исследование m vitro динамики во времени АЦ активирующего эффекта инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска при концентрации пептидов 10"8М и для сравнения эпидермального ростового фактора (ЭФР), пептида не инсулиновой природы, обладающего рецептором тирозинкиназного типа (Никольский и др , 1987) Показано, что в мембранной фракции скелетных мышц крыс наибольшее выраженное активирующее действие исследованных пептидов на АЦ проявляется через 2 5 мин Активирующий АЦ эффект инсулина составляет +236% Эффект менее выражен при действии ИФР-1 (+201%), ЭФР (+186%) и ИПП моллюска+124% (Рис 1, Таблица 1)

Динамике во времени эффектов инсу 460 -1 на активность АЦ в мембранной фрак ^ 2.6 мин 6 мин 1 Время действия пегттада (мин) пина, ИПП и Эс цин мышц кры Г 1 -инсулин +инсулин <777?. ИПП ^Ш-ЭФР ЕЗЗ+ЭФР № сы

Рис 1 Концентрация пептидов- 10"8М Активация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100%, приведена в тексте Различия достоверны (р<0 05)

Таблица 1. Динамика во времени действия ИФР-1 на активность АЦ в мембранной

фракции скелетных мышц крыс

Воздействия Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)

2 5 мин 5 мин 10 мин

Без ИФР-1 71 2±4 8 85 11±3 3 101 20±9 24

(100%) (100%) (100%)

+ ИФР-1 214 3Ш2 1 136 16±5 2 96 14±4 6

(301%) (160%) (95%)

Примечание В скобках - базальная активность АЦ (без воздействий), принятая за 100% и активность АЦ (в %) при действии ИФР-1

В мембранной фракции культуры куриных миобластов показано (рис 2), что стимулирующий АЦ эффект инсулина через 2 5 мин составляет +256%, по сравнению с базальной активностью, принятой за 100% и имеет сходство с данными, полученными на мембранной фракции скелетных мышц крыс (+236 %) (рис 1)

В тканях моллюска А су^еа, ИПП, выделенный из висцеральных органов этого моллюска, оказывает наиболее выраженное активирующее действие на АЦ (+422%), по сравнению с ЭФР (+221%), ИФР-1 (+169%) и инсулином (+133%) (Рис 3, Таблица 2) Следует отметить, что активирующий АЦ эффект исследуемых пептидов в наибольшей

Рис 2 Концентрация инсулина 10 8М

Различия достоверны (р<0 05)_

степени проявляется через 2,5 мин, через 5 мин снижается, а через 10 минут практически отсутствует (Таблица 2, Рис 3)

Таблица 2 Динамика во времени действия ИФР-1 на активность АЦ в мембранной

фракции гладких мышц моллюска

Воздействия Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)

2 5 мин 5 мин 10 мин

Без ИФР-1 110 21±10 8 125 31±9 3 106 04±6 6

(100 %) (100%) (100%)

+ ИФР-1 259 92±11 4 229 31±5 2 103 81±5 8

(269%) (183%) (98%)

Примечание - как в таблице 1

Таким образом, в мембранных фракциях, выделенных из мышечных тканей исследуемых животных и культуры клеток куриных миобластов, наблюдается закономерность проявления эффекта пептидов в зависимости от времени действия Инсулин, ИФР-1, ИПП и ЭФР оказывают активирующее действие на АЦ в течение 2,5 и 5 мин с максимальным эффектом через 2 5 мин АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов видоспецифичен В скелетных мышцах крыс ряд эффективности пептидов по их влиянию на АЦ имеет следующий порядок, инсулин > ИФР-1 > ЭФР > ИПП, а в мышечных тканях моллюска - ИПП > ЭФР > ИФР-1 > инсулин

Pile. 3. Концентрация пептидов - 10'" М

Активация АЦ пептидами (а %) по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100%, приведена в ■ тексте. Различия достоверны (р<0.05). ____ _

Влияние In vivo разных доз инсулина на активность АЦ is тканях позвоночных и беспозвоночных в разные временные сроки.

Обнаружив в опытах In vitro стимулирующее влияние пептидов и «сули нового су пер семейства на активность АЦ, мы исследовали влияние инсулина, основного представителя инсу.ншонош суперсемейства, на активность АЦ в разных дозах и при разном времени действия в условиях in vivo. Эксперименты проведены на фракциях мышечных мембран крыс, куриных эмбрионов и моллюсков после введения инсулина (вн)'трибрюшинно или внугрижелточно) в дозах 0.05 нг/г-1 Онг'г есеа тела (вес крысы или куриного эмбриона, вес моллюска без раковины). Доза, вводимого in vivo инсулина рассчитывалась с учетом концентрации инсулина, используемой в опытах in vitro. Основанием для выбора дозы служили данные литературы и результаты наших опытов In vitro. Было показано, что в скелетных мышцах крыс стимулирующий АЦ эффект инсулина (+222%) выявляется через 5 мин после введения гормона (I иг/г), а через !5 мин он снижается почти в три раза (67%) (Рис. 4). При более высокой дозе инсулина (10 нг/г), стимулирующий АЦ эффект гормона через 5 мин выражен слабее (+124%), а через 15 мин отсутствовал.

Рис. 4. Активация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью АЦ, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05)__

Динамик* (юноностн АЦ во BpíVíkH • мембранной фракции крыс при введении рмных доз инсулина in vivo

Время действия гормона

В экспериментах in vivo в мембранных фракциях мышц куриных эмбрионов разного возраста обнаружен АЦ активирующий эффект инсулина. У 10-дневных куриных эмбрионов он выявлялся уже через 5 мин, более четко выражен через 15 мин, а через 30 мин не проявлялся (рис. 5),

Динамик* активности АЦ но времени о мембранной фракции Ю-дневных куриных эмбрионов при введении разный до* кксугтина fn vivo

t I -имсуттимО

+имсулнн O.WHTíf (10*Ц) +ИНСУПИН 0.5нпУ(10*М> «инсулин UHrir (íkIO^M)

Время действия гормона

Рис. 5. Различия достоверны (р<0.05)

У 17-дневных куриных эмбрионов выявлено дозозависимое активирующее действие инсулина на активность АЦ через 5 минут (Рис. 6), которое ослабевает через 15 и 30 мин после введения гормона.

Дннимнкл итланоъти АЦ «с ВР(ГЦ*НН в чеибранной фдокцин

? 'ДН t П.....% к^риМЫЯ ЭМбрлЭНРП гтрн пиСДЙНИИ раЗНЫХ

ДРЭ МНСУЛЙНД IR V'1'О

f I -КNС уп И и

^'Xi ^тгуцпу ОДБк л ряд • Ии СуЛИ И D.ÍHt/r (>

^^ * инсулин 1.7« Г*

Врими доЙСТВИ* гормоне

Рис. б. Различия достоверны (р<0.05)

При введении моллюскам инсулина (0.5 нг/г и 5.0 иг/г) активность АЦ возрастала через 5 мин после введения гормона на +49% и +381%, соответственно, по сравнению с контролем, принятым за 100%. Через 20 мин влияние гормона (0.5 нг/г) на активность АЦ снижается (+22%) и практически исчезает (+6%) через 40 мин (Рис, 7). При введении инсулина (5 нг/г) моллюскам АЦ стимулирующий эффект гормона через 20 мим составлял +110%, а через 40 мин +50% (рис. 7).

Динамика во времени активности АЦ в мембранной фракции гладких мышц моллюска при действии инсулина vivo

|__] .инсулин

ES3 -»инсулин 0.5НГ/Г (10* №) ^Ш* инсулин 5Hfír (10"' М)

20 нн

Время действия гормоне

Рис. 7. Светлые столбики - базадьная активность АЦ. Заштрихованные столбики - инсулин-стимулированная активность АЦ при разных дозах гормона. Различия достоверны (р<0.05).

Из полученных нами данных следует, что отчетливое влияние инсулина на активность АЦ в мышечных мембранах моллюска (Рис 7) выявляется при более высокой дозе инсулина, чем у млекопитающих и птиц Это можно объяснить тем, что у моллюска A cygnea рецепторы к инсулину не обнаружены (Лейбуш, Чистякова, 2003), а эффект инсулина может реализовываться через ИФР-1-подобные рецепторы или рецепторы ИПП моллюска, которые способны опосредовать активирующее влияние инсулина на АЦ (Шпаков и др , 2005)

Следует отметить, что проявление АЦ стимулирующего влияния инсулина и инсулиноподобных пептидов во времени имеет сходство в опытах т vitro и in vivo АЦ активирующий эффект пептидов отчетливо выявляется при коротких сроках влияния пептида (2,5 и 5 мин) при физиологических концентрациях (10"9-10"8М), с увеличением времени действия эффект пептидов ослабевает или отсутствует

АЦ активирующий эффект инсулина, ИФР-1 и ИПП при разных концентрациях в условиях in vitro.

Установив оптимальное время действия пептидов инсулинового суперсемейства, при котором происходит активация АЦС (2 5 мин), необходимо было выявить при каких концентрациях АЦ стимулирующий эффект пептидов наиболее выражен В разных тканях стимулирующий эффект пептидов инсулиновой природы осуществляется через специфичные рецепторы, отличающиеся по сродству к пептиду в гомологичных и негомологичных пептиду тканях

Проведено исследование влияния инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска и ЭФР в течение 2 5 мин при разных концентрациях (10"12-10^М) в мембранных фракциях крыс, кур, моллюсков, а также во фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов

В мембранной фракции скелетных мышц 1фыс стимулирующий АЦ эффект инсулина, ИФР-1, ИПП обнаруживается при концентрациях - 10И-10"7М (Рис 8) Наиболее выраженный АЦ стимулирующий эффект составляет для инсулина +250% при 10"8М, для ИФР-1 +91% при 10"9М, для ИПП +111% при 10"8М, для ЭФР +190% при 10 10М (Рис 8)

Можно отметить, что в диапазоне концентраций 10'1О-10'7М наиболее четко выражен активирующий АЦ эффект инсулина, эффекты других исследованных пептидов

инсулиновой природы проявлялись слабее АЦ стимулирующий эффект ЭФР проявлялся при более низких концентрациях (10 и-10"1ОМ)

400-,

is*

1 350

OS

И 300-

л 250-

Б

Влияние инсулина, ИФР-1, ИПП и ЭФР на активность АЦ в мембранной фракции скелетных мышц крысы при разных концентрациях пептидов

■ инсулин

—• ЭФР

А ИПП

—О — ИФР1

-loe [пептид] М

Рис 8 Назальная активность АЦ принята за 100 % Время действия пептидов 2 5 мин

J

Таблица 3. Влияние in -vitro разных концентраций инсулина на активность АЦ во фракциях мышечных мембран куриных эмбрионов разного возраста и цыплят.

Объекты (возраст) 10-сут Эмбрионы 13-сут Эмбрионы 16-сут Эмбрионы Цыплята 3-сут

Воздействия Активность АЦ (пмоль цАМФ/мин/мг белка) В скобках - Активность АЦ (в %) в присутствии инсулина, по отношению к базальной активности, принятой за 100 %

Без Инсулина 14 02+1 10 (100 %) 3,90±0 45 (100 %) 2 01±0 09 (100%) 8 52±0 41 (100 %)

+инсулин Ю'" М 16 34+1 35 (117%) 4 21±0 34 (108 %) 4 81+0 46 (239%) 10 11+0 55 (119%)

+ инсулин ю-'°м 39 14+1 93 (279 %) 10 33±0 89 (265 %) 5 28±0 30 (263 %) 11 24+0 48 (132%)

+ инсулин 109М 48 25±2 21 (344 %) 15 92±1 24 (408 % ) 10 24+0 62 (509 %) 14 54±0 82 (171 %)

+ инсулин 10'8М 19 87±1 44 (142 %) 9 84±0 56 (252 %) 9 92±0 47 (494 %) 19 55+1 13 (238 %)

+ инсулин 10"7М 17 13+0 98 (122 %) 4 93+0 45 (126 %) 7 51±0 33 (374%) 22 21+1 37 (261 %)

+ инсулин Ю^М 17 90+1 12 (128%) 5 12+0 21 (131 %) 1 95±0 22 (97 %) 24 39+1 62 (286 %)

Изучение АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства и ЭФР в онтогенезе позволило выявить следующие факты Наиболее выраженный АЦ активирующий эффект инсулина (10"ИМ-10"6М обнаруживается у куриных эмбрионов (10, 13, 16 суток) и цыплят (3 суток) при концентрации гормона 10_9М, и составляет у 10-сугочных эмбрионов +244%, у 13-суточных +308%, у 16-суточных +409% (Таблица 3), а у 3-х суточных цыплят (+186%) при более высокой концентрации 10бМ, что может быть связано с переходом эмбрионов в постэмбриональный период, когда процессы роста и дифференцировки заканчиваются

Проведенные нами исследования действия инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов (4-й день развития) показали, что наибольший АЦ стимулирующий эффект инсулина (+352%) выявляется при концентрации 10"9М, а ИФР-1 (+289%) при концентрации Ю',0М (данные в диссертации)

В мембранной фракции мышц моллюска АЦ стимулирующий эффект инсулина, ИФР-1, ИПП и ЭФР выявляется при концентрациях - 10"П-10"8М (Рис 9) Инсулин и ИФР-1 оказывают наиболее выраженное стимулирующее действие на активность АЦ при концентрации 10 8М (+63% и +54%, соответственно), а ИПП и ЭФР при 10*9М (+415% и +223%, соответственно)

Влияние инсулина, ИФР-1, ИПП и ЭФР на активность АЦ в мембранной фракции гладких мышц моллюска при разных концентрациях пептида

400 - ■ инсулин

-•- ЭФР

* ипп

300- -о-ИФР1

!од [пептид] М

Рис 9 Базальная активность АЦ принята за 100% Время действия пептидов - 2 5 мин

Таким образом, определен диапазон концентраций, при которых проявляется АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов Следует отметить видоспецифичность действия пептидов Действие ИГ1П, выделенного из висцеральных ганглиев моллюска А суёпеа, является более эффективным в ткани моллюска и менее эффективным в тканях позвоночных

Участие ц-АМФ-зависимой ФДЭ в механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства

Уровень цАМФ в клетке зависит не только от АД — фермента, осуществляющего его синтез, но и от фосфодиэстеразы (ФДЭ) - фермента, обеспечивающего его деградацию Исследована динамика во времени активности примембранной формы цАМФ-ФДЭ во фракции скелетных мышц кур Эта изоформа ФДЭ локализована на внутренней стороне мембраны и способна активироваться инсулином (Ноивку, 1985) Нами показано, что активность примембранной цАМФ-ФДЭ не изменяется через 2 5 и 5 О мин после действия инсулина, увеличивается на +115% через 10 мин и на +179% через 20 мин, по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100% (Таблица 4)

Таблица 4. Влияние инсулина (10"8М) на активность примембранной цАМФ-ФДЭ в скелетных мышц кур в зависимости от времени

Воздействия Активность цАМФ-ФДЭ (нмоль АМФ/мин/мг белка)

2 5 мин 5 0 мин 10 0 мин 20 0 мин

Без инсулина 3 37±05 (100%) 3 70±0 33 (100%) 3 56±0 61 (100%) 3 21±0 28 (100%)

+ инсулин 3 06±0 21 (91%) 4 07±0 18 (110%) 7 65±0.23 (215%) 8 95±0 44 (279%)

Примечание в скобках представлена активность цАМФ-ФДЭ (в %) в присутствии инсулина и базальная активность фермента, принятая за 100%

При исследовании действия разных концентраций инсулина (10"9М-10"7М) обнаружено, что наиболее выраженное действие гормона (+115%) на активность цАМФ-ФДЭ выявляется через 10 мин при концентрации 10"8М (данные в диссертации)

Соотношение активности систем АЦ-цАМФ и цАМФ-ФДЭ в реализации действия инсулина на клетку является важным моментом в понимании внутриклеточных механизмов функционирования пептидов инсулиновой природы

При активации АЦ гормонами скорость синтеза цАМФ начинает превышать скорость его деградации Повышение уровня цАМФ приводит к активации мишени его действия - ПКА Сродство ПКА к цАМФ в 100-1000 раз больше, чем у ФДЭ При усилении синтеза цАМФ происходит сначала насыщение цАМФ-регуляторных центров ПКА, и лишь затем гидролиз цАМФ с участием ФДЭ

Исходя из представленных нами данных, активирующие эффекты инсулина на АЦ и цАМФ-ФДЭ четко разделены во времени АЦ активирующий эффект инсулина проявляется через 2 5 и 5 мин и отсутствует через 10 мин Между тем, цАМФ-ФДЭ активируется инсулином только через 10 минут инкубации с гормоном Таким образом, активация цАМФ-ФДЭ наступает лишь тогда, когда цАМФ как вторичный посредник выполнит свою функцию, достигнет порогового уровня и осуществит свое активирующее действие на ПКА, а затем и на эффекторные системы (Ткачук, 1983), что согласуется с нашими данными о действии инсулина на активность АЦ и цАМФ-ФДЭ и данными литературы

В связи с этим основное внимание будет уделено исследованию АЦС, участвующей в осуществлении регуляторного действия пептидов инсулинового суперсемейства на клеточные процессы

Использование анти-инсулиновой сыворотки для доказательства специфичности АЦ стимулирующего эффекта инсулина.

Для доказательства АЦ стимулирующего действие инсулина, а не других пептидных гормонов, не относящихся к гормонам инсулинового суперсемейства, была использована анти-инсулиновая сыворотка (АИС), выработанная в лаборатории на инсулин млекопитающих, которая нейтрализует действие инсулина и, как установлено нами подавляет стимулирующее действие инсулина на АЦ При добавлении нормальной сыворотки (без инсулина) к фракции скелетных мышц крыс и гладких мышц моллюска, активирующий АЦ эффект инсулина составляет +68% у крыс и +41% у моллюсков При использовании АИС стимулирующий АЦ эффект инсулина отсутствует у крыс (+7%) и моллюсков (-5%) (Табл 5)

Полученные данные свидетельствуют о том, что обнаруженное нами активирующее действие инсулина на АЦ в мышечных тканях исследуемых объектов осуществляется именно инсулином и является специфичным при действии этого гормона

Таблица 5 Нейтрализация АЦ стимулирующего эффекта инсулина в мембранных фракциях скелетных мышц крыс и гладких мышц моллюска в присутствии анти-инсулиновой сыворотки

Воздействия Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)

Нормальная сыворотка Анти-инсулиновая сыворотка

Гладкие мышцы моллюска Anodonta cygnea

Без инсулина 111 18±6 13 (100%) 148 29±4 31 (100%)

Инсулин 10"8М 156 76+8 54* (141%) 158 67±8 16 (107%)

Скелетные мышцы крысы

Без инсулина 97 34+4 58 (100%) 115 8216 49 (100%)

Инсулин 10 5М 163 49±6 17* (168%) 110 03+7 12 (95%)

Примечание приведены данные из трех независимых экспериментов, повторенных три раза Значения представлены в виде среднего арифметического с учетом ошибки среднего Различия достоверны (р< 0 05 (*) В скобках - активность АЦ в % Базальная активность принята за 100%

Следующая часть работы посвящена расшифровке структурно-функциональной организации механизма АД активирующего действия инсулина и ИФР-1

В этой части работы мы поэтапно исследовали звенья, которые могут быть вовлечены в реализацию действия инсулиноподобных пептидов, начиная от рецептора и заканчивая эффекторными системами, которые являются конечным звеном реализации сигнала

Участие рецептора тирозинкиназного типа в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства.

Для доказательства участия рецептора тирозинкиназного типа, характерного для пептидов инсулинового суперсемейства в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулиновой природы, использовали селективные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ - тирфостин 47 и генистеин, которые блокируют тирозинкиназную

функцию рецептора инсулина и других пептидов инсулиновой природы Ингибиторы инкубировали с пробами в течение 15 мин после чего в пробу добавляли пептиды (время действия 2 5 мин) при концентрации, вызывающей максимальный АЦ стимулирующий эффект Влияние этих ингибиторов на активирующие АЦ эффекты инсулина, ИФР-1, ЭФР и для сравнения на эффект изопротеренола (в случае позвоночных) и серотонина (в случае беспозвоночных), которые также действуют активирующим образом на АЦ, но через рецептор серпантинного типа, изучали in vitro во фракции мембранных препаратов мышечной ткани крыс, культуры куриных миобластов, моллюсков

У крыс в присутствии тирфостина 47 (1 25-5 0 мкМ) активирующий АЦ эффект пептидов снижался при действии инсулина до 50%, при ИФР-1 до 65 %, при ЭФР до 50 % по отношению к максимальному эффекту пептидов, принятому за 100% (Рис 10) В присутствии генистеина (1.25-5 0 мкМ) снижение АЦ стимулирующих эффектов всех используемых пептидов у крыс было более выражено Эффект инсулина снижался до 40%, эффект ИФР-1 до 10 %, эффект ЭФР - до 18 % (рис 11) В тоже время у крыс стимулирующий эффект изопротеренола на АЦ (Ю^М) практически не изменялся в присутствии тирфостина 47 и генистеина (0.5-20 0 мкМ).

£ 120-ч

Влияние тирфостина 47 на стимулирующий аденилетциклазу эффект инсулина, ЭФР, ИФР1 и изопротеренола в скелетных мышцах крыс

—*—инс ЭФР 4 ИФР1 —т—изо

1

т

■9- 40 л

0 2 4 6 в 10 12 14 16 18 20 [тирфостин 47} мкМ

Рис 10 По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола на АЦ (принятого за 100 %) в присутствии тирфостина 47_

Влияние генистеина на стимулирующий аденилатцихлазу эффект инсулина, ЭФР, ИФР1 и изопротеренола в скелетных мышцах крыс

—■— инс

—е— ЭФР

- * ИФР1

—т— изо

8 10 12 14 16 1S 20 (генистеин] мкМ

Рис И. По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола на АЦ (принятого за 100 %) в присутствии генистеина

В культуре клеток 4-х суточных куриных миобластов тирфостин 47 (Рис 12) и генистеин (данные представлены в диссертации) ингибировапи АЦ активирующий эффект инсулина до 43% и 38%, соответственно Однако, активирующее действие изопротеренола на АЦ в присутствии ингибиторов тирозинкиназ (тирфостина 47 и генистеина) не изменялось (р < OOS) Это свидетельствует о том, что классические рецепторы серпантинного типа не участвуют в механизме действия пептидов инсулиновой природы

Влияние тирфостина 47 на стимулирующий аденилатцихлазу

эффект инсулина и изопротеренола в культура клеток миобластов

£ 200л

я X

§ 150. Т 4

i I

я е »о 1 —■—инс —»—изо

! | 60 i

1 0-

9 2 4 S 8 {тирфостин 47J мкМ 10

Рис 12 Ппо оси ординат - снижение стимулирующего

эффекта инсулина и изопротеренола на АЦ (принятого

за 100 %) в присутствии тирфостина 47

Влияние тирфостина 47 на стимулирующий аденилатциклазу эффект инсулина, ЭФР и л серо тонина в мышечной ткани моллюска

§5,120п

£ 0 ' ! | 1' I | ■ I I | I | I | I—I1 < 1—1-4-4—г-

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

[тирфостин 47] мкМ

Рис 13 По оси ординат - снижение стимулирующею эффекта пептидов и серотонина на АЦ (принятого за 100 %)_

Влияние генистеина на стимулирующий

аденнлатцикпазу эффект инсулина, ЭФР

и серотонина в мышечной ткани моллюска

£ 120-,

3 ^ ;

л 100- I • 1 • ■» - --- ---А

а

2 1 80£ т ч —■—инс

ю -«-ЭФР

1 60- -ж- сер

е> \ V

t 40- \

® к

5 о 20- Ч-Н— ■ч

1

X о

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

[генистеин] мкМ

Рис. 14. По оси абсцисс - концентрация генистеина в

мкМ, по оси ординат - снижение АЦ стимулирующего

эффекта пептидов и серотонина (принятого за 100 %) в

присутствии генистеина

У моллюсков наиболее выраженное снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов наблюдалось в присутствии тирфостина 47 (2 5 мкМ) Эффект инсулина уменьшался до 20 %, эффект ЭФР до 30-35% (Рис 13) В присутствии генистеина АЦ стимулирующий эффект пептидов снижался до 25 % в случае инсулина (1 25 мкМ генистеин), и до 50-75% в случае ЭФР (5 мкМ генистеин) (рис 14)

Необходимо подчеркнуть, что у моллюсков А су^пеа активность АЦ увеличивается не в присутствии изопротеренола, а в присутствии серотонина, реализующего свое действие также через рецепторы серпантинного типа (РейБеуа а!, 1992) Исследование действия ингибиторов тирозинкиназ - тирфостина 47 и генистеина (0 5-20 0 мкМ) на стимулирующий АЦ эффект серотонина в мембранной фракции мышечных тканей моллюсков не выявило изменений в действии этого биогенного амина на активность АЦ

Таким образом, в мембранной фракции крыс, моллюсков и культуры клеток куриных миобластов стимулирующее влияние исследуемых пептидов на АЦ снижалось в присутствии тирфостина 47 и генистеина в диапазоне концентраций - 1 25, 2.5, 5 0, 10, 20 мкМ во всех исследуемых объектах (Рис 10-14)

Стимулирующее действие изопротеренола (крысы, куры) или серотонина (моллюски) на АЦ, реализуемое через рецепторы серпантинного типа не изменялись в присутствии тирфостина 47 или генистеина в исследуемых объектах (см Рис 10-14)

Можно заключить, что в мышечной ткани млекопитающих (крысы), птиц (куры), культуре клеток куриных миобластов и в мышцах моллюсков активирующее действие инсулина, ИФР-1, ЭФР на АЦ осуществляется с участием рецепторов тирозинкиназного типа, специфичных для действия этих пептидов (Рейвеуа е1 а1, 1996, Певпеуа е1 а1,2003)

Участие в-белков в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина

Для доказательства участия в-белков в действии инсулина на активность АЦ был применен широко распространенный подход, в котором используется набор гуаниновых нуклеотидов, способных в разной степени либо стимулировать ГТФ-азную активность О-белков в присутствии ГТФ и его аналогов - ГТФув, ГИДФ и тем самым активировать АЦ, либо ингибировать ГТФ-азную активность в-белка в присутствии ГДФ|38

Было исследовано влияние ГТФ и ряда его негидролизуемых аналогов на активность АЦ в присутствии и отсутствии гормона (Табл 6)

Таблица 6. Влияние гуаниновых нуклеотидов в отсутствии и присутствии инсулина на

активность АЦ во фракции мышечных мембран крысы и моллюска

Животные

Воздействия Крыса Моллюск

Активность АЦ (%)

Контроль 100±101 % 100±13 %

Инсулин (Ю'ЙМ) 222±1 3% 186±1 8%

(+122%) (+86%)

ГТФуЗ (10"5М) 242±1 4% 470±9 4%

(+142%) (+370%)

ГИДФ(10'5М) 236±1 8% 269±4 9%

(+136%) (+169%)

ГТФ (10"5М) 135±1 05% 163±5 1%

(+35%) (+63%)

ГДФрв (10"5М) 95±1 2% 92±2 4%

(-5%) (-8%)

Инсулин + ГТФуЭ 473±2 5% 726±20 3%

(+373%) (+626%)

[109%1 [170%]

Инсулин + ГИДФ 399±8 2% 441±12 3%

(+299%) (+341%)

[41%] [86%1

Инсулин + ГТФ 277±10 1% 279±8 4%

(+177%) (+179%)

Г20%1 Г30%]

Инсулин + ГДФрв 102±5 4% 105±4 3%

(+2%) (+5%)

Г-17%] Г-86%1

Примечание в круглых скобках - активирующий АЦ эффект используемых агентов в % по отношению к базальной активности, принятой за 100% В квадратных скобках -потенцирование эффекта гормона в присутствии гуаниновых нуклеотидов в %

Согласно представленным данным, ГТФ-уЗ, ГИДФ, ГТФ стимулируют активность

АЦ в мышечных мембранах крыс и моллюсков При совместном действии инсулина и

гуаниновых нуклеотидов происходит усиление (потенцирование) эффекта гормона по

сравнению с аддитивным эффектом гормона и гуаниновых нуклеотидов, действующих

раздельно - в присутствии ГТФуЭ, ГИДФ и ГТФ на +109%, +41% и +20% у крыс и на

+170%, 86% и 30% у моллюсков (табл 6) ГДФ^З же напротив снижает АЦ

стимулирующий эффект инсулина как в мышцах крыс, так и моллюсков

Потенцирование эффекта инсулина в присутствии ГТФуБ, ГИДФ, ГТФ и отсутствие потенцирующего эффекта в присутствии ГДФрв свидетельствует о вовлеченности вв-белков в АЦ сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства

Таблица 7. Влияние коклюшного и холерного токсинов на базальную, инсулин- и ИФР1-стимулируемую активность АЦ в скелетных мышцах крысы и моллюска А су^пеа

Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)

Воздействия Скелетные мышцы крысы Гладкие мышцы моллюска

БезКТ +КТ БезКТ +КТ

Без пептидов 39 7±3 4 48 5±2 0 63 2±4 1 69 1±9,6

(100%) (100%) (100%) (100%)

Инсулин 67 9±3 6 48 2±2 7 200 5±14 4 74 2±7 6

10 9М (171%) (99%) (317%) (108%)

ИФР-1 57 4±2 1 43 1±1 6 139 2±12 4 76 8±7 3

10 »М (145%) (89%) (220%) (111%)

Без ХТ +ХТ Без ХТ +ХТ

Без пептидов 39 6±2 6 79 7±2 7 47 4±3 0 94 3±5 6

(100%) (100%) (100%) (100%)

Инсулин 69 3±2 8 105 8±7 4 151 7±9 8 134 0±7 5

10"9М (175%) (133%) (320%) (142%)

ИФР-1 561±А 2 106 2±6 5 100 0±5 4 122 6±8 8

10-*М (143%) (133%) (210%) (130%)

Примечание В скобках - активность АЦ в % Активность АЦ без пептидов принята за 100%

Для выяснения типов в белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 были использованы бактериальные токсины (коклюшный и холерный), которые модифицируют а-субъединииы и О« белков

Коклюшный токсин вызывает АДФ-рибозилирование ш-субъединицы в! белка, что ведет к потере его функциональной активности (МШ^ап, 1988, Яе^те, 1990) Известно, что Ру-димер белка обладает собственной регуляторной способностью и может стимулировать активность ФИ-З-К Обработка мышечных мембран крысы и моллюска коклюшным токсином приводила к блокированию АЦ стимулирующего эффекта, как

инсулина, так и ИФР-1 (таблица 7), что можно объяснить нарушением диссоциации гетеротримерного С1 белка на аьсубъединицу и (Зу димер в условиях действия коклюшного токсина

Таким образом, коклюшный токсин, предотвращая индуцируемую инсулином или ИФР-1 стимуляцию активности ФИ-З-К, реализуемую через (Зу-зависимый механизм, тормозит активацию АЦ

Влияние холерного токсина на мембраны приводит к блокаде ГТФ-азной активности ов-субъединицы и тем самым переводит её в перманентно активированное состояние В связи с этим обработка мембран холерным токсином может повлечь за собой стимулирование каталитической активности АЦ и наряду с этим ослабление регуляторных эффектов гормонов, действие которых на АЦ осуществляется через вэ белок (МШщап, 1988, Яе^ше, 1990) Обработка фракции мышечных мембран крысы и моллюска холерным токсином приводит к 2х-кратному увеличению базальной активности АЦ и снижению стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1 на активность фермента (таблица 7), что полностью согласуются со сведениями литературы и указывает на вовлеченность вз белка в активацию АЦ с участием инсулина или ИФР-1.

Таким образом, совокупность данных, полученных с использованием коклюшного и холерного токсинов, указывает на участие как 01, так и Сэ белков в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1.

Участие фосфа гидилинозитол-3 киназы в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1.

Для выяснения участия ФИ-З-К в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства (инсулина и ИФР-1) был использован специфический ингибитор этого фермента - вортманнин Инкубация мышечных мембран крысы и моллюска с вортманнином (10"9-10"7М) несколько снижает базальную активность АЦ (таблица 8) В отсутствии ингибитора инсулин и ИФР-1 отчетливо стимулируют активность АЦ Между тем, АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижается в зависимости от концентрации ингибитора (10"9-10"7М) Ингибирующее действие вортманнина было наиболее выражено при концентрации 10"7М (таблица 8) Установленные факты свидетельствуют об участии ФИ-З-К в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1 в мышечных тканях изучаемых объектов

Таблица 8. Влияние вортманнина (1(Г9М-1СГ7М) на стимуляцию ИФР-1 (10~8М) и инсулином (1СГ8 М) активности АЦ в мембранной фракции скелетных мышцах крыс и гладких мышц моллюска Апос1оп1а су%пеа

Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)

збъекты Крысы Моллюски

воздействия без пептида ИФР-1 инсулин без пептида ИФР-1 инсулин

без ворманнина 21±1 6 38 2±1 0* 41 4±2 3* 17 8±1 0 41 1±2 6* 24 5±1 0*

+вортманнин 10"9М 17 9±2 0 9 4±1 3 9 7±1 4 15 8±20 146±1 3 14 2±0 4

+вортманнин 1<Г®М 16 5±2 3 8 6±1 3 8 4±1 3 14 6±2 3 13 9±0 8 11 6±10

+вортманнин юЛ-1 13 2±\ 9 6 3±0 9 6 8±0 8 14 3±0 9 13 8±1 8 7,4±0 5

Примечание значения активности АЦ в присутствии пептидов, достоверно отличающиеся от

активности фермента в отсутствии пептидов (р<0 05), отмечены звездочкой

Для проверки гормоноспецифичности ингибирующего действия вортманнина на АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 были использованы изопротеренол и серотонин, гормоны неродственные пептидам инсулиновой природы и реализующие действие через рецептор серпантинного типа, не связанный с ФИ-З-К сигнальной системой Результаты этих опытов показали отсутствие влияния вортманнина на катехоламинчувствительную АЦ сигнальную систему (данные приведены в диссертации) Этот факт указывает на участие ФИ-З-К в, обнаруженным нами, АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1

Участие протеиикииазы С в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулипового суперсемейства

Для доказательства участия ПКС в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали селективный блокагор ПКС - кальфостин (Yomg et al, 2005) В отсутствии кальфостина АЦ активирующий эффект инсулина и ИФР-1 составлял +101% и +73% у крыс, и +78% и +86% у моллюсков соответственно, по отношению к базальной АЦ, принятой за 100% Как обнаружено нами, кальфостин (Ю'10-10'8М) блокировал АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 в мембранных

фракциях мышц крысы и моллюска Наиболее выраженный ингибирующий эффект кальфостина обнаруживается при концентрации 10'8М. В присутствии кальфостина (10 8М) АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижался на 46% и 32% у крыс, и на 47% и 50% у моллюсков, соответственно, по отношению к максимальному АЦ стимулирующему эффекту пептидов, принятому за 100% (данные в диссертации)

Для идентификации изоформы ПКС, участвующей в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали моноклональные антитела к ПКС£, которая по данным литературы является одним из участников реализации сигналов инсулиновой природы

Таблица 9 Влияние антител к ПКС£ на АЦ активирующий эффект ИФР-1 (10 8М) и инсулина (10 8М) в мышечных мембранах крысы и моллюска Л су§пеа

Активность АЦ (

Объекты Крысы Моллюски

Воздейтсвия Без пептида ИФР-1 Инсулин Без пептида ИФР-1 инсулин

без антител 100±4 4 253±17 247±24 100412 307424 255418

АТ 1 1000 104±9 5 102±14 108±16 166±25 251421 254412

АТ 1 100 9848 2 95±12 103+5 163418 327427 237420

АТ 1 10 94±6 8 68±3 6 88±8 14545 403433 238425

Активность АЦ выражена в % к контрольным величинам, принятым за 100%

Антитела к ПКС£ почти полностью блокировали АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 в мышечных мембранах крыс (таблица 9) Таким образом, использование моноклональных антител к ПКС£ показало, что эта изоформа фермента вовлечена в стимулирующее действие инсулина и ИФР-1 на АЦ в скелетных мышцах крыс Между тем, в гладких мышцах моллюска эти антитела не оказывали блокирующего действия на АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 Мышцы моллюска обладают иным набором ПКС (Боввт ег а1 , 1996) и в АЦ стимулирующем действии этих пептидов инсулинового суперсемейства, по-видимому, участвует другая изоформа ПКС, близкая по своим свойствам к ПКСе из мозга позвоночных

Таким образом, настоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР-1 и ИПП

моллюска в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных. Этот механизм имеет принципиально сходную структурно-функциональную организацию в случае инсулин- ИФР-1- и ИПП-компетентных АЦ сигнальных систем Он может быть представлен в клетке шестикомпонентным сигнальным каскадом рецептор-тирозинкиназа => Gi-белок (py-димер) => фосфатидилинозитол-3-киназа => протеинкиназа С С, => Gs-белок => аденилатциклаза АЦ является генератором внутриклеточного посредника - цАМФ, который способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы "А" передавать гормональный сигнал к различным эффекторным системам

В плане изучения функциональной роли, обнаруженного нами, АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, было исследовано его участие в реализации регуляторного действия пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы, как клеточный рост и апоптоз

Участие АЦ сигнального механизма в митогенном действии пептидов инсулиновой природы

Для изучения митогенного действия пептидов инсулинового суперсемейства мы использовали фибробластоподобную культуру клеток Swiss ЗТЗ, любезно предоставленную нам из банка культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург) Проведена функциональная характеристика АЦ системы в культуре Swiss3T3 клеток Установлено, что АЦ система в культуре этих клеток Таблица 10 Функциональные свойства АЦС культуры Swiss3T3 клеток

Воздействия Активность АЦ (пкмоль цАМФ/минЛш белка) Стимулирующий АЦ эффект в %

Назальная 30 59±1 41 100% (базальная)

NaF 10'2М 178 91±4 15 585% (+485%)

форсколин 105 М 99 26±3 21 324% (+224%)

ГИДФ Ю-6 М 111 20±3 48 364% (+264%)

ГТФ 105 М 82 98±2 92 271% (+171%)

ЭФР 109 М 168 31±4 75 550% (+450%)

ИФР-1 109 М 102 14±3 34 334% (+224%)

Инсулин 10'9 М 74 89±2 11 245% (+145%)

В скобках - активирующий АЦ эффект агентов гормональной и негормональной природы (в

%), по отношению к базальной активности АЦ, принятой за 100%

стимулируется классическими негормональными активаторами АЦ - ШБ,

форсколином, ГИДФ, ГТФ, а также инсулином, ИФР-1 и ЭФР (таблица 10)

Проведенные нами исследования показали, что в культуре Swiss ЗТЗ присутствует АЦС с функциональными свойствами, близкими к АЦС других клеток и тканей позвоночных, которая способна к восприятию внеклеточных сигналов различной природы.

¡Рисунок 15 (1,2,3). Участие системы АЦ-цАМФ в мнгогенном действий пептидов мнового суперсемейства (инсулина и ИФР-1)

Влияние инсулина, ИФР-1, ЭФР [¡а включение

(|4С)тимиаина ч ДПК

Активность АЦ в присутствии инсулина, ИФР-1 и ЭФР (в % к баз алыми активности, принятой за 100%)

Влияние

дибутирилового аналога цЛМФ на включение ['4С]тииидина в ДНК

Рис, 15-1

Рис, 15-2

Рис, 15 - 3

По оси абсцисс: Инсулин - 1000 кг/мл; ИФР-1 - 50 нг/мл; ЭФР-Юнг/M.I По оси ординат: включение

|"*С]тимидинавДНК

По оси абсцисс:

Инсулин - 1000 нг/мл;

ИФР-1-50 нг/мл; ЭФР

- I t) нг/мл

По оси ординат:

активность

АЦ в % к контролю

По оси абсцисс: ! log концентрации аибутирилоного ■шало га цАМФ По оси ординат: включение |4С1тимидина в ДНК

Оценив функциональные свойства АЦ сигнальной системы культуры З^чз^ЗТЗ клеток, была исследована способность инсулина, ИФР-1 и ЭФР индуцировать в культуре клеток 8л[553ТЗ митогенный эффект, оцениваемый по включению [14С]-тимидина в ДНК (Рис. 15-1), Показано, что инсулин (1000 нг/мл), ИФР 1 (50 нг/мл) и ЭФР (10 нг/мл) стимулировали синтез ДНК (прирост от 100% до 250%).

Исследуемые пептиды в тех же концентрациях оказывали стимулирующее влияние (2,5 мин) на активность АЦ. (Рис. 15-2), Для подтверждения участия цАМФ в реализации мито генного эффекта был использован его дибугириловый аналог цАМФ, обладающий

способностью проникать в клетку Этот аналог, взятый при низких концентрациях (10 п-10"9 М), вызывал четкий митогенный эффект, по величине даже превосходящий аналогичный эффект ЭФР и ИФР-1 Эффект оценивали по включению [14С]-тимидина в ДНК (Рис 15-3)

Представленные экспериментальные данные подтверждают нашу гипотезу (Перцева, 2000) об участии АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства и, продуцируемого им цАМФ, в реализации митогенных процессов

Участие адеиилатциклазиого сигнального механизм в антиапоптотическом действии инсулина и инсулиноподобного фактора роста 1

Нами подобрана модель апоптоза, включающая клеточные линии, с разной степенью устойчивости к условиям, вызывающим незапрограммированную гибель клеток (апоптоз) В экспериментах использовали культуру клеток Е1А+сНа-га8, обладающую высокой проапоптотической чувствительностью к удалению ростовых факторов и действию ДНК-повреждающих агентов («впадают в апоптоз») (Ви1аущ а1, 1999) и культуру клеток Е1А+Е1В с высокой устойчивостью как к действию ДНК повреждающих агентов, так и к удалению ростовых факторов из среды («не впадают в апоптоз») В клеточных культурах была охарактеризована чувствительность АЦС к действию инсулина и ИФР-1 (Таблица 11)

Полученные результаты свидетельствуют о том, что клетки культуры линий ЕМ-'-сНа-газ и Е1А+Е1В способны отвечать на действие инсулина и ИФР-1 (10"®М) активацией АЦ, что указывает на наличие в них рецепторов инсулина и ИФР-1, а также АЦС, чувствительной к этим пептидам Клетки сохраняют чувствительность АЦС к инсулину и ИФР-1 как в среде с 10% сывороткой, так и в среде с 0 5% сывороткой.

