Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы сопряжения гормональных рецепторов с G-белками в аденилатциклазной сигнальной системе позвоночных и беспозвоночных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы сопряжения гормональных рецепторов с G-белками в аденилатциклазной сигнальной системе позвоночных и беспозвоночных"

----

На правах рукописи

ШПАКОВ АЛЕКСАНДР ОЛЕГОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СОПРЯЖЕНИЯ ГОРМОНАЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРОВ С в-БЕЛКАМИ В АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЕ ПОЗВОНОЧНЫХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2007

003053828

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Научный консультант: доктор биологических наук,

профессор Марианна Николаевна Перцева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Людмила Валентиновна Пучкова

доктор биологических наук, профессор Зоя Иринарховна Крутецкая

доктор биологических наук, профессор Евгений Викторович Розенгарт

Ведущее учреждение Институт биологии развития им.

Н.К. Кольцова РАН, Москва

Защита состоится «27» марта 2007 г. в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.127.01 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан « /у »_ О Л 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 002.]21#1 /7

доктор биологических наук, профессор М.Н. Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Регуляция большинства жизненно важных функций и процессов в организме позвоночных и беспозвоночных животных осуществляется с помощью гормонов и гормоноподобных веществ. Их действие реализуется через высоко специализированные гормональные сигнальные системы. Предметом нашего исследования была наиболее широко распространенная гормоночувствительная аденилатциклазная система (АЦС). Ее основными компонентами являются рецептор, расположенный в плазматической мембране и специфически опознающий гормональный сигнал, гетеротримерный G-белок стимулирующего (Gs-белок) или ингибирующего (Gj-белок) типа, который состоит из трех типов субъединиц - а, Р и у, и фермент аденилатциклаза (АЦ), генерирующий образование вторичного посредника цАМФ (Sunahara, Taussig, 2002). цАМФ активирует протеинкиназу А и через нее регулирует широкий спектр эффекторных систем клетки.

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы в изучении АЦС, молекулярные механизмы передачи через нее гормональных сигналов остаются до конца невыясненными. Недостаточно информации о молекулярных детерминантах в белках, компонентах АЦС, вовлеченных в процесс их функционального взаимодействия и являющихся ключевыми звеньями в сигнал передающей цепи. Много вопросов остается и в отношении регуляции АЦС гормонами, которые действуют через рецепторы, не относящиеся к серпантинному типу. По-прежнему мало изученными остаются АЦС беспозвоночных животных, в первую очередь одноклеточных эукариот.

Понимание того, каким образом функционирует АЦС, является одним из магистральных направлений в современной биохимии и молекулярной эндокринологии, поскольку через эту систему регуляторное влияние на клетку оказывают более сотни различных по химической природе гормонов, а сама АЦС играет ключевую, координирующую роль в регуляции практически всех жизненно важных клеточных процессов - роста, метаболизма, аиоптоза, дифференцирования. Решению актуальной проблемы функционирования АЦС и посвящено настоящее исследование, в котором изучены молекулярные механизмы функционального сопряжения компонентов АЦС и, в первую очередь, взаимодействие между активированным рецептором и G-белком, как ключевого этапа передачи гормонального сигнала через эту систему. В работе применен эволюционный подход, который заключался в сравнительном исследовании функциональных блоков АЦС у животных различного филогенетического уровня -высших позвоночных (крысы), многоклеточных беспозвоночных (моллюски, черви) и одноклеточных эукариот (инфузории). Оригинальным и перспективным является использование для выяснения молекулярных механизмов сопряжения рецепторов с G-белками пептидной стратегии, которая представляет собой принципиально новый подход в изучении функционирования сигнальных систем и их компонентов на субмолекулярном уровне (Chidiac, 1998; Covic et al., 2002).

Открытие в лаборатории АЦ сигнального механизма действия инсулина (Pertseva et а!., 2003), заставляет по-новому взглянуть на молекулярные механизмы действия на АЦС родственного ему релаксина. Релаксин регулирует широкий спектр физиологических процессов в организме человека и рассматривается как перспективный лекарственный препарат для лечения заболеваний репродуктивной, сердечно-сосудистой и нервной систем (Ivell, Einspanier, 2002; Lu et al., 2005). Однако до сих пор молекулярные механизмы действия релаксина на клетку изучены недостаточно. Их

О,

У

расшифровка представляет собой важнейший этап в понимании общих закономерностей регуляторного влияния релаксина и других пептидов инсулинового суперсемейства на функциональную активность эффекторных, в том числе цАМФ-зависимых, систем клетки, и является необходимым условием для практического применения релаксина в медицине.

Опираясь на развиваемую нами концепцию молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных и гормон-зависимых заболеваний (Перцева, Шпаков, 2004), было предпринято исследование функционального состояния АЦС и молекулярных механизмов сопряжения рецепторов с G-белками в условиях патологии при стрсптозотоциновом диабете 1-го и 2-го типов у крыс. Понимание природы нарушений функционирования АЦС при сахарном диабете важно как для диагностики этого социально значимого заболевания, так и для поиска эффективных путей его лечения.

Создание новых, более эффективных, гормональных препаратов, обладающих высокой специфичностью и селективностью регуляторного действия на АЦС, требует разработки функциональных зондов для изучения молекулярных механизмов взаимодействия рецепторов с G-белками. Одним из перспективных подходов для разработки таких зондов является синтез нсгормональных регуляторов АЦС - пептидов, которые мимикрируют функционально важные для взаимодействия с G-белками участки рецепторов и способны влиять на функциональную активность компонентов АЦС (Nürnberg et al., 1999; Breitvveg-Lehmann et al., 2002). Нами были впервые синтезированы и изучены различные по структуре поликатионные пептиды, которые по независимому от рецептора механизму активируют G-белки и влияют на передачу гормональных сигналов через АЦС, являясь, таким образом, негормональными регуляторами функциональной активности этой системы.

В настоящее время сравнительно мало известно о структурно-функциональной организации АЦС одноклеточных эукариот, в частности инфузорий. В то же время, исследование сигнальных систем одноклеточных представляет как теоретическую, так и практическую ценность. Согласно развиваемым в нашей лаборатории представлениям (Перцева, 1989; Pertseva, 1991), именно на уровне одноклеточных организмов начинают формироваться гормональные сигнальные системы высших эукариот. Инфузории Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis, избранные нами в качестве объектов, широко используются в экотоксикологических исследованиях. Поскольку АЦС является одной из мишеней внешних воздействий, то выяснение ее функционирования поможет в разработке новых эффективных подходов для оценки последствий таких воздействий и их высокочувствительного мониторинга.

Цели и задачи исследования. Цель исследования состояла в выяснении молекулярных механизмов функционального сопряжения гормональных рецепторов и гетеротримерных G-белков, компонентов АЦС, в клетках животных различного филогенетического уровня.

Задачи исследования состояли:

1) С помощью сравнительного теоретического анализа выявить в рецепторах серпантинного типа и гетеротримерных G-белках молекулярные детерминанты, ответственные за их функциональное сопряжение и вовлеченные в процесс передачи гормонального сигнала.

2) Использовать пептидную стратегию, заключающуюся в синтезе пептидов, которые соответствуют взаимодействующим с рецепторами С-концевым участкам а-субъединиц

G-белков, для исследования молекулярных механизмов передачи гормональных сигналов через АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных животных.

3) С применением впервые синтезированных пептидов, соответствующих С-концевому участку третьей цитоплазматической петли (С-ЦПЗ) рецептора релаксина LGR7, выявить и изучить молекулярные механизмы передачи релаксинового сигнала через АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных.

4) Расшифровать и исследовать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма действия релаксина, обнаруженного в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах моллюска Anodonta cygnea.

5) Исследовать чувствительность АЦС к биогенным аминам и пептидным гормонам при стрептозотоциновом диабете 1-го и 2-го типов у крыс и выявить локализацию нарушений в АЦС, возникающих в условиях этой патологии.

6) Провести сравнительное исследование механизмов действия синтетических поликатионных пептидов, не имеющих гомологии с сигнальными белками, но способных мимикрировать функционально важные для сопряжения с G-белками участки рецепторов, на функциональную активность компонентов АЦС.

7) Охарактеризовать АЦС одноклеточных эукариот - инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis, и изучить молекулярные механизмы передачи через нее гормональных сигналов на этапе сопряжения рецептора с G-белком и АЦ.

Научная новизна. В результате проведенных теоретических и экспериментальных исследований показано, что одним из основных молекулярных механизмов, лежащих в основе функционального сопряжения рецепторов с G-белками в тканях позвоночных и беспозвоночных, является способность поликатионных спиралей цитоплазматических петель активированного гормоном рецептора взаимодействовать с С-концевым сегментом а-субъединицы гетеротримерного G-белка и опосредовать, таким образом, передачу гормонального сигнала к АЦ и цАМФ-зависимым эффекторным системам.

Впервые показано, что С-концевые пептиды а-субъединиц Gs- и Gi-белков способны с высокой селективностью прерывать передачу гормонального сигнала через те типы G-белков, производными первичной структуры которых они являются, вследствие чего их можно применять для идентификации G-белков, участвующих в сигнальной транедукции.

Показано, что впервые синтезированные нами пептиды, соответствующие С-ЦПЗ релаксинового рецептора LGR7 серпантинного типа, не только влияют на передачу релаксинового сигнала через АЦС в сердце и мозге крыс, но и независимым от рецептора способом активируют Gs-белки и АЦ. Это указывает на участие рецептора LGR7 в транедукции релаксинового сигнала в этих тканях и свидетельствует о вовлечении в процесс функционального сопряжения с Gs-белком С-ЦПЗ этого рецептора.

Впервые расшифрован АЦ сигнальный механизм действия релаксина, реализуемый в скелетных мышцах крысы, который включает: рецептор тирозинкиназного типа => Gj-белок (Gßy-димер) => фосфатидилинозитол-3-киназу => протеинкиназу С^ => Gs-белок => АЦ. По своей структурно-функциональной организации он сходен с открытым ранее в лаборатории АЦ сигнальным механизмом действия инсулина (Pertseva et al., 2003).

В работе впервые показано, что основные нарушения в АЦС при стрептозотоциновом диабете 1-го и 2-го типов у крыс, возникают па этапе сопряжения рецепторов биогенных аминов и пептидных гормонов с различными типами G-белков.

Для изучения этих нарушений была применена разработанная автором пептидная стратегия.

Впервые исследована АЦС представителей одноклеточных эукариот - инфузорий

0. атег и Т. руп/огт!.?, сходная по ряду свойств с АЦС позвоночных. Показано, что ее функциональная активность регулируется биогенными аминами и пептидными гормонами млекопитающих. Эги данные и результаты проведенного нами сравнительного теоретического анализа первичных структур сигнальных белков, компонентов АЦС одноклеточных, свидетельствуют о раннем формировании АЦС в эволюции эукариот.

Научно-практическая значимость работы. Синтезированные нами и исследованные в работе пептиды, соответствующие участкам рецепторов и в-белков, ответственным за взаимодействие между ними, а также синтетические поликатионные пептиды, мимикрирующие эти участки, но не имеющие гомологии с сигнальными белками, могут быть в дальнейшем применены как в качестве функциональных зондов для изучения молекулярных основ функционирования АЦС, так и в качестве высокоэффективных и селективных негормональных регуляторов активности сигнальных белков. В перспективе на основе этих пептидов могут быть разработаны лекарственные препараты, избирательно действующие на функциональную активность гормональных сигнальных систем. Материалы диссертации могут быть использованы в курсах лекций для студентов и аспирантов в Санкт-Петербургском государственном университете, Медицинском университете, Химико-фармацевтической Академии и других Университетах и вузах России.

Положения, выносимые на защиту.

1. Основные молекулярные детерминанты, ответственные за взаимодействие с О-белками, локализованы в проксимальных к мембране участках цитоплазматических петель рецепторов и характеризуются наличием кластеров положительно заряженных аминокислот и способностью формировать спиральные структуры. Синтетические пептиды, которые соответствуют участкам рецепторов и С-белков, ответственным за их функциональное взаимодействие, способны с высокой эффективностью и селективностью по конкурентному механизму прерывать проведение гормонального сигнала через АЦС.

2. Молекулярные механизмы стимулирующего АЦ действия релаксина являются ткане- и видоспецифичными и реализуются через гетеротримерные в-белки. В сердце и мозге крысы релаксин осуществляет свое действие через трехкомпонентную АЦС, в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах моллюска А. су§пеа - через шести компонентный АЦ сигнальный механизм.

3. В условиях стрептозотоцинового диабета 1-го и 2-го типов у крыс наблюдаются нарушения функционирования чувствительной к биогенным аминам и пептидным гормонам АЦС, в первую очередь на этапе сопряжения активированного гормоном рецептора с в-белком.

4. Синтетические поликатионные пептиды, мимикрирующие взаимодействующие с О-белками участки рецепторов, способны по независимому от рецептора механизму активировать в-белки и влиять на проведение гормонального сигнала через АЦС.

5. В клеточных культурах инфузорий Д атег и Т. руг1/огт15 имеется функционально активная АЦС, чувствительная к гормонам млекопитающих. Это согласуется с присутствием у одноклеточных эукариот сигнальных белков, гомологичных

компонентам ЛЦС позвоночных, что свидетельствует об эволюционной консервативности АЦС эукариотических организмов.

Апробация работы. Основные результаты и положения работы широко представлены на большом числе отечественных и зарубежных научных конференций и симпозиумов, в том числе: на VI Международном конгрессе по нейроэндокринологии (Питгсбург, США, 2006), на III Международном симпозиуме по пептидам (Прага, Чехия, 2004), на III и IV Международных конференциях по релаксину и родственным пептидам (Брум, Австралия, 2000; Виоминг, США, 2004), на XVII, XXI и XXII Конференциях сравнительных эндокринологов (СЕСЕ: Кордоба, Испания, 1994; Бонн, Германия, 2002; Упсапа, Швеция, 2004), на Международном симпозиуме по сигнальной транедукции (FEBS: Брюссель, Бельгия, 2003), на Симпозиуме '"Cell Signalling Mechanisms: from Membrane to Nucleus" (FEBS: Амстердам, Нидерланды, 1997), на Европейской конференции "Cell signaling, transcription, and translation as therapeutic targets" (Люксембург, 2002), на Международном симпозиуме "Structure, stability and folding of proteins: fundamental and medical aspects" (Москва, 1998), на VII Восточноевропейской конференции по нейробиологии беспозвоночных (Калининград, 2003), на IV Международной конференции по простейшим нервным системам (Пущино, 1994), на XI, XII и XIII Международных конференциях по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996, 2002, 2006), на Международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004), на I и II Всероссийских симпозиумах по химии и биологии пептидов (Москва, 2003; Санкт-Петербург, 2005), на XV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005), на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005), на Всероссийском физиологическом съезде (Екатеринбург, 2004), на I съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003). Публика[[ии. По теме диссертации опубликовано 85 научных работ, в том числе 45 статей в рецензируемых отечественных и международных научных изданиях и 40 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 300 страницах, состоит из введения, 6 отдельных глав, включающих обзор литературы, результаты экспериментальных и теоретических исследований и их обсуждение, главы с описанием методов исследования, заключения, выводов и списка литературы, включающего 342 источника, в том числе 78 отечественных и 264 иностранных. Работа иллюстрирована 87 рисунками и 11 таблицами.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В опытах использовали: (1) самцов белых крыс линии Wistar и самцов белых беспородных крыс; (2) инфузорий Tetrahymena pyriformis и Dileptiis anser, (3) пресноводных двустворчатых моллюсков Anodonta cygnea; (4) земляных червей Lumbricus terrestris.

В работе применяли широкий спектр биохимических и фармакологических подходов и методов, включающий:

- выделение фракций плазматических мембран из тканей позвоночных (крысы) и беспозвоночных (моллюски, черви) животных методом дифференциального ультрацентрифугирования;

- выделение частично очищенных мембранных фракций из гомогенатов клеточных культур инфузорий;

- определение активности К^2+-зависимой АЦ с помощью меченых [<х-32Р]АТФ и [8-3Н]АТФ в качестве субстратов;

- определение активности цАМФ-зависимой протеиикиназы (протеинкиназы А) с помощью [у-згР]АТФ в качестве субстрата;

- определение связывающих характеристик |3-адренергических (АР) и серотониновых рецепторов с помощью [3Н]-дигидроальпренолола и 5-[1,2-3Н(Ы)]-гидрокситриптамина, соответственно;

- определение ГТФ-связывания гетеротримерных О-белков с помощью [8-3Н]СррМНр;

- АДФ-рибозилирование гетеротримерных О-белков холерным и коклюшным токсинами;

- создание моделей стрептозотоцинового диабета 1-го и 2-го типов у крыс;

- синтез пептидов твердофазным методом и их применение для изучения функционирования АЦС и молекулярных механизмов сопряжения между компонентами этой системы - гормональными рецепторами и С-белками;

- теоретические исследования первичной структуры сигнальных белков с помощью программ ВЬАвТр и ВЬАЭТх;

- поиск локальной гомологии в сигнальных белках с помощью разработанного автором графического метода;

- расчет склонности участков первичной структуры сигнальных белков к формированию а-егшралей и суперспиральных структур.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Поиск молекулярных детерминант в молекулах рецепторов серпантинного типа и гетеротримерных С-бслков, ответственных за нх функциональное взаимодействие.

Проблема функционального взаимодействия между белками - компонентами АЦС и поиск молекулярных детерминант, вовлеченных в это взаимодействие, занимает одно из центральных мест в современной биохимии и молекулярной эндокринологии. Выявление этих детерминант, ставшее задачей первого этапа исследования, было необходимо для разработки в дальнейшем пептидной стратегии и направленного синтеза пептидов, способных эффективно влиять на функциональную активность АЦС.

Данные литературы и проведенный нами с помощью компьютерных методов сравнительный анализ первичных структур цитоплазматических петель более 50 рецепторов серпантинного типа свидетельствуют о том, что в большинстве из них ключевую роль в сопряжении с О-белками играет третья цитоплазматическая петля, причем если для взаимодействия с 05-бслками наиболее важны С-концевыс участки этой петли, то для взаимодействия с выбелками - ее Ы-концевые участки. В >4- и С-концевых участках третьей цитоплазматической петли были выявлены высоко консервативные мотивы, обогащенные положительно заряженными аминокислотными остатками, которые определяют селективность и эффективность взаимодействия рецептора с в-белками. Эти участки, как показал теоретический анализ их вторичной структуры, способны к образованию амфипатических а-спиралей, что наиболее отчетливо выражено в случае С-концевых участков.

В молекулах в-белков определяющая роль в сопряжении с рецептором принадлежит сравнительно короткому С-концевому сегменту их Оа-субъсдиниц (БипаЬага е1 а!., 1997; В1аЬоз й а!., 2001). Проведенный нами сравнительный анализ

показал, что среди Ga-субъединиц, относящихся к одному семейству, первичная структура их С-концевых сегментов высоко консервативна или даже идентична, и, наоборот, среди Ga-субъединиц, относящихся к различным семействам, она вариабельна. Таким образом, С-концевые сегменты Ga-субъединиц отвечают не только за эффективность, но и за селективность взаимодействия G-белка с рецептором.

2. Исследование молекулярных механизмов действия гормонов на активность АЦС с применением С-концевых пептидов a-субъединиц Gs- и Gi-белков.

Второй этап был посвящен разработке и апробации пептидной стратегии, которая основана на применении пептидов, соответствующих С-концевым сегментам а-субъединиц G-белков. Эти пептиды были использованы для исследования молекулярных механизмов регуляции АЦС гормонами и выявления типа G-белков, участвующих в процессе передачи гормонального сигнала. Нами были синтезированы три пептида, соответствующие С-концевому сегменту Gas-субъединицы млекопитающих - 385-394, 387-394 и карбобензокси-387-394 Gas, и пептид, который соответствует С-концевому сегменту 346-355 Оа,2-субъединицы млекопитающих. Было изучено их влияние на передачу стимулирующих и ингибирующих активность АЦ гормональных сигналов в тканях позвоночных (крыса) и беспозвоночных (моллюск Л. cygnea).

Все Gas-пептиды дозозависимо снижали стимулирующие АЦ эффекты серотонина (рис. 1) и изопротеренола в тканях моллюска и крысы, которые осуществляются через Gs-белки. Их ингибирующее влияние осуществлялось по конкурентному механизму - Gas-пептиды конкурировали с Gs-белком за связывание с молекулой рецептора. Наиболее эффективным был пептид 385-394, наименее эффективным - карбобензокси-387-394, на основании чего сделан вывод о том, что эффективность С-концевых Са5-пептидов определяется их структурой - длиной (декапептид 385-394 активнее октапептида 387394) и наличием функциональных групп (пептид 387-394 с карбобензоксигруппой менее активен в сравнении с не модифицированным аналогом).

Пептид 346-355 Ga^ дозозависимо снижал осуществляемые через Gj-белки ингибирующие эффекты изопротеренола в мышцах моллюска и Ог-агониста бромкриптина в мозге крысы на предварительно стимулированную форсколином активность АЦ (рис. 2). В случае серотонина в скелетных мышцах крысы, который, как было показано нами ранее, активирует как Gs-, так и 0,-белки, пептид 346-355 Ga^ подавлял ингибирующий АЦ сигнал и способствовал выявлению стимулирующего эффекта гормона, в то время как Gas-пептиды подавляли стимулирующий АЦ сигнал и способствовали выявлению его ингибирующего эффекта (рис. 3). Это свидетельствует о возможности использования С-концевых пептидов в качестве селективных блокаторов сопряжения рецепторов с определенным типом G-белков.

Все С-концевые пептиды дозозависимо снижали стимуляцию гормонами ГТФ-связывания, которое является показателем функциональной активности G-белков. При этом Gas-пептиды снижали стимуляцию ГТФ-связывания биогенными аминами, действующими через Gs-белки (рис. 4), в то время как пептид 346—355 Gaj2 снижал стимуляцию ГТФ-связывания изопротеренолом в мышцах моллюска и бромкриптином в мозге крысы, реализующими свое действие через Gj-бслки (рис. 5). Стимуляция ГТФ-связывания серотонином в скелетных мышцах крысы, который активирует оба типа G-белков, снижалась в присутствии как Gas-, так и Са;2-пептидов (рис. 5).

Put. 1. Влияние Gcts-пептндов на стимулирующий АЦ эффект серотопина в гладких мышцах моллюска.

2 и 3 - пептиды 385-394, 387-394 и карбобснэокеи-387-394 Gas. По вертикали - стимулирующий АЦ эффект lü"6Мсерогокина,%.

□ 1 ¡ИЗ г Ш з НИ ^ Ш 5

s 6

Рис. 2. Влияние пептида 346-355 Cia.,2 па ингибированис изопротсренолом к гладких мышцах моллюска (я) н Di-агонистом бром криптином в мозге крысы (6) активности АЦ. стимулированной форсколином. /-10'5М форсколин; 2 - (/) + 10 É M гормон; 3-6 - (2) + 10"7, lin, 10 s и Ю4 M пептид.

Вязальная активность АЦ принята за 100%.

Ингибирующее влияние С-концевых пептидов реализуется па этане сопряжения рецептора с С-бел ком. Доказательством этого является переход рецепторов в низкоаффинное для агониста состояние в их присутствии. 1'ак, если без С-концевых пептидов кривая вытеснения антагониста ¡3-АР [3Н]-диги дроал ьпрено лола а гон истом изопротеренолом при добавлении ГТФ, который снижает сродство рецептора к агонисту, смещалась вправо (значение К, возрастало с 78 до 482 нМ), то в присутствии Ссц-мептида 385-394, такое смещение практически отсутствовало, поскольку рецептор изначально находился в низко аффинном состоянии (К„ 141 нМ) (рис. 6).

