Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы

Щеголев, Алексей Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы"

I'4

На правах рукописи Щеголев Алексей Юрьевич

Потенцирование ]ЧО-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

9 9 ДПР 2910

Москва 2010

004601487

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН, Москва

Научный руководитель доктор биологических наук

И. С. Северина

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, заслуженный деятель наук РФ, профессор ИЛ. Конь

доктор медицинских наук,

профессор В. Л. Козельцев.

Ведущее учреждение: Российский государственный медицинский университет.

Защита диссертации состоится «21» мая 2010 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Одним из значительных открытий последних лет, имеющих фундаментальное значение и позволивших по-новому подойти к пониманию молекулярных основ ряда физиологических процессов в клетке, является открытие оксида азота (N0) и установление его роли в регуляции различных физиологических и биохимических процессов (Нобелевская премия в области физиологии и медицины, 1998 г). Эндогенный оксид азота (N0) образуется из Ь-аргинина под действием Ь-аргинин-КО-синтазы. N0 участвует в процессах нейротрансмиссии, является цитотоксическим агентом и мощным фактором гемостаза. Он ингибирует агрегацию тромбоцитов и рассматривается в настоящее время как эндогенный вазодилататор. Антиагрегантные свойства и сосудорасширяющее действие оксида азота связаны с активацией растворимой гуанилатциклазы и накоплением циклического 3,5-гуанозинмонофосфата (цГМФ). Таким образом, можно говорить о существовании внутриклеточной сигнальной системы: оксид азота - растворимая гуанилатциклаза - цГМФ. Важная роль повсеместно распространенной сигнальной системы: N0 — растворимая гуанилатциклаза -цГМФ в функции клеток, нарушение активности этой системы при многих патологических состояниях (гипертония, астма, сепсис, септический. шок, злокачественные новообразования) требуют создания препаратов,, которые бы направленно регулировали активность этой системы и таким образом устраняли бы возникшие нарушения. Подобные модуляторы активности гуанилатциклазы не только способствовали бы выяснению физиологической значимости этого фермента, но и, что не менее существенно, могли бы использоваться в качестве терапевтических средств.

Наиболее известными лекарственными препаратами, которые долгие годы используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний: стенокардии, тяжелых форм гипертонии, комплексного лечения инфаркта миокарда и сердечной недостаточности и связанных с недостаточностью образования эндогенного оксида азота, являются органические нитраты (нитроглицерин, изосорбитдинитрат и др.). Однако механизм действия этих соединений был установлен только в конце 70-х годов, когда было обнаружено, что в результате их метаболизма образуется оксид . азота, активирующий растворимую гуанилатциклазу, что приводит к накоплению цГМФ. Последний активирует цГМФ-зависимые протеинкинзы, а также кальций зависимую АТФ-азу, участвующие в дефосфорилировании легких цепей миозина, что приводит к выходу ионов кальция из мышечных волокон и в конечном итоге к вазодилатации. Использование данных лекарственных средств ограничивается возникновением ряда побочных эффектов при их продолжительном применении, в том числе развитием толерантности. В связи с этим поиск соединений, способных активировать гуанилатциклазу по ИО-независимому механизму,

представлял бы значительный интерес и мог бы способствовать появлению новых эффективных лекарственных средств для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Таким соединением оказался УС-1 (3-(5'-оксиметил-2'-фурил)-1-бензил индазол), который является не только МО-независимым активатором фермента, но и усиливает активацию фермента донорами оксида азота. В присутствии УС-1 и донора оксида азота наблюдается (в зависимости от концентрации соединений) аддитивное или синергичное усиление активации фермента. Этот эффект имеет большое фармакотерапевтическое и физиологическое значение. Использование соединений, аналогичных по своему действию УС-1, позволило бы значительно снижать дозы нитровазодилятаторов без снижения эффективности их лечебного действия. Это в свою очередь снизило бы возникновение нежелательных побочных эффектов, в том числе развитие толерантности при их длительном применении. В последнее время обращается особое внимание на возможность существования эндогенных соединений, аналогичных по своему действию УС-1. Известно, что УС-1 усиливает Ж)-зависимую активацию гуанилатциклазы и при физиологических концентрациях оксида азота и таким образом повышает эффективность эндогенного N0 в проявлении своих физиологических эффектов. В связи с этим выявление эндогенных соединений, аналогичных по своему действию УС-1, заслуживает особого внимания. Однако данные о них пока отсутствуют.

Цель исследования - выявление, изучение и анализ соединений, способных усиливать активацию растворимой гуанилатциклазы донорами оксида азота. Задачи исследования:

Были изучены следующие группы соединений:

1. Производные протопорфирина IX: (2,4-дй-(1-метоксиэтил)-дейтеропорфирин IX) - димегин и гематопорфирин.

2. Полиамины (путресцин, спермидин, спермин)

3. Производные изатина (эндогенного индола): 5-нитроизатин и арбидол (противовирусный препарат)

4. Лекарственные средства: антибиотики - левомицетин и тетрациклин и противовирусный препарат - оксолин.

Научная новизна

В представленной работе впервые были выявлены и исследованы соединения эндогенной природы, обладающие способностью УС-1, синергично усиливать Ж)-зависимую активацию гуанилатциклазы. Такими соединениями оказались производные протопорфирина IX - гематопорфирин IX и полиамины (путресцин, спермидин, спермин). Полученные результаты впервые указывают на новый биохимический эффект этих соединений, который позволит более глубоко понять их специфические, биологические функции. Помимо использованных эндогенных соединений, способных аналогично УС-1 усиливать стимуляцию гуанилатциклазы ЫО-донорами, аналогичной способностью обладали и

некоторые фармакологические средства: антивирусные препараты - арбидол и оксолин и антибиотики - левомицетин и тетрациклин. Факт проявления этими соединениями способности синергично усиливать МО-зависимую активацию гуанилатциклазы имеет большое фармакотерапевтическое значение. Все изученные лекарственные препараты широко используются в медицинской практике. Как правило, лечение ими достаточно продолжительно. Поэтому, вполне возможно возникновение дополнительных эффектов, связанных с резким усилением МО-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы. Последнее обстоятельство следует принимать во внимание.

Научно-практическая значимость исследования

Представленные в настоящей работе данные о способности соединений, как эндогенной природы, так и являющихся лекарственными препаратами, усиливать (аналогично УС-1) стимуляцию растворимой гуанилатциклазы МО-донорами, являются актуальными и представляют значительный интерес не только в плане широких этимологических исследований, но и для решения задач практической медицины. Использование соединений, аналогичных по своему действию УС-1, позволит значительно снижать дозы нитровазодилятаторов без снижения эффективности их лечебного действия. Это, в свою очередь, снизит возможность возникновения нежелательных побочных эффектов, в том числе и развитие толерантности при их длительном применении. А также будет способствовать созданию новых, более эффективных лекарственных средств. В связи с этим, поиск, изучение и внедрение в медицинскую практику соединений, способных усиливать активацию гуанилатциклазы МО-донорами, представляет

значительный интерес.

Апробация работы.

Диссертация обсуждена 15 марта 2010 г. на совместной конференции лабораторий: биохимии аминов н циклических нуклеотидов; биохимии и химической патологии белков; синтеза физиологически активных соединений; нанобиоэлектрохимии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН.

Результаты работы неоднократно докладывались и обсуждались на ежегодных научных конференциях молодых ученых (2007, 2008, 2009), проводимых в Институте биомедицинской химии РАМН.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 статей в научных журналах.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 101 странице, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 120 источников, из них 15 отечественных и 105 зарубежных. Диссертация содержит 23 рисунка и 4 таблицы.

Материалы и методы исследования Объект исследования.

В качестве источника растворимой гуанилатциклазы использовали тромбоциты человека. В этих клетках гуанилатциклаза представлена на 95 % растворимой формой и характеризуется высокой активностью.

Выделение тромбоцитов из крови человека.

Тромбоциты выделяли из венозной крови доноров при комнатной температуре; в качестве антикоагулянта использовали 3,8%-раствор цитрата натрия трехзамещенного в соотношении с кровью 1:10 по объему. Кровь центрифугировали 10 минут при 450 g , обогащенную тромбоцитами плазму наслаивали на равный объем Ficoll-Paque ("Pharmacia", Швеция) и центрифугировали 30 минут при 650 g. Осадок тромбоцитов, сконцентрированный на границе раздела фаз, отбирали, ресуспендировали в равном объеме 50 мМ Трис-НС1-буфера (рН 7,6), содержащего 150 мМ NaCl и 5 мМ ЭДТА, и центрифугировали 15 минут при 1500 g. Осадок тромбоцитов ресуспендировали в 2 мл указанного буфера и центрифугировали 10 минут при 800 g; процедуру повторяли дважды. Окончательный осадок тромбоцитов ресуспендировали в 1,5 мл холодного (4°С) 50 мМ Трис-HCl-буфера (рН 7,6), содержащего ДТТ (0,2 мМ). Проводили микроскопический контроль чистоты выделяемых тромбоцитов; присутствия других форменных элементов крови не обнаружено.

Выделение растворимой гуанилатциклазы.

Суспензию отмытых тромбоцитов разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE 5-78 (Великобритания) в течение 20 секунд при амплитуде 16 мкм. Процедуру проводили на холоду, температура в озвучиваемой пробе не должна превышать 4 °С. В результате происходило разрушение мембран тромбоцитов и выход цитозольного содержимого тромбоцитов в раствор. Разрушенные тромбоциты центрифугировали в течение 1 часа при 105 000 g (при 4°С) на ультрацентрифуге Beckman Optima LE 90-К. Супернатант отбирали и использовали в качестве ферментного препарата растворимой гуанилатциклазы. Ферментный препарат использовали сразу после его получения. Белок определяли по методу Bradford.