Согласно данным литературы пептиды инсулинового суперсемейства - инсулин и ИФР-1, а также цАМФ, образующийся в результате активации АЦ, способны оказывать антиапоптотическое действие на клетки Показано, что инсулин (10"^М), ИФР-1 (10"^М) и дибутирил-цАМФ (Ю'^М) оказывают ингибирующее влияние на апоптоз, вызванный удалением ростовых факторов сыворотки, в культуре клеток Е1А+сНа-газ (Плеснева, 2003) Оценка антиапоптотического эффекта инсулина, ИФР-1 и дибутирил-цАМФ проводилась на клетках культуры Е1А+сНа-газ с использованием метода клоногенной

выживаемости, который относится к числу наиболее чувствительных способов тестирования антиапоптотического действия агентов Обнаружено, что культивирование

Таблица 11. Влияние инсулина и ИФР-1 на активность АД в грубой мембранной фракции

Условия Активность АЦ (пмоль цАМФ/мин/мг белка)

In vitro ElA+cHa-ras (клетки, впадающие в апоптоз) Е1А+Е1В (клетки, не впадающие в апоптоз)

Контроль Инсулин ИФР-1 Контроль Инсулин ИФР-1

Среда +10% сыворотка 33 9±3 4 (100) 48 1±2 1 (142) 56 4+1 3 (166) 4 9±0 5 (100) 14 3±1 2 (292) 17 6±1 (359)

Среда+ 0 5% сыворотка (апоптоз) 95,9±3,4 (100) 137,0±9,0 (143) 181,6±8,2 (189) 26 7±0 5 (100) 61 4±1 2 (230) 86 3±2 1 (323)

In vivo ElA+cHa-ras (клетки, впадающие в апоптоз) Е1А+Е1В (клетки, не впадающие в апоптоз)

Контроль Инсулин ИФР-1 Контроль Инсулин ИФР-1

Среда+10% сыворотка 4 1+0 29 (100) 6 0+0 9 (146) 12 2±0 5 (297) 5 2±0 3 (100) 8 5±1 0 (163) 11 4±1 3 (219)

Среда+ 0 5% сыворотка (апоптоз) 110+1 2 (100) 17 2±1 2 (156) 24 8±2 2 (225) 5 8+0 6 (100) 10 0±0 7 (172) 13 6+0 6 (234)

грубую мембранную фракцию клеток, для определения активности АД Время инкубации 2 5 мин В опытах in vivo инсулин и ИФР-1 (10"8М) добавляли к

культурам клеток, время инкубации 5 мин Цифры в скобках - эффект гормонов в процентах к контролю, принятому за 100% Апоптоз индуцировали удалением ростовых факторов сыворотки из среды

трансформантов на среде без ростовых факторов уменьшает число живых клеток, способных дать потомство в клональном посеве минимум в 2 раза, по сравнению с клетками, культивируемыми в нормальных условиях (среда+10% сыворотки)

Показано, что только 43% культуры клеток «выживают» в условиях, когда клетки впадают в апоптоз (среда +0 5% сыворотки) по сравнению с контролем (среда+10% сыворотка, принято за 100%) В экспериментах, когда в среду с 0,5% сывороткой был добавлен инсулин, ИФР-1 или дибутирил-цАМФ в указанных выше концентрациях, способность клеток давать жизнеспособное потомство восстанавливалась до значений, составляющих около 70% (для инсулина 77%, для ИФР-1 67%, для дибутирил цАМФ 66% по сравнению с контролем, принятым за 100%)

Таким образом, эксперименты показали способность инсулина и ИФР-1 через, обнаруженный нами, АЦ сигнальный механизм и продуцируемый им цАМФ, оказывать митогенное и антиапоптотическое действие в клеточных культурах

Исследования подтверждают участие АЦ сигнального механизма в реализации антиапоптотического действия пептидов инсулинового ряда - инсулина и ИФР-1

Функциональное состояние АЦ сигнального механизма действия инсулина при сахарном диабете

На основе концепции молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных заболеваний (Перцева, 2004) исследовано функционирование АЦ сигнального механизма при экспериментальном стрептозотоциновом сахарном диабете 1-го и 2-го типа у позвоночных (крысы) и диабетоподобном состоянии у беспозвоночных (моллюски)

Диабет вызывали однократным введением (гр) стрептозотоцина (80нг/г веса животного) На 30-сут стрептозотоцинового диабета обнаружена гипергликемия в крови крыс, в 4,2 раза превышающая уровень глюкозы у контрольных крыс Впервые выявлено увеличение уровня глюкозы в гемолимфе моллюсков (в 2,5 раза) на 2-е и 4-е сутки развития диабетоподобного состояния Обнаружено при диабете снижение АЦ-стимулирующего эффекта инсулина и его потенцирования гуаниновыми нуклеотидами у крыс и у моллюсков

Инсулин независимый диабет (2-го типа) вызывали введением новорожденным крысятам (1-2 сут) однократно стрептозотоцина (80 нг/г веса животного) При этом типе диабета также возникают нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина АЦ стимулирующий эффект инсулина и потенцирование не проявляется

На основании полученных данных выявлены функциональные дефекты в АЦ сигнальном механизме действия инсулина при диабете, в мышцах крыс и моллюсков, затрагивающие дистальные звенья АЦ сигнального механизма на уровне каталитического компонента - АЦ, Ов-белка и его сопряжения с АЦ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных Эти оригинальные данные расширяют современные представления о круге сигнальных путей действия пептидов инсулинового суперсемейства и способствуют формированию нового позитивного взгляда на вовлеченность АЦ сигнального механизма в действие гормонов и ростовых факторов инсулиновой природы, осуществляемого через рецепторы тирозинкиназного типа До наших исследований в литературе существовала точка зрения об участии АЦ сигнального механизма только в действии гормонов, обладающих рецепторами серпантинного типа

Важными представляются доказательства, полученные в работе, о распространенности обнаруженного АЦ сигнального механизма действия изученных пептидов в тканях как позвоночных, так и беспозвоночных животных Установлена принципиально сходная структурно-функциональная организация инсулин-, ИФР-1- и ШШ-компетентной АЦ сигнальных систем На современном этапе наших исследований она представлена в клетке шестикомпонентным сигнальным каскадом рецептор-тирозинкиназа => 01-белок (Ру-димер) => фосфатидилинозитол-3-киназа => протеинкиназа СС => Оэ-белок => аденилатциклаза АЦ сигнальный механизм охватывает стадии от рецептора тирозинкиназного типа до фермента - АЦ, являющейся генератором вторичного внутриклеточного посредника - цАМФ Образовавшийся цАМФ способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы "А" передавать гормональный сигнал к различным эффекторным системам

Открытый нами АЦ сигнальный механизм действия пептидов инсулиновой природы по своей структурно-функциональной организации наряду со сходством, обладает и существенными отличиями от известных до сих пор гормональных АЦ сигнальных систем Эти отличия сводятся

- во-первых, к участию в одном АЦ сигнальном механизме сразу дух типов гетеротримерных О-белков (Об и 01), которые обычно вовлечены в разные сигнальные системы,

- во-вторых, к взаимодействию рецепторов тирозинкиназного типа, специфичных для гормонов инсулиновой группы с 01-белком, выступающим в качестве донора ру субъединиц, а не сп-субъединицы как во многих других сигнальных системах

- в-третьих, к большему числу, составляющих его блоков (шесть компонентов, во всяком случае) по сравнению с трехкомпонентным АЦ сигнальным механизмом действия биогенных аминов (рецептор серпантинного типа => Gs или Gi-белок => АЦ),

За период, прошедший со времени обнаружения нами АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства (Plesneva et al, 1994, Kuznetsova et al, 1999, Plesneva et al, 2001) в литературе появились данные, касающиеся отдельных его сигнальных блоков, подтверждающие установленную нами структурно-функциональную организацию этого АЦ сигнального механизма Так показано, что рецепторы инсулина и ИФР-1 функционально сопряжены с Gi-белком (Kuemmerle, Murthy, 2001, Dupont et al, 2003, Kreuzer et al, 2004) Также установлено участие ФИ-З-К и Ï1KCÇ и связь их с продукцией цАМФ в ряде сигнальных путей действия пептидов инсулинового суперсемейства (Dessauer, Nguyen, 2005, Nguyen, Dessauer, 2005)

В плане изучения спектра функций, обнаруженного нами АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, установлено его участие в реализации регуляторного действия пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы, как клеточный рост (стимуляция) (Плеснева и др 1999) и апоптоз (ингибирование) (Плеснева и др , 2003), способствующие в итоге выживанию клетки

Таким образом, выдвинутая нами гипотеза (Перцева, 2001) о важной роли АЦ сигнального механизма в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на жизненно-важные клеточные процессы - клеточный рост, апоптоз нашла подтверждение в наших исследованиях (Плеснева и др, 1999, Плеснева й др , 2003)

Основываясь на эволюционном подходе Л А Орбели ко всем изучаемым явлениям (Орбели, 1958) мы использовали комплекс методов эволюционной физиологии применительно к изучению биохимических систем организма Исследование включало несколько аспектов а) изучение трех эволюционно родственных пептидов инсулинового суперсемейства - инсулина и ИФР-1 позвоночных, а также ИПП беспозвоночных (моллюска Anodonta cygnea), б) изучение действия этих пептидов на АЦС в тканях-мишенях животных разного филогенетического уровня (позвоночные - млекопитающие и птицы, а также беспозвоночные - моллюск Anodonta cygnea), в) часть исследований (птицы) проведена в онтогенезе, г) исследованы АЦ сигнальные механизмы действия пептидов инсулинового суперсемейства и выявлены функциональные нарушения в них при патологии - сахарном диабете

В плане развиваемой в лаборатории концепции (Перцева, Шпаков, 2004) молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных заболеваний проведено исследование функциональных нарушений в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1, возникающих при сахарном диабете Впервые обнаружены дефекты в этом сигнальном механизме на уровне каталитического компонента - АЦ, вв-белка и его сопряжения с АЦ, а также ослабление регуляторных метаболических эффектов гормона у крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом 1-го и 2-го типов

Использование эволюционного подхода позволило выявить не только существование АЦ сигнального механизма действия ряда пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных, но и обнаружить принципиальное сходство в его структурно-функциональной организации, свидетельствующее об эволюционной консервативности этой сигнальной системы

ВЫВОДЫ

1 В мышечных тканях представителей позвоночных (крысы) и беспозвоночных (моллюски) животных обнаружена чувствительная к влиянию пептидов инсулиноподобного суперсемейства АЦС Инсулин, ИФР-1 и ИПП моллюска оказывают ГТФ-зависимое активирующее действие на АЦ АДФ-рибозилирование бактериальными токсинами позволило выявить участие в-белков как ингибирующего (выбелок), так и стимулирующего (вв-белок) типов в АЦ сигнальном механизме действия изученных пептидов

2 Установлено участие рецепторов тирозинкиназного типа, в активирующем действии инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска на АЦС, ведущем к образованию внутриклеточного посредника - цАМФ Показано, что селективные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ - тирфостин 47 и генистеин, блокируют активирующее действие исследуемых пептидов на АЦ в мышцах позвоночных и беспозвоночных

3 Выявлено участие фосфатидилинозитол-3 киназы в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства, на что указывает блокирование активирующего влияния пептидов инсулиновой природы на АЦ в присутствии специфического ингибитор ФИ-З-К - вортманнина

4 Установлено участие протеинкиназы ПКСС идентифицированной с помощью моноклональных антител в реализации АЦ стимулирующего действия пептидов инсулинового суперсемейства в мышечных тканях позвоночных

5 На основе совокупности полученных данных, сделан вывод о существовании в клетках позвоночных, ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина и ИФР 1, включающего сигнальную цепь рецептор-тирозинкиназа => Оьбелокфу) => фосфатидилинозитол-3-киназа => ПКС£ => Gs-белок => аденилатциклаза Сходный механизм обнаружен в мышцах моллюска Anodonta cygnea, отличающийся только изоформой ПКС

6. Экспериментально подтверждена гипотеза о важной роли АЦ сигнального механизма в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на фундаментальные клеточные процессы Показана их способность стимулировать клеточный рост (в культуре клеток Swiss3T3) и ингибировать апоптоз (в культуре клеток EIA+cHa-ras)

7 Обнаружение АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства природы в тканях-мишенях у представителей как позвоночных, так и беспозвоночных животных, а также сходство в его структурно-функциональной организации указывает на консервативность этого сигнального механизма в эволюции

8 При эндокринной патологии (сахарном диабете 1-го и 2-го типов) у человека, а также у экспериментальных животных (позвоночных и беспозвоночных) при стрептозотоциновой модели диабета обнаружены функциональные нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1, локализованные в основном на уровне G-белка и его сопряжения с АЦ

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Pertseva М N, Kuznetsova L А, Plesneva S.A., Gnshin А V, Panchenko V Р ß-agomst-mduced mhibitory-guamne-nucleotide regulatory protein coupling to adenylate in mollusk Anodonta cygnea foot muscle sarcolemma//Eur J Biochem Pharmacol 1992 V 210 P 279-286

2. Перцева M H, Плеснева C.A., Шпаков А О, Русаков Ю И, Кузнецова Л А Новые данные, свидетельствующие об участии аденилатциклазной системы в механизме действия инсулина и родственных пептидов//Доклады Академии наук 1995 Т 342 №3 С 410-412

3. Pertseva М N, Plesneva S A., Shpakov А О, Rusakov Yu.1, Kuznetsova L A Involvement of adenylyl cyclase signalling system in the action of insulin and mollusc insulin-like peptide // Comp Biochem Physiol 1995 V 112 P 689-695

4. Перцева M H, Шпаков А О. Плеснева С А. Современные достижения в изучении сигнальных механизмов действия инсулина и родственных ему пептидов // Журн эвол биохим физиол 1996 Т 32 N3 С 318-340

5 Pertseva M N, Plesneva S A., Kuznetsova L A, Shpakov А О, Derkach К V On the tyrosine kinase mechanism of the novel effect of insulin and insulin-like growth factor-I Stimulation of adenylyl cyclase system in muscle tissues // Biochem Pharmacol 1996 V 52 N 12 P 1867-1874

6 Плеснева С A, Баркан P С, Решетникова Г Ф, Кузнецова JIА, Перцева М Н Аденилатциклазный сигнальный механизм в митогенном действии инсулина, инсулиноподобного и эпидермального факторов роста//Доклады Академии наук, 1999 Т 368 №6 С 833-838

7 Kuznetsova L, Plesneva S., Deqabma N, Omeljaniuk E, Pertseva M N On the mechanism of relaxin action the involvement of adenylyl cyclase signalling system // Regulatory Peptides 1999 V 80 P 3339

8 Плеснева С А., Кузнецова Jl A, Омельянкж E В , Шпаков А О, Перцева М Н Аденилатциклазный сигнальный механизм действия релаксина // Журн эвол биохим физиол 2000 Т 36 N 6 С 562-568

9 Кузнецова Л А, Плеснева С А. Влияние биогенных аминов и полипептидных гормонов на активность протеинкиназы А и аденилатциклазы в мышцах моллюска Anodonta cygnea // Журн эвол биохим физиол 2001 Т 37 №5 С 395-400

10 Plesneva S А, Shpakov А О, Kuznetsova L А, Pertseva М N A dual role of protein kinase "С" in insulin signal transduction via adenylyl cyclase signaling system in muscle tissues of vertebrates and invertebrates // Biochem Pharmacol 2001 V 61 N 10 P 1277-1291

11 Плеснева С А, Шпаков AO, Кузнецова Л А, Перцева MH Роль протеинкиназы С в регуляции процесса трансдукции инсулинового сигнала через аденилатциклазный сигнальный механизм//Российский Физиологический журнал им ИМ Сеченова 2001 Т 87 N8 С 11061117

12 Шпаков А О, Плеснева С А, Кузнецова Л А, Перцева М Н Исследование функциональной организации нового - аденилатциклазного сигнального механизма действия инсулина // Биохимия 2002 Т 67 N 3 С 403-412

13. Pertseva М N, Shpakov А О, Plesneva S A., Kuznetsova L A A novel view on the mechanisms of action of msuhn and other insulin superfamily peptides involvement of adenylyl cyclase signaling system//Comp Biochem Physiol 2003 V 134 N1 P 11-36

14 Шпаков А О, Гурьянов И A, Власова E H, Корольков В И, Кузнецова Л А, Плеснева С.А, Власов Г П, Перцева М Н Ингибирование синтетическими катионными пептидами стимулирующего влияния гормонов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы//Доклады Академии наук 2003 Т 389 N 1 С 127-130

15. Шпаков А О, Плеснева С.А, Кузнецова Л А , Леонтьева Е А Инсулинрегулируемая аденилатциклазная сигнальная система в клеточной культуре фибробластов мыши линии L // Журн эвол биохим физиол 2003 Т 39 N 5 С 438-444

16. Плеснева С.А., Поспелова Т В , Кузнецова Л А, Быкова Т В, Шпаков А О, Перцева М Н Новая инсулинкомпетентная аденилатциклазная сигнальная система как возможный механизм антиапоптотического действия инсулина и инсулиноподобного фактора роста 1 // Доклады Академии наук 2003 Т 393 N4 С 551-553

17. Kuznetsova L, Shpakov А, Rusakov Yu, Plesneva S., Bondareva V, Pertseva M Comparative study of biological activity of insulin of lower vertebrates in the novel adenylyl cyclase test-system // Regulatory Peptides 2003 V. 116 N 1-3 P 81-86

18 Кузнецова Л А, Плеснева С А, Шпаков AO, Шарова ТС Стимулирующее влияние инсулина и эпидермального фактора роста на активность протеинкиназы А, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и гликогенсинтетазы в скелетных мышцах кур в эмбриогенезе // Журн эвол биохим физиол 2004 Т 40 N 4 С 325-333

19 Кузнецова Л А, Плеснева С А., Шпаков А О, Бондарева В М, Перцева М Н Инсулинрегулируемая аденилатциклазная сигнальная система скелетных мышц крысы в условиях введения инсулина т vivo и при инсулиновой недостаточности, вызванной стрептозотоциновым диабетом//Журн эвол биохим физиоч 2004 Т 40 N4 С 334-343

20. Шпаков А О, Шипююв В Н, Кузнецова Л А, Бондарева В М, Плеснева С.А., Перцева М Н Реактивность аденилатциклазной сигнальной системы нервных ганглиев моллюска Anodonta cygnea к серотонину и адренергическим агонистам // Нейрохимия 2004 Т 21 N 3 С 190-197 21 Шпаков А О, Кузнецова Л А, Плеснева С.А, Перцева М Н О вовлеченности фосфатидилинозитол-3-киназы и протеинкиназы СС, в аденилатцгаслазный сигнальный механизм действия релаксина в мышечных тканях крыс и моллюсков // Бюл экспер биол мед 2004 Т 138 N 10 С 420-423

22. Шпаков А О, Гурьянов И А, Кузнецова Л А, Плеснева С.А., Корольков В И, Перцева М Н, Власов Г П Использование С-концевых пептидов а-субъединиц G-белков для исследования их функционального сопряжения с рецепторами биогенных аминов в тканях крыс и моллюсков // Биол мембраны 2004 Т 21 № 6 С 441-450

23 Шпаков А О, Шипююв В Н, Бондарева В М, Кузнецова Л А, Плеснева С.А., Русаков Ю.И, Перцева М Н Регуляторное действие родственных инсулину нейропептидов моллюска Anodonta cygnea на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы // Нейрохимия 2005 Т 22 № 1 С 28-37

24. Шпаков А О, Шипилов В Н, Гурьянов И А, Кузнецова Л А, Бондарева В М, Плеснева С.А., Перцева МН Молекулярные механизмы регуляторного действия биогенных аминов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы в нервных ганглиях моллюска Anodonta cygnea II Доклады Академии наук 2005 Т 401 №6 С 829-832

25 Шпаков А О, Кузнецова Л А, Плеснева С А., Гурьянов И А, Перцева М Н Молекулярные причины изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы сердечной мышцы к биогенным аминам при экспериментальном стрептозотоциновом диабете // Цитология 2005 Т 47 № 6 С 540-548

26 Шпаков АО, Кузнецова Л А, Плеснева С.А., Перцева МН Молекулярные механизмы изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы к биогенным аминам при стрептозотоциновом диабете//Бюл экспер биол мед 2005 Т 140 №9 С 286-290

27. Kuznetsova L, Plesneva S, Shpakov A, Pertseva M Functional defects m insulin and relaxin adenylyl cyclase signaling systems in myometrium of pregnant women with type 1 diabetes // Ann N Y Acad Sci 2005 V 1041 P 446-448

28. Shpakov A, Pertseva M, Kuznetsova L, Plesneva S. A novel, adenylate cyclase, signaling mechanism of relaxin H2 action //Ann NY Acad Sci 2005 V 1041 P 305-307

29. Кузнецова Л A, Федин A H, Чистякова О В, Плеснева С.А., Шпаков А О, Перцева М И Об участии аденилатциклазного сигнального механизма в расслабляющем действии релаксина и инсулина на мышцы матки и трахеи крысы и на миометрий человека // Российский Физиологический журнал им И М Сеченова. 2006 Т 92 № 7 С 863-871

30. Шпаков А О , Кузнецова Л А, Плеснева С.А., Бондарева В М, Гурьянов И А, Власов Г П, Перцева М Н Снижение функциональной активности G-белков, компонентов гормоночувствительной аденилатциклазной сигнальной системы, при экспериментальном диабете 2-го типа//Бюл экспер биол мед 2006 Т 142 №12 С 641-645

31. Pertseva М , Shpakov А, Kuznetsova L, Plesneva S, Omeljamuk E Adenylyl cyclase signaling mechanisms of relaxin and insulin action similarities and differences // Cell Biology International 2006 V 30 P 533-540

33 Shpakov A, Kuznetsova L, Plesneva S, Kolychev A, Bondareva V , Chistyakova О, Pertseva M Functional defects m adenylyl cyclase signaling mechanisms of insulin and relaxm m skeletal muscles of rat with streptozotocin type 1 diabetes // Central Eur J of Biology 2006 VI N4 P 401-415

34 Перцева M H, Кузнецова Л A, Шпаков А О, Плеснева С А., Бондарева В М, Манова Е А, Морозова С И Новых подход в изучении молекулярных причин диабета обнаружение дефектов в гормональных сигнальных механизмах в мышечных тканях человека и животных при инсулинзависимом диабете//Патогенез, 2006 Т4 № 3 С 4-10

35 Кузнецова Л А, Л А Плеснева Л А., Чистякова О В, Шпаков А О, Бондарева В М, Перцева М Н Стрептозотоциновая модель сахарного диабета у моллюска Anodonta cygnea функциональное состояние аденилатциклазного сигнального механизма действия

пептидов инсулинового суперсемейства и их влияние на ферменты углеводного обмена // Журн эвол биохим физиол 2007 Т 43 N6 С 511-519

36. Шпаков А О, Кузнецова Л А, Плеснева С А, Перцева М Н Изменение чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы к биогенным аминам и пептидным гормонам в тканях голодающих крыс//Бюл эксп биол мед 2007 Т 144 К» 7 С 15-19

Список сокращений

АЦ - аденилатциклаза

АЦС - аденилатциклазная сигнальная система АИС - антиинсулиновая сыворотка

в-белки - гетеротримерные ГТФ-связывающие белки стимулирующего (вв) и ингибирующего ((й) типов

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат (внутриклеточный посредник)

ИФР-1 - инсулиноподобный фактор роста 1

ИПП - инсулиноподобный пептид моллюска Апоскяйа су§деа

ФИ-З-К - фосфатидилинозитол 3 киназа

ПКС - Протеинкиназа «С»

ПКА - Протеинкиназа «А»

ЭФР - эпидермальный фактор роста

ГИДФ - гуанилилимидодифосфат

цАМФ-ФДЭ - фосфодиэстераза

КТ - коклюшный токсин

ХТ - холерный токсин

Подписано в печать 21 09 2007 Формат 60x84/16 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис» Печать ризографическая Заказ № 3/2109 П л 2 6 Уч -изд л 2 6 Тираж 100 экз

ЗАО «КопиСервис» Адрес 197376, Санкт-Петербург, ул Проф Попова, д 3 тел (812) 327 5098

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Плеснёва, Светлана Александровна

Условные обозначения и сокращения I

Введение и цели работы.8

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.12

- Общие сведения о пептидах инсулинового суперсемейства. .12

- Регуляторные эффекты инсулина и пептидов инсулинового суперсемейства.15

- Участие аденилатциклазы и цАМФ-фосфодиэстеразы в реализации эффектов пептидов инсулинового суперсемейства.19

- Характеристика компонентов, участвующих в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства.23

- пептиды инсулинового суперсемейства.24

- рецептор.25

- О белки.31

- фосфатидилинозитол-3 киназа.33

- протеинкиназа С.34

- аденилатциклаза.35

- Участие АЦ сигнального механизма в регуляции функционально значимых клеточных процессов.37

- Роль АЦ сигнальной системы и цАМФ в митогенном действии пептидов инсулинового суперсемейства.43

- Регуляторное влияние цАМФ в реализации метаболических эффектов инсулиноподобных пептидов.51

- Ферменты углеводного обмена в в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных.55

-Эволюционный подход в изучении сигнальных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства.61

- Участие АЦ сигнальной системы в реализации действия пептидов инсулиновой природы при сахарном диабете.

- Задачи исследования.62

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.64

- Объекты исследования.64

- Использованные в работе клеточные культуры.

- культура клеток куриных миобластов.66

- получение культуры клеток куриных миобластов.67

- культура фибробластоподобных клеток линии Swiss ЗТЗ.

-получение культуры фибробластоподобных клеток линии Swiss ЗТЗ.69

- культура клеток, трансформированная из нормальных фибробластов.71

- получение культуры клеток, трансформированных из нормальных фибробластов.

- Выделение мембранных фракций

- получение мембранной фракции из тканей позвоночных и беспозвоночных.73

- получение грубой мембранной фракции (Р2) из клеточных культур.

- выделение фракции, содержащей примембранную форму ФДЭ.

- Методы определения активности ферментов.76

- определение активности АЦ.76

- определение активности цАМФ-ФДЭ.77

- определение активности креатинкиназы.79

- определение активности ПКА.80

- определение активности ГС и Г-бФДГ.82

- АДФ-рибозилирование мембранных препаратов.

- Электрофорез в полиакриламидном геле .84

- Метод иммуноблотинга.85

- Метод поверхностного иммуноблотинга.86

- Условия действия гормонов, активаторов, ингибиторов и бактериальных токсинов.87

- Метод определения белка.

- Статистическая обработка результатов.

- Использованные реактивы .91

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 93

- Влияние in vitro инсулина, ИФР-1 и ИНН на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных и в культурах клеток в разные временные сроки.93

- Влияние in vivo разных доз инсулина на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных в разные временные сроки.99

- АЦ активирующий эффект инсулина, ИФРи ИПП при разных концентрациях в условиях in vitro.104

- Участие цАМФ-зависимой ФДЭ в механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства.109

- Использование антиинсулиновой сыворотки для доказательства специфичности АЦ стимулирующего эффекта инсулина.113

- Участие рецептора тирозинкиназного типа в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства.115

- Участие G-белков в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина.122

- Участие фосфатидилинозитол-3 киназы в реализации

АЦ стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1.127

- Участие протеинкиназы С в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства.132

- Участие АЦ сигнальной системы в реализации ростстимулирующего действия инсулина в культуре клеток куриных миобластов.159

- Участие АЦ сигнального механизма в митогенном действии пептидов инсулиновой природы.169

- Участие АЦ сигнального механизма в антиапоптотическом действии инсулина и ИФР-1.179

- Влияние инсулина на активность Г6Ф-ДГ и ГС в мышечных тканях крыс, цыплят и моллюсков.189

- Влияние инсулина на активность ПКА.194

- Аденилатциклазных сигнальный механизм действия инсулина в скелетных мышцах крыс при стрептозотоциновом диабете.201

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аденилатциклазный сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных"

Изучение гормональных сигнальных систем, участвующих в регуляции жизненно важных для организма клеточных процессов, является одной из актуальных проблем современной молекулярной эндокринологии и биохимии. К числу систем, осуществляющих реализацию регуляторного действия веществ гормональной и негормональной природы, относится аденилатциклазная сигнальная система (АЦС), которая представлена в клетке сложным трансмембранным комплексом, состоящим, по крайней мере, из трех молекулярных блоков. Необходимыми компонентами АЦС являются: рецепторы, способные воспринимать внеклеточные сигналы, гетеротримерные ГТФ-связывающие белки (в-белки) стимулирующего (Об) или ингибирующего (01) типа, состоящие из трех субъединиц - а, (3, у и обеспечивающие сопряжение между рецептором и третьим компонентом системы - ферментом аденилатциклазой (АЦ),катализирующей образование универсального внутриклеточного посредника - циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). При его участии осуществляется реализация целого ряда регуляторных эффектов в клетке (пролиферация, дифференцировка, апоптоз, синтез белка и др.).

К настоящему времени в литературе накоплен значительный объем данных, свидетельствующих об участии АЦС и цАМФ в трансдукции сигналов группы гормонов не пептидной природы (серотонин, адреналин, норадреналин и др.), осуществляющих свой эффект на клетку через рецепторы серпантинного типа, семь раз пронизывающие мембрану. В рамках настоящего исследования мы предприняли попытку выяснить возможность участия АЦС в реализации действия пептидов инсулинового суперсемейства, обладающих рецепторами тирозинкиназного типа, один раз пронизывающими мембрану клетки. До исследований, проведенных нами, участие системы АЦС-цАМФ в реализации действия гормонов инсулиновой природы практически отрицалось. В литературе имелись лишь отдельные сведения о влиянии инсулина, бомбиксина, релаксина на активность АЦ (РейБеуа ег а1., 2003; Ра1е1, 2004). Несмотря на успехи, достигнутые за последние десятилетия в изучении молекулярных механизмов действия инсулина и инсулиноподобных пептидов, многие аспекты плейотропного действия этого гормона и родственных ему пептидов до сих пор остаются невыясненными (РеЛзеуа е! а1., 2003; Телкова, 2005). В связи с этим изучение ранее неизвестных молекулярных механизмов действияпептидов инсулинового суперсемейства, насчитывающего в настоящее время около 50 представителей, относится к числу актуальных проблем современной эндокринологии. Согласно современным представлениям, инсулин и родственные ему пептиды играют ключевую роль в регуляции ряда клеточных процессов - клеточный рост, апоптоз, метаболизм. Эти пептиды имеют общее эволюционное происхождение, так как возникли в ходе эволюции из общего анцестрального гена в результате дупликации и последующей дивергенции образовавшихся генетических линий, сохранив при этом структурное и функциональное сходство (Murray-Rust etal., 1992; Chanetal., 1992).

К изучению участия АЦС в реализации действия гормонов и ростовых факторов инсулиновой природы лаборатория приступила в начале 90-х годов. Отправной точкой послужили данные, впервые полученные нами, о способности инсулина и родственных пептидов активировать ГТФ-зависимым образом АЦ в мышечных тканях млекопитающих и моллюсков (Plesneva et al., 1994). Мы использовали эволюционный подход, предложенный JT.A. Орбели (1958) применительно к эволюционной биохимии, который включал исследования в филогенезе, онтогенезе и при патологии. Было изучено: 1) влияние на АЦС инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) позвоночных и инсулиноподобного пептида (ИПП) беспозвоночных (моллюск Anodonta cygnea\ 2) влияние на АЦС пептидов в тканях-мишенях животных разного филогенетического уровня (позвоночные крысы, птицы и беспозвоночные - моллюски); 3) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС в онтогенезе (в тканях куриных эмбрионов разного возраста и у цыплят); 4) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС при экспериментальном диабете у позвоночных и беспозвоночных.

Цель работы. Доказать участие аденилатциклазной сигнальной системы в реализации регуляторных эффектов инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска в клетке и расшифровать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма их действия в тканях позвоночных и беспозвоночных, а также установить роль АЦ сигнального механизма в регуляции фундаментальных клеточных процессов - клеточный рост, апоптоз.

Обзор литературыОбщие сведения о пептидах инсулинового суперсемействаПочти 90 лет прошло со времени открытия инсулина, основного представителя группы гормонов инсулинового суперсемейства, когда Фредерик Грант Бантинг (канадский физиолог) и Маклеод Джон Джеймс Рикард (английский физиолог) в 1921 году открыли инсулин и описали первые его свойства, за что и были удостоены в 1923 году присуждения Нобелевской премии.

За прошедшее время инсулин был выделен и очищен из тканей позвоночных. Для большинства инсулинов была установлена первичная структура. Наряду с инсулинами, были обнаружены инсулиноподобные пептиды - инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1), инсулиноподобный фактор роста 2 (ИФР-2), релаксин, бомбиксин, инсулиноподобные пептиды моллюска и другие пептиды, которые сейчас считаются представителями единого инсулинового суперсемейства.

В процессе эволюции инсулин и группа инсулиноподобных пептидов возникла уже у эукариот. Эти пептиды имеют гомологичную структуру и образуют обширное инсулиновое суперсемейство. К этому семейству принадлежат пептиды обнаруженные у позвоночных и беспозвоночных: инсулины высших животных (млекопитающих, птиц); низших позвоночных (рыб); релаксин и ряд инсулиноподобных факторов роста (ИФР-1 и ИФР-2) позвоночных; инсулиноподобные пептиды беспозвоночных, в частности моллюсков (ИПП и/или МИЛ); инсулиноподобные пептиды насекомых (бомбиксины) (ЕЬЬеппк е1 а1.,1989; Русаков и др., 1991; Chan et al., 1992; Murray-Rust et al., 1992; Geraerts et al., 1993; Gregoire et al., 1998; Smit et al., 1998).

Пептиды инсулинового суперсемейства имеют много общего в структурно-функциональной организации их молекулы. Данные об аминокислотной последовательности и консервативности структурных элементов в пределах семейства свидетельствуют о том, что эти пептиды состоят, как правило, из двух цепей А и В (за исключением ИФР-1, представленного одной цепью), имеют дисульфидные мостики в пределах одной цепи и между А и В цепями, спиральную структуру А и В цепей, обеспечивающую их пространственную связь, внутрицепочечные повороты в А и В цепях и экранированные гидрофобные остатки (Murray-Rust et al., 1992; Chan et al., 1992). Гомология первичной структуры пептидов инсулинового суперсемейства и инсулина млекопитающих различается на 50% в случае инсулинов позвоночных и ИФР-1, и на 2040%, в случае ряда ИПП беспозвоночных (насекомые, моллюски) (Smit et al., 1993, 1998).

Согласно эволюционной концепции Стейнера (Steiner et al., 1984; Chan et al., 1992) пептиды инсулинового суперсемейства являются продуктами, которые возникли из общего анцестрального гена в результате дупликации и последующей дивергенции генетических линий. Это произошло на ранних этапах эволюции примерно 600 млн. лет назад и было подтверждено Смитом и соавторами (Smit et al., 1993, 1998), который использовал данные о структуре генов, кодирующих инсулино-подобные пептиды (МИПы) моллюсков Ьутпаеа stagnalis и обнаружил сходство в структуре инсулиновых генов в ряду позвоночные ибеспозвоночные животные. Было сделано предположение, что общий анцестральный ген пептидов инсулинового суперсемейства присутствовал у представителей Archaemetazoa, предшественников беспозвоночных и позвоночных животных.

Используя результаты сравнительного исследования нуклеотидной и аминокислотной последовательностей пептидов инсулинового суперпсемейства, была сделана попытка (Murray-Rust et al., 1992) схематически воспроизвести их молекулярную филогению, которая отражает взаимосвязь гормонов в пределах этого суперсемейства. Согласно этой схеме наиболее близкие по структуре пептиды представлены тремя кластерами (см. Схему).

Схема 1. Молекулярная филогения взаимосвязи гормонов в пределах инсулинового суперсемейства.

Родственные отношения в пределах инсулинового суперсемейства (молекулярная филогения).

ИнсулиныБомбиксиныРелаксины:крысыИПП Lymnaea stagnalis:МИП 5ИПП Anodonta cygneaкатрана акулы ската человека свиньи I' ктМИП 2 МИПЗ МИП 1Представителями первого кластера являются инсулин, ИФР-1 млекопитающих и бомбиксин насекомых.

Ко второму кластеру относятся релаксины рыб и млекопитающих.

К третьему - инсулино-подобные пептиды моллюсков (ИПП моллюсков Anodonta cygnea и Lymnaea stagnalis). (Русаков и др., 1991; 2004; Smit et al., 1991, 1992, 1993,1996, 1998; Li etal., 1992a, 1992b).

Однако, несмотря на большие успехи, достигнутые за последние десятилетия, в изучении молекулярных механизмов действия инсулина и инсулиноподобных пептидов, многие аспекты плейотропного действия этого гормона и родственных ему пептидов до сих пор остаются невыясненными (Перцева, 1999).

Регуляторные эффекты инсулина и пептидов инсулинового суперсемействаИнсулин позвоночных оказывает широкий спектр регуляторных эффектов на клетку (Перцева и др., 1996; Pertseva et al., 2003; Перцева, Шпаков, 2002). Традиционно их можно разделить на две группы: метаболические и ростовые (или митогенные). Эффекты, относящиеся к метаболическим могут оказывать быстрое или медленное (в случае вовлечения генов) действие на поглощение, транспорт, промежуточный метаболизм и накопление малых пищевых молекул - гексоз, аминокислот, жирных кислот. Ростовые или митогенные эффекты более медленные и реализуются на генетическом уровне. Они индуцируют экспрессию ряда специфических генов, стимуляцию синтеза ДНК, РНК, специфических белков, и в результате процесс клеточного роста в целом (White, Kahn, 1994; O'Brein, Granner, 1996; Gupta, 1997). Сравнение биологическойактивности инсулина и инсулиноподобного фактора роста 1 показало, что эти пептиды осуществляют метаболическое и митогенное действие на клетку при разных концентрациях, причем картина действия инсулина отличается от ИФР-1 в плане действующих концентраций (Jones, Clemmons, 1995). Инсулиноподобный пептид беспозвоночных (И1111 моллюска) также способен оказывать как метаболическое, так и митогенное действие (Русаков и др., 1991). Согласно распространенному взгляду, регуляторные эффекты инсулина реализуются через различные сигнальные пути с вовлечением рецептора тирозинкиназы, митоген-активируемого протеин киназного (МАПК) каскада, фосфолипид-зависимых путей и др. (Телкова, 2005).

Передача инсулинового сигнала индуцирует следующие события: 1) связывание гормона с рецептором тирозинкиназного типа, состоящим из двух а-субъединиц (135 кДа), находящихся на внешней поверхности клетки и ответственных за связывание лиганда и двух трансмембранных ß-субъединиц (95 кДа) обладающих внутренней тирозинкиназной активностью; 2) активацию рецептора тирозинкиназы и аутофосфорилирование ß-субъединиц; 3) взаимодействие фосфотирозина рецепторной молекулы с белками, содержащими src-гомологичный 2 домен (SH2), и индукцию нисходящего внутриклеточного каскада тирозинового фосфорилирования широкого спектра эффекторных белков. В реализации регуляторных эффектов инсулина, в отличие от некоторых других ростовых факторов, принимают участие адапторные белки (их, по крайней мере, четыре) составляющие семейство субстратов инсулинового рецептора (ИРС I-IV), которые взаимодействуют с эффекторными белкамичерез их тирозин фосфоршшруемые сайты (Whitehead et al., 2000). Помимо тирозинкиназы, протеинкиназы серин/треонинового типа, такие как МАПКиназы, Sö-киназа, протеинкиназы С и некоторые другие белки вовлекаются в инсулин-индуцируемый процесс фосфорилирования. Этот каскадный механизм индуцирует конформационные изменения в эффекторных молекулах и, таким образом, модулирует их функциональную активность. Этот процесс останавливается группой специфических фосфатаз катализирующих дефосфорилирование белков.

Общепринято, что тирозинкиназный каскад является основным механизмом передачи инсулинового сигнала, через который реализуется большинство эффектов гормона, а возможно и все. Вопрос взаимосвязи различных сигнальных путей с тирозинкиназным механизмом и степень участия каждого из них в регуляции метаболического и митогенного действия инсулина - является ключевым вопросом изучения этой проблемы. Общие сведения о сигнальных механизмах действия инсулина описаны детально в ряде обзоров (White, Kahn, 1994; Cheathman, Kahn, 1995; O'Brein, Granner, 1996; Перцева и др. 1996; Pertseva et al., 1996; Salteil, 1996; Gupta, 1997; Shpakov, Pertseva, 2000; Whitehead et al., 2000).

Механизм действия ИФР-1 имеет много общего с таковым инсулина, поскольку его рецептор обладает также внутренней тирозинкиназной активностью. Сведения о структуре рецептора ИФР-1 и сигнальных путях, участвующих в реализации его регуляторного действия, описаны в работах ряда авторов (Jones, Clemmons, 1995; Blakesley et al., 1996; Butler et al, 1998; Лейбуш, 1998; Lopaczynski, 1999).

Несмотря на значительный прогресс в изучении сигнальных механизмов действия инсулина, имеется много пробелов в понимании этой актуальной проблемы.

Прежде всего это касается роли цАМФ, хорошо известного вторичного посредника действия большой группы гормонов (катехоламинов, глюкагона, биогенных аминов и других), реализующих свой эффект через рецепторы серпантинного типа, семь раз пронизывающие мембрану. Эта проблема до сих пор не получила достаточного внимания в отношении изучения механизмов реализации регуляторных эффектов инсулина и инсулиноподобных пептидов, действующих через рецепторы тирозинкиназного типа. Однако именно эта проблема послужила причиной спора в отношении данных о влиянии инсулина на систему аденилатциклаза-цАМФ, информация о которых накапливается со времени открытия цАМФ. Такое положение вещей дало основание отрицать участие аденилатциклазной системы в действии инсулина.

Однако, полученные нами данные (РеЛБеуа е! а1., 1995; Перцева и др., 1996; РеЛэеуа й а1., 1996; Кгш1е&оуа & а1., 1999; Перцева, 1999; Р1еБпеуа е1 а1., 2001), показывающие впервые вовлечение аденилатциклазной (АЦ) сигнальной системы в механизм действия инсулина и других пептидов инсулинового суперсемейства потребовали основательного пересмотра этой проблемы.

Участие аденилатциклазы и цАМФ-фосфодиэстеразы в реализации эффектов пептидов инсулинового суперсемействаПервые исследования эффекта инсулина на уровень цАМФ в различных клетках касаются середины 60-х. Основным обнаруженным фактом было снижение цАМФ в тканях млекопитающих (Park et al., 1967; Robison, Park, 1970). Также были получены многочисленные данные о том, что инсулин является антагонистом гормонов, которые увеличивают уровень цАМФ. Этот инсулиновый эффект был обнаружен в результате изучения продукции цАМФ стимулированной гормонами -катехоламинами, глюкагоном и другими (Butcher, Sutherland, 1967; Butcher et al., 1968; Manganiello et al., 1971). Согласно работам авторов (Butcher et al., 1966; 1968) снижение внутриклеточного уровня цАМФ является одним из механизмов, обеспечивающих реализацию действия инсулина. Другим авторам не удалось обнаружить какого-либо влияния низких физиологических концентраций инсулина на базальный и гормон-стимулированный уровень цАМФ (Butcher et al., 1968; Sneyd et al., 1967; Kono, Barham, 1973; Fain, Rosenberg, 1972; Jarett et al., 1972).

Обнаружение участия аденилатциклазы (АЦ) - фермента, катализирующего образование цАМФ, послужило толчком для серии исследований, посвященных изучению эффекта инсулина на этот фермент. В большинстве случаев инсулин оказывал ингибирующий эффект или не оказывал никакого эффекта на активность АЦ (Нерр, 1971, 1972; Illiano, Cautrecasas, 1972; Kono, Barham, 1973). При концентрации ЮцМ и выше инсулин снижал активность АЦ в мембранах печени крысы (Ray et al., 1970), и тканях семменников (Giudicelli et al., 1972). В печени мышейинсулин подавлял как базальную, так и глюкагон-стимулированную АЦ активность и не оказывал влияние на активность цАМФ-фосфодиэстеразы (Нерр, 1971, 1972).

Иллиано и Кутрикайзаз (Illiano, Cuatrcasas, 1972) были первыми, кто предположил участие АЦ системы в механизме действия инсулина. Они обнаружили, что инсулин ингибирует активность АЦ предварительно стимулированную эпинефрином (адреналином) и глюкагоном в мембранах клеток печени, а также кортикотропным гормоном в гомогенате жировых клеток. Полученные данные о том, что инсулин регулирует активность некоторых форм цАМФ-фосфодиэстераз (цАМФ-ФДЭ) позволили предположить, что снижение уровня цАМФ вероятно связано не с прямым действием гормона на АЦ, но с активацией цАМФ-ФДЭ, которая ответственна за гидролиз цАМФ (Loten, Sneyd, 1970; Exton et al., 1971; Houslay, 1986). Было выявлено, что инсулин активирует, по крайней мери, изоформы ФДЭ в клетках печени: периферическую, т.е. примембранную ФДЭ и ФДЭ "плотных везикул" (обе являются высоко-аффинными формами, связанными с плазматической мембраной) (Houslay, 1986, 1990, 1991 a,b; Houslay et al., 1984).

Полученные в этот период данные преимущественно касались обнаружения ингибирующего влияния инсулина на АЦ. Это дало возможность предположить, что гетеротримерные G-белки ингибирующего типа, непосредственно взаимодействующие с инсулиновым рецептором, могут быть потенциальными участниками передачи инсулинового сигнала. Сопоставление имеющихся данных (Tepperman, 1981; Makino et al., 1992) позволило заключить, что инсулиносуществляет негативное действие на уровень цАМФ, ингибирует АЦ и/или активирует цАМФ-ФДЭ активность. Таким образом, с этого времени сложилось мнение, что снижение уровня цАМФ является основным механизмом действия инсулина с участием системы АЦ-цАМФ-ФДЭ. Этот взгляд на проблему недолго оставался единственным.

Некоторые исследователи вообще не обнаружили никакого влияния инсулина на активность АЦ в различных тканях млекопитающих (Allen, Clark, 1971; Нерр, 1972; Golder, Boyns, 1973).

В 60-80 годы появились скудные данные о стимулирующем действии инсулина на АЦ активность или на уровень цАМФ. Впервые наблюдали увеличение цАМФ в ответ на действие инсулина Голдберг и соавторы (Goldberg et al., 1967). Введенный in vivo инсулин (2-4 Е/кг) приводил к быстрому увеличению уровня цАМФ (36-78%) в скелетных мышцах крысы. Помимо этого, инсулин оказывал стимулирующее влияние на базальную активность АЦ и ингибирующее действие на ФДЭ в мозгу крыс (Hetenyi, Singhal, 1973). При инкубации жировых клеток крысы с инсулином, он вызывал потенцирующее (усиливающее) действие на стимулирующий АЦ совместный эффект адреналина и теофиллина (Fain, 1975). Позже было показано (Kramer et al., 1990) увеличение уровня цАМФ в культуре клеток матки новорожденных макак {rhesus monkey) при инкубации их с инсулином (200нг/мл).

