Структурно-функциональная организация аденилатциклазной сигнальной системы инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis

Деркач, Кира Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональная организация аденилатциклазной сигнальной системы инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация аденилатциклазной сигнальной системы инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова

На правах рукописи

ДЕРКАЧ Кира Викторовна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ИНФУЗОРИЙ ОД.£Р7У8М$ЕЯ И ТЕТЯАНУМЕЫА РУМРОИМЯ

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2003

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной эндокринологам (заведующий лабораторией - доктор биологических наук, профессор М Н. Перцева) Института эволюционной' физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук, Санкт-Петербург.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник А .0. Шпаков

Институт эволюционной физиологии и биохимии им И.М Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Я.Ю. Багров

Институт эволюционной физиологии и биохимии им И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Л.В. Пучкова

Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Институт цитологии РАН,

Санкт-Петербург

Защита состоится 23 декабря 2003 г в 11м часов на заседании Диссертационного совета Д 002.127.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр М. Тореза, 44.

С диссертацией мйжно ознакомиться в библиотеке ИЭФиБ им. И М Сеченова РАН. Автореферат разослан« 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор / '¿,- - МП- Маслова

2ол5'Д

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Одной из актуальных задач современной молекулярной эндокринологии является сравнительное исследование структурно-функциональной организации гормональных сигнальных систем у животных различного филогенетического уровня. Решение этой задачи позволит выявить основные закономерности эволюции эндокринных систем и механизмов их действия в филогенезе и на этой основе разработать новые подходы для регуляции функциональной активности компонентов сигнальных систем, что имеет первостепенное значение для практической медицины.

В настоящее время молекулярные механизмы функционирования гормональных сигнальных систем высших эукариот и, в первую очередь, высших позвоночных животных хорошо изучены. В то же время информация о гормональных сигнальных системах одноклеточных организмов (низших эукариот) крайне скудна и противоречива. Отсутствие понимания того, каким образом функционируют сигнальные системы у низших эукариот, не позволяет проследить пути эволюции эндокринной системы на ранних этапах развития многоклеточных организмов и выявить ключевые этапы формирования гормонокомпетентности эукариотической клетки.

Одной из наиболее важных и широко распространенных сигнальных систем, опосредующих регуляторное действие различных по своей химической природе гормонов, является аденилатциклазная сигнальная система (АЦС), включающая три основных компонента, ассоциированных с плазматической мембраной клетки. Первый из них представляет собой рецептор серпантинного типа, семь раз пронизывающий плазматическую мембрану, который специфически опознает сигнальную молекулу (гормон). Вторым, сопрягающим, компонентом является гетеротримерный ГТФ-связывающий белок (6-белок) стимулирующего или ингибирующего типа, передающий сигнал на третий, каталитический, компонент АЦС - фермент аденилатциклазу (АЦ|. В свою очередь, АЦ, осуществляя синтез вторичного посредника цАМФ, регулирует, таким образом, функциональную активность эффекторного белка - фермента цАМФ-зависимой протеинкинзы (ПКА).

К настоящему времени значительный прогресс достигнут в изучении структурно-функциональной организации АЦС, а также молекулярных механизмов функционального сопряжения компонентов этой системы у высших позвоночных и, в меньшей степени, многоклеточных беспозвоночных животных Большой вклад в изучение молекулярных механизмов функционирования'гсрмоночувствительной АЦС у позвоночных и беспозвоночных животных внесли и исследования, проводимые в лаборатории молекулярной эндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И М. Сеченова РАН Э™ исследования, начатые еще в конце 70-х годов и обобщенные в монографии М Н. Перцевой (1989), направлены на сравнительное изучение АЦС животных различного филогенетического уровня и имеют своей целью выяснение путей эволюции этой системы. На основе обобщения полученных в лаборатории экспериментальных данных и сведений литературы, а также их всестороннего анализа и выявления ряда закономерностей в эволюции АЦС Перцевой МН была выдвинута гипотеза о формировании гормональных сигнальных систем на самом раннем этапе развития эукариотической

клетки - на уровне одноклеточных организмов (Рей5е7а е( а1„ 1990). Подтверждение этой гипотезы, в значительной мере меняющей существующие представления в современной молекулярной эндокринологии и эволюционной биохимии, стало основной целью данной работы.

Детальный анализ современного состояния проблемы структурно-функциональной организации ситальных систем низших эукариот указывает на то, что роль АЦС в реализации регуляторного влияния гормонов и сигналов негормональной природы в клетках низших эукариот до сих пор практически не исследована (Шпаков и др., 20036). В то же время в последние годы в геноме ряда представителей низших эукариот обнаружены гены, кодирующие белки - компоненты АЦС. В клетках инфузории Те^Иутепа ругНогтк выявлены гормоны, характерные для высших эукариот, которые способны регулировать пищевое поведение инфузорий и метаболизм. Эти данные позволяют предположить наличие функционально активной АЦС у таких сравнительно примитивных организмов, как низшие эукариоты.

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в обнаружении и структурно-функциональной характеристике гормоночувствительной АЦС в клетках представителей низших эукариот - инфузорий ОНерШя апяег и Те^аЬутепа ругЯогтт. Молекулярные механизмы функционирования АЦС инфузорий изучали в сравнении с таковой представителей позвоночных и беспозвоночных квотных (высших эукариот), используя эволюционный подход.

Основные задачи работы состояли в следующем:

1. Функционально охарактеризовать АЦС инфузорий Р.апвеги Т.руп!ошв с использованием веществ негормональной природы в сравнении с АЦС беспозвоночных (моллюск Аподо^а судпеа) и позвоночных животных (крыса, куриные эмбрионы).

2. Исследовать чувствительность АЦС инфузорий к пептидному гормону высших эукариот глюкагону и биогенным аминам, выявить черты сходства и различия в их регуляторном действии на АЦС инфузорий и высших эукариот.

3. Исследовать включение рецепторов и гетеротримерных 6-белков в процесс передачи гормонального сигнала через АЦС инфузорий.

4 Выявить активность цАМФ-зависимой протеинкиназы в клетках инфузорий и изучить ее регуляцию веществами гормональной природы.

5. В аспекте практического применения полученных данных, исследовать чувствительность АЦС инфузорий к действию таких неблагоприятных факторов внешней среды, как катионы тяжелых металлов, и разработать на этой основе экотоксикологический тест.

Основные результаты, научная новизна работы.

В клеточных культурах представителей одноклеточных организмов - инфузорий О.апвег и Труг^от7/в впервые выявлена и охарактеризована АЦС. Показано, что фактором, определяющим уровень базальной активное™ АЦ Тругйогт®, является доля делящихся" инфузорий (стадия развития культуры) Обнаружено, что АЦ инфузорий стимулируется такими активаторами феомента, как Мп2+,

NaF, гуаниновые нуклеотиды (ГН), форсколин, причем величина их стимулирующего эффекта определяется уровнем базальной активности фермента

Впервые показано, что гормоны высших эукариот гл'юкагон и серотонин (у D.anser также адреналин и изопротеренол), действующие через рецепторы серпантинного типа, способны стимулировать активность АЦ в культурах D.anser и T.pyriformis. Свое максимальное стимулирующее влияние на активность АЦ эти гормоны оказывают в концентрациях, которые наиболее эффективны в тканях высших эукариот. Выявлено также ингибирование адреналином АЦС тетрахимен. Величина и направленность гормонального эффекта определяются уровнем базальной активности АЦ' чем она выше, тем менее выражена гормональная стимуляция и тем в большей степени проявляется ингибирующее влияние гормонов. Действие гормонов частично 'или полностью снимается антагонистами серотониновых и p-адренергических рецепторов (р-АР). В клетках инфузорий впервые охарактеризованы рецепторы, специфично связывающие р-АР лиганды и сходные по ряду своих показателей с р-АР высших эукариот. Показано, что биогенные амины стимулируют ГТФ-связывающую активность G-белков, что указывает на их участие в процессе передачи гормонального сигнала. В клеточных культурах D anser и T.pyriformis впервые обнаружена активность ПКА и исследована ее регуляция гормонами. Действие гормонов на активность ПКА и АЦ было однонаправленным, что указывает на функциональную связь меледу этими ферментами подобно тому, как это наблюдается у высших эукариот. Таким образом, доказано, что в клетках инфузорий присутствует функционально активная гормоночувствительная АЦС, обладающая чертами сходства с таковой высших эукариот.

Показано, что катионы тяжелых металлов (КТМ) нарушают функционирование АЦС инфузорий в условиях in vitro понижают их выживаемость в условиях in vivo. Эти данные указывает на возможность использования АЦС D.anser и T.pyriformis в качестве высокочувствительного экотоксиколожческого тест-объекта для оценки состояния водных бассейнов.

Теоретическое и практическое значение работы.

Обнаружение гормональной регуляции АЦС инфузорий, как представителей низших эукариот, является очень важным для понимания эволюции гормоночувствительных сигнальных систем эукариот в целом и формирования молекулярных механизмов функционирования цАМФ-зависимых сигнальных путей в частности. Полученные данные дают материал для дальнейших исследований регуляторной роли гормонов высших эукариот как у инфузорий, так и у других представителей низших эукариот (дрожжевых фибов, трипаносом и др.). Разработанная стратегия изучения АЦС инфузорий может быть использована для исследования регуляции гормональными и негормональными агентами жизненно важных функций паразитических форм одноклеточных, возбудителей многих заболеваний человека Изучение чувствительности АЦС инфузорий к воздействию КТМ позволяет разработать новый зкотоксикологический тест для мониторинга водных экосистем. В перспективе этот тест можно использовать для тестирования и других вредных химических веществ. .

Апробация работы.

Обсуждение работы проходило на заседании секции молекулярных основ эволюции функций ИЭФиБ им И.М.Сеченова РАН. Результаты работы были доложены на SEB Annual Meeting, Lancaster,

England (1996), 22th Conference of European comparative endocrinologists, Bonn, Germany (2002), FEBS Meeting on Signal transduction, Brussels, Belgium (2003), XI Всероссийском симпозиуме «Мембранный транспорт и функции клетки» (1994), Конференции молодых физиологов и биохимиков России «Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций» (1995), Международной конференции «Инфузории в биотестировании» (1997) и на научных семинарах Лаборатории молекулярной эндокринологии ИЭФБ им. И.М. Сеченова РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа, в том числе 11 статей в рецензируемых журналах.

Объем, структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методическою раздела, результатов исследования и их обсуждения, выводов. Работа изложена на ^¿страницах. включает /^рисунков и -У таблиц, список литературы составляет /^¿'источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. В опытах использовали культуры инфузорий T.pynformis и Danser, пресноводных двустворчатых моллюсков анодонт (Anodonta cygnea), 11- и 16-ги-дневных эмбрионов кур породы Леггорн кросс-288, белых самцов крыс Rattus norvegicus линии Wistar. Исследования проводили на скелетных мышцах и стриатуме мозга крыс и гладких мышцах ноги моллюсков.

Материал для исследования, Гомогенаты клеток инфузорий получали растиранием клеток в ручном гомогенизаторе (D.ansei) или их обработкой ультразвуком на приборе УЗДН-2Т (T.pyrifcrmis) Количество разрушенных клеток составляло не менее 95% от их общего количества. Для получения грубой мембранной фракции супернатант, полученный после центрифугирования гомогената (600 g, 3 мин), центрифугировали (15000 g, 15 мин), полученный осадок ресуспендировали в 10 мМ HEPES-Na буфере, pH 7 5, содержащем 5 мМ MgCI2, и переосаждали в том же режиме. Фракции плазматических мембран скелетных мышц крысы, гладких мышц моллюска и сердечных мышц 11- или 16-ти-дневных куриных эмбрионов получали по методу Kidwai et ai. (1973) Выделение фракции синаптосом из стриатума мозга крысы проводили по методу Hajos (1975).

Определение активности Мд2+-зависимой аденилатциклазы (АЦ) проводили с использованием [а-32Р]АТФ или [8-3Н]АТФ в качестве субстрата по модифицированным методам (Salomon et al, 1974) и (Ткачук, Балденков, 1978), соответственно. Ферментативную реакцию проводили при 30 (инфузории, моллюски) или 37 °С (крысы, куриные эмбрионы) и времени инкубации 10 мин в инкубационной среде, содержащей меченый субстрат. Активность АЦ выражали в пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг белка (далее - ЕД).

Определение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы (ПКА) проводили по модифицированному методу Gill, Walton (1979), используя [у-32Р]АТФ в качестве субстрата. Для исследования активности ПКА использовали гомогенаты клеточных культур инфузорий и мышечных тканей моллюска и крысы Для характеристики степени активации или ингибирования фермента

гормонами использовали отношение активности ЛКА, определяемой в отсутствие цАМФ, к активности фермента, определяемой в присутствии цАМФ

Определение связывающих мест для адренергических лигандов проводили с помощью рН]-дигидроальпренолола (рН]-ДГА), как описано в работе (Pertseva et al., 1992) с некоторыми изменениями. Значения специфического связывания рН]-ДГА рассчитывали вычитанием неспецифического связывания рН]-ДГА из общего связывания рН]-ДГА с мембранами. Для определения аффинности к различным лигандам сайтов, связывающих рН]-ДГА, измеряли специфическое связывание 50 нМ [3Н]-ДГА в присутствии возрастающих концентраций (10-10-104 М) немеченого лиганда. Математическая обработка данных проводилась с помощью программы GraphPad InPlot. Кривые насыщения преобразовывали по методу Скэтчарда, что позволяло судить о сродстве рецепторов (Кд) для рН]-ДГА. Значения IC50 представляли собой концентрацию немеченого лиганда, вызывающего 50 %-ное замещение рН]-ДГА. Значения КИнг. для лигандов рассчитывали по формуле 1С50/(1+[3]Жд), где [S] - концентрация рН]-ДГА.

Определение ГТФ-связывающей активности G-белков проводили по модифицированным методам Panchenko et al (1987) и Mclntire et al. (2001) в гомогенатах клеток инфузорий и фракциях плазматических мембран мышц моллюска и крысы, используя [8-3Н]-гуанилилимидодифосфат ([8-3Н]-Gpp[NH]p). Специфическую ГТФ-связывающую активность определяли как разность между связыванием меченого Gpp[NH]p в отсутствие ГТФ и таковым в присутствии 10 мМ ГТФ.

Ростовую активность инфузорий оценивали по изменению плотности клеток в культуре после 24-часовой их обработки катионами тяжелых металлов (КТМ). Для Danser и Г piriformis исходная плотность клеток в контроле и опытных образцах составляла 32 ± 5 и 27000 клеток/мл соответственно.

Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при р<0.05. Все данные представлены как среднее±стандартная ошибка среднего Каждая серия включала не менее 3 экспериментов, выполненных в 3-6 параллелях.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Обнаружение и функциональная характеристика активности АЦ в гомогенатах инфузорий 1.1. Dileptus anser

В гомогенате клеток инфузории D anser базальная активность магний-зависимой АЦ составляла а различных опытах от 1430 до 3914 ЕД (Деркач и др, 1995, 2002) Эти значения сравнительно высоки и примерно в 20 раз превосходят таковые для базальной акшвности АЦ инфузории T.pynformis, а также существенно выше значений базальной активности АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных животных Форсколин, взаимодействующий с каталитическим сайтом АЦ позвоночных животных, в концентрации 10"5 М повышал активность АЦ на 55% (базальная активность АЦ 1795 ЕД). В клеточной культуре с высоким уровнем базальной активности АЦ (3914 ЕД) величина стимулирующего эффекта форсколина снижалась до 33 % Полученные нами данные хорошо согласуются с данными других

авторов, которые показали, что величина стимулирующего эффекта форсколина на активность АЦ тем ниже, чем выше уровень базальной активности фермента (Р1егош е{ а1., 1995).

ГТФ и его негидролизуемый аналог 6рр[ЫН]р в концентрациях от 10"8 до 1СИ М оказывали выраженный стимулирующий эффект на активность АЦ (рис.1, А) (Деркач и др, 2002). Кривые дозозависимоста ' имели колоколообразную форму: максимальные стимулирующие эффекты гуаниновых нуклеотидов (ГН) достигались при концентрациях ГТФ 105 М (+42 %) и Срр(ЫН]р 10"6 М (+62 %) Эти данные указывают на полноценное сопряжение фермента АЦ с в-белком стимулирующего типа (С5-белком). Характер стимулирующего влияния ГН на АЦ и диапазон концентраций, в которых они наиболее эффективно активируют фермент (10^-10® М), сходны с таковыми для высших эукариот. Тот факт, что в процентном выражении величина стимулирующего эффекта ГН на активность АЦ не столь значительна, как у высших эукариот, может быть связан с очень высоким уровнем базальной активности фермента у О.элзег, на фоне которой стимулирующие эффекты ГТФ и 6рр[Щр проявляются не столь отчетливо. Действительно, в гомогенате клеток О апвег, имеющих базальную активность АЦ, равную 3914 ЕД, максимальные стимулирующие эффекты ГТФ (10-6 М) и 6рр[Ш]р (10"5 М) снижены до 33 и 41 %, соответственно (рис. 1, Б).

5500

® 5000

=г <

45004000 3500 3000 2500 2000 1500

-1д[гуаниновый нуклеотид], М

Рис. 1. Влияние ГН - ГТФ и Срр[ЫН]р на активность АЦ в клетках инфузории О.атег с <базальными активностями фермента 1796 ± 110 (А) и 3914 ± 174 ЕД (Б). 7 — ГТФ, 2-6рр[1ЧН]р.

1.2. Те£га/1утела ругКоппю

Исследование культур Труг^отв с различной плотностью клеток и различного возраста показало, что фактором, определяющим уровень базальной активности АЦ, является стадия развития культуры (доля делящихся инфузорий). В культурах Т.рупйтте, имеющих 2-5 %, 20-30 % и более 35 % делящихся клеток, базальная активность АЦ составляла в среднем 31, 228 и 747 ЕД, соответственно (Деркач и др, 2003). Полученные данные указывают на то, что у Т.рутйогтю, которые находятся в экспоненциальной стадии роста, базальная активность АЦ в значительной степени повышена в сравнении с инфузориями, находящимися в стационарной фазе. Это, как можно полагать, связано с

6000

участием АЦС в позитивной регуляции ростовых и метаболических процессов, интенсивность которых у инфузорий в экспоненциальной фазе роста выше, чем у Т.ругйогтк в стационарной фазе роста.

Функциональная активность АЦ Т.ру^отв, так же как и АЦ высших зукариот, зависит от присутствия катионов магния и марганца (Деркач и др., 1992, 2003). Воздействие 5 мМ МпС12 на базальную активность АЦ Т.рупЬгт® во всех случаях вызывает значительное повышение активности фермента. Так в культурах Т.руп^тя с базальными активностями, равными 2.8, 26.5, 43 и 46 ЕД, катионы Мп2* повышают активность АЦ на 1382, 608, 286 и 193 % соответственно. Приведенные данные указывают на отчетливо выраженную зависимость действия Мпг+ на активность АЦ от уровня базальной активности фермента: чем выше базальная активность, тем в меньшей степени катионы марганца способны ее повышать. Стимулирующие эффекты форсколина также снижались в культурах с высоким уровнем базальной активности АЦ. В культурах инфузорий с базальными активностями, равными 2.8,18,43 и 46.3 ЕД, форсколин повышал активность АЦ на 49, 39,25 и 12% соответственно. Следует отметить, что стимулирующее действие форсколина на АЦ Г.рупЛшк выражено в значительно меньшей степени, чем в случае АЦ высших зукариот.

Фторид натрия является одним из самых мощных стимуляторов АЦ в тканях высших зукариот. В концентрации 10 мМ №Р стимулировал активность АЦ Г.ругйз/тк в культурах с базальной активностью 142 ЕД и ниже. В то же время при действии на культуры с базальной активностью 347 ЕД и выше оказывал слабо выраженный ингибирующий эффект на активность АЦ (Деркач и др., 2003). Стимулирующий эффект №Р имел два максимума. Первый (стимуляция активности АЦ на 11971346 %) соответствовал культурам с очень низкими базальными активностями (2.8 и 3.1 ЕД), второй (на 601 %) - культуре с базальной активностью 26.5 ЕД. Механизм действия ИаР заключается в активации им С-белков, как стимулирующего, так и ингибирующего типов, что, в свою очередь, и вызывает стимуляцию или ингибирование сопряженного с ними фермента АЦ. В стационарной фазе роста, как можно полагать, основная часть пула 65-белков не активна, поскольку многие метаболические и ростовые процессы, в которые включены эти в-белки, заторможены. Вследствие этого, №Р за счет их активации вызывает значительное повышение активности АЦ (действие на в-белки в этом случае не выявляется). В то же время, в фазе интенсивного деления инфузорий, когда базальная активность АЦ становится высокойГпрактически весь пул С5-белков активирован, и их дополнительная активация, вероятно, уже не возможна. В этом случае начинает проявляться ингибирующее влияние №Р на АЦ, осуществляемое через 0,-белки (С(1аЬге, 1990)

Действие ГТФ на активность АЦ Труг^огтю также определялось уровнем базальной активности фермента и носило дозозависимый характер (табл. 1) (Деркач и др, 2003) ГТФ в концентрациях 106 и 10'5 М оказывал стимулирующий эффект на активность АЦ во всех исследованных нами культурах Тру^ошБ. Увеличение концентрации ГТФ до 10"4 М приводило к появлению ингибирующего влияния ГТФ на АЦ в культурах с высокой базальной активностью. Это, вероятно, связано, как и в случае с №Р, с активацией С,-белок-сопряженных путей регуляции активности АЦ в культуре инфузорий в экспоненциальной фазе роста. Влияние Срр[МН]р (107 М) на активность АЦ в культурах Т.ру^отв качественно не отличалось от такового в случае ГТФ (Деркач и др., 2003).,

Таблица 1. Влияние ГТФ (10-6-104 М) на активность АЦ Т.руг^оггп'я в зависимости от величины

базальной активности фермента (х ± 5,).

Базальная активность АЦ, ЕД Активность АЦ, ЕД

ГТФ, 10-6 дд ГТФ, 10-5 м ГТФ, 1(Н м

2.8 ±0.1 22 0± 1.7(786) 40.1 ±1.6 (1432) 44 5 ± 3.0(1589)

23.2 ±1.2 36.6 ±2.5 (158) 45.3+ 1.8(195) 46 5 ± 2 4 (200)

43 0 + 2.0 60 1 ± 3.9 (140) 66.5 + 4.1 (155) 49.1+2.0(114)

347 ±12 437 ±21 (126) 382 ±6 (110) 411 ±12(119)

1470 + 33 2018 ± 43(137) 1571 ±33 (107) 1313 + 32(89)

1644 ±54 2215 ± 56(135) 2080 ±65 (127) 1395 ±61 (85)

В скобках приведена'активность АЦ, % (базальная активность фермента принята за 100 %). Все значения активности АЦ, стимулированной ГТФ, достоверно отличаются от базального уровня активности фермента при Р < 0.05.

1.3. Сравнительная характеристика функциональной активности АЦ в тканях высших эукариот - моллюсков (беспозвоночные), птиц и млекопитающих (позвоночные)

Для оценки чувствительности АЦС высших эукариот к стимуляторам негормональной природы (№Р, ГН и форсколин) нами были избраны: гладкие мышцы ноги пресноводного двустворчатого моллюска А.судпеа (беспозвоночные), скелетные мышцы и стриатум мозга крысы (высшие позвоночные, Млекопитающие) и сердечная мышца куриных эмбрионов (высшие позвоночные, Птицы) (Деркач, Шпаков, 1999).'Обнаружено, что стимуляция активности АЦ во фракциях плазматических мембран мышц моллюска и крысы, а также в мембранной фракции сердца 16-ти-дневных куриных эмбрионов негормональными агентами -10 мМ ИаР, 10"6 М ГТФ, 10-® М Срр[ЫН]р и Ю-5 М форсколином на качественном уровне сходна с таковой, наблюдаемой нами в гомогенатах клеточных культур инфузорий (данные не представлены). Однако количественно стимулирующие эффекты негормональных агентов существенно различаются, особенно в случае действия форсколина, который стимулирует активность АЦ в тканях высших эукариот заметно интенсивнее, чем активность АЦ инфузорий. Это может быть связано со структурными особенностями каталитического сайта и доменной организации АЦ инфузорий. В то же время, на основе полученных данных можно сделать вывод о том, что АЦС инфузорий по своей чувствительности к агентам негормональной природы качественно сходна с АЦС высших эукариот.

2. Регуляция функциональной активности АЦ инфузорий биогенными аминами в сравнении с таковой высших эукариот 2.1. Шерй/э апвег

На следующем этапе работы была исследована чувствительность АЦ О апзег к биогенным аминам. Было изучено влияние на активность фермента серотонина и агонистов АР - адреналина и

изопротеренола. В тканях позвоночных и беспозвоночных эти гормоны регулируют активность АЦ как по стимулирующим (через 65-белки), так и по ингабирующим (через 0,-белки) сигнальным путям, причем первые, как правило, предпочтительней.

С целью изучения дозозависимости эффектов гормонов исследовался широкий диапазон их концентраций: от Ю-9 до 105 М (Деркзч и др., 2002). Адреналин во всем этом диапазоне оказывал выраженный стимулирующий эффект на активность АЦ, величина которого лишь незначительно повышалась с увеличением концентрации гормона (табл. 2). В гомогенате клеток О.алвег с более высокой баэальной активностью АЦ (3914 ЕД) стимуляция активности АЦ проявлялась значительно слабее, а максимум стимулирующего действия гормона приходился на его концентрации 10'7 и 10"6 М. (5-Агонист изопротеренол стимулировал активность АЦ менее отчетливо в сравнении с адреналином. Полученные данные указывают на присутствие у О.апзег рецепторов, стимулирующим образом сопряженных с АЦ и способных отвечать на обработку агонистами АР - адреналином и изопротеренолом. При этом максимальный стимулирующий эффект гормоны оказывают в концентрациях, являющихся наиболее эффективными и 'в случае высших эукариот. Серотонин в концентрациях от 107 до 10-5 М отчетливо стимулировал активность АЦ, а его эффект по величине сопоставим с таковым в тканях высших животных (табл. 2). Антагонист серотониновых рецепторов ципрогептадин (Ю-6 М) практически полностью блокировал эффект серотонина. Это может указывать на специфичность взаимодействия серотонина с рецептором О.атоел, который, как можно полагать, сходен с серотониновыми рецепторами высших эукариот.

Таблица 2. Влияние биогенных аминов на активность АЦ в гомогенатах клеточных культур йзлвег.

Концентрация гормона, М Активность АЦ, ЕД, х ± 5„

адреналин адреналин Изопротеренол серотонин

Без гормона 1795 ±105 (100) 3900 + 105 (100) 2230 ± 120 (100) 1680 ± 90 (100)

Ю9 2040 + 125(114) 4290 ±190 (110) 2250 ±150 (101)* 1650 ±140 (98)*

10-8 2390 ± 165 (133) 4330 + 245 (111) 2250 ±110 (101)' 1550 ±160 (92)*

ю-7 2570 ±120 (143) 4640 ±210 (119) 2560 + 125 (115) 3230 + 305 (192)

10-6 .2590 1 205(144) 4680 ±150 (120) 2900+105 (130) 3650 ± 220 (217)

10-5 2780 ±135 (155) 4520 ±185 (116) 2500 ±150 (112)' 2440 ±100 (145)

8 скобках приведена активность АЦ, % (базальная активность фермента принята за 100 %). Все значения активности АЦ, стимулированной гормонами, достоверно отличаются от базального уровня активности фермента при Р < 0.05, за исключением тех, которые отмечены звездочками.

2.2. Tetrahymena pyriformis

В случае Tpyriformis знак эффекта серотонина (КН М) очень сильно зависел от уровня базальной активности АЦ культуры инфузорий (рис. 2, А) (Деркач и др, 2003). В культурах со сравнительно низкой базальной активностью стимуляция АЦ гормоном достигала 185 %, в то время как в культурах с высокой базальной активностью серотонин оказывал сильный ингибирующий эффект на АЦ, тем более значительный, чем выше величина базальной активности фермента.

В отличие от серотонина адреналин (107 М) не оказывал стимулирующего эффекта на активность АЦ, а его ингибирующий эффект заметно проявлялся даже в культуре со сравнительно низкой базальной активностью 23 2 ЕД (рис. 2, Б) (Деркач и др., 2003). Сильное ингибирующее влияние адреналина на АЦ может быть связано с активацией им рецепторов, сходных с АР позвоночных животных, которые функционально сопряжены с выбелками и через них негативным образом регулируют активность АЦ. (З-Агонист изопротеренол не проявлял заметного ингибирующего действия на АЦ, стимулируя активность фермента в культуре с базальной активностью, равной 2.8 ЕД (на 35 %) (рис. 2, В) Это указывает на присутствие в клетках T.pyriformis рецептора, способного связываться с изопротеренолом и сопряженного с 63-белком.

Рис. 2. Влияние серотонина (10'7 М) (А), адреналина (Ю-7 М) (Б) и изопротеренола (10"7 М) (В) на активность АЦ Т.ру^огтк в культурах с базальной активностью фермента (ЕД): 1 -2.8; 2 -18.0; 3 - 23.2; 4 - 225; 5 - 439; 6 -1259. По вертикали - активность АЦ в процентах (базальная активность в каждом случае принята за 100%).

2.3. Сравнительное исследование чувствительности к биогенным аминам активности АЦ во фракциях плазматических мембран тканей моллюска и крысы

Нами было изучено влияние серотонина (гладкие мышцы моллюска и стриатум мозга крысы) и изопротеренола (мышцы и мозг крысы) на активность АЦ и потенцирование эффекта биогенных аминов ГН (Шпаков, Деркач, 1999). Показано, что серотонин в концентрациях 10"э-10"5 М оказывает дозозависимое стимулирующее действие на активность АЦ в гладких мышцах моллюска, оказывая максимальный стимулирующий эффект в концентрациях 10"6 и 10"5 М -154 и 149 % соответственно.