Проведение ферментативной реакции.

Пробы (общий объем 150 мкл) содержали 50 мМ Tris-HCl буфер (рН 7,6), 1 мМ ГТФ, 4 мМ MgCh, 4 мМ креатинфосфат, 20мкг креатинфосфокиназы, 10 мМ теофиллин (10 мМ концентрация теофиллина была достаточна для полного торможения активности фосфодиэстеразы тромбоцитов человека), 20 мкг супернатанта 105 000 g (по белку) и исследуемые соединения в требуемых концентрациях. Ферментативную реакцию проводили при 37°С в водяном термостате в течение 15 минут. Реакцию останавливали помещением проб в кипящую водяную баню, с последующим охлаждением во льду и удалением денатурированного белка центрифугированием (10 минут при 1500 g). В

полученном супернатанте определяли активность гуанилатциклазы по количеству цГМФ, образовавшегося в ходе ферментативной реакции методом иммуноферментного анализа. Иммуноферментный анализ проводили с использованием набора реактивов для количественного определения цГМФ фирмы (ООО "Медицина. Аналитика. Ветеринария", Россия). Активность гуанилатциклазы выражали в пмоль образовавшегося цГМФ за 1 минуту инкубации на 1 мг белка.

Результаты исследования

Из литературных данных известно, что протопорфирин IX (ПП) -предшественник гема является активатором фермента. Мы исследовали некоторые производные протопорфирина IX - димегин и гематопорфирин (ГП) действие которых на систему оксид азота - растворимая гуанилатциклаза -цГМФ ранее не изучалось.

Химические структуры использованных производных ПП представлены ниже:

Примечание: ПП - протопорфирин IX; ГП - гематопорфирин IX; Димегин -(2,4-ди(1- метоксиэтил) - дейтеропорфирин IX динатриевая соль).

Димегин и ГП являются активаторами гуанилатциклазы и при оптимальной (для обоих соединений) концентрации равной 5 мкМ, коэффициенты активации фермента равны 3,2 (для димегина) и 2,7 (для ГП). Коэффициент активации гуанилатциклазы ПП (при той же оптимальной - 5,0 мкМ - концентрации) составляет 3,5 раза; т.е. эффективность стимуляции фермента ПП и его производными была достаточно близкой. Из табл.1 видно, что активация гуанилатциклазы в присутствии 10,0 мкМ нитропруссида натрия и 5,0 мкМ димегина (или 5,0 мкМ ГП) увеличивается до 190 ± 19 % (или 134 ± 10 %), т.е. димегин (или ГП) вызывает синергичное усиление активации фермента донором оксида азота. Синергичное усиление активации гуанилатциклазы 10,0 мкМ нитропруссидом натрия наблюдается также в присутствии 3,0 мкМ YC-1 и равно 255 ±19% (табл.1).

Следует отметить, что димегин и ГП не влияли на активацию фермента YC-1. Из таблицы 1 видно, что при инкубации 1уанилатциклазы в присутствии 3,0

мкМ УС-1 и 5,0 мкМ димегина (или 5,0 мкМ ГП) найденная активность не отличается от арифметической суммы активностей фермента, стимулированных каждым из агентов по отдельности; димегин и ГП не изменяли и синергичного усиления активации гуанилатциклазы нитропруссидом натрия в присутствии УС-1 (табл.1). Во всех случаях димегин и ГП действовали на фермент независимо от УС-1. Следовательно, между УС-1 и димегином (или ГП) отсутствуют какие-либо конкурентные отношения. Таким образом, представленные данные о синергичном усилении димегином и ГП активации фермента МО-донорами не позволяют сделать вывод о возможном взаимодействии димегина (или ГП) с теми же участками аллостерического центра гуанилатциклазы, с которыми взаимодействует УС-1.

Таблица 1. Влияние димегина (5 мкМ) и гематопорфирина IX (5 мкМ) на активацию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека нитропруссидом натрия (НН).

Соединения и добавки Стимулированная активность * Сумма** Влияние*** %

УС-1 димегин ГП

НН 422±30

УС-1 42±3

УС-1 +НН 1121±89 467 ±37 +255±19

Димегин 154±9

Димегин + НН !099±88 576±4б +190±!9

Димегин + УС-1 191±!3 196±13 -3

Димегин +НН + УС-1 1655*136 618±49 +268±22

ГП 117±8

ГП + НН 723±51 539±3б +!34±10

ГП + УС-1 163±1! I59±11 +3

ГП +НН +УС-1 135Ы15 581±47 +232±18

Примечание. Приведены средние значения из 4-5 независимых экспериментов. (+ средние стандартные отклонения). Во всех случаях ошибка средней <10%. Базальная активность гуанилатциклазы равна 76+ б пмоль цГМФ/мг белка/мин.

* - стимулированная нитропруссидом натрия активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг белка/мин)

** - арифметическая сумма отдельных активностей рГЦ.

*** - влияние - отношение стимулированной активности к арифметической сумме.

Следует отметить, что в отличие от синергичного усиления нитропруссидной активации в присутствии димегина и ГП, стимулирующие эффекты нитропруссида натрия и ПП были аддитивны (табл.2). Аддитивность

наблюдается также и при инкубации гуанилатциклазы с УС-1 и ПП. Полагают, что в основе механизма этого явления лежит стабилизация активной конформации белка. Таблица 2 показывает, что димегин и ГП тормозили (на 32 ± 2 и 30 ± 2 %, соответственно) активацию гуанилатциклазы ПП, что указывает на конкурентные отношения между этими соединениями и ПП, и на возможность взаимодействия (хотя бы частичного) с теми же участками фермента, с которыми связывается и ПП.

Несмотря на то, что димегин и ГП вызывают синергичное усиление N0-зависимой активации гуанилатциклазы, как и УС-1, а ПП такой способностью не обладает, объяснить этот факт особенностями химических структур этих соединений пока не представляется возможным. Тем не менее, впервые выявленная способность производных протопорфирина IX, обладающих эндогенной природой, синергично усиливать активацию гуанилатциклазы N0-донорами указывают на новый биохимический эффект этих соединений. Этот факт может иметь большое фармакотерапевтическое и физиологическое значение и его следует принимать во внимание.

Таблица 2. Влияние димегина (5мкМ), гематопорфирина IX (5 мкМ), нитропруссида натрия (НН) (10 мкМ) и УС-1 (3 мкМ) на активацию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) протопорфирином IX (5 мкМ).

Соединения и добавки Стимулированная активность* Сумма ** Влияние*** %

УС-1 НН димегина ГП

ПП 259 ±18

УС-1 149±11

УС-1 +ПП 437±32 408±29 107±-7

НН 360±29

нн + пп 600±45 619±46 97±б

Димегин 200±12

Димегин + ПП 308±22 459±33 - 33±2

ГП 177±12

ГП + ПП 331±24 475±34 -30 ±2

Примечание. Приведены средние значения из четырех независимых экспериментов (+ средние стандартные отклонения). Во всех случаях ошибка средней <10%. Базальная активность гуанилатциклазы равна 70+ 5 пмоль цГМФ/мг белка/мин.

* - стимулированная нитропруссидом натрия активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг белка/мин)

** - арифметическая сумма отдельных активностей рГЦ.

*** - влияние - отношение стимулированной активности к арифметической сумме.

Недавно выяснилось, Что сигнальная система МО-растворимая гуанилатцшслаза - цГМФ, участвует в регуляции пролиферативных процессов в клетке. Было показано, что аллостерический активатор растворимой гуанилатциклазы УС-1 и 8-бром-цГМФ (проникающий в клетки аналог цГМФ) защищают клетки от апоптических стимулов, а, следовательно, и их гибели. С другой стороны, ингибитор растворимой гуанилатциклазы ООО (1-Н[],2,4]-оксадиазоло[4,3-а]хиноксалин-1) вызывает значительное усиление каспазной активности и способствует гибели опухолевых клеток. Более того, было показано, что уровень цГМФ в плазме нелеченых больных раком значительно выше, чем у здоровых людей, и он нормализуется при ремиссии. Другими словами, увеличение уровня цГМФ может способствовать развитию пролиферативных процессов в клетке. Действительно, в литературе имеется достаточное количество данных, указывающих на определенную роль цГМФ в пролиферативных процессах в клетке. Известно, что важную роль в процессах роста и деления клеток приписывают и полиаминам, которые, как ранее было показано, активируют растворимую гуанилатциклазу в культурах клеток сердца и повышают уровень цГМФ. Эти данные дают основание предположить участие сигнальной системы МО-растворимая гуанилатциклаза-цГМФ в пролиферативных процессах в клетке и вовлечение этой системы в реализацию эффектов полиаминов. Поэтому мы исследовали влияние полиаминов на функционирование системы МО-растворимая гуанилатциклаза-цГМФ.

Как видно из таблицы 3, все использованные полиамины оказались активаторами фермента, увеличивая базальную активность последнего примерно одинаково: в 1,2; 1,9; 1,6 раз в опытах с путресцином, спермидином и спермином, соответственно. Использованные полиамины при инкубировании (по отдельности) с ферментом и нитропруссидом натрия потенцировали активацию гуанилатциклазы использованным МО-донором (нитропруссидом натрия). Путресцин и спермин вызывали аддитивный эффект. В опытах со спермидином наблюдалось даже синергичное усиление нитропруссидной активации до 136% (таблица 3). Эти данные показывают, что полиамины (по отдельности) и нитропруссид натрия действуют независимо на два разных участка фермента. Следовательно, механизм активации гуанилатциклазы полиаминами является МО-независимым. Путресцин, спермидин и спермин примерно одинаково тормозили активацию растворимой гуанилатциклазы УС-1 (на 36, 54 и 47 % соответственно), а также снижали увеличенную активацию фермента нитропруссидом натрия в присутствии УС-1 (на 68, 71 и 65 % соответственно), что указывает на конкурентные отношения между УС-2 и полиаминами.