До начала наших исследований (Plesneva et al., 1994; Pertseva et al., 1995, 1996) не было ни одной публикации о прямом ГТФ-зависимом стимулирующем действии инсулина на базальную активность АЦ, и о механизме его действия, вовлекающим рецептор тирозинкиназного типа,в-белки, фосфатидилинозитол-3-киназу и другие компоненты. Скудность данных о способности инсулина активировать АЦ, вероятно, связана с тем, что в большинстве случаев активность АЦ определяли через 10 мин и позднее после действия инсулина, когда АЦ активирующий эффект гормона, согласно нашим данным полностью исчезает (Перцева и др., 1995). Во-вторых, концентрации инсулина, использованные в экспериментах, часто значительно превосходили физиологический уровень и могли быть причиной его ингибирующего влияния на АЦ. В третьих, использовались ткани и клетки, в которых было низкое содержание инсулин-чувствительных изоформ АЦ.

Некоторые работы, появившиеся позднее, посвященные АЦ сигнальному механизму действия инсулина и полученные факты подтверждают участие обнаруженного нами аденилатциклазного сигнального механизма реализации действия пептидов инсулинового суперсемейства, что и будет рассмотрено далее.

Следует отметить, что механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства на клетку связан не только с аденилатциклазой, чему и посвящено исследование, но включает и фосфодиэстеразу, чье участие мы косвенно проверили в нашей работе.

Осуществление сигнала пептидов инсулиновой природы через АЦ сигнальный механизм, исследованный нами, предполагает подробное изучение фермента синтеза цАМФ за счет аденилатциклазы, а также получение предварительных сведений о роли фермента распада цАМФ, осуществляемого фосфодиэстеразой, и именно той формой, которая подвержена регуляторному влиянию инсулина. Согласно работам Хауслея(Ношку е1 а1., 1985) в клетках существует примембранная или мембраносвязанная форма цАМФ-ФДЭ, которая способна подвергаться регуляции инсулином и участвовать в процессе контроля реализации действия пептидов инсулинового суперсемейсва на клетку, осуществляемого через систему образования вторичного посредника -цАМФ. Согласованность работы инсулинзависимой АЦ и инсулинзависимой ФДЭ обеспечивают в клетке образование вторичного посредника - цАМФ, через который и реализуется действие пептидов инсулиновой природы. Инсулинзависимая форма ФДЭ служит звеном, лимитирующем распространение сигнала через систему инсулинзависимой АЦС в случае избытка образования цАМФ и отсутсвия возможности его деградации за счет инсулиннезависимых ФДЭ.

Характеристика компонентов, участвующих в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства.

Данные литературы и экспериментальные разработки, полученные в наших сравнительных исследованиях позволили предположить вовлечение в действие инсулина и инсулиноподобных пептидов в тканях позвоночных и беспозвоночных целого ряда компонентов, принимающих участие в реализации действия пептидов инсулиновой природы, а именно самого рецептора, обладающего тирозинкиназной активностью, посредников, способных участвовать в передаче сигнала инсулинового суперсемейства. Такими посредниками могут быть в-белки, ФИ-З-К, нормальные или атипичные формы ПКС, которые способны передавать инсулиновый сигнал на АЦ сигнальную систему.

Предполагаемые участники событий реализации действия пептидов инсулиновой природы через АЦ сигнальную систему представлены в схеме.

Схема 2. Посредники, участвующие в осуществлении действия пептидов инсулиновий природы на клетку через аденилатциклазный сигнальный механизм.

Предполагаемые участники аденилатциклазного сигнального механизмадействия инсулинаИнсулинмембрана }61- белок (Ру)?■ДДДПротеинкиназа С?Фосфатидилинозитол-З-киназа?Се- белок (сдАденилатциклаза Цитоплазма 1Метаболический АнтиаптотическийМитогенныйНа схеме представлены участники реализации действия пептидов инсулинового суперсемейсва с вовлечением АЦ сигнального механизма.

Пептиды инсулинового суперсемействаПрежде всего необходимо рассмотреть строение молекул пептидов инсулинового суперсемейства.

Инсулин является пептидом, состоящим из двух цепей и включающим 51-52 аминокислотных остатка. А цепь включает 21аминокислотный остаток, Б-цепь - от 29 до 32 аминокислотных остатков, в зависимости от объектов, откуда инсулин был выделен. По своей третичной структуре инсулин представляет собой компактную глобулу, имеющую гидрофобное ядро и гидрофильные поверхности, ответственные за межмолекулярные взаимодействия. Взаимное положение полипептидных цепей молекулы инсулина стабилизируется дисульфидными связями (Б7-А7, Б19-А-20). В клетке инсулин синтезируется в виде его предшественника - проинсулина, состоящего из 81-86 аминокислотных остатка. В результате «выщепления» аминокислотных остатков из молекулы проинсулина, образуется инсулин, который поступает в кровь и осуществляет свой регуляторный эффект.

ИФР-1 - одноцепочечный пептид, состоящий из 70 аминокислотных остатков. По своей структуре он сходен с проинсулином, включает А и Б домены (гомология у человека составляет 43-45%). Третичная структура ИФР-1 сходна со структурой инсулина.

Локализация генов инсулина и ИФР-1 в хромосомах человека различна. Ген инсулина локазизован в И хромосоме, а ген ИФР-1 - в 12 хромосоме. РецепторКак известно в тканях мишенях высших позвоночных, инсулин и ИФР-1 действуют на клетку через рецепторы тирозинкиназного типа, обладающие собственной тирозинкиназной активностью.

Рецепторы инсулина и ИФР 1 являются мембранными гликопротеинами, представленными гетеротетрамерами, состоящими из двух а-субъединиц, и двух (3-субъединиц, наделенных протеинтирозинкиназной активностью. Инсулиновый рецептор и рецептор ИФР-1 имеет типичное строение. Они представлены в клетке гетеротетрамерными мембранными компонентами гликопротеинового комплекса, состоящего из двух доменов: а-домена и (3-домена общей массой 320 кДа. Две а-субъеденицы образуют внеклеточный домен, который расположен на внешней поверхности клетки и способен воспринимать эффект инсулина и таким образом выполнять лиганд-связывающую функцию. Молекулярная масса а-субъединицы составляет 135 кДа. Две р-субъеденицы представлены трансмембранным доменом, с молеклярной массой 95 кДа, который обладает тирозинкиназной активностью и именно этот тирозинкиназный сайт обладает каталитической активностью и обеспечивает реализацию внутриклеточных сигналов инсулина.

При связывании инсулина с рецептором происходит активация тирозинкиназы, которая катализирует фосфорилирование по тирозину как самого рецептора (аутофосфорилирование), так и широкого круга эффекторных белков. Согласно современным представлениям эта инсулин-регулируемая энзиматическая реакция является ключевой в механизме действия инсулина. На следующих этапах происходит фосфорилирование эфекторных белков по серину и треонину с участием специфических протеинкиназ (протеинкиназа "С", "А", митогенактивируемые протеинкиназы и другие) (СЬеШаш е1 а1., 1995). Наряду с протеинкиназным каскадом в регуляторные эффекты инсулина вовлечены и другие сигнальные пути, в частности связанные с гидролизом фосфолипидов (Перцева и др. 1996). Важнымдостижением последних лет является установление участия гетеротримерных О-белков в механизмах трансдукции инсулинового сигнала.

Одним из спорных и невыясненных вопросов, касающихся путей реализации регуляторного действия инсулина, остается вопрос об участии аденилатциклазной (АЦ) системы, генерирующей цАМФ. Как известно, этот циклический нуклеотид выполняет функцию вторичного посредника в действии обширной группы гормонов (катехоламинов, глюкагона, гипофизарных гормонов и других), рецепторы которых семь раз пронизывают мембрану (рецепторы серпантинного типа) и сопряжены функционально с О-белками. Между тем, в отношении гормонов, взаимодействующих с рецепторами, обладающими тирозинкиназной активностью (инсулин, ростовые факторы), в литературе сформировался негативный взгляд на возможность участия системы АЦ-цАМФ в опосредовании регуляторных влияний этих пептидов. Согласно данным литературы прошедших лет инсулин в некоторых тканях способен ингибировать базальную и предварительно стимулированную катехоламинами или глюкагоном активность АЦ и тем самым снижать уровень цАМФ. Кроме того, показано, что инсулин активирует мембраносвязанные формы цАМФ-зависимой фосфодиэстеразы и тем самым ингибирует процесс накопления цАМФ в клетке (Ноиз1ау, 1991 а,Ь). В 1994-1995 гг. появился принципиально новый взгляд на эту проблему в связи с тем, что автор впервые обнаружил способность инсулина и других пептидов инсулинового суперсемейства активировать ГТФ-зависимым образом АЦ вмышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных. Было установлено (Plesneva et al., 1994; 1999), что в реализацию указанного эффекта вовлечена тирозинкиназа рецептора инсулина и G-белки, как ингибирующего, так и стимулирующего типа (Pertseva et al., 1996). Полученные данные явились первым экспериментальным свидетельством возможности существования в клетке последовательного функционального взаимодействия рецепторов инсулина с G-белками и далее с АЦ (Plesneva et al., 1994). На основе полученных фактов и анализа сведений литературы была выдвинута гипотеза об участии обнаруженного АЦ сигнального механизма в осуществлении митогенного, а не метаболического действия инсулина и родственных ему пептидов. В этой связи следует подчеркнуть, что метаболические и митогенные регуляторные эффекты инсулина реализуются через раздельные сигнальные пути.

Проверка этой гипотезы была осуществлена нами в исследованиях, проведенных на скелетных мышцах куриного зародыша, развивающегося in vivo, в которых были сопоставлены сроки появления в процессе онтогенеза, с одной стороны, стимулирующего АЦ эффекта инсулина, с другой - митогенного действия этого гормона (Деркач и др. 1997). Из данных литературы известно, что в ходе эмбриогенеза в мышцах кур митогенное действие инсулина проявляется с первой недели развития (Duelos et al., 1991), между тем метаболическое влияние (изменение различных показателей углеводного обмена) - появляется лишь с 15 дня эмбрионального развития (Лейбсон и др., 1974). В наших исследованиях было выявленосовпадение сроков возникновения стимулирующего АЦ эффекта инсулина и его митогенного действия (первая декада эмбриогенеза) в процессе развития куриного зародыша in vivo (Деркач и др., 1997; Sandra, Przybylski, 1975).

Эксперименты с использованием селективных блокаторов тирозинкиназ показали, что в мышечных тканях млекопитающих (крысы) и птиц (цыплята) АЦ активирующее действие инсулина и ИФР-1 опосредуется через рецептор тирозинкиназного типа специфичный для обоих пептидов (Pertseva et al., 1996). Как оказалось, то же самое может быть сказано в отношении эффекта релаксина на АЦ. Сайты специфически связывающие инсулиноподобные пептиды позвоночных были обнаружены в ряде тканей млекопитающих (эндометрии, мозге, сердце) (Bullesbach et al., 1992; Schwabe and Bullesbach, 1994; Parsell et al., 1996). К числу пептидов инсулинового суперсемейства принадлежит релаксин. Мы были первыми, кто нашел подтверждение его тирозинкиназной природы (Kuznetsova et al., 1999). Позднее это было подтверждено данными (Bartsch et al., 2001), полученными в экспериментах с человеческими эндометриальными клетками и клетками моноцитов человека, где релаксин индуцирует накопление цАМФ, которое блокируется тирфостинами.

Что касается вовлечения гетеротримерных G-белков в действие гормонов и ростовых факторов, действие которых опосредуется через рецептор с собственной тирозинкиназной активностью, картина остается неясной. Собранные данные показывают возможное участие G-белка главным образом ингибиторного типа в рецепторной и пострецепторной стадиях трансдукции инсулинового сигнала в клетках позвоночных (Anand-Srivastava et al, 1995; O'Brien et al., 1987; Luft, 1997; Chidiac, 1998; Clapham, 1993; Hedin et al., 1993; Okamoto, Nishimoto, 1991; Okamoto et al., 1993; Wess, 1998). Наши экспериментальные и теоретические исследования (Перцева и др., 1995; Pertseva et al., 1996; Shpakov, 1996) показали, что рецептор тирозинкиназного типа инсулина и инсулиноподобных пептидов могут взаимодействовать с G;/0 и Gs-белками, приводя к их тирозиновому фосфорилированию и активации с высвобождением а- и Ру-субъединиц. За этими событиями, как мы полагаем, следует активация АЦ. Подобные стадии сигнальной трансдукции с участием Gs показаны в случае ЭФР (Poppleton et al., 1996). В скелетных мышцах крыс и цыплят, так же как и в гладких мышцах моллюска, АЦ стимулирующий эффект ЭФР, который опосредуется через рецептор тирозинкиназного типа и G-белокстимулирующего типа был зарегестрирован (Перцева и др., 1995, 1996; Pertseva et al., 1996; Деркач и др., 1997).

Имеются данные (Knol et al., 1992, 1995; Шпаков, Перцева, 1993), согласно которым, ткани моллюсков содержат G-белки структурно и функционально сходные с G-белками высших животных. В гладких мышцах двустворчатого моллюска Anodonta cygnea мы (Pertseva et al., 1992) идентифицировали 45-52 кДа дуплет G-белков - субстратов холерного токсина (гомологов а-субъединицы Gj-белка). Это дает основания сказать, что в мышцах Anodonta cygnea рецептор тирозинкиназного типа, ИПП, взаимодействуют с Gs/Gi-подобными белками, за чем следует регуляция АЦ активности. Структурный консерватизм G-белков в ряду беспозвоночные-позвоночные также позволяет говорить о консерватизме их функции сигнальной трансдукции (Перцева, 1989; Шпаков, Перцева, 1993). Фосфатидилинзитол-З-киназаФосфатидилинозитол-З-киназа участвует в реализации ряда инсулиновых эффектов как ростового, так и метаболического в тканях млекопитающих и других позвоночных (Combettes-Souverain and Issad, 1998; Gutkind et al., 1998). В экспериментах с использованием вортманнина на моллюсках Aplysia californica было обнаружено, что ФИ-3-К опосредует действие инсулина на ГЖС систему (Sossin et al., 1996). Структурные и функциональные гомологи регуляторной и каталитической субъединиц ФИ-З-К млекопитающих были обнаружены в тканях других беспозвоночных, насекомых (Drosophila) и у нематод (Caenorhabditis elegans). Их первичная структура имела 47-58% идентичныхаминокислотных остатков по сравнению с таковыми у млекопитающих (Шпаков и др., 2004). В данных литературы, имеются доказательства активации ФИ-З-К Ру-субъединицей Gj-белка (Шпаков, 1999). Наши данные об ингибировании инсулинстимулируемого АЦ-сигнального каскада коклюшным токсином и вортманнином показали вовлечение в него Gj белка и ФИ-З-К (Plesneva et al., 2001). Протеинкиназа ССреди мишеней регуляторного действия инсулина и других ростовых факторов, опосредующих свое действие через ФИ-З-К, право на существование имеет атипичная форма ПКС, а именно, ГЖС£. Мы сделали предположение, что ПКС^ вовлечена в АЦ сигнальный механизм инсулинового действия (Plesneva et al., 2001). Это было подтверждено в наших экспериментах со специфическими антителами против ПКС£, млекопитающих (кролика). Они представляют собой синтетический пептид, соответствующий С-концевому участку фермента (амино кислотным остаткам 577-592). Обработка мембранной фракции скелетных мышц крысы антителами приводила к нарушению трансдукции инсулинового сигнала через АЦ сигнальный механизм. Анлогичный эффект был выявлен в случае действия ИФР-1 и релаксина. Однако, в мышечных мембранах моллюска моноклональные антитела к ПКС£ не вызывали блокирующего эффекта на инсулиновый, ИФР-1 и ИПП АЦ активирующий эффект. Это можно рассматривать как свидетельство в пользу видо специфичности ПКС^ антител и/или определенных различий в паттерне ПКС изоформ в мышцах Anodonta cygnea не принадлежащих к ПКС^ типу или в сравнении с млекопитающими, где ПКС-зета имеетнесколько другие свойства. В поддержку этого предположения свидетельствуют работы Сосина (Sossin et al., 1996) о том, что Apl II, Са2+-независимая ПКС изоформа Aplysia califomica, являющаяся мишенью действия инсулина опосредованного через ФИ-З-К является гомологом ПКСе. Согласно данным литературы, у Drosophila melanogaster и Aplysia californica ПКС разделяются на подгруппы, которые найдены у млекопитающих (Dekker and Parker, 1995). Аденилатциклаза (АЦ)Установлено, что в тканях млекопитающих фермент АЦ представлен, по крайней мере, девятью изоформами фермента, которые формируют АЦ семейство. Несмотря на сходство в их мембранной топологии и существование обширных гомологичных участков в их аминокислотных последовательностях, они имеют различия в регуляторных свойствах и тканевом распределении, что и было использовано в классификации АЦ изоформ (Krupinski et al., 1992; Taussig and Gilman, 1995; Lai et al., 1997). Это вызывает вопрос, о том, которая из девяти изоформ АЦ является мишенью действия инсулина (и вероятно некоторых других членов инсулинового суперсемейства). Со времени открытия способности инсулина и инсулиноподобных пептидов активировать АЦ (Plesneva et al., 1994; Pertseva et al., 1995, 1996b; Kuznetsova et al., 1999), в ряде работ эти данные подтверждаются и даже и показан изоферментный тип АЦ чувствительный к инсулину (Кузнецова, 2002).

Такие работы были проведены и другими авторами. Так (Kawabe et al., 1994, 1996) показали, что в эмбриональных почечных клетках человекас повышенной экспрессией АЦ V, инсулин увеличивал продукцию цАМФ. Инкубация этих клеток с ПКС£ увеличивает накопление цАМФ. Эти авторы наблюдали прямое фосфорилирование АЦ V за счет ПКС^, после чего наблюдали увеличение АЦ активности в экспериментах in vitro, используя очищенные рекомбинантные формы АЦ V и ПКС^. Было сделано предположение, что инсулин регулирует цАМФ сигнальную передачу на уровне АЦ V через атипичную ПКС которая активируется инсулином и другими ростовыми факторами.

В связи с этим, значительный интерес представляют результаты изучения (Chen et al., 1995), направленные на идентификацию АЦ изоформ, чувствительных к стимулирующему действию ЭФР. Было показано, что АЦ V подвергается стимуляции ростовыми факторами, тогда как АЦ VI, несмотря на выраженную стимуляцию и структурную связь с АЦ V, не подвергается этому действию.

Согласно литературным данным, паттерн АЦ изоформ в исследуемых объектах, используемых в наших исследованиях был следующим. Крупинский и др., (Krupinski et al., 1992) показали, что в скелетных мышцах мыши АЦ представлена АЦ II (53%), АЦ VI (61%), АЦ IV и АЦ VII (11% каждая) и АЦ V (2%). В нашем объекте - скелетные мышцы крыс, АЦ изоформы вероятно имеют сходные паттерны. В гладких мышцах млекопитающих, человеческом и крысином миометрии почти все известные изоформы АЦ были идентифицированы за исключением АЦ I и АЦ VIII (Mhaouty-Kodja et al., 1997; Price et al., 1999). К сожалению, нет данных о АЦ изоформах в мышечных тканях моллюска.

Суммируя выше изложенные данные можно сделать предположение. Среди изоформ АЦ, присутствующих в скелетных мышцах крысы и миометрии человека, тканью мишенью регуляторного действия инсулина и пептидов инсулинового суперсемейства могут быть АЦ V, изоформа фермента представленная в периферических органах и изоформа - АЦ IIУчастие аденилатциклазного сигнального механизма в регуляции функционально значимых клеточных процессов при регуляторном влиянии пептидов инсулинового суперсемейства.

Известно, что регуляция развития нормальных тканей включает поддержание динамичного (функционального) баланса между такими фундаментальными процессами, как клеточная пролиферация, дифференциация и апоптоз. Запрограммированная гибель клеток является генетически предопределяемым физиологическим процессом, который встречается не только тогда, когда организм умирает, но также в течение всей жизни. Этот процесс играет важную роль в эмбриональном развитии, поддержании тканевого гомеостаза и при защите от патогенных факторов (Jacobson, 1997; Adams and Cory, 1998; Wilson, 1998). Молекулярные механизмы клеточной гибели еще в деталях не изучены. Однако сравнительные исследования этого процесса в ряду беспозвоночные-позвоночные выявили его эволюционный консерватизм (Fahrbach, 1997). Оказалось весьма вероятно, что «апоптотический» сигнальный механизм является очень древним в эволюции, поскольку гомологичные молекулы выполняют сходные функции у животных, филогенетически очень далеких друг от друга, таких как нематоды, насекомые и позвоночные.

Использование беспозвоночных как более простой модели клеточной гибели значительно способствовало пониманию путей и механизмов протекания этого процесса у высших животных (Перцева, 2006).

Сравнение протекания апоптоза у млекопитающих и нематод Caenorhabditis elegants, который был тщательно исследован, позволило подразделить апоптотические эффекторные белки на два класса: 1). Семейство онкогенов состоящее из Bcl-2, Bel-XL, Вах-1, которые регулируют чувствительность клеток к апоптозу; и 2). Семейство цистеиновых протеаз, обозначенных как ICE (interleikin-1 ß-converting enzyme) (интерлекин-1 ß-конвертирующий энзим), которые ответственны за исполнительную фазу клеточной гибели (Singleton et al., 1996). Bcl-2 ген кодирует белок, который локализован в митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме и околоядерной мембране. Он подавляет природный апоптоз предположительно через регуляцию кальциевого заряда в клетке. Bel-XL, по-видимому, имеет сходную функцию. Напротив, другой белок Вах - проапоптотический белок способен к гетеродимеризации с Ве1-2 или Bel-XL и усилению программы клеточной гибели. Соотношение этих двух белков к Вах определяет клеточную предрасположенность к апоптозу. В настоящее время 7 гомологичных ced-ЗЛСЕ-подобных белков идентифицировано у позвоночных. Филогенетический анализ показал, что некоторые из них имеют большое сходство с ced-3 белком нематоды С. elegants. Они синтезируются как проферменты и подвергаются протеолизу с образованием активных ферментов - группы каспаз, которые являются цистеиновыми протеазами и представлены в клетках во многих вариантах. Предполагается, что этиферменты формируют протеолитический каскад, взаимно активируя друг друга и приводя к клеточной деградации (Wilson, 1998). Учитывая то, что клеточная регенерация и клеточная гибель, являются фактически противоположными и взаимоисключающими процессами, стоит принять во внимание и существование доказательств в поддержку их функциональной связи (Evan and Littlewood, 1998; Wilson, 1998). Сведения о взаимосвязи между этими двумя антагонистическими процессами, которые должны быть отрегулированными, чтобы в клетке был достигнут адекватный ответ (клеточная выживаемость или гибель), является логическим подтверждением о том, что инсулин и инсулино-подобные пептиды обладающие митогенным действием могут осуществлять антиапоптотический эффект.

Имеются данные, подтверждающие это предположение. Согласно Батлер (Butler et al., 1998), ИФР-ы играют существенную роль в стимуляции процессов развития, роста и органогенеза, которые реализуются через их митогенное и антиапоптотическое действие. Было обнаружено, что инсулин и его предшественник - проинсулин играют важную роль на ранних стадиях развития позвоночных. В сетчатке куриных эмбрионов проинсулин модулирует (замедляет) апоптоз. Тот же самый эффект вызывал ИФР-1 на более поздних стадиях развития куриного эмбриона (Alarcon et al., 1998). Было сделано заключение, что проинсулин, инсулин и ИФР-1 - все они - являются ответственными за поддержание такого основного процесса в клетке как клеточный рост и выживаемость, регулируя апоптоз на ранних стадиях развития. ИФР-1 эффект на церамид-индуцированный апоптоз у куриного эмбриона вкультуре клеток внутреннего уха также предотвращает клеточную гибель (Frago et al., 1998). Антиапоптотическое влияние инсулина и ИФР-1 было показано на многих других типах клеток, что позволяет определить эти пептиды как факторы клеточной выживаемости (Merlo et al., 1996; Parrizas et al., 1997). Имеется информация о том, что рецептор ИФР-1 контролирует (через свою тирозинкиназную активность) интенсивность клеточной пролиферации в различных типах клеток, по крайней мере, двумя путями: как митогенный фактор и как протектор против апоптоза. В рецепторе ИФР-1 были выявлены домены, которые ответственны за генерацию митогенного или антиапоптотического сигналов (Li et al., 1996; Kulik et al., 1997; O'Connor, 1998). Протекторное действие ИФР-1 как было предположено реализуется через изменение активности ced-3/ICE-подобных протеаз. Детали о антиапоптотическом действии пептидов инсулинового суперсемейства представлены в работе Перцевой (Перцева, 2000). Изучение механизмов, подчеркивающих действие инсулина и ИФР-1 предотвращать клеточную гибель, которая вызывается физиологическими и нефизиологическими факторами, было начато только недавно.

Дальнейшая дешифровка АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства и наша гипотеза о его участии в ростстимулирующем действии этих пептидов (Перцева и др., 1995, 1996; Pertseva et al., 1995; 1996; Перцева, 2000) позволила нам скомбинировать две группы литературных данных, которые ранее не были взаимосвязаны. Первая группа данных показывает, что пептиды инсулинового ряда (проинсулин, инсулин, ИФР-1), помимо ростстимулирующего действия,осуществляют антиапоптотический эффект. Другая группа данных дает доказательства, что цАМФ, генерируемый АЦ сигнальной системой, также способен защищать клетки ингибируя апоптоз. Было показано, что сам цАМФ, также как форсколин, изопротеренол и другие агенты, способствующие образованию цАМФ, подавляют апоптоз за счет индуцирования различных факторов при лейкемии и в культуре гладкомышечных клеток сосудов (Garcia-Bermejo et al., 1998; Orlov et al., 1999). Также обработка дибутириловым аналогом цАМФ фолликулярных клеток крысы приводила к снижению интенсивности апоптоза в этой культуре (Chun et al., 1996). В этих клетках апоптотический процесс ингибировался в присутствии фолликул-стмулирующего гормона, действие которого опосредуется через рецептор серпантинного типа и через АЦ сигнальную систему, и в присутствии ИФР1, который согласно нашим исследованиям реализует свое действие через рецептор тирозин киназного типа и АЦ сигнальный механизм (Pertseva et al., 1996). Берридж и соавторы (Berridge et al., 1993) получили данные дающие доказательства, что цАМФ повышает выживаемость клеток и замедляет апоптоз в клетках костного мозга. Но механизм лежащий в основе этих регуляторных эффектов цАМФ остается неясным.

Обнаружение АЦ сигнального механизма действия инсулина и инсулино-подобных пептидов, с одной стороны, и получение фактов, показывающих участие этих пептидов и цАМФ в регуляции клеточной гибели, привело нас к следующему предположению. АЦ сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства вовлекается, в дополнение к ростстимулирующему, также в антиапоптотический эффект.

Это расширяет рамку нашей гипотезы о роли АЦ сигнального механизма и цАМФ как вторичного посредника в реализации широкого спектра регуляторных эффектов пептидов инсулинового ряда, которые являются ответственными за выживаемость клетки. Исследования в подтверждение этих предположений в настоящее время развиваются в нашей лаборатории. Сегодня накоплены данные показывающие, что некоторые стадии АЦ сигнального пути действия инсулина и инсулино-подобных пептидов, которые мы обнаружили, совпадают со стадиями трансдукции антиапоптотического сигнала, который они индуцируют. Выявлено, что в передаче этого сигнала рецептор тирозин киназного типа (Kulik et al., 1997) и ФИ-З-К участвуют (Butler et al., 1998; Kulik et al., 1997; Parrizas et al., 1997). Затем было показано, что тио-производные цАМФ, которые специфично активируют ПКА, ослабляют апоптоз в нейтрофилах человека ингибированием каспазы 3 (Parvathenani et al., 1998). Другие авторы также обнаружили прямые доказательства антиапоптотического действия цАМФ-зависимой протеин киназы в ряде клеток: НЕК-293 клетки (Lizcano et al., 2000), эозинофилов (Chang et al., 2000), и лейкемийных человеческих HL-60 клетках (Рае et al., 2000). Кроме этого имеются данные о исчезновении защитного (протекторного) действия цАМФ на апоптоз в культуре клеток гепатоцитов крысы в присутствии ингибиторов ФИ-З-К, ПКА и МАРК (Webster and Anwer, 1998). Из этого следует, что некоторые компоненты АЦ сигнального механизма вовлекаются в антиапоптотическое действие гормонов, генерирующих цАМФ и ростовых факторов (инсулина, ИФР1 и других). Поскольку активирующее действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦ является очень быстрымпроцессом (2.5-5.0 мин) (Рейзеуа е1 а1., 1995; Кигг^оуа е1 а1., 1999), АЦ сигнальный механизм, как можно предположить, играет запускающую роль в антиапоптотическом действии инсулина, ИФР-1 и других инсулиноподобных пептидов.

Роль АЦ сигнальнои системы и цАМФ в митогенном действии пептидов инсулинового суперсемейства.

Согласно данным литературы, многие пептиды инсулинового суперсемейства (инсулин млекопитающих, ИФР1, релаксин и ИПП моллюска) стимулируют АЦ систему в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных. Бомбиксин насекомых, другой член инсулинового суперсемейства, также проявляет цАМФ-аккумулирующий эффект в тканях мишенях (Филлипович, Кутузова, 1985). Так, сигнальный механизм, вовлекающий АЦ систему, может напрямую вовлекаться в трансдукцию сигналов, генерируемых инсулином и инсулиноподобными пептидами. Он может расцениваться как универсальный механизм действия гормонов и ростовых факторов, принадлежащих к инсулиновому суперсемейству. Все эти пептиды имеют две общие особенности: во-первых, их рецепторы обладают собственной тирозинкиназной активностью, во-вторых, они осуществляют как метаболический, так и митогенный эффект на клетку. Таким образом, встает вопрос, в какой из двух типов эффектов вовлечен АЦ сигнальный механизм?Результаты наших исследований и данных литературы свидетельствуют о вовлечении АЦ-цАМФ системы скорее в митогенное,чем в метаболическое действие пептидов инсулинового суперсемейства (Pertseva et al., 1995; Pertseva et al., 1996).

Предпосылки существования этой гипотезы основываются на следующих заключениях:А). Новый подход к роли цАМФ как к возможному позитивному регулятору клеточной пролиферации, что предполагали Дюмонт и другие авторы (Dumont et al., 1989, 1992; Roger et al., 1995; Van Keymeulen et al., 2000). Достижения, сделанные в изучении этой проблемы, привели авторов к заключению, что влияние цАМФ на клеточную пролиферацию является либо позитивным (стимуляция), либо негативным (ингибирование), что зависит от ряда факторов. Эти факторы следующие: 1). Тип клетки и программа ее дифференциации; 2). Стадия клеточного цикла; 3). Концентрация цАМФ (при низких физиологических концентрациях - эффект стимулирующий, при более высоких, фармакологических концентрациях - эффект может быть ингибирующим). Негативная роль цАМФ в регуляции клеточного роста была показана в ряде работ в 70-80-е годы (Dumont et al., 1989). Именно эти авторы описали факт, что исследования главным образом проводились не на нормальных клеточных линиях, а на клеточных линиях, которые имеют различные дефекты, возможно связанные с использованием культур клеток, уже заведомо модифицированных введением какого-либо гена, либо модифицированных условиями использованной среды культивирования, либо на высокодифференцированных клетках, не способных к пролиферации. Другой причиной могли быть высокие концентрации цАМФ и/или продолжительное действие нуклеотидов, чтоприводит к иигибированию клеточного роста. Негативный контроль процесса пролиферации цАМФ-ом был обнаружен в ограниченном ряду клеточных типов, в то время как в большинстве нормальных клеток цАМФ имеет митогенный эффект.

Б). Противоположность (антагонизм) многих метаболических эффектов инсулина и гормонов - стимуляторов АЦ ф-адренергические агонисты, глюкагон, серотонин, TSH - тиреотропный стимулирующий гормон и другие) и однонаправленность (синергизм) их митогенного действия (Baptist et al., 1993).

Для того, чтобы объяснить это, нужно обратить внимание на четкую согласованность в способности большой группы гормонов и ростовых факторов активировать АЦ и процесс синтеза цАМФ, с одной стороны, и на существование ростстимулирующего действия цАМФ на клетку, с другой. Эти гормоны и ростовые факторы могут быть подразделены на две подгруппы в соответствие с типом рецепторов, опосредующих их митогенное действие.

К первой подгруппе принадлежат хорошо известные гормоны -стимуляторы АЦ, реализующие свой эффект через рецептор серпантинного типа, сопряженный с гетеротримерными G-белками (биогенные амины, глюкагон, TSH и другие). Большинство из них осуществляют ростстимулирующий эффект (Gutkind et al., 1998).

К другой подгруппе принадлежат гормоны и ростовые факторы (пептиды инсулинового суперсемейства, ЭФР, фактор роста тромбоцитов, и другие), осуществляющие митогенное действие через рецептор тирозинкиназного типа.

Инсулиноподобные пептиды (Pertseva et al., 1995, 1996; Plesneva et al., 2001) и ЭФР (Nair et al., 1990; Nair and Patel, 1993) активируют АЦ через гетеротримерный G-белок стимулирующего типа. В отношении их регуляторного действия на метаболические процессы в клетке, инсулин и инсулиноподобные пептиды являются антагонистами гормонов -активаторов АЦ - принадлежащих к первой подгруппе. Это исключает вовлечение АЦ сигнального механизма в реализацию метаболических эффектов пептидов инсулинового суперсемейства. В то же самое время, две подгруппы гормонов осуществляют однонаправленное стимулирующее влияние как на АЦ активность, так и на клеточную пролиферацию. Факты, изложенные выше, дают основание предположить вовлечение АЦ сигнальной системы в механизм митогенного действия большой группы гормонов и ростовых факторов, в котором цАМФ может играть роль вторичного посредника (Pertseva et al., 1995, 1996; Перцева, 1999, 2000).

В). Предположение, что метаболические и митогенные эффекты инсулина, инсулино-подобных гормонов и ростовых факторов реализуются через различные сигнальные пути, которые расходятся на рецепторной стадии или на инициации пострецепторных стадий сигнальной трансдукции (Gupta, 1997; Combettes-Souverain and Issad, 1998).

В последние 10 лет накопились данные, которые дают экспериментальные подтверждения этому представлению (Baptist et al., 1993; Draznin et al., 1993). Изучение регуляторных эффектов ИФР-1 (вход [ЗН]-дезоксиглюкозы, вход кальция, продукция диацилглицерола,включение [ЗН]-тимидина в Balb/c ЗТЗ клетки) позволило получить доказательства, что механизм трансдукции митогенного действия инсулиноподобных факторов отличается от метаболических эффектов инсулиноподобных пептидов (Kojima et al., 1990). Это согласуется с результатами генетических исследований показывающих, что мутации в инсулиновом рецепторе, который сходен с рецептором ИФР-1, имеют разное влияние на метаболические и митогенные действия инсулина (Taylor et al., 1992, 1994; Pertseva et al., 1996). Все это согласуется с концепцией о том, что плейотропное действие инсулина опосредуется через несколько отличных сигнальных путей (O'Britn and Granner, 1996). Другим подтверждением этого служат данные, показывающие, что МАПК- каскад, обычно приписываемый к участию в механизме митогенного действия ростовых факторов, не вовлекается в реализацию метаболических эффектов инсулина, таких как поглощение глюкозы, липогенез, синтез гликогена, и не влияет на активность гликогенсинтетазы, киназы фосфорилазы и фосфорилазы (Lazar et al., 1995). Предположение, что МАПК каскад вовлекается в реализацию ростстимулирующих эффектов инсулина, таких как - регуляция синтеза ДНК, процесс трансляции, было также показано в обзоре Дентона и Тава (Denton and Tavare, 1995).

Изучение механизма действия инсулина на экспрессию генов, которые модулируют утилизацию глюкозы и клеточный рост, показало, что регуляция инсулином функционирования Egr-1 (ранний ген, ответственный за рост) и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ген ответственный за метаболизм) опосредуется через различные сигнальныепути (Alexander-Bridges et al., 1992). Согласно этому предположению эффекты инсулина на гены ответственные за ростовые эффекты, реализуются через фосфорилирование белков, в то время как гормоны действуют на гены, ответственные за метаболизм, через ингибирование этого процесса. Исходя из данных Кона (Cohen, 1993; Cohen, Frame, 2001) о механизме реализации метаболического действия инсулина, регуляция ключевых ферментов метаболизма гликогена опосредуется через ингибирование соответствующих протеинкиназ и стимуляцию протеин фосфатазы I, которая фосфорилирует гликоген синтетазу (активация фермента) и киназуфосфорилазы, а также фосфорилазу (ингибирование ферментов).

Согласно Лазар (Lazar et al., 1995) после активации рецептора инсулин регулирует форфорилирование по серину и треонину, стимулируя фосфорилирование одних белков и дефосфорилирование других. Фосфорилирование по серину и/или треонину многих мишеней, вызванное инсулином, является во многом вкладом других ростовых факторов. Напротив, дефосфорилирование белков, обуславливает то, что инсулин является единственным фактором, служащим критерием для многих его метаболических эффектов.

Таким образом, в литературе существуют сведения о разграничении метаболических и митогенных эффектов инсулина и пептидов инсулинового суперсемейства.

В экспериментах с фибробластоподобными клетками Swiss3T3 культуры, сравнение было сделано между митогенным эффектоминсулина, ИФР-1 и ЭФР и их стимулирующим действием (Плеснева и др. 1999). Инсулин (1000 нг/мл), ИФР1 (10 нг/мл) и ЭФР (Юнг/мл) осуществляли (вызывали, имели) отчетливый митогенный эффект (увеличение до 250%, по сравнению с контролем, принятым за 100%), оцениваемый по включению [14С]-тимидина в ДНК. Пептиды, взятые при тех же концентрациях, отчетливо стимулировали АД активность (увеличение над контролем от 400 до 700%). Если наша гипотеза справедлива, то цАМФ формируется в результате АЦ активации, которая мимикрирует митогенный эффект пептидов. Действительно, негидролизуемый аналог цАМФ (дибутирил-цАМФ) при низких12 9концентрациях (10" 10" М) осуществляет четкий стимулирующий эффект на синтез ДНК (увеличение на 400-750% над контролем). Эти факты убедительно соотносятся с литературными данными о способности цАМФ и его аналогов воспроизводить митогенный эффект (Roger et al., 1995).

Имеющиеся в литературе исследования показывают, что была установлена динамика АЦ стимулирующего эффекта инсулина в процессе онтогенетического развития по сравнению с таковыми митогенного и метаболического эффекта инсулина в скелетных мышцах цыплят, развивающихся in ovo и in vitro (первичная культура миобластов) (Деркач и др., 1997; Плеснева и др. 1998). Эффект инсулина на АЦ был выявлен и имел выраженный пик в первые 10 дней эмбрионального развития. На следующих стадиях эмбриогенеза и постэмбрионального развития он был менее выражен. В процессе миогенеза in vitro эффект сильно увеличивался на 1-2-й дни клеточного роста миобластов в культуре, что согласуется с периодом интенсивной пролиферации миобластов. Эффект инсулина,связанный с его митогенным действием (стимуляция синтеза ДНК, РНК, аминокислотного поглощения, белкового синтеза и др.) был также выявлен на ранних стадиях миогенеза in vivo (первая неделя эмбриогенеза) и in vitro (1-2-й дни пролиферации миобластов). В то же самое время, in vivo метаболические эффекты инсулина (влияние на различные показатели углеводного метаболизма) начинают проявляться только с начала третьей недели эмбрионального развития (цыплят), и in vitro выявляются только в зрелых мышечных клетках (миотубах) (5-6 дней роста или развития культуры), которые совпадают со стадиями их дифференциации (Деркач и др., 1997; Плеснёва и др. 1998),На ранних стадиях развития мышечной ткани инсулин, вероятно, действует как ростовой фактор - регулятор клеточной пролиферации, но не как регулятор углеводного метаболизма. Совпадение появления признаков, динамика и уровень экспрессии инсулина, проявление АЦ эффекта в процессе эмбриогенеза, с одной стороны, и митогенное действие гормона на стадии интенсивного клеточного роста, с другой стороны, указывает на четкую взаимосвязь этих параметров. Это свидетельствует о вовлечении АЦ сигнального механизма и соответственно цАМФ в реализацию ростстимулирующего действия инсулина. Другие члены инсулинового суперсемейства также осуществляют митогенное действие. Инсулин и ИФР-1 при низких концентрациях (io-n-io-9 М) имеет одинаковый эффект (Bigazzi et al., 1992). При тех же концентрациях ИФР-1 индуцирует быстрое увеличение уровня цАМФ в ряде тканей (Cronin et al., 1987; Fei et al., 1990; Parsell et all., 1996). Данные, имеющиеся в литературе и полученные нами, далиоснование для постулирования участия АЦ сигнального механизма и цАМФ в митогенном действии пептидов инсулинового суперсемейства. Действие пептидов инсулинового суперсемейства, осуществляющих сой эффект через рецептор тирозинкиназного типа может быть реализовано при участии (Зу-субъединиц Оьбелков и ц-АМФ, который формируется в процессе трансдукции митогенного сигнала через АЦ систему (Ощктс! е1 а1., 1998).

Регуляторное влияние цАМФ в реализации метаболических эффектов инсулина и инсулиноподобных пептидов.

Наш взгляд АЦ-цАМФ система, не вовлеченная непосредственно в метаболическое действие инсулина, не исключает ее роль как регулятора трансдукции метаболических сигналов, генерируемых этим гормоном. В рамках нашей гипотезы мы сделали предположение, что цАМФ, образующийся в АЦ сигнальном механизме может быть вторичным посредником, принимающим участие в реализации митогенного и антиапоптотического действия инсулина, и паралельно - ингибитором метаболических эффектов гормона. Такое ингибиторное влияние цАМФ вероятно реализуется на ключевой стадии дивергенции (расхождения) сигнальных путей вероятно ниже, чем ФИ-З-К. Из этого следует, что цАМФ будет функционировать как фактор, контролирующий трансдукцию инсулинового сигнала с одного сигнального пути (метаболического) на другой (митогенный). Это представляется возможным, поскольку в клетке митогенный и метаболический сигнальные пути конкурируют за утилизацию энергии, необходимой дляреализации эффектов пептидов инсулинового ряда, например, процессов синтеза, необходимых для интенсификации клеточного роста, с оной стороны, и процессов, ответственных за накопление энергетических резервов (в частности накапливая гликогена), с другой. Если это так, то тогда индуцированное инсулином накопление цАМФ через АЦ сигнальный механизм, который как мы рассматриваем, вовлекается в митогенное действие этого гормона, будет ингибировать передачу сигнала через метаболический путь.

В настоящее время в литературе имеются данные, подтверждающие нашу идею. Было показано в некоторых исследованиях, что цАМФ осуществляет ингибирующее влияние на реализацию некоторых метаболических эффектов инсулина и ИФР-1. Увеличение уровня цАМФ в адипоцитах, индуцированное различными агентами приводило к снижению клеточной реактивности к метаболическому действию инсулина и его антилиполитическому эффекту ^езэЬи ^ а1., 1993). Накопление цАМФ также снижает клеточную реактивность к стимулирующему действию инсулина на транспорт глюкозы. Авторы (\¥е8з1аи е! а1., 1993) делают заключение о ключевой роли уровня цАМФ в модуляции чувствительности к инсулину клеток мишеней и в частности ингибированию трансдукции метаболических эффектов инсулина. Здесь цАМФ является антагонистом метаболического действия инсулина. Изучение двух серин/треонин-специфических протеин фосфатаз (РР-1 и РР-2А), ответственных за регуляцию активности ферментов метаболизма гликогена, способность цАМФ предотвращать инсулиновые эффекты на фосфатазы в культуре клеток скелетных мышц крысы была выявлена(Srinivasan and Begum, 1994; Begum and Ragolia, 1996; Brady, Saltiel, 2001). Было также сделано предположение, что уровень цАМФ является оценкой эффекта на инсулиновую регуляцию метаболизма гликогена и опосредуется через митоген-активируемый протеинкиназный каскад.

Наша гипотеза нашла подтверждение в исследованиях (Ito et al., 1997), показывающих что цАМФ способен как подавлять инсулин-активируемый эффект на транспорт амино кислот и синтез гликогена в гепатоцитах крысы, так и потенцировать влияние инсулина на синтез ДНК (митогенный эффект), который с нашей точки зрения реализуется через АЦ сигнальный механизм и цАМФ.