Изопротеренол, действующий на АЦ через р-АР, стимулировал активность фермента в скелетных мышцах крысы также дозозависимым образом (максимальный стимулирующий эффект достигался при концентрациях гормона 10"6 и 10"5 M и составлял 63 и 67 %). Таким образом, максимум стимулирующего действия биогенных аминов на АЦ в мышцах моллюска и крысы достигался при тех же концентрациях гормонов, что и в случае действия последних на АЦ инфузорий. В то же время, если эффекты серотонина на АЦ высших эукариот и инфузорий в стационарной фазе роста были сопоставимы, то эффекты изопротеренопа в случае инфузорий были заметно менее выражены по сравнению с таковыми в случае мышц моллюска и крысы. Стимулирующие эффекты биогенных аминов в тканях моллюска и крысы потенцировались ГН в отличие от таковых в клетках инфузорий.

3. Идентификация и характеристика адренергичесхих рецепторов в клеточных культурах инфузорий, а также исследование регуляторного влияния биогенных аминов на ГТФ-связывающую активность G-белков.

Обнаружение регуляторного эффекта адреналина и изопротеренола на активность АЦ в клеточных культурах инфузорий стало отправной точкой для идентификации и характеристики в клетках инфузорий связывающих мест, с которыми специфично взаимодействуют АР ашнисты, а также для исследования регуляторного влияния серотонина и АР агонистов на ГТФ-связывающую активность сопрягающего компонента АЦС - G-белков

3.1. Выявление и характеристика АР в клеточных культурах инфузорий

Показано, что РН]-ДГА связывается с мембранами обеих инфузорий. Уровень неспецифического связывания был сравнительно высок и составлял в случае Danser45-60 % и в случае T.pynformis 6575 % от общего. связывания, что, вероятно, связано с гетерогенностью мембранной фракции. Рассчитанные нами значения Кд составили: для D.anser - 13 нМ, для Tpynformis - 27 нМ. Таким образом, связывание [3Н]-ДГА с мембранами инфузорий осуществлялось с аффинностью, на один-два порядка более низкой по сравнению с таковой, наблюдаемой в случае ¡5-АР высших эукариот (Шпаков и ДР., 2004)

Для характеристики сайтов, связывающих [3Н]-ДГА, были проведены эксперименты по конкурентному вытеснению меченого антагониста лигандами р-АР агонистом изопротеренолом и антагонистами поопранололом и атенололом (рис. 3) (Шпаков и др, 2004). В случае D.anser значения IC50 для изопротеренола, пропранолола и атенолола составили 1 3, 0.076 и 48 мкМ, значения Кинг -0.27, 0.016 и 101 мкМ, соответственно. В случае Tpyriformis IC50 для тех же лигандов составили 2 0, 0.295 и 44 мкМ, значения КИНг - 0.70, 010 и 15.4 мкМ соответственно. В присутствии ГТФ (10"5 М) наблюдалось смещение вправо кривой конкурентного вытеснения рН)-ДГА изопротеренолом (рис. 3). В случае Danser это приводило к увеличению IC50 более чем на порядок (17.0 мкМ), в то время как в случае T.pynformis сдвиг был слабо выражен (Ю50 = 39 мкМ). Полученные данные указывают на то, что в клетках инфузорий присутствуют рецепторы, способные специфично связываться с агонистами и антагонистами р-АР и по этому показателю сходные с р-АР высших эукариот

Рис. 3. Вытеснение лигандами АР меченого рН]-ДГА из связывающих мест в мембранных фракциях клеточных культур О.агкег и Т.руМогтк. 1 - пропранолол; 2 - изопротеренол; 3 - атенолол; 4 -изопротеренол + ГТФ, Ю-5 М.__

3.2. Исследование влияния антагонистов АР на активность АЦ с целью функциональной характеристики АР в клетках инфузорий

Стимулирующие эффекты адреналина и изопротеренола на АЦ О.апБег были чувствительны к блокаторам р-АР: практически полностью снимались в присутствии пропранолола (105 М) и заметно снижались в присутствии атенолола (105 М) (табл. 3) (Шпаков и др., 2004). В то же время в присутствии антагонистов а^АР йохимбина и идазоксана эти эффекты либо не менялись, либо несколько усиливались. Эти данные указывают на включение р-АР в передачу сигнала, генерируемого АР агонистами, в клетках О.апБег. В культуре Т.ругйопп^ в присутствии блокаторов Р-£Р пропранолола и атенолола стимулирующий эффект изопротеренола практически полностью снимался, в то время как ингибирующий эффект адреналина не менялся (табл. 3). В присутствии аг-АР блокаторов наблюдалось полное снятие ингибирующего действия адреналина и усиление стимулирующего влияния изопротеренола. Полученные результаты указывают на то, что адреналин оказывает ингибирующее влияние на активность АЦ через рецепторы, близкие по ряду своих свойств аг-АР позвоночных животных.

3.3. Регуляция серотонином и АР агонистами ГТФ-связывающей активности гетеротримерных в-белков в клетках инфузорий.

Для доказательства участия гетеротримерных С-белков в процессе передачи гормонального сигнала, генерируемого биогенными аминами, было исследовано их влияние на ГТФ-связывающую активность й-белков в гомогенатах клеток инфузорий. Обнаружено, что серотонин и адреналин

дозозависимо стимулируют ГТФ-связывание в клеточных культурах 0.ап$ег и ТрупЬтив, что выражается в повышении уровня связывания меченого Срр[ИН]р (рис. 4) (Шпаков и др, 2004).

Таблица 3. Действие антагонистов АР на базальную и подвергнутую действию гормонов активность АЦ инфузорий Р.атаег и Т.руп(огт1з (активность АЦ - в ЕД)_

Антагонист, ю-зм В отсутствие гормонов Адреналин, 10-БМ Изопротеренол, Ю-бМ

0|1ерШБ апэег

Без антагониста 1345+95 2140+120 (+59) 1900+105 (+41)

Пропранолол 1005+80 (-25) 1180±125[+17] 1125±100[+12]

Атенолол 1155+85 (-14) 1575+130 [+36] 1465±125 [+27]

Йохимбин 1400±110 (+4) 2370+135 [+69] 2065+110 [+48]

Идазоксан | 1395±95(+4) 2295±90[+65] 1955+125 [+40]

Те^утепа рупй)птаз

Без антагониста 17.4+0.8 12.3±1 2 (-29) 19.8+1.4 (+14)

Пропранолол 16 8±0.9(-3) 11.9±0.7[-29] 16.3±09[-3]

Атенолол 15.8±1.1 (-9) 11.6+1.2 [-27] 17.1 ±0 8 [+8]

Йохимбин 23.9±1.4 (+37) 25.0±1.0 [+5] 28.6±1.2[+20]

Идазоксан 19.0+0.6 (+13) 21.9±1.2 [+15] 24.0±1.7[+26]

В круглых скобках приведена величина стимулирующего или ингабирующего эффекта гормонов на активность АЦ (в %) по отношению к базальной активности фермента, в квадратных скобках - величина эффекта гормонов на активность АЦ (в %) по отношению к активности АЦ, подвергнутой действию антагонистов АР.

Рис. 4. Стимуляция серотонином и адреналином ГТФ-связывающей активности в культурах инфузорий.

Серотонин наиболее эффективно стимулировал ГТФ-связывание в случае D.anser в концентрации Ю-5 М, в случае T.pyriformis-Ю-8 М. Адреналин оказывал максимальное стимулирующее влияние на ГТФ-связывание в концентрации 10"5 М. В то же время, стимулирующий эффект р-агониста изопротеренола на ГТФ-связывание у инфузорий проявляется заметно слабее и при действии 10-5 M изопротеренола составлял у D.anser 68 %, а у T.pyriformis - 17 %. Подтверждением участия гетеротримерных G-белков в реализации регуляторного влияния биогенных аминов является практически полное блокирование их эффектов на ГТФ-связывание в присутствии сурамина (10'5 М) -ингибитора гетеротримерных G-белков (Шпаков и др., 2004).

4. Регуляция функциональной активности АЦ инфузорий глюкагоном в сравнении с таковой в сердце куриных эмбрионов

4.1. D.anser

Рецептор глюкагона в тканях позвоночных животных функционально сопряжен с АЦ в основном через Gs-5enoK. Через него гормон осуществляет стимуляцию активности фермента АЦ. В то же время, возможен и альтернативный вариант функционального сопряжения рецептора глюкагона с С,-белком.

В гомогентате клеточной культуры D.anser глюкагон млекопитайэщих оказывает отчетливое стимулирующее действие на активность АЦ в концентрациях 10"9-10-7 M (Деркач и др., 1992,2002). При более высоких концентрациях гормона его стимулирующий эффект полностью подавляется, что может быть связано с активацией глюкагоном путей, ингибирующих активность АЦ. Потенцирования эффекта глюкагона ГН не наблюдалось. Так при совместном действии 107 M глюкагона и 1СИ M ГТФ стимуляция АЦ составляет 34 %, то есть не отличается от таковой при раздельном действии гормона и ГТФ.

4.2. T.pyriformis

Глюкагон стимулирует активность АЦ T.pyriformis в концентрациях от Ю-9 до Ю-5 М, оказывая ингибирующий эффект на активность фермента в концентрации 1(Н M (Деркач и др., 2003). Обнаружено, что величина стимулирующего эффекта глюкагона (Ю-8 М) в значительной степени определяется уровнем базальной активности АЦ T.pyriformis (рис. 5, А). В наибольшей степени гормон стимулирует АЦ в культурах T.pynformis с низкими базальными активностями фермента - 3.1 (на 284 %) и 46 3 ЕД (на 262%). Если в культурах с низким уровнем базальной активности фермента ингибирующее действие глюкагона начинает проявляться только при его концентрациях, намного превышающих физиологические (104 М), то в культурах с высокой базальной активностью ингибирующий эффект гормона начинает проявляться лри его действии в концентрациях Ю'МО-6 M и становится значительным по величине. Так при действии Ю-5 M глюкагона на культуры с базальной активностью АЦ, равной 439 и 1259 ЕД, активность фермента составляет соответственно 60 и 30 % от величины базальной активности АЦ. Причина проявления ингибирующего эффекта состоит в активации ингибирующих АЦ путей глюкагоном в концентрациях, превышающих физиологические (Christophe,

1995). При этом ингибирующее влияние глкжагона наиболее заметно проявляется на фоне высокой базальной активности АЦ, характерной для инфузорий, находящихся в экспоненциальной стадии роста.

Уровень базальной активности АЦ Тругйогтк определяет величину потенцирования стимулирующего эффекта глкжагона ГН, в качестве которых был избран Срр[ЫН]р (107 М) (рис. 5, Б). Потенцирующий эффект рассчитывали как разность между величиной стимулированной активности фермента при совместном действии глюкагона и Срр[К'Н]р и величиной арифметической суммы активностей фермента при раздельном действии гормона и ГН. Значительное по величине потенцирование гормонального эффекта гуаниновым нуклеотидом в культурах Т.руМотз с низкой базальной активностью указывает на императивность процессов активации рецептора и 6-белка, что является еще одним свидетельством в пользу функционального сопряжения стимулируемого глюкагоном рецептора с 63-белком в клетках инфузорий.

400

350

зоо

250 200 150 100 50 О

1 2345678910111213 Культура инфузорий

123456789 10111213 Культура инфузорий

Рис. 5. Влияние глюкагона (Ю-8 М) (А) на активность АЦ ТрупЬгтт и потенцирование его эффекта Срр[Щр (107 М) (Б) в зависимости от величины базальной активности АЦ. Цифры по горизонтали -культуры с базальной активностью АЦ (ЕД): 1 - 3.1; 2 - 141; 3 - 18.0; 4 - 26.5; 5 - 42.1; б - 43 0; 7 -46.3,8-627; 9 - 66 6, 142; 11-225; 12 - 439; 73-1259.

4.3. Регуляция активности АЦ во фракции плазматических мембран куриных эмбрионов глюкагоном 8 сравнении с таковой в гомогензте шетрахимены

Глюкагон оказывает дозозависимое стимулирующее влияние на активность АЦ во фракции плазматических мембран желудочков сердца 16-ти-дневных куриных эмбаионов, причем форма кривой зависимости активности АЦ от концентрации гормона качественно не отличается от таковой, полученной для тетрахимены (Деркач и др., 1992). В пользу сходства глюкагон-чувствительной АЦС ТрупЬтв с таковой сердца куриных эмбрионов свидетельствуют результаты, полученные при исследовании влияния глюкагона и совместно глюкагона и Срр[ЫН]р на активность АЦ во фракции

плазматических мембран сердца 11-ти-дневных куриных эмбрионов. Обнаружено, что стимулирующий эффект гормона на АЦ и его потенцирование ГН в гомогенатах Т.ругИогтя с низким уровнем базальной активности фермента характеризуются значительным сходством с таковыми, наблюдаемыми для куриных эмбрионов (рис. 6).

Рис. 6. Сравнение глюкагон-чувствительной АЦС в гомогенате Т.ругйогт'к с базальной активностью 180 ЕД и во фракции плазматических мембран сердца 11-ти-дневных куриных эмбрионов. 1 - без добавок; 2 - глюкагон, 10-8 М; 3 -СррЩр, 107 М; 4 - глюкагон, 10* М, + Срр[МН]р, 10"7 М. Над столбиками, соответствующими совместному действию глюкагона и Срр[ЫН]р, указана величина потенцирующего эффекта.

5. Обнаружение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы в гомогенатах инфузорий и ее регуляция гормонами в сравнении с таковой высших эукариот

Функциональная активность ПКА, контролирующей широкий спектр ростовых и метаболических процессов в клетке, регулируется через АЦС, Несмотря на то, что а настоящее время в тканях высших эукариот ПКА исследована обстоятельно, данные по этому ферменту у одноклеточных организмов в литературе единичны. Вследствие этого, нами была поставлена задача - выявить активность ПКА у инфузорий и изучить, каким образом на нее влияют гормоны-регуляторы АЦС.

Общая активность ПКА в гомогенатах клеточных культур инфузорий дилептуса и тетрахимены в отсутствие цАМФ составляет 446 и 112, в присутствии цАМФ - 685 и 254 пмопь включенного рР]-фосфата за 1 мин на 1 мг белка соответственно (Шпаков и др., 2003а) Отношение активностей ПКА в отсутствие цАМФ к таковой в прису1ствии цАМФ в гомогенатах инфузорий В.ап$ег и Г.рулЛэттгё составило 0 65 и 0 44 соответственно. У О.этеег фермент стимулировался как биогенными аминами, так и глюкзгоном (рис. 7). Однако стимулирующее действие глюкагона на ПКА в целом было значительно более выраженным, чем таковое биогенных аминов. У Г.ру/т/огтк биогенные амины практически не влияли на активность ПКА, в то время как глюкагон заметно ее повышал (рис. 7) Действие гормонов на активность ПКА и АЦ было однонаправленным, что указывает на функциональную связь между этими ферментами у инфузорий подобно тому, как это происходит у высших эукариот.