Рис. 3. Влияние С-концевых пептидов на регуляцию серотонином активности АЦ в скелетных мышцах крысы.

1,0 йЗ-пептиды ,185-394, 387-394 и карбобснзокси-387-394 Go^; 4 -псптил 346-355 Gctij. По вертикали - активность АЦ и присутствии i0'f' М серою ни на, %. Вязальная активность АЦ принята за 100%.

Рис. 4. Влияние Gas-]ienmaoB и пептида 346-355 Gaj3 (10'" М) на стимуляцию П еревязывания серотонином в гладких мышцах моллюска изопротеренолом в скелетных мышцах крысы (в).

1 - без добавок; 2 — гормон, 10"® М; 3 - гормон + 385--394 Gas; 4 ~ гормон 5 - гормон + карбобензокси-387-394 Ga3; б - гормон + 346-355 Са.з. ГТФ-связывапие в контроле принято за 100 %. *, р < 0.05.

(я) и мозге крысы (С) и 387-394 Ca,;

Hue. 5. Влияние Ссц-пептидов и 346-355 Gaj2 (1СГ5 М) на стимуляцию ГТФ~связывания изопротереиолом в гладких мышцах моллюска (а), бромкрйлтнном в мозге крысы (о) и серотонином в скелетных мышцах крысы (в). Обозначения те же, что и на рис. 4. р< 0.Q5.

Рис. 6. Вытеснениё~[ ^([]-дигйдроальпреполола нзопрогеренолом из связывающих .мест в мембранах скелетных мышц крысы в присутствии Осц-пептида 355-394, А — контроль; Б - в присутствии 101 М пептида 385-394 Са5. I - изипротерснол; 2 - I изопротеренол + ГТФ, 10й М. По оси ординат - специфическое связывание ['Н]-дш идроальпренолола. %. ____________

Разработанная нам» стратегия, основанная на использовании С-концевых пеггтидов, была применена для изучения сигнальных механизмов действия биогенных аминов на активность АЦС в т канях моллюска А. су^ка

Октопамин, дофамин и серотонин (10"8-104 М) дозозависимо стимулировали активность ЛЦ и ГТФ-связывание в ганглиях и гладких мышцах моллюска. При сравнительном исследовании действия биогенных аминов на АЦС в тканях моллюска обнаружено, что в ганглиях наиболее эффективны октопамин и дофамин, в мышцах -октопамин и серотонин. В присутствии пептида 385-394 Gcts стимулирующие активность АЦ (рис. 7) и ГТФ-связывание эффекты биогенных аминов снижались или полностью блокировались. Это свидетельствует о том, что эти эффекты реализуются через рецепторы, сопряженные с Gj-белками. Пептид 346-355 Оа,2 был эффективен только в отношении АЦ эффекта серотонина в ганглиях. Он отчетливо его усиливал, что указывает на участие в реализации этого эффекта как Gs-, так и Gi-белков. Полученные данные согласуются с результатами ингибиторного анализа, проведенного нами с помощью специфических антагонистов рецепторов биогенных аминов.

Таким образом, блокирование С-концевыми пептидами функциональной активности АЦС осуществляется на этапе взаимодействия активированного гормоном рецептора с G-белком, причем действие С-концсвых пептидов осуществляется по конкурентному механизму и является высоко селективным. Gas-нептиды ингибируют передачу стимулирующих, а Оа,2-пептиды — ингибирующих АЦ гормональных сигналов.

6 5 4

-1од[лептид 385-394], М

7 6 5 4

-1од[пептид 385-394], М

Рис. 7. Влияние пептида 385-394 Gas (10"7-10'4 М) на стимуляцию гормонами (10"5 М) активности АЦ в ганглиях и гладких мышцах моллюска.

А - ганглии, Б - мышцы. 1 - октопамин; 2 - дофамин; 3 -серотонин._

3. Молекулярные механизмы действия релаксина на активность АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных.

Целью третьего этапа работы была расшифровка молекулярных механизмов регуляторного влияния релаксина, родственного инсулину пептидного гормона, на функциональную активность АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных.

В качестве объектов для исследования были избраны ткани позвоночного животного крысы - миокард, мозг и скелетные мышцы, и мышцы беспозвоночных -

моллюска А. су^еа и червя Ь. /етгейги. Для изучения участия О-белков и релаксинового рецептора 1ХЖ7 серпантинного типа в регуляторном действии релаксина на АЦ была применена пептидная стратегия. Она была основана на использовании С-концевых пептидов а-субъединиц О-белков и впервые синтезированных нами 11-ти и 15-ти-членных пептидов, (ЗУККЕ-Ме-ИАКК-амида (619-629) и ЕИУМ(ЗУККЕ-М1е-1ЬАКК-амида (615-629), соответствующих С-ЦПЗ рецептора релаксина 1X3117. Выбор пептидов, производных С-ЦПЗ рецептора 1X3117, был продиктован следующими обстоятельствами: (/) соответствующий участок в рецепторе тиреотропного гормона, гомологичного, согласно нашим данным, рецептору ЬОЯ7, играет ключевую роль во взаимодействии с й-белками (Коэ!^ е1 а1., 1992); (2) в участке 619-629 расположены кластеры положительно заряженных аминокислот, которые являются основными молекулярными детерминантами, ответственными за сопряжение рецепторов с С-белками. Поскольку включение гидрофобных радикалов в пептиды усиливает их взаимодействие с мембраной и повышает эффективность взаимодействия с сигнальными белками (Соу1с е1 а!., 2002), пептид 619-629 был модифицирован остатком пальмитиновой кислоты - 0УККЕ-»1е-IЬАКЯК(Ра1 т)-амид (619-629-Ьуз(Ра1т)).

Релаксин дозозависимо стимулировал АЦ во всех исследованных тканях (рис. 8). Действие гормона было наиболее отчетливо выражено в миокарде и мозге, в меньшей степени - в скелетных мышцах крысы, и слабо выявлялось в мышцах беспозвоночных, что свидетельствуют о тканевой и видовой специфичности его влияния на АЦС. Релаксин также стимулировал ГТФ-связывание О-белков (рис. 9). В присутствии сурамина, специфичного ингибитора гетеротримерных О-белков, стимулирующие эффекты релаксина блокировались. Это указывает на то, что релаксин осуществляет свое действие на АЦ именно через гетеротримерные О-белки и не оказывает заметного влияния на другие их типы.

Рис. 8. Стимуляция релаксином активности АЦ в тканях крысы и мышцах моллюска А. су$пеа и червя £. (е/те-^т.

1, 2, 3 - мозг, миокард и скелетные мышцы крысы; 4 - гладкие мышцы моллюска; 5 - мышцы кожно-мускульного мешка червя. Базальная активность АЦ, которая составляла в мозге - 76.9+5.2, в миокарде - 16.6+1.1, в скелетных мышцах - 16.2+0.8, в мышцах моллюска - 23.6+1.8, в мышцах червя -55.7±4.4 пмоль цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка, принята за 100 %.

-1од[релаксин], М

10 9 8 7 -1од[релаксин], М

Рис. 9. Стимуляция релаксином ГТФ-связывания во фракциях мембран миокарда, скелетных мышц и мозга крысы.

1 - миокард, 2 - скелетные мышцы, 3 -мозг.

Базалъный уровень ГТФ-связывания, который в миокарде, скелетных мышцах и мозге составлял соответственно 2.37±0.14, 1.45±0.13 и 6.9310.35 пмоль на 1 мг мембранного белка, принят за 100 %.

Пептиды 615—629 и 619-629-ЬуБ(Ра1т) в отсутствие гормона дозозависимо стимулировали активность АЦ (рис. 10) и ГТФ-связыванис. Стимулирующий эффект пептида 619-629-Ьуз(Ра1т) был выражен в большей степени, что связано с наличием в его структуре гидрофобного остатка пальмитата. Таким образом, пептиды, производные С-ЦПЗ рецептора ЬСЯ7, способны независимым от рецептора способом стимулировать активность АЦ и в-белка. Действие пептидов осуществлялось в микромолярном диапазоне концентраций, что указывает на их высокую эффективность.

-1од[пептид], М

Рис. 10. Стимуляция пептидами, производными С-ЦПЗ

релаксинового рецептора ЬСТ17, активности АЦ в миокарде крысы. 1 - пептид 619-629; 2 - пептид 619-629-Ьуз(Ра1ш); 3 - пептид 615-629.

В присутствии пептидов 619-629-Ьуз(Ра1т) и 615-629 (10'6-104 М) стимулирующий эффект релаксина на АЦ и ГТФ-связывание в миокарде (рис. 11) и мозге крысы дозозависимо снижался. Ингибирующее влияние пептидов осуществляется по конкурентному механизму - они конкурируют с рецептором релаксина ЬОЯ7, производными которого являются, за связывание с О-белком. Таким образом, релаксиновый сигнал в миокарде и мозге передается к АЦ через рецептор Г0117

серпантинного типа. Влияние пептидов на стимулирующие АЦ эффекты релаксина было ткане- и видоспецифичным - в скелетных мышцах крысы и мышцах беспозвоночных оно не выявлялось, что указывает на участие других типов рецепторов в реализации эффектов гормона в этих тканях.

Для выяснения типа G-белков, участвующих в передаче релаксинового сигнала, были применены С-копцевые пептиды и техника АДФ-рибозилирования мембран холерным и коклюшным токсинами. АДФ-рибозилтрансферазы этих токсинов селективно выключают из процесса передачи гормонального сигнала Gs- и Gj-белки, соответственно (MilHgan, 1988; Reislne, 1990).

Пептид 385-394 Gas отчетливо снижал АЦ эффекты релаксина в миокарде и мозге, пептид 346-355 Gal2 на них не влиял (рис. 12). В скелетных мышцах крысы и мышцах беспозвоночных С-концевые пептиды были не эффективны. Обработка холерным токсином приводила к блокированию АЦ эффекта релаксина в мембранах миокарда и мозга (табл. 1). Коклюшный токсин в этом случае был не эффективен. Следовательно, релаксин осуществляет регуляцию АЦ в миокарде и мозге крысы через Gs-белок, а его АЦ сигнальный механизм в этих тканях включает три компонента - рецептор серпантинного типа LGR7, Gs-белок и фермент АЦ.

В скелетных мышцах крысы (табл. 1) и гладких мышцах моллюска обработка обоими токсинами приводила к блокированию АЦ эффекта релаксина, что свидетельствует об участии как Gs-, так и G,-белков в реализации эффекта гормона в этих тканях. Сходная картина наблюдалась и в случае расшифрованного ранее в лаборатории АЦ сигнального механизма действия инсулина, который, наряду с Gs- и Gi-белками,

включает рецептор-тирозинкнназу, фосфатидилинозитол-3-киназу и протеин киназ у С'С (РеЛБеуа е! а!.. 1995, 1996, 2003; Р1езпсуа с! а!., 2001). Мы предприняли попытку идентифицировать эти сигнальные блоки в АЦ сигнальном механизме действия релаксина в скелетных мышцах крысы и мышцах моллюска.

500

= 400

J <

É о О X

о

5 Ё С

300

200

100

¡'не. 12. Влияние С-концевык пептидов Go.,- и Ga^-субьсдиниц на стимулирующий АЦ зффект релаксина (10'8 М). а - мозг крысы; б - миокард крысы; в - скелетные мышцы крысы; г - мышцы моллюска; д мышцы червя, i - без пептида; 2, 3 - в присутствии НУ1 и 10"' М пептида 385-394 Gct5; 4-в присутствии ИГ1 М пептида 346-355 Get,¡. *.р< 0.05. _

Таблица 1. Влияние АДФ-рибозилирования мембран бактериальными токсинами на стимуляцию АЦ релаксином в тканях крысы.

Ткань Активность АЦ, шлоль цАМФ'мнн na 1 мг мембранного белка

Вез гормона ¡ Релаксин, 10'Е М

Обработка коклюшным токсином

Мозг 80.4 ± 7.4 425.3 + 9.5* (+429%)

Миокард 17.4 + 1.6 111.3 ± 7.1* (+540 %)

Скелетные мышцы 16.4 + 1.2 22.3 ± 1.7* (+36%)

Обработка холерным токсином

Мозг 138.6 + 8.9 165.4 + 8,3* (+19%)

Миокард 35.2 ± 1.4 44.8 ±2,5* (+27%)

Скелетные мышцы 34.7 ± 1.8 36.2 ±1,9 (+4%)

Значения стимулированной релаксином АЦ активности, достоверно отличающиеся от активности фермента в отсутствие гормона (¡у < 0.05), отмечены звездочками.

Тирфостин-47 (рис. 13) и генистеин, ингибиторы тирозинкиназы, и вортманнин, ингибитор фосфатидилинозитол-3-киназы, дозозависимо снижали АЦ эффект релаксина в скелетных мышцах крысы и мышцах моллюска, что указывает на участие тирозинкиназы и фосфатидилинозитол-3-киназы в реализации эффекта гормона. Тирозинкиназа, как мы полагаем, является рецепторной, поскольку использованные нами ингибиторы тирозинкиназы действуют в основном на мембранносвязанные формы фермента. Специфические антитела к атипичной изоформе протеинкиназы СС, млекопитающих дозозависимо ингибировали АЦ эффект релаксина в скелетных мышцах крысы, но были не эффективны в мышцах моллюска, что может быть связано как с их видовой специфичностью, так и с различиями в наборе изоформ протеинкиназы С в тканях позвоночных и беспозвоночных. Ингибирование АЦ эффекта релаксина тирфостином-47, генистеином, вортманнином и антителами, выработанными на протеинкиназу СС,, было специфичным и не выявлялось в отношении стимуляции АЦ биогенными аминами.

Следовательно, АЦ сигнальный механизм действия релаксина в скелетных мышцах крысы включает: рецептор тирозинкиназного типа => 0,-белок (вРу-димер) => фосфатидилинозитол-3-киназу => протеинкиназу СС, => Сн-белок => АЦ. В гладких мышцах моллюска Апос1оп1а су§пеа его структурно-функциональная организация сходная, отличаясь лишь изоформой протеинкиназы С.

Рис. 13. Действие ингибитора тирозинкиназы тирфостина-47 на стимулирующий АЦ эффект релаксина (10'8 М) в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах моллюска. 1 - мышцы крысы; 2 - мышцы моллюска. Максимальный АЦ эффект релаксина принят за 100 %. Изменения АЦ эффекта релаксина при действии тирфостина-47 достоверны, р < 0.05.

4. Нарушения функционального сопряжения рецепторов с гетеротримерными G-белками при стрсптозотоциновом диабете.

В настоящее время получены доказательства того, что при различных формах патологии, в том числе при диабете, наблюдаются значительные функциональные нарушения в гормональных сигнальных системах (Lania et al., 2001; Thompson et al., 2005). В случае АЦС предполагается, что наиболее чувствительным звеном является сопряжение рецепторов с G-белками. На четвертом этапе с целью выявления функциональных нарушений в АЦС при стрептозотоциновом диабете 1-го и 2-го типа у

крыс нами была исследована чувствительность этой системы и ее отдельных компонентов к действию гормональных агентов, осуществляющих как стимуляцию активности АЦ через Gj-белки, так и ее ингибирование через Gi-белки.

30-сут стрептозотоциновый диабет 1-го типа вызывали интраперитониальным введением крысам стрептозотоцина, вследствие чего у животных развивалась стойкая глюкозурия и гипергликемия. Назальная активность АЦ в скелетных мышцах диабетических крыс (18.5±0.9 пмоль цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка) была выше, чем в контроле (13.7+0.4 пмоль цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка). Стимулирующее действие изопротеренола (10"8-10'5 М) на активность АЦ и ГТФ-связывание в скелетных мышцах контрольных крыс было более выражено в сравнении с диабетическими животными. Так гормон (10"6 М) стимулировал ГТФ-связывание в контроле на 97 %, при диабете - на 42 %. Полученные результаты свидетельствуют о снижении реактивности Gs-сопряженной АЦС в скелетных мышцах крысы к изопротеренолу при стрептозотоциновом диабете 1-го типа, причем основные повреждения возникают на уровне Gs-белка.

Норадреналин, который активирует как Gs-, так и Gj-белки, повышал активность АЦ в скелетных мышцах при диабете эффективнее, чем в контроле, в то время как его стимулирующее влияние на ГТФ-связывание G-белков при диабете было выражено слабее. Это связано с подавлением иш ибирующего влияния норадреналина на активность АЦ, осуществляемого через Gj-белки, что и было подтверждено с помощью С-концевых пептидов. Так, в присутствии пептида 346-355 Ga¡2, который подавляет ингибирующий путь регуляции АЦ, эффект гормона в контроле возрастал на 50 %, при диабете - только на 20 % (Рис. 14). Наряду с этим, пептид 346-355 Ga;2 снижал стимуляцию норадреналином ГТФ-связывания в мышцах контрольных животных более отчетливо в сравнении с диабетическими крысами. Полученные нами результаты согласуются с данными литературы о нарушении функции Gi-белков при диабете 1-го типа (Wichelhaus et а!., 1994; Gando et al., 1997).

Сходные изменения чувствительности АЦС к гормонам были выявлены и в миокарде крыс со стрептозотоциновым диабетом 1-го типа.

Рис. 14. Влияние пептидов 385-394 Gas и 346-355 Gota на стимулирующий АЦ эффект норадреналина (10"6 М) в скелетных мышцах контрольных крыс и крыс с диабетом 1-го типа. 1,3- контроль; 2, 4 - диабет 1-го типа. 1, 2 - в присутствии пептида 385-394 Gas; 3,4 - в присутствии пептида 346355 Gai2.

Базальная активность АЦ принята за 100%.^ <0.05.

■1од[пептид], М

Таким образом, при стрептозотоциновом диабете 1-го типа снижается чувствительность ЛЦС скелетных мышц и миокарда крыс к действию биогенных аминов, что наиболее отчетливо выявляется в случае АЦС, сопряженной с Gj-белками. Это может быть связано как с нарушением взаимодействия G.-белков с рецептором, так и со снижением уровня их экспрессии при диабете 1-го типа. Выявлено также снижение функционального сопряжения рецепторов биогенных аминов с Gs-белком, ведущее к ослаблению стимулирующего АЦ сигнала.

Для создания стрептозотоциновой модели инсулин-независимого диабета 2-го типа (Hemmings, Spafford, 2000) новорожденным 1-2-сут самцам крыс вводили стрептозотоцин в дозе 80 мг/кг веса тела животного, что приводило к развитию у них диабета 2-го типа. Животных забивали через 80 дней после введения стрептозотоцина.

Активаторы G-белков NaF и GppNHp, негидролизуемый аналог ГТФ, стимулировали AI] в миокарде крыс с диабетом 2-го типа слабее в сравнении с контрольными животными. В мозговой ткани различия были выражены в меньшей степени. Эти данные свидетельствуют о том, что при стрептозотоциновом диабете 2-го типа в миокарде снижается чувствительность Gs-белков к негормональным активаторам, а, следовательно, нарушается их взаимодействие с АЦ.

Релаксин и изопротсренол, действующие через Gj-белки, дозозависимо стимулировали АЦ в миокарде как диабетических, так и контрольных животных, однако их АЦ эффекты при диабете были заметно снижены, в наибольшей степени в случае релаксина (рис. 15). В присутствии пептида 385-394 Gas АЦ эффекты гормонов в миокарде снижались (рис. 16). При этом у диабетических крыс АЦ эффекты гормонов были менее чувствительны к ингибирующему влиянию пептида 385—394 G<xs, а в случае релаксина - также и к ингибирующему влиянию пептидов, производных С-ЦПЗ релаксинового рецептора LGR7. Так пептиды 619-629-Lys(Palm) и 615-629 (10"5 М) в миокарде контрольных крыс снижали АЦ эффект релаксина (10"s М) на 71-72 %, а в миокарде диабетических животных - на 52-55 %. Это является следствием снижения эффективности сопряжения гормональных рецепторов с Gs-белком при диабете 2-го типа.

В мозге диабетических и контрольных крыс не было выявлено заметных различий в эффективности стимулирующего АЦ действия релаксина и серотонина, что указывает на тканевую специфичность нарушений функциональной активности Gs-белков и их сопряжения с рецепторами при стрептозотоциновом диабете 2-го типа.

Для выявления нарушений в сопряженных с G,-белками сигнальных каскадах при стрептозотоциновом диабете 2-го типа было изучено влияние пептидного гормона соматостатина и П2-агониста бромкриптина, действующих на АЦ через G,-белки, на предварительно стимулированную форсколином активность АЦ. Обнаружено, что как в миокарде, так и в мозге диабетических животных ингибирующие эффекты гормонов на стимуляцию АЦ форсколином отчетливо снижаются (рис. 17). При этом ингибирование АЦ при диабете лишь в незначительной степеии снижалось в присутствии пептида 346355 Gcxq, в то время в контроле этот пептид полностью блокировал ингибирующие АЦ эффекты гормонов (рис. 16).

500 ^ 400-< л ё 300 а 1___—| 1 / 2 250- ^ * 200- о О 6 л /Л. А 2

О) X £ 200 < | 150- Е <

100 100-

9В7 -!од[репаксин], М 7 6 5 -1од(изотротерекол}, М

Рис. ¡5. Стимулирующие АЦ эффекты гормонов в миокарде контрольных и диабетических крыс. и - релаксин, 6 - изонрогеренол, 1 - контроль, 2 - диабет 2-го типа. Базалъная активность АЦ примята за 100 %.

Рис. 16. Влияние пептидов 385-394 Си, и 346-355 Оа,г (10 М) на стимулирующие АЦ эффекты релаксина (10'8 М) (1, 2) и иэопротерснола (10''' М) (3. 4) в миокарде (в) и на ин| ибиронание сомвтоетатином (!0 7 М) (7, 2) и бромкриптином (10 % М) (3, 4) стимулированной форсколином АЦ активности в миокарде и мозге (б) контрольных, и диабетических крыс.

1,3- контроль. 2, 4 — диабет 2-го типа. Белые столбики - без пептида, серые - в присутствии пептида 385-394 Осц, черные - в присутствии пегггада 346-355 Ъо.,;. Стимулирующие АЦ эффекты гормонон (а) и форсколина в отсутствие гормонов (5) приняты за ¡00 %. *.р < 0.05. __________.

S 100- а t ё 100

в 5S 80- t- 80

?i •i g 60 з 2 £ 1 40 о. о * •е-| 20- Ik '—£ 2 1 купирующий АЦ: форсколина, °j 60 40 20-

£

8 7 6 -!од[соматостатин], М о 7 6 6 -1од[бромкриптин], М

Рис. 17. Ингибирование стимулированной форсколином (10° М) активности АЦ

соматостатином в миокарде (а) и бромкриптином в мозге (б) крыс.

1 - контроль, 2 - диабет 2-го типа. Стимулирующий АЦ эффект форсколина в

отсутствие гормонов принят за 100 %.

Совокупность полученных нами данных свидетельствует о нарушениях функционального сопряжения гетеротримерных G-белков с рецепторами различных гормонов и АЦ при стрептозотоциновом диабете 2-го типа. Как и в случае стрепгозотоцинового диабета 1-го типа, наиболее значительные нарушения возникают при передаче гормонального сигнала через G,-белки, что согласуется с данными литературы о снижении их функций при диабете 2-го типа (Livingstone et al., 1991; Palmer et al., 1992). Базальная активность АЦ при стрептозотоциновом диабете 2-го типа, в отличие от таковой при диабете 1-го типа, в миокарде и мозге практически не меняется. Выявлена тканевая специфичность изменений в функциональной активности Gs-сопряженной АЦС при диабете 2-го типа, заключающаяся в снижении ее чувствительности к гормонам в миокарде диабетических крыс при отсутствии заметных изменений в мозге.