Механизм активации полиаминами активности гуанилатциклазы пока остается невыясненным, однако, было отмечено, что полиамины повышают сродство растворимой гуанилатциклазы к субстрату, так же как и Ушах. Кроме

того, они, по-видимому, могут замещать катион металла, который является кофактором фермента.

Таблица 3. Влияние путресцина (100 мкМ), спермидина (100 мкМ) и спермина(100 мкМ) на активацию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека нитропруссидом натрия (НН, 10 мкМ), УС-1 (3 мкМ) и на синергизм активации фермента нитропруссидом натрия (10 мкМ) в присутствии

YC-1 (ЗмкМ)

Соедииения и добавки Стимулированная активность * Сумма ** Влияние*** %

путресцина спермидина спермина

НН 465 ±35

Путресцин НН + путресцин спермидин НН + спермидин спермин НН + спермин 20 ± I 485 I 34 91 ±3 756 ±52 61 ±5 528 ± 38 485 ±35 556 ± 39 526 ± 37 0 +36 0

УС-1 111 ±8

УС-1 + путресцин УС-1 +спермидин УС-1 + спермин 84 ±5 93 ±6 91 ±5 131 ± 10 202 ± 14 172 ± 13 -36 -54 -47

НН + УС-1 1143 ± 84 576 ±46

НН + УС-1 + путресцин НН + УС-1 + спермидин НН + УС-1 +спермин 370 ± 26 334 ± 27 408 ± 26 -68 -71 -65

* - стимулированная нитропруссидом натрия активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг белка/мин)

** - арифметическая сумма отдельных активностей рГЦ.

*** - влияние - отношение стимулированной активности к арифметической сумме.

Таким образом, механизм активации фермента полиаминами может быть связан с их взаимодействием с катионным участком активного центра гуанилатциклазы. Следует отметить, что наибольшим сродством к катионному участку обладает спермидин. Каков механизм выявленного нами потенцирующего влияния полиаминов на МО-зависимую активацию растворимой гуанилатциклазы пока неизвестно. Однако, учитывая способность полиаминов тормозить активацию гуанилатциклазы УС-1 и снижать

увеличенную в присутствии УС-1 стимуляцию фермента нитропруссидом натрия (что указывает на конкурентные отношения между полиаминами и УС-1), можно предположить, что полиамины взаимодействуют, хотя бы частично с теми же участками в аллостерическом центре гуанилатциклазы, с которыми взаимодействует и УС-1.

Выявленная нами способность полиаминов (путресцина, спермидина, спермина) потенцировать и синергично усиливать (по аналогии с УС-1, хотя и менее эффективно) >Ю-зависимую активацию растворимой гуанилатциклазы указывает на новый биохимический эффект этих соединений, который необходимо принимать во внимание, особенно, учитывая эндогенную природу этих соединений.

Еще одним соединением эндогенной природы является изатин. Изатин -эндогенный индол, обнаруженный у млекопитающих в мозге, различных органах и тканях и биологических жидкостях. Изатин и его метаболиты входят в состав различных природных веществ, являются компонентами многих синтетических соединений, обладающих широким спектром эффектов, включая антивирусные, противоопухолевые, антибактериальные. Некоторые производные изатина являются ингибиторами апоптоза, антиконвульсантами, проявляют антивирусную и антигрибковую активности. Поскольку молекула изатина входит в состав многих лекарственных препаратов, возможность конкуренции последних с эндогенным изатином может влиять на эффективность их лечебного действия. Нами было исследовано влияние 5-нитроизатина и арбидола (противовирусного препарата) на активность растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов человека. 5-нитроизатин является простейшим производным изатина. К этому же классу соединений следует отнести и арбидол, который содержит в своем составе индольное кольцо, составляющее основу молекулы изатина.

Химические структуры соединений приведены ниже:

'О

5-нитроизатин

арбидол (этиловый эфир 1-метил-2 фенил-тиометил-4-диметил аминометил-5-окси-6-бром-индол-3-карбоновой кислоты)

Представленные в настоящей работе данные впервые демонстрируют, что 5-нитроизатин и арбидол в диапазоне концентраций' 0,1 - 10 мкМ не влияли на базальную активность растворимой гуанилатциклазы, но потенцировали активацию фермента нитропруссидом натрия. Рисунок 1 показывает, что оба использованных соединения потенцировали активацию фермента нитропруссидом натрия. Наибольшее усиление индуцированной

нитропруссидом натрия стимуляции гуанилатциклазы достигалось в присутствии 10 мкМ концентраций 5-нитроизатина и арбидола. Поскольку нитропруссид натрия не является прямым донором N0, мы исследовали влияние использованных соединений в 10 мкМ концентрации на стимуляцию гуанилатциклазы прямым NO-донором - спермин NONO в диапазоне концентраций последнего от 1 до 20 мкМ.

Рис. 1. Влияние увеличивающихся концентраций 5-нитроизатина и арбидола на активность растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека, стимулированную нитропруссидом натрия (НН).

; ¡то | | tsoo

j]......

¡S 1М ______________________

! í i«» ' Х- ••'"

¡4 I

i í ам

С! 1 1С.'

КУГ'Ц.НТрй^ИП С;'.И*. VI

Примечание. Стимулированияя НН (10 мкм) активность рГЦ в присутствии увеличивающихся концентраций 5-нитроизатина (□) и арбидола (Д). Ордината: стимулированная НН (10) мкМ активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин). Абсцисса: концентрации соединений (5-нитроизатина и арбидола(мкМ)). Базальиая активность равна 105 ± 5, стимулированная НН (10 мкМ) - 743 ± 52; пмоль цГМФ/мг/мин. Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения).

5-нитроизатин и арбидол синергично усиливали индуцированную спермин NONO активацию гуанилатциклазы с интенсивностью того же порядка, что и в опытах с YC-1 (см. рис.2а). Известно, что основным действием YC-1 является повышение чувствительности фермента к N0, что приводит к сдвигу влево кривой зависимости активации гуанилатциклазы от концентрации N0-донора.

Также как и YC-1, 5-нитроизатин и арбидол вызывали сдвиг влево концентрационио зависимой кривой активации спермин NONO (уменьшение величины ECso - концентрации, равной половине, вызывающей наибольшее стимулирование активности) (см. рис.2а). Величины ECso в присутствии YC-1 снижались с 7,5 мкМ (без YC-1) до 3,0 мкМ, а в опытах с 5-нитроизатином и арбидолом - до 3,0 и 2,0 мкМ, соответственно (см. рис.2б).

В то же время 5-нитроизатин и арбидол не влияли на интенсивность синергичного усиления индуцированной спермин NONO активации гуанилатциклазы в присутствии YC-1 (см. рис.За). Величины ECso для спермин NONO в присутствии YC-1 были равны 3,4 мкМ, а после добавления 5-нитроизатина и арбидола - 3,6 и 3,4 мкМ, соответственно (см. рис.Зб).

Рис. 2 а и б. Влияние 5-нитроизатина и арбидола на стимуляцию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека спермин NONO.

г..........-

.0 5000

О 4500

I .___

IÍ 5 £ 4000 :

3500 -

О О. 3000 -

S 2

2500

5 "

¡i о ¿ о 2000 ■■

1500

i. О 1000 -

> <"

£ 500 -

и 0 :

-г'

1 5 10 20 Концентрации препарата, (мкМ)

100

ДО

1 5 10 20

Концентрации препарата, (мкМ)

Примечание. Рис.2а: Увеличивающиеся концентрации NO-донора, спермин NONO, в отсутствии (•) и в присутствии YC-1 (о) (ЗмкМ), 5-нитроизатина (□) и арбидола (А) (по 10 мкМ). Ордината: стимулированная спермин NONO активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин). Абсцисса; концентрации спермин NONO (мкМ). Базальная активность равна 120 ± 10 (пмоль цГМФ/мг/мин). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения). Рис.2б: Изменение величин ECso кривых зависимости активации гуанилатциклазы от концентрации спермин NONO в отсутствии (•) и после добавления (по отдельности) YC-1 (о) (Змкм), 5-нитроизатина (□) и арбидола (Ж) (по 10 мкМ). Ордината % максимальной активности. Абсцисса: концентрации спермин NONO (мкМ). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения).

Следовательно, 5-нитроизатин и арбидол не конкурировали с YC-1 за связывание, хотя бы частичное, с тем же аллостерическим центром гуанилатциклазы, с которым взаимодействует YC-1.

Рис.3 а и б. Влияние 5-нитроизатина и арбидола на потенцирование индуцированной спермин NONO активации растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека в присутствии YC-1. а б

28000

__ 26000

; § I 24000 i 2 4 22000

■ О _

24000

2 "

_ ^ 20000 I £ isooo ■ I | 16000

i 3 14000 Í о 32000 10000 ■ 8000 5- ¡ 6000

1 | 4000 ■ й 2000 -о -

?• О

.. Í ■v-l

1 Б 20

Спермин NONO, (мкМ)

100

Спермин NONO, |мкМ)

Примечание. Рис.За: Увеличивающиеся концентрации NO-донора, спермин NONO в отсутствии (•) и в присутствии ЗмкМ YC-1 (о) или 3 мкМ YC-1 после добавления 5-нитроизатина (□) или арбидола (А) (по 10 мкм). Ордината: стимулированная спермин NONO активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин). Абсцисса: концентрации спермин NONO (мкМ). Базальная активность равна 120 ± 10 (пмоль цГМФ/мг/мин), Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения). Рис. 36: Изменение величин ECS0 кривых зависимости активации гуанилатциклазы от концентрации спермин NONO в отсутствии (•) и в присутствии 3 мкМ YC-1 (о), или 3 мкМ YC-1 после добавления 5-нитроизатина (□) и арбидола (Á) (по 10 мкМ). Ордината: % максимальной активности. Абсцисса: концентрации спермин NONO (мкМ). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения).