Исследование ПКА в тканях моллюска и крысы показало, что отношение активностей, определяемых в отсутствие и в присутствии цАМФ, в гладких мышцах моллюска равно 0.39, в скелетных мышцах крысы - 0.29. Серотонин (моллюск) и изопротеренол (крыса) а концентрациях 10^ М

10001

^ 800 о4

< 600л

8 400-1 х а

| 200-

452%

410%

Т.ругНогтЫ

эмбрионы кур

стимулировали активность фермента на 63 и 52 %, соответственно. Глюкагон (Ю-7 М) стимулировал ПКА только в мышцах моллюска (на 39 %), почти не влияя на нее в мышцах крысы. Таким образом, ЛКА высших эукариот по своей чувствительности к гормонам-стимуляторам АЦ сходна с таковой инфузорий.

D.anser

T.pyriformis

Рис. 7. Влияние биогенных аминов (Ю-6 М) и глюкагона (Ю-7 М) на активность ПКА в гомогенатах инфузорий Danser и Tpynformis. Активность фермента в контроле принята за 100%.

6. Влияние двухвалентных катионов тяжелых металлов на функциональную активность АЦ в гомогенатах клеточных культур инфузорий и моллюсков

Как известно, инфузории широко используются в качестве биоиндикаторов состояния водной среды. Исследование влияния КТМ in vivo и in vitro на функциональную активность АЦС пресноводных моллюсков (Шпаков, Деркач, 1994а, 19946; Деркач, Шпаков, 1999) показало ее высокую чувствительность к этим наиболее распространенным загрязнителям окружающей среды. На основе полученных данных мы решили исследовать возможность испопьзования АЦС инфузорий в качестве высокочувствительного тест-объекта для изучения состояния водных бассейнов. 6,1. D.anser

Добавление а инкубационную среду КТМ приводит к существенному снижению базапьной активности АЦ инфузорий D.anser (Деркач и др., 1995). Так катионы ртути в концентрации 104 М ингибируют базальную активность АЦ на 94 %, кадмия, цинка, свинца и меди - на 75, 66, 53 и 41 % соответственно. Стимуляция АЦ ГТФ (Ю-6 М) полностью снимается в присутствии всех изученных катионов, кроме свинца. В концентрации 10"6 М катионы кадмия, меди, свинца и цинка не оказывают выраженного ингибирующего эффекта на активность АЦ, а стимулирующее действие ГТФ (Ю-6 М) и форсколина (10"5 М) в этих случаях частично сохраняется. В то же время катионы Нд2"*" (10-6 М) снижают базальную активность АЦ на 56 %, стимулирующие эффекты ГТФ и форсколина отсутствуют. Таким образом, по степени токсического действия на АЦ D.anser in vitro двухвалентные КТМ располагаются в следующий убывающий ряд- Hg2-"> Cd2+ > Zn2+> Pb2+ > Си2\

Результаты исследования влияния КТМ на активность АЦС /л' vitro были сопоставлены с данными, полученными нами по их влиянию на ростовую активность инфузорий in vivo (Деркач и др,

1995). При концентрациях КТМ в среде 104 M время гибели 50 % инфузорий для разных катионов было следующим: Нд2+ -1 ч, Си2+ -1 ч 20 мин, Cd2+ - 3 ч, РЬ2- - 6 ч, Zn2+ -15 ч. Концентрации КТМ, при которых 50 % инфузорий погибали за 4 ч, оказались следующими: H g2* -1 мкм, Си2* -1.5 мкм, Cd2+ -3 мкм, РЬ2+- 20 мкм, Zn2* - 90 мкм. Таким образом, для дилептусов показан следующий ряд токсичности КТМ по их влиянию на ростовую активность инфузорий: Hg2* > Cu2+ > Cd2* > Pb2t > Zn2+. 6.2. T.pyriformis

ALjC инфузории T.pyriformis, так же как и АЦС D.anser, в значительной степени ингибируется КТМ in vitro (Деркач и др., 1995). Катионы ртути, свинца, цинка, меди и кадмия в концентрации 10"4 M снижают базальную активность фермента на 82, 80, 79, 72 и 54 % соответственно. Стимулирующие эффекты ГТФ Ю-6 M и форсколина Ю-5 M на АЦ, составляющие 26 и 34 % соответственно, полностью снимаются в присутствии этих катионов. Суммируя полученные данные, мы получили следующий убывающий ряд токсичности КТМ в отношении АЦС тетрахимены: Нд2- > РЬ2" > Zn2+ > Cu2* > Cd2+.

С целью сопоставления токсичности КТМ в отношении АЦС in vitro и жизнеспособности тетрахимен в присутствии этих катионов in vivo нами было исследовано влияние КТМ на рост клеточной культуры Tpyriformis. Показано, что наиболее выраженное токсическое действие на Tpynformis оказывали катионы кадмия и ртути: через 24 ч жизнеспособность в присутствии этих катионов (по сравнению с контролем) сохраняли только 10 и 15 % клеток, соответственно. Под влиянием катионов меди "ерез 24 ч жизнеспособными оставались 57 % инфузорий. Катионы РЬ2* и Zn2"- не оказывали заметного влияния на клеточный рост. Таким образом, ряд токсичности КТМ для тетрахимен in vivo сходен с таковым для дилептусов и выглядит следующим образом: Cd2+ > Hg2* > Cu2"- > Pb2+ s Zn2+.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлена и охарактеризована аденилатциклазная сигнальная система (АЦС) в клеточных культурах представителей низших эукариот - инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis. Исследование культур T.pynformis с различной плотностью и различного возраста показало, что фактором, определяющим уровень базальной активности АЦ, является стадия развития культуры. Показано, что АЦ инфузорий, как и АЦ высших эукариот, стимулируется такими активаторами фермента, как катионы марганца, NaF, гуаниновые нукпеотцды, форсколин, причем величина их стимулирующего эффекта определяется уровнем базальной активности фермента

2. Показано, что глюкагон и биогенные амины, действующие через рецепторы серпантинного типа, могут регулировать активность АЦ в культурах инфузорий. Величина и "направленность их эффекта определяются уровнем базальной активности фермента. Специфичность действия биогенных аминов на АЦ доказывается блокированием эффектов гормонов антагонистами адренергических и серотониновых рецепторов.

3. В клеточных культурах инфузорий выявлены адренергические рецепторы, специфично связывающиеся с p-адренергическими лигандами с аффинностью более низкой в сравнении с рецепторами высших эукариот. Показано, что ГТФ-связывающая активность гетеротримерных G-белков увеличивается под действием биогенных аминов. Полученные данные указывают на присутствие в клетках инфузорий функционально активной гормоночувствительной АЦС, включающей адренергические рецепторы, гетеротримерные G-белки и фермент АЦ

4. В клеточных культурах D.anseru T.pynformis впервые обнаружена активность протеинкиназы А (ПКА) и исследована ее регуляция гормонами. Действие гормонов на активность ПКА и АЦ является однонаправленным, что указывает на функциональную связь мевду ними, как это наблюдается у высших эукариот.

5. Показано, что катионы тяжелых металлов нарушают функционирование АЦС инфузорий т w'fro и снижают их выживаемость в условиях in vivo. Это указывает на возможность использования АЦС D.anser и T.pyriformis в качестве высокочувствительного экотоксикологическога тест-объекта для оценки состояния водных бассейнов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Деркач К.В., Кузнецова Л А, Ирлина И.С., Перцева М.Н. Обнаружение глюкагончувствительной аденилатциклазной системы у инфузории Tetrahymena pyroformis II Журнал эволюционной биохимии и физиологии 1992. Т. 28 (5). С. 556-561.

2. Шпаков А.О, Деркач К.В. Влияние катионов тяжелых металлов на активность аденилатциклазной системы гладких мышц и гепатопанкреаса некоторых двустворчатых и брюхоногих моллюсков II Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1994а. Т. 30 (4). С. 516-524.

3. Шпаков АО., Деркач К.В. Влияние катионов меди и кадмия in vivo и in vitro на активность аденилатциклазы и 5'-нуклеотидазы в тканях пресноводных моллюсков II Журнал эволюционной биохимии и физиологии 19946. Т. 30 (6) С. 729-737.

4. Деркач К.В., Шпаков А.О., Успенская З.И , Голикова М Н. Влияние катионов тяжелых металлов на активность аденилатциклазы и на рост инфузорий Tetrahymena pynformis и Dileptus anser в культуре II Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1995. Т 31 (1). С. 44-51. ,

5. Деркач К.В., Шпаков А.О., Успенская 3 И. Ингибирование активности аденилатциклазы и роста культуры инфузорий Dileptus anser под влиянием катионов тяжелых металлов II Цитология. 1995. Т. 37 (4). С. 370.

6. Шпаков АО., Деркач К.В. Нарушение функционирования гормон-чувствительной аденилатциклазной системы гепатопанкреаса некоторых пресноводных моллюсков под влиянием in vivo катионов меди и кадмия II Цитология. 1995 Т 37 (4). С. 400-401.

7. Деркач К.В., Шпаков А.О. Чувствительность аденилатциклазной системы молпюска Anodonta судпеа к действию катионов тяжелых металлов II Материалы Конференции "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций». С-Петербург. 1995 С. 62.

8. Derkach K.V., Shpakov A.O. The mechanisms of heavy metal cation action on the adenylate cyclase signalling system of ciliata, molluscs and mammals II Proc. SEB Annual Meeting. Lancaster University, England March 24-29,1996. Abstract A5.18.

9. Шпаков A.O., Деркач K.B., Перцева M.H. Аденилатциклазная сигнальная система инфузорий как высокочувствительный биотест в экологическом мониторинге качества воды II Сб. Международной конференции "Инфузории в биотестировании", СПб, 1998. С. 93-94.

10. Деркач К.В., Шпаков АО, Успенская З.И, Перцева МН. Ингибирование катионами тяжелых металлов in vitro аденилатцикпазной сигнальной системы инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis II Сб. Международной конференции "Инфузории в биотестировании", СПб, 1998. С. 96-97.

11. Деркач К.В., Шпаков А 0., Успенская 3 И. Влияние катионов тяжелых металлов на рост инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis в культуре II Сб. Международной конференции "Инфузории в биотестировании", СПб, 1998. С. 202-203.

12. Деркач К.В., Шпаков АО. Влияние дитиотреитола и меркаптоэтанола на функциональную активность аденилатцикпазной ситальной системы в гладких мышцах пресноводного моллюска Anodonta cygnea II Цитология. 1998. Т. 40 (12). С. 1031-1036.

13. Шпаков А.О, Деркач К.В. Роль сульфгидрильных групп в функционировании компонентов аденилатцикпазной сигнальной системы в гладких мышцах моллюска Anodonta cygnea (Влияние N-этилмалеимида и ларз-хлормеркурибензойной кислоты) II Цитология. 1999. Т. 41 (6). С. 499-505.

14. Derkach K.V., Shpakov А.О., Kuznetsova L.A., Uspenskaya Z.I., Plesneva S.A., Pertseva M.N. The hormone-sensitive adenylyl cyclase system of infusorians Dileptus anser and Tetrahymena pyriformis II Proc. 21st Conference of European comparative endocrinologists, Bonn, Germany. August 26-30,2002. P. 93.

15. Деркач K.B., Шпаков A.O, Кузнецова Л.А., Плеснева C.A., Успенская З.И, Перцева МН. Гормоночувствительная аденилатциклазная система инфузории Dileptus anser //Цитологая. 2002. Т 44 (11). С. 1129-1134.

16. Шпаков А.О., Деркач К.В., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Успенская 3 И., Перцева М.Н. Новые данные в пользу сходства функциональных блоков инсулиновой сигнальной системы низших и высших эукариот II Сб. тезисов Второй научной конференция с международным участием «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии». Новосибирск. 15-17 октября, 2002. С. 184.

17. Шпаков А.О, Деркач К.В., Успенская З.И., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Регуляция биогенными аминами и пептидными гормонами активности аденилатциклазы и протеинкиназы А у инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis II Доклады Академии наук. 2003а. Т. 388 (2). С. 275277.

18. Шпаков АО., Деркач К.В., Перцева М.Н. Гормональные системы низших эукариот II Цитология. 20036. Т 45(3). С. 223-234

19. Деркач К.В., Шпаков А О, Кузнецова Л.А., Ирлина И С., Плеснева С А, Перцева М.Н. Регуляция аденилатциклазной системы инфузории Tetrahymena pyriformis гормональными и нетривиальными

— агентами и ее зависимости от уровня базальной активности аденилатциклазы II Журнал эволюционной биохимии и физиологии 2003. Т. 39 (4). С. 332-338.

20. Derkach K.V., Shpakov А.О, Uspenskaya Z.I. et al The regulation of adenylyl cyclase and protein kinase A in the cell cultures of ciliata Dileptus anser and Tetrahymena pyriformis by peptide hormones II FEBS J 2003. V. 270. Suppl 1 P. 57.

21. Шпаков A.O., Деркач K.B., Успенская З.И, Шпакова ЕА, Кузнецова Л А., Плеснева С.А., Перцева М Н. Молекулярные механизмы действия лигандов адренергических рецепторов высших эукариот на функциональную активность компонентов аденилатциклазной сигнальной системы инфузорий II Цитология 2004 Т. 46 (3). С. 000-000. (в печати)

Отпечатано ЧП Рикон пр. Металлистов, 62 тир. 50 экз. заказ 141103

¿189 65

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Деркач, Кира Викторовна

Список принятых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Гормончувствительная аденилатциклазная сигнальная система высших эукариот

1.1.1. Рецепторы, функционально сопряженные с аденилатциклазой

1.1.2. Гетеротримерные ГТФ-связывающие белки

1.1.3. Аденилатциклаза

1.1.4. цАМФ-зависимая протеинкиназа

1.2. Гормональные сигнальные системы низших эукариот

1.2.1. Обнаружение у низших эукариот гормонов, сходных

Ф с таковыми высших эукариот

1.2.2. Рецепторы 27 Рецепторы серпантинного типа.