5. Молекулярные механизмы действия поликатноиных пептидов, мимикрирующих цигоплазматические петли рецепторов, на функциональную активность АЦС.

На пятом этапе проводилось изучение молекулярных механизмов действия впервые синтезированных нами поликатионных пептидов на функциональную активность АЦС. Поликатионные пептиды характеризуются способностью формировать амфипатические спирали, вследствие чего мимикрируют участки цитоплазматических петель рецепторов, взаимодействующие с G-белками, и способны активировать G-белки по независимому от рецепторов механизму (Mousli et al., 1990; Higashijima et al., 1990; Leschke et al., 1997; Fukushima et al., 1998; Nürnberg et al., 1999; Breitweg-Lehmann et al., 2002). Эти пептиды могут быть применены в качестве функциональных зондов для изучения сопряжения рецепторов с G-белками.

Для исследования нами были синтезированы 12 поликатионных неразветвленных пептидов, которые по своим структурным признакам объединены в три группы (собственно поликатионные, поликатионные с остатками глутаминовой кислоты и поликатионные с гидрофобными Сю-радикалами), а также 4 поликатионных пептида с разветвленной структурой (табл. 2). Исследование вторичной структуры с помощью спектроскопии кругового дихроизма показало, что наиболее высокой склонностью к образованию спиральных структур среди них обладают пептиды с гидрофобными радикалами.

Таблица 2. Структура поликатионных пептидов, доля их спиральной конформации (по данным спектроскопии кругового дихроизма в трифторэтаноле) (1) и значения 1С50 (цМ) для ингибирующего влияния на АЦ эффекты серотонина в мышцах моллюска (2) и изопротеренола в скелетных мышцах крысы (5).

№ Пептид 1 2 3

Группа 1. Поликатионные пептиды.

I Ас-АНААНА 6% >1000 >1000

II Ас-АН АААНААНА 20% 100 120

III Ас-РРНААНАААНААНА 21 % 60 100

IV Ас-АНАКАНАКАНАКАНАКА 20% 120 150

V С-еАИх-УКАКККККККУ/К 24% 52 65

Группа 2. Поликатионные пептиды, содержащие остатки глутаминовой кислоты.

VI Ас-КШЕКЬНЕКЬНЕКЬ 31 % 500 400

VII Ac-KLHEK.LHEKK.HEKL 24% 160 160

VIII Ас-ЕКЕКЕКЕКЕКЕКЕКЕКЕ 27% 160 150

IX АС-1НЕК1НЕК1НЕК1НЕКА 58% 500 750

Группа 3. Поликатионные пептиды, содержащие гидрофобные Сю-радикалы.

X К(С ,„)-НЕКК(С Ю)-НЕКК(С, 0)-НЕКК(С, 0)-НЕКА 75% 56 70

XI СК(С, 0)-еА11х-УКАККККККК\УК 70% 32 47

XII С-£АЬх-МКК(С,о)-ККК(С,О)-КККК(С10)-УКК(С,О)-кк 63% 22 28

Пептид (ЕК)„.

XIII Ас-ЕКЕКЕКЕКЕКЕКЕКЕКА 60% >1000 >1000

Группа 4. Разветвленные пептиды (димерные XIV и XV, тетрамериые XVI и XVII).

XIV (ОККККК0ЯККРР0)2-К-еАЬх-С(Асш) 58% 180 500

XV (01Ю080ККККК<31111КРР(3)2-К-ЕА11х-С(Аст) 22% 100 60

XVI [(СЯКК1и1д11Я11РРО)2-К-ЕАЬх-С12 6% 8 2

XVII [(СКОО8СККККК0ЯКЯРР0)2-К-бА11х-С12 12% 7 0.9

Все аминокислоты даны в однобуквенном коде; Ас - ацетил; Асш - ацетамидометильная группа; еАЬх - остаток 8-аминогексановой кислоты; Сю - остаток каприновой кислоты.

Пептиды с гидрофобными радикалами (рис. 18) и с разветвленной структурой в отсутствие гормона отчетливо стимулировали базальную активность АЦ в тканях крысы и моллюска. Они также стимулировали ГТФ-связывание в-белков. Сурамин (10" М), селективный ингибитор гетеротримерных О-белков, подавлял стимулирующие эффекты

поликатионных пептидов. Это указывает на то, что мишенями их действия являются гетеротримерные в-белки. В присутствии 10^-10"4 М этих пептидов стимулирующие АЦ эффекты активаторов й-белков - ЫаР и GppNHp снижались, но не более чем на 40 %. Разветвленные пептиды достаточно эффективно ннгибировали активность АЦ, стимулированную форсколином, что указывает на их способность взаимодействовать с каталитическим сайтом АЦ. Таким образом, впервые показано, что искусственно созданные поликатионные пептиды по независимому от рецептора механизму влияют на активность компонентов АЦС и ее стимуляцию негормональными активаторами.

га

с 30-1 а/

ГТ = « ^

г 24

I

I!

118

—»—пептид X « пептид XI —А— пептид XII

5 4 3 -1од[пептид], М

Рис. 18. Влияние пептидов с гидрофобными Сю-радикалами на базальную активность АЦ в гладких мышцах моллюска.

Неразветвленные пептиды с гидрофобными радикалами и разветвленные тетрамерные пептиды дозозависимо снижали стимуляцию АЦ и ГТФ-связывания серотонином в мышцах моллюска и изопротеренолом в мышцах крысы, осуществляемую ими через С8-белки. Эффективность ингибирующего влияния пептидов на АЦ эффекты биогенных аминов представлена в виде значений Ю50 (табл. 2). Поликатионные пептиды также снижали ингибирующие АЦ эффекты соматостатина и Ог-агониста бромкриптина в мозге и миокарде крысы и изопротеренола в мышцах моллюска, реализуемые через белки, причем пептид X с гидрофобными радикалами был намного эффективнее пептида XV с разветвленной структурой (рис. 19).

Поскольку ингибирующее влияние поликатионных пептидов осуществляется в отношении широкого спектра гормонов в тканях различных животных, оно не является высоко специфичным и осуществляется на этапе сопряжения активированного гормоном рецептора с в-белком, а не на более поздних, пострсцепторных этапах передачи гормонального сигнала. Об этом свидетельствуют как данные об ингибировании поликатионными пептидами стимулирующего эффекта гормонов на ГТФ-связывание 0-белков, так и снижение в их присутствии аффинности связывания рецепторов с агонистами.

Так аффинность агониста к р-АР в миокарде в присутствии пептида X с гидрофобными радикалами и пептида XVII с разветвленной структурой снижается (рис. 20), что выражается в повышении значений К; для изопротеренола (в контроле 47 нМ) в присутствии пептидов X и XVII до 253 и 78 нМ. В присутствии пептида X сдвиг вправо

кривой вытеснения изопротеренолом [3Н]-,аигкдроШ1Ьпренолола при добавлении ГТФ практически отсутствует (рис. 20), в присутствии пептида XVII он заметно снижается. Сходные результаты получены при исследовании влияния пол и кати о иных пептидов на связывание | И]-диI идроаль пренол о ла в скелетных мышцах крысы.

Рис. 19. Влияние пол и катион пых пептидов на кнгибирование гормонами активности АЦ. стимулированной форсколином.

а - соматоетатин (Ю-7 М), мозг; б - бромкриптин (10"? М), мозг; в - соматоетатин ( Ш"7 М), миокард; г - изолротеренол ( 10° М); мышцы моллюска.

I - без пептида; 2 - пептид X, 105 М; 3 - пептид X, 10"4 М; 4 - пептид XV, 10"! М; 5 -пептид XV. 1M Стимулирующий АЦ эффект форсколипа (10"s M) в отсутствие 1 пептидов принят за 100%,____________

Для выявления типа G-белков, на которые действуют поликатионные пептиды, был применен метод АДФ-рибозилированмя бактериальными токсинами (Reisine. 19901 и пептидная стратегия. В мембранах, рибознлированныч с помощью холерного токсина, стимулирующие АЦ эффекты пептидов X и XV снижались или блокировались полностью. В мембранах, обработанных коклюшным токсином, стимулирующие эффекты пептидов повышались (рис. 21). С-коНЦевой пептид 385-394 Gas дозозависимо ингибировал стимуляцию поликатионкыми пептидами активности АЦ и 1"ТФ-связываиия. в то время как пептид 346-355 Ga,? влиял на эти эффекты в меньшей степени.

Таким образом, установлено, что поликатионные пептиды с гидрофобными радикалами и с разветвленной структурой способны активировать как Gs- (в большей степени), так и 0,-белки. При этом они взаимодействуют с G-концевымн сегментами Ga-субъсдиниц и мимикрируют действие активированного гормоном рецептора.

Рис. 20. Вытеснение |' Н ] -д и г идроал ы i ре полола изопротерсполом из связывающих мест в миокарде крысы в присутствии пептида X с гидрофобными радикалами, А - контроль: Б - в присутствии I0"J М пептида X,

1 - иэопротеренол; 2 - изопротеренол совместно с ГТФ. 10" М. По вертикали -специфическое связывание [ Н]-дигидрйальпренолола, %.

о о

CL

S*

э я

200

160

120

EL а

rt Ю

5 5)

< s

Рис. 21. Влияние АДФ-рибозилирования коклюшным токсином на АЦ эффекты поликатион кых пептидов.

а - мозг крысы. 6 - миокард крысы, в - гладкие мышцы моллюска. I • пептид X, 10 s М; 2 - пептид X, Ш"4 М; 3 - пептид XV, 10'5 М; 4 - пептид XV, 10"4 М. Активность АЦ в рибозилироваиных коклюшным токсиИОм мембранах, которая составляла в мозге и миокарде крысы 80.4±7.4 и 17.4+1.6, й мышцах моллюска 25.8+1.8 пмодь цАМФ/мип на 1 мг мембранного белка, принята за 100 %. *,р< 0.05.

6. Обнаружение АЦС у инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis и изучение ее чувствительности к гормонам млекопитающих.

Заключительный, шестой, этап работы был посвящен исследованию АЦС представителей одноклеточных организмов - инфузорий D. anser и T. pyriformis. Выбор инфузорий был продиктован тем, что они сравнительно легко культивируются, а для Т. pyriformis возможна синхронизация деления клеточной культуры. Это дает возможность проследить инфузорий на различных стадиях клеточного цикла и выяснить, как влияет стадия цикла на функциональную активность АЦС.

В различных культурах инфузорий D. anser базальная активность М^-зависимой АЦ составляла от 1430 до 3914 пмоль цАМФ/мин на 1 мг белка, что существенно выше ее значений в тканях позвоночных. Форсколин и гуаниновые нуклеотиды - ГТФ и GppNHp стимулировали АЦ D. anser, причем их стимулирующий эффект более отчетливо выявлялся в культурах со сравнительно низкой базалыюй активностью фермента, что хорошо согласуются с данными других авторов о том, что величина АЦ эффекта тем ниже, чем выше базальная активность фермента (Pieroni et al., 1995).

Исследование культур T. pyriformis показало, что фактором, определяющим базальную активность АЦ, является стадия развития культуры. В культурах, имеющих 2-5, 20-30 и более 35 % делящихся клеток, базальная активность АЦ составляла 31, 228 и 747 пмоль цАМФ/мин на 1 мг белка, соответственно. Таким образом, у T. pyriformis в экспоненциальной стадии роста базальная активность АЦ значительно выше в сравнении с инфузориями в стационарной фазе, что, как можно полагать, связано с активным участием АЦС в регуляции ростовых и метаболических процессов у инфузорий в экспоненциальной фазе роста.

Функциональная активность АЦ T. pyriformis, стимулировалась катионами Mn2f, форсколином, гуаниновыми нуклеотидами и фторидом натрия. Стимулирующие АЦ эффекты фторида натрия, наиболее мощного активатора G-белков у позвоночных (Chabre, 1990), как и эффекты других активаторов АЦ, были отчетливо выражены в культурах инфузорий со сравнительно низкой базальной активностью АЦ, а в культурах с высокой базалыюй активностью снижались или полностью отсутствовали (рис. 22).

Биогенные амины - адреналин, изопротеренол и серотонин стимулировали АЦ у D. anser (табл. 3). Наиболее эффективным среди них был серотонин - его эффект был сопоставим с таковым у позвоночных.

В культурах T. pyriformis серотонин стимулировал АЦ, адреналин ингибировал активность фермента, причем в культурах с более высокими значениями базальной активности АЦ стимулирующий эффект серотонина снижался и даже переходил в ингибирующий, а ингибирующий эффект адреналина, наоборот, усиливался (рис. 23). Изопротеренол стимулировал АЦ только в культуре с низкой базальной активностью.

В пользу участия в этих эффектах гетеротримерных G-белков свидетельствует то, что биогенные амины также стимулировали ГТФ-связывание, а стимуляция ими ГТФ-связывания блокировалась в присутствии сурамина, ингибитора гетеротримерных G-белков.

1

Таблица 3. Влияние биогенных аминов на активность АЦ инфузории £>, агкек

Концентрация гормона, М Активность АЦ, нмольцАМФ/мин на 1 мг белка,

адреналин изопротеренол Серотонин

Без гормона 1795+105 (100%) 22301120(100%) 1680190(100%)

10в 23901165 (133 %) 22501110(101 %) 15501160(92%)

10'' 2570±120(143 %) 2560+125 (115 %) 32301305 (192%)

10* 2590+205(144 %) 2900±!05(130 %) 36501220 (217 %)

105 2780±135(155 %) 25001150(112%) 24401100(145%)

1600-^ 1400ГГ 12001000£ 8оо-2 600" 400 Е 200 < 0 - X X пп а ПОПпппп .

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 121314 Культуры инфузорий

Рис. 22. Влияние фторида натрия (10"" М) на активность АЦ Т. руг$огта в культурах с различной базальной активностью фермента. Цифры по горизонтали - базальная активность АЦ Т. руп/ог>п!$ (нмоль цАМФ/мнн на 1 мг белка): 1 - 2.8: 2 - 3.!; 3 »18.0; 4 - 23.2; 5 - 26.5; 6 - 42.1; 7 - 43.0: 8 - 56.2; 9 -62,7; 10 - 142; 11 - 347; 12 - 1259; 13 - 1470; 14 - 1644. По вертикалиЩактивность АЦ, % (базаяъная активность АЦ в каждом случае принята за 100%).

300-

■4Ç

2S0-

if

< 200

H

150

m s 100-

S

< 50

0-

Рис. 23. Влияние серотонина (А), адреналина (Б) и изолротеренола (В) {10" М) на активность АЦ Т. ругМотиз.

Цифры по горизонтали - базальная активность ЛЦ (пмоль цАМФ/мин на I мг белка): /-2.8:2- 18.0; 3 -23.2; 4 - 225; 5 — 439; 6 - 1259. По вертикали - активность АЦ, % (базальная активность АЦ в каждом случае принята за 100 %).

Обнаружение чувствительности АЦС инфузорий к лигандам АР стало отправной точкой для изучения рецепторов, связывающих эти лиганды. Показано, что антагонист р-АР [3Н]-дигидроальпренолол специфически связывается с мембранами обеих инфузорий со значениями Kd (для D. anser - 13 нМ, для Т. pyriformis - 27 нМ), которые на о дин-два порядка ниже в сравнении с таковыми для р-АР высших эукариот (рис. 24). Лиганды р-АР по конкурентному механизму вытесняли ('Н]-ди ги дроал ьпренолол (порядок эффективности пропранолол > изопрогерспол > атенолол) как в культуре D. anser (рис, 25), так и Т. pyriformis. В присутствии ГТФ кривая конкурентного вытеснения [ Н]-дигидроальпренолола иэопротеренолом смещалась вправо. Следовательно, в клетках инфузорий имеются сопряженные с G-белкамм рецепторы, способные специфично связываться с атомистами и антагонистами р-АР и но этому показателю сходные с Р-АР высших эукариот.

У D. anser стимулирующий АЦ эффект адреналина и изопротерснола снимался б локаторам и Р-АР пропранололом и атснололом (табл. 4), но был не чувствителен к блокаторам сг,;-Л Р. У Т. pyriformis ингибирующий эффект адреналина, наоборот, снимался антагонистами ал-АР йохимбиноч и идазоксаном, но был не чувствителен к блокаторам Р-АР (табл. 4),

Эти данные указывают на участие рецептора, сходного с р-АР позвоночных, в передаче стимулирующего АЦ сигнала адреналина и изо п реп ер с но ла в клетках D. anser, и на участие рецептора, близкого по ряду свойств ал-АР позвоночных, в передаче ингибирующего АЦ сигнала адреналина в клетках Т. pyriformis.

Рис. 24. Связывание [ Н]-дигидроальпренолола с мембранами инфузорий. А - кривые насыщения; по оси абсцисс - концентрация [3Н]-дигидроальпренолола, нМ; по оси ординат - количество специфически связанного [3Н]-дигидроальпренолола, фмоль на 1 мг мембранного белка. Б, В - графики Скэтчарда; по оси абсцисс - количество специфически связанного [3Н]-дигидроальпренолола, фмоль на 1 мг мембранного белка; по оси ординат - отношение связанного меченого лиганда к свободному [3Н]-дигидроальпренололу (в случае й. апзег - х 10"3; Т. руг^/огтк-х 10"4)._

Рис. 25. Вытеснение лигандами АР меченого [311]-дигидроальпренолола из связывающих мест в мембранной фракции й. атег.

1 - пропранолол; 2 -изопротеренол; 3 - атенолол; 4 -изопротеренол + ГТФ, 10 5 М.

Таблица 4. Действие антагонистов АР на базальную и стимулированную адреналином и изопротеренолом активность АЦ инфузорий (пмоль цАМФ/мин на 1 мг белка).

Антагонист, 10"6М В отсутствие гормонов Адреналин, 10"6М Изопротеренол, ю-®м

Dileptus anser

Без антагониста 1345±95 2140±120 (+59) 1900+105 (+41)

Пропранолол 1005+80 (-25) 1180+125[+17] 1125+100 [+121

Атенолол 1155±85 (-14) 1575+130 [+36] 1465±125[+271

Иохимбин 1400+110(+4) 2370+135 [+691 2065±110 [+48]

Идазоксан 1395±95(+4) 2295+90[+65] 1955+125 [+401

Telrahvmena piriformis

Без антагониста 17.410.8 12.3+1.2 (-29) 19.8±1.4 (+14)

Пропранолол 16.8+0.9 (-3) 11.9+0.7 [-291 16.3+0.9 [-3]

Атенолол 15.8+1.1 (-9) 11.6+1.2 [-271 17.1 ±0.8 [+81

Йохимбин 23.9±1.4 (+37) 25.0+1.0 [+51 28.611.2 [+201

Идазоксан 19.0±0.6 (+13) 21.9+1.2 [+151 24.0+1.7 [+261

В круглых скобках приведена величина стимулирующего или ингибирующего АЦ эффекта лигандов АР (в %) по отношению к базальной активности АЦ. В квадратных скобках приведена величина АЦ эффекта адреналина и изопротеренола (в %) по отношению к активности АЦ, подвергнутой воздействию антагонистов.

Далее была изучена чувствительность ЛЦС инфузорий к пептидным гормонам млекопитающих - релаксину и глюкагону, рецепторы которых в тканях позвоночных сопряжены с АЦ в основном через Сабелек. Релаксин дозозависимо стимулировал активность АЦ и ГТФ-связывание у О. атег и Т. руп/огтЬ (рис. 26). Сурамин, ингибитор гетеротримерных в-белков, блокировал стимулирующие эффекты релаксина, что указывает на участие в них гетеротримерных С-белков.

Глюкагон в концентрациях 109—10-7 М отчетливо стимулировал АЦ в культурах Д атег и Т. руп/огтЬ. Величина АЦ эффекта глюкагона определялась уровнем базальной активности АЦ Т. руг'^огтЫ - в культурах с высокой базальной активностью фермента чувствительность АЦС к глюкагону была снижена (рис. 27). В культурах со сравнительно низкой базальной активностью АЦ эффект глюкагона усиливался в присутствии йрр'ЫНр, негидролизуемого аналога ГТФ, что свидетельствует о кооперативности стимуляции АЦ гормоном и гуаниновыми нуклеотидами и указывает на функциональное сопряжение активированного глюкагоном рецептора с 05-белком у инфузорий Т. руг'фгт\$.

Таким образом, у инфузорий А атег и Т. руп/огт!5 впервые выявлена и охарактеризована АЦС, чувствительная к биогенным аминам и пептидным гормонам млекопитающих, которая включает гетеротримерные С-белки и сходна по ряду свойств с гормоночувствительной АЦС позвоночных.

-20

10

9 8 7 -!од[релаксин], М

9 8 7 -1од[релаксин], М

Рис. 26. Стимуляция релаксином активности АЦ (А) и ГТФ-связывания О-белков (Б) в культурах инфузорий.

1 - Р. атег, 2-Т. ругп/огтгэ._

400 350 5 300 < 250 Ез 200 | 150 | 100 3 50 X А. А лц г J. - X, Рис. 27. Влияние глюкагона (10'" М) на активность АЦ в культурах Т. pyrifomüs с различной базалыгой активностью фермента. Цифры по горизонтали - базальная активность АЦ (пмоль цАМФ/мин па 1 мг белка): 1 -3.1; 2- 14.1; 3 - 18.0; 4 - 26.5; 5 - 42.1; 6 - 43.0; 7 - 46.3; 8 -62.7; 9 - 66.6; 10 - 142; 11 - 225; 12 -439; 13 - 1259. По вертикали - активность АЦ, % (базальная активность в каждом случае - 100 %}.

" 12345 6 78910111213 Культуры инфузорий

Нами впервые была выявлена активность эффектор но го звена ЛЦС - фермента протеинкиназы А в клеточных культурах инфузорий О. апзег и Т руп/огпщ, которая в отсутствие цДМФ составляла 446 и 112, в присутствии цАМФ - 685 и 254 пмоль включенного [згР]-фосфата за 1 мин на 1 мг белка (отношение активностей протеинкиназы А в отсутствие цЛМФ к таковой в присутствии цАМФ у О. аюег и Т. руг\}отЬ составило 0.65 и 0.44), У О. апхег фермент стимулировался биогенными аминами (серотоиином и изопротеренолом) и г люка го ном. причем стимулирующее п роте инки пазу А действие глюкагона было более выраженным, У Т. руп[огт'т активность протеинкиназы А отчетливо стимулировалась только глюкагоном. Действие гормонов на активность нротеинкиназы А и АЦ было однонаправленным, что указывает на функциональную связь между этими ферментами у инфузорий, как это происходит и у высших эукариот,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате комплекса проведенных исследований получены принципиально новые данные и расширены современные представления, касающиеся функционирования гормоночувствитсльной ЛЦС в клетках животных различного филогенетического уровня и молекулярных механизмов функционального взаимодействия рецепторов с гетеротр«мерными О-белкамй, как ключевого этапа передачи гормонального сигнала, осуществляемого через АЦС,

С помощью сравнительного теоретического анализа в структуре рецепторов серпантинного типа выявлены молекулярные детерминанты, которые представляют собой проксимальные к мембране участки цито плазматических петель, в первую очередь третьей цито плазматической петли, и ответственны за взаимодействие активированного гормоном рецептора с С-концевым сегментом а-субъединицы О-белка. Характерными особенностями этих участков является наличие в их езруктуре кластеров положительно заряженных аминокислот и способность к образованию амфипатическич а-спиралей. Полученные данные могут быть использованы для направленного поиска в молекулах

рецепторов и G-белков участков, функционально важных для передачи гормонального сигнала через АЦС, что и было продемонстрировано в наших экспериментах по изучению АЦС, чувствительной к биогенным аминам и пептидным гормонам.