Выше было отмечено, что изатин является составной частью различных природных соединений, обладающих широким спектром эффектов, а также входит в состав многих лекарственных препаратов. Вполне возможна конкуренция последних с эндогенным изатином, которая может влиять на эффективность их лечебного действия. Однако, в наших опытах добавленный изатин практически не изменял ни интенсивности синергичного усиления индуцированной спермин NONO активации гуанилатциклазы в присутствии 5-

нитроизатйна и арбидола (рис.4а) и не влиял на сдвиг влево соответствующих концентрационно зависимых кривых (рис.4б).

Рис. 4 а и б. Влияние изатина на потенцирование индуцированной спермин NONO активации растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека в присутствии 5-нитроизатина и арбидола. а , б

2600

и 2400

О S tí 2200

s S 2000

о Д 1800 -

С Z -1 1600 -

О Z О- 1400 -

с. 1200 -

X 3 л «; 1000

Í о О £ 800 -

о О с. о о 600 -

S 400 -

>- 200 -

5 U 0

5 10

SpNONO.(mkM)

40 -

SpNONO.(mkM)

Примечание. Рис.4а: Увеличивающиеся концентрации NO-донора, спермин NONO, в отсутствии (•) и в присутствии 5-нитроизатина (□) или 5-нитроизатина после добавления изатина (■) и арбидола (Д) или арбидола после добавления изатина (Ж) (по 10 мкМ). Ордината: стимулированная спермин NONO активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин). Базальная активность равна 57 ± 4 (пмоль цГМФ/мг/мин). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения). Рис.4б: Сравнение величин ЕС50 кривых зависимости активации гуанилатциклазы от концентрации спермин NONO в отсутствии (•) и в присутствии 5-нитроизатина (□) или 5-нитроизатина после добавления изатина (■); арбидола (Д) или арбидола после добавления изатина (А) (по 10 мкМ). Ордината: % максимальной активности. Абсцисса: концентрация спермин NONO (мкМ). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения).

Величины ECso для спермин NONO без и в присутствии (по отдельности) 5-нитроизатина и арбидола (по 10 мкМ) равны 7,35; 3,8; 4,2 мкМ, а после добавления изатина (10 мкМ) - 4,2 и 5,0 мкМ, соответственно (см. рис.4б). Эти данные указывают на отсутствие конкуренции между изатином и 5-нитроизатином и арбидолом.

Выявленное нами отсутствие конкуренции между арбидолом и изатином позволяет предположить, что эндогенный изатин не будет влиять на регуляцию NO-стимулированной гуанилатциклазы фармакологическими препаратами, содержащими модифицированное изатиновое кольцо. Роль арбидола в

функционировании сигнальной системы КО-растворимая гуанилатциклаза-цГМФ неизвестна. Несмотря на то, что арбидол действует на уровне клеточных мембран и препятствует проникновению вирусов в клетку, он тем не менее достаточно быстро адсорбируется, распределяется по органам и тканям и обнаруживается в плазме крови. Следовательно, он может взаимодействовать с растворимой гуанилатциклазой. Длительное лечение арбидолом может привести к возникновению дополнительных эффектов, связанных с усилением N0-зависимой активации гуанилатциклазы, на которое следует обращать внимание.

В последнее время в литературе появляется все больше сообщений о вовлечении системы оксид азота - растворимая гуанилатциклаза - цГМФ (прямо или косвенно) в терапевтическое действие некоторых известных лекарств. Астма и другие воспалительные процессы в дыхательных путях характеризуются избыточным образованием оксида азота. Это обусловлено повышением экспрессии индуцибельной 1Ч0-синтазы, резким увеличением активности растворимой гуанилатциклазы и накоплением цГМФ. В качестве лечебного средства при таких заболеваниях наиболее широко и успешно используется муколитический препарат амброксол (лазолван). Ранее было показано, что амброксол является МО-зависимым ингибитором растворимой гуанилатциклазы. Подобные сведения имеют важное значение для создания новых эффективных лекарственных препаратов, а также для уточнения (а возможно, и пересмотра) существующих представлений о механизме терапевтического действия ряда известных лекарств. Так, впервые было показано, что сигнальная система МО-растворимая гуанилатциклаза-цГМФ может быть вовлечена в механизм действия таких широко используемых препаратов, как химиотерапевтические средства: метронидазол (1-(2-оксиэтил)-2-метил-имидазол) и антипротозойный препарат - нитазол (5-ацетиламино-5-нитротиазол). Эти соединения генерируют оксид азота, активируют растворимую гуанилатциклазу и вызывают накопление цГМФ. Одновременно, было установлено, что соединения понижают артериальное давление у гипертензивных крыс с выраженным гипотензивным эффектом, характерным для нитросорбитмононитрата. Полученные результаты пока не позволяют пересмотреть принятые в настоящее время механизмы терапевтического действия этих лекарственных средств. Однако, несомненно, что эти данные необходимо принимать во внимание при оценке эффективности противомикробного действия этих лекарственных средств, возможном возникновении побочных эффектов, а также при направленном создании подобных лекарств нового поколения. В настоящей работе мы исследовали влияние антибиотиков левомицетина и тетрациклина и противовирусного препарата оксолина на сигнальную систему оксид азота - растворимая гуанилатциклаза - цГМФ. Перечисленные препараты широко используются в медицинской практике, однако, возможность их действия на сигнальную систему оксид азота - растворимая гуанилатциклаза -цГМФ не была изучена до настоящего времени. Левомицетин - синтетический

антибиотик широкого спектра действия, он хорошо проникает в органы и жидкости организма, где и может взаимодействовать с гуанилатцйклазой. Тетрациклин также является антибиотиком широкого спектра действия и быстро проникает во многие органы и ткани организма. Оксолин обладает противовирусной активностью.

Левомицетин, тетрациклин и оксолин в диапазоне концентраций 0,1 - 10 мкМ не влияли на базальную активность растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов человека. Рисунок 5 показывает, что все исследованные соединения потенцировали активацию фермента нитропруссидом натрия (10 мкМ). Наибольшее усиление индуцированной нитропруссидом натрия активации гуанилатциклазы достигалось в присутствии 10 мкМ концентраций левомицетина, тетрациклина и оксолина.

Рис.5. Влияние увеличивающихся концентраций левомецитина, тетрациклина и оксолина на активность растворимой гуанилатциклазы (рГц) тромбоцитов человека стимулированную нитропруссидом натрия (НН).

Примечание. Стимулированная НН (10 мкМ) активность рГЦ в присутствии увеличивающихся концентраций левомецитина (А), тетрациклина (□) и оксолина (х) (по 10 мкМ). Ордината: стимулированная НН (10 мкМ) активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин). Абсцисса: концентрация препаратов (левомецитина, тетрациклина, оксолина). Назальная активность равна 107 ± 5, стимулированная НН (10 мкМ) - 1887 ± 132 (пмоль цГМФ/мг/мин). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения).

10000 л

I 20000-

1.0 10,0 концентрация препарата, (икЦ

Поскольку нитропруссид натрия не является прямым донором N0, мы исследовали влияние использованных соединений в 10 мкМ концентрации на стимуляцию гуанилатциклазы спермин NONO в диапазоне концентраций последнего от 1 до 20 мкМ. Рисунок 6а показывает, что все исследованные соединения синергично усиливали (аналогично YC-1) индуцированную спермин NONO активацию растворимой гуанилатциклазы. При этом наиболее сильным активатором фермента оказался оксолин.

Рис. 6 а и б. Влияние левомицетина, тетрациклина и оксолина на стимуляцию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека спермин NONO.

Спермин NONO, (мкМ) Спермин NONO.(mkM)

Примечание. Рис.6а: Увеличивающиеся концентрации NO-донора спермин NONO в отсутствии (•) и в присутствии левомицетина (А),тетрациклина (о) и оксолина (х) (по 10 мкМ). Ордината: стимулированная спермин NONO активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин). Абсцисса: концентрация спермин NONO в пробе (мкМ). Базальная активность гуанилатциклазы равна 123 ± 10 (пмоль цГМФ/мг/мин). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения). Рис. 66: Сравнение величин ECso кривых зависимости активации гуанилатциклазы от концентрации спермин NONO в отсутствии (•) и после добавления левомицетина (А), тетрациклина (□) и оксолина (х) (по 10 мкМ). Ордината: % максимальной активности. Абсцисса: концентрация спермин NONO в пробе (мкМ). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения),

Как видно из рис. 6 б в случае левомицетина, тетрациклина и оксолина сдвига влево концентрационно зависимой кривой не наблюдалось. Величины ECso для спермин NONO без и в присутствии (по отдельности) левомицетина,

тетрациклина и оксолина (по 10 мкМ) равны 6,0; 6,0; 5,5 и 5,0 мкМ, соответственно. То есть соединения эффективно стимулировали NO-зависимую активацию фермента, синергично усиливая вызванную спермин NONO активацию гуанилатциклазы.

Рис. 7 а и б. Влияние левомицетина, тетрациклина и оксолина на потенцирование индуцированной спермин NONO стимуляции растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека в присутствии YC-1.