Рецепторы, родственные рецепторам тирозинкиназного типа высших эукариот

1.2.3. в-белки 32 а-Субъединицы С-белков

3- и у-Субъединицы С-белков

1.2.4. Аденилатциклаза и гуанилатциклаза - ферменты-генераторы вторичных посредников

1.2.5. цАМФ-зависимая протеинкиназа 47 1.3. Заключение

ГЛАВА 2. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

2.1. Экспериментальные животные

2.2. Химические реактивы

2.3. Получение гомогенатов и грубых мембранных фракций клеточных культур инфузорий

2.4. Получение фракций плазматических мембран с использованием ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы

2.4.1. Получение фракции сарколеммальных мембран гладких мышц ноги моллюска А поЛоШа cygnea

2.4.2. Получение фракций плазматических мембран сердца куриных эмбрионов

2.4.3. Получение фракций сарколеммальных мембран скелетных мышц крыс

2.4.4. Получение фракции плазматических мембран мембран стриатума мозга крысы

2.5. Определение активности 1У^2+-зависимой аденилатциклазы 56 2.5:1. Метод с использованием [а-32Р/А ТФ в качестве субстрата

2.5.2. Метод с использованием [№ЩАТФ в качестве субстрата

2.6. Определение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы

2.7. Определение связывающих мест с помощью меченого 13Н]-дигидроальпренолола

2.8. Определение ГТФ-связывающей активности в-белков

2.9. Определение ростовой активности инфузорий

2.10. Проведение экотоксикологических опытов с моллюсками

2.11. Определение белка по методу Лоури

2.12. Статистическая обработка полученных результатов

2.13. Теоретические исследования первичной структуры белков

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Описание объектов исследования и обоснование их выбора

3.2. Обнаружение и функциональная характеристика активности аденилатциклазы в гомогенатах инфузорий

3.2.1. Dileptus unser

3.2.2. Tetrahymena pyriformis

3.2.3. Сравнительная характеристика функциональной активности АЦ в тканях высших эу кар йот

3.3. Регуляция функциональной активности аденилатциклазы в гомогенатах клеточных культур инфузорий биогенными аминами ^ в сравнении с таковой в тканях высших эукариот

3.3.1. Dileptus ans er

3.3.2. Tetrahymena pyriformis

3.3.3. Сравнительное исследование чувствительности к биогенным аминам активности ЛЦ во фракциях плазматических мембран тканей моллюска и крысы

3.4. Идентификация и характеристика адренергических рецепторов в клеточных культурах инфузорий, а также регуляторного влияния биогенных аминов на ГТФ-связывающую активность G-белков f 3.4.1. Выявление и характеристика адренергических рецепторов в клеточных культурах инфузорий

3.4.2. Исследование влияния антагонистов адренергических рецепторов на активность АЦ с целью функциональной характеристики адренергических рецепторов в клетках инфузорий

3.4.3. Регуляция серотонином и адренергическими агонистами ГТФ-связывающей активности гетеротримерных G-белков в клетках инфузорий.

3.5. Регуляция функциональной активности АЦ инфузорий глюкагоном в сравнении с таковой в сердце куриных эмбрионов

3.5. /. Dileptus anser

3.5.2. Tetrahymena pyriformis

3.5.3. Регуляция активности АЦ во фракции плазматических мембран куриных эмбрионов глюкагоном в сравнении с таковой Tetrahymena pyriformis

3.6. Обнаружение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы в гомогенатах инфузорий и ее регуляция гормонами в сравнении с таковой высших эукариот

3.6. 1. Dileptus unser и Tetrahymena pyriformis 3.6.2. Высшие эукариоты

3.7. Влияние двухвалентных катионов тяжелых металлов на функциональную активность АЦ инфузорий и моллюсков

3.7.1. Dileptus unser

3.7.2. Tetruhymenu pyriformis

3.7.3. Влияние китионов тяжелых металлов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы высших эукариот

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 102 ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная организация аденилатциклазной сигнальной системы инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis"

Актуальность проблемы.

В настоящее время молекулярные механизмы функционирования гормональных сигнальных систем высших эукариот и, в первую очередь, высших позвоночных животных хорошо изучены. В то же время информация о гормональных сигнальных системах одноклеточных организмов (низших эукариот) крайне 'Скудна и противоречива. Отсутствие понимания того, каким образом функционируют сигнальные системы у низших эукариот, не позволяет проследить пути эволюции эндокринной системы на ранних этапах развития многоклеточных организмов и выявить ключевые этапы формирования гормонокомпетентности эукариотической клетки.

Одной из наиболее важных и широко распространенных сигнальных систем, опосредующих регуляторное действие различных по своей химической природе гормонов, является аденилатциклазная сигнальная система (АЦС), включающая три основных компонента, ассоциированных с плазматической мембраной клетки. Первый из них представляет собой рецептор серпантинного типа, семь раз г пронизывающий плазматическую мембрану, который специфически опознает сигнальную молекулу (гормон). Вторым, сопрягающим, компонентом является гетеротримерный ГТФ-связывающий белок (в-белок) стимулирующего или ингибирующего типа, передающий сигнал на третий, каталитический, компонент АЦС - фермент аденилатциклазу (АЦ). В свою очередь, АЦ, осуществляя синтез вторичного посредника цАМФ, регулирует, таким образом, функциональную активность эффекторного белка - фермента цАМФ-зависимой протеинкинзы (ПКА).

К настоящему времени значительный прогресс достигнут в изучении структурно-функциональной организации АЦС, а также молекулярных механизмов функционального сопряжения компонентов этой системы у высших позвоночных и. в меньшей степени, многоклеточных беспозвоночных животных. Так, показано, каким образом осуществляется функциональное сопряжение между сигнальными белками - компонентами АЦС, как регулируется функциональная активность этих белков. .Клонированы гены, кодирующие белки - компоненты АЦС, известны аминокислотные последовательности (АКП) этих белков, что позволяет выявить в их молекулах функционально активные сайты, определить пространственную структуру доменов, ответственных за их функциональную активность, создать модели белок-белковых комплексов, которые определяют процесс векторной передачи сигнала с активированного лигандом рецептора на эффекторные звенья АЦС.

Большой вклад в изучение молекулярных механизмов функционирования гормоночувствительной АЦС у позвоночных и беспозвоночных животных внесли и исследования, проводимые в лаборатории молекулярной эндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН. Эти исследования, начатые еще в конце 70-х годов и обобщенные в монографии М.Н. Перцевой (1989), направлены на сравнительное изучение АЦС животных различного филогенетического уровня и имеют своей целью выяснение путей эволюции этой системы. На основе обобщения полученных в лаборатории экспериментальных данных и сведений литературы, а также их всестороннего анализа и выявления ряда закономерностей в эволюции АЦС Перцевой М.Н. была выдвинута гипотеза о формировании гормональных сигнальных систем на самом раннем этапе развития эукариотической клетки - на уровне одноклеточных организмов (Реггзеуа е1 а1., 1991). Подтверждение этой гипотезы, в значительной мере меняющей существующие представления в современной молекулярной эндокринологии и эволюционной биохимии, стало основной целью предпринятой нами работы.

Детальный анализ современного состояния проблемы структурно-функциональной организации сигнальных систем низших эукариот указывает на то, что роль АЦС в реализации регуляторного влияния гормонов и сигналов негормональной природы в клетках низших эукариот до сих пор практически не исследована (Шпаков и др., 2003а). В то же время в последние годы в геноме ряда представителей низших эукариот обнаружены гены, кодирующие белки -компоненты АЦС. В клетках инфузории Те(гаИутепа ругфэгти выявлены гормоны, характерные для высших эукариот, которые способны регулировать пищевое поведение инфузорий и метаболизм. Эти данные позволяют предположить наличие функционально активной АЦС у таких сравнительно примитивных организмов, как низшие эукариоты.

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в обнаружении и структурно-функциональной характеристике гормоночувствительной АЦС в клетках представителей низших эукариот - инфузорий ВИерШя атег и Те1гаЪутепа руп/огтм. Молекулярные механизмы функционирования АЦС инфузорий изучали в сравнении с таковой представителей позвоночных и беспозвоночных животных (высших эукариот), используя эволюционный подход.

Основные задачи работы состояли в следующем:

1. Функционально охарактеризовать АЦС инфузорий О.атег и Т.руг{]огт1.ч с использованием веществ негормональной природы в сравнении с АЦС беспозвоночных (моллюск Апорта cygnea) и позвоночных животных (крыса, куриные эмбрионы).

3. Исследовать включение рецепторов и гетеротримерных О-белков в процесс передачи гормонального сигнала через АЦС инфузорий.

4. Выявить активность цАМФ-зависимой протеинкиназы в клетках инфузорий и изучить ее регуляцию веществами гормональной природы.

Положения выносимые на защиту.

1. В клеточных культурах инфузорий D.unser и T.pyriformis присутствует аденилатциклазная сигнальная система, функциональная активность которой регулируется как агентами негормональной природы (фторид натрия, катионы марганца, гуаниновые нуклеотиды, форсколин), так и гормонами: биогенными аминами и пептидным гормоном высших эукариот - глюкагоном.

2. Чувствительность аденилатциклазной сигнальной системы к негормональным и гормональным воздействиям зависит от уровня базальной активности аденилатциклазы в клеточных культурах инфузорий.

3. В мембранной фракции обеих инфузорий присутствуют, рецепторы, специфически связывающиеся с адренергическими лигандами и функционально сопряженные с гетеротримерными G-белками.

4. Эффекторным звеном АЦС инфузорий, также как и в случае высших эукариот. является фермент цАМФ-зависимая протеинкиназа.

5. АЦС инфузорий D.anser и T.pyriformis может служить тест-объектом для оценки степени загрязнения водных бассейнов катионами тяжелых металлов.

Основные результаты, научная новизна работы.

В клеточных культурах представителей одноклеточных организмов инфузорий D.anser и T.pyriformis впервые выявлена и охарактеризована АЦС. Показано, что фактором, определяющим уровень базальной активности АЦ T.pyriformis, является доля делящихся инфузорий (стадия развития культуры). Обнаружено, что АЦ инфузорий стимулируется такими активаторами фермента, как Mn2+, NaF, гуаниновые нуклеотиды (ГН), форсколин, причем величина их стимулирующего эффекта определяется уровнем базальной активности фермента.

Впервые показано, что гормоны высших эукариот 'глкжагон и серотонин (у D.anser также адреналин и изопротеренол), действующие через рецепторы серпантинного типа, способны стимулировать активность АЦ в культурах D.anser и T.pyriformis. Свое максимальное стимулирующее влияние на активность АЦ эти гормоны оказывают в концентрациях, которые наиболее эффективны в тканях высших эукариот. Выявлено также ингибирование адреналином АЦС T.pyriformis.

Величина и направленность гормонального эффекта определяются уровнем базальной активности АЦ: чем она выше, тем менее;' выражена гормональная стимуляция и тем в большей степени проявляется ингибирующее влияние гормонов. Действие гормонов частично или полностью снимается антагонистами серотониновых и Р-адренергических рецепторов (р-АР). В клетках инфузорий впервые охарактеризованы рецепторы, специфично связывающие р-АР лиганды и сходные по ряду своих показателей с Р-АР высших эукариот. Показано, что биогенные амины стимулируют ГТФ-связывающую активность G-белков, что указывает на их участие в процессе передачи гормонального сигнала. В клеточных культурах D.anser и T.pyriformis впервые обнаружена активность ПКА и исследована ее регуляция гормонами. Действие гормонов на активность ПКА и АЦ было однонаправленным, что указывает на функциональную связь между этими ферментами подобно тому, как это наблюдается у высших эукариот. Таким образом, доказано, что в клетках инфузорий присутствует функционально активная гормоночувствительная АЦС, обладающая чертами сходства с таковой высших эукариот.

Показано, что катионы тяжелых металлов (КТМ) нарушают функционирование АЦС инфузорий в условиях in vitro и снижают их выживаемость в условиях in vivo. г3ти данные указывает на возможность использования АЦС D.anser и T.pyriformis в качестве высокочувствительного экотоксикологического тест-объекта для оценки состояния водных бассейнов.

Теоретическое и практическое значение работы.

Обнаружение гормональной регуляции АЦС инфузорий, как представителей низших эукариот, является очень важным для понимания эволюции гормоно^увствительных сигнальных систем эукариот в целом и формирования молекулярных механизмов функционирования цАМФ-зависимых сигнальных путей в частности. Полученные данные дают материал для дальнейших исследований регуляторной роли гормонов высших эукариот как у инфузорий, так и у других представителей низших эукариот (дрожжевых грибов, трипаносом и др.). Разработанная стратегия изучения АЦС инфузорий может быть использована для исследования регуляции гормональными и негормональными агентами жизненно важных функций паразитических форм одноклеточных, возбудителей многих заболеваний человека. Изучение чувствительности АЦС инфузорий к воздействию КТМ позволяет разработать новый экотоксикологический тест для мониторинга водных экосистем. В перспективе этот тест можно использовать для тестирования и других вредных химических веществ.

Апробация работы.

Обсуждение работы проходило на заседании секции молекулярных основ эволюции функций ИЭФиБ им.И.М.Сеченова РАН. Результаты работы были доложены на SEB Annual Meeting, Lancaster, England (1996), 22th Conference of

European comparative endocrinologists, Bonn, Germany (2002), FEBS Meeting on Signal transduction, Brussels, Belgium (2003), XI Всероссийском симпозиуме «Мембранный транспорт и функции клетки» (1994), Конференции молодых физиологов и биохимиков России «Биохимические и биофизические механизмы физиологических i функций» (1995), Международной конференции «Инфузории в биотестировании» (1997) и на научных семинарах Лаборатории молекулярной эндокринологии ИЭФБ им. И.М. Сеченова РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа, в том числе 11 статей в рецензируемых журналах.

Объем, структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, результатов исследования и их обсуждения, выводов. Работа изложена на 133 страницах, включает 19 рисунков и 9 таблиц, список литературы составляет 167 источников.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Деркач, Кира Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлена и охарактеризована аденилатциклазная сигнальная система (АЦС) в клеточных культурах представителей низших :>укариот - инфузорий Dileptas unser и Telrahymena pyriformis. Исследование культур T.pyriformis с различной плотностью клеток и различного возраста показало, что фактором, определяющим уровень базальной активности АЦ, является стадия развития культуры. Показано, что АЦ инфузорий, как и АЦ высших эукариот, стимулируется такими активаторами фермента, как катионы марганца, NaF, гуаниновые нуклеотиды, форсколин, причем величина их стимулирующего эффекта определяется уровнем базальной активности фермента.

2. Показано, что глюкагон и биогенные амины, действующие через рецепторы серпантинного типа, могут регулировать активность АЦ в культурах инфузорий. Величина и направленность их эффекта определяются уровнем базальной активности фермента. Специфичность действия биогенных аминов на АЦ доказывается блокированием эффектов гормонов антагонистами адренергических и серотониновых рецепторов.

3. В клеточных культурах инфузорий выявлены адренергические рецепторы, специфично связывающиеся с ß-адренергическими лигандами с аффинностью более низкой в сравнении с рецепторами высших эукариот. Показано, что ГТФсвязывающая активность гетерогримерных G-белков увеличивается под действием биогенных аминов. Полученные данные указывают на присутствие в клетках i инфузорий функционально активной гормоночувствительной АЦС, включающей адренергические рецепторы, гетеротримсрные G-белки и фермент АЦ.

4. В клеточных культурах D.anser и T.pyriformis впервые обнаружена активность протеинкиназы А (ПКА) и исследована ее регуляция гормонами. Действие гормонов на активность Г1КА и АЦ является однонаправленным, что указывает па функциональную связь между ними, как это наблюдается у высших эукариот.

5. Показано, что катионы тяжелых металлов нарушают функционирование АЦС инфузорий in vitro и снижают их выживаемость в условиях in vivo. Это указывает на возможность использования АЦС D.anser и T.pyriformis в качестве высокочувствительного экотоксикологического тест-объекта для оценки состояния водных бассейнов.

1.3. Заключение.

Суммируя представленные выше данные, можно прийти к заключению о том, что на уровне низших эукариот возникают и окончательно формируются многокомпонентные сигнальные системы, опосредующие регуляторное действие на клетку гормонов и нейромедиаторов различной химической природы. При этом разнообразие сигнальных систем и включенных в эти системы сигнальных блоков не уступает таковому, характерному для высших эукариот, а в ряде случаев даже превосходит его. Это в первую очередь справедливо для АЦС и ГЦС - сигнальных систем, включающих мембранносвязанные формы ферментов-циклаз - АЦ и ГЦ.