Для исследования молекулярных механизмов функционального сопряжения компонентов АЦС нами была разработана и применена пептидная стратегия, представляющая собой интенсивно развивающуюся в последние годы область нанобиотехнологии. Эта стратегия заключалась в синтезе пептидов, которые по своей первичной структуре соответствуют участкам рецепторов и G-белков, вовлеченным во взаимодействие между ними. С этой целью впервые были синтезированы пептиды, которые соответствуют по первичной структуре выявленным с помощью теоретического анализа участкам сигнальных белков - С-ЦПЗ рецептора релаксина LGR7 и С-концевым сегментам а-субъединиц Gs- и Gi-белков. Показано, что синтетические пептиды действуют на функциональную активность АЦС с высокой селективностью. Это выражается в том, что они эффективны только в отношении тех сигнальных путей, которые осуществляются с участием сигнальных белков, производными которых эти пептиды являются. Обнаружено, что пептиды, производные третьей цитоплазматической петли релаксинового рецептора LGR7, способны активировать пострецепторные звенья АЦС по независимому от рецептора механизму вследствие их прямого взаимодействия с Gs-белком. Применение таких пептидов открывает новые перспективы для поиска и разработки негормональных регуляторов сигнальных систем, которые действуют независимо от рецептора и с высокой селективностью активируют пострецепторные звенья сопряженных с G-белками сигнальных каскадов.

С помощью пептидной стратегии и широкого набора функциональных тестов впервые установлены два различных АЦ сигнальных механизма действия релаксина, которые являются ткане- и видоспецифичными. Первый из них, трехкомпонентный, включает рецептор серпантинного типа LGR7, Gs-белок и фермент АЦ, в то время как второй, шестикомпонентный, включает более сложную цепь сигнальных белков: рецептор тирозинкиназного типа => G,-белок (Gßy) => фосфатидилинозитол-3-кипазу => протеинкиназу СС, => Gj-белок => АЦ. Трехкомпонентный АЦ сигнальный механизм функционирует в сердце и мозге крыс, шестикомпонентный - в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах моллюска А. cygnea. Полученные данные свидетельствуют в пользу множественности АЦ сигнальных путей действия релаксина, что важно при разработке новых подходов для его практического применения в медицине.

Иллюстрацией успешного применения пептидной стратегии стало использование С-концевых Gas- и Gaj-пептидов для установления типа G-белков, участвующих в передаче сигнала, генерируемого биогенными аминами, в нервной и мышечной тканях моллюска А. cygnea. Показано, что стимулирующие АЦ эффекты октопамина и дофамина в ганглиях моллюска Л. cygnea реализуются через рецепторы, функционально сопряженные с Gs-белком, в то время как серотонин в ганглиях одновременно активирует как Gs-, так и Gj-белки. В мышцах моллюска эффекты этих гормонов осуществляются через сопряженные с Gs-белками рецепторы. Совокупность собственных экспериментальных данных и сведений литературы позволила сделать вывод о том, что впервые выявленная в ганглиях моллюска А. cygnea АЦС сходна по ряду своих показателей с АЦС высших позвоночных.

В ходе исследования состояния АЦС при стрептозотоциновом диабете как 1-го, так и 2-го типов у крыс выявлено значительное ослабление чувствительности АЦС в

скелетных мышцах и миокарде диабетических животных к действию биогенных аминов (катехоламинов, серотонину), которые в наибольшей степени проявляются в случае АЦС, сопряженной с Gi-белками. Одной из причин нарушений функционирования АЦС при диабете может быть ослабление функционального сопряжения рецепторов и АЦ с G,- и, в меньшей степени, Gs-белками. Выявлена тканевая специфичность изменений в активности Gs-сопряженной АЦС при стрептозотоциновом диабете 2-го типа, заключающаяся в снижении ее чувствительности к гормонам в миокарде диабетических крыс при отсутствии заметных изменений в мозге. Полученные при исследовании стрептозотоцинового диабета данные о снижении функциональной активности АЦС и ослаблении функционального взаимодействия проксимальных звеньев этой системы -рецептора и G-белка в мышечных тканях подтверждают основные положения высказанной нами ранее концепции молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринной патологии (Перцева, Шпаков, 2004), которая устанавливает причинно-следственные связи между нарушениями, возникающими в гормональных сигнальных системах, и развитием эндокринных и гормон-зависимых заболеваний.

Выявление структурных особенностей взаимодействующих с G-белками участков рецепторов, таких как наличие поликатионных мотивов и способность к образованию спиралей, стало отправной точкой для создания серии синтетических пептидов, представляющих собой поликатионные амфипатические спирали и мимикрирующих, таким образом, функционально важные для взаимодействия с G-белками участки рецепторов. Показано, что впервые синтезированные нами поликатионные пептиды обладают способностью регулировать компоненты АЦС в клетках позвоночных и беспозвоночных, причем их действие направлено в основном на гетеротримерные Gs- и G,-белки и их функциональное сопряжение с рецептором. Создание искусственных негормональных регуляторов АЦС на основе поликатионных пептидов линейной и разветвленной структуры не только открывает новое направление для изучения фундаментальных основ взаимодействия между сигнальными белками, но и в будущем позволит разработать функциональные зонды, способные селективно по независимому от рецептора механизму регулировать и модулировать активность гормональных сигнальных систем, сопряженных с G-бслками.

В результате проведенного исследования с использованием эволюционного подхода и широкого набора биохимических методов нами была впервые выявлена и охарактеризована АЦС в клеточных культурах двух видов одноклеточных эукариот -свободноживущих инфузорий D. anser и T. pyriformis. Показано, что АЦ инфузорий, как и АЦ высших эукариот, чувствительна к действию как негормональных агентов, так и гормонов высших позвоночных - глюкагона и биогенных аминов, действующих через рецепторы серпантинного типа, а также релаксина, способного действовать на АЦ как через рецепторы серпантинного, так и тирозинкиназного типа. Величина эффекта негормональных и гормональных агентов в значительной степени определяется уровнем базальной активности АЦ в культуре инфузорий - чем она выше, тем слабее выражен эффект. Специфичность действия биогенных аминов на АЦ инфузорий доказывается блокированием их АЦ эффектов антагонистами адренергических и серотониновых рецепторов. С помощью фармакологических подходов у инфузорий выявлены АР, которые специфично связываются с лигандами Р-АР. Обнаружено также, что биогенные амины стимулируют ГТФ-связывание гетеротримерных G-белков. В клетках инфузорий нами впервые обнаружена активность протеинкиназы А и исследована ее регуляция

гормонами. Действие гормонов на протеинкиназу А и АЦ является однонаправленным, что указывает на функциональную связь между ними, как это наблюдается в клетках высших эукариот. Совокупность полученных данных указывают на присутствие в культурах инфузорий функционально активной гормоночувствительной АЦС, включающей AP-подобные рецепторы, гетеротримерные G-белки и фермент АЦ, который через изменение внутриклеточного уровня цАМФ регулирует активность протеинкиназы А, эффекторного звена АЦ-цАМФ-системы.

Таким образом, данные, полученные нами в ходе экспериментального исследования АЦС инфузорий, а также результаты проведенного нами сравнительного теоретического анализа первичных структур сигнальных белков, потенциальных компонентов АЦС низших эукариот, позволяют более полно представить картину эволюции гормоночувствительных АЦС эукариот и доказывают, что сложный ансамбль универсальных молекулярных детерминант, ответственных за функциональное взаимодействие между сигнальными белками, компонентами АЦС, сложился на самых ранних этапах эволюции и, в общих чертах, сохранился до уровня высших позвоночных. ] 1ри этом ключевой этап передачи гормонального сигнала через АЦС - функциональное взаимодействие активированного лигапдом рецептора с гетеротримерным G-белком у животных различного филогенетического уровня не претерпел значительных изменений. Именно на этом этапе определяются: (1) направленность (векторность) сигнального импульса, в основе которой лежит селективное взаимодействие рецептора с определенным типом G-белка, через который осуществляется регуляция конкретной эффекторной системы клетки; (2) интенсивность сигнального импульса, которая повышается на уровне сопряжения G-белка с рецептором в десятки и сотни раз. На этапе функционального сопряжения рецептора с G-белком возможна регуляция активности сигнальной системы по независимому от рецептора механизму, причем в качестве таких иегормональных регуляторов могут выступать как вещества природного происхождения (пептидные токсины), так и искусственно созданные пептиды, мимикрирующие участки молекул рецепторов и G-белков, функционально важные для их взаимодействия. Различные классы таких пептидов были нами синтезированы и успешно применены для регуляции функциональной активности АЦС в тканях различных видов животных.

ВЫВОДЫ.

1. Основные молекулярные детерминанты рецепторов серпантинного типа, ответственные за взаимодействие с G-белками, локализованы в проксимальных к мембране участках их цитоплазматических петель и характеризуются наличием кластеров положительно заряженных аминокислот и способностью формировать спиральные структуры.

2. Синтетические пептиды, соответствующие молекулярным детерминантам в а-субъединицах G-белков и рецепторах, которые ответственны за их функциональное сопряжение, способны с высокой эффективностью и селективностью по конкурентному механизму прерывать проведение гормонального сигнала, осуществляемого через те сигнальные белки, производными которых они являются.

3. Молекулярные механизмы стимулирующего АЦ действия релаксина являются ткане- и видоспецифичными. В сердце и мозге крысы релаксин осуществляет свое действие через трехкомпонентную АЦС, включающую рецептор LGR7 серпантинного типа, Gs-белок и АЦ, в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах моллюска А. cygnea — через

шестикомпонентный АЦ сигнальный механизм, включающий рецептор тирозинкиназного типа, Ру-димср Gj-белка, фосфатидилинозитол-3-киназу, протеинкиназу Gj-белок и АЦ.

4. В условиях стрептозотоцинового диабета 1-го и 2-го типов у крыс наблюдается ослабление функционального сопряжения активированного гормоном рецептора с G-белком и АЦ. В большей степени нарушаются функции Gj-белков, что приводит к подавлению ингибирующего влияния биогенных аминов и соматостатина на АЦ.

5. Синтетические поликатионные пептиды, мимикрирующие взаимодействующие с G-белками участки рецепторов, активируют G-белки и негативно влияют на проведение гормонального сигнала через АЦС. Эффективность и молекулярные механизмы действия этих пептидов на АЦС определяются распределением положительно заряженных аминокислот в спирали, наличием гидрофобных радикалов и степенью разветвленности.

6. В клеточных культурах инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis обнаружена и охарактеризована чувствительная к гормонам млекопитающих АЦС, сопряженная с гетеротримерными G-белками и сходная по ряду признаков с гормоночувствительной АЦС позвоночных, что свидетельствует о высокой консервативности АЦС у представителей низших и высших эукариот и ее раннем формировании в эволюции.

Основные публикации по теме диссертации.

1. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Хемосигнальные системы одноклеточных эукариот и бактерий как предшественники гормонокомпетентных систем высших животных // Журн. эвол. биохим. физиол. 1993. Т. 29. С. 454-474.

2. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Структурно-функциональная характеристика ГТФ-связывающих белков беспозвоночных животных // Журн. эвол. биохим. физиол. 1993. Т. 29. С. 635-653.

3. Pertseva M.N., Shpakov А.О. On the prokaryotic genesis of hormonal signalling systems of eukaryotes // In "Evolutionary Biochemistry and Related Areas of Physicochemical Biology", Eds. by B.Poglazov et a!., Bach Inst, of Biochemistry and ANK.O, Moscow. 1995. P. 509-519.

4. Shpakov A.O. Molecular basis of the functional coupling of receptors to GTP-binding proteins // Membr. Cell Biol. 1996. V. 9. P. 467-488.

5. Шпаков А.О. Гомология первичной структуры трегьих цитонлазматических доменов рецепторов родопсинового типа и цитоплазматичсского хвоста (3-субъединицы инсулинового рецептора // Цитология. 1996. Т. 38. С. 1179-1190.

6. Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты рецепторов и ГТФ-связывающих белков, определяющие специфичность взаимодействий между ними // Журн. эвол. биохим. физиол. 1996. Т. 32. С. 488-511.

7. Шпаков А.О. Структурные элементы молекул ГТФ-связывающих белков и эффекторов, опосредующие сопряжение между ними // Укр. биохим. журнал. 1997. Т. 69. С. 3-20.

8. Шпаков Л.О., Перцева М.Н. Молекулярные основы функционального сопряжения белков - компонентов инсулиновой сигнальной системы // Усп. биол. химии. 1999. Т. 39. С. 141-186.

9. Шпаков А.О., Корольков В.И., Власова E.H., Афонина М.П., Власов Г.П. Влияние синтетических катионных пептидов на активацию аденилатциклазной сигнальной системы биогенными аминами в мышечных тканях моллюсков и крыс // Цитология. 2001. Т. 43. С. 483-490.

10. Деркач К.В., Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Успенская З.И., Перцева М.Н. Гормоночувствительная аденилатциклазная система инфузории Dileptus anser il Цитология. 2002. T. 44. С. 1129-1134.

11. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Консервативность инсулиновой сигнальной системы в эволюции беспозвоночных и позвоночных животных // Жури. эвол. биохим. физиол. 2002. Т. 38. С. 430-441.

12. Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты в рецепторах серпантинного типа, ответственные за их функциональное сопряжение с гетеротримерными G-белками // Цитология. 2002. Т. 44. С. 242-258.

13. Шпаков А.О. Роль ßy-димеров ГТФ-связывающих белков в процессах передачи гормонального сигнала // Журн. эвол. биохим. физиол. 2002. Т. 38. С. 512-529.

14. Pertseva M.N., Shpakov А.О., Plesneva S.A., Kuznetsova L.A. A novel view on the mechanisms of action of insulin and other insulin superfamily peptides: involvement of adenylyl cyclase signaling system H Comp. Biochem. Physiol. 2003. V. 134. P. 11-36.

15. Деркач K.B., Шпаков A.O., Кузнецова Jl.А., Ирлина И.С., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Регуляция аденилатциклазной системы инфузории Tetrahymena pyriformis гормональными и нсгормональными агентами и ее зависимость от уровня базальной активности аденилатциклазы // Журн. эвол. биохим. физиол. 2003. Т. 39. С. 332-338.

16. Шпаков А.О. Участие заряженных аминокислотных остатков цитоплазматических петель рецепторов серпантинного типа в процессе передачи гормонального сигнала // Журн. эвол. биохим. физиол. 2003. Т. 38. С. 205-217.

17. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Власова E.H., Корольков В.И., Кузнецова JI.A., Плеснева С.А., Власов Г.П., Перцева М.Н. Ингибирование синтетическими катионными пептидами стимулирующего влияния гормонов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы // Докл. РАН. 2003. Т. 389. С. 127-130.

18. Шпаков А.О., Деркач К.В., Перцева М.Н. Гормональные системы низших эукариот// Цитология. 2003. Т. 45. С. 223-234.

19. Шпаков А.О., Деркач К.В., Успенская З.И., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Регуляция биогенными аминами и пептидными гормонами активности аденилатциклазы и протеинкиназы А у инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis II Rom. PAH. 2003. T. 378. C. 275-277.

20. Шпаков A.O., Гурьянов И.А., Авдеева E.B., Воробьев В.И., Власов Г.П. Молекулярные механизмы действия звездообразных поликатионных пептидов, содержащих последовательность 48-60 ТАТ-белка ВИЧ-1, на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы // Цитология. 2004. Т. 46. С. 1011-1022.

21. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Воробьев В.И., Авдеева Е.В., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Чубей Н.М., Перцева М.Н., Власов Г.П. Разобщающее действие катионных пептидов, содержащих гидрофобные радикалы, на функциональное сопряжение рецепторов серпантинного типа с ГТФ-связывающими белками // Цитология. 2004. Т. 46. С. 268-276.

22. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Корольков В.И., Перцева М.Н., Власов Г.П. Использование С-копцевых пептидов а-субъединиц G-белков для исследования их функционального сопряжения с рецепторами биогенных аминов в тканях крыс и моллюсков // Биол. мембраны. 2004. Т. 21. С. 441-450.

23. Шпаков А.О., Деркач К.В., Успенская З.И., Шпакова Е.А., Кузнецова JI.A., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы действия лигандов адренергических рецепторов высших эукариот на функциональную активность компонентов аденилатциклазной сигнальной системы инфузорий Dileptus anser и Tetrahymenapyriformis // Цитология. 2004. Т. 46. С. 317-325.

24. Шпаков А.О., Кузнецова J1.A., Плеснева С.А., Перцева M.II. О вовлеченности фосфатидилинозитол-3-киназы и протеинкиназы СС, в аденилатциклазный сигнальный механизм действия релаксина в мышечных тканях крыс и моллюсков // Бюл. экспер. биол. мед. 2004. Т. 138. С. 420-423.

25. Шпаков А.О., Шипилов В.Н., Бондарева В.М., Кузнецова J1.A., Плеснева С.А., Русаков Ю.И., Перцева М.Н. Регуляторное действие родственных инсулину нейропептидов моллюска Anodonia cygnea на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы // Нейрохимия. 2004. Т. 21. С. 250-259.

26. Шпаков А.О., Шипилов В.Н., Кузнецова Л.А., Бондарева В.М., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Реактивность аденилатциклазной сигнальной системы нервных ганглиев моллюска Anodonta cygnea к серотонину и адренергическим агонистам // Нейрохимия. 2004. Т. 21. С. 190-197.

27. Shipilov V.N., Shpakov А.О., Rusakov Yu.l. Pleiotropic action of insulin-like peptides ofmollusk Anodonta cygnea II Ann.N.Y. Acad. Sci. 2005. V. 1040. P. 464-465.

28. Shpakov A.O, Korol'kov V.I., Plesneva S.A., Kuznetsova L.A., Pcrtseva M.N. Effects of the C-terminal peptide of the as subunit of the G protein on the regulation of adenylyl cyclase and protein kinase A activities by biogenic amines and glucagon in mollusk and rat muscles //Neurosci. Behav. Physiol. 2005. V. 35. P. 177-186.

29. Shpakov A.O, Pertseva M.N, Kuznetsova L.A, Plesneva S.A. A novel, adenylate cyclase, signaling mechanism of relaxin H2 action // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005. V. 1041. P. 305-307.

30. Shpakov A.O., Shipilov V.N., Bondareva V.M. Sensitivity of adenylyl cyclase signaling system of the mollusk A. cygnea ganglions to serotonin and adrenergic agonists // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005. V. 1040. P. 466-468.

31. Шпаков A.O., Гурьянов И.А., Власов Г.П. Молекулярные механизмы взаимодействия поликатионных пептидов с G-белками // Докл. РАН. 2005. Т. 405. С. 270-273.

32. Шпаков А.О., Кузнецова JI.A., Плеснева С.А., Гурьянов И.А., Перцева М.Н. Молекулярные причины изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы сердечной мышцы к биогенным аминам при экспериментальном стрептозотоциновом диабете // Цитология. 2005. Т. 47. С. 540-548.

33. Шпаков А.О., Кузнецова JI.A., Шипилов В.Н., Плеснева С.А., Бондарева В.М., Перцева М.Н. Функциональная характеристика регулируемой октопамином аденилатциклазной сигнальной системы в нервной ткани моллюска Anodonta cygnea //Нейрохимия. 2005.Т. 22. С. 102-109.

34. Шпаков А.О., Перцева М.Н., Гурьянов И.А., Власов Г.П. Влияние пептидов, производных третьей цитоплазматической петли релаксинового рецептора 1 типа, на

стимуляцию релаксином GTP-связывающей активности G-белков // Биол. мембраны.

2005. Т. 22. С. 435-442.

35. Шпаков А.О., Шипилов В.Н., Гурьянов И.А., Кузнецова Л.А., Бондарева В.М., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы регуляторного действия биогенных аминов на функциональную активность адснилатциклазной сигнальной системы в нервных ганглиях моллюска Anodonta cygnea II Докл. РАН. 2005. Т. 401. С. 829-832.

36. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Использование пептидной стратегии для изучения молекулярных механизмов передачи гормонального сигнала в клетку // Журн. эвол. биохим. физиол. 2005. Т. 41. С. 389-403.

37. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы к биогенным аминам при стрептозотоциновом диабете // Бюл. экспер. биол. мед. 2005. Т. 140. С. 286-290.

38. Pertseva М., Shpakov A., Kuznetsova L., Píesneva S., Omeljaniuk E. Adenylyl cyclase signaling mechanisms of relaxin and insulin action: similarities and differences // Cell Biol. Int. 2006. V. 30. P. 533-540.

39. Шпаков A.O., Гурьянов И.А., Кузнецова Jl.A., Плеснева С.А., Шпакова Е.А., Власов Г.П., Перцева М.Н. Регуляция функциональной активности чувствительной к релаксину аденилатциклазы пептидами, производными релаксинового рецептора LGR7 // Докл. РАН. 2006. Т. 407. С. 835-838.

40. Шпаков А.О. Структурно-функциональная организация сопряженных с G-белками сигнальных систем амебы Dictyostelium discoideum II Журн. эвол. биохим. физиол. 2006. Т. 42. С. 426-444.

41. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Власов Г.П., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы взаимодействия поликатионных пептидов с рецепторами серпантинного типа и гстеротримерными G-белками в тканях крыс // Журн. эвол. биохим. физиол.

2006. Т. 42. С. 321-327.

42. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Шпакова Е.А., Власов Г.Г1., Перцева М.Н. Исследование молекулярных механизмов действия релаксина на аденилатциклазную сигнальную систему с применением синтетических пептидов, производных релаксинового рецептора LGR7 // Рос. физиол. журн. 2006. Т. 92. С. 521-535.

43. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Бондарева В.М., Гурьянов И.А., Власов Г.П., Перцева М.Н. Снижение функциональной активности G-белков, компонентов гормоночувствителыюй аденилатциклазной сигнальной системы, при экспериментальном диабете 2-го типа // Бюл. экспер. биол. мед. 2006. Т. 142. С. 641645.

44. Shpakov А.О., Kuznetsova L.A., Plesneva S.A., Kolychev A.P., Bondareva V.M., Chistyakova O.V., Pertseva M.N. Functional defects in adenylyl cyclase signaling mechanisms of insulin and relaxin action in rat skeletal muscles in condition of streptozotocin type 1 diabetes // Central Eur. J. Biol. 2006. V. 1. P. 530-544.