Теперь позволим себе сформулировать нашу гипотезу в целом (Перцева, 2000). Согласно текущему потоку информации (Saltiel, 1996), плейотропное действие инсулина на клеточные процессы и функции реализуется через сеть сигнальных путей, которые вероятно расходятся на рецепторной и ранних пострецепторных стадиях гормональной сигнальной трансдукции. Данные, свидетельствующие о существовании различий между сигнальными путями, ответственными за митогенное и метаболическое действие инсулина было обсуждено выше. Теперь вопрос состоит в том, что является ответственным за выбор инсулинового сигнального пути (сигнального пути реализации инсулинового сигнала в каждом отдельном случае, какие механизмы и факторы вовлекаются в эти процессы в клетке).

Хотя вопросы остаются открытыми, механизмы переключения трансдукции гормональных сигналов с одного пути на другой (исключая один и начиная другой) в настоящее время весьма актуальны. Мыпостулировали, что один из таких механизмов может быть - АЦ сигнальным механизмом. Открытый нами аденилатциклазный сигнальный механизм действия инсулина и инсулиноподобных пептидов, позволил выдвинуть гипотезу о том, что через него осуществляется, прежде всего, митогенное, нежели метаболическое влияние гормонов инсулинового сперсемейства. Дальнейшая дешифровка АЦ сигнального механизма на основе накопленных данных, подтверждало нашу гипотезу: во-первых, АЦ сигнальный механизм и цАМФ вовлекаются не только в митогенное, но также в антиапоптотическое действие инсулина и инсулиноподобных пептидов, и, во-вторых, АЦ сигнальный механизм является ответственным за негативную регуляцию метаболического эффекта инсулина, но не за его реализацию. В действии пептидов инсулинового суперсемейства АЦ сигнальный механизм и цАМФ способны, со всей вероятностью, осуществлять координирующую функцию регуляции большинства важных клеточных процессов:1. АЦ-цАМФ система действует как вторичный мессенджер в трансдукции митогенных сигналов пептидов, приводящих к стимуляции клеточной пролиферации.

2. АЦ-цАМФ система вовлекается в реализацию негативного влияния пептидов на процессы клеточной гибели, которые повышают оптимальную завершенность их митогенного эффекта и таким образом выживаемость клеток.

3. АЦ-цАМФ система играет роль негативного регулятора метаболического действия пептидов, что мешает реализации ряда метаболических эффектов, поскольку повышается их митогенное влияние.

В двух первых случаях, цАМФ прямо участвует в передаче митогенного и антиапоптотического сигналов, выполняя «трансдукторную» роль. В третьем случае цАМФ играет регуляторную роль, т.е. участвует в регуляции метаболических эффектов. Эти три факта лежат в основе нашей гипотезы о ключевой роли цАМФ, продуцированного АЦС, как общего координатора и регулятора трех несовместимых клеточных процессов. Являясь точкой отсчета над разными сигнальными системами, цАМФ определяет путь для реализации эффекта трансдукции сигнала: начиная одну программу (пролиферативную) и выключая две другие, которые ведут к апоптозу и преобладанию анаболических процессов в клетке. Тройственная координирующая роль цАМФ может быть основана на взаимной регуляции жизненно-важных клеточных процессов, регулируемых инсулином и другими пептидами инсулинового суперсемейства, и может быть рассмотрена как новая функция цАМФ. Дальнейшее развитие нашей гипотезы и ее экспериментальное подтверждение даст лучшее понимание механизмов действия и регуляторных функций гормонов и ростовых факторов инсулиновой природы.

Ферменты углеводного обмена в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных.

Известно, что пептиды инсулинового суперсемейства обладают широким спектром биологических эффектов, важнейшими из которых являются метаболические и митогенные. Основной метаболический эффект инсулина - гипогликемический, определяется усилением процессов утилизации глюкозы и синтеза гликогена в периферическихтканях, что показано для зрелой мышечной ткани позвоночных животных (Halse et al., 2001).

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ, НФ 1.1.1.49) - ключевой фермент пентозофосфатного пути (ПФП), который поставляет два важных соединения для анаболических процессов: НАДФ, необходимый во многих обменных процессах, в том числе для синтеза жирных кислот, и рибозо-5-фосфат - предшественник нуклеотидов. Г6ФДГ катализирует первую реакцию ПФП - дегидрирование глюкозо-6-фосфата до 6-фофоглюканата с образованием НАДФ. Показано участие фермента в реализации ростовых эффектов (Tian et al., 1998). Под влиянием инсулина активность фермента увеличивается в ряде тканей (Kletzien et al., 1994; Bergetal., 1995).

Гликогенсинтетаза (ГС, НФ 2.4.1.11) является ферментом, лимитирующим скорость синтеза гликогена. Фермент представлен в тканях в двух формах: независимой от глюкозо-6-фосфата (Г6Ф) активной ГС-1 (independent) и зависимой от Г6Ф, неактивной ГС-D (dependent) формах, взаимопревращение которых и, соответственно, скорость синтеза полисахарида контролируется реакциями фосфорилирования-дефосфорилирования. Инсулин стимулирует ГС посредством ее дефосфорилирования, переводя фермент из неактивной ГС-Б-формы в активную ГС-1-форму (Cohen, 1993; Cohen, Frame, 2001).

Оценка активности Г6ФДГ и ГС в мышечных тканях животных разного филогенетического уровня продемонстрировала наличие видовых различий в активности ферментов. Значительные различия выявлены при сравнении активности ферментов у позвоночных и беспозвоночных. Так,оказалось, что для моллюсков характерна высокая активность Г6ФДГ мышц по сравнению с высшими животными. Эти данные могут свидетельствовать о весьма существенном значении ПФП в углеводном обмене мышечной ткани моллюска и означать, что у этих животных значительная часть фосфорилированных гексоз включается в ПФП. В отношении моллюсков наши данные согласуются с данными литературы, указывающими на высокую активность Г6ФДГ в мышечной ткани анодонты (Гормосова, Шапиро, 1984). Также выявлена связь между степенью подвижности моллюска и величиной активности Г6ФДГ -активность фермента высока у малоподвижных и прикрепленных моллюсков (анодонта, мидия) (Гормосова, Шапиро, 1984). Иная картина была обнаружена нами в отношении активности ГС в мышцах анодонты. Активность ГС была ниже по сравнению с активностью фермента у высших позвоночных. Результаты, полученные на моллюсках, согласуются с данными литературы (Гормосова, Шапиро, 1984), свидетельствующими, что у малоподвижных моллюсков, к которым относится анодонта, содержание гликогена и активность ГС в мышцах ниже по сравнению с подвижными видами. Таким образом, эти данные хорошо согласуются со сведениями литературы, о связи между высокой активностью Г6ФДГ, относительно низким содержанием гликогена и низкой активностью ГС, с одной стороны, и малой подвижностью анодонты с другой.

Инсулин способен обеспечивать регуляцию целого ряда процессов в организме как метаболических (углеводный обмен), так и рост-стимулирующих. Действие гормонов осуществляется через сложную сетьсигнальных систем, многие из которых окончательно не установлены (Saltiel, 1996; Whitehead et al., 2000; Cohen, Frame, 2001). Выявлено сходство в направленности, но не в эффективности стимулирующего влияния инсулина на активность ферментов. Таким образом, сопоставление метаболической активности инсулина (по стимуляции ключевых ферментов гликогенеза и ПФП) может свидетельствовать о присутствии в молекуле инсулина сходных функциональных доменов, способных усиливать расщепление Г6Ф в ПФП и синтез гликогена в мышцах как беспозвоночных, так и позвоночных животных.

Следует отметить, что точно не известны сигнальные пути, ведущие к активации инсулином изученных ферментов углеводного обмена. Базируясь на данных литературы, можно высказать следующие предположения о механизмах действия инсулина на Г6ФДГ. Стимуляция активности фермента может осуществляться за счет усиления экспрессии мРНК фермента и активации синтеза белка Г6ФДГ (Kletzien et al., 1994; Berg et al., 1995). Этот эффект блокируется ингибиторами синтеза белка (актиномицином Д и пуромицином) (Кузнецова, 1998 а,б), в мышцах анодонты в течение 30 мин наблюдается блокада ГбФДГ-стимулирующего эффекта инсулина ингибитором синтеза ДНК - актиномицином Д и блокатором синтеза белка - пуромицином. Эти данные свидетельствуют о том, что механизмом стимуляции инсулином активности Г6ФДГ мышц беззубки является синтез ферментного белка de novo. Другой механизм был предложен Стентоном и соавторами (Stanton et al., 1991). Суть его состоит в том, что стимуляция инсулином активности Г6ФДГ осуществляется за счет изменения локализации фермента в пределахклетки. Так было показано, что в норме Г6ФДГ находится в связанном состоянии с внутриклеточными структурами. При действии инсулина Г6ФДГ в течение нескольких минут фермент транслоцируется в цитозоль, где его активность возрастает. Обнаружено, что подобная транслокация и стимуляция активности Г6ФДГ зависит от степени фосфорилирования по тирозину рецептора гормона и активации фосфатидилинозитол-3-киназы (ФИ-З-К) (Stanton et al., 1991; Tian et al., 1998). Наряду со стимуляцией инсулином активности Г6ФДГ было выявлено одновременное увеличение клеточного роста гепатоцитов и опухолевых клеток крыс (Tian et al., 1998). Это свидетельствует об участии Г6ФДГ в процессах роста тканей. В наших экспериментах на мышцах анодонты не выявлено связи между стимуляцией инсулином и транслокацией в цитозоль Г6ФДГ (Tian et al., 1998).

По современным представлениям сигнальный механизм стимулирующего действия инсулина на активность ГС включает следующую цепь сигнальных событий. Инсулин, взаимодействуя с рецептором, стимулирует его тирозинкиназную активность, что приводит к фосфорилированию по тирозину инсулин-рецепторного субстрата 1 (ИРС1), который активирует фосфатидилинозитол 3-киназу. 3-фосфоинозитиды - продукты фосфатидилинозитол 3-киназной реакции, стимулируют фосфатидилинозитид-зависимую протеинкиназу Д (PKD1), фосфорилирующую протеинкиназу В. Последняя фосфорилирует по серину гликогенсинтетазу киназу 3, ингибируя ее и тем самым способствуя процессу дефосфорилирования гликогенсинтетазы и ее активации (Cohen, Frame, 2001) Имея в виду этот механизм,проанализируем картину, выявляемую в отношении ГС мышц. В наших работах (Кузнецова, 19986; Кузнецова и др., 2004). было продемонстрировано, что фосфорилирование по тирозину рецепторов инсулина очень существенно для стимуляции активности как Г6ФДГ, так и ГС в мышцах моллюсков и цыплят. Показано, что блокаторы рецепторных тирозинкиназ (тирфостин 47 и генистеин) снижали до контрольного уровня Г6ФДГ- и ГС-стимулирующий эффект инсулина, что указывает на вовлеченность рецептора тирозинкиназного типа в стимуляцию этих ферментов в мышцах животных разного филогенетического уровня.

Активность Г6ФДГ и ГС различалась в мышцах высших и низших животных. Самая высокая активность Г6ФДГ была обнаружена в мышцах моллюска. В мышцах высших позвоночных (крысы и цыплята) активность фермента была на порядок ниже. Противоположная картина была выявлена при изучении активности ГС. Активность фермента была более высока в мышцах крыс и цыплят, и ниже в мышцах моллюска и миноги.

Инсулин in vitro дозозависимо активировал Г6ФДГ и ГС в мышцах изученных животных. В мышцах крыс и цыплят пептид оказывал максимальное влияние на активность Г6ФДГ при концентрации Ю"10М, а в мышцах моллюска - при концентрации на два порядка более высокой (10"8М). Максимальная активация инсулином ГС выявлялась прио оконцентрации 10" М в мышцах крысы и при концентрации 10" М в мышцах цыплят и моллюска.

Чувствительность Г6ФДГ и ГС к инсулину не зависит от уровня исходной активности ферментов в мышцах изученных животных.

Инсулин оказывает сходное однонаправленное регуляторное влияние на активность ферментов, т.е. можно говорить о наличии количественных различий в действии пептида, а не качественных.

Эволюционный подход в изучении сигнальных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемействаИмеющийся опыт, достигнутый в изучении молекулярной структуры инсулинов различного происхождения и сигнальных механизмов гормонального действия у позвоночных и беспозвоночных и данные литературы (Перцева, 1989; 1999; Русаков и др., 1991, 2004; King, Kahn, 1981) дали возможность подойти к проблеме касающейся механизмов регуляторного действия инсулина с эволюционной точки зрения.

Такое понимание эволюционного процесса приводит нас к предположению, что перспективно изучать механизмы действия инсулина используя сравнительные исследования сигнальных механизмов в плане влияния инсулина и других пептидов инсулинового суперсемейства. Гомология первичной структуры пептидов инсулинового суперсемейства и их рецепторов (Murray-Rust et al., 1992) отражает сходство механизмов их сигнальной трансдукции. Если это действительно так, то изучение сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства будет способствовать лучшему пониманию этой проблемы, и таким образом прогрессу в области молекулярной и сравнительной эндокринологии.

Эволюционный подход, который мы использовали (Pertseva 1991; Pertseva et al., 2006), дал нам возможность во-первых: провестисравнительные исследования влияния на АЦ систему пептидов -представителей трех кластеров филогенетического древа (Murray-Rust et al., 1992) - инсулина, ИФР-1 млекопитающих, релаксина (человеческого) млекопитающих, инсулиноподобного пептида моллюска Anodonta cygnea (ИПП). Во-вторых, АЦ стимулирующий эффект пептидов исследовали в тканях-мишенях как позвоночных (миометрий человека, скелетные мышцы крыс и цыплят), так и беспозвоночных (гладкие мышцы ноги моллюска Anodonta cygnea).

Участие АЦ сигнальной системы в реализации действия пептидов инсулиновой природы при сахарном дибетеМножество данных существует, позволяющих в какой-то мере объяснить причины возникновения сахарного диабета. Об этом, я думаю, не стоит говорить. В настоящее время, этот вопрос, несомненно, должен рассматриваться на молекулярном уровне. Данных литературы, относительно участия в этом процессе АЦ сигнальной системы, практически нет, что на самом деле и интересно.

Задачи исследования состояли в следующем:1. Исследовать действие инсулина, ИФР-1 и ИПП, выделенного из висцеральных органов моллюска Anodonta cygnea, на АЦС в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных. Охарактеризовать зависимость эффекта от времени и концентрации исследуемых пептидов, а также от присутствия гуаниновых нуклеотидов для подтверждения вовлеченности в АЦ сигнальный механизм гетеротримерных G-белков.

632. Исследовать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма, опосредующего эффекты пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных и выяснить последовательность этапов передачи регуляторных сигналов этих пептидов на АЦС. С этой целью: а) установить тип рецепторов и в-белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия пептидов, используя ингибиторы рецепторных тирозинкиназ и метод АДФ-рибозилирования бактериальными токсинами; б) выявить участие фосфатидилинозитол-3 киназы (ФИ-З-К), используя специфичный ингибитор вортманнин; в) идентифицировать изоформу протеинкиназы «С» (ПКС); используя ингибиторы ПКС и моноклональные антитела к изоформам ПКС.

3. Исследовать участие АД сигнального механизма действия инсулина и ИФР-1 в регуляции процессов клеточного роста и апоптоза, исходя из гипотезы о важной роли цАМФ в регуляции фундаментальных процессов в клетке.

4. Исследовать функциональные нарушения в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства при эндокринной патологии - сахарный диабет 1-го и 2-го типов.

Материалы и методы исследованияОбъекты исследованияОбъектами исследования служили представители позвоночных (крыса, кура) и беспозвоночных (пресноводный двустворчатый моллюск Anodonta cygnea), а также культуры клеток.

В экспериментах были использованы:1). Самцы крыс Ratus norvégiens линии Wistar, из вивария Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, РАН. Крысы содержались в привычных стандартных условиях на обычном рационе и имели свободный доступ к воде.

3). Двустворчатые пресноводные моллюски Anodonta cygnea, выловленные в водоемах Ленинградской области. У моллюсков преобладают гладкомышечные ткани, которые считаются парамиозиновыми гладкомышечными тканями (Скоборовичук, 1974:Заварзин, 1976). Исследования были проведены на гладких мышцах ноги двустворчатого пресноводного моллюска Апос1оШа су^пеа, представляющих собой группу гладких мышц, расположенных послойно.

4) Культура клеток миобластов куриных эмбрионов, фибробластоподобная культура клеток линии SwissЗTЗ, культура клеток, трансформированная из нормальных фибробластов разных линий (Е1А+сНа-гаБ и Е1А+Е1В). Они служат основой для формирования мышечной ткани и являются тканями-мишенями действия инсулина и инсулиноподобных пептидов, поскольку содержат рецепторы этих пептидов, через которые реализуются физиологически значимые ответы в клетке. (Плеснёва и др., 1998; 1999; 2003).

Эксперименты проводили на мембранных фракциях, выделенных из скелетных мышц лап крыс, из мышечной ткани голени кур, гладкой мышцы ноги моллюска, культуры миобластоподобных и фибробластоподобных клеток.

Выбор объектов и тканей-мишеней был обусловлен следующими обстоятельствами:1). Возможностью проводить сравнительный анализ функционирования АЦ сигнальной системы в скелетных мышцах позвоночных (крысы, куры, куриные эмбрионы, миометрий человека) и гладких мышцах беспозвоночных (двустворчатый пресноводный моллюск Апос1оп1а су%пеа)\ Выбор исследуемых объектов и тканей обусловлен не только возможностью сравнивать позвоночных и беспозвоночныхживотных, но и возможностью анализировать изучаемые эффекты на разных типах мышц.

2). Использовать культуры клеток, являющихся "предшественниками тканей-мишеней" (т.е. мышечных тканей) для понимания молекулярных и функциональных основ механизмов, реализации эффектов пептидов инсулинового суперсемейства, осуществляемых через АЦ сигнальную систему в клетке, в условиях, когда клетки лишены эффекторных влияний, присутствующих на уровне организма.

Использованные в работе клеточные культуры Культура куриных миобластовКультура куриных миобластов представляет собой первичную монослойную культуру миобластов куриных эмбрионов, растущих в условиях in vitro, которая охарактеризована нами морфологически на разных стадиях развития. Через 8 часов развития культура представлена одиночными миобластами, имеющими веретеновидное тело и два полярных отростка. На 2-3 сутки развития миобласты образуют симпласт с 2-3 ядрами. На 4-5 сутки развития в миосимпластах появляется поперечная исчерченность. Выявленные нами морфологические характеристики культуры соответствуют данным литературы (Соколов, 1975; Лызлова С.Н., 1981; Пинаев, 1981).

Избранная в качестве модели культура клеток куриных миобластов имеет ряд преимуществ. Во-первых, развивающаяся в культуре in vitro мышечная клетка изолирована от нервных и эндокринных влияний, что позволяет изучать регуляторное действие инсулина и инсулиноподобных пептидов в отсутствии влияния других факторов. Во-вторых, в условиях развития культуры имеется возможность контролировать процесс миогенеза и регистрировать его стадии по морфологическим признакам, сопоставляя их с биохимическими показателями. В-третьих, мышечные клетки в культуре миобластов воспроизводят последовательность развития митогенных и метаболических эффектов инсулина в мышечной ткани, развивающейся in vivo.

Для проведения биохимических исследований клетки культуры гомогенизировали в 40 мМ трис-HCl, pH 7,5 выделяли супернатант и грубую мембранную фракцию (Р2), которые использовали, соответственно, для определения активности креатинкиназы и АЦ.

Культура фибробластоподобных клеток линии Swiss ЗТЗКультура клеток была выбрана в качестве модели для выявления митогенного эффекта инсулиноподобных пептидов, поскольку ранее использовалась для решения подобных задач (Баркан, Никольский, 1985; Баркан и др., 1992).

Выбор был обусловлен следующими обстоятельствами, о которых можно судить по характеристике рецепторов ростовых факторов (в частности эпидермального фактора роста - ЭФР). В культуре присутствуют: 1). H1R14 (HnR14) - нормальный рецептор ЭФР (EGFR), человеческий, встроенный в NIH3T3; 2) CDG3 - цитоплазматический домен без 63 аминокислотных остатков; без Туг 1173 и Туг 1148; 3). CD126 - цитоплазматический домен без 126 аминокислотных остатков; без Туг в положениях 1173,1148,1086, 1068.

Получение культуры Swiss ЗТЗ клетокВ работе использована линия минимально трансформированных клеток Swiss3T3, полученных из Российской коллекции клеточных культур (Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург), адаптированных к росту в среде «Игла», содержащей 10% сыворотку крупного рогатого скота. Клетки рассевали в 12- или 24-луночные пластиковые платы, либо воплоские пластиковые флаконы или чашки Петри в концентрации 15x10 клеток на 1 см2. Через сутки после посева клетки переводили в среду,содержащую 0.5% сыворотки и выращивали в инкубаторе в течение 3-х суток до полного прекращения пролиферации (Баркан и др., 1992).

Митогенную активность оценивали по интенсивности синтеза ДНК в клетках, измеряя включение 14С-тимидина в ДНК в препаратах клеточных культур.

Для изучения влияния инсулина, ИФР-1, ЭФР, цАМФ на активность АЦ эти соединения добавляли в среду, содержащую культуру клеток и проводили инкубацию клеток культуры с препаратами в течение короткого промежутка времени (2.5-5.0 мин) при комнатной температуре. Активность АЦ определяли в грубой мембранной фракции (Р2), выделенной из культуры клеток.

Во всех сериях независимых опытов эксперименты были повторены трижды с 3-мя или 4-мя параллелями.

Использовали: инсулин (1000 нг/мл), ИФР-1 (50 нг/мл), ЭФР (10 нг/мл), цАМФ (10"12-10"9 М). (Плеснёва и др., 1999).

Культура клеток, трансформированная из нормальных фибробластов.

Для изучения возможности участия АЦ сигнального механизма в реализации антиапоптотического действия пептидов инсулинового ряда использована культура трансформированных клеток Е1А+сНа-газ, полученных из нормальных эмбриональных фибробластов крысы, а затем модифицированная введением пары комплементирующих онкогенов, обладающих высокой проапоптотической чувствительностью к удалению ростовых факторов и действию ДНК-повреждающих агентов (Никольский идр, 1987).

Для сравнения была взята клеточная линия, полученная также методом переноса онкогенов в нормальные фибробласты, где вместо онкогена сНа-гаБ был введен вирусный ген Е1А+Е1В (19 кДа) - аналог антиапоптотического гена Вс1-2 человека. Полученный трансформант Е1А+Е1В 19 кДа является высоко устойчивым как к действию ДНК повреждающих агентов, так и к удалению ростовых факторов из среды культивирования. В экспериментах по изучению антиапоптотического действия пептидов инсулинового суперсемейства и цАМФ апоптоз вызывали культивированием клеток линии Е1А+сНа-гаБ на среде, лишенной ростовых факторов в течение 24 часов. Для изучения антиапоптотического действия факторов, в среду культивирования несодержащую сыворотку добавляли инсулин (10"7 М), ИФР-1 (10"8 М) или дибутириловый аналог цАМФ (10"9 М). Через 24 часа культивирования клетки снимали и клонировали на среде, содержащей 10% сыворотку в количестве 100-200 клеток на чашку Петри (30мм). На каждую точку анализировали не менее трех чашек. Эксперимент повторяли 4 раза.

Получение культуры клеток, трансформированных из нормальных фибробластов-Культуры клеток с известными параметрами были взяты из банка культур Института Цитологии, РАН. (Санкт-Петербург) и обрабатывалась согласно условиям экспериментов.

Активность АЦ определяли в грубой мембранной фракции (Р2), выделенной из культуры клеток.

Выделение мембранных фракцийЭксперименты проводились на мембранных фракциях, полученных из мышечной ткани животных, которые служили объектом исследования. Считается принятым называть мембранную фракцию, полученную из мышечной ткани - сарколеммальной фракцией или фракцией сарколеммы. Этот термин также будет использоваться в данной работе.

Эксперименты на культуре клеток были проведены на частично обогащенном препарате мембран клеток культуры, в дальнейшем обозначаемым как Р2 фракция.

Получение мембранной фракции из тканей позвоночных и беспозвоночныхСарколеммальную фракцию получали по, модифицированному нами, методу Кидвея и соавторов (Kidwei et al., 1973) из гладких мышц ноги пресноводного моллюска Anodonta cygnea, скелетных мышц задних лап крысы Rattus norvegicus, скелетных мышц ног куриных эмбрионов и кур (т. gastrocnemius). Для получения фракции в каждом эксперименте были использованы мышцы 25-30 моллюсков, 4-6 крыс, 10-15 цыплят, 30-40 куриных эмбрионов.

Метод основан на разделении субклеточных фракций в градиенте плотности сахарозы. Метод обеспечивает обогащение фракции по активности АЦ, являющейся маркерным ферментом плазматических мембран разного типа клеток и возможность получения фракции мембран в наиболее щадящих условиях. В полученном по этому методу препарате сохраняется чувствительность АЦ системы к гормонам.

Выделение сарколеммальной фракции из всех исследуемых объектов (крыса, куриные эмбрионы, моллюск Anodonta cygnea) проводили по следующей схеме.

Получение грубой мембранной фракции (Р2) из клеточных культурКлетки культуры с чашек Петри или флаконов, освобождали от среды инкубации, ополаскивали буферным раствором, соскабливали и гомогенизировали в 40 мМ Тпб-НО (рН 7.5). Гомогенат центрифугировали 10 мин при 1500 затем супернатантцентрифугировали в течение 20 мин при 20000 Осадок ресуспензированный в 50 мМ Тш-НСЛ (рН 7.5), представляющий собой грубую мембранную фракцию (обозначенную нами как Р2-фракция) использовали для определения активности АЦ, а супернатант для определения активности креатинкиназы в случае использования клеток миобластов куриных эмбрионов.

Действие инсулина на активность примембранной ФДЭ исследовали, добавляя его в инкубационную среду для определения активности ФДЭ, в концентрации, используемой при изучении АЦ активности.

При изучении эффекта инсулина и других гормонов, принадлежащих к его суперсемейтсву, а также серотонина или изопротеренола на АЦ, гормон добавляли in vitro непосредственно в пробы до конечных концентраций 10"7-10"12М (пептиды инсулинового суперсемейства) и 10"6М (изопротеренол, серотонин). Селективные ингибиторы тирозинкиназ - тирфостин 47 и генистеин - использовали в концентрациях 0,5-10 мкМ, время преинкубации их с мембранной фракцией составляло 15 мин (Salomon et al., 1974; White, 1974).

Метод определения активности цАМФ-ФДЭАктивность цАМФ-ФДЭ (КФ 3.1.4.17 - 3'5'-циклонуклеотид -фосфодиэстераза) определяли по методу Ткачука и Балденкова с некоторыми изменениями. Этот метод характеризуется высокой чувствительностью и надежностью, поскольку включает только одноступенчатую реакцию (Ткачук, Балденков, 1978; Thompson et al. 1979). Принцип метода заключается в гидролизе радиоактивногосубстрата [8-3Н]цАМФ до [3Н-5-АМФ] при участии цАМФ-ФДЭ. Разделение продукта реакции от пула других меченых нуклеотидов осуществляли с помощью восходящей тонкослойной хроматографии на пластинках со слоем селикогеля.

Метод определения активности креатинкиназыАктивность креатинкиназы (КФ 2.7.3.2) определяли калориметрическим методом (Петрова, Лызлова, 1985) в растворимой фракции клеток культуры миобластов куриных эмбрионов. Принцип метода: креатин, образовавшийся в ходе обратной креатинкиназной реакции (КФ + АДФ -> креатин + АТФ) дает в щелочной среде с анафтолом и диацетилом комплексное соединение розового цвета, по интенсивности окраски которого судят об активности креатинкиназы.

Определение активности протеинкиназы «А»Фракцию растворимых белков (супернатант) получали центрифугированием гомогената мышечной ткани (20 мМ трис-НС1=буфер, рН 7,4) с охлаждением при 1800 g в течение 20 мин.

Метод определения активности ПКА основан на цепи сопряженных ферментативных реакций и подтвержден радиоизотопными методами (Technicova-Dobrova, et al., 1991; Кузнецова, Плеснева, 2001).

Реакция 1, катализируемая ПКА, приводит к образованию фосфорилированного протамина и АДФ, эквимолярное количество которого и регистрируется в двух других сопряженных друг с другом реакциях (2 и 3) по образованному НАД.

При определении активности Г6ФДГ ткань гомогенизировали в растворе (1:1) 50 мМ Трис-HCl-буфере (рН 8.0), содержащем 1 мМ MgCl2 и 0.15 М КС1 и экстрагировали на холоду 20 мин. Инкубацию с агентами и пептидами и последующее центрифугирование проводили, как описано для ГС. Далее к супернатанту добавляли реакционную смесь: (конечные концентрации в кювете спектрофотометра, мМ): 50 Трис-HCl, 1 MgCl2, 0.2 Г6Ф, 0,2 6-фосфоглюканат и 0.1 НАДФ. Контрольные пробы не содержали субстратов и НАДФ. Активность Г6ФДГ выражали в мкмолях восстановленного НАДФ (НАДФН) на мг белка за 1 мин.

Содержание белка определялось методом Бредфорда (Bradford, 1976), используя бычий сывороточный у-глобулин в качестве стандарта.

Данные представлены в виде средней ± стандартная ошибка среднего (х ± 8Х). Для сравнения контрольных и экспериментальных данных применен метод парных сравнений Стьюдента. Достоверными считали различия при р < 0.05.

Метод иммуноблотингаПосле электрофореза белки, распределенные в геле, переносили на поливинилиденовые дифлюоридные мембраны (Millipore, США). Перед переносом белков мембраны подвергали обработке. 30 секунд их выдерживали в метаноле, затем промывали водой в течение 2-х минут и далее помещали на 2-5 минут в буферный раствор (переносящий буфер), содержащий (150 мл Н2О, 10 мл переносящего буфера No vex, 40 мл метанола, 200 мкл антиоксиданта (Invitrogen, Англия). ПААГ накладывали на мембрану и помещали между слоями фильтровальной бумаги в аппарат для иммуноблотинга. Предварительно фильтровальную бумагу насыщали переносящим буфером.

Метод поверхностного иммуноблотингаПроцедуру поверхностного иммуноблотинга проводили по методу(Р1екЬапоу,1996). По окончании электрофореза на гель плотно накладывали нитроцеллюлозную мембрану, предварительно смоченную водой, на 5-10 минут. Затем мембрану снимали с геля и окрашивали иммунохимически. При необходимости можно снять еще одну реплику с оборотной стороны геля, но с потерей чувствительности.

Мембранную реплику, снятую с электрофоретического геля методом поверхностного блотинга промывали 2 раза по 5 минут в физиологическом буферном растворе (ФБР), рН 7.2-7.5, затем инкубировали в молоке (3%) в течение 1 часа при комнатной температуре для исчерпания сорбирующей способности нитроцеллюлозной мембраны.

После этого мембрану помещали в раствор антител, разведённых в ФБР, и оставляли на ночь при комнатной температуре. Далее мембрану промывали в ФБР и обрабатывали конъюгатом белка А с пероксидазой хрена, разведённым ФБР 1:2, в течение 1 часа при комнатной температуре, промывали трижды по 10 минут ФБР, ополаскивали один раз дистиллированной водой и проявляли в растворе, содержащем 0,05% бензидина, 0,03% Н202, 0,002М лимонную кислоту и 0,004 М №2НР04 (рН 5). После проявления зон фильтр промывали тёплой водой (для остановки реакции проявления).

Условия действия гормонов, активаторов и ингибиторов Активаторы и ингибиторыДАТ, является природным активатором, а ФМА синтетическимактиватором изоформ ПКС, принадлежащим к классическим (сПКС) и новым (пПКС) изоформам ПКС. Эти соединения не оказывают никакого эффекта на атипичную, форбол-нечувствительную изоформу ПКС (аПКС), к которым принадлежит аПКС£. Активирующий эффект ДАГ и ФМА вероятно реализуется через общий механизм, ответственный за высоко селективное увеличение сродства ПКС к мембранам, содержащим фосфатидилсерин.

Кальфостин С представляет собой периленквинон, изолированный из С1ас1о8рогтт ЫаёоярогШёез. Он является потенциальным селективным ингибитором ПКС, демонстрирующим в 1 ООО-раз большую ингибирующую способность в отношении этого фермента, чем таковую способность выявленную для других протеинкиназ. Механизм ингибирования ПКС кальфостином С, как полагают, происходит при его фотоактивации, в результате чего образуется короткоживущее соединение, которое взаимодействует с цистеин-богатыми цинксодержащими структурами в регуляторном домене ПКС. Это приводит к необратимой инактивации ПКС.

Вортманнин (изолированный из Т. \vortmannii) является метаболитом грибков и действует как потенциальный селективный и необратимый ингибитор ФИ-З-К. Механизм его действия заключается в блокировании активности ФИ-З-К в результате прямого взамодействия с каталитической субъединицей фермента. Вортманнин также ингибирует другие киназы, такие как киназа легких цепей миозина и ФИ-4-К, но при концентрации в100 раз более высокой чем требуется для ингибирования ФИ-З-К. ГоромоныЭффекты инсулина и ИФР-1 в присутствии перечисленных выше активаторов и блокаторов были исследованы in vitro. При этом агенты добавлялись в пробы для определения активности АЦ. Инсулин растворяли в 0.01 N НС1 и доводили до нужной концентрации буферным раствором, используемым в экспериментах. Серотонин и изопротеренол растворяли в Tris-HCl (рН 7.5). ДАГ, ФМА, кальфостин С растворяли в ДМСО, а затем разбавляли 50 мМ Tris-HCl (рН 7.5) непосредственно перед использованием. Активаторы и блокаторы были преинкубированы с пробами в течение 10 мин (ДАГ, ФМА, кальфостин) и в течение 5 мин (вортманнин), после чего следовало добавление инсулина или других гормонов (серотонин, изопротеренол) в концентрациях вызывающих максимальный АЦ стимулирующий эффект. Продолжительность действия инсулина была ограничена 2.5 мин, т.е. временем достаточным для проявления его максимального эффекта на АЦ. В случае серотонина или изопротеренола продолжительность их действия была ограничена 10 мин. Пробы, обработанные таким же образом, не содержащие гормонов, активаторов и блокаторов, но содержащие среду, в которой эти агенты растворялись служили как контроль.

Бактериальные токсиныKT (коклюшный токсин), представляет собой экзотоксин, изолированный из культуры Bordetella pertussis, и используется в качестве бесценного инструмента для характеристики Gi/o-белков, связанных с различными сигнальными системами. KT катализирует АДФ-рибозилирование G¡a (цистеиновые остатки), что приводит к инактивации Gi/o-белков и блокированию ингибирующего действия гормонов на АЦ, т.е. в результате к снижению активности этого фермента.

ХТ (холерный токсин), т.е. его А субъединица изолирована из Vibrio cholerae. ХТ индуцирует АДФ-рибозилирование остатков аргинина Gsa-белке. Такого рода модификация инактивирует ГТФ-азную активность и удерживает Gsa-белок в перманентно активном состоянии. В результате преобработки мембранной фракции с ХТ каталитическая активность АЦ увеличивалась, а регуляторный эффект гормонов, действующих на АЦ через Gs-белки, снижался.

Метод определения белкаСодержание белка в пробах определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951). В качестве стандарта использовали раствор сывороточного альбумина быка (1мг/1мл). Сущность метода заключается в том, что при взаимодействии белка с солями меди в щелочной среде образуютсясоединения, восстанавливающие реактив Фолина. Интенсивно развивающаяся окраска пропорциональна содержанию белка в пробе.

Статистическая обработка результатовДанные в таблицах и рисунках представлены как mean±SEM в виде среднеарифметического значения и ошибки среднего. В случае построения кривых каждая точка являлась результатом, как минимум, трех измерений, повторенных в трех, четырех экспериментах. Различия между контрольными пробами и пробами, подвергнутыми воздействию гормонов без или в присутствии активаторов и ингибиторов были обработаны статистически с использованием анализа данных по компьютерной программе (ANOVA). Достоверность различий средних значений оценивали по ¿-критерию Стъюдента. На всех рисунках и таблицах различия между контрольными пробами и пробами, содержащими гормоны или другие агенты (стимуляторы, ингибиторы) являются достоверными при р<0.05.

Использованные реактивы и радиоактивные препаратыВсе использованные в работе препараты получены из фирмы Sigma (St.Louis, МО, USA).

Креатинфосфат, фосфокреатинкиназа, ГТФ, ГИДФ, Tris-HCl, нейтральная окись алюминия по Брокманну для колоночной хроматографии, АТР, цАМР, НАД, НАДФ, тимидин, дитиотрейтол, ЭДТА,92имидазол, ДАГ, ФМА, вортманнин, коклюшный токсин (KT), холерный токсин (XT) получены из фирмы Sigma (St.Louis, МО, USA).

В работе использовался инсулин млекопитающих (24 IU), полученный из фирмы Lilly Co. (Indianapolis, IN, USA) или из фирмы Sigma (St.Louis, МО, USA); ИФР-I человеческий, рекомбинантный, полученный из фирмы Amersham (Backinghamshire, England) или из фирмы Sigma (St.Louis, МО, USA).

Радиоактивные препараты - [8-3Н]цАМФ, [а-32Р]АТР получены из фирмы "Изотоп" (Санкт-Петербург, Россия) или из фирмы "Amersham" (Англия).

В работе использовались антитела к Протеинкиназе «С» zeta (зета) из кролика, полученные на С-концевой вариабельный (V5) фрагмент (557592 аминокислоты) из фирмы "Sigma" (St.Louis, МО, USA). Разведение для иммуноблоттинга, рекомендованные в литературе -1:20000. Мы использовали для проведения молекулярных исследований разведение препарата - 1:10000; и в опытах in vitro при исследовании активности АЦ в пробах - 1:1000.

Результаты исследования и их обсуждениеВ работе представлены экспериментальные доказательства активирующего действия инсулина, ИФР-1 и ИПП на АЦ, установлена структурно-функциональная организация АЦ сигнального механизма в клетке и его роль в регуляции пептидами инсулиновой природы клеточного роста и апоптоза.

Основные этапы работы состояли в исследовании:- действия пептидов инсулиновой природы на активность АЦ при разном времени и разной концентрации in vitro и in vivo;- участия примембранной цАМФ-ФДЭ в функционировании АЦ сигнального механизма действия инсулиноподобных пептидов;- звеньев АЦ сигнального механизма (от рецептора до эффекторных систем);- роли АЦ сигнального механизма, как в регуляции клеточных процессов, так и его функционального применения в условиях патологии;Влияние in vitro инсулина, ИФР-1 и ИПП на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных и в культурах клеток в разные временные сроки.

Проведено исследование in vitro динамики во времени АЦ активирующего эффекта инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска при концентрации пептидов 10"8М и для сравнения эпидермального ростовогофактора (ЭФР), пептида не инсулиновой природы, обладающего рецептором тирозинкиназного типа (Никольский и др., 1987; РгоезЬ е! а1., 1985). Показано, что в мембранной фракции скелетных мышц крыс наибольшее выраженное активирующее действие исследованных пептидов на АЦ проявляется через 2.5 мин. Активирующий АЦ эффект инсулина составляет +236%. Эффект менее выражен при действии ИФР-1 (+201%), ЭФР (+186%) и ИПП моллюска +124% (Рис. 1; Таблица 1).

Динамика во времени эффектов инсулина, ИПП и ЭФР на активность АЦ в мембранной фракции мышц крысыВремя действия пептида (мин)Рис. 1. Влияние in vitro инсулина, ИПП и ЭФР на активность АЦ в мембранной фракции скелетных мышц крысы через 2.5, 5 и 10 минут. Концентрация пептидов - 10"8МАктивация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05).

95Таблица 1. Динамика во времени действия in vitro ИФР 1 на активность АЦ в мембранной фракции скелетных мышц крысВоздействия Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) 2.5 мин 5 мин 10 минБез ИФР-1 71.2+4.8 (100%) 85.1+3.3 (100%) 101.2+9.2 (100%)+ ИФР-1 214.3+12.1 (301%) 136.2+5.2 (160%) 96.1+4.6 (95%)Примечание: В скобках - базальная активность АЦ (без воздействий), принятая за 100% и активность АЦ (в %) при действии ИФР-1.

В мембранной фракции культуры куриных миобластов показано (рис. 2), что стимулирующий АЦ эффект инсулина в условиях in vitro через 2.5 мин составляет +256%, по сравнению с базальной активностью, принятой за 100% и имеет сходство с данными, полученными на мембранной фракции скелетных мышц крыс (+236 %) (рис. 1).я1 Динамика во времени эффекта инсулина на§ 100"] активность АЦ в культуре клеток куриных миобластов2.5 мин 5 мин 10 минВремя действия пептида (мин)Рис. 2. Влияние in vitro инсулина на активность АЦ в культуре клеток куриных миобластов через 2.5, 5 и 10 минут. Концентрация инсулина - 10"8М Различия достоверны (р<0.05)В тканях моллюска A.cygnea, ИПП, выделенный из висцеральных органов этого моллюска, оказывает наиболее выраженное активирующее действие на АЦ (+422%), по сравнению с ЭФР (+221%), ИФР-1 (+169%) и инсулином (+133%) (Рис 3; Таблица 2). Следует отметить, что активирующий АЦ эффект исследуемых пептидов в наибольшей степени проявляется через 2,5 мин, через 5 мин снижается, а через 10 минут практически отсутствует (Таблица 2; Рис 3).

Таблица 2. Динамика во времени действия in vitro ИФР 1 на активность АЦ в мембранной фракции гладких мышц моллюскаВоздействия Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) 2.5 мин 5 мин 10 минБез ИФР-1 110.2±10.8 (100 %) 125.3±9.3 (100%) 106.0±6.6 (100%)+ ИФР-1 259.9±11.4 (269%) 229.3±5.2 (183%) 103.8±5.8 (98%)Примечание - В скобках - базальная активность АЦ (без воздействий), принятая за 100% и активность АЦ (в %) при действии ИФР-1.

Таким образом, в мембранных фракциях, выделенных из мышечных тканей исследуемых животных и культуры клеток куриных миобластов, наблюдается закономерность проявления эффекта пептидов в зависимости от времени действия. Инсулин, ИФР-1, ИПП и ЭФР оказывают активирующее действие на АЦ в течение 2,5 и 5 мин с максимальным эффектом через 2.5 мин. АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов видоспецифичен. В скелетных мышцах крыс ряд эффективности пептидов по их влиянию на АЦ имеет следующий98порядок: инсулин > ИФР-1 > ЭФР > ИПП, а в мышечных тканях моллюска - ИПП > ЭФР > ИФР-1 > инсулин.

2 с о юs 2600500| 400s §2te300=г 200 <лЙ о х шSЁ <100Динамика во времени эффектов инсулина, ИПП и ЭФР на активность АЦ в мембранной фракции мышц моллюскаЦ-инсулин+инсулин FZ^-ИПП +ИПП -ЭФР +ЭФР2.5 мин 5 мин 10 минВремя действия пептида (мин)Рис. 3. Влияние in vitro инсулина, ИПП и ЭФР на активность АЦ в мембранной фракции гладких мышц моллюска через 2.5, 5 и 10 минут.

Концентрация пептидов - 10"8МАктивация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05).

99Влияние in vivo разных доз инсулина на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных в разные временные сроки.

Обнаружив в опытах in vitro стимулирующее влияние пептидов инсулинового суперсемейства на активность АЦ, мы исследовали влияние инсулина, основного представителя инсулинового суперсемейства, на активность АЦ в разных дозах и при разном времени действия в условиях in vivo.

Эксперименты проведены на фракциях мышечных мембран крыс, куриных эмбрионов и моллюсков после введения инсулина (внутрибрюшинно или внутрижелточно) в дозах 0.05 нг/г-10нг/г веса тела (вес крысы или куриного эмбриона, вес моллюска без раковины). Доза, вводимого in vivo инсулина рассчитывалась с учетом концентрации инсулина, используемой в опытах in vitro. Основанием для выбора дозы служили данные литературы и результаты наших опытов in vitro. Было показано, что в скелетных мышцах крыс стимулирующий АЦ эффект инсулина (+222%) выявляется через 5 мин после введения гормона (1 нг/г), а через 15 мин он снижается почти в три раза (67%) (Рис. 4). При более высокой дозе инсулина (10 нг/г), стимулирующий АЦ эффект гормона через 5 мин выражен слабее (+124%), а через 15 мин отсутствовал.

Динамика активности АЦ во времени в мембранной фракции крыс при введении разных доз инсулина in vivo' i -инсулинГ^я ^инсулин 0.05нг(г (10"*М) Г777Л «инсулин 0.1НГ/г (2x10*М) втаа +инсулин 1.0нг/г (2х10*М) -»инсулин Юнг/r <2х10'7М)S мин 15 минВремя действия гормонаРис. 4. Влияние in vivo разных доз инсулина на активность АЦ в мембранной фракции скелетных мышц крыс в разные временные промежутки. Активация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью АЦ, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05)В экспериментах ш vivo в мембранных фракциях мышц куриных эмбрионов разного возраста обнаружен АЦ активирующий эффект инсулина. У 10-дневных куриных эмбрионов он выявлялся уже через 5 мин, более четко выражен через 15 мин, а через 30 мин не проявлялся (рис. 5).