20000

0 1 1Б000

1 о

I " 12000

S í 5 5

• u sooo h

г?

¿ | 4000

и — . , ^-----. - , ----------------и -,-,---1---,---

1 5 10 л 1 5 10 33

Сперши NONO, (шМ)

Спермин NOMO, (мкМ)

Примечание. Рис.7а: Увеличивающиеся концентрации NO-донора спермин NONO в отсутствии (•) и в присутствии 3 мкМ YC-1 (о) или 3 мкМ YC-1 после добавления левомицетина (А),тетрациклина (□) или оксолина (х) (по 10 мкМ). Ордината: стимулированная спермин NONO активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин). Базальная активность гуанилатциклазы равна 94 ± 8 (пмоль цГМФ/мг/мин). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения). Рис.7б: Изменение величин ECso концентрационно зависимых кривых индуцированной спермин NONO стимуляции рГЦ в отсутствии (•) и в присутствии 3 мкМ YC-1 (о) или 3 мкМ YC-1 после добавления левомицетина (А),тетрациклина (а) и оксолина (х) (по 10 мкМ). Ордината: % стимулированной активности. Абсцисса: концентрация спермин NONO в пробе (мкМ). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные . отклонения).

Рисунок 7а показывает, что интенсивность синергичного усиления индуцированной спермин NONO активации гуанилатциклазы в присутствии YC-1 (ЗмкМ) или YC-1 (ЗмкМ) после добавления (по отдельности) левомицетина, тетрациклина и оксолина практически одна и та же; т.е. добавление этих соединений не изменяет величины потенцирующего влияния YC-1 на активацию фермента NO-донором. Эти соединения не влияли и на сдвиг влево кривой

зависимости активации гуанилатциклазы от концентрации спермин NONO в присутствии YC-1 (ЗмкМ) (см. рис.7б). Величины ECso для спермин NONO без и в присутствии YC-1 (ЗмкМ) равнялись 7,5 и 2,5 мкМ, а при добавлении (по отдельности) левомицетина, тетрациклина и оксолина (по 10 мкМ) эти величины составляли 2,1; 2,2 и 1,6 мкМ, соответственно (рис.7б). То есть все использованные препараты не конкурировали с YC-1 при взаимодействии с ферментом. Отсутствие конкурентных отношений между YC-1 и использованными препаратами исключает возможность взаимодействия левомецитина, тетрациклина и оксолина (хотя бы частично) с тем же аллосгерическим центром фермента, с которым связывается YC-1. Химические структуры препаратов различаются между собой и отличаются от структуры YC-1. Считается общепринятым, что в основе механизма антибактериального действия левомицетина и тетрациклина лежит подавление ими биосинтеза белка микробной клетки. Обнаруженная в настоящей работе способность этих препаратов синергично усиливать (аналогично YC-I) NO-зависимую активацию растворимой гуанилатциклазы указывает на новый биохимический эффект этих соединений. Поскольку лечение этими лекарственными средствами, как правило, достаточно продолжительно, можно предположить возможность возникновения дополнительных эффектов, связанных с резким усилением NO-зависимой активации гуанилатциклазы. Последнее необходимо принимать во внимание.

Выводы

1) Димегин и гематопорфирин активировали фермент. Соединения не конкурировали с YC-1, но вызывали синергичное усиление активации фермента донором N0, что впервые указывало на их новый биохимический эффект.

2) Полиамины увеличивали активность фермента. Соединения потенцировали NO-зависимую активацию фермента: путресцин и спермин вызывали аддитивный эффект, а спермидин синергично усиливал стимуляцию гуанилатциклазы нитропруссидом натрия. Выявленные конкурентные отношения между полиаминами и YC-1 указывали на то, что механизм потенцирующего влияния полиаминов может быть связан с возможностью их взаимодействия с теми же участками фермента, с которыми взаимодействует YC-1.

3) Производные изатина: 5-нитроизатин и арбидол не влияли на базальную активность гуанилатциклазы, но синергично усиливали индуцированную N0-донорами активацию фермента. 5-нитроизатин и арбидол не конкурировали с YC-1, что исключает возможность их взаимодействия с теми же участками, с которыми взаимодействует YC-1. В наших опытах изатин не конкурировал с 5-нитроизатином и арбидолом.

конкурировали с YC-1, что исключало возможность их взаимодействия с теми же участками фермента, с которыми взаимодействует YC-1.

Исследования проведены при финансовой поддержке РФФИ (грант 05-04-48577)

Публикации по теме диссертации

1. И.С. Северина, Н.В. Пятакова, А.Ю. Щеголев, Г.В. Пономарев. YC-1 -аналогичное потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы производными протопорфирина IX // Биохимия.-2006.-71,(3), 426-431.

la. I.S. Severina, N.V. Pyatakova, A.Yu. Shchegolev, G.V. Ponomarev. YC-1 - like potentiation of NO-dependent activation of soluble guanylate cyclase by dérivâtes of protoporphyrin IX // Biochemistry (Moscow).-2006.-7l, (3), 340-344.

2. И.С. Северина, Н.В. Пятакова, А.Ю. Щеголев. Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы полиаминами // Биомедицинская химия.-2007.-53, (1), 44-49.

2а. I.S. Severina, N.V. Pyatakova, A.Yu. Shchegolev. Potentiation of NO-dependent activation of soluble guanylate cyclase by polyamines // Biochemistry (Moscow) Supplement Series В Biomedical Chemistiy.-2007.-l,(3), 254-257.

3. И.С. Северина, Н.В. Пятакова, А.Ю. Щеголев, Т.А. Сидорова. YC-1 -аналогичное потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы адренохромом. Биомедицинская химия.- 2008,- 54, (6), 679686.

За. I.S. Severina, N.V. Pyatakova, A.Yu. Shchegolev, Т.А. Sidorova. YC-1 - like potentiation of NO-dependent activation of soluble guanylate cyclase by adrenochrome // Biochemistry (Moscow) Supplement Series В Biomedical Chemistry.-2009.-3, (1), 44-47.

4. А.Ю. Щеголев, Т.А. Сидорова, И.С. Северина. Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы левомицетином, тетрациклином и оксолином // Биомедицинская химия.-2009.-55, (3), 331-337.

5. В.В.Бахаров, А.А. Гидаспов, Е.В. Переседова, В.Г. Граник, Н.Б. Григорьев, И.С. Северина, А.Ю. Щеголев, А.Б. Шереметьев. 1,3,5-триазиннитроловые кислоты. Синтез и NO-генерирующая способность. Известия Академии наук, серия химическая, 2009, (9), 1900-1910.

Щеголев Алексей Юрьевич «Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы» Данные, представленные в настоящей работе, впервые показывают, что производные ПП (димегин и гематопорфирин) синергично усиливают активацию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) NO-донором. Этот факт указывает на новый биохимический эффект этих соединений, который может иметь важное значение. Было изучено влияние полиаминов (путресцина, спермидина, спермина) на систему N0- рГЦ-цГМФ. Все полиамины потенцировали активацию NO-донором. Этот факт указывает на новый биохимический эффект этих соединений, который необходимо принимать во внимание, особенно учитывая эндогенную природу полиаминов. Было изучено влияние производных изатина (5-нитроизатина и арбидола) на активацию рГЦ NO-донорами. Эти соединения синергично усиливали (аналогично YC-1) активацию фермента NO-донорами. Этот факт указывает на новый биохимический эффект этих соединений, который может иметь важное значение. Было изучено влияние антибиотиков левомицетина и тетрациклина и противовирусного препарата оксолина на систему NO-рГЦ-цГМФ. Все препараты синергично усиливали (аналогично YC-2) активацию фермента NO-донорами. Выявленные регуляторные свойства левомицетина, тетрациклина и оксолина синергично увеличивать NO-зависимую активацию рГЦ могут указывать на дополнительные фармакологические эффекты, которые могут возникать при продолжительном лечении данными лекарственными средствами.

Schegolev Aleksei

«Potentiation of NO-dependent activation of soluble guanylate cyclase» The data presented here demonstrate for the first time that the derivates of PTP (dimegin and haematophorphyryn) produce a synergistic effect on the activation of soluble guanylate cyclase (sGC) by NO-donor. This fact represent a new biochemical effect of these compounds that may have important significance. The influence of polyamines (putrescine, spermidine, spermine) on the NO-sGC-cGMP system was investigated. All polyamines used potentiated the sGC activation by NO-donor. This fact represent a new biochemical effect of these compounds, which should be taken into consideration, especially due to the endogenous nature of polyamines. The influence of derivates of isatin (5-nitroisatin and arbidol) on activation of sGC by NO-donors was investigated. These compounds synergistically increased (similar to YC-I) activation of the enzyme by NO-donors. This fact represent a new biochemical effect of these compounds that may have important significance. The influence of antibiotics laevomycetin and tetracycline and the antivirus agent oxolin on the N0-sGC-cGMP system was investigated. All preparations used synergistically increased (similar to YC-1) activation of the enzyme by NO-donors. The revealed regulatory properties of laevomycetin, tetracycline and oxolin to increase synergistically NO-dependent activation of sGC may cause additional pharmacological effects during prolong treatment by these drugs.

Подписано в печать: 07.04.2010

Заказ № 3512 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Щеголев, Алексей Юрьевич

Введение .4 стр.

Цель и задачи исследования.7 стр.

Обзор литературы.8 стр.

Глава 1. О растворимой гуанилатциклазе.8 стр.

1. Основные характеристики растворимой гуанилатциклазы.8 стр.

2. Субъединичная структура и изоформы растворимой гуанилатциклазы.10 стр.