АЦ низших эукариот могут выполнять функции либо рецептора и эффектора одновременно (рецепторные формы), либо только эффектора (нерецепторные формы). Рецепторные формы АЦ представлены несколькими типами белков, общей чертой которых является способность один или два раза пронизывать плазматическую мембрану. Нерецепторные формы пронизывают мембрану 12 раз и сходны по своим структурно-функциональным характеристикам с мембранносвязанными формами АЦ позвоночных животных. У низших эукариот (.D. discoideum) также обнаружены молекулы мембранносвязанных форм АЦ, которые обращены своим циклазным доменом вовне клетки и синтезируют внеклеточный цАМФ. У позвоночных остались только те из перечисленных форм АЦ, которые 12 раз пронизывают мембрану (Hurley, 1999). Из двух линий мембранносвязанных форм ГЦ, присутствующих у низших эукариот, представители первой из которых один раз пронизывают мембрану, а представители второй имеют 12 трансмембранных доменов, у позвоночных сохранилась только линия ГЦ, пронизывающих мембрану один раз. Уже на уровне низших эукариот произошел отбор растворимых (цитозольных) форм АЦ и ГЦ, лишенных трансмембранных доменов. Цитозольные формы циклаз, широко представленные у прокариот, обнаружены у позвоночных животных, но отсутствуют у растений и некоторых типов беспозвоночных (насекомые, плоские черви). В отношении низших эукариот ситуация противоречивая. Растворимые АЦ и ГЦ обнаружены у амебы D. discoideum, но не выявлены у дрожжевых грибов (Roelofs et al., 2001а).

У низших эукариот в полной мере представлены такие ключевые блоки гормональных систем высших эукариот, как рецепторы серпантинного типа и сфу-гетеротримерные О-белки. Рецепторы низших эукариот эволюционировали от бактериальных родопсинов. а-Субьединицы О-белков, в свою очередь, произошли от малых О-белков и ГТФ-связывающих факторов элонгации прокариот, в то время как р-субъединицы, вероятно, берут свое начало от \VD-coдержащих белков бактерий (НлэЬе^иез а1., 2001). Следует однако отметить, что у дрожжевых а-, Р- и у-субъединиц О-белков имеются характерные особенности, отличающие их от таковых высших эукариот (при достаточно высоком общем уровне гомологии первичных структур). Такие отличия в основном выражаются в присутствии в их молекулах дополнительных участков АКП, функции которых пока не выяснены. Можно предположить, что эти участки являются адапторными и необходимы для более эффективного связывания субъединиц как между собой, так и с другими сигнальными белками. На это указывают возможность формирования этими участками спираль-спиральных структур и регулярность их АКП. В дальнейшем надобность в таких участках могла отпасть вследствие приобретения О-белками высших эукариот специальных приспособлений, позволяющих им более эффективно образовывать межмолекулярные комплексы. Среди таких приспособлений оптимизация пространственной структуры Ы-концевых спиралей в субъединицах О-белков, а также обретение ими способности заякориваться в мембране вследствие модификации различными по своей природе гидрофобными радикалами. Важно подчеркнуть, что эволюция сигнальных молекул шла согласованно, поскольку участки-вставки с регулярной структурой обнаруживаются не только в субъединицах О-белков, но также и в рецепторах серпантинного типа низших эукариот (рецепторы цАМФ Д (Л\$со1с1еит) и эффекторных белках (молекулы АЦ и ГЦ). Например, молекула АЦ (СУШ) 5.сегеушае имеет АКП 674-1300, сплошь состоящую из повторов, обогащенных остатками лейцина. В процессе эволюции молекул рецепторов и эффекторов эти участки-вставки в большинстве случаев исчезают из их первичной структуры.

Несмотря на достигнутые в последние годы успехи в исследовании сигнальных систем низших эукариот, позволяющие говорить об основных путях их эволюции, в этой области биохимии и молекулярной биологии остается еще много невыясненных вопросов и проблем. Так остается неизученным механизм возникновения мембранносвязанных форм АЦ и ГЦ из их цитозольных форм, а также дальнейшая судьба тех из указанных форм ферментов, которые отсутствуют у позвоночных животных. До сих пор нет единого мнения в отношении формирования гетеротримерных й-белков, которые на уровне низших эукариот предстают уже практически в сформированном виде (даже у сравнительно примитивных дрожжевых грибов). Требует дальнейшего анализа такая важнейшая проблема, как функциональное значение гормонов и гормоноподобных веществ у одноклеточных организмов. Однако имеющиеся данные позволяют высказать предположение о том, что именно на уровне низших эукариот из множества вариантов сигнальных систем в результате естественного отбора были отобраны те функциональные блоки, которые послужили необходимым материалом для построения более совершенных сигнальных систем высших животных.

Основываясь на результатах проведенного нами анализа данных литературы, касающихся сигнальных систем низших эукариот, мы предприняли экспериментальное исследование с целью подтвердить присутствие функционально активной АЦС, чувствительной к гормональным стимулам, в клетках представителей низших эукариот - инфузорий Т.руп/огт1$ и Б.атег, а также сравнить молекулярные механизмы функционирования АЦС инфузорий с таковыми АЦС высших эукариот. Актуальность этой задачи во многом объясняется еще и тем, что мы не располагаем какой-либо генетической информацией о присутствии компонентов АЦС у инфузорий. Это связано с очень плохой изученностью генома инфузорий в отличие, например, от таких организмов, как дрожжи 8.сегеу1и1ае и 5\pombe, амеба 0.сИ$со1с1еит, геномы которых расшифрованы практически полностью. Кроме того, ранее не проводилось направленных исследований по выявлению каких-либо компонентов АЦС у инфузорий, как это было сделанд в случае трипаносом в отношении различных форм АЦ. Возникает противоречие. С одной стороны, получено много доказательств в пользу участия гормонов в регуляции широкого спектра жизненно важных процессов у инфузорий (достаточно вспомнить работы группы Чабы). С другой стороны, во-первых, полностью отсутствует какая-либо молекулярно-биологическая информация в отношении сигнальных белков, через посредство которых может реализовываться регуляторное влияние этих гормонов на клетки инфузорий, и, во-вторых, практически нет данных по структурно-функциональной организации этих белков и молекулярным механизмам их действия. В настоящей работе предпринята попытка, используя методы молекулярной эндокринологии и биохимии, в определенной степени восполнить этот пробел, по крайней мере, во второй его части.

ГЛАВА 2. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

2.1, Экспериментальные животные

В опытах использовали следующих животных:

1. Инфузорий Tetrahymena pyriformis, условия культивирования которых приведены в статье (Ирлина, Меркулова, 1975). Безбактериальные культуры клеток инфузории Т.pyriformis получали из Института цитологии РАН. Культуры имели различную плотность клеток (от 25000 до 300000 клеток/мл) и возраст.(14, 24 и 42 ч).

2. Инфузорий Dilepîus anser, которых культивировали в солевой среде Prescott при 25°С (в качестве корма использовали инфузорий T.pyriformis). Культуры клеток инфузории D. anser получали из Института цитологии РАН.

3. Пресноводных двустворчатых моллюсков анодонт (Anodonta cygnea), которых собирали в мае-сентябре в водоемах Ленинградской области и содержали в хорошо аэрируемых ваннах при температуре 6-15 °С, без специального кормления.

4. Пресноводных брюхоногих моллюсков катушек (Corelus corneus) и живородок (Viviparus contectus), которых, так же как и анодонт, собирали в водоемах Ленинградской области и содержали в хорошо аэрируемых ваннах.

5. 11- и 16-ти-дневных эмбрионов кур породы Леггорн кросс-288.

6. Белых самцов крыс Ratlus norvegicus линии Wis tar весом 100-150 г, которых содержали в виварии на стандартном рационе.

2.2. Химические реактивы

Для опытов использовали следующие реактивы: динатриевую соль креатинфосфата, креатинфосфокиназу из мышц кролика (НФ 2.7.3.2), 5'-гуанилилимидодифосфата натриевую соль (Gpp[NH]p). имидазол. форсколин, дитиотреитол, гистон 2В, АТФ, цАМФ, ГТФ, Tris-OH, HEPES-Na, Lubrol-PX, ЭДТА, сурамин, бычий сывороточный альбумин (Sigma, США). В экспериментах использовали следующие гормоны и антагонисты: серотонин, (-)-изопротеренол, адреналин, глюкагон (Serva, Германия), ципрогептадин, атенолол, йохимбин. пропранолол, идазоксан (Sigma, США). Для колоночной хроматографии использовали нейтральную окись алюминия II по Брокману (Reanal, Венгрия), для фильтрования - фильтры GF/B (для рецепторного связывания) и нитроцеллюлозные фильтры тип НА, 0.45 мкм (Millipore, США) (для ГТФ-связывания).

Для радиоизотопных экспериментов использовали: [у-32Р]АТФ (4 Ки/мМ) (для определения активности ПКА), [а-32Р]АТФ (4 Ки/мМ) и [8-3Н]АТФ (Ки/мМ) (для определения активности АЦ) производства фирмы "Изотоп" (Санкт-Петербург, Россия). р,у-имидо[8-3Н]-гуанозин-5'-трифосфата аммонийную соль ([8-3H]Gpp|NHJp) (5 Ки/мМ) (для ГТФ-связывания) и [пропил-2,3-3Н]-дигидроальпренолол (30 Ки/мМ) (для рецепторного связывания) производства фирмы Amersham (Англия). Перед экспериментами радиоактивные препараты проверяли на наличие радиохимических примесей методами ТСХ в двух системах растворителей и колоночной хроматографии, которые должны были составлять не более 2 % от общей активности препарата.

2.3. Получение гомогенатов и грубых мембранных фракций клеточных культур инфузорий

Гомогенаты клеток D.anser получали из массовой культуры одного клона инфузорий объемом до 3-4 л. Плотность культуры составляла 140-150 кл/мл. Клетки осаждали центрифугированием (600 g в течение 3 мин) и трижды отмывали 20 мМ Tris-HCl-буфером (рН 7.5). Гомогенат получали растиранием клеток в ручном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (60-70 ударов). Количество разрушенных клеток составляло не менее 95% от их общего количества.

Гомогенат клеток инфузории T.pyriformis получали следующим образом. Сначала'клетки инфузорий осаждали центрифугированием (600 g в течение 3 мин), после чего их трижды отмывали 20 мМ Tris-HCl-буфером (рН 7.5). Гомогенизирование проводили путем обработки клеток ультразвуком на приборе

УЗДН-2Т при частоте 20 кГц в течение 1 мин при охлаждении. Количество разрушенных клеток составляло не менее 95% от их общего количества.

Для получения грубой мембранной фракции супернатант, полученный после центрифугирования гомогената клеточной культуры инфузорий (600 g в течение 3 мин), центрифугировали (15000 g в течение 15 мйн), полученный осадок ресуспендировали в 10 мМ НЕРЕБ-Ка буфере, рН 7.5, содержащем 5 мМ М§С12, и переосаждали в том же режиме.

2.4. Получение фракций плазматических мембран с использованием ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы

2.4.1. Получение фракции сарколеммальных мембран гладких мышц ноги моллюска АпойоМа суцпеа

Гладкие мышцы ноги анодонт промывали в дистиллированной воде и измельчали ножницами на льду до кашеобразного состояния, после чего гомогенизировали, используя ручной гомогенизатор Политрон (30 сек, 3-4 раза) при соотношении 1:10 объемов ткани и буфера А (10 шМ Тт-НС1, рН 7.5, 5 мМ 1^С12, 0.25 М сахарозы). Для получения одной фракции брали по 25-35 моллюсков. Разливали образовавшийся гомогенат в пластиковые пробирки для ультрацентрифугирования и подслаивали 0.8 М сахарозу. Центрифугировали на ультрацентрифуге Вескшап (ротор SW-27) - 110000 g, 60 мин. После окончания центрифугирования фракция ПМ, расположенная на границе градиента сахарозы (0.25-0.8 М), была собрана и разведена в 3-4 раза ТпБ-НСГбуфером (А) без сахарозы. Осаждение мембран осуществляли на ультрацентрифуге Весктап (ротор 8^/-27) -110000 75 мин. Супернатант отбрасывали, а мембраны промывали повторно свободным от сахарозы буфером А. Затем мембраны ресуспендировали в сходном буфере, определяли белок и использовали для экспериментов (К1с1\уа1, 1973).

2.4.2. Получение фракций плазматических мембран сердца куриных эмбрионов

Желудочки сердца 11- или 16-ти-дневных куриных эмбрионов тщательно измельчали ножницами и затем смешивали с буфером А (10 шМ имидазол-HCl, pH 7.5, 5 мМ MgCl2, 0.25 М сахарозы) в соотношении 1:5 - 1:10. Для получения одной фракции брали желудочки сердца от 80-100 эмбрионов. В опыте использовали материал, который был расположен на границе 0.25 и 0.8 М сахарозы после ультрацентрифугирования (100000 g, 60 мин). Фракцию отмывали от сахарозы с помощью повторного центрифугирования в указанном режиме в 10 мМ имидазол-HCl буфере (pH 7.5) и использовали для опыта в тот же день.

2.43. Получение фракций сарколеммальных мембран скелетных мышц крыс

Скелетные мышцы ноги крыс тщательно измельчали ножницами и затем смешивали с буфером А (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 мМ MgCl2, 0.25 М сахарозы) в соотношении 1:5 - 1:10. Для получения одной фракции брали 4-6 крыс. Гомогенизировали, используя ручной гомогенизатор Политрон - 30 сек, 4-5 раз. Все дальнейшие операции проводили так же, как описано в пункте 2.4.1.

2.4.4. Получение фракции синаптосомальных мембран стриатума мозга крысы

Выделение фракции синаптосом из стриатума мозга крысы проводили по методу Hajos (1975). Отделяли правое и левое полушария, измельчали ткань ножницами, гомогенизировали на холоду в 40 mM Tris-HCl, pH 7.4, содержащем

0.32М сахарозу (соотношение ткани и буфера 1:10). Гомогенат центрифугировали при 1000g (1500 об/мин на К-23) в течение 10 мин, после чего осадок f ресуспендировали в том же буфере и повторно центрифугировали в том же режиме. Объединенный супернатант центрифугировали при 20000g (12500 об/мин на К-24) в течение 20 мин. Полученный осадок ресуспендировали примерно в 10 мл того же буфера, после чего проводили ультрацентрифугирование в градиенте концентраций сахарозы на ультрацентрифуге Beckman (ротор SW-27) - 110000 g, 60 мин. После окончания ультрацентрифугирования фракцию синаптосом, расположенную на границе градиента сахарозы 0.8-1.2 М, собирали, дважды промывали ее 40 mM Tris-НС1, pH 7.4 (без сахарозы), каждый раз осаждая синаптобомы центрифугированием при 20000g (12500 об/мин на К-24) в течение 20 мин. Промытый осадок фракции синаптосом стриатума мозга крысы ресуспендировали в том же буфере (40 шМ Tris-НС1, pH 7.4) и использовали для экспериментов.