Динамика активности АЦ во времени в мембранной фракцииРис. 6. Влияние in vivo разных доз инсулина на активность АЦ в мембранной фракции скелетных мышц 17-дневных куриных эмбрионов в разные временные промежутки. Активация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью АЦ, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05)При введении моллюскам инсулина (0.5нг/г и 5.0 нг/г) активность АЦ возрастала через 5 мин после введения гормона на +49% и +381%, соответственно, по сравнению с контролем, принятым за 100%. Через 20 мин влияние гормона (0.5 нг/г) на активность АЦ снижается (+22%) и практически исчезает (+6%) через 40 мин (Рис. 7). При введении инсулина (5 нг/г) моллюскам АЦ стимулирующий эффект гормона через 20 мин составлял +110%, а через 40 мин +50% (рис. 7).

Динамика во времени активности АЦ в мембранной фракции гладких мышц моллюска при действии инсулина in vivo5 мин 20 мин 40минВремя действия гормонаРис. 7. Влияние irt vivo разных доз инсулина на активность АЦ в мембранной фракции гладких мышц моллюска в разные временные промежутки. Активация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью АЦ, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05)Из полученных нами данных следует, что отчетливое влияние инсулина на активность АЦ в мышечных мембранах моллюска (Рис. 7) выявляется при более высокой дозе инсулина, чем у млекопитающих и птиц. Это можно объяснить тем, что у моллюска A.cygnea рецепторы к инсулину не обнаружены (Лейбуш, Чистякова, 2003), а эффект инсулина может реализовываться через ИФР-1-подобные рецепторы или рецепторыИПП моллюска, которые способны опосредовать активирующее влияние инсулина на АЦ (Шпаков и др., 2005 а,б).

Следует отметить, что проявление АЦ стимулирующего влияния инсулина и инсулиноподобных пептидов во времени имеет сходство в опытах in vitro и in vivo. АЦ активирующий эффект пептидов отчетливо выявляется при коротких сроках влияния пептида (2,5 и 5 мин) приО Яфизиологических концентрациях с увеличением временидействия эффект пептидов ослабевает или отсутствует. АЦ активирующий эффект инсулина, ИФР-1 и ИПП при разных концентрациях в условиях in vitro.

Установив оптимальное время действия пептидов инсулиновогосуперсемейства, при котором происходит активация АЦС (2.5 мин),необходимо было выявить при каких концентрациях АЦ стимулирующийэффект пептидов наиболее выражен. В разных тканях стимулирующийэффект пептидов инсулиновой природы осуществляется черезспецифичные рецепторы, отличающиеся по сродству к пептиду вгомологичных и негомологичных пептиду тканях.

Проведено исследование влияния инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска12 6и ЭФР в течение 2.5 мин при разных концентрациях (10' -10'М) в мембранных фракциях крыс, кур, моллюсков, а также во фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов.

В мембранной фракции скелетных мышц крыс стимулирующий АЦ эффект инсулина, ИФР 1, ИПП обнаруживается при концентрациях 10"П-10"7М (Рис. 8). Наиболее выраженный АЦ стимулирующий эффект составляет: для инсулина +250% при 10"8М; для ИФР 1 +91% при 10"9М:для ИПП +111% при 10"8М; для ЭФР +190% при 10-иМ. (Рис. 8).

Ют.л Цго п (б юлIо о х ш5Ёя <400 -,350 300250 200 150 100 Влияние инсулина, ИФР-1, ИПП и ЭФР на активность АЦ в мембранной фракции скелетных мышц крысы при разных концентрациях пептидов—I— -12-11I-10-8"-0-I-7—-И-- инсулин—•— ЭФР.А. ИПП— о— ИФР1-1од [пептид] МРис. 8. Активность АЦ в присутствии разных концентраций пептидов в мембранной фракции скелетных мышц крыс. Базальная активность АЦ принята за 100 %. Время действия пептидов 2.5 минМожно отметить, что в диапазоне концентраций 10"Ш-10"7М наиболее четко выражен активирующий АЦ эффект инсулина, эффекты других исследованных пептидов инсулиновой природы проявлялись слабее. АЦ стимулирующий эффект ЭФР проявлялся при более низких концентрациях (Ю^-Ю'^М).

Таблица 3. Влияние in vitro разных концентраций инсулина на активность АЦ во фракциях мышечных мембран куриных эмбрионов разного возраста и цыплят.

Объекты (возраст) 10-сут Эмбрионы 13-сут Эмбрионы 17-суг Эмбрионы 3-сут ЦыплятаВоздействия Активность АЦ (пмоль цАМФ/мин/мг белка) Без Инсулина 14.02±1.10 (100 %) 3.90±0.45 (100 %) 2.01+0.09 (100 %) 8.52±0.41 (100%)+инсулин 10"ПМ 16.34±1.35 (117%) 4.2110.34 (108 %) 4.81+0.46 (239 %) ЮЛ 1±0.55 (119%)+ инсулин Ю"10М 39.14±1.93 (279 %) 10.33±0.89 (265 %) 5.28±0.30 (263 %) 11.24+0.48 (132 %)+ инсулин 10'9М 48.25±2.21 (344 %) 15.92±1.24 (408 % ) 10.24±0.62 (509 %) 14.54+0.82 (171 %)+ инсулин 10"8М 19.87±1.44 (142 %) 9.84±0.56 (252 %) 9.92+0.47 (494 %) 19.55±1.13 (238 %)+ инсулин 10"7М 17.13±0.98 (122 %) 4.93+0.45 (126 %) 7.51±0.33 (374 %) 22.21±1.37 (261 %)+ инсулин 106М 17.90+1.12 (128 %) 5.12+0.21 (131 %) 1.95+0.22 (97 %) 24.39±1.62 (286 %)В скобках - активность АЦ (в %) в присутствии инсулина, по отношению к базальной активности, принятой за 100 %.

Изучение АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства и ЭФР в онтогенезе позволило выявить следующие факты. Наиболее выраженный АЦ активирующий эффект инсулина (10" ПМ-106М) обнаруживается у куриных эмбрионов (10, 13, 17 суток) и цыплят (3 суток) при концентрации гормона 10"9М, и составляет у 10-суточных эмбрионов +244%, у 13-суточных +308%, у 17-суточных +409% (Таблица 3), а у 3-х суточных цыплят (+186%) при более высокой концентрации что может быть связано с переходом эмбрионов впостэмбриональный период. По-видимому, у 3-х суточных цыплят, меняется картина гормонального контроля, и весь организм настраивается на существование в постэмбриональном периоде, используя компенсаторные механизмы реализации физиологических функций.

Нами также были проведены исследования действия инсулина и ИФР-1 на АЦ в мембранной фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов (Рис. 9). В этих исследованиях действия инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов (4-й день развития) мы показали, что наибольший АЦ стимулирующий эффект инсулина (+352%) выявляется при концентрацииа ИФР-1 (+289%) приконцентрации Ю"10М.

Завистимость активности АЦ от концентрации 160 -| инсулина и ИФР1 в культуре клеток куриных миобластов140 120 100 80 •=• 60 40 20 —I— 12-1-1-1-■-1—11 10 9-log [пептид] МРис. 9. Активность АЦ в присутствии разных концентраций инсулина и ИФР 1 в мембранной фракции куриных миобластов. Базальная активность АЦ принята за 100 %. Время действия пептидов 2.5 минВ мембранной фракции мышц моллюска АЦ стимулирующий эффект инсулина, ИФР-1, ИПП и ЭФР выявляется при концентрациях -10"П-10"8М (Рис. 10). Инсулин и ИФР-1 оказывают наиболее выраженное стимулирующее действие на активность АЦ при концентрации 10"8М (+63% и +54%, соответственно), а ИПП и ЭФР при 10"9М (+415% и +223%, соответственно).

Влияние инсулина, ИФР-1, ИПП и ЭФР на активность АЦ воо-1 в мембранной фракции гладких мышц моллюска при разных концентрациях пептида>5 500 -о« 400 --■■--■ инсулинТ 300 о—•—ЭФР А ИПП —о—ИФР1оI 200 и=Т <100 о-О■а-о-11-ю-98-71од [пептид] МРис. 10. Активность АЦ в присутствии разных концентраций пептидов в мембранной фракции гладких мышц моллюска. Базальная активность АЦ принята за 100 %. Время действия пептидов 2.5 минТаким образом, определен диапазон концентраций, при которых проявляется АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов. Следует отметить видоспецифичность действия пептидов. Действие ИПП, выделенного из висцеральных ганглиев моллюска А.су%пеа, является более эффективным в ткани моллюска и менее эффективным в тканях позвоночных.

Участие ц-АМФ-зависимой ФДЭ в механизме действия пептидов инсулинового суперсемействаУровень цАМФ в клетке зависит не только от АЦ - фермента, осуществляющего его синтез, но и от фосфодиэстеразы (ФДЭ) фермента, обеспечивающего его деградацию. Исследована динамика во времени активности примембранной формы цАМФ-ФДЭ во фракции скелетных мышц кур. Эта изоформа ФДЭ локализована на внутренней стороне мембраны и способна активироваться инсулином (Нош1ау, 1985). Нами показано, что активность примембранной цАМФ-ФДЭ не изменяется через 2.5 и 5.0 мин после действия инсулина, увеличивается на +115% через 10 мин и на +179% через 20 мин, по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100% (Таблица 4).лТаблица 4. Влияние инсулина на активность примембраннойцАМФ-ФДЭ в скелетных мышц кур в зависимости от времениВоздействия Активность цАМФ-ФДЭ (нмоль АМФ/мин/мг белка) 2.5 мин 5.0 мин 10.0 мин 20.0 минБез инсулина 3.37+0.5 (100%) 3.70+0.33 (100%) 3.56+0.61 (100%) 3.21+0.28 (100%)+ инсулин 3.06+0.21 (91%) 4.07+0.18 (110%) 7.65+0.23 (215%) 8.95+0.44 (279%)Примечание: в скобках представлена активность цАМФ-ФДЭ (в %) в присутствии инсулина и базальная активность фермента, принятая за 100%Ранее было показано, что в пределах концентраций белка в пробе от 10 до 30 мкг базальная активность ФДЭ линейна в течение 20 минут. (Плеснёва, 1983).

При исследовании действия разных концентраций инсулина (10"9М-10"7М) обнаружено, что наиболее выраженное действие гормона (+115%) на активность цАМФ-ФДЭ выявляется через 10 мин при концентрации 10"8М (Табл.5).

Таблица 5. Влияние разных концентраций инсулина in vitro на активность ФДЭ в мембранной фракции скелетных мышц курКонцентрация Гормона Активность ФДЭ (пкмоль АМФ/мин/мг белка)Без гормона (контроль) 3.37±0.11 (100%)(10'9М) 2.43±0.05 (72%)(10"8М) 7.25±0.08 (215%)(10'7М) 5.79±0.03 (172%)Примечание: в скобках активность ФДЭ (в %) по отношению к базальной, принятой за 100 %.

Соотношение активности систем АЦ-цАМФ и цАМФ-ФДЭ в реализации действия инсулина на клетку является важным моментом впонимании внутриклеточных механизмов функционирования пептидов инсулиновой природы.

При активации АЦ гормонами скорость синтеза цАМФ начинает превышать скорость его деградации. Повышение уровня цАМФ приводит к активации мишени его действия - ПКА (Кузнецова, Плеснева, 2001). Сродство ПКА к цАМФ в 100-1000 раз больше, чем у ФДЭ. При усилении синтеза цАМФ происходит сначала насыщение цАМФ-регуляторных центров ПКА, и лишь затем гидролиз цАМФ с участием ФДЭ.

Исходя из представленных нами данных, активирующие эффекты инсулина на АЦ и цАМФ-ФДЭ четко разделены во времени. АЦ активирующий эффект инсулина проявляется через 2.5 и 5 мин и отсутствует через 10 мин. Между тем, цАМФ-ФДЭ активируется инсулином только через 10 минут инкубации с гормоном. Таким образом, активация цАМФ-ФДЭ наступает лишь тогда, когда цАМФ как вторичный посредник выполнит свою функцию, достигнет порогового уровня и осуществит свое активирующее действие на ПКА, а затем и на эффекторные системы (Ткачук, 1983; 2007), что согласуется с нашими данными о действии инсулина на активность АЦ и цАМФ-ФДЭ и данными литературы.

В связи с этим основное внимание будет уделено исследованию АЦС, участвующей в осуществлении регуляторного действия пептидов инсулинового суперсемейства на клеточные процессы.

113Использование анти-инсулиновой сыворотки для доказательства специфичности АЦ стимулирующего эффекта инсулина.

Для доказательства АЦ стимулирующего действие инсулина, а не других пептидных гормонов, не относящихся к гормонам инсулинового суперсемейства, была использована анти-инсулиновая сыворотка (АИС), выработанная в лаборатории на инсулин млекопитающих, которая нейтрализует действие инсулина и, как установлено нами подавляет стимулирующее действие инсулина на АЦ (Бондарева, Лейбсон, 1970). При добавлении нормальной сыворотки (без инсулина) к фракции скелетных мышц крыс и гладких мышц моллюска, активирующий АЦ эффект инсулина составляет +68% у крыс и +41% у моллюсков. При использовании АИС стимулирующий АЦ эффект инсулина отсутствует у крыс (+7%) и моллюсков (-5%) (Табл. 6).

Полученные данные свидетельствуют о том, что обнаруженное нами активирующее действие инсулина на АЦ в мышечных тканях исследуемых объектов осуществляется именно инсулином и является специфичным при действии этого гормона.

Таблица 6. Нейтрализация АЦ стимулирующего эффекта инсулина в мембранных фракциях скелетных мышц крыс и гладких мышц моллюска в присутствии анти-инсулиновой сыворотки.

Воздействия Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) Нормальная сыворотка Анти-инсулиновая сывороткаГладкие мышцы моллюска АпоёогЛа cygnea Без инсулина 111.18+6.13 (100%) 148.29+4.31 (100%)Инсулин 10"8М 156.76+8.54* (141%) 158.67+8.16 (107%)Скелетные мышцы крысы Без инсулина 97.34+4.58 (100%) 115.82+6.49 (100%)Инсулин 10"8М 163.49+6.17* (168%) 110.03+7.12 (95%)Примечание: приведены данные из трех независимых экспериментов, повторенных три раза. Значения представлены в виде среднего арифметического с учетом ошибки среднего. Различия достоверны (р< 0.05 (*). В скобках - активность АЦ в %. Базальная активность принята за 100%.

Следующая часть работы посвящена расшифровке структурно-функциональной организации механизма АЦ активирующего действия инсулина и ИФР-1.

В этой части работы мы поэтапно исследовали звенья, которые могут быть вовлечены в реализацию действия инсулиноподобных пептидов, начиная от рецептора и заканчивая эффекторными системами, которые являются конечным звеном реализации сигнала.

Участие рецептора тирозинкиназного типа в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства.

Для доказательства участия рецептора тирозинкиназного типа, характерного для пептидов инсулинового суперсемейства в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулиновой природы (Levitzki, 1992), использовали селективные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ - тирфостин 47 и генистеин, которые блокируют тирозинкиназную функцию рецептора инсулина и других пептидов инсулиновой природы. Ингибиторы инкубировали с пробами в течение 15 мин после чего в пробу добавляли пептиды (время действия 2.5 мин) при концентрации, вызывающей максимальный АЦ стимулирующий эффект. Влияние этих ингибиторов на активирующие АЦ эффекты инсулина, ИФР-1, ЭФР и для сравнения на эффект изопротеренола (в случае позвоночных) и серотонина (в случае беспозвоночных), которые также действуют активирующим образом на АЦ, но через рецептор серпантинного типа, изучали in vitro во фракции мембранных препаратов мышечной ткани крыс, культуры куриных миобластов, моллюсков.

У крыс в присутствии тирфостина 47 (1.25-5.0 мкМ) активирующий АЦ эффект пептидов снижался при действии инсулина до 50%, при ИФР-1 до 65 %, при ЭФР до 50 % по отношению к максимальному эффекту пептидов, принятому за 100% (Рис. 11).

120-,Влияние тирфостина 47 на стимулирующий аденилатциклазу эффект инсулина, ЭФР, И Ф Р 1 и изопротеренола в скелетных мышцах крысXшеX £ га а оЁ а»-8-«■о о X X оXфгп 510080 60 40 20 — ■ — инс.•. ЭФР.-Ж " ИФР1— ▼ — изо—Г10—г12—I— 1 4—Г"1 6—Г18—Г20[тирфостин 47] мкМРис. 11. Активность АЦ в мембранной фракции скелетных мышц крыс в присутствии разных концентраций ингибитора рецепторных тирозинкиназ - тирфостина 47 По оси ординат - снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола (принятого за 100 %) в присутствии тирфостина 47.

В присутствии генистеина (1.25-5.0 мкМ) снижение АЦ стимулирующих эффектов исследуемых пептидов у крыс было более выражено. Эффект инсулина снижался до 40%, эффект ИФР-1 до 10 %, эффект ЭФР - до 18 % (рис. 12). В тоже время у крыс стимулирующий эффект изопротеренола на АЦ (10"6М) практически не изменялся в присутствии тирфостина 47 и генистеина (0.5-20.0 мкМ).п <я х ю оIX£ ясоеоо о яXо г в> £ <ч 5160 140 120 100 80 60 40 20 0Влияние генистеина на стимулирующий аденилатциклазу эффект инсулина, ЭФР, ИФР1 и изопротеренола в скелетных мышцах крыст1 — ■ — и н с.— « — ЭФР.Ж. ИФР1—^ — изо■ ■—I—■—I—1—|—■—1—6 8 10 12 14[ген и стеи н] м кМ16—I— 18—I— 20Рис. 12. Активность АЦ в мембранной фракции скелетных мышц крыс в присутствии разных концентраций ингибитора рецепторных тирозинкиназ - генистеина. По оси ординат - снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола (принятого за 100 %) в присутствии генистеина.

В культуре клеток 4-х суточных куриных миобластов тирфостин 47 (Рис. 13) и генистеин ингибировали АЦ активирующий эффект инсулина до 43% и 38%, соответственно. Однако, активирующее действие изопротеренола на АЦ в присутствии ингибиторов тирозинкиназ (тирфостина 47 и генистеина) не изменялось (р < 0.05). Это свидетельствует о том, что классические рецепторы серпантинного типа не участвуют в механизме действия пептидов инсулиновой природы.

200-,Влияние тирфостина 47 на стимулирующий аденилатциклазу эффект инсулина и изопротеренола в культуре клеток миобластовЗ-<п■5■ — инс • — изоо246810[тирфостин 47] мкМРис. 13. Активность АЦ в культуре клеток куриных миобластов в присутствии разных концентраций тирфостина 47.

У моллюсков наиболее выраженное снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов наблюдалось в присутствии тирфостина 47 (2.5 мкМ). Эффект инсулина уменьшался до 20 %, эффект ЭФР до 30-35%. (Рис 14).

Влияние тирфостина 4 7 на стимулирующий аденилатциклазу эффект инсулина, ЭФР и серотонина в мышечной ткани моллюска[тирфостин 47] и кМРис. 14. Активность АЦ в мембранной фракции гладких мышц моллюска в присутствии разных концентраций ингибитора рецепторных тирозинкиназ - тирфостина 47 По оси ординат - снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов и серотонина (принятого за 100 %) в присутствии тирфостина 47.

В присутствии генистеина АЦ стимулирующий эффект пептидов снижался до 25 % в случае инсулина (1.25 мкМ генистеин), и до 50-75% в случае ЭФР (5 мкМ генистеин) (рис. 15).=т <а о ьX ®в ■8-6о о5 X О Xа 2120 100 80 60 40 20 0Влияние генистеина на стимулирующий аденилатциклазу эффект инсулина, ЭФР и серотонина в мышечной ткани моллюска— ■— И НС —•—ЭФРсер—г10—I— 1 21 41618—I— 2 0[генистеин] мкМРис. 15. Активность АЦ в мембранной фракции гладких мышц моллюска в присутствии разных концентраций ингибитора рецепторных тирозинкиназ - генистеина. По оси абсцисс - концентрация генистеина в мкМ; по оси ординат - снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов и серотонина (принятого за 100 %) в присутствии генистеина.

Необходимо подчеркнуть, что у моллюсков А.су^еа активность АЦ увеличивается не в присутствии изопротеренола, а вприсутствии серотонина, реализующего свое действие также через рецепторы серпантинного типа (РейБеуа & а1., 1992). Исследование действия ингибиторов тирозинкиназ - тирфостина 47 и генистеина (0.520.0 мкМ) на стимулирующий АЦ эффект серотонина в мембранной фракции мышечных тканей моллюсков не выявило изменений в действии этого биогенного амина на активность АЦ.

Таким образом, в мембранных фракциях крыс, моллюсков и культуры клеток куриных миобластов стимулирующее влияние исследуемых пептидов на АЦ снижалось в присутствии тирфостина 47 и генистеина в диапазоне концентраций - 1.25, 2.5, 5.0, 10, 20 мкМ во всех исследуемых объектах (Рис. 11-15).

Стимулирующее действие изопротеренола (крысы, куры) или серотонина (моллюски) на АЦ, реализуемое через рецепторы серпантинного типа не изменялись в присутствии тирфостина 47 или генистеина в исследуемых объектах (см. Рис. 11-15).

Можно заключить, что в мышечной ткани млекопитающих (крысы), птиц (куры), культуре клеток куриных миобластов и в мышцах моллюсков активирующее действие инсулина, ИФР-1, ЭФР на АЦ осуществляется с участием рецепторов тирозинкиназного типа, специфичных для действия этих пептидов. (Рейвеуа е1 а1., 1996; Плеснева и др., 1998; РеЛэеуа ег а!., 2003).

Участие в-белков в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулинаДля доказательства участия в-белков в действии инсулина на активность АЦ был применен широко распространенный подход, в котором используется набор гуаниновых нуклеотидов, способных в разной степени либо стимулировать ГТФ-азную активность в-белков в присутствии ГТФ и его аналогов - ГТФу8, ГИДФ и тем самым активировать АЦ, либо ингибировать ГТФ-азную активность в-белка в присутствии ГДФрБ.

Было исследовано влияние ГТФ и ряда его негидролизуемых аналогов на активность АЦ в присутствии и отсутствии гормона (Табл. 7).

Согласно представленным данным, ГТФуБ, ГИДФ, ГТФ стимулируют активность АЦ в мышечных мембранах крыс и моллюсков. При совместном действии инсулина и гуаниновых нуклеотидов происходит усиление (потенцирование) эффекта гормона по сравнению с аддитивным эффектом гормона и гуаниновых нуклеотидов, действующих раздельно - в присутствии ГТФуБ, ГИДФ и ГТФ на +109%, +41% и +20% у крыс и на +170%, 86% и 30% у моллюсков (табл. 7). ГДФ|38 же напротив снижает АЦ стимулирующий эффект инсулина как в мышцах крыс, так и моллюсков.

Таблица 7. Влияние гуаниновых нуклеотидов в отсутствии и присутствии инсулина на активность АЦ во фракции мышечных мембран крысы и моллюска.

Воздействия Активность АЦ (%) Крыса МоллюскКонтроль 100+1.01 % 100+1.3%Инсулин (10"8М) 222+1.3% (+122%) 186+1.8% (+86%)ГТФуБ (10"5М) 242+1.4% (+142%) 470+9.4% (+370%)ГИДФ(10'5М) 236+1.8% (+136%) 269+4.9% (+169%)ГТФ (10"5М) 135+1.05% (+35%) 163+5.1% (+63%)ГДФр8 (10"5М) 95+1.2% (-5%) 92+2.4% (-8%)Инсулин + ГТФуЗ 473+2.5% (+373%) [109%] 726+20.3% (+626%) [170%]Инсулин + ГИДФ 399+8.2% (+299%) [41%] 441+12.3% (+341%) [86%]Инсулин + ГТФ 277+10% (+177%) [20%] 279+8.4% (+179%) [30%]Инсулин + ГДФРБ 102+5.4% (+2%) [-17%] 105+4.3% (+5%) [-86%]Примечание: в круглых скобках - активирующий АЦ эффект используемых агентов в % по отношению к базальной активности, принятой за 100%. В квадратных скобках - потенцирование эффекта гормона в присутствии гуаниновых нуклеотидов в %.

Потенцирование эффекта инсулина в присутствии ГТФу8, ГИДФ, ГТФ и отсутствие потенцирующего эффекта в присутствии ГДФ08 свидетельствует о вовлеченности Ов-белков в АЦ сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства.

Для выяснения типов в белков (МШ^ап, 1988), вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 были использованы бактериальные токсины (коклюшный и холерный), которые модифицируют а-субъединицы О белков, либо нарушают их сопряжение с самим ферментом.

Обработка фракции мышечных мембран крысы и моллюска коклюшным токсином приводила к некоторому увеличению базальной активности АЦ и к блокированию стимулирующего АЦ эффекта ИФР-1 (10"9 М) (табл. 8).

Известно, что коклюшный токсин вызывает АДФ-рибозилирование а-субъединицы в! белка, что ведет к потере его функциональной активности (МП^ап, 1988; И^те, 1990). Это обычно проявляется в ослаблении или исчезновении ингибирующего действия Ф белка на АЦ и в прерывании трансдукции ингибирующего сигнала с участием 01 белка, сопряженного с рецептором. Однако в наших опытах с коклюшным токсином мы наблюдали неожиданное подавление АЦ-стимулирующего эффекта ИФР-1, которое может быть связано с нарушением диссоциации гетеротримерного Ф белка на од-субъединицу и (Зу димер в условияхдействия коклюшного токсина. Известно, что ßy димер может стимулировать активность фосфатидилинозитол-3 киназы. Следовательно блокада диссоциации гетеротримерного (aißy) комплекса коклюшным токсином может предотвращать ИФР-1/инсулин-индуцируемую стимуляцию активности ФИ-З-К, реализуемую через ßy-зависимый механизм, и как следствие активацию АЦ. Как это мы наблюдали и в случае действия инсулина.

Таблица 8. Влияние коклюшного токсина на базальную, инсулин- и ИФР1-стимулируемую активность АЦ в скелетных мышцах крысы и моллюска A.cygnea.

Воздействия Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) Скелетные мышцы крысы Гладкие мышцы моллюска Без KT +КТ Без KT +КТБез пептидов 39.7±3.4 (100%) 48.5±2.0 (100%) 63.2±4.1 (100%) 69.1 ±9,6 (100%)Инсулин 10"9М 67.9±3.6 (171%) 48.2±2.7 (99%) 200.5±14.4 (317%) 74.2±7.6 (108%)ИФР-1 ю-9м 57.4*2.1 (145%) 43.Ш.6 (89%) 139.2±12.4 (220%) 76.8±7.3 (111%)Примечание: В скобках - активность АЦ в %. Активность АЦ без пептидовпринята за 100%.

Таким образом, коклюшный токсин, предотвращая индуцируемую инсулином или ИФР-1 стимуляцию активности ФИ-З-К, реализуемую через Ру-зависимый механизм, тормозит активацию АЦ.

Обработка фракции мышечных мембран крысы и моллюска холерным токсином приводит к 2х-кратному увеличению базальной активности АЦ в скелетных мышцах крысы и в мышцах моллюска (Табл. 9).

Таблица 9. Влияние холерного токсина на базальную, инсулин- и ИФР1-стимулируемую активность АЦ в скелетных мышцах крысы и моллюска А.су^пеа.

Воздействия Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) Скелетные мышцы крысы Гладкие мышцы моллюска Без ХТ +ХТ БезХТ +ХТБез пептидов 39.6±2.6 (100%) 79.7±2.7 (100%) 47.4±3.0 (100%) 94.3±5.6 (100%)Инсулин 10"9М 69.3±2.8 (175%) 105.8±7.4 (133%) 151.7±9.8 (320%) 134.0±7.5 (142%)ИФР-1 10"9М 56.7±4.2 (143%) 106.2±6.5 (133%) 100.0±5.4 (210%) 122.6±8.8 (130%)Примечание: В скобках - активность АЦ в %. Активность АЦ без пептидовпринята за 100%.

Известно, что модификация холерным токсином обычно ведет к потере ГТФ-азной активности as-субъединицы и тем самым переводит её в перманентно активированное состояние. В связи с этим обработка мембран холерным токсином влечет за собой стимулирование каталитической активности АЦ и наряду с этим ослабление регуляторных эффектов гормонов, чье действие на АЦ осуществляется через Gs белок (Milligan, 1988; Reisine, 1990; Moxham, Malbon, 1996; Morris, Malbon, 1999; Greasley et al., 2001). Наши данные о значительно меньшей выраженности стимулирующего эффекта ИФР-1 на активность АЦ в мышечных мембранах, подвергшихся действию холерного токсина, полностью согласуются с этими сведениями и указывают на вовлеченность Gs белка в активацию АЦ с участием инсулина и ИФР-1.

Таким образом, совокупность данных, полученных с использованием коклюшного и холерного токсинов как индикаторов вовлеченности гетеротримерных G белков в изучаемый процесс, указывает на участие Gi и Gs белков в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1. Участие фосфатидилинозитол-3 киназы в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1.

Для выяснения участия ФИ-З-К в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства (инсулина и ИФР-1) был использован специфический ингибитор этого фермента -вортманнин (Yano et al., 1993; Wilson et al., 1996). Инкубация мышечныхмембран крысы и моллюска с вортманнином (10"9-10"7М) несколько снижает базальную активность АЦ (таблица 10 и 11).д пТаблица 10. Влияние вортманнина (10 М—10 М) на стимуляцию ИФР-1о о(10 М) и инсулином (10 М) активности АЦ в мембранной фракции скелетных мышц крысАктивность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) Объекты Крысы Воздействия Без пептида ИФР-1 ИнсулинБез 21.0±1.6 38.2±1.0* 41.4±2.3*ворманнина 100% 100% 100%-Нвортманнин 17.9±2.0 9.4±1.3 9.7±1.410"9М 95% 25% 23%+вортманнин 16.5±2.3 8.6±1.3 8АЫ.З108М 79% 23% 20%+вортманнин 13.2±1.9 6.3±0.9 6.8±0.810"7М 63% 16% 16%Примечание: значения активности АЦ в присутствии пептидов, достоверно отличающиеся от активности фермента в отсутствии пептидов (р<0.05), отмечены звездочкой.

В отсутствии ингибитора инсулин и ИФР-1 отчетливо стимулируют активность АЦ. Между тем, АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижается в зависимости от концентрации ингибитора (10"9-10"М). Ингибирующее действие вортманнина было наиболее выражено при концентрации 10" М (таблица 10 и 11). Установленные факты свидетельствуют об участии ФИ-З-К в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1 в мышечных тканях изучаемых объектов.

Результаты, представленные в таблицах 10 и 11, позволяют констатировать следующие факты. Сам вортманнин снижает активность АЦ как у крыс, так и у моллюсков. В проявлении действия вортманнина на стимулирующее АЦ действие пептидов инсулиновой природы наблюдается принципиально сходная картина, однако, имеются некоторые особенности у представителей позвоночных и беспозвоночных. Как у крыс, так и у моллюсков, стимулирующий АЦ эффект пептидов инсулинового суперсемейства достаточно сильно снижается в присутствии вортманнина (см. таблицу 10 и 11). У крыс снижение стимулирующего АЦ эффекта инсулина и ИФР-1 выявляется уже при концентрации вортманнина 109М (таблица 10). У моллюсков снижение АЦ стимулирующего эффекта ИФР-1 выявляется также при концентрации вортманнина 109М и не зависит от увеличения концентрации вортманнина (таблица 11), а снижение АЦ стимулирующего действия инсулина наименее выражено при более низких концентрациях вортманнина (109М) и становится более заметным при более высокой концентрации ингибитора - 10-7М. Этот факт видимо связан с тем, что у моллюсков рецепторы инсулина не выявлены (возможно они и есть, но имеющиеся методы не позволяют их идентифицировать) и стимулирующий АЦ эффект инсулина осуществляется через рецепторы ИФР-1, которые четко выявлены у моллюска, либо через рецепторы ИПП.

Для проверки гормоноспецифичности ингибирующего действия вортманнииа на АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 были использованы изопротеренол и серотонин, гормоны неродственные пептидам инсулиновой природы и реализующие действие через рецептор серпантинного типа, не связанный с ФИ-З-К сигнальной системой.

Таблица 12. Влияние изопротеренола на активность ATI, в мембранной фракции скелетных мышц крыс в присутствии вортманнинаАктивность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) Воздействия Без вортманнина +вортманнин (10"7М)Без изопротеренола 21.1±1.2 (100%) 13.5±0.9 (64%)+изопротеренол( 10"6М) 38.4±1.9 (181%) 14.5±0.6 (69%)Примечание: в скобках представлена активность АЦ (в%), по отношению к базальной, принятой за 100%.

Таблица 13. Влияние серотонина на активность АЦ в мембранной фракции гладких мышц моллюска АпойоЫа су%пеа в присутствии вортманнинаАктивность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) Воздействия Без вортманнина -Нвортманнин (10"7М)Без серотонина 10.9±0.7 (100%) 11,2±0.6 (104%)+изопротеренол( 10'6М) 23.&Ы.1 (211%) 29.3±1.0 (259%)Примечание: как в таблице 12Результаты этих опытов (таблицы 12 и 13) показали отсутствие влияния вортманнина на катехоламинчувствительную АЦ сигнальную систему. Этот факт указывает на участие ФИ-З-К в, обнаруженном нами, АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1.

Участие протеинкиназы С в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемействаДля доказательства участия ПКС в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали селективный блокатор разных форм ПКС - кальфостин (Nixon, 1997; Young et al., 2005). В отсутствии кальфостина АЦ активирующий эффект инсулина и ИФР-1 составлял +101% и +73% у крыс, и +78% и +86% у моллюсков соответственно, по отношению к базальной АЦ, принятой за 100%. Как обнаружено нами, кальфостин (Ю"10-10"8М) блокировал АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 в мембранных фракциях мышц крысы и моллюска. Наиболее выраженный ингибирующий эффект кальфостина обнаруживается при концентрации 10"8М. В присутствииокальфостина (10' М) АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижался на 46% и 32% у крыс, и на 47% и 50% у моллюсков, соответственно, по отношению к максимальному АЦ стимулирующему эффекту пептидов, принятому за 100% (таблица 14).!Таблица 14. АЦ-стимулирующий эффект инсулина (10"8М) в присутствии11 7кальфостина (10" -10" М) в мембранной фракции крыс.

Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/ мг белка) Мембранная фракция скелетных мышц крыс Кальфостин (М) Кальфостин -инсулин +инсулин0 0 11.1+1.3 17.8+1.1 [+60%]10-пМ 10"11 М 23.4±1.1 (+111%) 15.7+1.4 [-33%]10ШМ ю-10 м 25.7+1.2 (+132%) 16.6+1.4 [-35%]10"9 м 10"9 м 24.3+2.4 (+119%) 14.6+1.0 [-40%]ю-8 м 108М 31.1+2.4 (+180%) 17.5+1.7 [-44%]10"7 м 10"7М 22.1+2.0 (+99%) 14.8+1.0 [-33%]Примечание: в круглых скобках - влияние самого кальфостина на активность АЦ без гормона (%). В квадратных скобках - влияние кальфостина на АЦ стимулирующий эффект инсулина (%).оТаблица 15. АЦ-стимулирующий эффект инсулина (10" М) в присутствии11 Пкальфостина (10" -10" М) в мембранной фракции моллюсков.

Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) Воздействия Мембранная фракция моллюска Кальфостин -инсулин +инсулин0 11.8±1.1 41.3+2.1 [+250%]10"1!М 23.9+1.8 37.6+2.7(+102%) [+57%]Ю"10М 25.3+2.2 34.3+2.6(+114%) [+36%]10"9 м 29.6±1.7 37.5+1.6(+151%) [+27%]10"8 м 37.7+1.3 33.4+1.7(+220%) [-11%]10"7 м 28.9+2.5 29.3+1.5(+145%) [+2%]Примечание: в круглых скобках - влияние самого кальфостина на активность АЦ без гормона (%). В квадратных скобках - влияние кальфостина на АЦ стимулирующий эффект инсулина (%).

Для идентификации изоформы ПКС, участвующей в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали моноклональные антитела к ПКС£, которая по данным литературы является одним из участников реализации сигналов инсулиновой природы ^апсЬей Qt а1., 1997; 2001).

Антитела к ПКС£ почти полностью блокировали АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 в мышечных мембранах крыс (таблица 16).

Таблица 16. Влияние антител к ПКС£ на АЦ активирующий эффект ИФР-1 (10"8М) и инсулина (10"8М) в мышечных мембранах крысыАктивность АЦ (%) Объекты Крысы Воздейтсвия Без пептида ИФР-1 Инсулинбез антител 100±4.4 253±17 247±24АТ 1:1000 104±9.5 102±14 108±16АТ 1:100 98±8.2 95±12 103±5АТ 1:10 94±6.8 68±3.6 88±8Активность АЦ выражена в % к контрольным величинам, принятым за 100%.

В отличие от результатов, полученных на мембранной фракции крыс, антитела к ПКС^ не оказывали существенного влияния на мембранных фракциях, выделенных из гладких мышц моллюска (таблица 17).

Таблица 17. Влияние антител к ПКС^ на АЦ активирующий эффект ИФРо о1 (10" М) и инсулина (10* М) в гладких мышцах моллюска А. су^еа.

Активность АЦ (%) Объекты Моллюски Воздейтсвия Без пептида ИФР-1 Инсулинбез антител 100±12 307±24 255±18АТ 1:1000 166±25 251±21 254±12АТ 1:100 163±18 327±27 237±20АТ 1:10 145±5 403±33 238±25Активность АЦ выражена в % к контрольным величинам, принятым за100%.

Таким образом, использование моноклональных антител к ПКС£ показано, что эта изоформа фермента вовлечена в стимулирующее действие инсулина и ИФР-1 на АЦ в скелетных мышцах крыс.

Между тем, в гладких мышцах моллюска эти антитела не оказывали блокирующего действия на АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1.

Нами были проведены эксперименты, целью которых было выявить существование ПКС£ изоформы в мышечных тканях крыс и моллюсков,которые, как мы предполагаем участвуют в передаче регуляторных сигналов пептидов инсулинового суперсемейства, опосредованных через АЦ сигнальный механизм.

С этой целью мы использовали моноклональные антитела к ПКС£. В экспериментах по установлению участия ПКС£, используя метод элекрофореза и точечного иммуноблота. (рис 16, 17), показано наличие преципитации препаратов мышечных тканей крыс и моллюсков с моноклональными антителами к ПКС£.1 2 Рис. 16. Идентификация участия ПКС£ в мембранах крысы и моллюска с использованием моноклональных антител (точечный иммуноблот).

Контроль без антител - 1 (крысы), 2 (моллюски) Обработка антителами - 3 (крысы), 4 (моллюски)138У крыс зоны преципитации отчетливо выявляются, у моллюсков они выражены слабее.

Нами был проведен электрофорез в ПААГ с последующим иммуноболингом с использованием моноклональных антител к ГЖС^ (Рис. 17) на препаратах, выделенных из мышечных тканей позвоночных (крысы) и беспозвоночных (моллюски).

На основании этого можно судить о существовании разного спектра изоформ ПКС в исследованных тканях позвоночных и беспозвоночных. У млекопитающих (крысы) четко выявляется ПКС£, принимающая участие в реализации действия пептидов инсулинового суперсемейства.

Согласно данным литературы, мышцы моллюска обладают иным набором ПКС (Sossin et al., 1996) и в АЦ стимулирующем действии этих пептидов инсулинового суперсемейства, по-видимому, участвует другая изоформа ПКС, близкая по своим свойствам к ПКСе из мозга позвоночных или подобная ПКС^.изоформа, которая встречается у амфибий Xenopus laevis (Dekker L.V. and Parker P.J., 1995)В целях выяснения роли различных протеинкиназ "С" в передаче инсулинового сигнала исследовали процесс активации АЦ в присутствии диацилглицерина и его липидорастворимого аналога - форболового эфира(форбол-12-миристат-13-ацетата). Для выявления участия разных форм протеинкиназы «С» в инсулин-регулируемой аденилатциклазной системе изучали влияние активаторов протеинкиназы "С" на различных уровнях передачи сигнала: 1) на уровне каталитической активности фермента -собственно аденилатциклазы; 2) на уровне функционального сопряжения аденилатциклазы с Gs-белками, оцениваемого по стимулирующему эффекту на фермент негидролизуемого аналога ГТФ гуанилилимидодифосфата; и 3) на уровне рецептора-тирозинкиназы путем запуска инсулином всей аденилатциклазной сигнальной системы.

Для решения вопроса, является ли влияние активированной протеинкиназы "С" на аденилатциклазную систему гормон- и рецептор-специфичным, изучали действие активаторов протеинкиназы "С" на аденилатциклазную систему, регулируемую биогенными аминами (серотонином - в случае моллюска, изопротеренолом - в случае крысы) через рецептор серпантинного типа. Наряду с процессом трансдукции стимулирующего гормонального сигнала через аденилатциклазную систему, исследовали процесс передачи через нее и ингибирующего сигнала, вызываемого изопротеренолом в гладких мышцах моллюска (Pertseva et al., 1992), в условиях активации протеинкиназы "С".

В отличие от большинства работ, посвященных рассматриваемой проблеме (Lin, Roth, 1994; Liu, Heckman, 1998; Lin et al., 1999; 2000), наши исследования (Плеснева и др., 2001; Plesneva et al., 2001) проведены не на целых клетках, а на мембранных фракциях, выделенных из мышечныхтканей крысы и моллюска. Выбор мембранных препаратов был продиктован следующими причинами: во-первых, тем, что именно с плазматической мембраной связаны основные компоненты аденилатциклазной сигнальной системы, чувствительной к инсулину, биогенным аминам и другим гормонам (гормональный рецептор, аденилатциклаза, G-белки), о чем свидетельствует отчетливая активация аденилатциклазной системы в ответ на добавление гормонов к мембранным фракциям тканей (Berra et al., 1993; Pertseva et al., 1996; Pertseva et al., 1995); во-вторых, согласно данным литературы (Avignon et al., 1995; Berti et al., 1994; Lai et al, 1997; McKenna et al., 1995; Yamada et al., 1995) в мембранных фракциях разных клеток и тканей (в том числе мышечной) присутствуют в базальном (нестимулированном) состоянии ряд изоформ протеинкиназы "С", регулируемых инсулином, в частности, протеинкиназа "С" а, р, б, 8, и 0, и атипичная протеинкиназа Таким образом, оба партнера, взаимодействие которых исследуется, присутствуют в одной и той же клеточной фракции. И, наконец, в-третьих, использование мембранного препарата, в отличие от целых клеток, имеет некоторые преимущества. Оно дает возможность изучать взаимодействие аденилатциклазной и протеинкиназа"С"-зависимых сигнальных систем на уровне мембраны без участия внутриклеточных процессов, в частности, транслокации протеинкиназы "С", т.е. в более упрощенном виде. Такой подход может облегчить анализ иинтерпретацию получаемых фактов. В пользу правомочности использования препарата плазматических мембран для указанной цели свидетельствуют результаты исследований ряда авторов (Lai et al., 1997; McKenna et al., 1995), выявивших взаимодействие между гормонрегулируемой аденилатциклазной сигнальной системой и протеинкиназой "С" в мембранной фракции некоторых тканей и клеток.

На первом этапе исследований было изучено влияние диацилглицерина и форбол-12-миристат-13-ацетата на базальную и гуанилилимидодифосфат-стимулированную активность аденилатциклазы.s §юX Ss5040 30с; о S20ZT <J3ЬоXm sfc <10Влияние ФЭ на стимулирующий АЦ эффект инсулина в скелетных мышцах крыс"I---1---1---гК 10 9 8-log [ФЭ] МРис. 18 Влияние форбол-12-миристат-13-ацетата (10"10-Ю"7М) на стимулированную инсулином (10'8М) АЦ активность в мембранной фракции мышц крысы.

10 7В концентрациях от 10" МдоЮ" М оба агента ш уЫго вызывали в мышечных мембранах крысы (Рис. 18) отчетливую стимуляциюкаталитической активности аденилатциклазы (прирост над контролем составил от 34 до 140%). В наибольшей степени эффект был выражен при концентрациях диацилглицерина и форбол-12-миристат-13-ацетата 10'9о п10" М, снижаясь при более высоких концентрациях этих агентов (10 М). Следует отметить, что стимуляцию форболовыми эфирами аденилатциклазы, чувствительной к инсулину, в культуре скелетных мышц крысы кроме нас (Плеснева и др., 2001; Plesneva et al., 2001) наблюдали и другие исследователи (Srinivasan and Begum, 1994). Сходная картина влияния диацилглицерина и форбол-12-миристат-13-ацетата на активность аденилатциклазы наблюдалась и в мышечных мембранах моллюска (Рис. 19).э >э5юX S5§ 2:т <лt оXm sfc <120 -|100 80 60 40 20 Влияние ФЭ на стимулирующим АЦ эффект инсулина в скелетных мышцах моллюска-ИНС + З +ИНС+«Ж-----------10 9 8-log [ФЭ1 М1Л «1Рис. 19. Влияние форбол-12-миристат-13-ацетата (10" -10" М)она стимулированную инсулином (10" М) аденилатциклазную активность в мембранной фракции мышц моллюска.

