Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение процесса диссоциации Gs-белка из мембран

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение процесса диссоциации Gs-белка из мембран"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА., ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

Юркова Мария Сергеевна

УДК 577. 151. 04: 577. 152. 421.

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ДИССОЦИАЦИИ О -БЕЖА ИЗ МЕМБРАН

В

03. 00. 04. - Биохимия

.АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор Е.С.Северин

Официальные оппоненты: . доктор биологических наук . Н.Б.Ливанова

канд. Сиологических наук В.0.Рыбин

учреадение - Институт Биологической и Медицинской химии АМН СССР

состоится "_"_1991 г. в *_" часов на

заседании Специализированного Совета Д. 053.05.32 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: г. Москва П98Э9, Ленинские горы, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан __1991 г.

Ведущее

Защита

, Ученый секретарь Специализированного Совета, к.б.н.

Ю.Н.Лейкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Аденилатциклаза ' (АТР-пирофосфат-лиаза циклизувдая Е.С. 4.6.T.I) представляет собой сложный комплекс, состоящий из одного или нескольких рецепторов, регуляторных GTP-связывакщих белков (с-белков) и собственно каталитического компонента.. Основная функция адекилатциклазного комплекса заключается в передаче гормонального сигнала внутрь клетки. До недавнего • времени полагали, что такая передача осуществляется только за счет изменения активности каталитического компонента аденилатциклаза, и, как следствие, изменения внутриклеточной концентрации сАМР. Сравнительно недавно было показано, что а-субъединица активирующего белка аденилатцикдазы, о ,-также как и а-субъединииы других G-белков, способна диссоциировать из мембраны в раствор при активации соответствующего с-белка. Это позволяет предполагать, что а-субъединицы G-белков могут являться самостоятельными первичными мессендкерами (Rodbell, 1985).

Известно таккэ, что состояние цитоскелета оказывает виша на функционирование аденилатциклазной системы. Была показана ассоциация как а -субъединицы," так и ^-комплекса с цатоскелетом. Однако параметры процесса диссоциации а3-субъединицы из мембраны или цитоскелета в раствор изучены не были.

В литературе описан ряд методик выделения G-белков из мембран различных клеток. Эти методики состоят в экстракции мембран под действием холата натрия и последующей очистке G-белков различными хроматографичесюши методами. Однако попытки очистить растворимый G-белок, диссоциирующий из мембран, ' в отсутствие детергента, к настоящему времени не известны. Следовательно, изучение закономерностей диссоциации а8-субъединицы из мембран в раствор и

взаимосвязи этого процесса с активацией ов-белка, а также выделение растворимого <зв-бвлка, представляются своевременными и актуальными.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании особенностей процесса диссоциации св-белка из мембран эритроцитов человека.

В данной роботе предусматривалось решение следующих задач:

Получение препарата частично очищенного каталитического компонета адниелатциклазы, позволяющего производить функциональное тестирование ав-белка.

Исследование действия фторид-иона и негидролизуемых аналогов гуаниловых нуклеотидов на солюоилизацию активности а -балка.

О

Исследование локализации в' мембране эритроцитов человека активности с -белка."

о

Выделение ов-Селка путем его избирательной солюбилизации.

Научная новизна работы. В ходе настоящей работы были подобраны условия для осуществления реконструкции в фосфолипидных везикулах аденилатциклазы из хвостатых ядер мозга быка и од-белка из мембран эритроцитов человека.

В работе впервые изучены параметры процесса диссоциации а-еубъединицы Св-белка из мембран в раствор под действием активаторов, 'таких как фторид-ион и гуаниловые нуклеотида, и показано их совпадение с параметрами активации вд-белка. Показано также, что около 50% й^-бвжа связано с фракцией цитоскелета, разрушающегося при обработке раствором с низкой ионной силой.

Оригинальным является предложенный метод очистки с^-Овжа. Первая стадия выделения, ионообменная хроматография, проведена в отсутствие детергента.

Практическое значение работы. Практическая ценность работы

состоит .в том, что предложенный в ной метод выделения Gg-белка позволяет получить высокоочищенный препарат белка за 3 хромэтографическиэ стадии. В результате выделения белок очищен в 120 раз по сравнению с исходным экстрактом. По сравнению с известной методикой- (Hanski, Gilman, 1982), включающей в себя ... экстракцию под действием холата натрия и 6 хроматоГрафических стадий, предлагаемый метод более прост и удобен.

