Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение GTP-связывающих белков, аденилатциклазы и гуанилатциклазы в клетках крови больных коронарным атеросклерозом

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гуманова, Надежда Георгиевна, Москва

X

Министерство здравоохранения РФ Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины

На правах рукописи

Гуманова Надежда Георгиевна

Изучение СТР-связывающих белков, аденилатциклазы и гуанилатциклазы в клетках крови больных коронарным

атеросклерозом

03.00.04. - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

д.б.н. Метельская В.А

Научный консультант:

к.м.н. Ахмеджанов Н.М.

Москва - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................................................................7

GTP-связывающие белки, аденилатциклаза и гуанилатциклаза.................................................................7

1. Характеристика GTP-связывающих белков.................................................................................................8

1.1. Олигомерные G-белки..............................................................................................................................10

1.1.1. а-Субъединица олигомерных (гетеротримерных) G-белков................................................................11

1.1.2. Ру-Субъединицы гетеротримерных G-белков.......................................................................................12

1.1.3. Группа олигомерных G-белков, устойчивых к действию коклюшного токсина..................................13

1.2. Мономерные G-белки...............................................................................................................................13

1.2.1. Группа SDS-устойчивых G-белков........................................................................................................16

1.3. Взаимодействие G-белков с гуаниновыми нуклеотидами.......................................................................17

1.4. Механизм гидролиза GTP........................................................................................................................18

1.5. Механизм активации G-белков рецептором...............,.-....:..................................................................18

1.6. Механизм активации эффектора..............................л......................... ..................................................19

1.6.1. Семейство RGS-белков..........................................................................................................19

1.7. Функции G-белков....................................................................................................................................19

1.7.1. Биологическая роль пренилирования в нормальном функционировании G-белков............................24

1.8. Идентификация G-белков.........................................................................................................................25

1.8.1. ADP-рибозилирование G-белков...........................................................................................................26

1.8.2. ADP-рибозилирование G-белков под действием микробных токсинов...............................................26

2. Аденилатциклазная система.......................................................................................................................27

3. Гуанилатциклаза (ГЦ).................................................................................................................................29

3.1. Структура доменов рГЦ и их функции....................................................................................................30

3.2. Механизм активации рГЦ........................................................................................................................30

3.3. СО-зависимая активация рГЦ..................................................................................................................31

3.4. Регуляция экспрессии и активности рГЦ.................................................................................................31

3.5. Модуляция ферментативной активности рГЦ лекарственными препаратами........................................31

4. G-белки в эритроцитах человека.................................................................................................................32

Атерогенез...........................................................................................................................................................34

1. Повреждения сосудов и коронарный атеросклероз....................................................................................35

2. Развитие атеросклероза...............................................................................................................................36

3. Тромбоциты и их роль в фиброзной организации пристеночных тромбов................................................37

4. Патогенез вазоконстрикции........................................................................................................................38

5. Роль разрыва бляшек и тромбообразование в развитии коронарной болезни...........................................40

6. Роль G-белков при различных патологиях сердечно-сосудистой системы................................................41

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................................................................................44

1. Объект исследования...................................................................................................................................44

1.1. Первая группа...........................................................................................................................................45

1.2 Вторая группа............................................................................................................................................45

2. Препаративные методы исследования........................................................................................................46

2.1. Выделение эритроцитов и получение мембран........................................................................................46

2.2. Выделение тромбоцитов и получение мембранной и растворимой фракции..........................................47

2.3. Получение препарата АЦ.........................................................................................................................47

3. Аналитические методы исследования.........................................................................................................47

3.1. Определение активности Gs-белка в мембранах эритроцитов................................................................47

3.2. [32Р]ADP-рибозилирование мембран эритроцитов под действием холерного и коклюшного токсина. .49

3.3. Электрофорез в ПААГ в присутствии SDS и получение количественных результатов..........................51

3.4. Определение GTP-связывающей активности белка G27K (Ral) в мембранах эритроцитов...................51

3.5. Определение активности аденилатциклазы в мембранах тромбоцитов.................................................53

3.6. Определение активности растворимой гуанилатциклазы в цитозоле тромбоцитов................................54

3.7. Определение активности ГАФД в цитозоле тромбоцитов.......................................................................54

3.8. Определение количества ГАФД в цитозоле тромбоцитов методом иммуноблоттинга..........................55

3.9. Реактивы, радиоиммунные исследования содержания гормонов и липидов..........................................55

4. Статистика...................................................................................................................................................56

РЕЗУЛЬТАТЫ........................................................................................................................................................57

1. Исследование (5-белков в мембранах эритроцитов...................................................................................57

1.1. Исследование высокомолекулярных в-белков в мембранах эритроцитов.............................................57

Данные представлены в виде среднее+стандартная ошибка..........................................................................61

1.2. Исследование низкомолекулярного О-белка с м.м. 27кДа в мембранах эритроцитов...........................62

2. Исследование активностей аденилатциклазы в мембранах тромбоцитов, растворимой формы гуанилатциклазы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) и ее содержания в цитозоле тромбоцитов........................................................................................................................................................64