150 л120 Влияние ДАГ и ФЭ на активность АЦ в мембранной фракции мышц моллюскаДАГФЭРис. 21. Влияние диацилглицерина (Ю'10-10'7 М) (ДАГ) и форбол-12-миристат-13 -ацетата (Ю"10-10"7 М) (ФМА) на базальную активность аденилатциклазы в мембранной фракции мышц моллюска. По оси абсцисс: концентрации ДАГ и ФМА (М); по оси ординат -активность аденилатциклазы в пмолях цАМФ за 1 мин на 1 мг белка. Светлые столбики - без добавок; заштрихованные столбики — эффект ДАГ и ФМА (при различных концентрациях (М); * - различия достоверны с вероятностью Р < 0.05. По оси ординат -активность АЦ в пмолях цАМФ/мин на мг белкаПроцесс активации протеинкиназы "С" в присутствии диацилглицерина и форбол-12-миристат-13-ацетата в мышечных мембранах крысы вызывал полное ингибирование стимулирующего действия гуанилилимидодифосфата на активность аденилатциклазы. Это146может свидетельствовать об уменьшении функционального взаимодействия между С8-белком и аденилатциклазой в условиях активации протеинкиназы "С".

Влияние ДАГ на активность АЦ в присутствии ГИДФ в мембранной фракции мышц крысы1 2 3- log [DAG] МРис. 22. Влияние ДАГ (10"8-10"7М) на ГИДФ-стимулированную активность аденилатциклазы в мембранах мышц крысы.

По оси абсцисс - отрицательный логарифм концентрации диацилглицерина (М).

Концентрация гуанилилимидодифосфата - 10'6 М.

По оси ординат - активность АЦ в пмолях цАМФ/мин на мг белкаБыло исследовано влияние активации протеинкиназы "С" диациглицерином и форбол-12-миристат-13-ацетатом на передачу гормонального сигнала через аденилатциклазную сигнальную систему. В присутствии форбол-12-миристат-13-ацетата (10"10-10"7 М) процесс передачи инсулинового сигнала (in vitro, 2.5 мин, 10"8 М) через аденилатциклазную сигнальную систему, который происходит через рецептор тирозинкиназного типа (Pertseva et al., 1996), подавляется в мышцах крысы (до 46-54%) и моллюска (до 19-38%). Сходные результаты были получены в мышцах крысы и моллюска в присутствии диацилглицерина.

В целях выяснения специфичности выявленного действия активаторов протеинкиназы "С" на процесс передачи инсулинового сигнала исследовали в аналогичных условиях стимулирующее влияние на активность аденилатциклазы других гормонов - серотонина (моллюск) и изопротеренола (крыса), осуществляемого через рецепторы серпантинного типа. Оказалось, что в присутствии диацилглицерина и форбол-12-миристат-13-ацетата эффект биогенных аминов не проявляется в мышечных тканях как моллюсков, так и крыс. Следовательно, в условиях активации протеинкиназы"С" блокирование процесса проведения стимулирующего сигнала через аденилатциклазную систему не является гормон- и рецептор-специфичным.

120100Влияние ФЭ и ДАГ на стимулированную изопротеренолом и серотонином активность АЦ в мембранных фракциях моллюска и крысыкры са- ФЭ и -ДАГ— + ФЭ+ ДАГсерРис. 24 Эффект форбол-12-миристат-13-ацетата (10"8М) (ФМА) иодиацилглицерина (ДАГ) (10' М) на стимулированную серотонином или изопротеренолом активность аденилатциклазы в мембранах мышц моллюска и крысы.

По оси абсцисс: серии в отсутствие или присутствии серотонина (моллюск) или изопротеренола (крыса); 1 - без активатора протеинкиназы "С"; 2 - эффект форбол-12-миристат-13-ацетата; 3 - эффект диацилглицерина.

По оси ординат - активность АЦ в пмолях цАМФ/мин на мг белкаВ следующих сериях экспериментов было исследовано влияние активаторов протеинкиназы"С" на опосредуемую аденилатциклазной150системой передачу ингибирующего сигнала. В качестве модели был выбран ингибирующий аденилатциклазу эффект изопротеренола в мышечной ткани моллюска Anodonta cygnea. В этом объекте, как обнаружено нами ранее (Pertseva et al., 1992), Р-адренергические агонисты вызывают, в отличие от тканей позвоночных животных, подавление активности аденилатциклазы через посредство р2-адренорецептора и G-белка ингибирующего типа (Gj2). В условиях активации протеинкиназы "С" диацилглицерином и форбол-12-миристат-13-ацетатом ингибирующий аденилатциклазу эффект изопротеренола в мышечных мембранах моллюска заметно не изменялся. Эти результаты согласуются с данными других авторов (Morimoto and Koshland, 1994), свидетельствующими о том, что взаимодействие между протеинкиназа"С"-зависимой и аденилатциклазной системами происходит только в случае проведения стимулирующего сигнала от рецептора к аденилатциклазе через Gs-белок. Авторы приходят к выводу, что cross-talk между этими системами возникает только тогда, когда они обе находятся в активированном состоянии.

Прежде всего необходимо отметить большое сходство данных во всех сериях экспериментов, полученных на мышечных тканях как представителя позвоночных (крыса), так и беспозвоночных животных (моллюск), что облегчает обсуждение результатов. Это хорошо согласуется с положением об общих принципах структурно-функциональной организации аденилатциклазной и протеинкиназа"С"-зависимой сигнальных систем у позвоночных и беспозвоночных животных (Pepio et al., 1998).

Как следует из установленных фактов, активированная диацилглицерином и форбол-12-миристат-13-ацетатом протеинкиназа "С" имеет несколько точек приложения действия в пределах инсулинстимулируемой аденилатциклазной системы. Во-первых, на уровне самой аденилатциклазы, активность которой в значительной степени усиливается в этих условиях. Согласно литературным данным, форбол-12-миристат-13-ацетат либо усиливает, либо угнетает каталитическую активность аденилатциклазы. Направленность этого эффекта определяется как типом аденилатциклазы, так и изоформами протеинкиназы "С", присутствующими в изучаемой ткани. Увеличение базальной активности аденилатциклазы I, II и III типов в ответ на действие форбол-12-миристат-13-ацетата (в течение 10 минут) обнаружено в различных клетках, в то время как аденилатциклаза IV, V и VI типов слабо или совсем не реагируют на это воздействие (Houslay and Milligan, 1997;Jacobowitz et al., 1993; Tamura et al., 1996). Показано, что из числа изоформ протеинкиназы "С" - протеинкиназа "С" а способна увеличивать каталитическую функцию аденилатциклазы II типа (Zimmermann and Taussig, 1996). Это возрастание каталитической активности некоторых типов аденилатциклазы авторы пытаются объяснить снятием ингибирующего действия на них Gj-белка вследствие потери им этой функции, вызванной фосфорилированием протеинкиназой "С" а-субъединицы этого G-белка (Houslay and Milligan, 1997). В литературе имеются сведения о том, что ß-субъединицы двух G-белков - Gj и трансдуцина, а также ß-субъединицы последнего являются субстратами фосфорилирования Ca -фосфолипид-зависимой протеинкиназы "С" (Sagi-Eisenberg, 1989).

Во-вторых, cross talk между аденилатциклазной и протеинкиназа "С"-зависимой сигнальными системами наблюдается на уровне Gs-белка и его взаимодействия с аденилатциклазой. Последнее оценивается по величине стимулирующего эффекта гуаниновых нуклеотидов (гуанилилимидодифосфат) на активность фермента. Этот эффект исчезает после обработки мышечных мембран активаторами протеинкиназы "С" -диацилглицерином и форболовым эфиром. В этой связи интересны данные о том, что протеинкиназа "С" способна регулировать реактивность аденилатциклазы к G-белкам по-разному, в зависимости от ее изоформы (Zimmermann and Taussig, 1996). Так обработка протеинкиназой "C'a аденилатциклазы II типа приводила к увеличению как ее базальной, так иРу- и а8-стимулированной активности. В отличие от этого протеинкиназа "С" а оказывала слабое влияние на базальную и Ру-стимулированную активность аденилатциклазы IV типа, но заметно снижала стимулирующий эффект аз на активность фермента. Существенно, что через эти типы аденилатциклаз осуществляется интеграция гормональных сигналов, генерируемых рецепторами, сопряженными с С8, ^ и Оч-белками, и опосредуемых через -, Ру-субъединицы О-белка и протеинкиназу "С" соответственно.

Наконец, нельзя исключить и третью точку влияния активированной протеинкиназы "С" - рецептор инсулина, относящийся к тирозинкиназному типу. В ряде работ (Башекеп еХ а1., 1995; Такауата е1 а1., 1988) было обнаружено, что форбол-12-миристат-13-ацетат, активируя протеинкиназу "С", вызывает снижение тирозинкиназной активности рецептора инсулина и, как следствие, ослабляет процесс фосфорилирования по тирозину как самого рецепторного белка, так и его субстратов. В исследованиях на СНО-клетках (клеточная культура яичников китайского хомячка) с экспрессированной протеинкиназой "С"? было обнаружено, что активация этой изоформы фермента приводила к ингибированию передачи сигналов, вызванных инсулином и другими пептидами инсулинового суперсемейства (в частности инсулиноподобным фактором роста I) (БашеЬеп ег а1., 1995). Этот антагонизм проявлялся на этапе лиганд-стимулируемого тирозинового фосфорилирования нескольких эндогенных субстратов рецептора инсулина, таких как белкисубстраты рецептора инсулина 1-4, фосфатидилинозитол-3-киназа, ГТФазу-активирующий белок (GAP) и Shc-белок.

Из этого следует, что обнаруженное нами блокирование передачи инсулинового сигнала через аденилатциклазную систему в условиях активации протеинкиназы "С", реализуется скорее всего на уровне Gs-белка и рецептора этого гормона. Функции этих сигнальных молекул ослабевают вследствие, как предполагают, их фосфорилирования по остаткам серина и треонина (Aragey and Quick, 1999; Sagi-Eisenberg, 1989; Takayama et al., 1988).

Согласно данным, представленным в настоящей статье, и многочисленным результатам более ранних исследований других авторов (Carmena et al., 1995; Kawabe et al., 1994; McKenna et al., 1995; Yoshimura and Cooper, 1992) аналогичное ингибирование передачи стимулирующего сигнала активаторами протеинкиназы "С" наблюдается и в случае аденилатциклазной сигнальной системы, регулируемой гормонами, осуществляющими свое действие через рецептор серпантинного типа. Эти авторы считают, что активированная протеинкиназа "С", в частности протеинкиназа "С" а, и в этом случае имеет не одну точку приложения своего негативного влияния в аденилатциклазной сигнальной системе: на уровне самого рецептора, Gs-белка (точнее, его а-субъединицы) и аденилатциклазы, а также их функционального взамодействия. Было высказано предположение о том, что этот негативный эффект реализуется с участием Gj-белка, поскольку указанный эффект подавляется приобработке клеток коклюшным токсином, мишенью действия которого как раз и является а-субъединица Q-белка. Таким образом, есть основания полагать, что инсулин и другие гормоны, активируя группу форбол-чувствительных протеинкиназ "С", вызывают по принципу обратной связи процесс фосфорилирования ими молекулярных блоков гормонрегулируемой аденилатциклазной системы, ведущий к блокированию передачи стимулирующих гормональных сигналов. Этот негативный cross-talk между аденилатциклазной и протеинкиназа"С"-зависимой сигнальными системами можно рассматривать как универсальный механизм десенситизации клетки-мишени, а в случае инсулинкомпетентной системы - механизмом возникновения резистентности клетки к инсулину. Как следует из сведений литературы (Houslay and Milligan, 1997), этот cross-talk является изоэнзим-специфичным со стороны обоих партнеров - протеинкиназы"С" и аденилатциклазы. В нашем объекте исследования (скелетные мышцы крысы) идентифицированы четыре изоформы форболчувствительной группы протеинкиназы "С": протеинкиназа "С" а, (3, 8 и 9, которые присутствуют как в базальном, так и в стимулированном состоянии в мембранной и цитозольной фракциях (Yamada et al., 1995; Lai et al., 1997). Все эти изоформы относятся к мишеням активирующего действия инсулина, которое осуществляется крайне быстро - в течение первых минут (1-5 мин) в условиях in vitro, возможно и в результате прямого взаимодействия фермента с рецептором инсулина и фосфорилирования потирозину (Avignon et al., 1995; Formisano et al., 1998; Lin and Roth, 1994; Srinivasan and Begum, 1994; Yamada et al., 1995).

В отношении изоэнзимного спектра аденилатциклаз показано, что в скелетных мышцах грызунов (мышь) к преобладающим изоформам относятся аденилатциклаза II типа (53%) и аденилатциклаза VI типа (16%), а аденилатциклаза V типа содержится в небольших количествах (Krupinski et al., 1992). Из них в периферических тканях форбол-чувствительными протеинкиназами "С" (в частности, протеинкиназой "C'a) регулируются аденилатциклаза II типа и аденилатциклаза V типа (Kawabe et al., 1994). В круг нашего рассмотрения попадают только инсулинрегулируемые изоформы аденилатциклазы. В работах, появившихся после обнаружения нами нового - аденилатциклазного сигнального механизма действия инсулина, установлено, что мишенью стимулирующего эффекта этого гормона, а также эпидермального фактора роста, является изоформа аденилатциклазы V типа, которая может фосфорилироваться как форбол-чувствительной протеинкиназой "С" а, так и форбол-нечувствительной протеинкиназой "С" Ç (Ishikava and Homey, 1997; Kawabe et al., 1994; Kawabe et al., 1996). Кроме того, нельзя исключить и аденилатциклазу II типа, которая играет в клетке роль интегратора различных гормональных и, в том числе, генерируемых ростовыми факторами сигналов, поступающих через гетеротримерные G-белки и протеинкиназа "С"-зависимую систему (Lustig et al., 1993).

Итак, из всей приведенной информации следует, что в обнаруженном нами взаимодействии между инсулинрегулируемыми аденилатциклазной и протеинкиназа "С"-зависимой сигнальными системам в мышечных тканях могут участвовать со стороны протеинкиназы "С" - форбол-чувствительные ее изоформы: а, Р и 0, а со стороны аденилатциклазы - изоформы V и возможно II типа. Однако нельзя исключить, опираясь на хорошо известный факт о способности всех изоформ аденилатциклазы активироваться Gs-белками (Houslay and Milligan, 1997), что и другие молекулярные варианты этого фермента могут активироваться инсулином в его тканях-мишенях.

Таким образом, как следует из результатов нашего исследования взаимоотношения между двумя основными сигнальными системами (аденилатциклазной и протеинкиназа "С"-зависимой) в клетках мышечной ткани позвоночных и беспозвоночных животных достаточно сложны. Это связано со сложностью организации указанных систем, включающих целый ряд функционально различающихся блоков (рецепторов, G-белков, ферментов - генераторов вторичных мессенджеров, и др.), каждый из которых представлен множественными молекулярными вариантами (как, например, аденилатциклаза и протеинкиназа "С"), отличающимися по своим свойствам и функциям.

Таким образом, настоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных ибеспозвоночных животных (Ркэпеуа е1 а1., 2001; Плеснева и др., 2001; Шпаков и др., 2002). Этот механизм имеет принципиально сходную структурно-функциональную организацию в случае инсулин- ИФР-1- и ИПП-компетентных АЦ сигнальных систем. Он может быть представлен в клетке шестикомпонентным сигнальным каскадом: рецептор-тирозинкиназа => И-белок фу-димер) => фосфатидилинозитол-3-киназа => протеинкиназа С С, Оэ-белок => аденилатциклаза. АЦ является генератором внутриклеточного посредника - цАМФ, который способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы "А" передавать гормональный сигнал к различным эффекторным системам.

В плане изучения функциональной роли, обнаруженного нами, АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, было исследовано его участие в реализации регуляторного действия пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы, как клеточный рост и апоптоз.

Участие АЦ сигнальной системы в реализации ростстимулирующего действия инсулина в культуре клеток куриных миобластовИсследования, проведенные на культуре клеток куриных миобластов являются продолжением исследований, направленных на доказательство участия АЦ сигнальной системы в механизме ростстимулирующего действия инсулина. Цель её состояла в изучении динамики АЦ-активирующего эффекта инсулина в процессе миогенеза тvitro (1-7 день роста миобластов в культуре) и сопоставлении характера и выраженности этого эффекта со стадиями пролиферации и дифференцировки мышечных клеток.

Было обнаружено (таблица 18), что в мембранной фракции 4-х дневной культуры миобластов активность АЦ отчетливо стимулируется агентами негормональной природы - форсколином, негидролизуемым аналогом ГТФ - TTOyS и NaF, которые действуют либо непосредственно на АЦ (форсколин), либо опосредовано - через G-белки (NaF, TTOyS).

Таблица 18. Влияние агентов негормональной природы на активность аденилатциклазы в куриных миобластах на 4-й день роста в культуреВоздействия Активность аденилатциклазы в пикомолях цАМФ/мин на 1 мг белкабез воздействий (базальная) 32.72±1.01TTOyS 10"5М 65.77±2.64 (+101%)Форсколин 10"5М 82.45±2.87 (+152%)NaF 10"2М 114.84±3.15 (+251%)Примечание: цифры в скобках - эффект исследованных агентов в % к базальной активности АЦ.

Таблица 19. Активность креатинкиназы в развивающейся культуре куриных миобластовВозраст культуры Активность креатинкиназы(сутки) в мкмолях креатина/мин начашку1 9.30+0.652- 11.57+1.613 16.01±2.554 33.90+5.915 40.00+1.226 48.01+2.617 68.71±4.37Наряду с этим исследовали влияние изопротеренола, который является стимулятором АЦ различных тканей животных. Его влияние реализуется через (3-адренорецептор семь раз пронизывающий мембрану и сопряженный с О-белком (серпантинный тип рецептора). Изопротеренол вызывает увеличение активности АЦ в мембранной фракции 4-х дневных миобластов. В присутствии ГТФуБ эффект изопротеренола усиливается (потенцируется), что является доказательством участия в этом процессе О-белка. Полученные данные свидетельствуют о том, что в 4-х дневной культуре миобластов куриных эмбрионов все три блока АЦ-сигнальнойсистемы - рецепторный, регуляторный и каталитический функционально активны и способны проводить гормональный сигнал (Плеснева и др., 1998). Эти функциональные показатели АЦ-системы куриных миобластов соответствуют функциональной характеристике АЦ системы, выявленной нами и другими авторами (Деркач и др. 1997, Zalin, Montague, 1975; Clark et al., 1980; Pablo et al., 1982) в исследованиях, проведенных на развивающихся как in vivo, так и in vitro мышечных клетках кур и млекопитающих.

С целью идентификации стадий миогенеза, проходимых куриными миобластами в культуре, наряду с морфологическими (см. методическую часть) были использованы и биохимические показатели, такие как активность креатинкиназы - фермента, являющегося маркером процесса дифференцировки мышечной клетки (Соколов, 1975; Лызлова, 1981). В первые два дня роста культуры активность креатинкиназы невелика. На 3-ий день развития активность фермента увеличивается, а отчетливый ее подъем начинается с 4-го дня роста культуры, что согласно данным литературы (Лызлова, 1981; Пинаев, 1981; Balk et al., 1982) совпадает с замедлением клеточного деления и переходом миобластов к дифференцировке, сопровождающейся синтезом специфических белков мышечной ткани. Таким образом, основываясь на этих биохимических данных, а также морфологической картине, обнаруженной нами, первый и второй дни развития культуры соответствуют стадии пролиферациимиобластов, а третий и четвертый дни - переходу к процессу дифференцировки (слияние миобластов в миотубы).

Исследование влияния инсулина на активность АЦ мембранной фракции миобластов на различных стадиях роста в культуре Обнаружено, что базальная активность АЦ постепенно увеличивается в процессе роста культуры, достигая максимума на 4-ый день ее развития. На последующих стадиях (5-6 дни) активность фермента практически не изменяется и несколько снижается на 7-ой день роста культуры (Плеснева и др. 1998). С первого по седьмой день инсулин (10"9М) вызывает отчетливую стимуляцию активности АЦ. Активность фермента увеличивается в первые дни развития культуры примерно в 5 раз. Достигнув максимального значения на 2-й день роста клеток (+512%), эффект инсулина уменьшается по величине, начиная с 3-го дня развития миобластов, а на 7-ой день он составляет (+158%).

Обнаруженное нами стимулирующее действие инсулина на активность АЦ является дозозависимым и реализуется при концентрациях гормона в диапазоне от 10"ПМ до 10"7М. Максимальный стимулирующий эффект инсулина на АЦ выявляется при концентрации гормона 10"9М. Дозозависимая кривая стимулирующего действия инсулина на АЦ в культуре миобластов практически совпадает с графиком дозозависимости стимулирующего эффекта инсулина на АЦ в скелетных мышцах 10-дневного куриного эмбриона, развивающегося in ovo (Деркач и др. 1997).

При исследовании влияния ИФР 1 на АЦ культуры миобластов, было выявлено, что ИФР 1, подобно инсулину, увеличивает активность АЦ в 4-х дневной культуре миобластов, однако максимальный эффект этого агента наблюдается при концентрации на порядок более низкой (10" 10М), чем в случае инсулина, и превосходит его по величине.

Кривые дозозависимости эффектов инсулина и ИФР 1 имеют колоколообразную форму, отклоняясь, таким образом, от типичной формы кривых Михаэлиса-Ментена. Такая же закономерность была выявлена нами ранее при изучении стимулирующего действия инсулина, ИФР 1 и инсулиноподобного пептида моллюска на активность АЦ в мышечной ткани позвоночных и беспозвоночных. Указанный феномен может быть объяснен, исходя из представлений Кюля (Kühl, 1994). Согласно им колоколообразная форма кривых доза-ответ, многократно описанная в фармакологических исследованиях системы рецептор-агонист, может быть связана с одной стороны с десенситизацией рецептора, которая наступает при высоких концентрациях агониста (гормона) и ведет к снижению позитивного эффекта (нисходящая ветвь кривой), который индуцируется тем же агонистом, но в оптимальных концентрациях. С другой стороны, для инсулина и ИФР 1 существует возможность присутствия в клетке не одного, а двух типов гормонального рецептора - с высокой и с низкой аффинностью к лиганду (что показано для рецептора инсулина). Первый - высокоаффинный тип рецептора - может быть функционально сопряжен со стимулирующим, а второй, низкоаффинныйтип - с ингибирующим сигнальным механизмом. При этом, низкоаффинный тип рецептора способен вовлекаться в действие гормона лишь при высоких его концентрациях.

Исследование динамики АЦ-стимулирующего эффекта инсулина показало, что он развивается во времени достаточно быстро. Уже через 2,5 мин действия гормона эффект достигает больших величин (+250%), через 5 минут он выражен в меньшей степени (+146%), а к 10 минуте эффект полностью исчезает, что согласуется с данными, полученными нами на мышечных тканях млекопитающих и моллюсков.

Для выяснения механизма реализации активирующего АЦ действия исследуемых ростовых факторов в культуре клеток изучали влияние негидролизуемого аналога ГТФ - ГТФу8 (10"5М) на проявление АЦ-эффекта инсулина (10"9М) и ИФР 1 (Ю'10М). В этих условиях наблюдалось потенцирующее (усиливающее) влияние ГТФу8 на эффект инсулина: при совместном действии этих агентов эффект был на 50% больше аддитивного эффекта гормона и ГТФу8, действующих раздельно. Такое же потенцирующее действие ГТФу8 обнаруживалось и в отношении АЦ-стимулирующего эффекта ИФР 1. Данный факт, как уже отмечалось, указывает на вовлеченность О-белка (по всей вероятности 08-типа) в стимулирующий АЦ эффект инсулина и ИФР 1. Аналогичная картина была выявлена ранее в мышечных тканях крыс, кур и моллюсков.

Основываясь на современных представлениях о том, что основным механизмом действия инсулина и ряда ростовых факторов являетсятирозинкиназный каскад фосфорилирования белков, а также на наших данных об участии рецепторной тирозинкиназы в осуществлении стимулирующего АЦ эффекта инсулина, ИФР 1 и ЭФР в гладких мышцах моллюска и скелетных мышцах кур и крыс, была проведена серия экспериментов с использованием высокоселективных ингибиторов тирозинкиназ - тирфостина 47 и генистеина. Тирфостин 47 и генистеин диапазоне концентраций от 0.5 до 10 мкМ отчетливо блокировали АЦ-стимулирующий эффект инсулина в культуре миобластов. Между тем эффект изопротеренола, действующего через рецептор не тирозинкиназного, а серпантинного типа (Р-адренорецептор), не ингибировался в присутствии использованных блокаторов.

Суммируя результаты проведенного исследования, можно высказать некоторые соображения и сделать следующие выводы:Фермент синтеза цАМФ - АЦ проявляет свою активность в миобластах с первых дней роста в культуре. По своим регуляторным свойствам - чувствительности к стимуляторам негормональной природы (форсколин, ГТФу8, NaF,), и к Р-адренергическим агонистам (изопротеренол) АЦ принципиально не отличается от фермента скелетных мышц куриного эмбриона, развивающегося in vivo, а также большинства тканей позвоночных животных.

Инсулин и ИФР 1 в диапазоне физиологических концентраций оказывают в условиях in vitro ГТФ-зависимое стимулирующее влияние на активность АЦ, которое реализуется в течение 2,5-5,0 мин. Эти данныеподтверждают обнаруженный ранее факт способности инсулина, ИФР 1 и других пептидов инсулинового суперсемейства активировать АЦ в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных.

Сопоставление динамики АЦ-стимулирующего эффекта инсулина в мышечных клетках в процессе роста их в культуре со стадией миогенеза демонстрирует, что эффект инсулина, обнаруживаемый с первых дней развития культуры наиболее сильно выражен на 1 и 2 дни роста клеток в культуре. Согласно морфологическим исследованиям на этих днях культура представлена, в основном, миобластами, находящимися на стадии активной пролиферации. С переходом к дифференцировке на 4-7 дни роста (слияние миобластов, образование миотуб) АЦ-стимулирующий эффект инсулина ослабевает. С этим моментом совпадает резкий подъем (в 3-6 раз) активности креатинкиназы, связанный с усилением синтеза ферментного белка de novo, который, как отмечалось выше, является маркером процесса дифференцировки мышечных клеток и остановки клеточного деления. Следовательно, наблюдается взаимосвязь между периодом интенсивной пролиферации миобластов (1-2 дни роста в культуре), с одной стороны, и наибольшей выраженностью стимулирующего действия инсулина на активность АЦ в делящихся мышечных клетках, с другой. Необходимо подчеркнуть, что в этот же период в миобластах куриного эмбриона зарегистрировано митогенное действие инсулина и связанные с ним эффекты: стимуляция синтеза ДНК, РНК, белков, а также транспорта аминокислот.

Такая же закономерность была выявлена в скелетных мышцах куриного эмбриона, развивающегося in vivo. АЦ-стимулирующий эффект инсулина был обнаружен с первой декады эмбриогенеза, когда он был выражен в наибольшей степени и совпадал с периодом пролиферации миобластов. Существенно, что для его индукции на 10-ый день эмбрионального развития требовалась концентрация инсулина на порядок более низкая, чем на 14-16 дни, что указывает на большую чувствительность АЦ-системы к гормону в первой половине эмбриогенеза. Следует отметить, что в условиях развития мышечной ткани куриного эмбриона in vivo период пролиферации характеризуется очень высоким уровнем цАМФ и активности АЦ в этой ткани, что косвенно указывает на важную роль этой системы в процессах клеточного роста.

Исходя из данных о раннем появлении в ходе развития мышечной ткани митогенного дейтсвия инсулина, был сделан вывод о том, что этот гормон в период пролиферации мышечных клеток играет, в первую очередь, роль ростового (митогенного) фактора. Функция же его как регулятора метаболических процессов (углеводного обмена, в частности) проявляется позднее - в период дифференцировки мышечной ткани.

Совокупность полученных нами и имеющихся в литературе данных (Mierzejevski, Rosengurt, 1978; Kumegava et al., 1980) свидетельствует в пользу нашей гипотезы о вовлеченности аденилатциклазного механизма, в реализацию ростстимулирующего действия инсулина. Эта точка зрениясогласуется с новыми представлениями о роли цАМФ как позитивного регулятора процессов клеточного роста и механизмах его реализации.

Таким образом, обнаружено дозозависимое стимулирующееО 11действие инсулина (10' -10" М) на активность аденилатциклазы в мембранной фракции куриных миобластов, растущих в культуре в течение 7 дней. Этот эффект усиливается в присутствии негидролизуемых аналогов гуаниновых нуклеотидов (TTOyS) и блокируется селективными ингибиторами тирозинкиназ (тирфостином 47 и генистеином), что свидетельствует об участии в нем G-белка (Gs) и тирозинкиназы рецептора инсулина. Стимулирующее аденилатциклазу действие инсулина выявляется на всех исследованных стадиях роста миобластов (с 1 по 7 день). Однако оно наиболее выражено в первые два дня роста культуры миобластов, что совпадает с периодом интенсивной пролиферации мышечных клеток. При переходе миобластов к дифференцировке величина эффекта гормона постепенно уменьшается. Высказывается предположение о том, что в период клеточного роста основной функцией инсулина является регуляция митогенных процессов, которая осуществляется через аденилатциклазную сигнальную систему (Scott et al., 1988; Clarke et al., 1995; Плесневаи др., 1998; 1999).

Участие АЦ сигнального механизма в митогенном действии пептидов инсулиновой природыВ этом разделе приведены результаты исследования, предпринятого с целью экспериментального обоснования гипотезы об участии указанногоАЦ сигнального механизма и продуцируемого им цАМФ как вторичного посредника в митогенном, а не метаболическом влиянии пептидов инсулинового ряда. Задачи его состояли: 1) в сравнении характера и эффективности действия инсулина, ИФР 1 и ЭФР (взятого для сравнения как типичный митоген) на активность АЦ, с одной стороны, и на синтез ДНК, оцениваемый по включению [14С]-тимидина, с другой; и 2) в попытке воспроизвести митогенный эффект этих пептидов с помощью цАМФ. Работа проведена на минимально трансформированных фибробластоподобных клетках Swiss ЗТЗ, полученных из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Эта клеточная линия является классическим объектом тестирования митогенного действия.

Этот раздел работы выполнен непосредственно автором совместно с сотрудниками Института цитологии РАН, - Решетниковой Г.Ф и Баркан Р.С в лаборатории, возглавляемой академиком H.H. Никольским.

Для изучения митогенного действия пептидов инсулинового суперсемейства мы использовали фибробластоподобную культуру клеток Swiss ЗТЗ, любезно предоставленную нам из банка культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Проведена функциональная характеристика АЦ системы в культуре Swiss3T3 клеток (Плеснева и др., 1999). Установлено, что АЦ система в культуре этих клеток стимулируется классическими негормональными активаторами АЦ - NaF, форсколином, ГИДФ, ГТФ, а также инсулином, ИФР-1 и ЭФР (таблица 20).

Таблица 20. Функциональные свойства АЦС культуры Б-шзбЗТЗ клетокВоздействия Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) Стимулирующий АЦ эффект в %Базальная 30.59+1.41 100% (базальная)ЫаБ 102М 178.91+4.15 585% (+485%)форсколин 10"5 М 99.26±3.21 324% (+224%)ГИДФ 10'6 М 111.20±3.48 364% (+264%)ГТФ 10"5 М 82.98+2.92 271% (+171%)ЭФР 10"9М 168.31+4.75 550% (+450%)ИФР-1 10"9 М 102.14±3.34 334% (+224%)Инсулин 10"9 М 74.89+2.11 245% (+145%)В скобках - активирующий АЦ эффект агентов гормональной и негормональной природы (в %), по отношению к базальной активности АЦ, принятой за 100%.

Обнаружено, что АЦ система этих клеток обладает функциональными свойствами, близкими к ферменту других клеток и тканей позвоночных, поскольку чувствительна к классическим негормональным стимуляторам её активности: NaF, форсколину, а также к гормонам и ростовым факторам. Эти пептиды in vitro в концентрации 10"9 М отчетливо активировали АЦ, что согласуется с результатами наших предыдущих исследований, проведенных на мышечных тканях (Деркач и др., 1997; Плеснева и др., 1998).

Проведенные нами исследования показали, что в культуре Swiss ЗТЗ присутствует АЦС с функциональными свойствами, близкими к АЦС других клеток и тканей позвоночных, которая способна к восприятию внеклеточных сигналов различной природы.

Инсулин, инсулиноподобные факторы роста и релаксин позвоночных, а также инсулиноподобные пептиды беспозвоночных образуют инсулиновое суперсемейство (Steiner et al., 1984);, которое имеет общее эволюционное происхождение и обладает значительной структурной гомологией. Эти пептиды оказывают два типа регуляторных влияний на клетку: метаболические и ростстимулирующие (или митогенные). Однако молекулярные механизмы их реализации остаются во многом невыясненными.

Для оценки митогенного действия пептидов изучали способность инсулина, ИФР1 и ЭФР индуцировать в покоящихся клетках Swiss ЗТЗ митогенный эффект, оцениваемый по включению [14С]тимидина в ДНК (Рис. 26).

Рис. 26. Влияние инсулина, ИФР-1, ЭФР на включение [14С]тимидина в ДНКПо оси абсцисс: Инсулин - 1000 нг/мл; ИФР-1 - 50 нг/мл; ЭФР - 10 нг/мл По оси ординат: включение [14С]тимидина в ДНКВсе исследованные пептиды - инсулин (1000 нг/мл), ИФР 1 (50 нг/мл) и ЭФР (10 нг/мл) сильно стимулировали синтез ДНК в указанных174клетках (прирост от 250 до 100%). Учитывая использованные концентрации пептидов, следует отметить, что наиболее эффективно действующим митогеном в этих клетках является ЭФР, затем следует ИФР 1. Значительно меньшей эффективностью обладает инсулин, поскольку для достижения митогенного эффекта, близкого по величине к таковому ЭФР требуется в 100 раз большая концентрация гормона. Обнаруженный ряд эффективности ростстимулирующего действия пептидов (ЭФР > ИПФР1 > инсулин) хорошо согласуется с общепринятой точкой зрения о большей митогенной активности этих ростовых факторов по сравнению с инсулином.

Было исследовано влияние инсулина и ростовых факторов на активность АЦ в культуре клеток линии Swiss 3N3. Исследуемые пептиды в тех же концентрациях, при которых был обнаружен отчетливый митогенный эффект (Рис. 26), оказывали стимулирующее влияние (время действия 2,5 мин) и на активность АЦ (Рис. 27).

900 800 700'2§ 600-&Ё 500о¡4В 400^ зооЧ 200 100<4 % нИ|||111Я.¡■И■Ншмм1911контроль ЭФР Инсулин ИФР-1 Ю Ю00 50Рис. 27. Активность АЦ в присутствии инсулина, ИФР-1 и ЭФР (в % к базальной активности, принятой за 100%).

По оси абсцисс: Инсулин - 1000 нг/мл; ИФР-1 - 50 нг/мл; ЭФР - 10 нг/мл По оси ординат: активность АЦ в % к контролюПри использованных концентрациях оба ростовых фактора (ЭФР и ИФР 1) были более эффективны в отношении активации АЦ, чем инсулин. Если наша гипотеза верна, то продуцируемый аденилатциклазой в ответ надействие этих пептидов цАМФ должен воспроизводить их митогенный эффект.

Проверке этой возможности была посвящена серия наших исследований. Действительно, дибутириловый аналог цАМФ обладающий способностью проникать в клетку, взятый при низких концентрациях (10" 12-10"9 М), вызывал четкий митогенный эффект, по величине даже превосходящий аналогичный эффект ЭФР и ИФР1 (рис. 28). Эффект оценивали по включению [14С]-тимидинав ДНК (Плеснева и др., 1999).

При сравнении результатов серий экспериментов, представленных на рисунках 26, 27, 28 и выраженных в одинаковых единицах (в %), отчетливо выявляется: 1) однонаправленность митогенного (стимуляция синтеза ДНК) и активирующего АЦ эффектов инсулина, ИФР 1 и ЭФР, а также действия цАМФ на синтез ДНК; 2) сходная (примерно одного порядка) величина этих эффектов и, наконец, 3) совпадение ряда эффективности этих пептидов по исследуемым параметрам.

Наличие такой корреляционной закономерности служит веским свидетельством в пользу нашей гипотезы о вовлеченности АЦ сигнальной системы и продуцируемого ею цАМФ как вторичного посредника в митогенное действие пептидов инсулинового суперсемейства (инсулин, ИФР 1, релаксин и т. д.) и других ростовых факторов (в частности ЭФР). Существенный разрыв во времени реализации АЦ-эффекта пептидов (2,5-5 мин) и их митогенного действия (21-23 часа) указывает на то, что цАМФ следует, по-видимому, рассматривать как ранний триггер ипосредник сложного многоступенчатого митогенного механизма, требующего для своей реализации длительного времени.

1000-| 800SчЛ 600я §а^ 400з42000XРис. 28. Влияние дибутирилового аналога цАМФ на включение [14С]тимидина в ДНК в культуре клеток Swiss3T3 По оси абсцисс: - log концентрации дибутирилового аналога цАМФ По оси ординат: включение [14С]тимидина в ДНКСпособность аналогов цАМФ мимицировать митогенное действие гормонов - активаторов АЦ (вазопрессин, катехоламины, тиреостимулирующий гормон), действующих через рецепторы, семь разпронизывающие мембрану показана в Swiss ЗТЗ и других типах клеток. Этот факт позволил авторам предположить, что цАМФ может выполнять роль вторичного посредника в митогенном действии ростстимулирующих факторов данного типа. Однако эта мысль не высказывалась в литературе в отношении митогенного действия пептидов инсулинового суперсемейства, обладающих рецепторами-тирозинкиназами, поскольку до нас не была показана их способность активировать АЦ систему. В ряде работ прошлых лет было выявлено усиление митогенного эффекта инсулина, ИФР 1 и ЭФР в присутствии цАМФ, которое привело авторов к предположению о существовании какого-то взаимодействия между нуклеотидом и этими пептидами. С позиции обнаруженного нами АЦ-сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсумейства это усиление можно объяснить простой суммацией эффектов экзогенного и эндогенно образованного за счет действия этих пептидов цАМФ.

По современным представлениям цАМФ способен стимулировать пролиферативную активность клеток, индуцируя свой собственный митогенный путь, который существует отдельно от цАМФ-независимых путей, включающих митогенактивируемый протеинкиназный и фосфоинозитидный сигнальные каскады, но работающий с ними синергично.

Оценив функциональные свойства АЦ сигнальной системы культуры Swiss3T3 клеток, была исследована способность инсулина, ИФР-1 и ЭФР индуцировать в культуре клеток Swiss3T3 митогенныйэффект, оцениваемый по включению [14С]-тимидина в ДНК (Рис. 26). Показано, что инсулин (1000 нг/мл), ИФР 1 (50 нг/мл) и ЭФР (10 нг/мл) стимулировали синтез ДНК (прирост от 100% до 250%).

Исследуемые пептиды в тех же концентрациях оказывали стимулирующее влияние (2,5 мин) на активность АЦ. (Рис. 27). Для подтверждения участия цАМФ в реализации митогенного эффекта был использован его дибутириловый аналог цАМФ, обладающий способностью проникать в клетку. Этот аналог, взятый при низких19 Оконцентрациях (10" -10" М), вызывал четкий митогенный эффект, по величине даже превосходящий аналогичный эффект ЭФР и ИФР-1. Эффект оценивали по включению [14С]-тимидина в ДНК (Рис. 28).

Представленные экспериментальные данные подтверждают нашу гипотезу (Перцева, 2000) об участии АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства и, продуцируемого им цАМФ, в реализации митогенных процессов.

Участие адеиилатциклазиого сигнального механизма в антиапоптотическом действии инсулина и инсулиноподобного фактора роста 1Согласно данным литературы пептиды инсулинового суперсемейства - инсулин и ИФР 1 способны оказывать антиапоптотическое действие на клетки. Также известно, что цАМФ,180образующийся при активации АЦ, способен предотвращать апототичекие изменения в клетке (Перцева, 2000).

Исследования, представленные в этом разделе, посвящены экспериментальному подтверждению возможности участия АЦ сигнального механизма в реализации антиапоптотического действия пептидов инсулинового ряда - инсулина и ИФР-1.

Для решения этой задачи нами подобрана клеточная модель апоптоза, включающая клеточные линии, с разной степенью устойчивости к условиям, вызывающим запрограммированную гибель клеток (апоптоз).

В экспериментах использовали культуру клеток ElA+cHa-ras, обладающую высокой проапоптотической чувствительностью к удалению ростовых факторов и действию ДНК-повреждающих агентов («впадают в апоптоз») и культуру клеток Е1А+Е1В с высокой устойчивостью как к действию ДНК повреждающих агентов, так и к удалению ростовых факторов из среды («не впадают в апоптоз»). В клеточных культурах была охарактеризована чувствительность АЦС к действию инсулина и ИФР-1 (Таблица 21).

Таблица 21. Влияние in vitro инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в грубой мембранной фракции культур клеток ElA+cHa-ras, обладающих высокой проапоптотической активностьюУсловия Активность АЦ (пмоль/мин/мг белка) Контроль Инсулин ИФР-1Среда + 10% сыворотка 33.913.4 (100%) 48.1±2.1 (142%) 56.4±1.3 (166%)Среда + 0.5% сыворотка 95,9±3,4 (100%) 137,0±9,0 (143%) 181,6±8,2 (189%)оПримечание. В опытах in vitro пептиды (10" М) добавляли прямо в пробу, содержащую грубую мембранную фракцию, выделенную из этих клеток, и использовали ее для определения активности АЦ. Время инкубации мембранного препарата культуры клеток с пептидами - 2.5 мин. Цифры в скобках - эффект гормонов в процентах к контролю, принятому за 100%. Апоптоз индуцировали удалением ростовых факторов сыворотки из среды (инкубация клеток в среде содержащей 0.5% сыворотку вызывала апоптотические изменения в культуре клеток).

Таблица 22. Влияние in vivo инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в грубой мембранной фракции культур клеток El A+cHa-ras, обладающих высокой проапоптотической активностьюУсловия Активность АЦ (пмоль/мин/мг белка) Контроль Инсулин ИФР-1Среда+10% сыворотка 4.1+0.29 (100%) 6.0+0.9 (146%) 12.2+0.5 (297%)Среда + 0.5% сыворотка 11.0±1.2 (100%) 17.2+1.2 (156%) 24.8±2.2 (225%)Примечание: В опытах in vivo инсулин (10" М) и ИФР-1 (10" М) добавляли непосредственно в среду к культурам клеток, время инкубации 5 мин.

После инкубации из клеточной культуры выделяли мембранную фракцию и определяли в ней активность АЦ.

Цифры в скобках - эффект гормонов в процентах к контролю, принятому за 100%. Апоптоз индуцировали удалением ростовых факторов сыворотки из среды.

Таблица 24. Влияние in vivo инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в грубой мембранной фракции культур клеток Е1А+Е1В, обладающих низкой проапоптотической активностью.

Условия Активность АЦ (пмоль/мин/мг белка) Контроль Инсулин ИФР-1Среда+10% сыворотка 5.2+0.3 (100%) 8.5+1.0 (163%) 11.4d=1.3 (219%)Среда + 0.5% сыворотка 5.8+0.6 (100%) 10.0+0.7 (172%) 13.6+0.6 (234%)7 ЯПримечание: В опытах in vivo инсулин (10"М) и ИФР-1 (1(ГМ) добавляли непосредственно в среду к культурам клеток, время инкубации 5 мин.

После инкубации из клеточной культуры выделяли мембранную фракцию и определяли в ней активность АЦ.

Цифры в скобках - эффект гормонов в процентах к контролю, принятому за 100%.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что клетки культуры линий ElA+cHa-ras и Е1А+Е1В способны отвечать на действие инсулина и ИФР-1 (10"^М) активацией АЦ, что указывает на наличие в них рецепторов инсулина и ИФР-1, а также АЦС, чувствительной к этим пептидам. Клетки сохраняют чувствительность АЦС к инсулину и ИФР-1как в среде с 10% сывороткой, так и в среде с 0.5% сывороткой (Плеснева и др., 2003).