45. Шпаков А.О. Рецепторы серпантинного типа и гетеротримерные G-белки дрожжевых грибов: структурно-функциональная организация и молекулярные механизмы действия // Журн. эвол. биохим. физиол. 2007. Т. 43. С. 3-23.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Шпаков, Александр Олегович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

Гормональные сигнальные системы, их эволюция

Аденилатциклазная сигнальная система

Рецепторы, функционально сопряженные с G-белками

Гетеротримерные ГТФ-связывающие белки

Аденилатциклаза цАМФ-зависимая протеинкиназа

ГЛАВА 1. Молекулярные детерминанты, ответственные за функциональное взаимодействие между рецепторами и гетеротримерными G-белками

1.1. Теоретический анализ первичной структуры рецепторов серпантинного типа для выявления в них молекулярных детерминант, взаимодействующих с G-белками

1.1.1. Участие первой цитоплазматической петли рецепторов в связывании G-белков

1.1.2. Участие второй цитоплазматической петли рецепторов в сопряжении с G-белками

1.1.3. Ключевая роль третьей цитоплазматической петли рецепторов в функциональном взаимодействии с G-белками

1.1.4. Участие С-концевого домена рецепторов в сопряжении с G-белками

1.2. Молекулярные детерминанты в молекулах а-субъединиц G-белков, определяющие их взаимодействие с рецепторами

ГЛАВА 2. Применение пептидов, производных первичной структуры сигнальных белков, для изучения молекулярных механизмов передачи гормонального сигнала в клетку 53 2.1. Обзор литературы

2.1.1. Пептиды, производные рецепторов серпантинного типа

2.1.2. Пептиды, производные а-субъединиц G-белков

2.1.3. Перспективы использования пептидной стратегии

2.2. Результаты экспериментальных исследований

2.2.1. Исследование молекулярных механизмов действия биогенных аминов на активность АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных с применением С-концевых пептидов а-субъединиц Gs- и Gj-белков

2.2.2. Исследование регуляции биогенными аминами активности АЦС в тканях моллюска Anodonta cygnea и применение С-концевых пептидов для идентификации типа G-белков, участвующих в этом процессе

2.3. Обсуждение результатов исследования

2.3.1. Разработка принципов применения С-концевых пептидов Ga-субъединиц для изучения сопряжения рецепторов с различными типами G-белков

2.3.2. Применение С-концевых пептидов для идентификации типа G-белков, участвующих в регуляторном действии биогенных аминов на АЦС в нервной и мышечной тканях моллюска

ГЛАВА 3. Молекулярные механизмы действия релаксина и инсулиноподобных пептидов моллюска на аденилатциклазу и участие в этом процессе гетеротримериых G-белков

3.1. Обзор литературы и теоретические исследования S

3.1.1. Множественность молекулярных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства на клетку и участие в них гетеротримериых G-белков

3.1.2. Структурно-функциональная организация релаксиновой сигнальной системы

3.1.3. Структурно-функциональная характеристика и молекулярные механизмы действия инсулиноподобных пептидов моллюсков

3.2. Результаты экспериментальных исследований

3.2.1. Исследование молекулярных механизмов передачи релаксинового сигнала через трехкомпонентную АЦС

3.2.2. Исследование шестикомпонентного аденилатциклазного сигнального механизма действия релаксина

3.2.3. Молекулярные механизмы регуляторного влияния ИПП моллюска

A. cygnea на активность АЦС в тканях моллюска и крысы

3.3. Обсуждение результатов исследования

3.3.1. Регулируемая релаксином трехкомпонентная АЦС, включающая рецептор серпантинного типа LGR

3.3.2. Шестикомпопентный аденилатциклазный сигнальный механизм действия релаксина

3.3.3. Молекулярные механизмы регуляторного действия ИПП моллюска на АЦС

ГЛАВА 4. Нарушения функционального сопряжения рецепторов с G-белками при экспериментальном диабете

4.1. Обзор литературы

4.2. Результаты исследований

4.2.1. Регуляторное влияние биогенных аминов на активность АЦС в миокарде и скелетных мышцах крыс со стрептозотоциновым диабетом 1-го типа

4.2.2. Регуляция биогенными аминами и пептидными гормонами функциональной активности АЦС в тканях крыс с неонатальным СТЦ диабетом 2-го типа

4.3. Осуждение результатов исследования

ГЛАВА 5. Молекулярные механизмы действия поликатионных пептидов, мимикрирующих рецепторы, на функциональную активность АЦС

5.1. Обзор литературы

5.2. Результаты исследований

5.2.1. Характеристика поликатионных пептидов

5.2.2. Влияиие поликатиониых пептидов на активность АЦ и ГТФ-связывание G-белков

5.2.3. Влияние поликатионных пептидов на связывающие характеристики рецепторов и их сопряжение с G-белками

5.2.4. Исследование молекулярных механизмов действия поликатионных пептидов на компоненты АЦС - G-белки и рецептор '

5.3. Осуждение результатов исследований

5.3.1. Стратегия синтеза поликатионных пептидов и изучение чувствительности к ним АЦС

5.3.2. Механизмы действия поликатионных пептидов на АЦС и идентификация G-белков, мишеней их действия

ГЛАВА 6. Структурно-функциональная организация аденилатциклазной системы инфузорий и ее чувствительность к гормональным агентам

6.1. Обзор литературы и теоретический анализ первичных структур сигнальных белков низших эукариот

6.1.1. Обнаружение у низших эукариот гормонов, подобных таковым высших эукариот

6.1.2. Рецепторы серпантинного типа

6.1.3. Гетеротримерные G-белки

6.1.4. Аденилатциклазы и протеинкиназы А низших эукариот

6.1.5. Многообразие АЦС низших эукариот

6.2. Результаты экспериментальных исследований

6.2.1. Объекты исследования

6.2.2. Обнаружение и функциональная характеристика аденилатциклазы инфузорий

6.2.3. Чувствительность аденилатциклазы инфузорий к биогенным аминам

6.2.4. Идентификация и характеристика рецепторов катехоламинов у инфузорий

6.2.5. Стимуляция биогенными аминами ГТФ-связывания G-белков инфузорий

6.2.6. Чувствительность аденилатциклазы и G-белков инфузорий к пептидным гормонам млекопитающих

6.2.7. Характеристика цАМФ-зависимой протеинкиназы у инфузорий

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы сопряжения гормональных рецепторов с G-белками в аденилатциклазной сигнальной системе позвоночных и беспозвоночных"

Актуальность исследования. Регуляция большинства жизненно важных функций и процессов в организме позвоночных и беспозвоночных животных осуществляется с помощью гормонов и гормоноподобных веществ. Их действие реализуется через высоко специализированные гормональные сигнальные системы. Предметом нашего исследования была наиболее широко распространенная гормопочувствительная аденилатциклазная система (АЦС). Ее основными компонентами являются рецептор, расположенный в плазматической мембране (ПМ) и специфически опознающий гормональный сигнал, гетеротримерный G-белок стимулирующего (Gs-белок) или ингибирующего (Gi-белок) типа, который состоит из трех типов субъединиц - а, р и у, и фермент аденилатциклаза (АЦ), генерирующий образование вторичного посредника цАМФ. цАМФ активирует протеинкиназу А (П1С4) и через нее регулирует широкий спектр эффекторных систем клетки.

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы в изучении АЦС, молекулярные механизмы передачи через нее гормонального сигнала остаются до конца невыясненными. Недостаточно информации о молекулярных детерминантах в белках, компонентах АЦС, вовлеченных в процесс их функционального взаимодействия и являющихся ключевыми звеньями в сигнал передающей цепи. Много вопросов остается и в отношении регуляции АЦС гормонами, которые действуют через рецепторы, не относящиеся к серпантинному типу. По-прежнему мало изученными остаются АЦС беспозвоночных животных, в первую очередь одноклеточных эукариот.

Понимание того, каким образом функционирует АЦС, является одним из магистральных направлений в современной биохимии и молекулярной эндокринологии, поскольку через эту систему свое регуляторное влияние на клетку оказывают более сотни различных по своей природе гормонов, а сама АЦС играет ключевую, координирующую роль в регуляции практически всех жизненно важных клеточных процессов - роста, метаболизма, апоптоза, дифференцирования. Решению актуальной проблемы функционирования АЦС и посвящено настоящее исследование, в котором изучены молекулярные механизмы функционального сопряжения компонентов АЦС и, в первую очередь, взаимодействия между активированным рецептором и G-белком, как ключевого этапа передачи гормонального сигнала через эту систему. В работе применен эволюционный подход, который заключался в сравнительном исследовании функциональных блоков АЦС у животных различного филогенетического уровня -высших позвоночных (крысы), многоклеточных беспозвоночных (моллюски, черви) и одноклеточных эукариот (инфузории). Оригинальным и перспективным является использование для выяснения молекулярных механизмов сопряжения рецепторов с G-белками пептидной стратегии, которая представляет собой принципиально новый подход в изучении функционирования сигнальных систем и их компонентов на субмолекулярном уровне.

Открытие в лаборатории АЦ сигнального механизма действия инсулина (Pertseva et al., 2003), заставляет по-новому взглянуть и на молекулярные механизмы действия на АЦС родственного ему релаксина. Релаксин регулирует широкий спектр физиологических процессов в организме человека и рассматривается как перспективный лекарственный препарат для лечения заболеваний репродуктивной, сердечно-сосудистой и нервной систем. Однако до сих пор молекулярные механизмы действия релаксина па клетку изучены недостаточно. Расшифровка этих механизмов представляет собой важнейший этап в понимании общих закономерностей регуляторпого влияния релаксина и других пептидов инсулинового суперсемейства на функциональную активность эффекторных, в том числе цАМФ-зависимых, систем клетки, и является необходимым условием для практического применения релаксина в медицине.

Создание новых, более эффективных, гормональных препаратов, обладающих высокой специфичностью и селективностью регуляторного действия на АЦС, требует разработки функциональных зондов для изучения молекулярных механизмов взаимодействия рецепторов с G-белками. Одним из перспективных подходов для разработки таких зондов является синтез негормональных регуляторов АЦС - пептидов, которые мимикрируют функционально важные для взаимодействия с G-белками участки рецепторов и способны влиять на функциональную активность компонентов АЦС. В настоящем исследовании нами были впервые синтезированы различные по своей структуре поликатионные пептиды, которые по независимому от рецептора механизму активируют G-белки и влияют на передачу гормональных сигналов через АЦС.

В настоящее время сравнительно мало известно о структурно-функциональной организации АЦС одноклеточных, в частности инфузорий. В то же время, исследование сигнальных систем одноклеточных представляет как теоретическую, так и практическую ценность. Согласно развиваемым в нашей лаборатории представлениям (Перцева, 1989; Pertseva, 1991), именно на уровне одноклеточных эукариот начинают формироваться гормональные сигнальные системы высших эукариот. Инфузории Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis, избранные нами в качестве объектов, широко используются в экотоксикологических исследованиях. Поскольку АЦС является одной из мишеней внешних воздействий, то выяснение ее функционирования поможет в разработке новых эффективных подходов для оценки последствий таких воздействий и их мониторинга. Цели и задачи исследования. Цель исследования состояла в выяснении молекулярных механизмов функционального сопряжения гормональных рецепторов и гетеротримерных G-белков, компонентов АЦС, в клетках животных различного филогенетического уровня. Задачи исследования состояли:

1) С помощью сравнительного теоретического анализа выявить в рецепторах серпантинного типа и гетеротримерных G-белках молекулярные детерминанты, ответственные за их функциональное сопряжение и вовлеченные в процесс передачи гормонального сигнала.

2) Использовать пептидную стратегию, заключающуюся в синтезе пептидов, которые соответствуют взаимодействующим с рецепторами С-концевым участкам а-субъединиц G-белков, для исследования молекулярных механизмов передачи гормональных сигналов через АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных животных.

3) С применением впервые синтезированных пептидов, соответствующих С-концевому участку третьей цитоплазматической петли (С-ЦП-3) рецептора релаксина LGR7, выявить и изучить молекулярные механизмы передачи релаксинового сигнала через АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных животных.

4) Расшифровать и исследовать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма действия релаксина, обнаруженного в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах моллюска Anodonta cygnea.

5) Исследовать чувствительность АЦС к биогенным аминам и пептидным гормонам при стрсптозотоциновом (СТЦ) диабете 1-го и 2-го типов у крыс и выявить локализацию нарушений в АЦС, возникающих в условиях этой патологии.

6) Провести сравнительное исследование механизмов действия синтетических поликатионных пептидов, не имеющих гомологии с сигнальными белками, но способных мимикрировать функционально важные для сопряжения с G-белками участки рецепторов, на функциональную активность компонентов АЦС.

7) Охарактеризовать АЦС одноклеточных эукариот - инфузорий D. anser и Т. pyriformis, и изучить молекулярные механизмы передачи через нее гормональных сигналов на этапе сопряжения рецептора с G-белком и АЦ.

Научная иовизна. В результате проведенных теоретических и экспериментальных исследований показано, что одним из основных молекулярных механизмов, лежащих в основе функционального сопряжения рецепторов с G-белками в тканях позвоночных и беспозвоночных, является способность поликатионных спиралей цитоплазматических петель активированного гормоном рецептора взаимодействовать с С-концевым сегментом а-субъединицы гетеротримерпого G-белка и опосредовать, таким образом, передачу гормонального сигнала к АЦ и цАМФ-зависимым эффекторным системам.

Впервые показано, что С-концевые пептиды а-субъединиц Gs- и Gj-бслков способны с высокой селективностью прерывают передачу гормонального сигнала через те типы G-белков, производными первичной структуры которых они являются, вследствие чего их можно применять для идентификации G-белков, участвующих в сигнальной трапсдукции.

Показано, что впервые синтезированные нами пептиды, соответствующие С-ЦП-3 релаксинового рецептора LGR7, не только влияют на передачу релаксинового сигнала через АЦС в сердце и мозге крыс, но и независимым от рецептора способом активируют G-белки и АЦ. Это указывает на участие рецептора LGR7 в трансдукции релаксинового сигнала в этих тканях и свидетельствует о вовлечении в процесс функционального сопряжения с G-белком С-ЦП-3 рецептора LGR7.

Впервые расшифрован АЦ сигнальный механизм действия релаксина, реализуемый в скелетных мышцах крысы, который включает: рецептор тирозинкиназного типа => Gj-белок (GPy-димер) => фосфатидилипозитол-З-киназу (ФИ-5

К) => протеинкиназу СС, (F1KCQ=> Gj-белок => АЦ. По своей структурно-функциональной организации он сходен с открытым в лаборатории АЦ сигнальным механизмом действия инсулина (Pertseva et al., 2003).

В работе впервые показано, что основные нарушения в АЦС при СТЦ диабете 1-го и 2-го типов у крыс, возникают па этапе сопряжения рецепторов биогенных аминов и пептидных гормонов с различными типами G-белков. Для изучения этих нарушений была применена разработанная автором пептидная стратегия.

Впервые охарактеризована АЦС представителей одноклеточных эукариот -инфузорий D. anser и Т. pyriformis, сходная по ряду свойств с АЦС позвоночных. Показано, что ее функциональная активность регулируется биогенными аминами и пептидными гормонами млекопитающих. Эти данные и результаты проведенного нами сравнительного теоретического анализа первичных структур компонентов АЦС одноклеточных, свидетельствуют о раннем формировании АЦС в эволюции. Научно-практическая значимость работы. Синтезированные нами и исследованные в работе пептиды, соответствующие участкам рецепторов и G-белков, ответственным за взаимодействие между ними, а также синтетические поликатионные пептиды, мимикрирующие эти участки, но не имеющие гомологии с сигнальными белками, могут быть в дальнейшем применены как в качестве функциональных зондов для изучения молекулярных основ функционирования АЦС, так и в качестве высокоэффективных и селективных негормональных регуляторов активности сигнальных белков. В перспективе на основе этих пептидов могут быть разработаны лекарственные препараты, избирательно действующие на функциональную активность гормональных сигнальных систем. Материалы диссертации могут быть использованы в курсах лекций для студентов и аспирантов в Санкт-Петербургском государственном университете, Медицинском университете, Химико-фармацевтической Академии и других Университетах и вузах России.

Положения, выносимые на защиту.

1. Основные молекулярные детерминанты, ответственные за взаимодействие с G-белками, локализованы в проксимальных к мембране участках цитоплазматических петель (ЦП) рецепторов и характеризуются наличием кластеров положительно заряженных аминокислот и способностью формировать спиральные структуры.

Синтетические пептиды, которые соответствуют участкам рецепторов и G-белков, ответственным за их функциональное взаимодействие, способны с высокой эффективностью и селективностью по конкурентному механизму прерывать проведение гормонального сигнала через АЦС.

2. Молекулярные механизмы стимулирующего АЦ действия релаксина являются ткане- и видоспецифичными и реализуются через гетеротримерные G-белки. В сердце и мозге крысы релаксин осуществляет свое действие через трехкомпонентную АЦС, в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах моллюска A. cygnea - через шестикомпонентный АЦ сигнальный механизм.

3. В условиях СТЦ диабета 1-го и 2-го типа у крыс наблюдаются нарушения функционирования чувствительной к биогенным аминам и пептидным гормонам АЦС, в первую очередь на этапе сопряжения активированного гормоном рецептора с G-белком.

4. Синтетические поликатионные пептиды, мимикрирующие взаимодействующие с G-белками участки рецепторов, способны по независимому от рецептора механизму активировать G-белки и влиять на проведение гормонального сигнала через АЦС.

5. В клеточных культурах инфузорий D. anser и Т. pyriformis имеется функционально . активная АЦС, чувствительная к гормонам млекопитающих. Это согласуется с присутствием у одноклеточных эукариот сигнальных белков, гомологичных компонентам АЦС позвоночных, что свидетельствует об эволюционной ■ консервативности АЦС эукариотических организмов.

Апробация работы. Основные результаты и положения работы широко представлены на большом числе отечественных и зарубежных научных конференций и симпозиумов, в том числе: на VI Международном конгрессе по нейроэндокрииологии (Питтсбург, США, 2006), па 111 Международном симпозиуме по пептидам (Прага, Чехия, 2004), на III и IV Международных конференциях по релаксину и родственным пептидам (Брум, Австралия, 2000; Виоминг, США, 2004), на XVII, XXI и XXII Конференциях сравнительных эндокринологов (СБСЕ; Кордоба, Испания, 1994; Бонн, Германия, 2002; Уппсала, Швеция, 2004), на Международном симпозиуме по сигнальной трансдукции (FEBS; Брюссель, Бельгия, 2003), на Симпозиуме "Cell Signalling Mechanisms: from Membrane to Nucleus" (FEBS; Амстердам, Нидерланды, 1997), на Европейской конференции "Cell signaling, transcription, and translation as therapeutic targets" (Люксембург, 2002), на

Международном симпозиуме "Structure, stability and folding of proteins: fundamental and medical aspects" (Москва, 1998), на Международной научно-практической конференции «Инфузории в биотестировании» (Санкт-Петербург, 1997), на VII Восточноевропейской конференции по нейробиологии беспозвоночных (Калининград, 2003), на IV Международной конференции по простейшим нервным системам (Пущино, 1994), на XI, XII и XIII Международных конференциях по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996, 2002, 2006), на Международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004), на II Международной конференции «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии», посвященной памяти М.Г. Колпакова (Новосибирск, 2002), на I и II Всероссийских симпозиумах по химии и биологии пептидов (Москва, 2003, Санкт-Петербург, 2005), на XV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005), на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005), на Всероссийском физиологическом съезде (Екатеринбург, 2004), на Конференции «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов», посвященной памяти П. М. Альбицкого (Санкт-Петербург, 2003), на I съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), на Всероссийской конференции «Нейрофармакология в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2002).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 85 научных работ, в том числе 45 статей в рецензируемых отечественных и международных научных изданиях и 40 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 300 страницах, состоит из введения, 6 отдельных глав, включающих обзор литературы, результаты экспериментальных и теоретических исследований и их обсуждение, главы с описанием методов исследования, заключения, выводов и списка литературы, включающего 342 источника, в том числе 78 отечественных и 264 иностранных. Работа иллюстрирована 87 рисунками и 11 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шпаков, Александр Олегович

ВЫВОДЫ.

1. Основные молекулярные детерминанты рецепторов серпантинного типа, ответственные за взаимодействие с G-белками, локализованы в проксимальных к мембране участках их цитоплазматических петель и характеризуются наличием кластеров положительно заряженных аминокислот и способностью формировать спиральные структуры.

2. Синтетические пептиды, соответствующие молекулярным детерминантам в а-субъединицах G-белков и рецепторах, которые ответственны за их функциональное сопряжение, способны с высокой эффективностью и селективностью по конкурентному механизму прерывать проведение гормонального сигнала, осуществляемого через те сигнальные белки, производными которых они являются.

3. Молекулярные механизмы стимулирующего АЦ действия релаксина являются ткане- и видоспецифичпыми. В сердце и мозге крысы релаксин осуществляет свое действие через трехкомпонентную АЦС, включающую рецептор LGR7 серпантинного типа, Gs-белок и АЦ, в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах моллюска A. cygnea - через шестикомпонептный АЦ сигнальный механизм, включающий рецептор тирозипкииазпого типа, Ру-димер Gj-белка, фосфатидилипозитол-3-киназу, протеинкиназу Gs-белок и АЦ.

4. В условиях стрептозотоцинового диабета 1-го и 2-го типов у крыс наблюдается ослабление функционального сопряжения активированного гормоном рецептора с G-белком и АЦ. В большей степени нарушаются функции Gj-белков, что приводит к подавлению ингибирующего влияния биогенных аминов и соматостатина на АЦ.

5. Синтетические поликатионные пептиды, мимикрирующие взаимодействующие с G-белками участки рецепторов, активируют G-белки и негативно влияют на проведение гормонального сигнала через АЦС. Эффективность и молекулярные механизмы действия этих пептидов на АЦС определяются распределением положительно заряженных аминокислот в спирали, наличием гидрофобных радикалов и степенью разветвленности.

6. В клеточных культурах инфузорий Dileptus anser и Tetrahymenapyriformis обнаружена и охарактеризована чувствительная к гормонам млекопитающих АЦС, сопряженная с гетеротримерными G-белками и сходная по ряду признаков с гормоночувствительной АЦС позвоночных, что свидетельствует о высокой консервативности АЦС у представителей низших и высших эукариот и ее раннем формировании в эволюции.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность за помощь и содействие в проведении экспериментов сотрудникам лаборатории молекулярной эндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН ведущему научному сотруднику, доктору биологических наук Кузнецовой Людмиле Александровне, старшему научному сотруднику, кандидату биологических наук Плесневой Светлане Александровне, научному сотруднику, кандидату биологических наук Деркач Кире Викторовне, ведущему научному сотруднику, кандидату биологических наук Бондаревой Вере Михайловне, младшему научному сотруднику Шаровой Татьяне Сергеевне, за синтез пептидов - сотрудникам лаборатории биологически активных полимеров Института высокомолекулярных соединений РАН заведующему лабораторией, доктору химических наук, профессору Власову Геннадию Петровичу, старшему научному сотруднику, кандидату химических наук Гурьянову Ивану Александровичу, старшему научному сотруднику, кандидату химических наук Королькову Валерию Игоревичу, за предоставление клеточных культур инфузорий сотруднику лаборатории биологии одноклеточных организмов Института цитологии РАН старшему научному сотруднику, кандидату биологических наук Успенской Зое Ивановне.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате комплекса проведенных экспериментальных и теоретических исследований получены принципиально новые данные и расширены современные представления, касающиеся функционирования гормоночувствительной АЦС в клетках животных ' различного филогенетического уровня и молекулярных механизмов функционального взаимодействия рецепторов с гетеротримерными G-белками, как ключевого этапа передачи гормонального сигнала, осуществляемого через АЦС.

Несмотря на большое число работ, в которых проводился поиск участков в первичных структурах сигнальных белков, компонентов сопряженных с G-белками гормональных сигнальных систем, ответственных за функциональное взаимодействие между ними, до сих пор не проведен системный анализ полученных результатов. Такой анализ необходим как для идентификации набора универсальных молекулярных детерминант, вовлеченных в функциональное взаимодействие рецепторов с гетеротримерными G-белками и последних с эффекторами, так и для выяснения молекулярных механизмов процесса передачи гормонального сигнала, в основе которого лежит цепь конформационных перестроек пространственной структуры сигнальных белков, инициируемых связыванием гормона, берущая начало в лигандсвязывающем сайте рецептора и заканчивающаяся в каталитическом сайте фермента-генератора вторичных посредников, в случае АЦС - в каталитическом сайте фермента АЦ.

Основываясь на результатах проведенного нами сравнительного теоретического анализа первичных структур рецепторов серпантинного типа, относящихся ко всем основным их типам, и также на проанализированных и систематизированных нами данных литературы, в структуре этих рецепторов были выявлены молекулярные детерминанты, соответствующие проксимальным к мембране участкам ЦП, в первую очередь ЦП-3, которые ответственны за взаимодействие активированного гормоном рецептора с С-концевым сегментом а-субъединицы G-белка. Характерными особенностями таких участков являются присутствие в их структуре кластеров положительно заряженных АКО, образующих мотивы ВВххВ-типа, и способность к образованию амфипатических а-спиралей. Положительно заряженные АКО расположены в спирали таким образом, что они формируют положительно заряженную поверхность, которая, как можно полагать, и определяет функциональное взаимодействие рецептора с отрицательно заряженным рецептор-связывающим сайтом Ga-субъединицы. Образуемые проксимальными к мембране участками ЦП рецепторов амфипатические поликатионные спирали представляют собой продолжения, так называемые цитоплазматические «расширения», ТМ рецептора и формируют цитоплазматический выход из ТМК. Поскольку внутри ТМК рецептора или на его внешнем выходе расположен лиганд-связывающий сайт, с которым связывается молекула гормона, то между этим сайтом и проксимальными к мембране спиральными участками ЦП возможен непосредственный контакт через систему водородных связей и гидрофобных взаимодействий, которая формируется сетью АКО, расположенных внутри ТМК. Связывание лиганда вызывает такое перераспределение заряда в лигандсвязывающем сайте рецептора, которое инициирует изменение конформации проксимальных участков ЦП, ведет к их высвобождению из комплекса с другими участками рецептора и экспонированию в сторону Ga-субъединицы. Одной из перспективных физико-химических моделей, описывающих процесс передачи волны конформационных перестроек в системе рецептор-С-белок, является модель протонного насоса, экспериментально подтвержденная для эволюционно древних бактериальных родопсинов, предшественников всех рецепторов серпантинного типа эукариот, а также для некоторых рецепторов биогенных аминов.

Таким образом, выявленные нами молекулярные детерминанты могут рассматриваться, как ключевое звено в передаче гормонального сигнала на этапе сопряжения рецептора с G-белком, и представляют собой универсальный эволюционно древний механизм, лежащий в основе взаимодействия этих сигнальных белков. В то же время, проведенный нами теоретический анализ отчетливо продемонстрировал, что универсальность этих детерминант вовсе не означает, что они идентичны по своей структуре и локализации в серпантинных рецепторах, относящихся к различным их типам и сопряженных с различными G-белками. Так, несмотря на то, что в подавляющем большинстве рецепторов определяющую роль в сопряжении с G-белками играет ЦП-3, в некоторых типах рецепторах в этом процессе участвуют также ЦП-2 и СКД, причем структура локализованных в них молекулярных детерминант существенно не отличается от таковых в ЦП-3. В родопсине позвоночных, например, во взаимодействие с G-белками вовлечены ЦП-2, ЦП-3 и СКД. Это свидетельствует о том, что на начальных этапах эволюции, а родопсин берет свое начало непосредственно от бактериальных родопсинов, молекулярные детерминанты распределялись по всем ЦП рецептора и только впоследствии сосредоточились, в основном, в ЦП-3.

Нами показано, что функциональное значение различных участков ЦП-3 рецепторов для их взаимодействия с G-белками также не одинаково и определяется тем, с каким типом G-белка сопряжен рецептор. В Gs-сопряженных рецепторах для взаимодействия с Gs-белками более важны С-ЦП-3 и интерфейс ЦП-З/ТМ-6, в то время как в Gj/0-сопряженных рецепторах - их N-ЦП-З. В рецепторах, сопряженных с другими типами G-белков (Gqji,i4,i5,i6 и трансдуцином), набор участков, вовлеченных в связывание и активацию G-белков, более разнообразен и включает, в том числе, центральные участки ЦП-3. При этом в первичной структуре ЦП-3 локализованы консенсусные среди различных рецепторов N- и С-концевые мотивы, которые определяют селективность и эффективность их взаимодействия с определенными типами G-белком. Полученные данные могут быть использованы для направленного поиска в молекулах рецепторов и G-белков участков, функционально важных для передачи гормонального сигнала через АЦС, что и было продемонстрировано в наших экспериментах по изучению АЦС, чувствительной к пептидным гормонам и биогенным аминам.

Для исследования молекулярных механизмов функционального сопряжения компонентов АЦС и проверки сделанных на основе теоретических исследований выводов и предположений нами была разработана и применена пептидная стратегия, которая заключалась в синтезе пептидов, соответствующих по своей первичной структуре участкам этих белков, которые ответственны за взаимодействие между ними. С этой целью впервые были синтезированы пептиды, которые соответствуют по своей первичной структуре выявленным с помощью теоретического анализа участкам сигнальных белков - С-концевому сегменту ЦП-3 рецептора релаксина LGR7 серпантинного типа и С-концевым сегментам а-субъединиц Gs- и Gj-белков. Показано, что синтетические пептиды действуют на функциональную активность АЦС с высокой селективностью, что выражается в их влиянии только на те сигнальные пути, которые осуществляются с участием белков (рецепторов и а-субъединиц G-белков), производными АКП которых эти пептиды являются. Обнаружено также, что пептиды, производные рецептора LGR7, способны активировать пострецепторные звенья АЦС по независимому от рецептора механизму вследствие их прямого взаимодействия с Gs-белком. Применение таких пептидов открывает новые перспективы для поиска и разработки пегормональных регуляторов сигнальных систем, которые будут действовать по независимым от рецептора сигнальным путям и с высокой селективностью активировать пострецепторные звенья сопряженных с G-белками сигнальных каскадов.

Пептидная стратегия, основанная на применении пептидов, производных рецептора LGR7 и С-коицевых пептидов Ga-субъединиц, была использована для выяснения молекулярных механизмов действия на АЦС пептидного гормона релаксина, относящегося к пептидам инсулинового суперсемейства, который рассматривается как высоко эффективный лекарственный препарат для лечения широкого спектра заболеваний сердечно-сосудистой, нервной, выделительной и репродуктивной систем человека. Несмотря на то, что стимулирующее влияние релаксина на активность АЦ ранее было выявлено как в нашей лаборатории (Kuznetsova et al., 1999), так и другими авторами (Bani, 1997; Ivell, Einspanier, 2002), молекулярные механизмы действия гормона на АЦС до настоящего времени оставались не изученными. В частности, не был определен тип рецептора, через который релаксин опосредует свое регуляторное влияние на активность АЦ - предполагалось, что этот рецептор может относиться как к тирозинкиназному, так и к серпантинному типу (глава 3).

С помощью пептидной стратегии и широкого набора функциональных тестов нами впервые были установлены два различных АЦ сигнальных механизма действия пептидного гормона релаксина, которые являются ткане- и видоспецифичными. Первый из них, трехкомпонентный, включает рецептор серпантинного типа (LGR7), Gs-белок и фермент АЦ, в то время как второй, шестикомпонентный, включает более сложную цепь сигнальных белков: рецептор тирозинкиназного типа => Gj-белок (Gpy-димер) => ФИ-З-К => ПКС^ => Gs-белок АЦ. Несмотря на существенные различия в структурно-функциональной организации открытых нами АЦ сигнальных механизмов действия релаксина, они имеют и общие звенья - сопряжение гетеротримерного Gs-белка с ферментом АЦ. Показано, что трехкомпонентный АЦ сигнальный механизм, представляющий собой классическую АЦС, через которую свое регуляторное действие на АЦ оказывают значительное число гормонов и нейротрансмиттеров, функционирует в сердечной мышце и мозге крысы. В то же время, шестикомпонентный АЦ сигнальный механизм действия релаксина, сходный с таковым, обнаруженным ранее в лаборатории для инсулина (Pertseva et al., 2003) функционирует в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах представителя беспозвоночных животных двустворчатого моллюска A. cygnea. Полученные нами данные свидетельствуют в пользу множественности сигнальных путей действия релаксина на активность АЦ в различных тканях, что важно учитывать при разработке новых подходов для практического применения релаксина в клинической медицине.

При изучении действия на АЦС других представителей инсулинового суперсемейства ИПП двустворчатого моллюска A. cygnea, имеющих общее с релаксином происхождение, также были выявлены различия в молекулярных механизмах действия этих пептидов на АЦ. При этом, однако, показано, что регуляторные эффекты двух исследованных нами ИПП нейронального происхождения осуществляются через гетеротримерные Gs-белки, что свидетельствует об универсальности этого компонента АЦС для обеспечения функционального сопряжения различных по природе рецепторов пептидов инсулинового суперсемейства с ферментом АЦ.

Возможным объяснением множественности молекулярных механизмов действия на АЦ пептидов инсулинового суперсемейства, которые являются сравнительно древними гормонами, появившимися еще на уровне примитивных беспозвоночных и обнаруженными даже у одноклеточных организмов (глава 6), является то, на начальных этапах эволюции апробировались различные молекулярные модели реализации регуляторного действия гормонов и гормоноподобных веществ на активность ферментов, генераторов циклических пуклеотидов, в частности АЦ. Так, например, у амебы D. discoideum сигнальный каскад, через который внеклеточный цАМФ стимулирует функциональную активность фермента АЦ-Л, структурно близкого АЦ млекопитающих, включает следующие основные звенья: цАМФ (хемоаттрактант) => цАМФ-рецептор => гетеротримерный Са2ру-белок (Gpy-димер) => Ras-белок => ФИ-З-К => белок CRAC => АЦ-Л => цАМФ (вторичный посредник) (Manahan et al., 2004). Этот АЦ сигнальный механизм действия цАМФ имеет много общих черт открытым нами шестикомпонентным АЦ сигнальным механизмом действия релаксина. В дальнейшем могла произойти дивергенция и специализация АЦ сигнальных механизмов действия гормонов, многие из них утратили свое значение и исчезли. В случае пептидов инсулинового суперсемейства различные АЦ сигнальные механизмы могли сохраниться вследствие того, что функцию рецепторпого компонента в них выполняют различные по своей структурно-функциональной организации рецепторы - как серпантинного, так и тирозинкиназпого типов.

Еще одной иллюстрацией успешного применения пептидной стратегии стало использование С-концевых пептидов а-субъедипиц Gs- и Gj-белков в сочетании с другими биохимическими и фармакологическими подходами для установления типа G-белков, участвующих в передаче гормонального сигнала, генерируемого биогенными аминами, в нервной и мышечной тканях моллюска A. cygnea, а также для выяснения молекулярных механизмов функционирования АЦС в этих тканях. Показано, что стимулирующие АЦ эффекты октопамина и дофамина в ганглиях моллюска A. cygnea реализуются через рецепторы, функционально сопряженные с Gs-белком, в то время как серотонин одновременно активирует как стимулирующий (через Gs-белок), так и ипгибирующий (через Gj-белок) пути регуляции АЦС. Во взятых для сравнения мышцах моллюска эффекты исследованных нами биогенных аминов осуществляются только через Gs-сопряженныс рецепторы. Совокупность собственных экспериментальных данных и сведений литературы позволила сделать вывод о том, что впервые выявленная в ганглиях моллюска A. cygnea АЦС сходна по ряду своих показателей с АЦС высших позвоночных животных.

Наряду с исследованием АЦС в норме, нами было изучено функциональное состояние этой сигнальной системы в тканях крыс, страдающих экспериментальным СТЦ диабетом, для чего применяли комплексный подход, составной частью которого также была пептидная стратегия. Показано, что при СТЦ диабете как 1-го, так и 2-го типов возникают значительные изменения чувствительности АЦС скелетных мышц и миокарда диабетических крыс к действию биогенных аминов и пептидных гормонов, которые в наибольшей степени проявляются в случае АЦС, сопряженной с Gj-белками. Одной из причин нарушений функционирования АЦС при диабете может быть ослабление функционального сопряжения рецепторов с Gj- и, в меньшей степени, Gs-белками. Выявлена тканевая специфичность изменений в функциональной активности Gs-сопряженной АЦС при СТЦ диабете 2-го типа, заключающаяся в снижении ее чувствительности к гормонам в миокарде диабетических крыс в сравнении с контролем при отсутствии заметных изменений в мозге. Полученные данные свидетельствуют о том, что применение С-концевых пептидов Ga-субъединиц при эндокринных и других патологиях может стать эффективным инструментом для выявления нарушений, возникающих в гормональных сигнальных системах на этапе сопряжения рецепторов с гетеротримерными G-белками.

Полученные при исследовании СТЦ диабета данные о снижении функциональной активности АЦС и ослаблении функционального взаимодействия проксимальных звеньев этой системы - рецептора и G-белка в мышечных тканях диабетических животных подтверждают основные положения высказанной нами ранее концепции молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как причин эндокринной патологии (Перцева, Шпаков, 2004), которая устанавливает причинно-следственные связи между нарушениями, возникающими в гормональных сигнальных системах, и развитием эндокринных и гормон-зависимых заболеваний.

Выявление структурных особенностей G-белок-связывающих и G-белок-активирующих участков в молекулах рецепторов, таких как наличие поликатионных мотивов и способность к образованию a-спиралей, стало отправной точкой для создания серии синтетических пептидов, которые мимикрируют взаимодействующие с G-белками участки рецепторов, сходны с ними на уровне вторичной структуры - также способны формировать поликатионные амфипатические спирали, но не имеют гомологии на уровне первичной структуры. Показано, что впервые синтезированные нами поликатионные пептиды обладают способностью регулировать функциональную активность компонентов гормоночувствительной АЦС в клетках позвоночных и беспозвоночных животных, причем их действие направлено в основном на гетеротримерные G-белки и их функциональное сопряжение с рецептором. Некоторые из поликатионных пептидов, например разветвленные звездообразные пептиды, созданные на основе фрагмента 48-60 ТАТ-белка вируса иммунного дефицита 1-го типа человека, влияют также на рецептор и каталитический компонент АЦС - фермент АЦ, что свидетельствует в пользу того, что по своему действию на АЦС различные по структуре поликатионные пептиды отличаются друг от друга.

Проведенное в работе сравнение действия искусственно созданных поликатионных пептидов с природным токсином мастопараном обнаружило черты сходства и различий в их действии на АЦС. Как мастопаран, так и синтетические пептиды способны по независимому от рецептора механизму стимулировать функциональную активность G-белков и регулировать, таким образом, эффекторпые звенья цАМФ-зависимой сигнальной системы. Наряду с этим они по конкурентному механизму препятствуют передаче гормональных сигналов через АЦС, разобщая сигнальную цепь на этапе функционального сопряжения рецептора с G-белком. В то же время имеются и существенные различия в действии синтетических поликатионных пептидов и мастопарана на компоненты АЦС. Синтетические поликатионные пептиды способны стимулировать как Gs-, так и Gj-белки, хотя последние с меньшей эффективностью, и ингибировать передачу гормональных сигналов, осуществляемых через эти типы G-белков. Мастопаран селективно активирует Gj-белки и прерывает реализуемые через них сигнальные каскады. Так, например, в мышцах крысы мастопаран заметно превосходит синтетические поликатионные пептиды по своей способности блокировать ингибирующие эффекты биогенных аминов и соматостатина па предварительно стимулированную форсколином активность АЦ.

Создание искусственных иегормональных регуляторов АЦ на основе поликатионных пептидов линейной и разветвленной структуры не только открывает новое направление для изучения фундаментальных основ взаимодействия между сигнальными белками, возникших на самых ранних этапах эволюции, по и позволит уже в ближайшем будущем приступить к созданию нового поколения регуляторов гормональных сигнальных систем, мишенями действия которых являются G-белки и другие сигнальные белки, ответственные за пострецепторные этапы передачи гормонального сигнала. Следует подчеркнуть, что целенаправленный поиск негормопальпых пептидных регуляторов сигнальных систем ранее не проводился, и практически отсутствовала информация о самой стратегии создаиия таких регуляторов, вследствие чего полученные нами результаты и выводы могут рассматриваться как алгоритм для разработки более эффективных и селективных регуляторов сигнальных систем, действующих на пострецепторных этапах передачи сигнала.

Объектом нашего исследования, наряду с АЦС позвоночных и многоклеточных беспозвоночных, была избрана АЦС одноклеточных эукариот, которая лишь в общих чертах изучена для некоторых их представителей (дрожжевые грибы S. cerevisiae и S. pombe, амеба D. discoideum) и практически не изучена для подавляющего большинства других одноклеточных организмов, включая инфузорий. В результате проведенного комплексного исследования нами была впервые выявлена и охарактеризована АЦС в клеточных культурах двух видов свободноживущих инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis. Исследование культур Т. pyriformis с различной плотностью клеток и различного возраста показало, что фактором, определяющим уровень базальной активности АЦ, является стадия развития культуры. Показано, что АЦ инфузорий, как и АЦ высших эукариот, стимулируется такими активаторами фермента, как катионы марганца, NaF, гуаниновые нуклеотиды, форсколин, причем величина стимулирующего эффекта этих активаторов определяется уровнем базальной активности фермента - чем она выше, тем слабее выражен стимулирующий АЦ эффект.

Наряду с негормональными активаторами, АЦС инфузорий регулируется типичными гормонами позвоночных животных - глюкагоном и биогенными аминами, действующими через рецепторы серпантинного типа, а также пептидами инсулинового суперсемейства, реализующими свои эффекты через рецепторы тирозипкиназного типа (инсулин, ИФР-1) или через оба типа рецепторов (релаксин). Как и в случае негормональных регуляторов, величина и направленность их эффекта определяются уровнем базальной активности фермента. Специфичность действия биогенных аминов на АЦ инфузорий D. anser и Т. pyriformis доказывается блокированием их АЦ эффектов специфичными антагонистами АР и СР. С помощью фармакологических подходов у инфузорий выявлены родственные АР млекопитающих рецепторы, которые специфично связываются с лигандами Р-АР, хотя и с более низкой аффинностью в сравнении с таковой рецепторов высших эукариот. Обнаружено также, что биогенные амины стимулируют ГТФ-связывание гетеротримерных G-белков в клетках инфузорий. В клетках инфузорий нами впервые обнаружена активность ПКЛ и исследована ее регуляция глюкагоном и биогенными аминами. Действие гормонов на активность ПК4 и АЦ является однонаправленным, что указывает на функциональную связь между ними, как это наблюдается в клетках высших эукариот. Совокупность полученных данных указывают на присутствие в культурах инфузорий функционально активной АЦС, чувствительной к гормонам позвоночных животных. АЦС инфузорий включает рецепторы, в том числе сходные по ряду характеристик с АР высших эукариот, гетеротримерные G-белки и функционально сопряженный с ними фермент АЦ, который через изменение внутриклеточного уровня цАМФ регулирует активность ПКА, эффекторного звена АЦ-цАМФ-системы. Показано также, что АЦ эффекты пептидных гормонов (глюкагона и пептидов иисулиновой группы) в целом более выражены в сравнении с таковыми биогенных аминов. Это, возможно, связано с тем, что пептидные гормоны являются более древними сигнальными молекулами и вследствие этого более эффективно действуют на АЦС инфузорий, которая сформировалась гораздо раньше АЦС позвоночных животных.

Таким образом, данные, полученные нами в ходе экспериментального исследования АЦС инфузорий, а также результаты проведенного нами сравнительного теоретического анализа первичных структур сигнальных белков, потенциальных компонентов АЦС низших эукариот, позволяют более полно представить картину эволюции гормопочувствительпых АЦС эукариот и доказывают, что сложный ансамбль универсальных молекулярных детерминант, ответственных за функциональное взаимодействие между сигнальными белками, компонентами АЦС, сложился на самых ранних этапах эволюции и, в общих чертах, сохранился до уровня высших позвоночных. При этом ключевой этап передачи гормонального сигнала через АЦС - функциональное взаимодействие активированного лигандом рецептора с гетеротримерным G-белком у животных различного филогенетического уровня не претерпел значительных изменений. Именно на этом этапе определяются: (1) направленность (векторпость) сигнального импульса, в основе которой лежит селективное взаимодействие рецептора с определенным типом G-белка, через который осуществляется регуляция конкретной эффекторной системы клетки; (2) интенсивность сигнального импульса, которая повышается на уровне сопряжения G-белка с рецептором в десятки и сотни раз. На этапе функционального сопряжения рецептора с G-белком возможна регуляция активности сигнальной системы по независимому от рецептора механизму, причем в качестве таких негормональных регуляторов могут выступать как вещества природного происхождения (пептидные токсины), так и искусственно созданные пептиды, мимикрирующие участки молекул рецепторов и G-белков, функционально важные для их взаимодействия. Различные классы таких пептидов были нами синтезированы и успешно применены для регуляции функциональной активности АЦС в тканях различных видов животных.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Шпаков, Александр Олегович, Санкт-Петербург

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. М., Наука, 1994. 288 с.

2. Деркач К.В., Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Успенская З.И., Перцева М.Н. Гормоночувствительная аденилатциклазпая система инфузории Dileptus anser II Цитология. 2002. Т. 44. С. 1129-1134.

3. Ирлипа И.С., Меркулова Н.Н. Выращивание больших масс Tetrahymena pyriformis, пригодных для биохимических исследований и синхронизации деления инфузорий // Цитология. 1975. Т. 17. С. 1208-1215.

4. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. Структурно-функциональная организация G-белков и связанных с ними рецепторов // Цитология. 1992. Т. 34. С. 24-45.

5. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. Структурио-функциональпая организация клеточных систем передачи сигнала // Цитология. 2000. Т. 42. С. 844-874.

6. Кузнецова Л.А. Успехи в изучении серотониновых рецепторов, сопряженных с аденилатциклазной системой, в тканях позвоночных и беспозвоночных животных // Ж. эвол. биохим. физиол. 1998. Т. 34. С. 256-266.

7. Кузнецова Л.А. Регуляторные свойства изоформ аденилатциклаз // Ж. эвол. биохим. физиол. 2002. Т. 38. С. 289-304.

8. Кузнецова Л.А., Плеснева С.А. Влияние биогенных аминов и полипептидных гормонов на активность протеинкиназы А и аденилатциклазы в мышцах моллюска Anodonta cygnea II Ж. эвол. биохим. физиол. 2001. Т. 37. С. 395-400.

9. Кузнецова JI.A., Шпаков А.О. Рецепторы серотонина, участвующие в модуляции аденилатциклазной системы, в тканях позвоночных и беспозвоночных // Ж. эвол. биохим. физиол. 1994. Т. 30. С. 293-309.

10. Лейбуш Б.Н., Чистякова О.В. Рецептор инсулиноподобпого фактора роста 1 в тканях моллюска Anodonta cygnea II Ж. эвол. биохим. физиол. 2003. Т. 39. С. 128-133.

11. Перцева М.Н. Молекулярные основы развития гормонокомпетентности. Л., Наука, 1989.256 с.

12. Перцева М.Н. Существует ли эволюционное родство между хемосигнальными системами эукариот и прокариот//Ж. эвол. биохим. физиол. 1990. Т. 26. С. 505-513.

13. Перцева М.Н., Плеснева С.А., Шпаков А.О., Русаков Ю.И., Кузнецова Л.А. Новые данные, свидетельствующие об участии аденилатциклазной системы в механизме действия инсулина и родственных пептидов // Докл. РАН. 1995. Т. 342. С. 410-412.

14. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Хемосигнальные системы одноклеточных эукариот и бактерий как предшественники гормонокомпетентных систем высших животных // Ж. эвол. биохим. физиол. 1993. Т. 29. С. 454-474.

15. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Консервативность инсулиновой сигнальной системы в эволюции беспозвоночных и позвоночных животных // Ж. эвол. биохим. физиол. 2002. Т. 38. С. 430-441.

16. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Концепция молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как причин эндокринных заболеваний // Рос. физиол. жури. 2004. Т 90. С. 446-447.

17. Перцева М.Н., Шпаков А.О., Плеснева С.А. Современные достижения в изучении сигнальных механизмов действия инсулина и родственных ему пептидов // Ж. эвол. биохим. физиол. 1996. Т. 32. С. 318-340.

18. Плеснева С.А., Кузнецова Л.А., Омельянюк Е.В., Шпаков А.О., Перцева М.Н. Адепилатциклазный сигнальный механизм действия релаксина // Ж. эвол. биохим. физиол. 2000. Т. 36. С. 562-568.

19. Прудников И.М., Осипенко О.Н., Кастрикина Т.Ф., Цывкин В.Н. Влияние дофамина на ионную проводимость и активность аденилатциклазы в центральной нервной системе прудовика//Нейрофизиология. 1992. Т. 24. С. 437-451.

20. Русаков Ю.И., Колычев А.П., Шипилов В.Н., Бондарева В.М. Инсулиноподобные пептиды цереброплеврального ганглия моллюска Anodonta cygnea: выделение, очистка и радиолигандный анализ // Ж. эвол. биохим. физиол. 2003. Т. 39. С. 339-345.

21. Русаков Ю.И., Колычев А.П., Шипилов В.Н., Бондарева В.М. Очистка и лиганд-рецепторный анализ и нсул и но подобных пептидов педального ганглия моллюска Anodonta cygnea II Цитология. 2004. Т. 46. С. 442-447.

22. Ткачук В.А., Балденков Г.Н. Выделение, очистка и характеристика регуляторных свойств аденилатциклазы из сердца кролика // Биохимия. 1978. Т. 43. С. 1097-1110.

23. Успенская З.И. Серотипы инфузории D. anser II Цитология. 2002. Т. 44. С. 305-313.

24. Шипилов В.Н. Инсулиноподобные нейропептиды моллюска Anodonta cygnea L.: функциональные свойства и амплификация специфичных мРНК // Вестник молодых ученых. 2004. С. 36-42.

25. Шпаков А.О. Молекулярные основы функционального сопряжения рецепторов и ГТФ-связывающих белков // Биол. мембраны. 1995а. Т. 12. С. 453-471.

26. Шпаков А.О. Поиск гомологичных последовательностей в первичной структуре долихол-сопряженных ферментов//Ж. эвол. биохим. физиол. 19956. Т. 31. С. 245-257.

27. Шпаков А.О. Гомология первичной структуры третьих цитоплазматических доменов рецепторов родопсинового типа и цитоплазматического хвоста Р-субъединицы инсулинового рецептора // Цитология. 1996а. Т. 38. С. 1179-1190.

28. Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты рецепторов и ГТФ-связывающих белков, определяющие специфичность взаимодействий между ними // Ж. эвол. биохим. физиол. 19966. Т. 32. С. 488-511.

29. Шпаков А.О. Теоретическое и экспериментальное исследование участия аденилатциклазной сигнальной системы в механизме действия инсулина и родственных пептидов // Автореферат кандидатской диссертации. Санкт-Петербург, 1996в. 20 с.

30. Шпаков А.О. Структурные элементы молекул ГТФ-связывающих белков и эффекторов, опосредующие сопряжение между ними // Укр. биохим. ж. 1997. Т. 69. С. 320.

31. Шпаков А.О. Структурно-функциональная характеристика гетеродимерных фосфатидилинозитол-3-киназ и молекулярные механизмы их сопряжения с другими компонентами сигнальных систем // Цитология. 1999а. Т. 41. С. 975-991.

32. Шпаков А.О. Спирали с гептадной периодичностью в цитоплазматических доменах мембранно-связанных форм аденилатциклаз и их возможная роль во взаимодействии с другими компонентами аденилатциклазной сигнальной системы // Цитология. 19996. Т. 41. С. 667-674.

33. Шпаков А.О. Роль онкогенных G-белков в развитии опухолей эндокринной системы // Вопр. онкологии. 2001. Т. 47. С. 160-167.

34. Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты в рецепторах серпантинного типа, ответственные за их функциональное сопряжение с гетеротримерными G-белками // Цитология. 2002а. Т. 44. С. 242-258.

35. Шпаков А.О. Роль Ру-димеров ГТФ-связывающих белков в процессах передачи гормонального сигнала // Ж. эвол. биохим. физиол. 20026. Т. 38. С. 512-529.

36. Шпаков А.О. Участие заряженных аминокислотных остатков цитоплазматических петель серпантинного типа в процессе передачи гормонального сигнала // Ж. эвол. биохим. физиол. 2003. Т. 38. С. 205-217.

37. Шпаков А.О. Структурно-функциональная организация сопряженных с G-белками сигнальных систем амебы Dictyostelium discoideum II Ж. эвол. биохим. физиол. 2006. Т. 42. С. 426-444.

38. Шпаков А.О. Рецепторы серпантинного типа и гетеротримериые G-белки дрожжевых грибов: структурно-функциональная организация и молекулярные механизмы действия // Ж. эвол. биохим. физиол. 2007а. Т. 43. С. 3-23.

39. Шпаков А.О. Структурно-функциональная организация аденилатциклаз одноклеточных эукариот// Цитология. 20076. Т. 49. С. 91-106.

40. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Власов Г.П. Молекулярные механизмы взаимодействия поликатионных пептидов с G-белками // Докл. РАН. 2005а. Т. 405. С. 270-273.

41. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Власов Г.П., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы взаимодействия поликатионных пептидов с рецепторами серпантинного типа и гетеротримерными G-белками в тканях крыс // Ж. эвол. биохим. физиол. 2006а. Т. 42. С. 321-327.

42. Шпаков А.О., Деркач К.В., Перцева М.Н. Гормональные системы низших эукариот// Цитология. 20036. Т. 45. С. 223-234.

43. Шпаков А.О., Корольков В.И., Власова Е.Н., Афонина М.П., Власов Г.П. Влияние синтетических катионных пептидов на активацию аденилатциклазной сигнальной системы биогенными аминами в мышечных тканях моллюсков и крыс // Цитология. 2001. Т. 43. С. 483-490.

44. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А. Влияние тиолов и блокаторов сульфгидрильных групп на негативную регуляцию аденилатциклазной сигнальной системы биогенными аминами // Ж. эвол. биохим. физиол. 2000а. Т. 36. С. 293-297.

45. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы изменения чувствительности аденилатциклазиой сигнальной системы к биогенным аминам при стрептозотоциновом диабете // Бюл. экспер. биол. 2005д. Т. 140. С. 286-290.

46. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Структурно-функциональная характеристика ГТФ-связывающих белков беспозвоночных животных // Ж. эвол. биохим. физиол. 1993. Т. 29. С. 635-653.

47. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Структурно-функциональная характеристика Ру-субъедипиц G-белков и молекулярные механизмы их сопряжения с другими компонентами систем сигнальной трансдукции // Ж. эвол. биохим. физиол. 1997. Т. 33. С. 669-688.

48. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Молекулярные основы функционального сопряжения белков компонентов инсулиновой сигнальной системы // Усп. биол. химии. 1999а. Т. 39. С. 141-186.

49. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Использование пептидной стратегии для изучения молекулярных механизмов передачи гормонального сигнала в клетку // Ж. эвол. биохим. физиол. 2005. Т. 41. С. 389-403.

50. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы действия мастопарана на G-белки в тканях позвоночных и беспозвоночных животных // Бюл. экспер. биол. 2006. Т. 141. С. 273-277.

51. Шпаков А.О., Плеснева С.А., Кузнецова JI.A. Роль сульфгидрильпых групп цистеина в активации аденилатциклазной сигнальной системы биогенными аминами в тканях моллюсков и крыс // Ж. эвол. биохим. физиол. 20006. Т. 36. С. 92-96.

52. Шпаков А.О., Плеснева С.А., Кузнецова J1.A., Леонтьева Е.А. Инсулинрегулируемая аденилатциклазная сигнальная система в клеточной культуре фибробластов мыши линии L // Ж. эвол. биохим. физиол. 2003е. Т. 39. С. 438-444.

53. Шпаков А.О., Плеснева С.А., Кузнецова Л.А., Перцева М.Н. Исследование функциональной организации нового аденилатциклазного сигнального механизма действия инсулина // Биохимия. 20026. Т. 67. С. 403-412.

54. Acharya S., Saad Y., Karnik S.S. Transducin-a C-terminal peptide binding site consists of C-D and E-F loops ofrhodopsin II. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 6519-6524.

55. Albrizio S., D'Ursi A., Fattorusso C., Galoppini C., Greco G., Mazzoni M.R., Novellino E., Rovero P. Conformational studies on a synthetic C-terminal fragment of the a subunit of Gs proteins // Biopolymers. 2000. V. 54. P. 186-194.

56. Amatruda T.T., Dragas-Graonic S., Holmes R., Perez H. D. Signal transduction by the formyl peptide receptor: studies using chimeric receptors and site-drected mutagenesis // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 28010-28013.

57. Aris L., Gilchrist A., Rcns-Domiano S., Meyer C., Schatz P.J., Dratz E.A., Hamm H.E. Structural requirements for the stabilization of metarhodopsin II by the С terminus of the a subunit of transducin // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 2333-2339.

58. Bach Т., Syversvecn Т., Kvingedal A.M., Krobert K.A., Brattclid Т., Levy F.O. 5-HT4a and 5-HT4b receptors have nearly pharmacology and are both expressed in human atrium and ventricle // Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 2001. V. 363. P. 146-160.

59. Baker D.A., Kelly J.M. Structure, function, and evolution of microbial adenylyl and guanylyl cyclases // Mol. Microbiol. 2004. V. 52. P. 1229-1242.

60. Bakker R.A., Casarosa P., Timmerman H., Smit M.J., Leurs R. Constitutively active Gq/. ]-coupled receptor enable signaling by co-expressed Gj/0-coupled receptors // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 5152-5161.

61. Bartsch О., Bartlick В., Ivell R. Relaxin signalling links tyrosine phosphorylation to phosphodiesterase and adenylyl cyclase activity // Mol. Hum. Reprod. 2001. V. 7. P. 799-809.

62. Begin-Heick N. Liver p-adrenergic receptors, G proteins, and adenylyl cyclase activity in obesity-diabetes syndromes//Am. J. Physiol. 1994. V. 266. P. 1664-1672.

63. Berclovitz M., Le Roith D., von Schenk H., Ncwgaard C., Szabo M., Frohmann M., Shiloach J., Roth J. Somatostatin-like immunoreactivity and bioactivity is native to Tetrahymena pyriformis// Endocrinology. 1982. V. 110. P. 1939-1944.

64. Blahos J., Fischer Т., Brabct I., Stauffer D., Rovelli G., Bockacrt J., Pin J.P. A novel site on the G-protein that recognizes heptahelical receptors // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 32623269.

65. Bourrct R.B., Borkovich K.A., Simon M.J. Signal transduction pathways involving protein phosphorylation in prokaryotes//Ann. Rev. Biochem. 1991. V. 60. P. 401-441.

66. Breitweg-Lehmann E., Czupalla C., Storm R., Kudlacck O., Schunack W., Frcissmuth M., Nurnberg B. Activation and inhibition of G protein by lipoamines // Mol. Pharmacol. 2002. V.61.P. 628-636.

67. Bretwieser G.E. G protein-coupled receptor oligomerization: implications for G protein activation and cell signalling// Circ. Res. 2004. V. 94. P. 17-27.

68. Broadley K.J., Nederkoorn P.H., Timmerman H., Timms D., Davies R.H. The ligand-receptor-G-protein ternary complex as a GTP-synthase // J. Theor. Biol. 2000. V. 205. P. 297320.

69. Brown L.S., Dioumaev A.K., Lanyi J.K., Spudich E.N., Spudich J.L. Photochemical reaction cycle and proton transfers in neurospora rhodopsin // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 32495-32505.

70. Brugge J.S. New intracellular targets for therapeutic drug design // Science. 1993. V. 260. P. 918-919.

71. Brzostowski J.A., Kimmcl A.R. Signaling at zero G: G-protein-independent functions for 7-TM receptors//Trends Biochem. Sci. 2001. V. 26. P. 291-297.

72. Bulseco D.A., Schimcrlik M.T. Single amino acid substitutions in the гпг muscarinic reccptor alter receptor/G protein coupling without changing physiological response // Mol. Pharmacol. 1996. V. 49. P. 132-141.

73. Chabre M. Aluminofluoride and beryllofluoride complexes: new phosphate analogs in enzymology // Trends in Biochem. Sci. 1990. V. 50. P. 6-10.

74. Cheung A.H., Huang R.C., Graziano M.P., Stradcr C.D. Specific activation of Gs by synthetic peptides corresponding to an intracellular loop of the p-adrcncrgic receptor // FEBS Lett. 1991. V. 279. P. 277-280.

75. Cheung A.H., Sigal I.S., Dixon R.A.F., Strader C.M. Agonist-promoted sequestration of the P2-adrenergic receptor requires regions involved in functional coupling with Gs // Mol. Pharmacol. 1989. V. 35. P. 132-138.

76. Chidiac P. Rethinking receptor-G protein-effector interactions // Biochem. Pharmacol. 1998. V. 55. P. 549-556.

77. Chou P.Y., Fasman G.D. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence // Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1978. V. 47. P. 45-148.

78. Christensen S.T., Guerra C.F., Awan A., Whcatley D.N., Satir P. Insulin receptor-like proteins in Tetrahymena thermophila ciliary membranes // Curr. Biol. 2003. V. 13. P. 50-52.

79. Christophc J. Glucagon receptors: from genetic structure and expression to effector coupling and biological responses//Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1241. P. 45-57.

80. Clawgcs H.M., Dcprcc K.M., Parker E.M., Graber S.G. Human 5-HTj receptor subtypes exhibit distinct G protein coupling behaviors in membranes from Sf9 cells // Biochemistry. 1997. V.36. P. 12930-12938.

81. Cohen J.E., Onyike C.U., McElroy V.L., Lin A.H., Abrams T.W. Pharmacological characterization of an adenylyl cyclase-coupled 5-HT receptor in aplysia: comparison with mammalian 5-HT receptors // J. Neurophysiol. 2003. V. 89. P. 1440-1455.

82. Conklin B.R., Farfer Z., Lustig K.D., Julius D., Bowrne H.R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gq to that Gj // Nature. 1993. V. 363. P. 274-276.

83. Cotecchia S., Ostrowski J., Kjelsberg M.A., Caron M.G. Lefkowitz R.J. Discrete amino acid sequences of the ai-adrenergic receptor determine the selectivity of coupling to phosphatidylinositol hydrolysis//J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 1633-1639.

84. Coppi A., Merali S., Eichinger D. The enteric parasite Entamoeba uses an autocrine catecholamine system during differentiation into the infectious cyst stage // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 8083-8090.

85. Covic L., Gresser A.L., Talavera J., Swift S., Kuliopulos A. Activation and inhibition of G protein-coupled receptors by cell-penetrating membrane-tethered peptides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002a. V. 99. P. 643-648.

86. Covic L., Misra M., Badar J., Singh C., Kuliopulos A. Pepducin-based intervention of thrombin-receptor signaling and systemic platelet activation //Nat. Med. 2002b. V. 8. P. 11611165.

87. Cox R.T.L., Walker R.J. An analysis of the inhibitory responses of dopamine and octopamine on Helix central neurons//Сотр. Biochem. Physiol. 1988. V. 91. P. 541-547.

88. Csaba G. Phylogeny and ontogeny of hormone receptors: the selection theory of receptor formation and hormonal impriting // Biol. Rev. (Cambridge). 1980. V. 55. P. 47-63.

89. Csaba G. The unicellular Tetrahymena as a model cell for receptor research // Intern. Rev. Cytol. 1985. V. 95. P. 327-377.

90. Csaba G., Kovacs P. Insulin uptake, localization and production in previously insulin treated and untreated Tetrahymena. Data on the mechanism of hormonal imprinting // Cell. Biochem. Funct. 2000. V. 18. P. 161-167.

91. Csaba G., Kovacs P., Falus A. Human cytokines interleukin (IL)-3 and IL-6 affect the growth and insulin binding of the unicellular organism Tetrahymena II Cytokine. 1995. V. 7. P. 771-774.

92. Csaba G., Kovacs P., Pallinger E. Hormonal interactions in Tetrahymena'. effect of hormones on levels of epidermal growth factor (EGF) // Cell Biol. Int. 2005. V. 29. P. 301-305.

93. Cypess A.M., Unson C.G., Wu C.R., Sakmar T.P. Two cytoplasmic loops of the glucagon receptor are required to elevate cAMP of intracellular calcium // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 19455-19464.

94. Davey J. G-protein-coupled receptors: new approaches to maximize the impact of GPCRs in drug discovery // Exp. Opin. Ther. Targets. 2004. V. 8. P. 165-170.

95. Dincer D.U., Bidasee K.R., Guner S., Tay A., Ozcelikay Т., Altan V.M. The effect of diabetes on expression of Pr, P2- and Рз-adrenoreceptors in rat hearts // Diabetes. 2001. V. 50. P. 455-461.

96. Duerson K., Carroll R., Clapham D. a-Helical distorting substitution disrupt between m3 muscarinic receptor and G proteins // FEBS Lett. 1993. V. 324. P. 103-108.

97. Dursi A.M., Albrizio S., Greco G., Mazzeo S., Mazzoni M.R., Novellino E., Rovero P.

98. Conformational analysis of the Gas protein C-terminal region // J. Pept. Sci. 2002. V. 8. P. 476488.

99. Eichinger L., Pachebat J.A., Glockner G., Rajandream M.A., Sucgang R., Berriman M., Song J., Olsen R., Szafranski K., Xu Q. The genome of the social amoeba Dictyostelium discoideum // Nature. 2005. V. 435. P. 43-57.

100. Eisenschlos C., Flawia M.M., Torruella M., Torres H.N. Interaction of Trypanosoma cruzi adenylate cyclase with liver regulatory factors // Biochem. J. 1986. V. 236. P. 185-191.

101. Flawia M.M., Torres H.N. Adenylate cyclase activity in Neurospora crassa: modulation by glucagon and insulin // J. Biol. Chem. 1973. V. 248. P. 4517-4520.

102. Floyd P.O., Li L., Rubakhin S.S., Sweedler J.V. Insulin phohormone processing, distribution, and relation to metabolism in Aplysia californica // J. Neurosci. 1999. V. 19. P. 7732-7741.

103. Frederick J., Eichinger D. Entamoeba invandens contains the components of a classical adrenergic signaling system // Mol. Biochem. Parasitol. 2004. V. 137. P. 339-343.

104. Fujimoto I., Ikcnaka K., Kondo Т., Aimoto S., Kuno M., Mikoshiba K. Mast cell degranulating peptide and its optical isomer activate GTP-binding protein in rat mast cells // FEBSLett. 1991. V. 287. P. 15-18.

105. Fukushima N., Kohno M., Kato Т., Kawamoto S., Okuda K., Misu Y., Ueda H. Melittin, a metabostatic peptide inhibiting Gs activity// Peptides. 1998. V. 5. P. 811-819.

106. Galperin M.Y. Bacterial signal transduction network in a genomic perspective // Environ. Microbiol. 2004. V. 6. P. 552-567.

107. Gauthier С., Tavcrnicr G., Charpentier F., Langin D., Le Marec H. Functional Рз-AR in the human heart//J. Clin. Invest. 1996. V. 98. P. 556-562.

108. Gawler D., Milligan G., Spiegel A.M., Unson C.G., Houslay M.D. Abolition of expression of inhibitory guanine nucleotide regulatory protein G; activity in diabetes // Nature. 1987. V. 327. P. 229-232.

109. Gerhard C.C., Bakker R.A., Piek G.J., Planta R.J., Vreugdenhil E., Leysen J.E., van Heerikhuizen H. Molecular cloning and pharmacological characterization of a molluscan octopamine receptor//Mol. Pharmacol. 1997. V. 51. P. 293-300.

110. Gill G.N., Walton G.M. Assay of cyclic nucleotide-dependent protein kinase // Adv. Cycl. Nucl.Res. 1979. V. 10. P. 93-106.

111. Goldsmith L.T., Weiss G., Palcjwala S. Mechanism of action of relaxin human cervix. In: Tregear G. W., Ivell R., Bathgate R.A., Wade J.D., eds. Relaxin-2000. Dordrecht-Boston-London: Kluwer Acad. Publ., 2001. P. 285-289.

112. Gunnersen J.M., Fu P., Roche P.J., Tregear G.W. Expression of human relaxin genes: characterization of a novel alternatively-spliced human relaxin mRNA species // Mol. Cell. Endocrinol. 1996. V. 118. P. 85-94.

113. Gupta B.B.P. Mechanism of insulin action // Curr. Sci. 1997. V. 73. P. 993-1003.

114. Guiramand J., Montmayeur J.P., Geraline J., Bhatia M., Borteli E. Alternative splicing of the dopamine receptor directs specificity of coupling to G proteins // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 7354-7358.

115. Hadjiconstantinou M., Qu Z.K., Moroi-Fetters S.E., Neff N.H. Apparent loss of Gj protein activity in the diabetic retina// Eur. J. Pharmacol. 1988. V. 149. P. 193-194.

116. Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity // Brain Res. 1975. V. 93. P. 485-489.

117. Hamm H.E. The many faces of G protein signaling // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 669672.

118. Harashima Т., Heitman J. Ga subunit Gpa2 recruits kelch repeat subunits that inhibit receptor-G protein coupling during cAMP-induced dimorphic transitions in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Biol. Cell. 2005. V. 16. P. 4557-4571.

119. Hashim S., Li Y., Nagakura A., Takeo S., Anand-Srivastava M.B. Modulation of G-protein expression and adenylyl cyclase signaling by high glucose in vascular smooth muscle // Cardiovasc. Res. 2004. V. 63. P. 709-718.

120. Hashim S., Li Y.Y., Wang R., Anand-Srivastava M.B. Streptozotocin-induced diabetes impairs G-protein linked signal transduction in vascular smooth muscle // Mol. Cell. Biochem. 2002. V. 240. P. 57-65.

121. Hayataka K., O'Connor M.F., Kinzler N., Weber J.T., Parker K.K. A bioactive peptide from the transmembrane 5-intracellular loop 3 region of the human 5HTia receptor // Biochem. Cell. Biol. 1998. V. 76. P. 657-660.

122. Herrmann R., Heck M., Hcnklein P., Henklein P., Kleuss C., Hofmann K.P., Ernst O.P.

123. Sequence of interactions in receptor-G protein coupling//J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 2428324290.

124. Higashijima Т., Burnier J., Ross E.M. Regulation of Gj and G0 by mastoparan, related amphiphilic peptides and hydrophobic amines // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 14176-14186.

125. Hill S.J. G-protein-coupled receptors: past, present and future // Br. J. Pharmacol. 2006. V. 147. P. 27-37.

126. Hiripi L., Juhos S., Downer R.G. Characterization of tyramine and octopamine receptors in the insect (Locusta migratoria migratorioides) brain // Brain Res. 1994. V. 633. P. 119-126.

127. Hoffman C.S. Except in every detail: comparing and contrasting G-protein signaling in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomycespombe II Eukaryot. Cell. 2005. V. 4. P. 495503.

128. Hofmann K.P. Signalling states of photoactivated rhodopsin //Novartis Found. Symp. 1999. V. 224. P.158-175.

129. Hollingsworth M., Rudkin S., Douning S. Myometrial relaxant action of relaxin. In: Tregear G.W., Ivell R., Bathgate R.A., Wade J.D., eds. Relaxin-2000. Dordrecht-Boston-London: Kluwer Acad. Publ., 2001. P. 291-299.

130. Houslay M.D., Milligan G. Tailoring cAMP signaling responses through isoform multiplicity // Trends Biochem. Sci. 1997. V. 22. P. 217-224.

131. Hsu S.Y. New insights into the evolution of the relaxin-LGR signaling system // Trends Endocrinol. Metab. 2003. V. 14. P. 303-309.

132. Hsu S.Y., Nakabayashi K., Nishi S., Kumagai J., Kudo M., Sherwood O.D., Hsueh A.J. Activation of orphan receptors by the hormone relaxin // Science. 2002. V. 295. P. 671-674.