3. Активная форма растворимой гуанилатциклазы.14 стр.

4. Структурные особенности субъединиц фермента.15 стр.

5. -N-концевой гем-связывающий домен.17 стр.

6. -центральный димеризационный домен.21 стр.

7. -С-концевой каталитический домен.23 стр.

8. Механизм каталитической активности растворимой гуанилатциклазы.26 стр.

Глава 2. Оксид азота - эндогенный активатор растворимой гуанилатциклазы.28 стр.

1. Растворимая гуанилатциклаза-как основной внутриклеточный рецептор оксида азота.28 стр.

2. Механизм взаимодействия оксида азота с растворимой гуанилатциклазой.

3. Основные физиологические эффекты оксида азота.

30 стр. .32 стр.

Глава 3. YC-1 - NO-независимый активатор растворимой гуанилатциклазы.34 стр.

Материалы и методы исследований.40 стр.

1. Использованные реактивы.40 стр.

2. Объект исследования.41 стр.

3. Выделение тромбоцитов из крови человека.41 стр.

4. Определение концентрации белка.41 стр.

5. Ферментативная реакция.42 стр.

6. Имму но ферментный анализ.43 стр.

7. Статистическая обработка результатов.46 стр.

Результаты исследований.47 стр.

1. Потецирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы производными протопорфирина IX: (2,4-ди -(1-метоксиэтил)-дейтеропорфирин

IX) - димегин и гематопорфирин.47 стр.

2. Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы полиамииами: путресцин, спермидин, спермин.52 стр.

3. Потенцирование NO - зависимой активации растворимой гуанилатциклазы производными изатина (эндогенного индола): 5-нитроизатин и арбидол.56 стр.

4. Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы антибиотиками: левомицетином, тетрациклином и противовирусным препаратом оксолином.66 стр.

Обсуждение результатов.74 стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы"

Эндогенный оксид азота (N0) образуется из L-аргинина за счет окисления аминогруппы гуанидинового фрагмента под действием L-аргинин- NO-синтетазы и идентичен эндотелиальному фактору релаксации (ЭДФР) [1]. Эндогенный оксид азота участвует в процессах нейротрансмиссии, является цитотоксическим агентом и мощным фактором гемостаза [2]. Кроме того, оксид азота ингибирует агрегацию тромбоцитов и рассматривается в настоящее время как эндогенный вазодилататор. Антиагрегантные свойства и сосудорасширяющее действие оксида азота связаны с активацией растворимой гуанилатциклазы и накоплением циклического 3,5-гуанозинмонофосфата (цГМФ) [3].

Гуанилатциклаза катализирует биосинтез цГМФ из гуанозин-5-трифосфата (ГТФ). Гуанилатциклаза существует в двух формах: растворимой и мембраносвязанной. В настоящее время достоверно установлено, что эти формы не только самостоятельные белки, но и ферменты, с различными механизмами регуляции [4]. Растворимая гуанилатциклаза является гетеродимером, состоящим из двух иммунологически различных субъединиц. Мембранная форма представляет собой трансмембранный фермент, состоящий из одной полипептидной цепи [5;6] и служит рецептором для натрий уретических пептидов [7]. В данной работе будет рассматриваться только растворимая форма гуанилатциклазы, так как именно этот фермент лежит в основе молекулярных механизмов действия оксида азота.

Интерес к гуанилатциклазе резко возрос в конце 80-х годов после идентификации оксида азота в качестве эндотелиального фактора релаксации (ЭДФР) [8]. Именно тогда появилась новая внутриклеточная сигнальная система оксид азота - растворимая гуанилатциклаза - цГМФ [8].

Важная роль повсеместно распространенной сигнальной системы: N0 - растворимая гуанилатциклаза - цГМФ в функции клеток, нарушение активности этой системы при многих патологических состояниях (гипертония, астма, сепсис, септический шок, злокачественные новообразования) требуют создания препаратов, которые бы направленно регулировали активность этой системы и таким образом устраняли бы возникшие нарушения. Подобные модуляторы активности гуанилатциклазы не только способствовали бы выяснению физиологической значимости этого фермента, но и, что не менее существенно, могли бы использоваться в качестве терапевтических средств [9].

Наиболее известными лекарственными средствами, которые долгие годы используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний: стенокардии, тяжелых форм гипертонии, комплексного лечения инфаркта миокарда и сердечной недостаточности и связанных с недостаточностью образования эндогенного оксида азота, являются органические нитраты (нитроглицерин, изосорбитдинитрат и др.) [9]. Однако механизм действия этих соединений был установлен только в конце 70-х годов, когда было обнаружено, что в результате их метаболизма образуется оксид азота, активирующий растворимую гуанилатциклазу, что приводит к накоплению цГМФ. Последний активирует цГМФ-зависимые протеинкиназы, а также кальций-зависимую АТФазу, участвующих в дефосфорилировании легких цепей миозина, что приводит к выходу ионов кальция из мышечных волокон и в конечном итоге к вазодилятации. Несмотря на накопленное к настоящему времени достаточно большое число активаторов гуанилатциклазы, относящихся к донорам оксида азота, поиск новых соединений, которые могли бы избирательно стимулировать активность этого фермента, продолжается. В то же время, в последние годы, стали высказываться предположения, что использование лекарств, аналогичных органическим нитратам и другим донорам оксида азота, может стать проблематичным. Во-первых, это связано с феноменом толерантности, развивающимся при продолжительном применении нитратов. Механизм, лежащий в основе этой толерантности, остается невыясненным, но он может быть связан со сниженной метаболической активностью этих соединений [10]; с избыточным уровнем синтеза ряда эндогенных веществ, регулирующих тонус и состояние сосудистой стенки (эндотелина, ангиотензина 2, супероксид радикала и т.д.) в ответ на лечение [11]; или со снижением чувствительности растворимой гуанилатциклазы к оксиду азота [12]. Во-вторых, при использовании подобных соединений in vivo возможно высвобождение из них оксида азота, его свободная диффузия, прямое взаимодействие с другими молекулами и образованием токсических веществ. В связи с этим поиск соединений, способных активировать гуанилатциклазу по NO-независимому механизму, представлял бы значительный интерес и мог способствовать появлению новых эффективных лекарственных средств.

Таким соединением оказался YC-1 (3-(5'-оксиметил-2'-фурил)-1-бензил индазол) который является не только NO-независимым активатором фермента, но и усиливает активацию фермента донорами оксида азота [13]. В присутствии YC-1 и донора оксида азота наблюдается (в зависимости от концентрации соединений) аддитивная или синергичная активация фермента. Этот эффект имеет большое фармакотерапевтическое и физиологическое значение. Использование соединений, аналогичных по своему действию YC-1, позволило бы значительно снижать дозы нитровазодилятаторов без снижения эффективности их лечебного действия. Это в свою очередь снизило бы возникновение нежелательных побочных эффектов, в том числе и толерантность при их длительном применении. В последнее время обращается особое внимание на возможность существования эндогенных соединений, аналогичных по своему действию YC—1.

Известно, что YC-1 усиливает NO-зависимую активацию гуанилатциклазы и при физиологических концентрациях оксида азота и таким образом повышает эффективность эндогенного N0 в проявлении своих физиологических эффектов. В связи с этим выявление эндогенных соединений, аналогичных по своему действию YC-1, заслуживает особого внимания. Однако данные о них пока отсутствуют.

Цель исследования

Выявление, изучение и анализ соединений, способных усиливать активацию растворимой гуанилатциклазы NO-донорами.

Задачи исследования

Были изучены следующие группы соединений:

1. Производные протопорфирина IX: (2,4-ди-(1-метоксиэтил)-дейтеропорфирин IX) - димегин и гематопорфирин.

2. Полиамины (путресцин, спермидин, спермин)

3. Производные изатина (эндогенного индола): 5-нитроизатин и арбидол противовирусный препарат)

4. Лекарственные средства: антибиотики - левомицетин и тетрациклин, и противовирусный препарат - оксолин.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Щеголев, Алексей Юрьевич

Выводы

2) Полиамины увеличивали активность фермента. Соединения потенцировали N0-зависимую активацию фермента: путресцин и спермин вызывали аддитивный эффект, а спермидин синергично усиливал стимуляцию гуанилатциклазы нитропруссидом натрия. Выявленные конкурентные отношения между полиаминами и YC-1 указывали на то, что механизм потенцирующего влияния полиаминов может быть связан с возможностью их взаимодействия с теми же участками фермента, с которыми взаимодействует YC-1.

3) Производные изатина: 5-нитроизатин и арбидол не влияли на базальную активность гуанилатциклазы, но синергично усиливали индуцированную NO-донорами активацию фермента. 5-нитроизатин и арбидол не конкурировали с YC-1, что исключает возможность их взаимодействия с теми же участками, с которыми взаимодействует YC-1. В наших опытах изатин не конкурировал с 5-нитроизатином и арбидолом.

4) Лекарственные средства: левомецитин, тетрациклин и оксолин не влияли на базальную активность гуанилатциклазы, синергично усиливали индуцированную NO-донором активацию фермента. Использованные препараты не конкурировали с YC-1, что исключало возможность их взаимодействия с теми же участками фермента, с которыми взаимодействует YC-1.