Полученннв в работе данные подтвервдают теорию действия гормонов на клетки, предложенную Родбеллом (Rodbell, 1985, Rodbell, 1987). Согласно этой теории, а-субъединкцы G-белков являются первичными мессенднерами ц способны передавать гормональный ■ сигнал внутрь клетки, диссоциируя из мембраны в гщтоплазму при активации. Полученные данные расширяют представления о функционировании регуляторного бежа аденилатциклазной системы.

Апробация работы.. Результаты работы доложены на коллоквиуме кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на 4 Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, 1988).

Публикации. ПО теме диссертации опубликовано 3 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения и обсуждения результатов, еыводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит -Í01 страниц машинописного текста, 5 таблиц и 13 рисунков. Список • литературы включает i9? источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ "АТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение препарата адепилатцихлазы. Для получения частично

-з-

очищенного препарата каталитического компонента аденилатциклазй, отделенного от Gs, 5-7 г хвостатых ядер размораживали в 3-хкратном ■ объеме трис-HCl буфера, рН 7,6, содержащего 0,2 М сахарозу, 15 мМ MgClg, I мМ ДТТ. Ткань гомогенизировали с помощью гомогенизатора Поттера , добавляли сульфат аммония до концентрации 0,84 М, холат натрия до концентрации 0,4$ и инкубировали 20 каш, затем центрифугировали при 100 ООО g в течение 40 мин. Полученный супернатант наносили на колонку с Сефарозой 6В , уравновешенную буфером, содержащим 50 мМ трис-HCl, рН 7,Б, 1,2 М сульфат аммония, 0,2 М сахарозу, 14 мМ холат натрия, 15 мМ MgCl2, I мМ ДТТ, 3,5 мг/мл фосфатидилхолина. Элюцию проводили тем же буфером. Фракции, содержащие максимальную активность аденилатциклазы, определяемую в присутствии 100 мкМ форсколина, объединяли. Полученные 35 мл препарата концентрировали на мембрана Amioon РМ-ЗО до 9 мл, добавляли I мл раствора фосфатидилхолина (10 мг/мл) и обессоливали на колонке с Сефадексом G-50, уравновешенной буфером, содержащим 20 ш Na-HEPES, рН 7,5, I мМ ЭДГА, 100 MM NaCl.

Получение мембран эритроцитов. Мембраны эритроцитов человека выделяли известным способом (Hanski, Gilman, 1982) из эритромассы различных • групп крови.

Тени эритроцитов человека выделяли также в аналитических целях в 5 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,8 (Dolge et al, 1963).

. Экстракция мембран эритроцитов. Для проведения экстракции мембраны эритроцитов размораживали, суспендировали в 5 объемах 20 мМ трис-HCl буфера, рН 7,8, I мМ ЭДГА, I мМ ДТТ (ТЭД-буфера), содержащего 20 мМ NaCl, и центрифугировали в течение 40 мин при 22000 g. Затем мембра.^ обрабатывали 2 объемами ТЭД-буфе^а, ,содержащего I М NaCl. После центрифугирования в течение 40 мин

при 22000 g осадок мембран суспендировали в 5 объемах ТЭД-буфэра, содержащего 0,2 М сахарозу, и центрифугировали в тех кэ условиях. К полученному осадку добавляли ГЗД-буфер, содержался 0,2 М сахарозу и 100 мМ Nací, до исходного объема, прогревали до комнатной температуры, добавляли фторид натрия в виде раствора АИР (конечные концентрации А1С13 20 мкМ, )ígCl2 10 мМ, NaP Ю мМ) и инкубировали 30 мин при 25°С. Аналогично мембраны обрабатывали ОррИНр или GTP7S в присутствии 10 мМ Mgci2 в указанных концентрациях и временных интервалах. Мембраны контрольной группы инкубировали в присутствии 10, мМ MgCl2 без активаторов. По окончании времени инкубации суспензию мембран центрифугировали в течение So мин при 30000 g. После центрифугирования в супернатанты контрольных проб добавляли активаторы до заданных конечных концентраций.