Согласно данным литературы пептиды инсулинового суперсемейства - инсулин и ИФР-1, а также цАМФ, образующийся в результате активации АЦ, способны оказывать антиапоптотическое действие на клетки. Показано, что инсулин (Ю'^М), ИФР-1 (Ю'^М) и дибутирил-цАМФ (10"9м) оказывают ингибирующее влияние наапоптоз, вызванный удалением ростовых факторов сыворотки, в культуре клеток ElA+cHa-ras (Плеснева, 2003). Оценка антиапоптотического эффекта инсулина, ИФР-1 и дибутирил-цАМФ проводилась на клетках культуры ElA+cHa-ras с использованием метода клоногенной выживаемости, который относится к числу наиболее чувствительных способов тестирования антиапоптотического действия агентов (Рис. 29, Рис. 30). Обнаружено, что культивирование трансформантов на среде без ростовых факторов уменьшает число живых клеток, способных дать потомство в клональном посеве, минимум в два раза по сравнению с клетками, культивируемыми в нормальных условиях (среда + 10 % сыворотки). В экспериментах, где в среду без сыворотки был добавлен инсулин, ИФР-1 или дибутирил-цАМФ, в указанных концентрациях, способность клеток давать жизнеспособное потомство восстанавливалась.

186Рис. 29. Антиапоптотическое действие инсулина (107М), ИФР-1 (10" 8 М), и дибутирил-цАМФ (10"9 М), на клоногенную выживаемость культуры клеток линии Е1 А+сНа-гав.

1- клонирование клеток на среде, содержащей 10% сыворотку (принято за 100%); 2 - клонирование клеток на среде содержащей 0,5% сыворотку в течение 24 часов - 43,9% от контроля; 3, 4, 5 - клонирование клеток на среде содержащей 0,5% сыворотку в течение 24 часов в присутствии инсулина 76,7% от контроля (3), ИФР 1 66,7% от контроля (4), дибутирил-цАМФ 66,0% от контроля (5).

1,6- контроль, 2, 7 - 0,5 % сыворотки, 3,8-0,5% сыворотки + инсулин, 4, 9 - 0,5% сыворотки+ ифр, 5, 10 - 0,5% сыворотки +цАМФ-дибугират7 ЯРис. 30. Антиапоптотическое действие инсулина (10 М), ИФР-1 (10" М),и дибутирил-цАМФ (10"9 М), на клоногенную выживаемость культуры клеток линии Е1А+сНа-газ через 24 и 48 часов культивированияИсходя из обнаруженного нами аденилатциклазного сигнального механизма действия пептидов инсулиновой природы, включающего следующую сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа => Gi-белок ф-у) =>фосфатидилинозитол-3-киназа => протеинкиназа CÇ => Gg-белок =>аденилатциклаза (АД) => цАМФ => протеинкиназа А (Перцева и др., 1995; Pertseva et al., 1995, 1996; Kuznetsova et al., 1999; Plesneva et al., 2001; Шпаков и др., 2002; Pertseva et al., 2003), можно предположить, что этот механизм играет ключевую роль в регуляции пептидами инсулинового суперсемейства фундаментальных клеточных процессов: пролиферации, апоптоза, метаболизма (Плеснева и др., 1998; 1999; 2003; Перцева, 2000).

Показано, что только 43% культуры клеток «выживают» в условиях, когда клетки впадают в апоптоз (среда +0.5% сыворотки) по сравнению с контролем (среда+10% сыворотка, принято за 100%). В экспериментах, когда в среду с 0,5% сывороткой был добавлен инсулин, ИФР-1 или дибутирил-цАМФ в указанных выше концентрациях, способность клеток давать жизнеспособное потомство восстанавливалась до значений, составляющих около 70% (для инсулина: 77%, для ИФР-1: 67%, для дибутирил цАМФ: 66% по сравнению с контролем, принятым за 100%).

Таким образом, эксперименты показали способность инсулина и ИФР-1 через, обнаруженный нами, АЦ сигнальный механизм и продуцируемый им цАМФ, оказывать митогенное и антиапоптотическое действие в клеточных культурах.

Исследования подтверждают участие АЦ сигнального механизма в реализации антиапоптотического действия пептидов инсулинового ряда -инсулина и ИФР-1Таким образом, впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие об участии АЦ сигнального механизма и цАМФ как посредника в антиапоптотическом действии пептидов инсулиновой природы. На это указывают и данные литературы о вовлеченности в этот регуляторный эффект инсулина и ИФР-1 компонентов АЦ сигнального механизма, идентифицированных нами: рецептора тирозинкиназного типа, фосфатидилинозитол-3-киназы (КиПк е1 а1., 1997) и цАМФ-зависимой протеинкиназы (РагуаАепаш е1;. а1., 1998). Следовательно, выдвигаемая нами оригинальная гипотеза о вовлеченности нового АЦСМ действия инсулина и родственных пептидов в регуляцию такого фундаментального процесса, как апоптоз (Перцева, 2000; Плеснева и др., 2003), находит в настоящем исследовании экспериментальное обоснование (Плеснева и др., 1998; 1999; 2003). Однако необходимы дальнейшие исследования для более глубокого понимания молекулярных механизмов антиапоптотического действия пептидов инсулинового суперсемейства.

Влияние инсулина на активность глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы и гликогенсинтетазы в мышечных тканях крыс, цыплят и моллюсков.

Для выяснения вопроса, являются ли Г6ФДГ и ГС в мышцах животных различного филогенетического уровня мишенью действияинсулина было предпринято сравнительное изучение эффектов этих пептидов на активность исследуемых ферментов как в классических тканях-мишенях для инсулина у позвоночных - скелетные мышцы крыс, цыплят, так и у беспозвоночных - в мышце ноги пресноводного моллюска Anodonta cygnea. Цель настоящей работы заключалась в выявлении сходства или отличия в регуляторном действии инсулина на активность ферментов, участвующих как в ростовых и метаболических процессах (Г6ФДГ), так и только метаболических - синтез гликогена (ГС). Конкретные задачи работы состояли в следующем: 1) сравнить активность изучаемых ферментов в мышечных тканях у животных различного филогенетического уровня; 2) сравнить регуляторное влияние инсулина на активность Г6ФДГ и ГС в мышечных тканях разных животных. Активность Г6ФДГ в мышцах животных в условиях действия инсулина in vitro. Активность Г6ФДГ существенно отличается у различных видов животных (таблица 25). Низкая активность фермента обнаружена в мышечной ткани крыс как в нашей работе (таблица 25), так и в литературе (Кузнецова, 1998). Более высокая активность Г6ФДГ выявлена в мышцах у цыплят. В настоящей работе, как и в другом исследовании (Кузнецова, 1998 а,б), активность Г6ФДГ у анодонты в мышцах, взятых с октября по март, была высока и мало изменялась (колебания активности фермента были в пределах 19-24 мкмоль НАДФН/мин/мг белка).

Обнаружено дозозависимое активирующее влияние инсулина in vitro на активность Г6ФДГ в мышцах всех изученных нами животных (таблица 25).

Таблица 25. Влияние in vitro инсулина на активность Г6ФДГ в мышцах крысы, цыпленка и моллюска Anodonta cygnea.

Условия Активность Г6ФДГ (мкмоль НАДФН / мг белка / мин) Инсулин, М Крыса Цыпленок МоллюскКонтроль 0.80±0.03 2.14±0.06 21.70±0.65ю-11 1.10±0.1* 5.20+0.11* Ю"10 1.77±0.4* 7.85±0.13* 22.55+1.0910"у 1.60+0.3* 3.88±0.6* 24.61±1.52*10"8 0.89±0.02 3.35±0.09* 37.54±1.09*ю-7 0.80±0.03 2.55±0.11 26.47±0.87*Звездочкой отмечены достоверные изменения активности Г6ФДГ по сравнению с контрольными величинами, р<0.05.

Отчетливый эффект инсулина был выявлен при низких концентрациях (10"и М) и достигал максимума при 10"10 М, стимулируяактивность фермента в мышцах крыс на 125%, а цыплят - на 270%. При повышении концентрации инсулина его действие ослабевало. В мышцах моллюсков инсулин оказывал максимальный стимулирующий эффекто 7(+70%) при концентрации 10" М (таблица 25), а при концентрации 10"'М эффект инсулина снижался.

Таким образом, сравнительные исследования активирующего влияния инсулина на активность Г6ФДГ мышц изученных животных показали, что чувствительность фермента к инсулину самая высокая в скелетных мышцах цыплят, величина эффекта пептида несколько ниже в скелетных мышцах крыс при физиологической его концентрации а у моллюсков как эффект инсулина, так и его оптимальная концентрация были существенно ниже. Из полученных данных следует, что отчетливое влияние инсулина на активность Г6ФДГ в мышечных мембранах моллюска выявляется при более высокой дозе инсулина, чем у млекопитающих и птиц. Это можно объяснить тем, что у моллюска A.cygnea рецепторы к инсулину не обнаружены (Лейбуш, Чистякова, 2003), а эффект инсулина может реализовываться через ИФР-1-подобные рецепторы или рецепторы ИПП моллюска, которые способны опосредовать активирующее влияние инсулина на Г6ФДГ (Кузнецова, 1998 а,б). Кроме того следует подчеркнуть, что активность фермента на порядок выше по сравнению с активностью его у млекопитающих и птиц, что согласуется с данными литературы и собственными результатами исвидетельствует о важности ПФП в тканях беспозвоночных (Гормосова, Шапиро, 1984; Кузнецова, Плеснева, 2004 а,б,в).

Активность гликогенсинтетазы в мышцах животных при действии инсулина.

В мышечной ткани крыс и цыплят как активность I-формы ГС (таблица 26), так и отношение активной (I-формы) ГС к общей активности фермента было сходно (I/t - 0.45-0.50). В мышцах анодонты активность I-формы фермента была также ниже по сравнению с таковой у высших позвоночных, а величина отношения I/t оставалась сходной (0.5).

Инсулин in vitro увеличивал активность I-формы ГС в мышцах изученных нами животных (таблица 26) и практически не влиял на общую активность фермента. В то же время, максимальная активация 1-формы фермента у разных видов выявлялась при различных концентрациях инсулина. В мышцах крыс максимальный стимулирующий эффектоинсулина на I-форму ГС проявлялся при концентрации 10' М и составлял +75%, а у цыплят и моллюска при дозе 10'9 М прирост активности составлял 110 и 77%, соответственно (таблица 26).

Показано, что in vitro инсулин максимально увеличивает величинуоотношения I/t в мышцах крыс на 90% при концентрации 10" М (таблица 26). Активирующее влияние инсулина на активность I-формы ГС вомышцах моллюска было максимальным (113%) при концентрации 10" М.

Таблица 26. Влияние in vitro инсулина на активность I-формы ГС в мышцах крысы, цыпленка и моллюска Anodonta cygnea.

Условия Активность I-формы ГС (мкмоль НАД / мг белка / мин) Инсулин, М Крыса Цыпленок МоллюскКонтроль 2.85±0.40 (6.40+0.50) 2.23±0.13 (4.50±0.40) 0.88+0.04 (1.80+0.02)ю-10 4.10±0.50* 3.18+0.09* 0.90+0.03*10"9 4.40+0.10* 4.68±0.32* 1.56+0.02*10'8 5.0011.00* 3.54+0.25* 1.05+0.02*В скобках указана общая активность ГС. Звездочкой отмечены достоверные изменения активности ГС по сравнению с контрольными величинами, р<0.05.

Влияние инсулина на активность протеинкиназы АИсследовали активность ПКА в отсутствии и присутствии цАМФ и З-изобутил-1-метилксантина (1ВМХ) в цитоплазме мышечной ткани моллюска анодонты (таблица 27).

Таблица 27. Активность растворимой формы протеинкиназы А в мышцах анодонты.

Активность ПКА * -IBMX +IBMX -цАМФ +цАМФ Отношение -цАМФ к+цАМФ -цАМФ +цАМФ Отношение -цАМФ к +цАМФ16,7±1,8 56,6±4,9 0.295±0.015 20,5±1,9 58,0±5,0 0,353±0,010* - активность ПКА выражена: мкмоль НАД/10 мин/мг белка (в отсутствие цАМФ и в его присутствии) и в виде отношения активности фермента, определяемой в отсутствие цАМФ, к активности, выявленной в присутствии цАМФ.

Показано, что в мышцах анодонты присутствует растворимая форма ПКА. Добавление 1 мМ IBMX - ингибитора активности цАМФ-фосфодиэстеразы приводило к увеличению активности ПКА.

Как показано нами ранее (Pertseva et al., 1995), инсулин in vitro очень быстро (2-5мин) стимулирует активность АЦ в мышцах анодонты. В условиях in vitro инсулин (10"8М) вызывает стимуляцию активности ПКА (Кузнецова, Плеснева, 2001). Добавление ингибитора фосфодиэстеразы усиливало влияние гормона (на 60%).

Помимо опытов in vitro, мы исследовали активность ПКА в опытах in vivo.

Введение инсулина in vivo в дозах 0,3-30 нг/г приводило к сходным изменениям активности АЦ и ПКА (таблица 28).

Таблица 28. Влияние инсулина in vivo (0,3-30 нг/1 г) на активность АЦ и протеинкиназы А в мышцах анодонтыДобавки Показатели АЦ % ПКА %Контроль 23,2±4,1 100 0,33±0.03 100Инсулин (5 мин) Доза инсулина 3 нг/г 48,3±9,3* 208 0,62±0,05* 200ЗОнг/г 44,2±1,7* 190 0,92±0,08* 297Инсулин (20 мин) Доза инсулина 3 нг/г 47,9±7,3* 206 0,82±0,07* 265ЗОнг/г 34,5±6,9* 149 0,78±0,08* 252Активность АЦ выражена в пкмоль цАМФ/мин/мг, а активность ПЬСА выражена в виде отношения активности фермента, определяемой в отсутствие цАМФ, к активности, выявленной в присутствии цАМФ.

Величина эффекта гормона зависела от дозы гормона и времени его действия. В мышцах анодонты инсулин сходно стимулировал активность АЦ и ПКА через 5 мин при дозах 3 и 30 нг/г. Более продолжительное время действия (20 мин) не изменяло степени стимуляции АЦ при дозе 3 нг/г, а более высокие дозы гормона приводили к снижению АЦактивирующего эффекта. В то же время инсулин отчетливо и сходно стимулирует активность ПКА, достоверно увеличивает величины отношения -цАМФ/+цАМФ при дозах 3 и 30 нг/г как через 5, так и 20 мин.

Известно, что ПКА относится к типичным многосубстратным ферментам, играющим интегративную роль в передаче сигнала. Для понимания участия этого фермента в процессе передачи гормонального сигнала важно знать субстраты им фосфорилируемые (Walsh, van Patten, 1994). В качестве примера можно привести изученные нами ранее в мышцах анодонты фосфорилазу, гликогенсинтетазу (ГС) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (Г6ФДГ) (Кузнецова, Шарова, 1997; Кузнецова, 1998 а,б).

Несмотря на обнаруженный нами (Pertseva et al., 1995) сигнальный механизм стимуляции АЦ при действии инсулина, ведущий к усилению синтеза цАМФ и активации ПКА, действие гормона, опосредуемое ПКА, не приводит к тем изменениям активности ферментов углеводного обмена, которые вызываются типичными гормонами-стимуляторами АЦ (Кузнецова, Шарова, 1997; Кузнецова, 1998 а,б). Эти данные хорошо согласуются с общеизвестными представлениями об антагонизме между инсулином и катехоламинами или глюкагоном в их действии на углеводный метаболизм. Между тем, направленность регуляторного влияния инсулина на ферменты углеводного метаболизма (ферменты обмена гликогена и пентозофосфатного пути) противоположна эффектамуказанных выше гормонов, действующих через систему АЦ-цАМФ, и выражается в ингибировании фосфорилазной активности и активации ГС и Г6ФДГ (Кузнецова, Шарова, 1997; Кузнецова, 1998 а,б).

Полученные нами данные позволяют предположить, что система АЦ-цАМФ не вовлечена в реализацию указанных метаболических эффектов инсулина. Это заключение подкрепляет выдвинутую Перцевой с соавторами (Pertseva et al., 1995) гипотезу об участии инсулинстимулируемой АЦ сигнальной системы в механизме митогенного (при активации ПКА), а не метаболического действия инсулина. Подтверждение гипотезы получено на культуре клеток Swiss ЗТЗ, где аналоги цАМФ были способны имитировать эффект инсулина (Плеснева и др., 1999). В данном случае можно предположить, что после стимуляции инсулином активности ПКА мышц анодонты, следующим этапом будет транслокация активированной каталитической субъединицы фермента в ядро, фосфорилирование там фактора транскрипции (CREB), индукция экспрессии цАМФ-зависимых генов, что в итоге ведет к стимуляции клеточной пролиферации. Явление транслокации КС ПКА, открытое в 1974 году Коренманом и сотр. (Korenman et al., 1974), было выявлено и другими авторами в гладких мышцах позвоночных (Palmer et al., 1980) и в тканях моллюсков (Cheley et al., 1994).

Гормоны, увеличивающие уровень цАМФ в клетке, приводят к активации цАМФ-зависимой протеинкиназы А (ПКА; НФ 2.7.1.37),которая фосфорилирует мембранные, цитоплазматические и ядерные белки и в том числе ферменты, изменяя при этом ряд физиологических процессов в клетке, в частности, клеточную пролиферацию, дифференцировку и метаболизм. ПКА - это семейство многофункциональных серин/треониновых киназ с широкой субстратной специфичностью. Фермент в неактивном состоянии представляет собой тетрамерный комплекс, состоящий из двух различных типов субъединиц (С): две регуляторные (РС) и две каталитические (КС). Каждая РС имеет два цАМФ-связывающих центра и на 1Ч-конце - два участка, взаимодействующие со гидрофобным сайтом каталитических субъединиц, которые не активны, когда связаны с РС. При взаимодействии четырех молекул цАМФ с ПКА она диссоциирует на две РС и две КС. цАМФ, связанный с РС, вызывает в них конформационные изменения и снижает их сродство к КС почти в 10000 раз. Свободные КС становятся способными катализировать реакцию переноса у-фосфата с АТФ на фосфорилируемый белок (фосфотрансферазная реакция): 2цАМФ + (РС • КС)2 => РС(цАМФ)2 + 2КСВ тканях позвоночных имеются две ПКА, имеющие разные изоформы РС, которые отличаются по структуре, по способности к автофосфорилированию и по локализации. Широко распространенная изоформа 1 РС локализована преимущественно в цитоплазме, а изоформа 2 связана с внутриклеточными частицами. Реакция автофосфорилирования присуща только изоформе 2 регуляторнойсубъединицы, которая усиливает стимулирующее действие цАМФ на ПКА. В настоящее время выявлены четыре варианта PC (Pia и PIß, P2a и P2ß) и три КС (Ka, Kß и Ку) (Inoue et al., 1997). Как правило, каталитические субъединицы ПКА быстро (минуты) фосфорилируют цитоплазматические ферменты или белки, что приводит к изменению их активности и метаболизма. Наряду с этими эффектами, ПКА может опосредовать и более длительные воздействия (часы), когда активные PC и КС перемещаются в ядро и фосфорилируют фактор транскрипции (CREB-cAMP-response element-binding protein), таким образом влияя на клеточную пролиферацию.

ПКА подробно изучены у позвоночных. Молекулярная масса их отдельных субъединиц составляет 40-50 кДа. Снижение уровня цАМФ в клетке приводит к диссоциации четырех молекул цАМФ от димера PC и последующему его связыванию со свободными КС с образованием неактивного тетрамера. Каталитическая субъединица ПКА при этом инактивируется.

Сведения, касающиеся беспозвоночных, и в частности моллюсков, единичны. Так, выявлено наличие цАМФ-зависимого каскада у морских моллюсков: двустворчатого моллюска - мидии (Mytilus galloprovincialis) (Сао et al., 1996; Rodriguez et al., 1998) и брюхоногого - аплизии (Cheley et al., 1994). Обнаружено присутствие цАМФ-связывающего белка (54 кДа), который может функционировать как регуляторная субъединица ПК-А в тканях мидии. Авторы считают, что она сходна по некоторымпараметрам с изоформой 2 PC млекопитащих: по профилю элюции при хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, по способности образовывать димер и связываться с цАМФ, но имеет и некоторые отличия. Сравнительные исследования свойств регуляторной субъединицы ПКА млекопитающих и мидии выявили структурное отличие их N-конца, который ответственен за димеризацию (Cao et al., 1996; Rodriguez et al., 1998). Это отличие не дает возможности им функционировать при замене одна другой. Представленные данные свидетельствуют о том, что ткани моллюсков наделены активностью ПКА и способны фосфорилировать различные белки у этих животных (Cao et al., 1996; Rodriguez et al., 1998). В то же время гормональная регуляция ПКА у моллюсков практически не изучена.

Исследовалось влияние инсулина на активность аденилатциклазы растворимой изоформы ПКА в мышцах анодонты. Наряду с этим было важно выяснить участие ПКА мышечной ткани анодонты в реализации регуляторного влияния этих гормонов на ферменты углеводного метаболизма, которое было показано нами ранее (Кузнецова, Шарова, 1997; Кузнецова, 1998 а,б).

Аденилатциклазный сигнальный механизм действия инсулина при сахарном диабетеНа основе концепции молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных заболеваний(Перцева, Шпаков, 2004; Перцева и др., 2006) исследовано функционирование АЦ сигнального механизма при экспериментальном стрептозотоциновом сахарном диабете 1-го и 2-го типа у позвоночных (крысы) и диабетоподобном состоянии у беспозвоночных (моллюски).

Диабет вызывали однократным введением (i.p.) стрептозотоцина (80нг/г веса животного). На 30-сут стрептозотоцинового диабета обнаружена гипергликемия в крови крыс, в 4,2 раза превышающая уровень глюкозы у контрольных крыс. Впервые выявлено увеличение уровня глюкозы в гемолимфе моллюсков (в 2,5 раза) на 2-е и 4-е сутки развития диабетоподобного состояния. Обнаружено, что при диабете снижается АЦ-стимулирующее действие инсулина и потенцирование его гуаниновыми нуклеотидами у крыс и у моллюсков.

Инсулин независимый диабет (2-го типа) вызывали введением новорожденным крысятам (1-2 сут) однократно стрептозотоцина (80 нг/г веса животного) (Hemmings, Spafford, 2000). При этом типе диабета также возникают нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина. АЦ стимулирующий эффект инсулина и потенцирование его в присутствии гуаниновых нуклеотидов не проявляется.

При диабете, индуцированным введением стрептозотоцина крысам, было обнаружено в мембранной фракции скелетных мышц крыс снижение (в два и более раз) активации инсулином in vitro АЦ системы на 80-е сутки развития диабета. Потенцирующий эффект ГИДФ, который, как известно, усиливает АЦ-активирующее действие гормонов,на 80-е сутки диабета практически исчезал. В то же время, на 180-е сутки развития стрептозотоцинового диабета функциональные нарушения в инсулин-компетентных АЦ сигнальных механизмах были выражены слабее, что указывает на тенденцию к восстановлению этих показателей в сторону контроля. Это восстановление функций гормональных сигнальных систем особенно выражено в присутствии ГИДФ.

Стимулирующее АЦ эффекты негормональных агентов, используемых как тесты функционального состояния в белков (ЫаБ, ГИДФ) в скелетных мышцах уменьшались незначительно как на 80-е, так и на 180-е сутки развития диабета.

Применение пептидной стратегии в изучении функциональных дефектов в гормоно-компетентных АЦ сигнальных системах при стрептозотоциновом диабете (Перцева, 2005; Шпаков и др., 2006) позволило выявить, что, в условиях стрептозотоцинового диабета величина стимулирующих АЦ эффектов гормонов инсулиновой природы снижалась.

Исследование функционального состояния АЦ сигнального механизма действия различных гормонов, включающих пептиды инсулинового суперсемейства (инсулин, ИФР-1), биогенные амины (изопротеренол, серотонин) выявило ряд нарушений в работе этих сигнальных механизмов при диабете. Как установлено, многие из этих дефектов локализованы в сигнальных блоках, общих для всех изученных АЦ сигнальных систем (Нас^юог^ап^пои еХ а1., 1988; ВшИАеШ е1 а1., 1990;Livingstone et al., 1991; Palmer et al., 1992; Fu et al., 1994; Gando et al., 1997; Hashim, Anand-Srivastava, 2006; Hashim et al., 2002; 2004; Shpakov et al., 2006; Шпаков и др. 2005; 2007).

В случае трехкомпонентного АЦ сигнального механизма, осуществляющего влияние на АЦ, через рецепторы серпантинного типа (изопротеренол, серотонин), при диабете нарушается функциональное сопряжение рецепторов серпантинного типа с гетеротримерными G-белками, как стимулирующего, так и ингибирующего типов. На это указывают, наши данные о снижении чувствительности АЦ к действию гормонов, стимулирующих активность фермента (изопротеренол у крыс, серотонин у моллюсков). В пользу нарушения функционального взаимодействия рецепторов с G-белками указывают и полученные нами ранее результаты о снижении стимулирующего влияния гормонов на уровень ГТФ-связывания гетеротримерных G-белков при применении действия С-концевых пептидов а-субъединиц G-белков, для исследования функционального взаимодействия рецепторов с G-белками в норме и при стрептозотоциновом диабете (Шпаков и др., 2003; 2004). Обнаружено, что в тканях диабетических животных влияние С-концевого пептида 385-394 as на передачу стимулирующих АЦ сигналов, и влияние С-концевого пептида 346-355 ai2 на передачу ингибирующих АЦ сигналов в значительной степени снижено, что свидетельствует об изначальном ослаблении взаимодействия между активированным гормоном рецептороми G-белком в условиях использования модели стрептозотоцинового диабета у крыс.

Полученные нами данные согласуются с исследованиями других авторов (Pilora et al., 2994), которые показали, что при диабете нарушаются функции G¡ белка и снижается его экспрессия в различных тканях. Снижение функциональной активности Gj-белков отмечено при диабете 1 -го и 2-го типов как на экспериментальных его моделях, так и у человека.

На роль нарушений функции Gj-белков в патогенезе диабета указывают следующие данные. Во-первых, нокаут гена, кодирующего ai2-субъединицу, вызывает состояние, сходное с диабетом 2-го типа, и, во-вторых, экспрессия перманентно активированных форм а^-субъединицы у крыс со стрептозотоциновым диабетом 1-го типа улучшает их состояние и облегчает течение заболевания (Zheng et al., 1998). Поскольку экспрессия Gs-белков при диабете либо не меняется, либо возрастает (Gando et al., 1997; Hashim et al., 2002, 2004, 2006; Weber et al., 1997; Wichelhaus et al., 1994) то ослабление передачи стимулирующего АЦ сигнала связано с нарушением функционального сопряжения рецептора с Gs-белком и последнего с АЦ при этом заболевании.

В случае шестикомпонентных АЦ сигнальных механизмов, характерных для пептидов инсулнового суперсемейства в скелетных мышцах крыс основные нарушения локализованы на уровне сопряжения Gs-белка с АЦ, на что указывает ослабление стимулирующего влияниягормонов ннсулнновой группы на активность АЦ, а также исчезновение потенцирующего влияния ГИДФ на АЦ эффекты гормонов, свидетельствующее о нарушении взаимодействия О-белков и других сигнальных блоков инсулин АЦСМ в регуляции активности АЦ. В пользу ослабления функции 05-белков свидетельствуют и полученные нами данные о снижении при диабете стимулирующего АЦ влияния негормональных регуляторов гетеротримерных О-белков - N8? и ГИДФ.

Необходимо отметить, что при диабете 1-го типа в мышечных тканях крыс и человека нами ранее были выявлены функциональные дефекты в АЦ сигнальном механизме действия инсулина, ИФР-1 и биогенных аминов, сходные с обнаруженными при диабете 2-го типа (Кузнецова и др., 2004 а,б,в; 2007; Шпаков и др„ 2005 а,б). Выявленные при инсулин-зависимом диабете нарушения также локализовались на уровне 08 белка и его сопряжения с АЦ и это, несмотря на известные различия в генезе диабета 1-го и 2-го типов и в патогенетических факторах, их вызывающих.

Таким образом, в настоящей работе впервые установлено, что функциональные нарушения в АЦ сигнальном механизме действия гормонов при стрептозотоциновом диабете носят системный характер, охватывая целую группу гормонов инсулинового суперсемейства и биогенные амины, их цАМФ-зависимые сигнальные механизмы. На основе полученных результатов сделан вывод о том, что обнаруженные нарушения сигнал-проводящих функций АЦ сигнальный механизмдействия инсулина и других изученных гормонов могут являться, согласно концепции авторов (Перцева, Шпаков, 2004), ключевыми молекулярными причинами развития сахарного диабета, имеющего, таким образом, полигормональный генез.

Таблица 29. Влияние in vitro активаторов АЦ в скелетных мышцах крыс в условиях стрептозотоцинового диабета (80 и 180 суток)Активность АЦ, пмоль цАМФ /мин/ мг белка Контроль Диабет, 80 сут Диабет, 180 сутБазальная 19.3+1.1 30.2+2.9 21.9+1.7ГИДФ, 10'5М 36.9+2.0 (+91 %) 52.9+ 4.0(+75 %) 34.6+2.6(+58%)NaF, 10"2М 382+25(+1879 %) 501+46(+1559 %) 375±27(+1612 %)Примечание. В скобках приведены стимулирующие эффекты ГИДФ и в процентах по отношению к базальной активности АЦ, принятой за 100 %.

На основании полученных данных выявлены функциональные дефекты в АЦ сигнальном механизме действия инсулина при диабете, в мышцах крыс и моллюсков, затрагивающие дистальные звенья АЦ сигнального механизма на уровне каталитического компонента - АЦ, Ов-белка и его сопряжения с АЦ.

208ЗАКЛЮЧЕНИЕНастоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных.

Данные, имеющиеся в литературе и полученные нами, дали основание для постулирования участия АЦ сигнального механизма и цАМФ в митогенном действии пептидов инсулинового суперсемейства. Из нашей гипотезы следует, что митогенное действие пептидов инсулинового суперсемейства, вовлекающее АЦ сигнальный механизм, реализуется через цепь сигнальных событий, представленных на схеме.

Схема. Действие пептидов исулинового суперсемейства на фундаментальные клеточные процессыИнсулин

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Плеснёва, Светлана Александровна

ВЫВОДЫ

1. В мышечных тканях представителей позвоночных (крысы) и беспозвоночных (моллюски) животных обнаружена чувствительная к влиянию пептидов инсулиноподобного суперсемейства АЦС. Инсулин,

ИФР-1 и ИПП моллюска оказывают ГТФ-зависимое активирующее действие на АЦ. АДФ-рибозилирование бактериальными токсинами позволило выявить участие G-белков как ингибирующего (Gi-белок), так и стимулирующего (Gs-белок) типов в АЦ сигнальном механизме действия изученных пептидов.

2. Установлено участие рецепторов тирозинкиназного типа, в активирующем действии инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска на АЦС, ведущим к образованию внутриклеточного посредника - цАМФ. Показано, что селективные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ -тирфостин 47 и генистеин, блокируют активирующее действие исследуемых пептидов на АЦ в мышцах позвоночных и беспозвоночных.

3. Выявлено участие фосфатидилинозитол-3 киназы в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства, на что указывает блокирование активирующего влияния пептидов инсулиновой природы на АЦ в присутствии специфического ингибитор ФИ-З-К - вортманнина.

4. Установлено участие протеинкиназы ПКС^, идентифицированной с помощью моноклональных антител, в реализации АЦ стимулирующего действия пептидов нсулинового суперсемейства в мышечных тканях позвоночных.

5. На основе совокупности полученных данных, сделан вывод о существовании в клетках позвоночных ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина и ИФР I, включающего

216 сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа => Оьбелокфу-димер) => фосфатидилинозитол-3-киназа => ПКС<^ => вэ-белок => аденилатцикпаза. Сходный механизм обнаружен в мышцах моллюска Апоёог^а cygnea, отличающийся только изоформой ПКС.

6. Экспериментально подтверждена гипотеза о важной роли АЦ сигнального механизма в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на фундаментальные клеточные процессы. Показана их способность стимулировать клеточный рост (в культуре клеток ЗуюбзЗТЗ) и ингибировать апоптоз (в культуре клеток Е1 А+сНа-гаэ).

7. Обнаружение АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства в тканях-мишенях у представителей как позвоночных, так и беспозвоночных животных, а также сходство в его структурно-функциональной организации указывает на консервативность этого сигнального механизма в эволюции.

8. При эндокринной патологии (сахарном диабете 1-го и 2-го типов) у человека, а также у экспериментальных животных (позвоночных и беспозвоночных) при стрептозотоциновой модели диабета обнаружены функциональные нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1, локализованные в основном на уровне О-белка и его сопряжения с АЦ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных.

Данные, имеющиеся в литературе и полученные нами, дали основание для постулирования участия АЦ сигнального механизма и цАМФ в митогенном действии пептидов инсулинового суперсемейства. Из нашей гипотезы следует, что митогенное действие пептидов инсулинового суперсемейства, вовлекающее АЦ сигнальный механизм, реализуется через цепь сигнальных событий, представленных на схеме.

Схема. Действие пептидов исулинового суперсемейства на фундаментальные клеточные процессы

Инсулин

Рецептор-тирозинкиназа

Мембрана

Протеинфосфатазы

Клеточный рост (+)

Метаболизм (-)

Ц-АМФ, генерированный в АЦ сигнальном механизме, активирует цАМФ-зависимую протеинкиназу А, в результате происходит диссоциация субъединиц фермента. Активированная каталитическая субъединица перемещается в ядро, чтобы фосфорилировать и активировать фактор транскрипции (названный как GREB - сАМР-responsive element-binding protein). Последний, индуцирует экспрессию цАМФ-зависимых генов, что приводит к стимуляции клеточной пролиферации. Имеются основания предположить, что этот цАМФ-зависимый митогенный путь вовлекается в «cross talk» с основными митогенными путями, вовлекаемыми в каскад митоген-активируемых протеинкиназ (МАПК), запускаемых через рецептор тирозинкиназного типа. Взаимодействие может быть реализовано при участии (Зу-субъединиц G-белков и ц-АМФ, который формируется в процессе трансдукции митогенного сигнала через АЦ систему (Gutkind et al., 1998).

Эти данные расширяют современные представления о круге сигнальных путей действия пептидов инсулинового суперсемейства и способствуют формированию нового позитивного взгляда на вовлеченность АЦ сигнального механизма в действие гормонов и ростовых факторов инсулиновой природы, осуществляемого через рецепторы тирозинкиназного типа (Fantl et al., 1993; Plesneva et al., 2001; Pertseva et al., 2003; Плеснева и др. 2001). До наших исследований в литературе существовала точка зрения об участии АЦ сигнального механизма только в действии гормонов, обладающих рецепторами серпантинного типа.

Важными представляются доказательства, полученные в работе, о распространенности обнаруженного АЦ сигнального механизма действия изученных пептидов в тканях как позвоночных, так и беспозвоночных животных (Plesneva et al., 1994; 2001; Kuznetsova et al., 1999; 2001; 2003; 2005; Pilora et al., 2004). Установлена принципиально сходная структурно-функциональная организация инсулин-, ИФР-1- и ИПП-компетентной АЦ сигнальных систем. На современном этапе наших исследований она представлена в клетке шестикомпонентным сигнальным каскадом: рецептор-тирозинкиназа => Gi-белок (ßy-димер) => фосфатидилинозитол-3-киназа протеинкиназа С С, => Gs-белок => аденилатциклаза. АЦ сигнальный механизм охватывает стадии от рецептора тирозинкиназного типа до фермента - АЦ, являющейся генератором вторичного внутриклеточного посредника - цАМФ. Образовавшийся цАМФ способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы "А" передавать гормональный сигнал к различным эффекторным системам (Кузнецова, Плеснева, 2001).

Открытый нами АЦ сигнальный механизм действия пептидов инсулиновой природы по своей структурно-функциональной организации наряду со сходством, обладает и существенными отличиями от известных до сих пор гормональных АЦ сигнальных систем (Bullesbach et al., 1992; Hunter, 1995; Samiei, 1995; Hughes et al., 1997). Эти отличия сводятся:

- во-первых, к участию в одном АЦ сигнальном механизме сразу дух типов гетеротримерных G-белков (Gs и Gi), которые обычно вовлечены в разные сигнальные системы;

- во-вторых, к взаимодействию рецепторов тирозинкиназного типа, специфичных для гормонов инсулиновой группы с Gi-белком, выступающим в качестве донора Ру субъединиц, а не ai-субъединицы как во многих других сигнальных системах.

- в-третьих, к большему числу, составляющих его блоков (шесть компонентов, во всяком случае) по сравнению с трехкомпонентным АЦ сигнальным механизмом действия биогенных аминов (рецептор серпантинного типа => Gs или Gi-белок => АЦ);

За период, прошедший со времени обнаружения нами АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства (Plesneva et.al., 1994; Kuznetsova et al., 1999; Plesneva et al., 2001; Плеснева и др., 2000; 2001) в литературе появились данные, касающиеся отдельных его сигнальных блоков, подтверждающие установленную нами структурно-функциональную организацию этого АЦ сигнального механизма (Bryant-Greenwood? Schwabe, 1994). Так показано, что рецепторы инсулина и ИФР-1 функционально сопряжены с Gi-белком (Budd et al., 1986; Kuemmerle, Murthy, 2001; Dupont et al., 2003; Kreuzer et al., 2004). Также установлено участие ФИ-З-К и ПКС^ и связь их с продукцией цАМФ в ряде сигнальных путей действия пептидов инсулинового суперсемейства (Nguyen, Dessauer, 2003; Шпаков и др., 2005 а,б; 2004).

В плане изучения спектра функций, обнаруженного нами АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, установлено его участие в реализации регуляторного действия пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы, как клеточный рост (стимуляция) (Плеснева и др., 1999) и апоптоз (ингибирование) (Плеснева и др., 2003), способствующие в итоге выживанию клетки.

Таким образом, выдвинутая нами гипотеза (Перцева, 2000) о важной роли АЦ сигнального механизма в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на жизненно-важные клеточные процессы - клеточный рост, апоптоз нашла подтверждение (Aizenman, Vellis, 1987; Плеснева и др., 1999; Плеснева и др., 2003).

Основываясь на эволюционном подходе JI.A. Орбели ко всем изучаемым явлениям (Орбели, 1958) мы использовали комплекс методов эволюционной физиологии применительно к изучению биохимических систем организма. Исследование включало несколько аспектов: а) изучение трех эволюционно родственных пептидов инсулинового суперсемейства - инсулина и ИФР-1 позвоночных, а также ИНН беспозвоночных (моллюска Anodonta cygnea); б) изучение действия этих пептидов на АЦС в тканях-мишенях животных разного филогенетического уровня (позвоночные - млекопитающие и птицы; а также беспозвоночные - моллюск Anodonta cygnea); в) часть исследований птицы) проведена в онтогенезе; г) исследованы АЦ сигнальные механизмы действия пептидов инсулинового суперсемейства и выявлены функциональные нарушения в них при патологии - сахарном диабете.

В плане развиваемой в лаборатории концепции (Перцева, Шпаков, 2004) молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных заболеваний проведено исследование функциональных нарушений в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1, возникающих при сахарном диабете. Впервые обнаружены дефекты в этом сигнальном механизме на уровне каталитического компонента - АЦ, вв-белка и его сопряжения с АЦ, а также ослабление регуляторных метаболических эффектов гормона у крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом 1-го и 2-го типов.

Использование эволюционного подхода позволило выявить не только существование АЦ сигнального механизма действия ряда пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных, но и обнаружить принципиальное сходство в его структурно-функциональной организации, свидетельствующее об эволюционной консервативности этой сигнальной системы

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Плеснёва, Светлана Александровна, Санкт-Петербург

1. Баркан P.C., Бондарева В.М., Русаков Ю.И. 1992. Митогенное влияние инсулина, выделенного из мозга млекопитающих, на клетки Swiss3T3 //Цитология. Т. 34. С. 84-89.

2. Баркан P.C., Никольский H.H. 1985. Минимально трансформированные клеточные линии Swiss3T3 как объект исследования механизмов пролиферации // Цитология, Т. 27. С. 5-27.

3. Бондарева В.М., Лейбсон Л.Г. 1970. Влияние антиинсулиновой сыворотки на содержание сахара в крови у куриных эмбрионов // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 6. С. 246-251.

4. Гормосова С.А., Шапиро А.З. 1984. Основные черты биохимии энергетического обмена мидий. М. 502с.

5. Деркач К.В., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. 1997. Онтогенетический подход в изучении стимулирующего влияния инсулина на активность аденилациклазы и его роль в регуляторном действии гормона // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 33. С. 131-137.

6. Заварзин Л.А. Основы частной цитологии и сравнительной гистологии многоклеточных животных. 1976. М. Наука. 390с.

7. Кузнецова Л.А. 1998а. Гормональная регуляция активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы в мышечной ткани моллюска Anodonta cygnea. 1. Влияние биогенных аминов // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 34. С. 277-286.

8. Кузнецова JI.А. 19986. Гормональная регуляция активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в мышечной ткани моллюска Anodonta cygnea. 2. Влияние инсулина и глюкагона // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 34. С. 287-295.

9. Кузнецова Л. А. 2002. Регуляторные свойства изоформ аденилатциклаз // Журн. эвол. биохим. физиол., Т.38. №4. С. 289-304.

10. Кузнецова Л.А., Плеснева С.А. 2001. Влияние биогенных аминов и полипептидных гормонов на активность протеинкиназы А и аденилатциклазы в мышцах моллюска Anodonta cygnea // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 37. С. 395-400.

11. Кузнецова Л. А., Шарова Т.С. 1997. Влияние биогенных аминов, глюкагона и инсулина на активность гликогенсинтетазы и фосфорилазы в мышечной ткани моллюска АпоёоМа cygnea // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 33. С. 421-430.

12. Лейбсон Л.Г., Плисецкая Э.М., Бондарева В.М. 1974. Влияние инсулина на гликогенсинтетазную активность мышц куриных эмбрионов и цыплят раннего возраста // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 10. С. 433-439.

13. Лейбуш Б.Н. 1998. Рецепторы инсулина и инсулино-подобного фактора роста 1: пути структурной и функциональной дивергенции двух эволюционно связанных молекул // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 34. С. 62-71.

14. Лейбуш Б.Н., Чистякова О.В. 2003. Рецептор инсулино-подобного фактора роста 1 в тканях моллюска Апос1оп1а cygnea // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 39. С. 128-133.

15. Лызлова С.Н. 1981 Некоторые аспекты энергетического обеспечения развивающихся мышц // Проблемы миогенеза. JI. Наука. С. 115-127.

16. Никольский H.H., Соркин А. Д., Сорокин А.Б. 1987. Эпидермальный фактор роста. Л.: Наука. 200 с.

17. Орбели Л.А. 1958. Основные задачи и методы эволюционной физиологии // Эволюция функций нервной системы. Л.

18. Петрова Т. А., Лызлова С.Н. 1985. Оптимизация условий определения креатинкиназы колориметрическим методом // Вестник ЛГУ. Т. 24. С. 88-90.

19. Перцева М.Н. 1989. Молекулярные основы развития гормонокомпетентности. Л. Наука. 251с.

20. Перцева М.Н. 1999. Вклад эволюционной эндокринологии в изучение структуры и механизма действия инсулина // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 35., С. 233-240.

21. Перцева М.Н. 2006. Развитие эволюционной биомедицины как нового направления в биологической науке // Журн. Эвол. Биохим. физиол. Т. 42. № 5. С. 401-408.

22. Перцева М.Н., Плеснева С.А., Шпаков А.О., Русаков Ю.И., Кузнецова Л.А. 1995. Новые данные, свидетельствующие об участии аденилатциклазной системы в механизме действия инсулина и родственных пептидов // Доклады Академии наук. Т. 342. С. 410-412.

23. Перцева М.Н., Шпаков А.О. 2002. Консервативность инсулиновой сигнальной системы в эволюции беспозвоночных и позвоночных животных // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 38. № 5. С. 430-441.

24. Перцева М.Н., Шпаков А.О. 2004. Концепция молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как причин эндокринных заболеваний // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. Т. 90. С. 446-447.

25. Перцева М.Н., Шпаков А.О., Плеснева С.А. 1996 Современные достижения в изучении сигнальных механизмов действия инсулина и родственных ему пептидов // Журн. эвол. биохим. физиол., 1996. Т. 32. С. 318-340.

26. Пинаев Г.П. 1981 Синтез специфических сократительных белков как биохимическая основа дифференцировки миогенных клеток // В Сб.: Проблемы миогенеза. Л: Наука. С. 75-97.