Исследования проведены при финансовой поддержке РФФИ (грант 05-04-48577)

Заключение

Открытие оксида азота, идентификация его в качестве эндотелиального фактора релаксации (ЭДФР), установление роли растворимой гуанилатциклазы как основного внутриклеточного рецептора оксида азота, ответственного за реализацию его физиологических эффектов, привели к появлению новой внутриклеточной сигнальной системы оксид азота - растворимая гуанилатциклаза — цГМФ, выполняющей важную роль в регуляции функции клетки. Нарушение активности этой системы при многих патологических состояниях требует создания препаратов, которые бы направленно регулировали активность этой системы и таким образом устраняли бы возникшие нарушения. Таким соединением оказался YC-1 (производное бензил индазола). YC-1 является NO-независимым активатором растворимой гуанилатциклазы, обладающим гипотензивным и антиагрегантным действием. При этом, что особенно важно, YC-1 потенцирует и синергично усиливает активацию фермента NO-донорами и другими нитровазодилататорами. В результате YC-1 позволяет снижать дозы нитровазодилататоров без изменения эффективности их леченого действия. Это, в свою очередь, снижает или устраняет возможность возникновения нежелательных побочных эффектов, в том числе и развитие толерантности, при их длительном применении. Несмотря на отсутствие в настоящее время единого представления о механизме активации фермента оксидом азота в присутствии YC-1, сам факт открытия YC-1 и соединений аналогичных ему по своему действию, имеет огромное значение для решения задач практической медицины.

В обзоре Тулис [114], посвященному рассмотрению важной роли YC-1 при нарушениях функций сердечно-сосудистой системы, автор обращает особое внимание на возможность существования эндогенных соединений, аналогичных по своему действию YC-1. Выявление и исследование подобных соединений представляется автору важным и заслуживающим особого внимания. Потенцирующее влияние YC-1 на стимуляцию растворимой гуанилатциклазы NO-донорами наблюдается и при физиологических концентрациях оксида азота порядка от 1 до 100 нМ [72]. Поэтому, выявление соединений эндогенной природы, аналогичных по своему действию YC-1, приобретает особое значение. В нормальных условиях, образующийся эндогенный оксид азота, в присутствии подобных соединений, может быть более эффективным в проявлении своих физиологических эффектов. При патологических состояниях, накопление эндогенных соединений, обладающих свойствами YC-1, может привести к тяжелым последствиям, связанным с падением артериального давления и развитием септического шока. Благодаря вездесущей природе внутриклеточной сигнальной системы N0 -растворимая гуанилатциклаза - цГМФ передача внутри и внеклеточных сигналов имеет глубокое (пато)физиологическое значение. Соединения эндогенной природы, аналогичные по действию YC-1, могут служить в качестве потенциальных терапевтических средств и быть использованными в медицинской практике.

YC-1 был впервые описан в конце 80-х, начале 90-х годов прошлого века. Однако, интерес и внимание к этому соединению не ослабевают и в настоящее время. В последние годы, накопились данные, свидетельствующие о многофункциональных свойствах YC-1. Так, появились сообщения об антимитотическом и проапоптическом действии YC-1 [115,116]. Недавно было показано, что YC-1 не только усиливает NO-зависимую активацию растворимой гуанилатциклазы, но и стимулирует экспрессию индуцибельной NO-синтазы [117]. В то же время, продолжается поиск, выявление и исследование соединений, способных (аналогично YC-1) потенцировать NO-зависимую активацию растворимой гуанилатциклазы [118-120].

В представленной работе впервые были выявлены и исследованы соединения эндогенной природы, обладающие способностью YC-1, синергично усиливать NOзависимую активацию гуанилатциклазы. Такими соединениями оказались производные протопорфирина IX - гематопорфирин IX и полиамины (путресцин, спермидин, спермин). Хотя молекулярный механизм усиления NO-зависимой активации гуанилатциклазы этими соединениями не был выяснен, полученные результаты впервые указывают на новый биохимический эффект этих соединений, который позволит более глубоко понять их специфические, биологические функции. Помимо использованных эндогенных соединений, способных аналогично YC-1 усиливать стимуляцию гуанилатциклазы N0-донорами, аналогичной способностью обладали и некоторые фармакологические средства: антивирусные препараты — арбидол и оксолин и антибиотики - левомицетин и тетрациклин. Также как и в случае исследованных эндогенных соединений, механизм действия использованных лекарственных препаратов не выяснен. Однако, сам факт проявления этими соединениями способности синергично усиливать NO-зависимую активацию гуанилатциклазы имеет большое фармакотерапевтическое значение. Все изученные лекарственные препараты широко используются в медицинской практике. Как правило, лечение ими достаточно продолжительно. Поэтому, вполне возможно возникновение дополнительных эффектов, связанных с резким усилением NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы. Последнее обстоятельство необходимо принимать во внимание.

Таким образом, представленные в настоящей работе данные о способности соединений, как эндогенной природы, так и являющихся лекарственными препаратами, усиливать (аналогично YC-1) стимуляцию растворимой гуанилатциклазы N0-донорами, являются актуальными и представляют значительный интерес не только в плане широких энзимологических исследований, но и для решения задач практической медицины.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Щеголев, Алексей Юрьевич, Москва

1. Palmer R., Ashton D., Moncada S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. //Nature.-1988.-333, 664-666.

2. Palmer R., Ferrige A., Moncada S. Nitric oxide induces cultured cortical neuron apoptosis. //Nature.-1987.-327, 524-526.

3. Северина И.С. Растворимая гуанилатциклаза в молекулярном механизме физиологических эффектов оксида азота. // Биохимия.- 1998.- 63, выпуск 7.-е. 939 -947.

4. Северина И.С. Оксид азота. Роль растворимой гуанилатциклазы в механизмах его физиологических эффектов. // Вопросы мед. Химии.-2002.- 48, 3 35.

5. Lucas К.А., Pitari G.M., Kazerounian S., Ruiz-Stewart I., Park J., Schulz S., Chepenik K.P., Waldman S.A. Guanylyl cyclases and signaling by cyclic GMP. // Pharmacol. Rev.-2000.-52, 375-413.

6. Chinkers M., Garbers D., Chang M., Lowe D., Chin H., Goeddel D., Schulz S. A membrane form of guanylate cyclase is an atrial natriuretic peptides receptor. // Nature.-1989.-338, 78-83.

7. Ignarro L.J. Haem dependent activation of cytosolic guanylate cyclase by nitric oxide: a widespread signal transduction mechanism. // Bioch. Society Transductions.-1993.-20, 465469.

8. Hobbs A.J., Ignarro L.J. Nitric oxide-cyclic GMP-signal transduction system. // Methods Enzymol.-1996.-269, 134-148.

9. Buchmuller Rouiller Y., Mauel J. Macrophage activation for intracellular killing as induced by a Ca2+ ionophore. Dependence on L-arginine-derived nitrogen oxidation products. //J. Immunol.-1991.-146, 217-223.

10. Munzel Т., Kurs S., Heitzer Т., Harrison D. New insights into mechanism underlying nitrate tolerance. // Am. J. Cardiology.- 1996.-77,24C 30C.

11. Straub A., Stasch J.P., Alonso-Alija C., Benet-Buchholts J., Ducke В., Feurer A., Furstner C. NO-independent stimulators of soluble guanylate cyclase. // Bioorg. Med. Chem. Lett.- 2001.-11,781 -784.

12. Friebe A., Koesling D. Mechanism of YC-l-induced activation of soluble guanylyl cyclase. // Molecular Pharmacology.-1998.-53, 123 127.

13. Walter U. Cyclic-GMP-regulated enzymes and their possible physiological functions. // Adv. Cyclic Nucleotide Protein Phosphorylation Res.-1984.-17,249 258.

14. Hobbs A.J. Soluble guanylate cyclase: the forgotten sibling. // TiPS.-1997.-18, 484 -491.

15. Hardman J., Sutherland E. Guanyl cyclase, an enzyme catalyzing the formation of guanosine 3',5'-monophosphate from guanosine trihosphate. // J.Biol.Chem.-1969.-244, 6363-6370.

16. Ishikawa E., Ishikawa S., Davis Y., Sutherland E. Determination of guanosine 3',5'-monophosphate in tissues and of guanyl cyclase in rat intestine. // J.Biol.Chem.-l969.-244, 6371-6376.

17. Schultz G., Bohme E., Munske K. Guanyl cyclase. Determination of enzyme activity. // Life Sci.-1969.- 8, 1323-1332.

18. White A., Aurbach G. Detection of guanyl cyclase in mammalian tissues. // Biochem. Biophys. Acta.-1969,- 191, 686-697.

19. Furchgott R., Zawadski J. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. //Nature.-1980.-288, 373-376.

20. Ignarro L.J. Nitric oxide-mediated vasorelaxation. // Thromb. Haemost.- 1993.- 70, 148-151.

21. McDonald L., Murad F. Nitric oxide and cGMP signaling. // Adv. Pharmacol.- 1995.34, 263-275.

22. Ignarro L.J., Wood K.S. Activation of purified soluble guanylate cyclase by arachidonic acid requires absence of enzyme-bound heme. // Biochem. Biophys. Acta.- 1987.928, 160-170.

23. Gerzer R., Garbers D. The separation of the heme and apoheme forms of soluble guanylate cyclase. // Fed. Proc.-1982.-41, 1410-1413.

24. Craven R., DeRuberties F. Requirement for heme in the activation of purified guanylate cyclase by nitric oxide. // Biochem. Biophys. Acta.-1983.-745, 310-321.

25. Buechler W.A., Nakane M., Murad F. Expression of soluble guanylate cyclase activity requires both enzyme subunits. // Biochem. Biophys. Res. Coramun.-1991.-174, 351-357.

26. Yuen P.S.T., Potter L.R., Garbers D.L. A new form of guanylyl cyclase is preferentially expressed in rat kidney. // Biochemistry.-1990.-29, 10872-10878.

27. Harteneck C. Molecular cloning and expression of a new alpha-subunit of soluble guanylyl cyclase. Interchangeability of the alpha-subunits of the enzyme. // FEBS Lett.-1991,-292, 217-222.