Для экстракции Gs растворами с низкой ионной силой I мл суспензии мембран диализовали против I л 0,1 мМ ЭДТА, pH 8,0, I мМ ДТТ при 4°С в течение 16 час с одной сменой диализуюцего раствора. Аналогичные операции проводили с мембранами контрольной группы, но вместо 0,1 мМ ЭДТА использовали ТЭД-буфер, содержащий 100 мМ NaCl. По окончании диализа суспензию мембран центрифугировали в течение I часа при 30000 g, и в супернатанты опытных проб добавляли компонента буферного раствора, а также в супернатанты всех проб добавляли AMP.

Определение реконструирующей активности. В ходе настоящей работы были подобраны условия для осуществления реконструкции в фасфолишдных везикулах аденитатциклази из хвостатых ядер мозга быка и Сд-белка из эритроцитов человека. Аликвоты препат эта частично очищенной аденилатциклазй размораживали и добавляли

указанные вещества до конечной концентрацш:сульфат аммония 0,4 М, ДГТ 2 мМ, MgCl2 20 мМ, а также активаторы отбелка до их конечной концентрации - Aicij го мкМ и Naï 10 мМ, или GppNHp 100 мкМ, или GTP7S 10 мкМ. . 15 мкл полученного препарата предактивированной аденилатциклаза смешивали с 10 мкл раствора белка, исследуемого на реконструирующую активность. Реакцию начинали внесением 25 мкл инкубационной смеси, содержащей 100 Ш трис-HOl, pH 8,0, 5 ' M CAMP, 0,2 Ш ATP, 2 MM З-изобутил-1-метижсантин, 0,8 мг/мл креатинфосфокиназы, 20 Ш креатинфосфат и (а-32Р]-АТР (2,5-6,0 х Ю5 имп/мин). Инкубацию проводили при 30°С 90 мин. Определение количества образовавшегося

оо

{Р]-сАМР проводили по методу, предложенному Саломоном с сотр. (Salomon et al., 1975).

Определение белка. Белок определяли по цветной реакции с амидовым черным (Schaffner, Weiesman, 1973).

Электрофорез в полиакриламидном геле. Электрофорез проводили в непрерывной системе по методу Лэммли (Laenmli, 1970) в 10%-ном полиакриламидном геле толщиной 0,7 ш при силе тока 25 мА. По окончании электрофореза гель фиксировали в 50%-ноы этаноле, 2*-ном глицерине й 10£-ной уксусной кислота в течэние 16 час (Chaudhuri, Green, 1987) и окрашивали серебром по методу Рея (Wray et al., 1981). Электрофорез проводил}! также в градиенте (8-15%) полиакриламидаого геля толщиной 1,5 мм при силе тока 40 мА. В этом случае гель окрашивали Кумасси G-250.

Препарат §7-субъединиц GTP-связыващего белка из мозга быка, G0, был получен сотрудником проблемной лаборатории "Химии ферментов" Поповым К. М. го методу, предложенному Гилмэяом ,(Worthup et al., 1983).

-s-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I ДИССОЦИАЦИЯ в^БЕЛКА. ПОД ДЕЙСТВИИ! АКТИВАТОРОВ

Характеристика препарата аденилатциклазы.

Для тестирования отбелка в растворе в ходе работы был

получен препарат частично очищенного каталитического компонента

аденилатциклазы, позволяющий проводить функциональное

тестирование ав-белка, а также подобраны условия для

осуществления реконструкции в фэсфолипидных . везикулах

аденилатциклазы из хвостатых ядер мозга быка с с^белком из

эритроцитов человека. Препарат каталитического компонента

аденилатциклазы получали, как описано в "Материалах и методах".

Профиль элюции с колонки с Сефарозой СВ представлен на _рнс. I АКТИВНОСТЬ АДЕНиМТ-

Чмп/мии

3000 л ~

«о

2000

то

20 40 во 80 ПОМЕТА ФРАКЦИЙ

Рис. I.. Гельфальтрацяя каталитической субъедшшцы аденилатциклазы на колонке с сефарозой ЕВ. О - активность аденилатциклазы, измеренная в присутствии 100 мкМ форсколина» 5 Ш МпС12 и мМ Н§С12 в среде инкубации, О - поглощение при 280 нм.

Полученный препарат аденилатциклазы обладал свойствами, характерными для каталитического компонента, отделенного от вг (табл. I).

Табл. I. Характеристика препарата аденилатциклазы.

АКТИВАТОРЫ MgCl2 10мМ MgCl2 IOmM JínCl2 5мМ

АДЕНИЛАТ- IOmM Aid, 20ккЫ ФОРСКО- МпС12 5мМ ФОРСКО-

ЦИКЛАЗЫ NaT 10 мМ ЛИН I0"Aí ЛИН Ю_4М

Активность

пмоль сAMP 105 106 823 1016 • 6806

мг мин

Аденилатциклаза не стимулировалась таким активатором GB, как фторид натрия, но обладала способностью к активации под действием ионов iín2t форсколина н их комбинации. По своим свойствам препарат аденилатциклазы аналогичен тому, который был получен Вендор и Нир (Bender, Neer, 1983).

Диссоциация ов-белка под действием amp. Экстракцию Gg-белка из мембран осуществляли под действием акр (конечные концентрации AlClj 20 мкМ. MgCl2 10 Ш, NaP 10 ыЫ). Считают, что комплекс AlfjJ в присутствии ионов Hg2+ имитирует f-фосфатную группу gtp, вызывая активацию G-белков со связанным GDP (Deterre et al., 1987). При добавлении к препарату аденилатциклазы сутрнатанта после центрифугирования мембран эритроцитов в течение I часа при 100 ООО g не было обнаружено существенного повышения активности. Однако если перед центрифугированием мембраны эритроцитов обрабатывали аш\ как описано в "Материалах и методах", супернатант активировал препарат аденилатциклазы (табл. 2). После кипячения супернатанта его способность к активации исчезала. Аналогичные результаты были получены для супернатантов после

Табл. 2. Экстракция ов-белка под действием amp. После инкубации в присутствии ahf мембраны центрифугировали в указанных условиях. В супернатанга контрольных проб добавляли активаторы до заданных конечных концентрация. Супернатанты инактивировали при 100°С в течение 5 мин. Супернатвнты кэ обладали собственной адевилатциклазной активностью.

УСЛОВИЯ". АКТИВНОСТЬ АДЕШШТЩИШЗЫ, пмоль сАМР/мг мив ЭКСТРАКЦИИ- СУПЕРКАТАНТ 10 ООО х g СУПЕРНАТАНТ 30 ООО х g

НАТИВНЫЙ ИНАКТИВИРОВАННЫЙ НАТИВНЫЙ ИНАКТИВИРОВАННЫЙ MgCl2 IOmM 136 105 145 105

MgCl2 IOMM

A1C13 20мкМ 762 106 783 106

Nay IOmM

центрифугирования мембран в течение 20 мин при 30 ооо g, что позволило использовать такие препараты в дальнейших исследованиях.

Оптимальная температура экстракции составляла 25°С. Зависимость количества <18~белка» экстрагируемого под действием АИР, от рН имеет максимум при рН 8,0 и минимум при рН 8,5, последнее, видимо, связано с денатурацией аз-белка.

Увеличение времени инкубации мембран в присутствии amf более 30 мин не приводило к дальнейшему выходу бв-белка из мембран, однако экстракцию под действием AMF можно было повторять последовательно несколько раз, при этом количество Gg-белка в экстрактах последовательно уменьшалось (табл. 3). Это явление можно, вероятно, объяснить существование?* равновесия в распределении активированного Gg-белка между липидной и водной Фазами.

Табл. 3. Последовательные экстракции Св-белка из мембра! вритроцитоз человека под действием AMP. • N ЭКСТРАКЦИИ РЕКОНСТРУИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ

ЭКСТРАКТА, пмоль/мг мин

1 75,2

2 60,1

3 53,5

4 -46,7

Обработка мембран перед экстракцией I М Nací не приводила к уменьшению реконструирующей активности супернатантов, т.е. под действием I М NaCl не происходит заметного высвобождения 06-белка из мембран, хотя из литературы известно, что растворы с высокой ионной силой экстрагируют многие периферические мембранные белки (Fairbanks et al., 1971). В то же время повышение ионной силы i среде, содержащей AMP, способствует высвобождению из ыембрш реконструирующей активности. Оптимальные условия экстракции (I0C мМ NaCl, 0,2 М сахароза) близки к физиологическим, поэтому можш предполагать, что и в клетке часть выбелка способна переходит! при активации в цитоплазму.

Диссоциация Gg-белка под действием гуаниловых нуклеотидов.

При изучении действия на мембраны эритроцитов негидролизуемых аналогов gtp. таких, как GppNHp и GTPfS, было показано, что появление в супернатанте реконструирующей активности нелинейно зависит от времени (рис. 2). В течение 30 мин наблюдается лаг-фаза, характерная для активации сБ-белка. При активации се-бблка в присутствии аналогов СТР наличие лог-фазы обусловлено медленной диссоциацией связанного GDP из центра связывания .гуаниловых нуклеотидов (Levitzki, 1986). После лаг-фазы сдедуе-

Рис. 2. Зависимость экстракции Gg-белка из мембран под действием негидролизуемых аналогов OTP от времени инкубации. Проба ИНКубИрОВаЛИ ПРИ 30°С В ПРИСУТСТВИИ 10 MM MgClg И 100 Ш f GppNHp ( О ) или 10 мкМ GTPfS ( В ) указанное время; после центрифугирования супернатанты инкубировали I час для достижения одинаковой степени активации, затем тестировали реконструирующую активность, х- концентрация белка в экстрактах.

значительное увеличение эффекта и, наконец, постоянный уровень 'реконструирующей активности через 1,5-2 часа инкубации. Посла активации суперкатантов контрольных проб под действием аналогов GT7 их реконструирующая активность вставилась близкой к базальному уровнр Появление общего белка в супернатанте линейно зависит от времени, поскольку гуаниловые нуклеотида вызывают солюбилизаютю

части связанных с мембранами белков, что согласуется с данными по изучению действия негидролизуемых аналогов GTP на мембраны нейтрофилов кролика (Huang, Devanney, 1986). Однако, хотя появление общего белка в супернатанте линейно зависит от времени, зависимость экстракции сб-белка имеет более сложный характер и обладает указанными характерными чертами. Эти данные говорят о специфичности экстракции Ов-бвлка под действием гуаниловых нуклеотидов.

Зависимость количестве экстрагируемого Ов-белка от концентрации СррШр в условиях максимальной активации изображена

на рис.3. ......

Рис. 3. Зависимость АКТИВНОСТЬ, ЛМОАЬ

экстракции выбелка мг-МИН из мембран от концен- §Q треади оррШр. Пробы

инкубировали при 30 С

АО

в присутствии 10 мМ м«С1г и указанных концентраций СррШр в те- ВО чение 3 часов. После центрифугирования в су-^ пернотанты добавляли .ОррШр до концентрации

40

100 мкМ„ активировали I V час при 37°С, затем определяли реконструирующую активность.

J5 ¿¡[Gppi

Концентрация GppNHp, при которой наблюдается полумаксимальная экстракция активности ов-белка, равна 9 х 1СГ7 М. Это значение соответствует константе активации очищенного Gg-белка из мембран эритроцитов человека, равной II х Ю-7 М (Haneki, Oilman, 1982). Сопоставляя литературные данные о кинетике активации ав-белка и полученные нами результаты, описывающие процесс диссоциации Gs-белка из мембран, можно заключить, что лимитирующей стадией диссоциации 08-белка из мембран является именно связывание гуаниловых нуклоотидов в GTP-евязываицем центра.

Диссоциация ав-Селка под действием растворов с низкой ионной силой.

Экстракция ов-белка из мембран эритроцитов голубя в отсутствие активаторов достигается обработкой мембран раствором с низкой ионной силой (Pfeiufiei\ 1977). Аналогичные результаты были получены в процессе настоящей работы на мембранах эритроцитов человека. После диализа мембран против 0,1 Ш раствора ЭДТА, и последующего центрифугирования в супернатанте появляется около 30« общего мембранного белка, в том числе и белкицитоскелета -споктрин, белок полосы 4.1, актин я др. (рис. 4). Вместе с тем в супернатантах диализованных мембран появляется и значительная реконструирующая активность, составляющая 170-350 пмоль/мг мин. Таким образом, Gg-белок солюбилизаруется раствором с низкой ионной силой вместе с белками цитоскелетэ.

Обработка диализованных и контрольных «ембрвн аыр не вызывала качественных изменений белкового состава супернатантов по сравнению с супернатантами диализованных и контрольных мембран, не обработанных аир (рис. 4). Эти результаты указывают на селективность экстракции g -белка под действием amf. Следует

' « У i $

i.f : - .о .-.л- «t ?Л

1 В

'20J ЯД&

Рис. 4. Электрофорез в градиенте ПААГ экстрактов сделка. После диализа мембраны центрифугировали, осадок повторно экстрагировали 0,1 мМ ЭДТА и получали супернатанты после диализа (5) и после повторной экстракции (6). Мембраны, не подвергавшиеся обработке раствором с низкой ионной силой (3,4), а также мембраны после повторной экстракции 0,1 мМ ЭДТА (1,2) обрабатывали в стандартных условиях amp (2,4) или ТО мМ MgCl2 (1.3).

отметить, что полосу белка, соответствующую по молекулярной массе оЕ-белку, не удается обнаружить из-за малых количеств б3-белка в мембранах клеток.

При экстракт» в аналогичных условиях мембран коры.мозга быка

в раствор переходит существенно меньшее количество с^-белка, реконструирующая активность супернатантов мембран мозга ' составляла лишь около 40 пмоль/мг мин. Полученные данные свидетельствуют о присутствии значительных количеств о0-белка в мембранах эритроцитов человека, ассоциированного с фракцией цитоскелета, разрушающегося под действием растворов с низкой ионной силой.

В результате трех последовательных экстракций предварительно диализованных мембран с помощью 0,1 мМ ЗДТА реконструирующая активность в супернатантах практически исчезала вместе с уменьшением количества белков цигоскелета (рис. 5). Обработка таких мембран аыр приводила к появлению в супернатанте реконструирующей активности, составляющей около 50$ от активности, присутствующей в супернатанте контрольных проб. Получешше результаты свидетельствуют о том, что окало. 50% G -белка, экстрагируемого под действием AMP, не связано с белками цитоскелета, разрушающегося в растворах с низкой ионной силой. Таким образом, возможно предположить существование по крайней мере двух фракций Gg-белка в мембранах эритроцитов человека. Gs-белок в составе одной из этих фракций, вероятно, более прочно связан с той частью цитоскелета, которая экстрагируется под действием 0,1 мМ ЭДГА. аб-белок в составе другой фракции может взаимодействовать с другими компонентами цитоскелета или с интегральными мембранными белками. Такая компартментализация может иметь значение при осуществлении множественного влияния гормонов на-клетку. Под действием amp происходит солюбилизация gg-белка, входящего в состав обеих фракций.

Рис. 5. Экстракция й8-белка из мембран под действием растворов с низкой ионной силой и акр. Мембраны подвергали диализу против 0,1 мМ ЭДТА (I) и трек последовательный экстракциям под действием 0,1 Ш ЭДТА (2,3,4), а зате» обрабатывали ащ (5 - контроль, 6 - аир). 7,8 - активность ffg-белка, экстрагируемого под действием АНР из контрольных мембран (7 - контроль, 8 - акр).

II ВЕДВШШЕ О -БЕЛКА

В

Для получения се-белка» экстрагирующегося из мембран год действием активаторов, в высокоочищенном состоянии и изучения его физико-химических свойств было предпринято выделение растворимого G -белка;

Выделение проводили из 350 мл мэмбран эритроцитов человека с

концентрацией белка около 2 мг/мл. В качестве первой стадии были.

!

проведены 4 последовательные экстракции под действием /йр . Полученные наш результаты свидетельствуют о том, что экстракция под действием АМУ достаточно селективна по отношению к о „-белку (рис. 4), поэтому значительная степень очистки достигается ужа на этой стадии. Полученные супернатанты объединяли ( общий объем 1200 мл) и наноси.™ на колонку с ДЭАЭ-сефацел&м. Инообменная хроматография на ДЗАЗ-сефацеле (рис. G) была поведена в отсутствие детергента.

Рис. 6. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефацеле. © - реконструирующая активность, £3 - поглощение при 280 нм.

Активность сделка вотируется одним несимметричным пиком. Видимо, существование плеча пика связано с тем, что -выделяемый наш белок способен агрегировать с другими белками экстракта в отсутствие детергента. Фракции, содержавшие максимальную реконструирувщюую активность, объединяли (общий объем 150 мл), концентрировали на мембране Aroioon Pli-30 до 5 мл, добавляли раствор холата натрия до концентрации I,"* и наносили на колонку с ультрогелем АсА 44. Профиль злюции предстаьлен на рис. 7. Рис. 7. Гельфильтрация на ультрогелэ АсА 44. © - реконструирующая активность, ЕЗ - поглощение при 280 нм.