2.5. Определение активности Mg2+-3aBHCHMoif аденилатциклазы

2.5.1. Метод с использованием [а-32Р]АТФ в качестве субстрата

Определение активности магний-зависимой АЦ (АТФ-пирофосфатлиаза циклизующая, НФ 4.6.1.1) проводили при 30 °С (инфузории, моллюски) или 37 °С (крысы, куриные эмбрионы) и времени инкубации 10 мин по модифицированному методу Соломона и соавт. (Salomon et al., 1974) в инкубационной среде следующего состава: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 мМ АТФ, 1 мМ цАМФ, 20 мМ креатинфосфата, 0.2-0.5 мг/мл креатинфосфокиназы, 5 мМ MgCl2, [а-32Р]АТФ добавляли из расчета 12 мкКи на пробу. Общий объем пробы составлял 50 или 100 мкл. Реакцию начинали добавлением белка (15-50 мкг), а останавливали внесением в пробу 200 мкл 0.5 N HCl, после чего образцы помещали на 7 минут в кипящую водяную баню, а затем в каждую пробу вносили по 200 мкл 1.5 М имидазола и наносили образцы на колонку с окисью алюминия. Образовавшийся в ходе ферментативной реакции цАМФ элюировали с помощью 8 мл 10 мМ имидазол-HCl буфера, pH 7.4, в соответствии с методом White (1974). Элюат помещали в сцинтилляционные флаконы и в них измеряли радиоактивность по методу Черенкова на счетчике Rackbeta (LKB, Швеция). Активность АЦ выражали в пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг белка.

2.5.2. Метод с использованием [8-3Н]АТФ в качестве субстрата

Реакционная смесь (конечный объем 100 мкл) содержала 50 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 100 мкМ АТФ, 1 мМ цАМФ, 20 мМ креатинфосфата, 0.2 мг/мл креатинфосфокиназы, 0.5-1 мкКи [8-3Н]АТФ (по Ткачук, Балденков, 1978). Реакцию начинали добавлением в пробу 30-40 мг белка и инкубировали при 30 °С (инфузории, моллюски) или 37 °С (крысы, куриные эмбрионы) в течение 10 минут. Реакцию образования цАМФ останавливали добавлением смеси 50 мкл этанола и 100 мкл хлороформа. Денатурированный белок осаждали центрифугированием (4000 об/мин, 10 мин). Аликвоту супернатанта (10 или 20 мкл) наносили на ТСХ пластину с силикагелевым покрытием - Silufol-254 (Reanal,Венгрия). Для разделения цАМФ и других нуклеотидов использовали ТСХ. Пятна, соответствующие цАМФ, вырезали и помещали в виалы со сцинтилляционной смесью, содержащей 0.4 % 2.5-дифенилоксазола и 0.02 % 1-4бис2-5-фенилоксазолилбензола. Радиоактивность измеряли на счетчике Rackbeta (LKB, Швеция). Активность АЦ выражали в пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг белка.

2.6. Определение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы

Определение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы (КФ 2.7.1.37) проводили по модифицированному методу (Gill, Walton, 1979). Для исследования активности ПКА использовали гомогенаты клеточных культур инфузорий, а также гомогенаты мышц моллюска и крысы, для получения, которых брали по 8-10 моллюсков и 4-5 крыс соответственно. Стандартная реакционная смесь содержала (конечные концентрации): 30 мМ калий-фосфатный буфер, pH 6.8, 2 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl2. Гистон 2В добавляли в конечной концентрации 1 мг/мл, цАМФ - 0.1 мкМ. В каждую пробу вносили по 100-200 мкг белка. Реакцию начинали добавлением смеси «холодного» АТФ (конечная концентрация 0.5 мМ) и меченого у-32Р]АТФ (1-2 мкКи на пробу). Общий объем каждой пробы составлял 50 мкл. После инкубации в течение 10 мин при 30 °С ферментативную реакцию останавливали нанесением реакционной смеси на фильтр (Whatman ЗММ, 2.4 см), который быстро помещали в охлажденную 10%-ную трихлоруксусную кислоту (5-10 мл/фильтр) и промывали в ней в течение 15 мин при интенсивном перемешивании. В дальнейшем фильтры промывали еще трижды (по 15 мин) 5%-ной трихлоруксусной кислотой, после чего их помещали в виалы и измеряли радиоактивность по методу Черенкова на (3-счетчике "Rackbeta" (LKB, Швеция). Общую активность ПКА выражали в пмоль радиоактивного [32Р]-фосфата, включенного в субстратные белки, за 1 мин на 1 мг белка, добавляемого в пробу, в отсутствие и в присутствии цАМФ. Для характеристики степени активации или ингибирования фермента гормонами использовали отношение активности ПКА, определяемой в отсутствие цАМФ, к активности фермента, определяемой в присутствии цАМФ.

2.7. Определение связывающих мест с помощью меченого [3Н]-дигидроальпренолола

Определение p-адренергических рецепторов в клеточных культурах инфузорий проводили по модифицированному методу (Pertseva et al., 1992). Мембранный белок (100-200 мкг) инкубировали в течение 30 мин при 30 °С в 500 мкл инкубационной среды, содержащей 2.0-100 нМ [3Н]-дигидроальпренолола, 10 мМ HEPES-Na буфер, рН 7.5, 5 мМ MgCl2. Связывание останавливали добавлением 5 мл холодного 10 мМ калий-фосфатного буфера, рН 8.0, и затем фильтровали пробы через фильтры Whatman GF/C, трижды промывая их фосфатным буфером (по 5 мл). Фильтры высушивали и помещали в виалы со сцинтилляционной смесью, содержащей 0.4 % 2.5-дифенилоксазола и 0.02 % 1-4бис2-5-фенилоксазолилбензола. Радиоактивность измеряли на счетчике Rackbeta (LKB, Швеция). Значения специфического связывания [3Н]-дигидроальпренолола рассчитывали вычитанием неспецифического связывания [3Н]-дигидроальпренолола (измерено в присутствии 10"4 М немеченого альпренолола) из общего связывания [3Н]-дигидроальпренолола с мембранами. Для определения аффинности к различным лигандам сайтов, связывающих [3Н]-дигидроальпренолол, измеряли специфическое связывание 50 нМ

3Н]-дигидроальпренолола в присутствии возрастающих концентраций (Ю-10-Ю-4 М) немеченого лиганда. Математическая обработка данных; проводилась с помощью программы GraphPad InPlot. Кривые насыщения преобразовывали по методу Скэтчарда (Scatchard, 1949), что позволяло судить о сродстве рецепторов (Кд) к [3Н]-дигидроальпренололу. Значения 1С50 представляли собой концентрацию немеченого лиганда, вызывающего 50 %-ное замещение [3Н]-дигидроальпренолола. Значения Кинг. для лигандов рассчитывали по формуле 1С5о/(1+[8]/Кд), где [S] -концентрация [3Н]-дигидроальпренолола.

2.8. Определение ГТФ-связывающей активности G-белков.

Определение ГТФ-связывающей активности G-белков проводили по модифицированному методу (Panchenko et al., 1987) в гомогенатах клеточных культур инфузорий, а также во фракциях плазматических мембран мышц моллюска и крысы, для получения которых брали по 8-10 моллюсков и 4-5 крыс соответственно.

Стандартная реакционная смесь содержала (конечные концентрации): 50 мМ Трис

НС1 буфер, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 0,01%

Lubrol-PX 1 мкМ Gpp[NH]p, 0.5-1 мкКи [8-3H]Gpp[NH]p. Реакцию начинали внесением в каждую пробу 100-200 мкг (в случае гомогената) или 50-80 мкг (в случае мембранной фракции) белка. Общий объем каждой пробы составлял 50 мкл. После инкубации в течение 45 мин при 30 (инфузории, моллюски) и 37 °С (крысы) ферментативную реакцию останавливали добавлением к реакционной смеси 100 мкл

0.1 %-ного раствора Lubrol-PX в 20 мМ K/Na-фосфатном буфере, рН 8.0. Пробы фильтровали через фильтры Millipore (США) с использованием водоструйного насоса, фильтры дважды промывали 2 мл 20 мМ K/Na-фосфатного буфера, рН 8.0, помещали в виалы со сцинтилляционной смесью, содержащей 0.4 % 2.5дифенилоксазола и 0.02 % 1-4бис2-5-фенилоксазолилбензола. Радиоактивность измеряли на счетчике Rackbeta (LKB, Швеция). Специфическую ГТФ-связывающую f активность определяли как разность между связыванием радиоактивного Gpp[NH]p в пробе в отсутствие ГТФ и таковым в присутствии 10 мМ ГТФ.

2.9. Определение ростовой активности инфузорий

Ростовую активность инфузорий оценивали по изменению плотности культуры клеток после 24-часовой и более их обработки катионами тяжелых металлов по сравнению с контролем. Для инфузорий D.anser исходная плотность клеток в контроле и в опытных образцах составляла 32±5 клеток/мл. Для инфузорий T.pyriformis исходная плотность клеток в контроле и опытных образцах составляла 27000 клеток/мл.

2.10. Проведение экотоксикологических опытов с моллюсками

Условия проведения экспериментов in vivo были следующими. Моллюсков помещали в хорошо аэрируемые ванны (температура воды 15 °С). Одну группу составляли контрольные животные, две других - моллюски, помещенные в воду, содержащую 2x10"6 М хлорида меди (И) или хлорида кадмия соответственно. Через 15 дней исследовали активность АЦ в тканях всех трех групп моллюсков. При исследовании активности ферментов in vitro CuCl2 и CdCl2 в концентрациях 10"4 или 10"6 М добавляли непосредственно в инкубационную среду.

2.11. Определение белка по методу Лоури

Содержание белка определяли в соответствии с методом Лоури и соавт. (Lowry et al., 1951), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин. i

2.12. Статистическая обработка полученных результатов

Экспериментальные данные подвергали статистической обработке и представляли в виде значений: х ± Sx , где х - среднее арифметическое, Sx - средняя квадратичная ошибка.

Метод парных сравнений применяли для обработки результатов, полученных в опытах in vitro, когда контрольные и опытные пробы ставились в одной и той же фракции плазматических мембран или гомогенате. Достоверность различий оценивали с помощью критерия Стьюдента-Фишера. Различия считались достоверными при Р < 0.05 (Урбах, 1975).

2.13. Теоретические исследования первичной структуры белков

Аминокислотные последовательности белков получали из GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Для поиска гомологичных АКП и их выравнивания использовали программы BLASTp и BLASTx (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Деркач, Кира Викторовна, Санкт-Петербург

1. Деркач К.В., Шпаков А.О., Успенская З.И. Ингибирование активности аденилатциклазы и роста культуры инфузорий Dileptus anser под влиянием катионов тяжелых металлов // Цитология. 1995а. - Т. 37. N 4. - С. 370.

2. Деркач К.В., Шпаков А.О., Кузнецова JI.A., Плеснева С.А., Успенская З.И., Перцева М.Н. Гормоночувствительная аденилатциклазная система инфузории Dileplus unser II Цитология. 2002. - T. 44. N 11. - С. 1129-1134.

3. Деркач К.В., Шпаков А.О., Успенская З.И., Голикова М.Н. Влияние катионов тяжелых металлов на активность аденилатциклазы и на рост культуры инфузорий Tetrahymena pyriformis и Dileptus anser И Журн. эволюц. биохим. физиол. 19956. - Т. 31. N 1. - С. 44-51.

4. Ирлина И.С., Меркулова H.H. Выращивание больших масс Tetrahymena pyriformis, пригодных для биохимических исследований и синхронизации деления инфузорий // Цитология. 1975. - Т. 17. - С. 1208-1215.

5. Кузнецова Л.А. Успехи в изучении серотониновых рецепторов, сопряженных с аденилатциклазной системой, в тканях позвоночных и беспозвоночных животных // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1998. - Т. 34. - С. 256-266.

6. Кузнецова JI.A., Плеснева С.А. Влияние биогенных аминов и полипептидных гормонов на активность протеинкиназы "А" и аденилатциклазы в мышцах моллюска Anodonta cygnea II Журн. эволюц. биохим. физиол. 2001. Т. 37. N 5. - С. 395-400.

7. Кузнецова Л.А., Шпаков А.О. Рецепторы серотонина, участвующие в модуляции аденилатциклазиой системы, в тканях позвоночных и беспозвоночных // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1994. - Т. 30. N 4. - С. 293-309.

8. Перцева М.Н. Молекулярные основы развития гормонокомпетентности. Л., Наука, 1989. 256 с.

9. Перцева М.Н. Существует ли эволюционное родство между хемосигнальными системами эукариот и прокариот // Журн. эволюц. биохим. физиол. 1990. - Т. 26. N4.- С: 505-513.

10. Перцева М.Н., Плеснева С.А., Шпаков А.О., Русаков Ю.И., Кузнецова Л.А.

11. Новые данные, свидетельствующие об участии аденилатциклазиой системы в механизме действия инсулина и родственных пептидов // Доклады Академии наук. -1995.-Т. 342. N3,- С. 410-412.

12. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Хемосигнальные системы одноклеточных эукариот и бактерий как предшественники гормонокомпетентных систем высших животных // Журн. эволюц. биохим. физиол. 1993. Т. 29. N 4. - С. 454-474.

13. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Консервативность инсулиновой сигнальной системы в эволюции беспозвоночных и позвоночных животных // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 2002. Т. 38. N 5. С. 430-441.

14. Перцева М.Н., Шпаков А.О., Плеснева С.А. Современные достижения в изучениисигнальных механизмов действия инсулина и родственных ему пептидов // Журн.эволюц. биохимии и физиологии. 1996. - Т. 32. N 3. - С. 318-340.

15. Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты рецепторов и ГТФ-связывающихбелков, определяющие специфичность взаимодействий между ними // Журн.эволюц. биохимии и физиологии. 1996. - Т. 32. N 4. - С. 488-511.

16. Шпаков А.О. Структурные элементы молекул ГТФ-связывающих белков иэффекторов, опосредующие сопряжение между ними // Укр. биохим. журнал. 1997.-Т. 69. N 1. С. 3-20.

17. Шпаков А.О, Роль онкогенных в-белков в развитии опухолей эндокринной системы // Вопр. онкологии. 2001. - Т. 47. N 2. - С. 160-167.

18. Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты в рецепторах серпантинного типа, ответственные за их функциональное сопряжение с гетеротримерными в-белками // Цитология. 2002а. - Т. 44. N 3. - С. 242-258.

19. Шпаков А.О. Роль сульфгидрильных групп в функционированииаденилатциклазиой сигнальной системы // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. -20026. Т. 38. N 1,-С. 97-107.

20. Шпаков А.О. Участие заряженных аминокислот в процессе передачи гормонального сигнала через рецепторы серпантинного типа // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 2003. - Т. 39. N 3. - С. 205-217.

21. Шпаков А.О., Деркач К.В. Влияние катионов тяжелых металлов на активность аденилатциклазной системы гладких мышц и гепатопанкреаса некоторых двустворчатых и брюхоногих моллюсков //Журн. эволюц. биохимии и физиологии. -1994а. Т. 30. N 4. - С. 516-524.

22. Шпаков А.О., Деркач К.В., Перцева М.Н. Гормональные системы низших эукариот // Цитология. 2003а. - Т. 45. N 3. - С. 223-234.