27. Плеснёва С. А. 1983. Формирование в онтогенезе системы циклического аденозинмонофосфата как посредника действия катехоламинов в скелетной мышце. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Л.

28. Плеснева С.А., Баркан P.C., Решетникова Г.Ф., Кузнецова Л.А., Перцева М.Н. 1999. Аденилатциклазный сигнальный механизм в митогенном действии инсулина, инсулиноподобного и эпидермального факторов роста // Доклады Академии наук. Т. 368. С. 833-838.

29. Плеснева С.А., Кузнецова JI.A., Омельянюк Е.В., Шпаков А.О., Перцева М.Н. 2000. Аденилатциклазный сигнальный механизм действия релаксина // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 36. С. 562-568.

30. Рольник B.B. Биология эмбрионального развития птиц. 1968. JI. Наука. 425 с.

31. Русаков Ю.И., Бондарева В.М., Карасев B.C., Лейбуш Б.Н., Баркан P.C., Перцева М.Н. 1991. Некоторые биохимические характеристики инсулиноподобного вещества двустворчатого моллюска Anodonta cygnea // Биохимия. Т.56. С. 718-726.

32. Русаков Ю.И., Колычев А.П., Шипилов В.Н., Бондарева В.М. 2004. Очистка и лиганд-рецепторный анализ инсулиноподобных пептидов педального ганглия моллюска Anodonta cygnea // Цитология. Т. 46. С. 442-447.

33. Скоробовичук Н.Ф. Нервно-мышечный аппарат моллюсков. 1974. // В кн. "Развитие сократительной функции мышц двигательного аппарата" Л. Наука. С. 156-192.

34. Соколов И.Н. 1975. Креатинкиназа в развивающейся монослойной культуре куриных миобластов. Автореферат канд диссертации. Л.

35. Телкова И.Л. Молекулярно-клеточные эффекты инсулина и возможные механизмы развития инсулинорезистентности у больных ишемической болезнью сердца. 2005. // Успехи физиологических наук, Т. 36, № 2, С. 55-65.

36. Ткачук В.А. Введение в молекулярную эндокринологию. 1983. Издательство МГУ. 256с.

37. Ткачук В.А. Рецепция и внутриклеточная сигнализация. 2007. В книге «Современный курс классической физиологии» (избранные лекции), ред. Наточин Ю.В., Ткачук В.А., Москва, «ГЭОТАР-Медиа», С. 325-348.

38. Ткачук В.А., Балденков Г.Н. 1978. Выделение, очистка и характеристика регуляторных свойств аденилатциклазы сердца кролика // Биохимия. Т. 43. С. 1097-1110.

39. Филлипович Ю.В., Кутузова Н.М. 1985. Гормональная регуляция метаболизма у насекомых // В кн.: Основные результаты в области науки и технологий (ред. Михайлов А.И.). Серия биологическая химия., Т. 21, ВИНИТИ, Москва, С. 226.

40. Шпаков А.О. 1999. Структурно-функциональная характеристика гетеротримерных фосфатидилинозитол-3-киназ и молекулярные механизмы их сопряжения с другими компонентами сигнальных систем //Цитология. Т. 41. № Ц. С. 975-991.

41. Шпаков А.О., Перцева М.Н. 1993. Структурно-функциональная характеристика ГТФ-связывающих белков беспозвоночных животных // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 29., № 5-6., С. 635-653.

42. Шпаков А.О., Перцева М.Н. 2005. Использование пептидной стратегии для изучения молекулярных механизмов передачи гормонального сигнала в клетку // Журн. эвол. биохим. физиол., Т. 41. С. 389-403.

43. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. 20056. Молекулярные механизмы изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы к биогенным аминам при стрептозотоциновом диабете // Бюл. экспер. биол. мед., Т. 140. С. 286290.

44. Шпаков А.О., Плеснева С.А., Кузнецова Л.А., Перцева М.Н. 2002. Исследование функциональной организации нового -аденилатциклазного сигнального механизма действия инсулина // Биохимия. Т. 67. С. 403-412.

45. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. 2005. Молекулярные механизмы изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы к биогенным аминам при стрептозотоциновом диабете // Бюл. экспер. биол. мед., Т. 140. С. 286290.

46. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. 2007. Изменение чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы к биогенным аминам и пептидным гормонам в тканях голодающих крыс //Бюл. эксп. биол. мед., Т. 144. С. 15-19.

47. Adams J.M., Cory S. 1998. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival // Science. V. 281. P. 1322-1326.

48. Aizenman Y., Vellis J. 1987. Brain neurons develop in a srum and glial free environment: effects of transferring, insulin. ILS-1, and thyroid hormone on neuronal survival, growth and differentiation // Brain Res., V. 406. P. 32-42.

49. Alarcon C., Morales A.V., Piementel В., Serna J., de Pablo, F. 1998. (Pro)insulin and insulin-like growth factor-I complementary expression and roles in early development // Сотр. Biochem. Physiol., V. 121.P. 13-17.

50. Alexander-Bridges M., Buggs C., Giere L., Denaro M., Kahn В., White M., Sukhatme U., Nasrin N. 1992. Models of insulin action on metabolic and growth response genes // Mol. Cell. Biochem., V. 109. P. 99-105.

51. Allen D.O., Clark J.B. 1971. Effect of various antilipolytic compounds on adenylyl cyclase and phosphodiesterase activity in isolated fat cells // Adv. Enzyme Regul., V. 9.P. 99-112.

52. Anand-Srivastava M.B., McNeill J.H., Yang X.P. 1995. Reversal of defective G-proteins and adenylyl cyclase/cAMP signal transduction in diabetic rats by vanadyl sulphate therapy // Mol. Cell Biochem,. V. 153. P. 113-119.

53. Aragay A.M., Quick M.W. 1999. Functional regulation of Gal6 by protein kinase C // J. Biol. Chem., 274: 4807-4815.

54. Avignon A., Standaert M.L., Yamada K., Mischak H., Spencer B.,

55. Farese R.V. 1995. Insulin increases mRNA of protein kinase C-a and (3 in ratadipocytes and protein kinase C a, P and 0 in rat skeletal muscle // Biochem.1. J. 308: 181-187.

56. Bartsch O., Bartlick B., Ivell R. 2001. Relaxin signaling links tyrosine phosphorylation to phosphodiesterase and adenylyl cyclase activity // Mol. Human Reproduction. V. 7. P. 799-809.

57. Begum N., Ragolia L. 1996. cAMP counter-regulates insulin-mediated protein phosphatase-2A inactivation in rat skeletal muscle cells // J. Biol. Chem., V. 271. P. 31166-31171.

58. Berg E.A., Wu J.Y., Campbell L., Kagey M., Stapleton S.R. 1995. Insulin-like effects of vanadate and selenate on the expression of glucoses-phosphate dehydrogenase and fatty acid synthase in diabetic rats // Biochimie. V. 77. P. 919-924.

59. Berra E., Diaz-Meco M.T., Dominguez J., Municio M.M., Sanz L., Lozano J., Chapkin R.S., Moscat J. 1993. Protein kinase C zeta isoforms is critical for mitogenic signal transduction // Cell. V. 74. P. 555-563.

60. Berridge M.V., Tan A.S., Hilton C.J. 1993. Cyclic adenosine monophosphate promotes cell survival and retards apoptosis in a factor-dependent bone marrow-derived cell line // Exp. Hematol., V. 21. P. 269276.

61. Bigazzi M., Brandi M.L., Bani G., Sacchi T.B. 1992. Relaxin influences the growth of MCF-7 breast cancer cells. Mitogenic and antimitogenic action depends on peptide concentration // Cancer. V. 70. P. 639-643.

62. Birnbaumer L. 1990. G proteins in signal transduction // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., V. 30. P. 675-705.

63. Blakesley V.A., Scrimgeour A., Esposito D., Le Roith, D. 1996. Signaling via the insulin-like growth factor-I receptor: does it differ from insulin receptor signaling? // Cytokine Growth Factor Rev., V. 7P. 153-159.

64. Brady M.J., Saltiel A.R. 2001. The role of protein phosphatase-1 in insulin action // Recent Prog. Horm. Res., V. 56. P. 157-173.

65. Bryant-Greenwood G.D., Schwabe C. 1994. Human relaxins: chemistry and biology // Endocrinol. Rev., V. 15. P. 5-26.

66. Bullesbach E.E., Gang S., Schwabe C. 1992. The receptor-binding site of human relaxin. II. A dual prong-binding mechanism // J. Biol. Chem., V. 267. P. 22957-22960.

67. Butcher R.W., Baird C.E., Sutherland E.W. 1968. Effect of lipolytic and antilipolytic substances on adenosine 3', 5'-monophosphate levels in isolated fat cells // J. Biol. Chem., V. 243. P. 1705-1712.

68. Butcher R.W., Sneyd J.G.T., Park C.R., Sutherland, E.W.J. 1966. Effect of insulin on adenosine-3',5'-monophosphate in the rat epididymal fat pad // J. Biol. Chem., V. 241. P. 1652-1653.

69. Butcher R.W., Sutherland E.W. 1967. The effect of the catecholamines, adrenergic blocking agents, prostagladin El, and insulin on cyclic AMP levels in the rat epididymal fat pad in vitro // Ann. N.Y. Acad. Sei., Y. 139. P. 849-859.

70. Butler A.A., Yakar S., Gewolb I.H., Karas M., Okubo Y., Le Roith D. 1998. Insulin-like growth factor-I receptor signal transduction: at theinterface between physiology and cell biology // Comp. Biochem. Physiol., V. 121. P. 19-26.

71. Cao J., Fernandez M., Ramos-Martinez J.I., Villamarin J.A. 1996. Identification of Rll-binding proteins in the mollusc Mytilus galloprovincialis // FEBS Lett., V. 382. P. 93-96.

72. Carmena M.J., Garcia-Paramio P., Solano R.M., Prieto G.C. 1995. Protein kinase C regulation of the adenylyl cyclase system in rat prostatic epithelium // Prostate. V. 27. P. 204-211.

73. Chang H.S., Jeon K.W., Kim Y.H., Chung J.G., Park C.S. 2000. Role of cAMP-dependent pathway in eosinophil apoptosis and survival // Cell Immunol, V. 203. P. 29-38.

74. Cheatham B, Kahn C.R. 1995. Insulin action and the insulin signaling network // Endocrinol. Rev, V. 16. P. 117-141.

75. Cheley S, Panchal R.G, Carr D.W. 1994. Type II regulatory subunits of cAMP-dependent protein kinase and their binding proteins in the nervous system of Aplysia californica // J. Biol. Chem, V. 269. P. 2911-2020.

76. Chen Z., Nield H.S., Sun H., Barbier A., Patel J.P. 1995. Expression of type V adenylyl cyclase is required for epidermal growth factor-mediated stimulation of cAMP accumulation // J. Biol. Chem., V. 270. P. 2752527530.

77. Chidiac P. 1998. Rethinking receptor-G protein-effector interactions // Biochem. Pharmacol., V. 55. P. 549-556.

78. Chun S.Y., Eisenhauer K.M., Minami S., Billig H., Perlas E., Hsueh A J. 1996. Hormonal regulation of apoptosis in early antral follicles: follicle-stimulating hormone as a major survival factor // Endocrinology. V. 137. P. 1447-1456.

79. Clapham D.E. 1993. Mutations in G-protein-linked receptors: Novel insights on disease // Cell. Y. 75. P. 1237-1239.

80. Clarke D.W, Boyd F.T., Kappy M.S, Raizada M.K. 1985. Insulin stimulates macromolecular synthesis in cultured glial cells from rat brain // Amer. J. Physiol., V. 249. P. C484-C489.

81. Clark J., Vinicor F., Carr L., Clark C. 1980. Adenylyl cyclase responsiveness to guanyl nucleotides in the developing rat heart // Ped. Res., V. 14. P. 291-295.

82. Cohen P. 1993. Dissection of the protein phosphorylation cascades involved in insulin action//Biochem. Soc. Transact., V. 21. P. 555-567.

83. Cohen P., Frame S. 2001. The renaissance of GSK3. Nature Reviews // Molecular Cell Biology. V. 2. P. 769-776.

84. Combettes-Souverain M., Issad T. 1998. Molecular basis of insulin action // Diabetes Metab., V. 24. P. 477-489.

85. Cronin M.J, Malaska T., Bakhit C. 1987. Human relaxin increases cyclic AMP levels in cultured auterior pituitary cells // Biochem. Biophys. Res. Commun, V. 148. P. 1246-1251.

86. Danielsen A.G., Liu F, Hosomi J., Shii K., Roth R.A. 1995. Activation of protein kinase Ca inhibits signaling by members of insulin receptor family // J. Biol. Chem., Y. 270. P. 21600-21605.

87. Dekker L.V., Parker P.J. 1995. Introduction. Chapter 1 // In: Parker, P.J. and Dekker, L.V. (Eds.) Protein kinase C, Molecular Biology Intelligence Unit, Springer. P. 1-9.

88. Denton R.M., Tavare, J.M. 1995. Does mitogen-activated-protein kinase has a role in insulin action? The cases for and against // Eur. J. Biochem, V. 227. P. 597-611.

89. Draznin B, Chang L, Leitner J.W, Takata Y, Olefsky J.M. 1993. Insulin activates p21 Ras and guanine nucleotide releasing factor in cells expressing wild type and mutant insulin receptors // J. Biol. Chem, V. 268. P. 19998-20001.

90. Dumont J.E, Jauniaux J.-C, Roger P.P. 1989. The cyclic AMP-mediated stimulation of cell proliferation // Trends Biochem. Sci, V. 14. P. 67-71.

91. Dumont J.E., Lamy F., Roger P.P., Maenhaut C. 1992. Physiological and pathological regulation of thyroid cell proliferation and differentiation by thyrotropin and other factors // Physiol. Rev., V. 2. P. 667-697.

92. Dupont J., Dunn S.E, Barrett J.C., Le Roith D. 2003. Microarray analysis and identification of novel molecules involved in insulin-like growth factor-1 receptor signaling and gene expression // Recent Prog. Harm. Res., V. 58. P. 325-342.

93. Ebberink R.H.M., Smit A.B., Van Minnen J. 1989. The insulin family: evolution of structure and function in vertebrates and invertebrates // Biol. Bulletin., V. 177. P. 176-182.

94. Evan G., Littlewood T. 1998. A matter of life and cell death // Science.1. V. 281. P. 1317-1322.

95. Exton J.H., Hardman J.G., Williams T.F., Sutherland E.W., Park C.R. 1971. Effect of guanosine 3'^'-monophosphate on the perfused rat liver // J. Biol. Chem., V. 246. P. 2658-2664.

96. Fain J.N. 1975. Insulin as an activator of cyclic AMP accumulation in rat fat cells // J. Cyclic Nucl. Res., V. 1. P. 359-366.

97. Fain J.N., Rosenberg L. 1972. Antilipolytic action of insulin on fat cells // Diabetes. V. 21. P. 414-425.

98. Fantl W.J., Johnson D.E., Williams L.T. 1993. Signalling by receptor tyrosine kinases // Ann. Rev. Biochem., V. 62. P. 453-481.

99. Froesh E.R., Scmid Chr., Schwander J., Zapf J. 1985. Action of insulin-like growth factors // Ann. Rev. Physiol., V. 47. P. 443-467.

100. Frago L.M., Leon J., de la Rosa E.J., Gomes-Munoz A., Varela-Nieto I. 1998. Nerve growth factor and ceramides modulate all death in the early developing inner ear // J. Cell Science. V. 111. P. 549-556.

101. Fu L.X., Bergh C.H., Liang Q.M., Sjogren K.G., Xu X., Eriksson P., Hoebeke J., Hjalmarson A. 1994. Diabetes-induced changes in the Gi-modulated muscarinic receptor-adenylyl cyclase system in rat myocardium // Pharmacol. Toxicol., V. 75. P 186-193.

102. Garcia-Bermejo L., Perez C., ViaboaN.E., de Bras E., Aller P. 1998. cAMP increasing agents attenuate the generation of apoptosis by etoposide in promonocytic leukemia cells // J. Cell. Science. Y. 111. P. 637-644.

103. Geraerts W.P.M., Smit A.B., Li K.W., Roovers E. 1993. Insulin-related peptides in molluscs: genes, processing, functions and presumed receptors // Proceedings of 12th Int. Congress on Comp. Endocrinology, Toronto, Canada. Abstract, A-53.

104. Goldberg N.D., Villar-Palasi C., Sasko H., Larner J. 1967. Effects of insulin treatment on muscle 3',5'-cyclic adenylate levels in vivo and in vitro // Biochim. Biophys. Acta. V. 148. P. 665-672.

105. Golder M.P., Boyns A.R. 1973. Distribution of adrenocorticotropic hormone-stimulated adenylyl cyclase in the adrenal cortex // J. Endocrinol., V. 56. P. 471-481.

106. Gregoire F.M., Chomiki N., Kachinskas D., Warden C.H. 1998. Cloning and developmental regulation of a novel member of the insulin-like gene family in Caenorhabditis elegans // Biochem. Biophys. Res. Commun., V. 249. P. 385-390.

107. Giudicelli Y., Nordmann J., Nordmann R. 1972. Influence of certain effectors of cyclic AMP metabolism on the action of acetaldehyde, ethanol, and acetate on lipolysis in vitro // C. R. Acad. Sci., V. 274D. P. 3626-3629.

108. Gupta B.B.P. 1997. Mechanism of insulin action // Curr. Science. V. 73. P. 993-1003.

109. Gutkind J.S. 1998. Cell growth control by G protein-coupled receptors: from signal transduction to signal integration // Oncogene. Y. 17, P. 13311342.

110. Hadjiconstantinou M., Qu Z.K., Moroi-Fetters S.E., Neff N.H. 1988. Apparent loss of Gj protein activity in the diabetic retina // Eur. J. Pharmacol., V. 149. P. 193-194.

111. Halse R., Bonavaud M., Armstrong J.L., McCormock J.G., Yeaman S.J. 2001. Control of glycogen synthesis by glucose, glycogen and insulin in cultured human muscle cells // Diabetes. V. 50. P. 720-726.

112. Hashim S., Li J., Anand-Srivastava M. 2006. G-protein-linked cell signaling and cardiovascular functions in diabetes/hyperglycemia // Cell Biochem. Biophys., V. 44. P. 51-64.

113. Hashim S., Li Y., Nagakura A., Takeo S., Anand-Srivastava M.B. 2004. Modulation of G-protein expression and adenylyl cyclase signaling by high glucose in vascular smooth muscle // Cardiovasc. Res., V. 63. P. 709718.

114. Hashim S., Li Y.Y., Wang R., Anand-Srivastava M.B. 2002. Streptozotocin-induced diabetes impairs G-protein linked signal transduction in vascular smooth muscle // Mol. Cell. Biochem., V. 240. P. 57-65.

115. Hedin K.E., Duerson K., Clapham D.E. 1993. Specificity of receptor-G protein interactions: searching for the structure behind the signal // Cell. Signal., V. 5. P. 505-518.

116. Helmreich E.J., Hofmann K.P. 1996. Structure and function of proteins in G-protein-coupled signaling transfer // Biochim. Biophys. Acta. V. 1286. P. 285-322.

117. Hemmings S.J., Spafford D. 2000. Neonatal STZ model of type II diabetes mellitus in the Fischer 344 rat: characteristics and assessment of the status of the hepatic adrenergic receptors // Int. J. Biochem. Cell Biol., V. 32. P. 905-919.

118. Hepp K.D. 1971. Inhibition of glucagon-stimulated adenylyl cyclase by insulin // FEBS Lett., V. 12. P. 263-266.

119. Hepp K.D. 1972. Adenylate cyclase and insulin action. Effect of insulin, nonsupressible insulin-like material, and diabetes on adenylate cyclase // Eur. J. Biochem., V. 31. P. 266-276.

120. Hetenyi G., Singhal R.L. 1973. Effect of insulin on cerebral adenylyl cyclase and phosphodiesterase //Horm. Metab. Res., V. 5. P. 139-141.

121. Heyworth C.M., Wallace A.V., Houslay M.D. 1983. Insulin and glucagons regulate the activation of two distinct membrane bound cyclic AMP phosphodiesterases in hepatocytes //Biochem. J. V. 214. P. 99-110.

122. Houslay M.D. 1985. The insulin receptor and signal generation at the plasma membrane // In: "Molecular mechanisms of transmembrane signaling" (eds. Cohen and Houslay), Elsevier, P. 279-327.

123. Houslay M.D. 1986. Insulin, glucagon and the receptor-mediated control of cyclic AMP concentrations in liver. Twenty-second Colworth medal lecture//Biochem. Soc. Trans., V. 14. P. 183-193.

124. Houslay M.D. 1991 a. Gj-2 is at the centre of an activephosphorylation/dephosphorylation cycle in hepatocytes: The fine-tuning of stimulatory and inhibitory inputs into adenylate cyclase in normal and diabetic states // Cell. Signal., V. 3. P. 1-9.

125. Houslay M.D., Milligan G. 1997. Tailoring cAMP signaling responses through isoform multiplicity // Trends Biochem. Sci., Y. 22. P. 217-224.

126. Hughes S.J., Hollingsworth M., Elliot K.R. 1997. The role of a cAMP-dependent pathway in the uterine relaxant action of relaxin in rats // J. Reprod. Fértil., V. 109. P. 289-296.

127. Jacobowitz O., Chen J., Premont R.T., Iyengar R. 1993. Stimulation of specific types of Gs-stimulated adenylyl cyclases by phorbol ester treatment // J. Biol. Chem., V. 268. P. 3829-3832.

128. Jacobson M.D. 1997. Programmed cell death: a missing link is found // Trends Cell Biol, V. 7. P. 467-469.

129. Jarett L., Steiner A.L., Smith R.M., Kipnis D.M. 1972. The involvement of cyclic AMP in the hormonal regulation of protein synthesis in rat adipocytes // Endocrinology. V. 90. P. 1277-1284.

130. Jones J.L., Clemmons D.R. 1995. Insulin-like growth factors and their binding proteins: biological actions // Endocrine. Rev., V. 16. P. 3-34.

131. Kawabe J.-I., Ebina T., Toya Y., Oka N., Schwencke C., Duzic E. 1996. Regulation of type V adenylyl cyclase by PMA-sensitive and insensitive protein kinase C isoenzymes in intact cells // FEBS Lett., V. 384. P. 273-276.

132. Kawabe J., Iwami G., Ebina T., Ohno S., Katada T., Ueda Y., Homey, C J., Ishikawa Y., 1994. Differential activation of adenylyl cyclase by protein kinase C isoenzymes // J. Biol. Chem., V. 269. P. 16554-16558.

133. Kidwai A.M., Radcliffe A.M., Lee E.V., Daniel E.E. 1973. Isolation and properties of skeletal muscle membrane // Biochim. Biophys. Acta. V. 289. P. 593-607.

134. King G.L., Kahn C.R. 1981. Non-parallel evolution of metabolic and growth-promoting function of insulin // Nature. V. 292. P. 644-646.

135. Kletzien R.F., Harris P.K.W., Foellmi L.A. 1994. Glucose-6-phosphate dehydrogenase: a "housekeeping" enzyme subject to tissue-specific regulation by hormones, nutrients, and oxidant stress // FASEB J. V. 8. P. 174-181.

136. Kojima I., Kitaoka M., Ogata E. 1990. Studies on the cell-cycle dependence of the actions of insulin-like growth factor I in Balb/c 3T3 cells // J. Cell. Physiol., V. 143. P. 529-533.

137. Königsberg I.R. 1963. Clonal analysis of myogenesis // Science. V. 140. P. 1273-1279.

138. Kono T., Barham F.W. 1973. Effect of insulin on the levels of adenosine 3',5'-monophosphate and lipolysis in isolated rat epididymal fat cells // J. Biol. Chem., V. 248. P. 7417-7426.

139. Korenman S. G., Bhalla R.C., Stevens R. H. 1974. Protein kinase translocation as an early event in the hormonal control of uterine contraction //Science. V. 183. P. 430-432.

140. Kramer S.M., Gibson V.E.M., Fendly, B.M., Möhler M.A., Drolet D.W., Johnston P.D. 1990. Increase in cyclic AMP levels by relaxin in newborn rhesus monkey uterus cell culture // In Vitro Cell. Dev. Biol., V. 26. P. 647-656.

141. Kreuzer J., Nürnberg B., Krieger-Drauer H.I. 2004. Ligand-dependent autophosphorilation of the insulin receptor is positively regulated by Gi-proteins//Biochem. J., V. 380, P. 831-836.

142. Krupinski J., Lehman T.C., Frankenfield C.D. 1992. Molecular diversity in the adenylyl cyclase family. Evidence for eight forms of the enzyme and cloning of type VI // J. Biol. Chem., V. 267. P. 24858-24862.

143. Kulik G., Klippel A., Weber M.J. 1997. Antiapoptotic signaling by the insulin-like growth factor I receptor, phosphatidylinositol 3-kinase, and Akt // Mol. Cell Biol, V. 17. P. 1595-1606.

144. Kuemmerle J.F., Murthy K.S. 2001. Coupling of the IGF-1 receptor tyrosine kinase to Gj2 in human intestinal smooth muscle: G(3y-dependent

145. MAP kinase activation and growth // J. Biol. Chem., V. 276. P. 7187-7194.

146. Kuhl P.W. 1994. Excess-substrate inhibition in enzymology and highdose inhibition in pharmacology: a reinterpretation // Biochem. J. V. 298. P. 171-180.

147. Kumegava M, Ikeda E, Hosada S. and Takuma T. 1980. In vitro effects of thyroxine and insulin on myoblasts from chick embryo skeletal muscle // Dev. Biol., V. 79. P. 493-499.

148. Kuznetsova L, Plesneva S, Derjabina N, Omeljaniuk E, Pertseva M. 1999. On the mechanism of relaxin action: the involvements of adenylyl cyclase signalling system // Regul Pept, V. 80. P. 33-39.

149. Kuznetsova L, Plesneva S., Shpakov A., Pertseva M. 2005. Functional defects in insulin and relaxin adenylyl cyclase signaling systems inmyometrium of pregnant women with type 1 diabetes // Ann. N.Y. Acad. Sci., V. 1041. P. 446-448.

150. K.W., Geraerts W.P. 1992a. Isolation and chemical characterization of a novel insulin-related neuropeptide from the fresh water snail, Lymnaea stagnalis // Eur. J. Biochem., Y. 205. P. 675-678.

151. K.W., Geraerts W.P., Joosse J. 1992b. Purification and sequencing of molluscan insulin-related peptide II from the neuroendocrine light green cells in Lymnaea stagnalis // Endocrinology. V. 130. P. 3427-3432.

152. Makino H., Taira M., Shimada F. 1992. Insulin receptor gene mutation: a molecular, genetical and functional analysis // Cell. Signall., V. 4. P. 351-363.

153. Manganiello V.C., Murad F., Vaughan M. 1971. Effects of lipolytic and anti-lipolytic agents on cyclic 3',5'-adenosine monophosphate in fat cells // J. Biol. Chem, V. 246. P. 2195-2202.

154. McKenna J.P, Williams J.M, Hanson P.J. 1995. The isoform of protein kinase C inhibits histamine-stimulated adenylate cyclase activity in a particulate fraction of the human gastric cancer cell line HGT-1 // Inflamm. Res, Y. 44. P. 66-69.

155. Mierzejevski K, Rosengurt E. 1978. A partially purified serum fraction synergistically enchances the mitogenis activity of epidermal growth factor and insulin in quiescent cultures of 3T3 cells // Biochem. Biophys. Res. Commun, V. 83. P. 874-880.

156. Milligan G. 1988. Techniques used in the identification and analysis of function of pertussis toxin-sensitive guanine nucleotide binding properties //Biochem. J, V. 255, P. 1-13.

157. Morimoto B.H, Koshland D.E. 1994. Conditional activation of cAMP signal transduction by protein kinase C. The effect of phorbol esters on adenylyl cyclase in permeabilized and intact cells // J. Biol. Chem, V. 269. P. 4065-4069.

158. Morris A.J, Malbon C.C. 1999. Physiological regulation of G-protein-linked signaling // Physiol. Rev, Y. 79. P. 1373-1430.

159. Moxham C.M., Malbon C.C. 1996. Insulin action impaired by deficiency of the G-protein subunit Gja2 //Nature. V. 379. P. 840-844.

160. Murray-Rust J., Macleod A.N., Blundell T.L., Wood S.P. 1992. Structure and evolution of insulins: implifications for receptor binding // BioEssays. V. 14. P. 325-331.

161. Nair B.G., Parikh B., Milligan G., Patel T.B. 1990. Gs mediates epidermal growth factor-elicited stimulation of rat cardiac adenylate cyclase // J. Biol. Chem., V. 265. P. 21317-21332.

162. Nair B.G., Patel T.B. 1993. Regulation of cardiac adenylate cyclase by epidermal growth factor (EGF). Role of EGF receptor protein tyrosine kinase activity // Biochem. Pharmacol., V. 46. P. 1239-1245.

163. Neer E.J. 1995. Heterotrimeric G proteins: organizers of transmembrane signals // Cell. V. 80. P. 249-257.

164. Nguyen B.T., Yang L., Sanborn B.M., Dessauer C.W. 2003. Phosphatidylinositol 3-kinase activity is required for biphasic stimulation of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate by relaxin // Mol. Endocrinol., V. 17. P. 1075-1084.

165. Nixon J.S. 1997. The biology of protein kinase C inhibitors // In: Parker, P.J. and Dekker, L.V. (Eds.) Protein Kinase C, Springer-Verlag, Heidelberg. P. 205-229.

166. O'Brien R.M., Granner D.K. 1996. Regulation of gene expression by insulin // Physiol. Rev., V. 76. P. 1109-1161.

167. O'Brien, R.M., Houslay M.D., Milligan G., Siddle K. 1987. The insulin receptor tyrosyl kinase phosphorylates holomeric forms of theguanine nucleotide regulatory proteins Gi and Go // FEBS Lett., V. 212. P. 281-288.

168. O'Connor R. 1998. Survival factors and apoptosis // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., V. 62. P. 137-166.

169. Okamoto, Т., Nishimoto I. 1991. Analysis of stimulation-G protein subunit coupling by using active insulin-like growth factors II receptor peptide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 88. P. 8020-8023.

170. Okamoto, J., Okamoto Т., Murayama Y., Hayashi Y., Ogata E., Nishimoto I. 1993. GTP-binding protein-activator sequences in the insulin receptor//FEBS Lett., V. 334. P. 143-148.

171. Pablo F, Roth J, Hermander E,m Pruss R.M. 1982. Insulin is present in chicken eggs and early chick embryos // Endocrinology. V. 111. P. 19091916.

172. Palmer W. K, McPherson J. M, Walsh D. A. 1980. Critical controls in the evaluation of cAMP-dependent protein kinase activity rations as of hormonal action. //J. Biol. Chem. V. 255. P. 2663-2666.

173. Parrizas M., Saltiel A.R., LeRoith D. 1997. Insulin-like growth factor-I inhibits apoptosis using the phosphatidylinositol 3'-kinase and mitogen-activated protein kinase pathways // J. Biol. Chem, V. 272. P. 154-161.

174. Park C.R., Sneyd J.G.T, Corbin J.D., Jefferson L.S, Exton J.H. 1967. Role of cyclic adenylate in the actions of insulin // In: Ostman, J. (Ed) Diabetes, Excerpta Med. Found, Netherland, Amsterdam. P. 5-15.

175. Parsell D.A., Mak J.J., Amento E.P., Unemori E.N. 1996. Relaxin binds to and elicits a response from cells of the human monocytic cell line, THP-1 //J. Biol. Chem, V. 271. P. 27936-27941.

176. Parvathenani L.K, Buescher E.E, Chacon-Cruz E, Beebe S.J. 1998. Type I cAMP-dependent protein kinase delays apoptosis in human neutrophils at a site upstream of caspase-3 // J. Biol. Chem., V. 273, P. 67366743.

177. Patel T.B, 2004. Single transmembane spanning heterotrimeric G protein-coupled receptors and their signaling cascades // Pharmacol. Rev, V. 56, P. 371-385.

178. Pepio A.M., Fan X, Sossin W.S. The role of C2 domains in Ca -activated and Ca2+-independent protein kinase Cs in Aplysia. J. Biol. Chem. 273: 19040-19048. 1998.

179. Pertseva M.N. 1991. Pathways of the evolution of hormonal signal realization systems //Neurosci. Behav. Physiol, V. 21 P. 559-568.

180. Pertseva M.N., Plesneva S.A., Shpakov A.O., Rusakov Yu.I., Kuznetsova L.A. 1995. Involvement of adenylyl cyclase signalling system in the action of insulin and mollusc insulin-like peptide // Comp. Biochem. Physiol., V. 112. P. 689-695.

181. Pertseva M., Shpakov A., Kuznetsova L., Plesneva S., Omeljaniuk E. 2006. Adenylyl cyclase signaling mechanisms of relaxin and insulin action: similarities and differences // Cell Biology International. V. 30. P. 533-540.

182. Pertseva M.N., Shpakov A.O., Plesneva S.A., Kuznetsova L.A. 2003. A novel view on the mechanism of action of insulin and other insulin superfamily peptides: involvement of adenylyl cyclase signaling system // Comp. Biochem. Physiol., V. 134. P. 11-34.

183. Plekhanov A.Y. 1996. Immunoreplica from the gel surface: rapid and sensitive blot plus intact gel // Anal. Biochem., V. 239. P. 110-111.

184. Poppleton H, Sun H, Fulgham D, Bertics, P, Patel T.B. 1996. Activation of Gs by the epidermal growth factor receptor involves phosphorylation // J. Biol. Chem, 271, 6947-6951.

185. Price S.A, Pochun J, Phaneuf S, Bernal A.L. 1999. Expression of adenylyl cyclase isoforms in pregnant and non-pregnant human myometrium //Biochimie. V. 81. P. 382.

186. Ray T.K, Tomasi V, Marinetti G.V. 1970. Hormone action at the membrane level. I. Properties of adenylyl cyclase in isolated plasma membranes of rat liver // Biochim. Biophys. Acta. V. 211. P. 20-30.

187. Reisine T. 1990. Pertussis toxin in the analysis of receptor mechanisms // Biochem. Pharmacol, V. 39, P. 1499-1504.

188. Robison G.A, Park C.R. 1970. Cyclic adenylate in mammalian tissues. Diabetes Mellitus // Theory, Pract, P. 132-149.

189. Roger P.P., Reuse S., Maenhaut C., Dumont J.E. 1995. Multiple facets of the modulation of growth by cAMP // Vitamines and Hormones. V. 51. P. 59-191.

190. Roovers J.F.A., Vincent M.E., van Kesteren E., Geraerts W.P., Planta R.J., Vreugdenhil E., van Heerikhuizen H. 1995. Characterization of a putative molluscan insulin-related peptide receptor // Gene. V. 162. P. 181188.

191. Sagi-Eisenberg R. 1989. GTP-binding proteins as possible targets for protein kinase C action // Trends Biochem. Sci., V. 14. p. 355-357.

192. Saltiel A.R. 1996. Diverse signaling pathways in the cellular action of insulin // Am. J. Physiol., 1996. V. 270. P. E375-E385.

193. Samiei H.V. 1995. Signaling in new directions // Biochem. Cell. Biol., V. 73. P. 133-136.

194. Salomon Y., Londos C., Rodbell M.A. 1974. Highly sensitive adenylate cyclase assay // Anal. Biochem., V. 58. P. 541-548.

195. Sandra A., Przybylski R.Y. 1975. Insulin binding and effects of insulin in developing chick skeletal muscle in vitro // Fed. Proceed., V. 34. P. 334.

196. Scott M.R., Lee N.P., Yankaskas J.R., Boucher R.C. 1988. Effect of hormones on growth and function of cultured canine tracheal epithelial cells // Amer. J. Physiol., V. 255. P. C237-C245.

197. Schwabe C., Bullesbach E.E. 1994. Relaxin: structure, functions, promises, and nonevolution // FASEB J. V. 8. P. 1152-1160.

198. Shpakov A.O. 1996. Molecular basis of the functional coupling of receptors to GTP-binding proteins // Membr. and Cell Biol., V. 9, N 5., P. 467-488.

199. Skorokhod A., Gamulin V., Gundacker D., Kavsan V., Muller I.M., Muller W.E.G. 1999. Origin of insulin receptor-like tyrosine kinases in marine sponges //Biol. Bull., V. 197. P. 198-206.

200. Singleton J.R., Dixit V.M., Feldman E.L. 1996. Type 1 insulin-like growth factor receptor activation regulates apoptotic proteins // J. Biol. Chem., V. 271. P. 31791-31794.

201. Smit A.B., Geraerts W.P., Meester I., Heerikhuizen H., Joosse J. 1991. Characterization of a c DNA clone encoding molluscan insulin-related peptide II of Lymneae stagnalis // Eur. J. Biochem., Y. 199. P. 699-703.

202. Smit A.B., Thijsen S.F., Geraerts W.P., Meester I., Heerikhuizen H., Joosse J. 1992. Characterization of a c DNA clone encoding molluscan insulin-related peptide V of Lymneae stagnalis // Brain Res., V. 14. P. 7-12.

203. Smit A.B., Spijker s., Minnen J., Burke J.E., Winter F., Elk R., Geraerts W.P. 1996. Expression and characterization of molluscan insulin-related peptide VII from the mollusk Lymnaea stagnalis // Neuroscience. V.70. P. 589-596.

204. Smit A.B., Van Kesteren R.E., Li K.W., Van Minnen J., Spijker S. 1998. Towards understanding the role of insulin in the brain: Lessons from insulin-related signaling systems in the invertebrate brain // Progress in Neurobiology. V. 54. P. 35-54.

205. Smit A.B., Vreugdenhil E., Ebberink R.H.M., Geraets W.P., Klootwijk S., Joosse J. 1988. Growth-controlling molluscan neurons produce the precursore of an insulin-related peptide //Nature. V. 331. P. 535-538.

206. Sneyd J.G.D., Corbin J.D., Park C.R. 1967. The role of cyclic AMP in the action of insulin // Adv. Exp. Med. Biol., V. 2. P. 367-376.

207. Sossin W.S., Chen C.S., Toker A. 1996. Stimulation of an insulin receptor activates and down-regulates the Ca2+ -independent protein kinase C, Apl II, through a wortmannin-sensitive signaling pathway in Aplysia // J. Neurochem., V. 67. P. 220-228.

208. Srinivasan M., Begum N. 1994. Regulation of protein phosphatase 1 and 2A activates by insulin during myogenesis in rat skeletal muscle cells in the culture // J. Biol. Chem, V. 269. P. 12514-12520.

209. Stanton R.C, Seifer J.L, Boxer D.C, Zimmermam E, Cantley L.C. 1991. Rapid release of bound glucose-6-phosphate dehydrogenase by growth factors // J. Biol. Chem, V.266. P. 12442-12448.

210. Takayama S, White M.F, Kahn C.R. 1988. Phorbol ester-induced serine phosphorylation of the insulin receptor decreases its tyrosine kinase activity // J. Biol. Chem, V. 263. P. 3440-3447.

211. Tamura T, Takahashi H, Iizuka H. 1996. Protein kinase C-dependent modulation of stimulatory guanine nucleotide binding protein of fetal rat skin keratonocytes // Arch. Dermatol. Res, V. 288. P. 24-30.

212. Tang W.-J, Gilman A.G. 1991. Type-specific regulation of adenylyl cyclase by G-protein (3y subunits // Science. V. 254. P. 1500-1503.

213. Taussig R, Gilman A.G. 1995. Mammalian membrane-bound adenylyl cyclases // J. Biol. Chem, V. 270. P. 1-4.

214. Taylor S.I., Cama A., Accili D., Barbetti F., Quon M.J., de la Luz Sierra M., Suzuki Y., Koller E., Levy-Toledano R., Wertheimer E. 1992. Mutations in the insulin receptor gene // Endocrinol. Rev., V. 13. P. 566-595.

215. Taylor J.M., Neubig R.R. 1994. Peptides as probes for G protein signal transduction // Cell. Signal. V. 6. P. 841-849.

216. Technicova-Dobrova Z., Sardanelli A.M., Papa S. 1991. Spectophotometric determination of functional characteristics of protein kinases with coupled enzymatic assay // FEBS. V. 292. P. 69-72.

217. Tepperman J. 1981. Metabolic and Endocrine Physiology // 4th Edition. Year Boon Medical Publishers Inc. Chicago-London. P. 237- 238.

218. Tian W.N., Braunstein L.D., Pang J., Stuhlmeier K.M., Xi Q.C., Tian X., Stanton R.C. 1998. Importance of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity for cell growth // J. Biol. Chem., V. 273. P. 10609-10617.

219. Van Keymeulen A., Dumont J.E., Roger P.P. 2000. TSH induces insulin receptors that mediate insulin costimulation of growth in normal human thyroid cells // Biochem. Biophys. Res. Commun., V. 279. P. 202207.

220. Walsh D.A., van Patten S.M. 1994. Multiple pathway signal transduction by the cAMP-dependent protein kinase // FASEB J. V. 8. P. 1227-1236.

221. Webster C.R., Anwer M.S. 1998. Cyclic adenosine monophosphate mediated protection against bile acid-induced apoptosis in cultured rat hepatocytes // Hepatology. V. 27. P. 1324-1331.

222. Wess J. 1998. Molecular basis of receptor/G protein-coupling selectivity // Pharmacol. Ther., V. V. 80. P. 231-264.

223. Wesslau C., Eriksson J.W., Smith U. 1993. Cellular cyclic AMP levels modulate insulin sensitivity and responsiveness evidence against a significant role of Gi in insulin signal transduction // Biochem. Biophys. Res. Commun., V. 196. P. 287-293.

224. White A.A. 1974. Separation and purification of cyclic nucleotides by alumina column chromatography // Methods Enzymol., V. 380. P. 41-46.

225. White M.F., Kahn C.R. 1994. The insulin signalling system // J. Biol. Chem., V. 269. P. 1-4.

226. Whitehead J.P., Clark S.F., Urso B., James D.E. 2000. Signalling through the insulin receptor // Curr. Opin. Cell Biol., Y. 12. P. 222-228.

227. Wichelhaus A., Russ M., Petersen S., Eckel J. 1994. G protein expression and adenylate cyclase regulation in ventricular cardiomyocytes from STZ-diabetic rats // Am. J. Physiol., V. 267. P. 548-555.

228. Wilson M.R. 1998. Apoptotic signal transduction: emerging pathways // Cell Biol., V. 76. P. 573-582.

229. Wilson M., Burt A.R., Milligan G., Anderson N.G. 1996. Wortmannin-sensitive activation of p70s6k by endogenous and heterologously expressed Gi-coupled receptors // J. Biol. Chem., V. 271. P. 8537-8540.

230. Wittpoth C., Scholich K., Yigzaw Y., Stringfield T.M., Patel T.B. 1999. Regions of adenylyl cyclase that are necessary for inhibition of activity by 3yand Gia subunits of heterotrimeric G proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 96. P. 9551-9556.

231. Yamada K., Avignon A. Standaert M.L., Cooper D.R., Spencer B., Farese R.V. 1995. Effects of insulin on the translocation of protein kinase C-zeta and other protein kinase C isoforms in rat skeletal muscles II Biochem. J., V. 308. P. 177-180.

232. Yoshimura M., Cooper D.M. 1992. Cloning and expression of a Ca -inhibitable adenylyl cyclase from NCB-20 cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 89. P. 6716-6720.

233. Zalin R., Montague W. 1975. Changes in cyclic AMP adenylate cyclase and protein kinase levels during the development of embryonic chick skeletal muscle // Exp. Cell. Res., V. 93. P. 55-62.

234. Zheng X.L., Guo J., Wang H.Y., Malbon C.C. 1998. Expression of constitutively activated Gja2 vivo ameliorates streptozotocin-induceddiabetes // J. Biol. Chem., V. 273. P. 23649-23651.259

235. Zimmer H. G., Ibel H., Suchner U. 1990. ß-adrenergic agonists stimulate the oxidative pentose pathway in the rat heart // Cir. Res., V. 67. P. 1525-1534.

236. Zimmermann G., Taussig R. 1996. Protein kinase C alters the responsiveness of adenylyl cyclases to G protein a and ßy subunits // J. Biol. Chem, V. 271. P. 27161-27166.1. БЛАГОДАРНОСТИ

237. Прежде всего я хочу поблагодарить наш Институт, его стены и тот коллектив, который мне дал возможность приобщиться к пониманию значимости фундаментальных исследований, на которых основано все дальнейшее развитие науки в России.

238. Большое спасибо моим коллегам и друзьям, Наливаевой Наталии Николаевне, Журавину Игорю Александровичу, Антонову Сергею Михайловичу за поддержку и помощь.

239. Самые теплые и сердечные слова я хочу адресовать моей маме, которая в течение многих лет дожидалась этого момента, момента когда ее дочь защитится. Спасибо ей большое за терпение и понимание.