2.1. Измерения активности АЦ в мембранах тромбоцитов............................................................................65

2.2. Измерение активности растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) в цитозоле тромбоцитов.........................68

2.3. Измерение активности и содержания глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) в цитозоле тромбоцитов больных коронарным атеросклерозом......................................................................................69

ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................................................................................................71

Заключение..........................................................................................................................................................76

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................................78

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................................................79

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЦ - аденилатциклаза

ГАФД - Б-глицеральдегид-З-фосфат дегидрогеназа (КФ 1.2.2.12)

ГЦ - гуанилатциклаза

ДТТ - дитиотреитол

ИБС - ишемическая болезнь сердца

КТ - коклюшный токсин

ПААГ - полиакриламидный гель

рГЦ - растворимая гуанилатциклаза

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ХТ - холерный токсин

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

027К - мономерный О-белок с м.м. 27 кДа

(л - ингибирующий О-белок

00 - О-белок нервной ткани

ОррЫНр - гуанилил-(р,у-имидо)-дифосфат Ов - стимулирующий О-белок

01 - трансдуцин

СТРу8 - гуанозин-(5'-у-тио)трифосфат НМО-СоА - З-гидрокси-З-метилглутаршьСоА КОБ-белки - О- белки, регуляторы сигнальной функции БОБ - додецилсульфат натрия

ВВЕДЕНИЕ

Атеросклероз коронарных сосудов является одним из главных факторов патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний и продолжает сохранять печальное первенство, как причина смертности не только в России (Оганов, 1990), но и во всем мире (WHO-MONICA Project, 1994). Несмотря на значительные успехи в области изучения атерогенеза, борьба с атеросклерозом осложняется отсутствием четких представлений о его механизмах на молекулярном уровне. Исследования последних 20 лет показали, что в основе процессов, обусловливающих многообразные проявления атеросклеротических поражений на клеточном уровне, лежат нарушения сигнал-передающих систем, наблюдаемые при различных сердечно-сосудистых заболеваниях. В ряде работ было установлено, что изменения количества и активности компонентов систем трансмембранной передачи сигнала, в особенности, связанных с метаболизмом циклических нуклеотидов и играющих ключевую роль в детерминировании того или иного типа патологических нарушений клеточной активности, могут являться одной из основных причин инициации или прогрессирования атеросклеротического процесса. В многочисленных экспериментальных исследованиях отечественных и зарубежных авторов описаны изменения уровня циклических нуклеотидов и функциональной активности систем их синтеза в различных органах и тканях при атеросклерозе у людей и животных (Сперанская и соавт., 1976; Тертов и соавт., 1989; Tertov et al., 1987а; Tertov et al., 1987b; Tertov et al., 1987c; Тертов и соавт., 1984; Anwaar et al., 1998; Luoma et al., 1997; Anwaar et al., 1996; He et al., 1993; Galle et al., 1992; Кабаева и соавт., 1992; Tertov et al., 1986a; Tertov et al., 1986b; Бобкова и соавт., 1980; Герасимова, 1977). Главным образом, исследованию на предмет отклонений в передачи гормонального сигнала подвергались ткани сердца, либо сосудов. Наряду с этим, одной из важных составляющих развития атеросклеротических повреждений является тромбоз. Тромбы способны усугублять имеющиеся повреждения сосудов, способствуют их сужению вплоть до окклюзии, и таким образом, приводят к нестабильной стенокардии, инфаркту миокарда или внезапной смерти. Известно, что при коронарном атеросклерозе отмечены значительные нарушения агрегации тромбоцитов, включая их повышенную реактивность и адгезию. В связи с этим была поставлена задача выяснить, какие именно нарушения сигнал-передающих систем на уровне сигнальных GTP-связывающих белков и регулируемых ими систем-генераторов вторичных мессенджеров - циклических нуклеотидов - имеют место при коронарном атеросклерозе. В качестве объекта исследования были выбраны тромбоциты, непосредственно вовлеченные в атерогенез, с целью выявления механизмов нарушения их чувствительности при атеросклерозе. Кроме

того возникает вопрос, имеются ли подобные отклонения в других клетках, в частности, таких, как эритроциты, которые напрямую не участвуют в атерогенезе. Обнаружение дефектов сигнал-передающих систем в клетках, не вовлеченных в развитие патологического процесса, позволило бы с определенной долей вероятности допустить возможность аналогичных явлений и в других интактных тканях, что свидетельствовало бы о комплексном и системном характере происходящих в организме нарушений. Исходя из масштабного представления о дисбалансе сигнал-передающих систем при коронарном атеросклерозе можно было бы наметить дальнейшие пути для их фармакологической коррекции и предупреждения ранних стадий атерогенеза.