23. Шпаков А.О., Корольков В.И., Власова E.H., Афонина М.П., Власов Г.П.

24. Влияние синтетических катионных пептидов на активацию аденилатциклазной сигнальйой системы биогенными аминами в мышечных тканях моллюсков и крыс // Цитология.-2001.-Т. 43. N 5. С. 483-490.

25. Шпаков А.О., Кузнецова JI.A., Плеснева С.А. Влияние тиолов и блокаторов сульфгидрильных групп на негативную регуляцию аденилатциклазной сигнальной системы биогенными аминами // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 2000. - Т. 36. N 4. - С. 293-297.

26. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Структурно-функциональная характеристика ГТФ-связывающих белков беспозвоночных животных И Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 1993. - Т. 29. N 5-6. - С. 635-653.

27. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Молекулярные основы функционального сопряжения белков компонентов инсулиновой сигнальной системы// Успехи биологической химии. - 1999. - Т. 39. - С. 141-186.

28. Успенская З.И. Серотипы у низшей инфузории Dileptus anser // Цитология. 2002. -Т.44. - С. 305-313.

29. Alexandre S., Paindavoine P., Hanocq-Quertier J., Paturiaux-Hanocq F., Tebabi P.,

30. Pays E. Families of adenylate cyclase genes in Trypanosoma brucei // Mol. Biochem. Parasitai.' 1996.-V. 77. - P. 173-182.

31. Amiard J.C., Berthet В., Metayer C. Comparative importance of analytical, biologicaland ecological fluctations in determining sampling procedures adapted to metalaccumulation studies // J. Rech. Oceanogr. 1989. -V. 14. - P. 53-57.

32. Aubry L., Firtel R. Integration of signaling networks that regulate Dictyosteliumdevelopment // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1999. - V.15. - P. 469-517.

33. Berelovitz M., Le Roith D., von Schenk H., Newgaard C., Szabo M., Frohmann M.,

34. Shiloach J., Roth J. Somatostatin-like immunoreactivity and bioactivity is native to

35. Tetrahymenapyriformis//Endocrinology. 1982. - V. 110. - P. 1939-1944.

36. Bieger В., Essen L.O. Crystallization and preliminary X-ray analysis of the catalyticdomain of the adenylate cyclase GRESAG4.1 from Trypanosoma brucei 11 Acta

37. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000. - V. 56. - P. 359-362.

38. Bieger B., Essen L.O. Structural analysis of adenylate cyclases from Trypanosoma brucei in their monomeric state // EMBO J. 2001. - V. 20. - P. 433-445.

39. Blum J.J. An adrenergic control system in Tetrahymena // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1967.-V. 51.-P. 81-88.

40. Bourret R.B., Borkovich K.A., Simon M.J. Signal transduction pathways involving protein phosphorylation in prokaryotes // Ann. Rev. Biochem. 1991. - V. 60. - P. 401 -441.

41. Chidiac P. Rethinking receptor-G protein-effector interactions // Biochem. Pharmacol. -1998.-V. 55. P. 549-556.

42. Csaba G., Inczefi-Gonda A., Feher T. Induction of steroid binding sites (receptors) and presence of steroid hormones in the unicellular Tetrahymena 11 Comp. Biochem. Physiol. -1985,- V. 82.-P. 567-570.

43. Csaba G., Kovacs P. Insulin uptake, localization and production in previously insulin treated and untreated Tetrahymena. Data on the mechanism of hormonal imprinting // Cell. Biochem. Funct. 2000. - V. 18. - P. 161-167.

44. Csaba G., Kovacs P., Falus A. Human cytokines interleukin (IL)-3 and IL-6 affect the growth and insulin binding of the unicellular organism Tetrahymena // Cytokine. 1995. -V. 7.-P. 771-774.

45. Derkach K.V., Shpakov A.O., Uspenskaya Z.I. The regulation of adenylyl cyclase and protein kinase A in the cell cultures of ciliata Dileptus anser and Tetrahymena pyriformis by peptide hormones // FEBS J. 2003. - V. 270. Suppl. 1. - P. 57.

46. Eisenschlos C., Flawia M.M., Torruella M., Torres H.N. Interaction of Trypanosoma cruzi adenylate cyclase with liver regulatory factors // Biocherp. J. 1986a. - V. 236. - P. 185-191.

47. Eisenschlos C., Paladini A.A., Molina Y., Vedia L., Torres H.N., Flawia M.M.

48. Flawia M.M., Torres H.N. Adenylate cyclase activity in Neurospora crassa. III. Modulation by glucagon and insulin // J. Biol. Chem. 1973. - V. 248. - P. 4517-4520.

49. Galperin M.Y., Nikolskaya A.N., Koonin E.V. Novel domains of the prokaryotic two-component signal transduction systems // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - V. 203. - P. 1121.

50. Gill G.N., Walton G.M. Assay of cyclic nucleotide-dependent protein kinase // Adv. Cycl. Nucl. Res. 1979. - V. 10,- P. 93-106.

51. Gonzales-Perdomo M., Romero P., Goldenberg S. Cyclic AMP and adenylate cyclase activators stimulate Trypanosoma cruzi differentiation // Exp. Parasitol. 1988. - V. 66. -P. 205-212.

52. Hadwiger J.A., Srinivasan J. Folic acid stimulation of the Galpha4 G protein-mediated signal transduction pathway inhibits anterior prestalk cell development in Dictyostelium II Differentiation. 1999. - V. 64. - P. 195-204.

53. Haesungcharern A., Chulavatnatol M. Inhibitors of adeny/ate cyclase from ejaculated human spermatozoa// J. Reprod. Fertil. 1978. - V. 53. - P. 59-61.

54. Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity // Brain Res. 1975. - V. 93. - P. 485-489.

55. Hamm H.E. The many faces of G protein signaling // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 669-672.

56. Hatanaka M., Shimoda C. The cyclic AMP/PKA signal pathway is required for initiation of spore germination in Schizosaccharomyces pombe II Yeast. 2001. - V. 18. - P. 207217.

57. Janetopoulos C., Jin T., Devreotes P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells // Science. 2001. - V. 291. - P. 2408-2411.

58. Kariya K., Saito K., Iwata H. Adrenergic mechanism in Tetrahymena. III. cAMP and cell proliferation // Jap. J. Pharmacol. 1974. - V. 24. - P. 129-134.

59. Kasahara M., Unno T., Yashiro K., Ohmori M. CyaG, a npvel cyanobacterial adenylyl cyclase and a possible ancestor of mammalian guanylyl cyclases // J. Biol. Chem. 2001. -V. 276. - P. 10564-10569.

60. Krupinski J., Lehman T.C., Frankenfield C.D., Zwaagstra J.C., Watson P.A.

61. Molecular diversity of the adenylyl cyclase // J. Biol. Chem. -,1992. V. 267. - P. 2485824862.

62. Kudo S., Muto Y., Nosawa Y. Regulation by calcium of hormone-sensitive adenylate cyclase and calmodulin-dependent guanylate cyclase in Telrahymena plasma membrane // Comp. Biochem. Physiol. 1985. - V. 80. - P. 813-816.

63. Diclyoslelium development // Genes. Dev. 1993. - V. 7. - P. 986-995.

64. Roith D., Liotta A.S., Roth J., Shiloach J., Lewis M.E., Pert C.B., Krieger D.T.

65. ACTII and p-endorphin like molecules are native to unicellular organisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79. - P. 2080-2090.

66. Roith D., Shiloach J., Berelowitz M., Frohmann L.A., Liotta A.S., Krieger D.T., Roth J. Are messenger molecules in microbes the ancestors of the vertebrate hormones and tissue factors? // Fed. Proc. 1983. - V. 42. - P. 2602-2607.

67. Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. - P. 265-275.

68. Malmquist J., Israelsson B., Ljungqvist U. Inhibition of human liver membraneadenylate cyclase by zinc ions // Horm. Metab. Res. 1979a. - V. 7. - P. 530-531.

69. Malmquist J., Israelsson B., Ljungqvist U. Zinc inhibition of adenylate cyclase in humanliver membranes // IRCS Med. Sci.: Libr. Compend. 1979b. - V. 7. - P. 233.

70. Mance G. Pollution Threat of Heavy Metals in Aquatic Environments, Elsevier, London1. New York. 1987.

71. Meima M.E., Schaap P. Fingerprinting of adenylyl cyclase activities during Dictyostelium development indicates a dominant role for adenylyl cyclase B in terminal differentiation // Dev. Biol. 1999. - V. 212. - P. 182-190.

72. Moe G.R., Bollag G.E., Koshlund D.E. Transmembrane signaling by a chimera of the Escherichia coli aspartate receptor and the human insulin receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989.-V. 86.-P. 5683-5687.

73. Neer E.J., Smith T.F. G protein heterodimers: new structures propel new questions // Cell.- 1996.-V. 84.-P. 175-178.

74. Dictyostelium G subunit Ga2 produce dominant negative phenotypes and inhibit the activation of adenylyl cyclase, guanylate cyclase, and phospholipase C // Mol. Biol. Cell. -1992. -V. 3. -P. 735-747.

75. Oliveira' M.M., Antunes A., De Mello F.G. Growth of Trypanosoma cruzi epimastigotes controlled by shifts in cyclic AMP mediated by adrenergic ligands // Mol. Biochem. Parasitol. 1984. - V. 11. - P. 283-292.

76. Oz H.S., Huang H., Wittner M., Tanowitz H.B., Bilezikian J.P., Morris S.A. Evidence for guanosine triphosphate-binding proteins in Trypanosoma cruzi // Am. J. Trop. Med. Hyg.- 1994. -V. 50. -P. 620-631.

77. Paez-Osuna F., Zazueta-Padilla H.M., Izaguirre-Fierro G. Trace metals in bivalve from

78. Navachiste Lageon, Mexico//Mar. Pollut. Bull. 1991. - V. 22. - P. 305-307. Panchenko M.P., Hoffenberg S.I., Tkachuk V.A. Purification and some properties of

79. GTP-binding proteins from pig heart plasma membranes // Biochim. Biophys. Acta.1987.-V. 46.-P. 452-455.

80. Pertseva M.N., Kuznetsova L.A., Plesneva S.A., Grishin A.V., Panchenko M.P. (3

81. Agonist-induced inhibitory-guanine-nucleotide-binding regulatory protein coupling to adenylate cyclase in mollusk Anodonta cygnea foot muscle sarcolemma // Eur. J. Biochem.- 1992. V. 210.-P. 279-286.A

82. Pieroni J.P., Harry A., Chen J., Jacobowitz O., Magnusson R.P., Iyengar R. Distinct characteristics of the basal activities of adenylyl cyclases 2 and 6 // J. Biol. Chem. 1995. -V. 270.-P. 21368-21373.

83. Pitt G.S., Milona N., Borleis J., Lin K.C., Reed R.R., Devreotes P.N. Structurally distinct and stage-specific adenylyl cyclase genes play different roles in Dictyostelium development // Cell. 1992. - V. 69. - P. 305-315.

84. Roelofs J., Snippe H., Kleineidam R.G., Van Haastert P.J. Guanylate cyclase in Dictyostelium discoideum with the topology of mammalian adenylate cyclase // Biochem. J. 2001b. - V. 354.-P. 697-706.-f

85. Root P.A., Prince A., Gunderson R.E. Aggregation of Dictyostelium discoideum is dependent on myristoylation and membrane localization of the G protein a-subunit, Ga2 // J. Cell. Biochem. 1999. - V. 74. - P. 301 -311.

86. Ross D.T., Raibaud A., Florent I.C., Sather S., Gross M.K., Storm D.R., Eisen H. Thetrypanosome VSG expression site encodes adenylate cyclase5 and a leucine-rich putative regulatory gene // EMBO J. 1991. - V. 10. - P. 2047-2053.

87. Saito T., Small L., Goodenough U.W. Activation of adenylate cyclase in Chlamydomonas reinhardtii by adhesion and by heat // J. Cell. Biol. — 1993. V. 122. - P. 137-147.

88. Salomon Y., Londos C., Rodbell M.A. Highly sensitive adenylate cyclase assay // Anal. Biochem. 1974.-V. 58. - P. 541-548.

89. Savinon-Tejeda A.L., Ongay-Larios L., Ramirez J., Coria R. Isolation of a gene encoding a G protein alpha subunit involved in the regulation of cAMP levels in the yeast Kluyveromyces lactis // Yeast. 1996. - V. 12. - P. 1125-1133.

90. Simon M.I., Strathmann M.P., Gautam N. Diversity of G proteins in signal transduction !! Science. 1 991. - V. 252. - P. 802-808.

91. Srinivasan J., Gundersen R.E., Hadwiger J.A. Activated G subunits can inhibit multiple signal transduction pathways during Dictyostelium development // Dev. Biol. 1999. - V. 215.-P. 443-452.

92. Strader C.D., Fong T.M., Tota M.R., Underwood D., Dixon R.A.F. Structure and function of G protein-coupled receptors // Annu. Rev. Biochem. 1994. - V. 63. - P. 101132.

93. Sweet M.T., Allis C.D. Phosphorylation of linker histones by cAMP-dependent protein kinase in mitotic mieronuclei of Tetrahymena // Chromosomal- 1993. V.102. - P. 637647.

94. Sweet M.T., Carlson G., Cook R.G., Nelson D., Allis C.D. Phosphorylation of linker histones by a protein kinase A-like activity in mitotic nuclei // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272.-P. 916-923.

95. Taussig R., Gilman A.G. Mammalian membrane-bound adenylyl cyclases // J.Biol.Chem. 1995,-V. 270.-P. 1-4.

96. Taylor M.C., Muhia D.K., Baker D.A., Mondragon A., Schaap P.B., Kelly J.M.

97. Trypanosoma cruzi adenylyl cyclase is encoded by a complex multigene family // Mol. Biochem. Parasitol. 1999. -V. 104. - P. 205-217.

98. Tesmer J.J.G., Sunahara R.K., Gilman A.G., Sprang S.R. Crystal structure of the catalytic domains of adenylyl cyclase in a complex with Gsa-GTPyS // Science. 1997. -V. 278. - P. 1907-1916.

99. Thevelein J.M., de Winde J.H. Novel sensing mechanisms and targets for the cAMPprotein kinase A pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Mol. Microbiol. -1999.-V. 33.-P. 904-918.

100. Wess J. G protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G protein recognition // FASEB J. 1997. - V. 11. - P. 346354.

101. Wess J. Molecular basis of receptor/G protein-coupling selectivity // Pharmacol. Ther. -1998.-V. 80.-P. 231-264.

102. Xia Z., Storm D.R. Regulatory properties of the mammalian adenylyl cyclases // In: Molecular biology intelligence unit. Heidelberg, Germany: Springer-Verlag. 1996. - 175 P

103. Zhang C.C. Bacterial signalling involving eukaryotic-type protein kinases // Mol. Microbiol. 1996.-V. 20.-P. 9-15.

Информация о работе

Деркач, Кира Викторовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2003
ВАК 03.00.04

Диссертация

Структурно-функциональная организация аденилатциклазной сигнальной системы инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Структурно-функциональная организация аденилатциклазной сигнальной системы инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы