Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование статуса белков мембран эритроцитов методом многокоординатной экстракции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование статуса белков мембран эритроцитов методом многокоординатной экстракции"

На цравах рукописи

МНАЦАКАНЯН ГАЯНЭ ЛШАКОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СТАТУСА БЕЛКОВ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ МЕТОДОМ МНОГОКООРДИНАТНОЙ ЭКСТРАКЦИИ

/ 03.00.04 - Биохимия /

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

МНАЦАКАНЯИ ГАЯНЭ АШАКОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СТАТУСА БЕЛКОВ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ МЕТОДОМ МНОГОКООРДИНА'ШОЙ ЭКСТРАКЦИИ

/ 03.00.04 ~ Биохимия /

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии АН Республики Армения

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

ведущий научный сотрудник А.А.Арутюнян

• Официальные оппоненты: член-корр. АН РА, доктор

биологических наук, профессор

К.Г.Карагезян доктор биологических наук Э,С.Геворкян

Ведущая организация: Ереванский медицинский Институт

им. МД'араци, кафедра биохимии

Защита диссертации состоится " А/ 1992 г.

в А' ~ часов на заседании специализированного Совета К.055*01.СБ по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Ереванском ордена Трудового Красного Знамени государственном университете (375049, Ереван, ул. Мравяна I, Ереванский гооуниверситет, биологический факультет, кафедра биохимии).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан 1992 г.

Ученый Секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

^иил+лл.— Л.Г.Ананян

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одна из актуальных проблей современной биохимик связана о разработкой новых информативных тестов, позволяющих не только оценивать состояние отдельных структурных компонентов в составе макромолекулярного комплекса, но и характеризовать целостное состояние всей надмолекулярной структуры. Новый методический подход, оонованняй на идее т.н. "многокоординатной экстракции" белка из структуры, предложенной Арутгая-ном и др. / АгиЪиМап et а1 , 1988 /, и экспериментально разработанный в данной работе на примере белков плазматических мембран эритроцитов, в определенной мере решает цроблему оценки "статуса" /натнвного структурного состояния/ бзлковой молекулы, интегрированной в состав сложной макроструктуры.Разработанные физико-химичеокие характеристики белков позволяют отразить в совокупности их пространственное расположение в составе комплекса, характер взаимодействия с ближайшим молекулярным окружением.

Уровень современных знаний о структуре мембран обширен; однако эволюция'Представлений о структурнсм^ункциональных особенностях этих клеточных структур далеко еще не завершена. Метод многокоординатной экстракции позволяет получить качественно новую, графически описываемую информацию о мембранных белках, разнообразных по структуре и свойствам. ■

Особенностью клеточных мембран является способность их к структурным переходам, индуцированным структурными перестройками основных компонентов - липидов и белков. Одной из ['актуальных задач, выдвигаемых на современном этапе исследования биомембран, является выявление структурных переходов в мембранах, сопровождающих переключение клетки из одного метаболического состояния в другое, а также структурных сдвигов, обусловленных эволюционными, возрастными, гормональными, патологическими изменениями в организме. Разработанный в работе методический подход позволяет решить проблему оценки состояния белков мембраны в норме и при специфическом воздействии, сопровождающемся структурными изменениями.

Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы -экспериментальная разработка метода многокоординатной экстракции для исследования статуса белков мембран эритроцитов с де-

монстрацией чувствительности метода в сравнительных исследованиях. В связи с реализацией основной цели данной работы были поставлены конкретные задачи:

- разработать оптимальные условия для воспроизводимого выделения мембранных структур, экстракции и электрофореза мембранных белков о целью наладки метода;

- исследовать вкстрагируемоста белков мембран эритроцитов кур и человека в разных деухкоординатных системах о поиском эффективных координат для экстракции белков мембран эритроцитов. Продемонстрировать чувствительность новых физико-химических характеристик, предоставляемых разработанным методом;

- провести сравнительные исследования по выявлению ожидаемых сдвигов статуса белков плазматических мембран эритроцитов человека, вызванных: а/ длительным хранением крови в банках, б/ модификацией мембран ферментом типа фосфолипаза >

в/ температурной модификацией мембран;

- исследовать экстрагируемость белков мембран эритроцитов? ввделенных из крови разных доноров»

Научная новизна и практическая ценность работы. Метод многокоординатной экстракции, разработанный на. примере балков мембран эритроцитов, является новым методическим подходом к изучению белков - компонентов сложных надмолекулярных структур. На основе введенных физико-химических параметров получена качественно новая информация о статусе белков эритроцитарных мембран человека и кур, систематизированная в виде банка данных по совокупности таблиц-диаграмм и поверхностей экстракции для 27 белковых полос мембран эритроцитов кур и 20 белковых фракций- мембран эритроцитов человека. Показана уникальность информации практически о каддом исследуемом балке, характеризующая типы взаимодействий, стабилизирующих белок в общей структуре. Выявлены новые возможности классифицировать мембранные белки на основе типа экстрагируемости, разграничены типы экстрагиру-емости мембранных белков. эритроцитов кур и человека в трех двухкошонентных системах. Выявлены сдвиги статуса белков мембран эритроцитов человека, обусловленные: а/ длительным хранением крови, б/ модификацией мембран фосфолипазой А2, в/ предварительной инкубацией эритроцитов при 37°С до 2-х часов. Показаны возможные отклонения в экстрагируемости исследуемых бел-

ков мембран эритроцитов, выделенных из крови разных доноров.

Практическая ценность работы определяется возможностью широко применять метод многокоординатной экстракции для решения различных задач биохимии и молекулярной биологии, связанных с изучением не только клеточных мембран, но и других сложных макромолекудяркых объектов. Практический интерес представляет применение метода в качестве информативного и чувствительного теста для выявления сдвигов статуса белков в составе различных макромолекулярных структур, обусловленных эволюционными, возрастными, гормональными, патологическими изменениями в организме.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 14 Международном биохимическом конгрессе /Прага, 1988/, на 3-ей конференции молодых ученых ИЭБ АН Арм. ССР /Дшшжан,1989/, на 6-ой конференции молодых ученых и специалистов р-на 26 Комиссаров /Ереван, 1990/.

Работа апробирована на заседании Ученого Совета Института молекулярной биологии АН РА от 10 декабря 1991 г. и на заседании кафедры биохимии биологического факультета Ереванского государственного университета от 16 декабря 1991 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы / 3 главы /, описания методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста и содержит 27 рисунков. Библиография включает 169 наименований.

В обзоре литературы изложены основные положения современной концепции строения биомембран, дана детальная структурно-функциональная характеристика белков мембран эритроцитов человека, обсуждаются методы исследования мембранных белков.

Краткое содержание остальных глав приводится ниже.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования в работе служили плазматические мембраны эритроцитов кур и человека, для получения которых использовались свежая кровь 4-х месячных кур породы "белый леггорн" и цитратная донорская кровь из банков.

Отмывку эритроцитов проводили согласно /Гулак П.В. и др., 1983/.

Плазматические мембраны эритроцитов кур выделяли как описе но / Suzuki s. et al , 1982/. Мембраны эритроцитов человека получали методом гипотонического гемолиза согласно /Гулак П.В. и др., 1983 / с некоторыми модификациями. Конечные осадки мембран эритроцитов кур и человека суспензировали в 10 мМ трис-HGI, рН 7,4 буфере до| конечной концентрации 4 мг/мл по белку.

Солюбилизапию мембранных белков проводили в IG отдельных пробах. В каждую пробу со 100 мкл суспензии мембран добавляли 200 мкл соответствующих буферов с целью конечного получения 16 типов экстрагирующих сред. В модельном эксперименте при исследовании характера экстрагируемости белков мембран эритроцитов кур в системе рН-KaOI значения координат на осях экстракции соответствуют: для рН - значениям 6, 7, 8, 9, для ЫаС1 - концентрациям 0,14М, 0,35М, 0,7М, Т,4М. При экстракции белков мемс ран эритроцитов кур в трех двухкоординатных системах значения координат на осях соответствуют: для тритона X-I00 - 0, 0,01$, 0,05%, 0,25$; для HaCI - О, 0,14М, 0,35М, 0,7М; для мочевины -О, IM, 2М, 4М. При экстракции белков мембран эритроцитов человЕ ка в трех двухкомпонентных системах значения координат на осях соответствуют: для тритона X-I00 - 0, 0,05$, 0,255?, 1,25$; для HaCI - О, 0,I4M, 0,35М, 0,7Mj для мочевины - О, IM, 2М, 4М. Процедуру экстракции проводили при температуре 0°С в течение I ч при непрерывном перемешивании. Солюбшшзированный материал отделяли центрифугированием при .30 000^ в течение I часа. Процедуры солюбилизавди, центрифугирования и подготовки образцов к электрофорезу проводили одновременно для 16 проб и в идентичных условиях.

Белок в аликвотах солюбилизированного материала определяли по методу Брэдфорда / Bradford М.М., 1976 /.

Электрофорез мембранных балков проводили по методу Лаэммли / Laemmii U.K. , 1970 / с небольшими модификациями в двуз

ступенчатом ПААГ с ДСП - 3% концентрирующем и 10$ разделяющем -с использованием Silan A-I74 для сшивки геля к стеклу.

Сканирование электрофореграмм проводили на Ultrasсan XI / lkb / при 633 им.

Нумерация белковых полоо. Молекулярные веоа. Наиболее интенсивные белковые полосы на электрофореграммах белков мембран эритроцитов кур и человека были пронумерованы в порядке убывания молекулярного веса. Идентифицированы основные белки мембран эритроцитов человека согласно классификаций Стека-Хеста / Haest с. W. м.,1982 /.

Определение молекулярных весов проводили с помощью электрофореза sds маркеров. В наших экспериментах соотношение би-сакриламид /акриламвд было уменьшено вдвое по отношению к нормальной величине/ 1,3x1 CP* вместо 2,6х ИГ2 /, что привело к увеличению дистанции миграции белков. Гели с вдвое меньшим количеством сшивок, чем обычно, удобно использовать в широком диапазоне молекулярных весов, зависимость электрофоретической подвижности от логарифма молекулярного веса при этом гиперболическая, а не прямолинейная / "Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков", 1974 /.

Модификацию мембран Фосс&олшазой Ао из яда пчелы проводили как описано / Fujimoto Y. et ai , 1984 /с небольшими изменениями* Компьютерная обработка результатов экспериментов. Информация: по экстракции всех рассматриваемых белковых полос во всех системах экстракции была занесена в компьютер IBM/PC. С помощью специализированного пакета графических программ Boing graph были построены поверхности экстракции белков, произведен их сравнительный анализ.

Воспроизводимость результатов. С целью проверю! воспроизводимости величины выхода белка были проведены контрольные эксперименты для сравнения: а/ повторных выделении мембран из одного и того же источника, б/ выделений плазматических мембран эритроцитов человека из крови разных доноров, в/ результатов электрофореза одного образца, нанесенного на разные электрофоретичес-кие блоки, г/ употребления различных растворов для выделения мембран, солюбилизации белков, проведения электрофореза.

Погрешности, вносимые вышеуказанными процедурами,не; превышали J.7-20 % от абсолютной величины выхода белка.

- 8 -

РЕЗУЛЬТАТ И ОБСУЖДЕНИЕ]

Метод многокоординатной экстракции

В основе метода многокоординатной, экстракции лежит проведение селективного высвобождения белков из надмолекулярной структуры при комбинированном воздействии двух (двухкоординатная экстракция) или нескольких (многокоординатная экстракция) солю-билизирующих агентов в варьируемых комбинациях, влияние которыэ на нативную структуру белка или всего комплекса неоднотипно. Переход белка из состава мембраны в экстрагирующую среду обнаруживается при нескольких комбинациях параметров среды; детальное изучение этого перехода позволяет выявить новые структурно-функциональные закономерности комплексообразования данный бело! надмолекулярная структура.

В модельном эксперименте солюбшшзацию белков плазматических мембран эритроцитов кур проводили в системе экстракции рН-ЫаС1, т.н. координатой X служили- буфера с различными значениями рН(6-9), координатой У - растворы с возрастающими концентрациями ЫаС1 (0,14М - 1,4М) (оси на рис. 1а). Совокупно с и растворов ХУ объединена под термином "сетка экстракции". Экспериментально метод реализуется следующим образом. Выделенный объект исследования разбивается на идентичные образцы, количество которых соответствует количеству "точек" экстракции. Каждый из совокупности образцов подвергается воздействию раствора с тем же номером из сетки экстракции. После электрофоре-тического разделения солюбилизированных фракций со всех образцов, сканирования и идентификации белковых полос, определяются значения выхода каждой белковой полосы во всех точках экстракции. Результаты по экстракции каждой белковой полосы в конкретной системе экстракции можно представить в виде:

а/ таблицы-диаграммы (рис. I а), представляющей собой цифре вое поле, соответствующее сетке экстракции, в которой на месте каждой точки экстракции вписывается соответствующее значение выхода белка. В этом случае целесообразным представляется обобщение данных с помощью т.н. "линии полувыхода" (рис. I а), коте рая разделяет поле точек на диаграмме на две области, одна из которых охватывает условия, при которых белок преимущественно связан с мембраной, а другая - условия, при которых белок преимущественно дезагрегирован. Линия полувыхода обозначает гранич-

МлС1 / в молях / 9 -

1.4 1.11 1,03 1Д1 1,70

0,7 ■ 1,14 0,82 1,33 1,75

0,35 - 0,24 0,16 0,19 | 0,90

0,14 - 0,03 0,07 1 ..... 0,07 1 0,08

6 7 8 9 рН

Рис. I. Представление результатов по экстракции белковой полосы 8 мембран эритроцитов кур в системе экстракции рН-ЫаС1 в виде: а/ таблицы-диаграммы, б/ гистограммы, в/ поверхности экстракции.

ныв условия устойчивости комплекса белок-мембрана в двух координатах. Более строго линию полувыхода можно охарактеризовать как линию, разграничивающую точки, в которых выход белка превышает 50% от максимального в конкретной системе экстракции или в совокупности нескольких систем экстракции.

б/ гистограммы (рис. I б),

в/ поверхности экстракции (рис. I в ), являющейся графическим представлением совокупности значений Р как функции двух переменных Р (Х,У) в трехмерном пространстве. Поверхность экстракции описывает характер и особенности экстрагируе-мости белка в конкретных условиях среды с охватом всех точек) экстракции.

Графическое описание линий полувыхода на двухкоординатных диаграммах и поверхностей экстракции предоставляет ценную информацию о динамически равновесном состоянии мембранных белков в составе макроструктуры. Эта информация может быть полезна при выявлении изменений сродства этих белков к общей структуре цри модификациях как самих белков, так и их молекулярного окружения.

Классификация белков мембран эритроцитов кур по группам в системе экстракции рН-НаС1

Для исследуемых белковых полос мембран эритроцитов кур в системе экстракции рН-Най были построены таблицы-диаграммы и поверхности экстракции, анализ которых позволил сгруппировать представленные белковые фракции в соответствии с типом экстраги-руемости. В системе экстракции рН-ЫаС1 было разграничено три типа экстракции белков ( рис. 2 ):

. ТИП I / полосы 1,2,4,5,12-16,18,19 /. Существенная дезагрегация наблюдается при повышении концентрации ЫаС1 в среде от 0,35М к 0,7М и практически не зависит от изменения рН в диапазоне 6-9 (рис. 2а ). Однако для некоторых белков, объединенных в этот тип экстракции, обнаруживается небольшое характерное снижение величины выхода при переходе к значению рН 7 /примером может служить белковая фракция 19, поверхность экстракции которой представлена на рис. 2а/:

ТИП 2 /полосы 8,10,11,17,20-22 /. Высвобоэдение зависит от изменения как рН, так и ионной силы среды'(рис. 26);

ТИП 3 /полосы 3,6,7,23 /. Высвобождение из структуры обна-

Рис. 2. Поверхности экстракции белков мембран эритроцитов

кур, характерные для различных типов экстракции, разграниченных в системе рН-ЫаС1: а/ типа экстракции I(слева направо фракции 19 и 4), б/ типа экстракции 2 (фракции 8 и 10), в/ типа экстракций 3 (фракции 3, 6,7 и 23 ).

руживает сложную зависимость как от рН в диапазоне 6-9, так и от ионной силы среды (рис. 2в ). Эти белки сохраняют связь со структурой при всех значениях концентраций НаС1 при рН 7, однако легко диссоциругат из структуры при значениях рН 8 и 9 в большинстве случаев уже при концентрации НаС1 в среде 0,35М. Вероятно, это свидетельствует о том, что при рН 7 большинство заряженных групп этих белков нейтрализуются цротивоионами либо собственного белка, либо ближайшего окружения.

Объединенные двухкоординатные диаграммы. Классификация белков мембран эритроцитов кур по группам в системах экстракции тритон Х-100-ЫаС1. !КаС1-мочевина. тритон Х-100-мочевина

Скриннинг возможных деструктррующих агентов выявил, что наиболее информативными координатами для экстракции мембранных белков являются тритон Х-100, Ыа01 и мочевина, что обусловлено вкладом как гидрофобных, так и электростатических и водородных взаимодействий в поддержание нативной структуры мембран. Для более детального исследования поведения белков мембран эритроцитов кур при экстракции и выявления особенностей комплексообразо-вания белок-мембрана были рассмотрены результаты экспериментов по экстракции в трех двухкоордииатных системах (тритон Х-100--НаС1, НаС1- мочевина, тритон Х-100-мочевина) на единой диаграмме. Диаграммы с обозначенными линиями полувыхода белков в каждой двухкосрдинатной системе экстракции помещались на плоскости трехкоординатного пространства с координатами X - концентрации тритона Х-ЮО, У- концентрации ЫаС1, X - концентрации мочевины. В результате были получены т.н. "объединенные диаграммы" ( рис. 3 ), суммирующие данные по экстракции белков в трех различных двухкоордииатных системах. Совокупную линию полувыхода на плоскостях координат тритон Х-100-ЫаС1, НаС1- мочевина, тритон Х-100-мочевина можно представить как "сечение" на плоскостях ХУ, У2 , ХН некой поверхности полувыхода, описывающей граничные условия устойчивости комплекса белок-мембрана в трех двухкомпонентньгх средах.

Анализ формы совокупных линий полувыхода на объединенных диаграммах 27 исследуемых белковых полос мембран эритроцитов кур ( использование в качестве экстрагирующих координат тритона

У

Рис. 3. Объединенные двухкоординатные диаграммы для основных белковых полос мембран эритроцитов кур. Ось X соответствует тритону Х-100, У - ЫаС1, Н - мочевине'.

Х-100 и мочевины привело к появлению новых полос на электрофо-реграммах, в овязи с чем пришлось ввести иную нумерацию белковых фракций ), представленных на рис. 3,позволил разграничить три типа экстрагируемости белков:

ТИП I / полосы 11-13, 17, 20, 22, 24 /. Высвобождение из структуры зависит от изменения концентраций всех трех деструк-тирующих ингредиентов. Комбинированное воздействие на мембрану пар экстрагирующих агентов существенно не влияет на форму линий полувыхода белковых фракций II и 22. Наличие физиологической концентрации соли в среде в определенной мере стабилизирует мембрану, в этом случае для белков 12, 17, 20 повышается порог "эффективных" концентраций детергентов.

ТИП 2 /полосы 1,2,4,5,6,8,10,14-16,18,19,21,23,27/. Одна из экстрагирующих координат "неэффективна" в извлечении белка из состава мембраны в солюбилизирующую среду. Белки этого типа экстракции можно подразделить на два подтипа:

а/ комбинированное воздействие "неэффективной" координаты с "эффективной" существенно не влияет на форму линий полувыхода этих белков / полосы 1,2,4,5,16/;

б/ комбинированное воздействие "неэффективной" координаты с "эффективной" приводит к существенной диссоциации этих белков из структуры /полосы 6,8,10,14,15,18,19,21,23,27/.

ТИП 3 /полосы 7,9,25,26,28/. Выход этих белков в экстрагирующую среду является однокомпонентно-зависимым, однако совместное воздействие "неэффективных" ингредиентов в относительно высоких концентрациях обеспечивает структурный переход указанных белков из преимущественно связанного с мембраной состояния в растворимое.

Анализ формы объединенных линий полувьЬсода на диаграммах свидетельствует о том, что кроме пар белковых полос 1,2 и 4,5 остальные белки на диаграммах представляются весьма специфичными линиями полувыхода, что подтверждает многочисленные литературные данные о структурном многообразии мембранных белков. Обобщая эту часть исследований можно заключить, что с помощью данного методического подхода белки могут быть с одной стороны классифицированы по типу экстрагируемости из общей мембранной структуры, а с другой - охарактеризованы вплоть до индивидуальных отличий.

- 15 -

Классификация белков мембран эритроцитов человека по группам в системах экстракции тритон Х-ЮО-ЫаС!.

ЖаОТ -мочевина, тритон Х-ЮО-мочевина

Показав эффективность методического подхода в исследованиях на мембранах эритроцитов кур мы перешли к изучению белков мембран эритроцитов человека и обратились к такой актуальной цроблеме современной биологии и медицины как вопрос сохранения нативного структурно-функционального состояния компонентов мембран эритроцитов при длительном хранении крови в банках. Была предпринята попытка с помощью новых физико-химических параметров экстракции описать статус белков плазматических меморан эритроцитов человека и выявить возможные, сдвиги статуса белков, обусловленные длительным хранением крови. В данной серии экспериментов мембраны эритроцитов, выделенные из крови одного и того же донора, хранившейся 3 и 22 дня при 4°С ( эти мембраны обозначены как А и В соответственно), солюбилизировали в трех двухкомпоненткых системах: тритон Х-100-НаСГ, НаС1-мочевина, тритон Х-100-мочевина. Обобщение результатов экстракции позволило сконструировать по две объединенные диаграммы для каждой исследуемой белковой фракции, описывающие ее высвобождение из мембран А и В ( рис, 4 ).

Анадизирул объединенные диаграммы для белков мембран А и принимая их как диаграммы, отражающие состояние белков, близкое к нативному, можно сгруппировать представленные на рис. 4 белковые полосы в соответствии с типом экстракции:

Т>1П I /полосы 1-5, 9, 10, 13-18/. Одна из экстрагирующих координат сама по себе "неэффективна" в извлечении этих белков из структуры;

ТИП 2 /полосы 7,8,11,12,19,20 /. Выход этих белков из состава мембраны в экстрагирующий раствор является однокомпонент-нозависимым, однако комбинированное воздействие пары "неэффективных" координат в относительно высоких концентрациях приводит к существенной диссоциации этих белков из структуры.

Ка первый взгляд противоречивым является тот факт, что белки, представленные у нас полосами 1,2,8,14, соответствующиео(~ и £ - субъединицам спектрина и взаимодействующими с ними полосам 4.1 и 5,обнаруживают тритон-зависимый выход. Это противоречие объясняется способом получения мембран; фрагменты мембран,

Рис. 4. Объединенные двухкоординатные диаграммы для основных

белковых полос мембран эритроцитов человека, экстрагированных из мембран А/ непрерывные линии полувыхода/ и мембран В/пунктирные линии полувыхода/. Обозначения на осях соответствуют рис. 3.

полученные указанным выше способом, проявляют повышенную тенденцию к реагрегации и замыканию, высвобождение некоторых белков, локализованных на цитоплазматической поверхности мембранытстановится возможным лишь после деструкции бислоя детергентом в концентрации выше ККМ.

При данном способе получения мембран, в заданном диапазоне концентраций деструктирующих ингредиентов диаграммы экстракции являются конкретными и воспроизводимыми характеристиками белков и могут быть использованы в сравнительных исследованиях.

Исследование изменений в статусе белков мембран эритроцитов, обусловленных хранением крови и модификациями мембран фрсфолипазой Ад и температурой

Электрофоретическоэ сравнение препаратов тотальных мембран А и В не выявляет качественных и количественных различий в обт-щем спектре белков. Анализ объединенных диаграмм белков мембе ран, выделенных из крови, хранившейся 3 и 22 дня ( рис. 4 ), обнаруживает вызванные процессом длительного хранения изменения в статусе некоторых белковых полос. Линии полувыхода для белков 1-5, 8-16, 19 мембран, выделенных из крови, подвергнутой длительному хранению, смещены более к центру диаграммы. Снижение пороговых концентраций деструктирующих ингредиентов, требуемых для более чем 50% -ой экстракции белков из мембраны, свидетельствует об изменении общего состояния мембранной структуры, о прогрессирующем ослаблении белок-белковых и белок-липидных взаимодействий в структуре.

Для понимания сущности процессов, протекающих в мембранах при хранении крови, мы остановились на анализе результатов экстракции в одной, достаточно информативной двухкоординатной системе - системе экстракции тритон Х-Ю0-ЫаС1 /плоскость ХУ на диаграммах рис, 4 /. Анализ линий полувыхода в системе тритон Х-Ю0-ЫаС1 белков мембран А и В выявляет, что в большинстве случаев /полосы 1-4, 8, 14, 15/ имеет место снижение порога эффективных концентраций тритона Х-100 для обнаружения существенных количеств указанных белков в солюбилизатах. Это наводит на мысль, что несмотря на то, что белки 1,2,8,14 являются компонентами цитоскелетной сети, дестабилизация мембран может быть обусловлена нарушениями в структуре липидного матрикса мембра-

16 17, 18 19 20

Рис. 5. Двухкоордикатные диаграммы (система экстракции тритон Х-100-Най ) основных белков мембран эритроцитов человека, экстрагированных из модифицированных фосфоли-пазой ¿2 эритроцитарных мембран (непрерывные линии полувыхода - мембраны I, пунктирные линии полувыхода -мембраны II ), Ось X соответствует тритону Х-100, У - ЫаС1.

ны. В связи с этим встал вопрос зафиксировать ожидаемые сдвиги статуса белков мембран эритроцитов, искусственно вызвав определенную дезорганизацию структуры бислоя. С целью повлиять на микровязкость бислоя и подвижность его компонентов использовался фермент обмена фосфолипидов фосфолипаза ¿2« Были проведены эксперименты по экстракции в системе тритон Х-100-ЖаС1 мембран, выделенных из эритроцитов, модифицированных фосфолипа-зой ¿2 ( эти мембраны обозначены как I ),и эритроцитарных мембран, модифицированных фосфолипазой А2 (мембраны II ), соответственно сконструированы по две двухкоординатные диаграммы для кадцой белковой фракции (рис. 5 ). Анализ результатов экстракции позволил заключить, что фосфолипазная обработка мембран приводит к сильному изменению структуры мембран и вызывает существенное изменение линий полувыхода и поверхностей экстракции большинства экстрагируемых белковых полос /полосы 1-10, 13-16, 20/. Сравнивая линии полувыхода белков мембран А и В (плоскость ХУ на рис. 4 ) и белков мембран I и II (рис. 5 ) приходим к выводу, что изменения в характере экстрагируемости некоторых белковых полос / 1-4, 8, 10, 14, 15 / при хранении крови и модификации бислоя фосфолипазой А2 имеют сходную тенденцию. Нарушения в структуре мембран, вызванные хранением крови, не носят столь глубокого характера как при липазной обработке мембран. Можно предположить, что изменение общего состояния мембранной структуры при длительном хранении крови обусловлено дезорганизацией структуры его липидного бислоя, аналогичная дестабилизация наблюдается при модификации мембран фосфолипазой А^. В обоих случаях эта дестабилизация проявляется в снижении резистентности эритроцитарной мембраны к деструк-тирующему воздействию солюбшшзиругощих факторов. Характерно, что ни процесс длительного хранения крови, ни модификация мембран ферментом не приводят к существенному сдвигу форм поверхностей экстракции и линий полувыхода на диаграммах белков 17 и 18. Более детальную информацию о вышесказанном дает анализ поверхностей экстракции конкретных белков ( рис. 6).

Создается впечатление, что выход белков 9 и 16 из фосфолипаза А^-модифицированньгх мембран в точке экстракции 13 не облегчен (как это наблюдается для всех остальных белков, для которых регистрируется изменение статуса), а , наоборот, затруднен. Реально же изменение линий полувыхода белков 9 и 16 свя-

,1ео| »«о

Белковая фракция I

Белковая фракция 18

Рис. 6. Поверхности экстракции белковых фракций I, 14 и 18, солюбилизированных в системе экстракции тритон Х-100-ЫаС1 из мембран А, В, I и II (слева направо).

зано с резким усилением выхода в конечных точках сетки экстракции, что, в принципе, также подтверждает предположение о снижении резистентности мембраны к деструктирующему воздействию экстрагирующих агентов.

Достоверно показано, что предварительная инкубация эритроцитов при 37°С до 2-х часов существенно облегчает процесс высвобождения некоторых белков из состава мембраны в экстрагирующую среду. Детальный анализ изменений экстрагируемости мембранных белков эритроцитов, инкубированных цри 37°С до 2-х часов,выявил аналогию между этими изменениями и сдвигами статуса белков при хранении крови. Процесс инкубации эритроцитов при 37°С до 2-х часов как бы имитирует процесс хранения крови до 22-х дней при 4°С. В обоих процессах изменения в структуре затрагивают одни и те же белковые полосы / 1,2,8,14,15 /. Просматривается единая тенденция - снижение резистентности эрит-роцитарной мембраны к деструктирующему воздействию солюбилизи-рующих агентов.

Индивидуальные различия в экстрагируемости белков мембран эритроцитов у разных доноров

В многочисленных публикациях последних лет / Agre р. et al, 1988, Kundu м. , 1989, postnov Y.V1984/ содержатся сведения относительно структурных изменений эритроцитарных мембран при различных патологиях крови. В связи с этим актуален поиск новых информативных тестов, адекватно описывающих состояние отдельных структурных компонентов и всей мембраны в целом при различных патологиях крови. Апробайдя метода многокоординатной экстракции в решении задач, связанных с проблемой норма-патология, с одной стороны позволит выявить особенности мембранной основы патогенеза, а с другой - выявление характерных для данной патологии изменений откроет новые возможности для выработки дополнительных критериев дифференциальной диагностики. Однако в связи с этим возникает проблема контролей. Являются ли полученные характеристики белков мембран эритроцитов воспроизводимыми, или имеются индивидуальные различия в экстрагируемости белков мембран эритроцитов, выделенных из крови разных здоровых доноров. Для иллюстрации ответа на этот вопрос была поставлена серия экспериментов по выявлению различий в экстрагируемости исследуемых

белков из эритроцитарных мембран разных доноров в"чувствитель-ной" точке экстракции 14 сетки тритон Х-100-ЫаС1 (метод позволяет разграничить т.н. "чувствительные" точки экстракции, в которых различия сравниваемых белковых полос максимальны). Статистическая обработка результатов позволила заключить, что для большинства исследуемых белков разброс в значениях выхода не превышает от средней величины, для двух белков (поло-

сы 8 и 9 ) отклонения от средней величины составляют 15-17$, для минорных фракций анкирина (полосы 4 и 5 ) этот параметр доходит до 40%. Выяснение природы подобных сдзигов является предметом специальных исследований. Полученные яе результаты позволяют заключить, что эритроцитарные мембраны, выделенные из крови разных здоровых доноров,могут служить в качестве контроля при выявлении сдвигов статуса белков в составе мембран с патологическими изменениями. Для большей достоверности полученных результатов рекомендуется учитывать возможные вышеприведенные отклонения в выходе из состава мембраны в экстрагирующий раствор для всех рассматриваемых белковых полос.

вывода

1. На примере изучения характера экстрагируемости белков плазматических мембран эритроцитов кур в двухкомпонентной экстрагирующей системе рН-ЫаС1 разработан новый методический подход - метод многокоординатной экстракции. Рассмотрены новые физико-химические параметры, характеризующие состояние структурных белков в составе надмолекулярного комплекса. Выявлены новые возможности классифицировать мембранные белки на основе данных по двухкоординатной экстракции.

2. Для белков плазматических мембран эритроцитов кур и человека составлен банк данных по экстракции в трех двухкомпонен-тных системах (тритон Х-Ю0-ЫаС1, НаИ-мочевина, тритон Х-100-мочевина) в виде совокупности таблиц-диаграмм, поверхностей экстракции и объединенных диаграмм. Показано, что объединенные диаграммы являются специфическими и индивидуальными

характеристиками для каждого рассматриваемого белка. На основе данных по экстрагируемое™ в трех двухкомпонентных системах проведена классификация для мембранных белков эритроцитов кур и человека.

- 23 - ,

3. В трех двухкомпоионтных системах ( тритон X-100-UaCI, ЫаС1-мочевина, тритон X-100-мочевина) проведены сравнительные исследования по изучению стазуса мембранных белков эритроцитов человека, выделенных из крови, хранившейся 3 и 22 дня, выявлены сдвиги статуса некоторых белков при длительном хранении крови.

4. В двухкоординатной экстрагирующей системе тритон Х-100-ЫаС1 проведены сравнительные исследования по изучению характера экстрагируемости белков мембран эритроцитов человека в норме и при модификации мембран фосфолипазой Ag. Показано, что выявленные в экстрагируемости некоторых мембранных белков сдвиги, вызванные длительным хранением крови и модификацией мембран фосфолипазой Ag, имеют сходную тенденцию /снижение резистентности эритроцитарной мембраны к деструктирующему воздействию солюбилизирующх агентов/. Заключено, что сдвиги статуса некоторых белков при длительном хранении крови могут быть связаны с дестабилизацией бислоя эритроцитарной мембраны.

5. Продемонстрировано мембранмодифицирующее воздействие температуры на экстрагируемость мембранных белков эритроцитов человека.

6. Рассмотрены индивидуальные различия в сродстве некоторых белков к общей структуре мембран эритроцитов у разных доноров.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Arutunian A.A., Abramian A.Sh., Kalaehian A.S., Mnatsaka-nian G.A., Sarvazian N.A., Akopian T.N. A new approach

for structural prQtein investigation. Abs. of 19-th Intern. Bioohem. Congress, p. 56, Prague, 1988.

2. Мнацаканян Г.А., Калачян A.C., Арутюнян A.A. Исследование белков мембран эритроцитов с помощью двухкомпонентных солю-билизаторов. Тезисы докладов Ш конференции молодых ученых Института экспериментальной биологии АН Арм. ССР, г.Дили-жан, с. 54, 1988.

3. Мнацаканян Г.А., Калачян A.C., Шагинян К.А., Акопян Т.Н., Арутюнян A.A. Двухкоординатная солюбилизация мембранных белков. Биолог, ж. Армении, т, 42, 6, 538-546, 1989.

4. Мнацаканян Г.А., Калачян A.C., Оганисян А.И. Исследование •белков мембран эритроцитов кур методом многокоординатной

- 24 -

экстракции, Тезисы докладов 6-ой научно-технической конференции молодых ученых и специалистов р-на 26 Комиссаров, г. Ереван, с. 74, 1990.

5. Мнацаканян Г.А., Калачян A.C., Шагинян К.А., Акопян Т.Н., Арутюнян A.A. Графическое описание динамически равновесного состояния мембранных белков в составе макроструктуры. Биолог, ж. Армении» т. 43, № 12, 984-991, 1990.

6. Мнацаканян Г.А., Калачян A.C., Абрамян А.Ш., Арутюнян A.A. Исследование изменений в статусе белков мембран эритроцитов человека, вызванных длительным хранением крови и модификацией мембран фосфолипазой Ag. Биолог, ж. Армении (в печати) .