133. Hsu S.Y., Semyonov J., Park J.I., Chang C.L. Evolution of the signaling system in relaxin-family peptides// Ann. N.Y. Acad. Sci. USA. 2005. V. 1041. P. 520-529.

134. Jin H., Nip S., O'Dowd B.F., George S.R. Di dopamine receptor activity is not altered by a mutation in the first intracellular loop // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1402. P. 165-170.

135. Jonas E.A., Knox R.J., Kaczmarek L.K., Schwartz J.H. Insulin receptor in Aplysia neurons: characterization, molecular cloning, and modulation of ion currents // J. Neurosci. 1996. V. 16. P. 1645-1658.

136. Jost P., Fasshauer M., Kahn C.R., Benito M., Meyer M., Ott V., Lowell B.B., Klein H.H., Klein J. Atypical p-adrenergic effects on insulin signaling and action in (Зз-adrenoreceptor-deficient brown adipocytes // Am. J. Physiol. 2002. V. 283. P. 146-153.

137. Kallal L., Kurjan J. Analysis of the receptor binding domain of Gpalp, the Ga subunit involved in the yeast pheromone response pathway // Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 2897-2907.

138. Kasahara M., Unno Т., Yashiro K., Ohmori M. CyaG, a novel cyanobacterial adenylyl cyclase and a possible ancestor of mammalian guanylyl cyclases // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 10564-10569.

139. Kawamura K., Sudo S., Kumagai J., Pisarska M., Hsu S.Y., Bathgate R., Wade J., Hsueh

140. A.J. Relaxin research in the postgenomic era//Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005. V. 1041. P. 1-7.

141. Kidwai A.M., Radcliffe A.M., Lee E.V., Daniel E.E. Isolation and properties of skeletal muscle membrane // Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 289. P. 593-607.

142. Kimura K.D., Tissenbaum H.A., Liu Y., Ruvkun G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans И Science. 1997. V. 277. P. 942946.

143. Konig В., Gratzcl M. Site of dopamine Di receptor binding to Gs protein mapping with synthetic peptides // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1223. P. 261-266.

144. Koos R.D., Pillai S.B. Intersection of the relaxin and estrogen signaling pathways in the uterus II In: Tregear G.W., Ivell R., Bathgate R.A., Wade J.D., eds. Relaxin-2000. Dordrecht-Boston-London: Kluwer Acad. Publ., 2001. P. 101 -108.

145. Krupinski J., Lehman T.C., Frankenfield C.D., Zwaagstra J.C., Watson P.A. Molecular diversity of the adenylyl cyclase // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 24858-24862.

146. Kulkarni R.D., Thon M.R., Pan H., Dean R.A. Novel G-protein-coupled receptor-like proteins in the plant pathogenic fungus Magnaporthe grisea // Genome Biol. 2005. V. 6. R24.

147. Kusunoki H., Wakamatsu K., Sato K., Miyazawa Т., Kohno T. G protein-bound conformation of mastoparan-X //Biochemistry. 1998. V. 37. P. 4782-4790.

148. Kuznetsova L., Plesneva S., Derjabina N., Omeljaniuk E., Pertseva M.N. On the mechanism of relaxin action: the involvement of adenylyl cyclase signalling system // Regul. Peptides. 1999. V. 80. P. 33-39.

149. Kuznetsova L., Plesneva S., Shpakov A., Pertseva M. Functional defects in insulin and relaxin adenylyl cyclase signaling systems in myometrium of pregnant women with type 1 diabetes // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005. V. 1041. P. 446-448.

150. Kuznetsova L., Shpakov A., Rusakov Yu., Plesneva S., Bondareva V., Pertseva M.

151. Page S.L., Bi Y., Williams J.A. The CCK receptor activates RhoA through Gai2/i3 in NIH3T3 cells//Am. J. Physiol. 2003. V. 285. P. 1197-1206.

152. Roith D., Liotta A.S., Roth J., Shiloach J., Lewis M.E., Pert C.B., Krieger D.T. ACTH and р-endorphin like molecules are native to unicellular organisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 2080-2090.

153. Macda S., Lameh J., Mallet W.F., Philip M., Ramachandran J., Sadee W. Internalization of the Hml muscarinic cholinergic receptor involves the third cytoplasmic loop // FEBS Lett. 1990. V. 269. P. 386-388.

154. Malbon C.C. Insulin signalling: putting the "G-" in protein-protein interactions // Biochem. J. 2004. V. 380. P. 11-12.

155. Malmberg A., Strange P.G. Site-directed mutations in the third intracellular loop of the serotonin 5-HTia receptor alter G-protein coupling from G; to Gs in a ligand-dependent manner // J. Neurochem. 2000. V. 75. P. 1283-1293.

156. Manahan C.L., Iglesias P.A., Long Y., Devrcotcs P.N. Chemoattractant signaling in Dictyostelium discoideum H Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2004. V. 20. P. 223-253.

157. Marin E.P., Krishna A.G., Zvyaga T.A., Isele J., Siebert F., Sakmar T.P. The amino terminus of the fourth cytoplasmic loop of rhodopsin modulates rhodopsin-transducin interaction // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 1930-1936.

158. Mathi S.K., Chan Y., Li X., Wheeler M.B. Scanning of the glucagon-like peptide-1 receptor localizes G protein-activating determinants primarily to the N terminus of the third intracellular loop// Mol. Endocrinol. 1997. V. 11. P. 424-432.

159. Matsuda N., Hattori Y., Gando S., Akaishi Y., Kemmotsu O., Kanno M. Diabetes-induced down-regulation of pi-AR mRNA expression in rat heart // Biochem. Pharmacol. 1999. V. 58. P. 881-885.

160. McCaman M.W. Noncatecholic phenylethylamines: octopamine and phenylethanolamine in the central nervous system of Aplysia / Eds. Mosnaim A.D. and Wolff M.A., NY: Marcel Dekker Inc., 1980. Part 2. P. 193-200.

161. McCudden C.R., Hains M.D., Kimple R.J., Siderovski D.P., Willard F.S. G-protein signaling: back to the future // Cell Mol. Life Sci. 2005. V. 62. P. 551-557.

162. McCue L.A., McDonough K.A., Lawrence C.E. Functional classification of cNMP-binding proteins and nucleotide cyclases with implications for novel regulatory pathways in Mycobacterium tuberculosis II Genome Res. 2000. V. 10. P. 204-210.

163. Mclntire W.E., MacCIeery G., Garrison J.C. The G protein p subunit is a determinant in the coupling of Gs to the Pi-adrenergic and A2a adenosine receptors // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P.15801-15809.

164. Megaritis G., Merkouris M., Georgoussi Z. Functional domains of 5- and ц-opioid receptors responsible for adenylyl cyclase inhibition // Receptors Channels. 2000. V. 7. P. 199-212.

165. Micttinen H.M., Gripentrog J.M., Mason M.M., Jesaitis A.J. Identification of putative sites of interaction between the human formyl peptide receptor and G protein // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 27934-27942.

166. Milligan G. Techniques used in the identification and analysis of function of pertussis toxin-sensitive guanine nucleotide binding proteins // Biochem. J. 1988. V. 255. P. 1-13.

167. Miura S., Zhang J., Karnik S.S. Angiotensin I type 1 receptor-function affected by mutations in cytoplasmic loop CD // FEBS Lett. 2000. V. 470. P. 331-335.

168. Moench S.J., Moreland J., Stewart D.H., Dewey T.G. Fluorescence studies of the location and membrane accessibility of the palmitoylation sites to rhodopsin // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 5791-5796.

169. Morizumi Т., Imai H., Shichida Y. Two-step mechanism of interaction of rhodopsin intermediates with the C-terminal region of the transducin a-subunit // J. Biochem. (Tokyo). 2003. V. 134. P. 259-267.

170. Mousli M., Bronner C., Landry Y., Bockaert J., Rouot B. Direct activation of GTP-binding regulatory proteins (G proteins) by substance P and compound 48/80 // FEBS Lett. 1990. V. 259. P. 260-262.

171. Moxham C.M., Malbon C.C. Insulin action impaired by deficiency of the G-protein subunit Gia2 // Nature. 1996. V. 379. P. 840-844.

172. Mukhopadhyay S., Howlett A.C. CBi receptor-G protein association. Subtype selectivity is determined by distinct intracellular domains // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 499-505.

173. Murray-Rust J., Macleod A.N., Blundell T.L., Wood S.P. Structure and evolution of insulins: amplifications for receptor binding// BioEssays. 1992. V. 14. P. 325-331.

174. Natarajan K., Ashley C.A., Hadwiger J.A. Related Ga subunits play opposing roles during Dictyostelium development // Differentiation. 2000. V. 66. P. 136-146.

175. Natochin M., Moussaif M., Artcmyev N.O. Probing the mechanism of rhodopsin-catalyzed transduction activation//J. Neurochem. 2001. V. 77. P. 202-210.

176. Natochin M., Muradov K.G., McEntaffer R.L., Artemycv N.O. Rhodopsin recognition by mutant Gas containing C-terminal residues of transducin // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 26692675.

177. Neer E.J., Smith T.F. G protein heterodimers: new structures propel new questions // Cell. 1996. V. 84. P. 175-178.

178. Nguyen B.T., Yang L., Sanborn B.M., Dessauer C.W. Phosphatidylinositol 3-kinase activity is required for biphasic stimulation of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate by relaxin // Mol. Endocrinol. 2003. V. 17. P. 1075-1084.

179. Novotny J., Gustafson В., Ransnas L.A. Inhibition of P-adrenergic receptor-mediated signals by a synthetic peptide derived from the a subunit of the stimulatory G-protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 219. P. 619-624.

180. Nurnberg В., Togel W., Krause G., Storm R., Breitweg-Lehmann E., Schunack W. Non-peptide G-protein activators as promising tools in cell biology and potential drug leads // Eur. J. Med. Chem. 1999. V. 34. P. 5-30.

181. Obosi L.A., Hen R., Beadle D.J., Bermudez I., King L.A. Mutational analysis of the mouse 5-HT7 receptor: importance of the third intracellular loop for receptor-G protein interaction // FEBS Lett. 1997. V. 412. P. 321-324.

182. Okamoto Т., Nishimoto I. Detection of G protein-activator regions in 1П4 subtype muscarinic cholinergic and ci2-adrenergic receptors based upon characteristics in primary structure // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 8342-8346.

183. Okamoto J., Okamoto Т., Murayama Y., Hayashi Y., Ogata E., Nishimoto I. GTP-binding protein-activator sequences in the insulin receptor // FEBS Lett. 1993. V. 334. P. 143-148.

184. Okuda A., Matsumoto O., Akaji M., Taga Т., Ohkudo Т., Kobayashi Y. Solution structure of intracellular signal-transducing peptide derived from human Рг-adrenergic receptor // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 291. P. 1297-1301.

185. Olivcira M.M., Antunes A., De Mello F.G. Growth of Trypanosoma cruzi epimastigotes controlled by shifts in cyclic AMP mediated by adrenergic ligands // Mol. Biochem. Parasitol. 1984. V. 11. P. 283-292.

186. Panchenko M.P., Hoffenberg S.I., Tkachuk V.A. Purification and some properties of GTP-binding proteins from pig heart plasma membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 46. P. 452-455.

187. Patel T.B. Single transmembrane spanning heterotrimeric G protein-coupled receptors and their signaling cascades // Pharmacol. Rev. 2004. V. 56. P. 371-385.

188. Paveto C., Egidy G., Galvagno M.A., Passeron S.A. Guanine nucleotide-sensitive glucagon-stimulated adenylyl cyclase in Candida albicans: effect of glucagon on cell morphology// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. V. 167. P. 1177-1183.

189. Pertseva M.N. The evolution of hormonal signalling systems // Сотр. Biochem. Physiol. 1991. V. 100. P. 775-787.

190. Pertseva M.N., Plesneva S.A., Shpakov A.O., Rusakov Yu.I., Kuznetsova L.A.1.volvement of adenylyl cyclase signalling system in the action of insulin and mollusc insulinlike peptide//Сотр. Biochem. Physiol. 1995. V. 112. P. 689-695.

191. Pertseva M., Shpakov A., Kuznetsova L., Plesneva S., Omeljaniuk E. Adenylyl cyclase signaling mechanisms of relaxin and insulin action: similarities and differences // Cell Biol. Int. 2006. V. 30. P. 533-540.

192. Pertseva M.N., Shpakov A.O., Plesneva S.A., Kuznetsova L.A. A novel view on the mechanisms of action of insulin and other insulin superfamily peptides: involvement of adenylyl cyclase signaling system // Сотр. Biochem. Physiol. 2003. V. 134. P. 11-36.

193. Pieroni J.P., Harry A., Chen J., Jacobowitz O., Magnusson R.P., Iyengar R. Distinct characteristics of the basal activities of adenylyl cyclases 2 and 6 // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 21368-21373.

194. Pitt S., Vehovszky A., Szabo H., Elliott C.J. Second messengers of octopamine receptors in the snail Lymnaea If Acta Biol. Hung. 2004. V. 55. P. 177-183.

195. Raisley В., Zhang M., Hereld D., Hadwiger J.A. A cAMP receptor-like G protein-coupled receptor with role in growth regulation and development // Dev. Biol. 2004. V. 265. P. 433-445.

196. Reisine T. Pertussis toxin in the analysis of receptor mechanisms. Biochem. Pharmacol. 1990. V. 39. P. 1499-1504.

197. Rezaei K., Saar K., Soomets U., Valkna A., Nasman J., Zorko M., Akcrman K., Schroeder Т., Bartfai Т., Langel U. Role of third intracellular loop of galanin receptor type 1 in signal transduction // Neuropeptides. 2000. V. 34. P. 25-31.

198. Rodriqucz E., Lazaro M.I., Renaud F.L., Marino M. Opioid activity of P-endorphin-Iike proteins from Tetrahymena // J. Eukaryot. Microbiol. 2004. V. 51. P. 60-65.

199. Roeder T. Octopamine in invertebrates // Prog. Neurobiol. 1999. V. 59. P. 533-561.

200. Roelofs J., Snippe H., Kleineidam R.G., Van Haastert P.J. Guanylate cyclase in Dictyostelium discoideum with the topology of mammalian adenylate cyclase // Biochem. J. 2001. V. 354. P. 697-706.

201. Roovers E., Vincent M.E., van Kesteren E., Geraerts W.P., Planta R.J., Vreugdenhil E., van Hccrikhuizcn H. Characterization of a putative molluscan insulin-related peptide receptor // Gene. 1995. V. 162. P. 181-188.

202. Salomon Y., Londos C., Rodbell M.A. Highly sensitive adenylate cyclase assay // Anal. Biochem. 1974. V. 58. P. 541-548.

203. Sanborn B.M., Dodge K.L., Yue C., Ku C.Y. Relaxin and scaffolding proteins in signaling crosstalk. In: Tregear G.W., Ivell R., Bathgate R.A., Wade J.D., eds. Relaxin-2000. Dordrecht-Boston-London: Kluwer Acad. Publ., 2001. P. 279-283.

204. Sato M., Blumer J.B., Simon V., Lanier S.M. Accessory proteins for G proteins: partners in signaling// Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2006. V. 46. P. 151-187.

205. Schicss N., Csaba G., Kohidai L. Chemotactic selection with insulin, di-iodotyrosine and histamine alters the phagocytotic responsiveness of Tetrahymena II Сотр. Biochem. Physiol. 2001. V. 128. P. 521-530.

206. Schultz J.E., Klumpp S. Cyclic nucleotides and calcium signaling in Paramecium II Adv. Second Messenger Phosphorylation Res. 1993. V. 27. P. 25-46.

207. Schwabe C., Le Roith D., Thompson R.D., Shiloach J., Roth J. Relaxin extracted from protozoa (Tetrahymena pyriformis) И J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 27778-2781.

208. Schwartz T.W., Frimurer T.M., Hoist В., Roscnkilde M.M., Elling C.E. Molecular mechanism of 7TM receptor activation a global toggle switch model // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2006. V. 46. P. 481-519.

209. Scebcck Т., Gong K., Kunz S., Schaub R., Shalaby T. and Zoraghi R. cAMP signalling in Trypanosoma brucei // Int. J. Parasitol. 2001. V. 31. P. 491-498.

210. Shipilov V.N., Shpakov A.O., Rusakov Yu.I. Pleiotropic action of insulin-like peptides of mollusk Anodonta cygnea II Ann. N.Y. Acad. Sci. (Trends in Comparative Endocrinology and Neurobiology). 2005. V. 1040. P. 464-465.

211. Shirai H., Takahashi K., Katada Т., Inagami Т. Mapping of G protein coupling sites of the angiotensin II type 1 receptor// Hypertension. 1995. V. 25. P. 726-730.

212. Shpakov A.O. Molecular basis of the functional coupling of receptors to GTP-binding proteins // Membr. Cell Biol. 1996. V. 9. P. 467-488.

213. Shpakov A., Pertseva M., Kuznetsova L., Plesneva S. A novel, adenylate cyclase, signaling mechanism of relaxin H2 action // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005b. V. 1041. P. 305-307.

214. Smit A.B., Kesteren R.E., Li K.W., Minnen J., Spijker S. Towards understanding the role of insulin in the brain: lessons from insulin-related signaling systems in the invertebrate brain // Progr. Neurobiol. 1998. V. 54. P. 35-54.

215. Sossin W.S., Diaz-Arrastia R., Schwartz J.H. Characterization of two isoforms of protein kinase С in the nervous system of Aplysia californica // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 57635768.

216. Srinivasan J., Gundersen R.E., Hadwiger J.A. Activated G subunits can inhibit multiple signal transduction pathways during Dictyostelium development // Dev. Biol. 1999. V. 215. P. 443-452.

217. Strassheim D., Palmer Т., Houslay M.D. Genetically acquired diabetes adipocyte guanine nucleotide regulatory protein expression and adenylate cyclase regulation // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1096. P. 121-126.

218. Sun Q.Q., Dale N. G-proteins are involved in 5-HT receptor-mediated modulation of N- and P/Q- but not T-type Ca2+ channels // J. Neurosci. 1999. V. 19. P. 890-899.

219. Sunahara R.K., Taussig R. Isoforms of mammalian adenylyl cyclasc: Multiplicities of signaling // Mol. Interv. 2002. V. 2. P. 168-184!

220. Sweet M.T., Carlson G., Cook R.G., Nelson D., Allis C.D. Phosphorylation of linker histones by a protein kinase Л-like activity in mitotic nuclei // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 916-923.

221. Takahara H., Fujimura M., Tanigichi S., Hayashi N., Nakamura Т., Fujimiya M.

222. Changes in serotonin levels and 5-HT receptor activity in duodenum of streptozotocin-diabetic rats // Am. J. Physiol. 2001. V. 281. P. 798-808.

223. Tanaka Т., Kohno Т., Kinoshita S., Mukai H., Itoh H., Ohya M., Miyazawa Т., Higashojima Т., Wakamatsu K. a-helix content of G protein a-subunit is decreased upon activation by receptor mimetics // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 3247-3252.

224. Taussig R., Gilman A.G. Mammalian membrane-bound adenylyl cyclases // J. Biol.Chem. 1995. V. 270. P. 1-4.

225. Taylor J.M., Neubig R.R. Peptides as probes for G protein signal transduction // 1994. V. 6. P. 841-849.

226. Tesmer J.J.G., Sunahara R.K., Gilman A.G., Sprang S.R. Crystal structure of the catalytic domains of adenylyl cyclase in a complex with Gsa-GTPyS // Science. 1997. V. 278. P. 19071916.

227. Thcvclein J.M., de Winde J.H. Novel sensing mechanisms and targets for the cAMP-protein kinase Л pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Mol. Microbiol. 1999. V. 33. P. 904918.

228. Thompson M.D., Burnham W.M., Cole D.E. The G protein-coupled receptors: pharmacogenetics and disease//Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2005. V. 42. P. 311-392.

229. Van Poycr W., Torfs H., Poels J., Swinnen E., De Loof A., Akcrman K., Van den Broeck

230. J. Phenolamine-dependent adenylyl cyclase activation in Drosophila Schneider 2 cells // Insect Biochem. Mol. Biol. 2001. V. 31. P. 333-338.

231. Wade S.M., Dalman H.M., Yang S., Neubig R.R. Multisite interactions of receptors and G proteins: enhanced potency of dimeric receptor peptides in modifying G protein function // Mol. Pharmacol. 1994. V.45. P. 1191-1197.

232. Wakamatsu K., Okada A., Miyazawa Т., Ohya M., Higashijima T. Membrane-bound conformation of mastoparan-X, a G-protein-activating peptide // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 5654-5660.

233. Weber J.H., Vishnyakov A., Hambach K., Schultz A., Schultz J.E., Linder J.U. Adenylyl cyclases from Plasmodium, Paramecium and Tetrahymena are novel ion channel/enzyme fusion proteins // Cell. Signal!. 2004. V. 16. P. 115-125.

234. Weber L.P., MacLeod K.M. Influence of streptozotocin diabetes on the alpha-1 adrenoreceptor and associated G proteins in rat arteries // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. V. 283. P. 1469-1478.

235. Wess J. Molecular basis of receptor/G protein-coupling selectivity // Pharmacol. Ther. 1998. V. 80. P.231-264.

236. Wettschureck N., Offcrmanns S. Mammalian G proteins and their cell type specific functions // Physiol. Rev. 2005. V. 85. P. 1159-1204.

237. Wichelhaus A., Russ M., Petersen S., Eckel J. G protein expression and adenylate cyclase regulation in ventricular cardiomyocytes from STZ-diabetic rats // Am. J. Physiol. 1994. V. 267. P. 548-555.

238. Wilson M., Burt A.R., Milligan G., Anderson N.G. Wortmannin-sensitive activation of p70S6K by endogenous and heterologously expressed Gj-coupled receptors // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 8537-8540.

239. Winslow J.W., Shih A., Bourcll J.H., Weiss G., Reed В., Stults J.T., Goldsmith L.T. Human seminal relaxin is a product of the same gene as human luteal relaxin // Endocrinology. 1992. V. 130. P. 2660-2668.

240. Wu D., Jiang H., Simon M.I. Different ai-adrenergic receptor sequences required for activating different Ga subunits of Gq class of G proteins // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 98289832.

241. Xue Y., Batlle M., Hirsch J.P. GPR1 encodes a putative G protein-coupled receptor that associates with the Gpa2p Ga subunit and functions in a Ras-independent pathway // EMBO J. 1998. V. 17. P. 1996-2007.

242. Yang C.S., Spudich J.L. Light-induced structural changes occur in the transmembrane helices of the Natronobacterium pharaonis Htrll transducer // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 14207-14214.

243. Yano H., Nakanishi S., Kimura K., Hanai N., Saitoh Y., Fukui Y., Nonomura Y., Matsuda Y. Inhibition of histamine secretion by wortmannin through the blockage of phosphoinositol 3-kinase in RBL-2H3 cells // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 25846-25856.

244. Zhang C.C. Bacterial signalling involving eukaryotic-type protein kinases // Mol. Microbiol. 1996. V. 20. P. 9-15.

245. Zhang L., Wu J., Ruan K.H. Solution structure of the first intracellular loop of prostacyclin receptor and implication of its interaction with the C-terminal segment of Gas protein // Biochemistry. 2006. V. 45. P. 1734-1744.

246. Zheng X.L., Guo J., Wang H.Y., Malbon C.C. Expression of constitutively activated Gja2 in vivo ameliorates streptozotocin-induced diabetes // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 2364923651.

247. Zhu B.H., Sakai Y. Alteration of contractile properties to serotonin in gastric smooth muscle isolated from STZ-induced diabetic rats // J. Smooth Muscle Res. 1996. V. 32. P. 165-173.