Тактим образом, цель работы состояла в исследовании GTP-связывающих белков, аденилатциклазы и гуанилатциклазы в клетках крови больных коронарным атеросклерозом. Достижение поставленной цели включало ряд задач: определение уровня и активности высокомолекулярных G-белков (Gi и Gs), регуляторов аденилатциклазы, в мембранах эритроцитов; определение уровня низкомолекулярного G-белка Ral в мембранах эритроцитов; определение активности аденилатциклазы в мембранах тромбоцитов, а также, определение активности растворимой формы гуанилатциклазы в цитозоле тромбоцитов у больных коронарным атеросклерозом.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Часть I

GTP-связывающие белки, аденилатциклаза и гуанилатциклаза

Сотни химических и физических стимулов регулируют функции эукариотических клеток, контролируя активность на удивление малого количества основных сигнальных единиц, которые необходимы для адаптации и приумножения разнообразия ответных реакций клетки. Наиболее распространенные из этих единиц, по крайней мере в клетках млекопитающих, представляют собой системы из трех белковых комплексов, состоящие из элемента, распознающего сигнал (рецептора), сигнального генератора (эффектора), и элемента, от которого зависит активность эффектора, то есть

гуаниннуклеотидсвязывающего белка, обозначаемого GTP-связывающим белком. В общей сложности, в клетках млекопитающих содержатся сотни рецепторов, сопряженных с GTP-связывающими белками (G-белками) и десятки эффекторов. Определить точное количество различных по функциям G-белков довольно трудно, поскольку не вполне выяснено значение гетерогенности составляющих их а-, (3- и у-субъединиц, обеспечиваемое возможными комбинациями 16 а-, 5 0-, и по меньшей мере, 12 у -субъединиц (Berman, Gilman, 1998).

При различных патологических процессах, таких как ишемическая болезнь сердца, диабет, холера и многих других наблюдаются изменения в количестве и функционировании G-белков, при этом происходят изменения в регулируемых ими процессах, например, ионной проницаемости мембран, каталитической активности цитоплазматического домена рецептора, внутриклеточной концентрации вторичных мессенджеров, которые влияют на состояние клетки. Во всех этих процессах тем или иным образом принимают участие различные эффекторные системы, которые генерируют внутриклеточный сигнал в ответ на взаимодействие гормона с рецептором. G-белки осуществляют сопряжение в случае аденилатциклазы (АД) и (3-адренергических рецепторов, а также других типов адренорецепторов, ацетилхолиновых, пептидных рецепторов и многих других; сопряжение cGMP-фосфодиэстеразы и родопсина, фосфолипазы С и а-адренергического рецептора (Hurley, 1999).

Все виды мембранных АЦ активируются Gs (стимулирующим)-белком; Gi -белок -ингибитор активности АЦ. Таким образом, оба G-белка принимают непосредственное

участие в регуляции образования продукта ферментативной активности АЦ, вторичного мессенджера - сАМР, запускающего большое количество внутриклеточных реакций.

G-белки являются предметом интенсивного изучения многих лабораторий. Применение методов молекулярной биологии позволило установить тканевую специфичность G-белков. Они экспрессируются всеми типами клеток. Свойства G-белков могут зависеть от функционального назначения ткани (Birnbaumer et al.,1987).

Интенсивные исследования G-белков привели к накоплению большого количества материала по структуре G-белков, механизму сопряжения с рецептором и эффекторами, роли в течении того или иного патологического процесса. Растет число ранее неизвестных G- белков, пополняющих уже существующие семейства, а также составляющих новые группы с особыми свойствами и структурой. 1. Характеристика GTP-связывающих белков.

Условно GTP-связывающие белки можно объединить в семейство регуляторных GTP-гидролаз. Анализ кристаллических структур этих белков обнаруживает общие черты в их строении и полипептидной последовательности, благодаря чему можно предполагать общее эволюционное происхождение этих белков (Sprang, 1997). G-белки образуют относительно стабильный комплекс со своим субстратом, GTP и продуктами. У G-белков имеется консервативный участок узнавания гуаниловых нуклеотидов, хотя в механизме гидролиза GTP существуют некоторые различия, в частности, в диссоциации олигомерных G-белков на а- и ру-субъединицы. Во всех G-белках связывание и гидролиз GTP вызывает конформационные изменения в каталитическом домене. Комплексы с GTP и GDP определяют соответственно активное и неактивное состояние эффектора.

Семейство G-белков характеризует общий механизм действия. Механизм передачи гормонального сигнала на эффекторную систему представлен на схеме (рис. 1), предложенной Гилманом (Gilman, 1987) и дополненной в 1998г (Berman, Gilman, 1998).

Согласно этой модели, при связывании гормона (Н) и рецептора (R) образуется H:R-комплекс, способный взаимодействовать с G-белком (G.GDP), в результате происходит замена GDP на GTP и, как следствие этого, диссоциация комплекса H:R:G:GTP на Н, R, Got :GTP и (Зу. Gra :GTP способна регулировать эффекторные системы. При гидролизе GTP комплексом G:GTP:E, образуется G :GDP, который реассоциирует с (Зу с образованием G:GDP, завершая цикл.

Недавно было обнаружено семейство белков, которое отрицательно регулирует Ga субъединицу. Его назвали RGS (регуляторы сигнальной функции G-белков). RGS-белки являют