20 30 40 50 НОМЕРА

ФРАЩий

Акттиасщ ит/чин

20 30 40 НОМЕРА , ФРАКЦИИ

Рис. 8. Гидрофобная хроматография на фенил-сефарозе СЬ-4В. © реконструирующая активность, Ш - поглощение при ¿80 нм.

Рис. 9. Электрофорез в 10 % ~ — ----------

ПААГ полученного препарата.' -

Гель окрашивали серебром по методу Рея.

т\

-6?Кй А

• 43*4/» -ЗОНДА

По окончании гвльфильтрации фракции, содержавшие максимальную реконструирующую активность, объединяли, добавляли 3 объема ТЭД-буфера, содержащего 0,2 М сахарозу, 0,2 М НаСХ, АЫ? и проводили хроматографию на колонке с фенил-сефарозой сь-4В (рис. 8). . В результате выделения был получен препарат, содержащий 2 полипептида с молекулярными массами 36 и 42 кДа (рис. 9 ), соответствующим мол. массам 0- и а-субьединиц G -белка (Codina et

. О

al., 1984).

Результаты виде летя суммированы в табл. 4.

Табл. 4. Характеристика выделения G^-белка.

СТАДИЯ БЕЛОК, ОБЩАЯ УДЕЛЬНАЯ ОЧИСТКА ВЫХОД,

мг АКТИВНОСТЬ, АКТИВНОСТЬ, %

нмоль/мин нмоль/шш

ИСХОДНЫ- 20,4 5,77 0,283 I 100 ...

ДЭАЭ 2,2 1.8 0,815 2,9 31

УЛЬТРОГЕЛЪ 0,235 2,55 10,86 . 38,3 '44

ФЕНИЛ-

СЕФАРОЗА 0 043 1,47 34,13 120,6 25

При определении активности йа-белка по стадиям выделения концентрацию холата натрия ео всех; пробах доводили до 0,2555, поскольку холат натрия ■ влияет на активность каталитического компонента аденилатциклазы. Реконструирующая активность определялась на участке линейной зависимости от концентрации белка. Очистку и выход считали относительно исходного экстракта.

Метод выделения с8-белка из мембран различных клеток, впервые предложенный Гилманом, состоит в экстракции мембран под действием холата натрия и последующей очистке сБ-белка различными хроматографическими методами. При выделении С3-бэлка из-

-2.0-

эритроцитов человека мембраны экстрагируют 1% раствором холата натрия, содержащего 600 мМ NaCl (высокая концентрация соли необходима для оптимальной экстракции Gg-белка), и, г,о еле обессоливания на колонке с Сефадексом G-25, проводят последовательно ионообменную . хроматографию на ДЭАЭ-сефацеле, гельфильтрацию на ультрогелв АсА 34, -идрофобную хроматографию на гептиламин-сефарозе, повторную ионообменную хроматографию и адсорбционную хроматографию на гвдроксилапатите Таким образом, очистка G -белка из исходного солюбшшзатз включает 6 стадий

S

(Hanskl, G liman, 1982). Гомогенный белок, полученный в

результате, очищен в . 2990 peí по сравнению с исходным солюбияизатом.

Предлагаемый в данной работе способ получения Се-белка из мембран эритроцитов человека более прост и удобен: очистка в 120 раз по сравнению с исходным экстрактом за 3 хроматографические стадии практически до гомогенного состояния. Использование низглд концентраций NACI (100 Ш) на стадии экстракции позволяет осуществлять ионообменную хроматограф™ на ДЭАЭ-сефацеле без предварительного обессоливания . экстракта. Специфичность экстракции Gg-белка из мембран под действием активаторов позволяет добиться значительной очистки уке на стадии экстракции. Выделение то методу Гилмана проводится в присутствии детергентов. Детергенты могут вызывать нарушения взаимодействия субъединиц G-белков друг с другом и компонентами аденилатциклазной системы (bevitzki, 1986). Очистка с^-белка в отсутствие детергента, по-видимому, возможна. Нам удалось осуществить ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефацеле л адсорбционную хроматографию на гвдроксилапатите в отсутствие детергента, хотя препарат,

получаемый с колонки с гидроксилапатитом, был нестабилен. Несмотря на многочисленные попытки, нам не удалось осуществить гельфильтрацию в отсутствие детергента, выбелок из исходного экстракта, так же как и после ионообменной хроматографии, не элюировался с колонок с Сефадексом с-50 и ультрогелем АсА 44. Вероятно, это можно объяснить взаимодействием ав-белка с матрицей указанных носителей (Сойта et а1., 19вд).

Влияние Р7-субъединиц выбелка на реконструирующую активность полученного препарата.

Для дальнейшей работы полученный препарат выбелка переводили в ТЭД-буфар, содержащий 0,5% луброл рХ, 0,2 М сахарозу и АКР на колонке с ДЭАЭ-сефацелем,' поскольку в' луброле оз~белок более стабилен. Присутствие р-у-субъединщ со-йелка не оказывало влияния на базальную активность препарата аденилатциклазы, тогда, как реконструирующая активность ингибировалась на 60% (рис. 10). Рис. 10. Влияние Р7~субъедкккц со на реконструирующую активность полученного препарата. _____

мг-мии

АКГ^НОСТЬ, _ПМОЛЬ ■

5

I . . 1_к

0,24 а 8 2,4 -22-

Из литературы известно, что ру—субъединицы и оо-бслков

имеют сходные физико-химические свойства (СосЦпа ег а!.. 1986), и поэтому возможно взаимодействие различных а-субъединид с р-у-комплексом. Емдимо, имешо связывание ав в тройной кошлекс с Р7-субъединицами ао-белка лишает аз способности активировать препарат адешиштциклазы. Этот рез/льтат подтверждает, что в порученном наш препарате белок с мол. массой 42 кДа является а-субъедшшцей. Неясно, является ли полипепти^, с мол. массой 36

5

кДа р-субъединицей оз-белка, в литературе, имеются данные о том, что только а-субъединицы с-белков диссоциируют из мембран под действием активаторов .. (КойЪеи 19Э7). Изучая механизм!! ингибирования каталитической активности аденилагциклазы, Катада с сотр. высказали предположение, что свободные' Р7-субъединицы способны непосредственно взаимодействовать с каталитическим компонентом адекилатциклазы, ингибируя его активность (ХаЪайа е* а!., 1986). В нашем эксперименте это предположение не подтвервдается, поскольку присутствие Р7-су0ъединиц о -белка не влияло на базальную активность препарата аденилатциклазы.

ВЫВОДЫ

1. Полученный препарат частично очищенного каталитического компонента аденилатциклазы позволяет производить функциональное тестирование 03-белка.

2. Показано, что процесс -диссоциации активности выбелка из мембран эритроцитов человека под действием сррШр имеет лаг-период и характеризуется величиной концентрации нуклеотида, вызывающей полумаксимальную диссоциацию, равной 9хЮ-7М, что соответствует кинетике активации о -белка гуаниловыми нуклеотидами.

3. Установлено, что около 50% Gg-белка, экстрагирующегося из мембран под действием акр, связано с фракцией цитоскелета, разрушающегося при обработке раствором с низкой ионной силой.

4. Предложен способ выделения Gg-белка из эритроцитов человека, позволяющий получить высокоочищенный препарат Gg-белка при очистке в 120 раз по сравнению с исходным экстрактом.

5. Показано, что комплекс £7-субъедкниц выбелка ингибирует реконструирующую активность • полученного препарата gg-белка на 60%.

■ СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Скурат A.B., Юркова'М.С., Коц А.Я.,. Буларгина Т.В. Изучение свойств GTP-связывающего белка из эритроцитов человека // "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" Тезисы докладов 4 Всесоюзного симпозиума.-Петрозаводск.- 1988.- Стр. 50.

2. Скурат A.B., Юркова М.С., Коц А-Я., Буларгина Т.В. Освобождение . стимулирующего аденшгатциклазу отр-связывающего белка, Gs, из мембран эритроцитов человека под действием фторид-иона и гуаниловых нуклеотидов // Биохимия.- 198Э.- Т. 54.Стр. 1576-1682.

3. Скурат A.B., Юркова М.С., Коц А.Я., Буларгина Т.В. Выделение регуляторного GTP-связывающего белка, GB, освобождающегося из мембран эритроцитов человека под действием фторид-иона // Биохимия.- 1991.- Т. 56.- Стр. 74-78.