28. Gupta G., Azam M., Yang L. The beta2 subunit inhibits stimulation of the alphal/betal form of soluble guanylyl cyclase by nitric oxide. Potential relevance to regulation of blood pressure. // J.Clin.Invest.-1997.-100, 1488.

29. Mayer В., Koesling D. cGMP signalling beyond nitric oxide. // Trends Pharmacol. Sci.- 2001.-22, 546-548.

30. Zabel. U., Weeger. M., La M ., Schmidt. H.H. Human soluble guanylate cyclase: functional expression and revised isoenzyme family. // Biochem. J.-1998.-335, 51-57.

31. Lyer L.M., Anantharaman V., Aravind L. Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins. // BMC Genomics.- 2003.-4, 5.

32. Nioche P., Berka V., Vipond J., Minton N., Tsai A.L., Raman C.S. Femtomolar sensitivity of a NO sensor from Clostridium botulinum. // Science.-2003.-306, 1550-1553.

33. Chhajlani V., Frandberg P.A., Ahlner J., Axelsson K.L., Wikberg J.E. Heterogeneity in human soluble guanylate cyclase due to alternative splicing. // FEBS Lett.-1991.-290, 157-158.

34. Giuili G., Scholl U., Bulle F., Guellaen G. Molecular cloning of the cDNAs coding for the two subunits of soluble guanylyl cyclase from human brain. // FEBS Lett.- 1992.-304, 8388.

35. Simpson P.J., Nighorn A., Morton D.B. Identification of a novel guanylyl cyclase that is related to receptor guanylyl cyclases, but lacks extracellular and transmembrane domains. // J.Biol.Chem.-1999.-274,4440-4446.

36. Papapetropoulos A., Pyriochou A. Soluble guanylyl cyclase: more secrets revealed. // Cellular Signaling. 2005.-17, 407 413.

37. Wolin M., Wood K., Ignarro L. Guanylate cyclase from bovine lung. A kinetic analysis of the regulation of the purified soluble enzyme by protoporphyrin IX, heme and nitrosyl-heme. //J.Biol.Chem.-1982.-257, 13312.

38. Foerster J.,Harteneck C., Malkewitz J. A functional heme-binding site of soluble guanylyl cyclase requires intact N-termini of alpha 1 and beta 1 subunits. // Eur.J.Biochemistry.- 1996.-240, 380-386.

39. Zhao Y., Marietta M. A. Localization of the heme binding region in soluble guanylate cyclase. //Biochem.-l 997.-36, 15959-15964.

40. Evgenov О., Pacher P., Schmidt P., Hasko G, Schmidt H.H., Stasch J.P. N0-independent stimulators and activators of soluble guanylate cyclase: discovery and therapeutic potential. // Nat. Rev. Drug Discov.-2006.-5, 755-768.

41. Zhao Y., Schelvis J., Babcock G., Zhao Y., Schelvis J.P., Babcock G.T., Marietta M.A. Identification of histidine 105 in the betal subunit of soluble guanylate cyclase as the heme proximal ligand. // Biochemistry.- 1998.-37, 4502-4509.

42. Friebe A., Wedel В., Harteneck C., Foerster J., Schultz G., Koesling D. Functions of conserved cysteines of soluble guanylyl cyclase. // Biochemistry.-1997.-36, 1194-1198.

43. Martin E., Sharina I., Kots A. A short history of cGMP, guanylyl cyclases, and cGMP-dependent protein kinases. // Handb Exp Pharmacol.-2009.-191, 1-14.

44. Schmidt P., Schramm M., Schroder H. Identification of residues crucially involved in the binding of the heme moiety of soluble guanylate cyclase. // J.Biol. Chem.-2004.-279, 3025-3032.

45. Tesmer J.J., Sunahara R.K., Gilman A. Crystal structure of the catalytic domains of adenylyl cyclase in a complex with Gsalpha.GTPgammaS. // Science.-1997.-278, 1907-1916.

46. Sase K., Michel T. Caveolin versus calmodulin. Counterbalancing allosteric modulators of endothelial nitric oxide synthase. J.Biol. Chem.-1997.-272(41), 25907-25912.

47. Minushkina L.O., Zateishchikov D.A., Zateishchikova A.A., Zotova I.V., Kudriashova O.Y., Nosikov V.V., Sidorenko B.A. NOS3 gene polymorphism and left ventricular hypertrophy in patients with essential hypertension. // Kardiol.-2002.-42(3), 42-43.

48. Ко F.N., Wu C.C., Kuo S.C., Lee F.Y., Teng C.M. YC-1, a novel activator of platelet guanylate cyclase. // Blood.-1994.-84,4220-4233.

49. Rothermund L., Friebe A., Paul M., Koesling D., Kreutz R. Acute blood pressure effects of YC-1-induced activation of soluble guanylyl cyclase in normotensive and hypertensive rats. // Br. J. Pharmacology.-2000.-130, 205-208.

50. Friebe A., Schultz G., Koesling D. Sensitizing soluble guanylyl cyclase to become a highly СО-sensitive enzyme. // EMBO J.-1996.-15, 6863-6868.

51. Wu C.C., Ко F.N., Kuo S.C., Lee F.Y., Teng C.M. YC-1 inhibited human platelet aggregation through NO-independent activation of soluble guanylate cyclase. // Br. J.Pharmacology.-1995.-116, 1973-1978.

52. Mayer В., Brunner F., Schmidt K. Novel actions of methylene blue. // Eur. Heart. J.- 1993.-14 (Suppl.l), 22-26.

53. Martin E., Lee Y.C., Murad F. YC-1 activation of human soluble guanylyl cyclase has both heme-dependent and heme-independent components. // Proc. Natl. Acad. Sci.-2001.-98, 12938-12942.

54. Mayer В., Koesling D. GMP signalling beyond nitric oxide. // Trends Pharmacol. Sci.-2001.-22, 546-548.

55. Kharitonov V.G, Russwurm M., Magde D., Sharma V.S., Koesling D. Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase. // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1997.-239,284-286.

56. Russwurm M., Mergia E., Mullerschusen F., Koesling D. Inhibition of deactivation of NO-sensitive guanylyl cyclase accounts for the sensitizing effect of YC-1. // J.Biol.Chem.-2002.-28, 24883-24888.

57. Cary S.P., Winger J.A., Marietta M.A. Tonic and acute nitric oxide signaling through soluble guanylate cyclase is mediated by nonheme nitric oxide, ATP, and GTP. // Proc.Natl.Acad. Sci.-2005.-102, 13064-13069.

58. Russwurm M., Koesling D. NO activation of guanylyl cyclase. // EMBO J.-2004.-23, 4443-4450.

59. Stone J.R., Marietta M.A. Soluble guanylate cyclase from bovine lung: activation with nitric oxide and carbon monoxide and spectral characterization of the ferrous and ferric states. //Biochemistry.-1994.-33, 5636-5640.

60. Denninger J.W., Schelvis J.P., Brandish P.E., Zhao Y., Babcock G.T., Marietta M.A. Interaction of soluble guanylate cyclase with YC-1: kinetic and resonance Raman studies. // Biochemistry.- 2000.-39,4191-4198.

61. Galle J., Zabel U., Hubner U., Hatzelmann A., Wagner В., Wanner C., Schmidt H.H. Effects of the soluble guanylyl cyclase activator, YC-1, on vascular tone, cyclic GMP levels and phosphodiesterase activity. //Br. J. Pharmacology.-1999.-127,195-203.

62. Hurley J.H. The adenylyl and guanylyl cyclase superfamily. // Curr.Opin.Struct.Biol.-1998.-8,770-777.

63. Liu Y., Ruoho A.E., Rao V.D., Hurley J.H. Catalytic mechanism of the adenylyl and guanylyl cyclases: modeling and mutational analysis. // Proc.Natl.Acad. Sci.-1997.-94, 13414-13419.

64. Friebe A., Russwurm M., Koesling D. A point-mutated guanylyl cyclase with features of the YC-1-stimulated enzyme: implications for the YC-1 binding site? // Biochemistry.-1999.-38, 15253-15257.

65. Lamothe M., Fu-Jung Chang., Balashova N., Shirokov R., Beuve A. Functional characterization of nitric oxide and YC-1 activation of soluble guanylyl cyclase: structural implication for the YC-1 binding site? // Biochemistry.-2004.-43, 3039 3048.

66. Sopkova-De Olivera Santos J., Collot V., Bureau I. YC-1, an activation inductor of soluble guanylyl cyclase. Acta Cristallogr.-2000.-56, 1035-1036.

67. Северина И.С. Оксид азота. Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы (пато)физиологическое и фармакотерапевтическое значение. // Биомедицинская химия.-2007.- том 53, вып.4, с. 385-399.

68. Waldman S.A., Murad F. Cyclic GMP syntesis and function. // Pharmacol. Rev.-1987.-39(3), 163-196.

69. Yazawa S., Tsychita H., Makino R. Functional characterization of two nucleotide-binding sites in soluble guanylate cyclase. // J.Biolog.Chem.-2006.-281, 21763-21770.

70. Stasch J.P., Dembowsky К., Perzborn E., Stahl E., Schramm M. Cardiovascular actions of a novel NO-independent guanylyl cyclase stimulator, BAY 41-8543: in vivo studies. // Br. J. Pharmacology.-2002.-135, 344 355.

71. Doggrell S.A. Clinical potential of nitric oxide-independent soluble guanylate cyclase activators. // Curr. Opin.Investig. Drugs.-2005.-6, 874-878.

72. Bradford H.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical Biochemistry.-1976.-72, 248-254.

73. Garbers D.L., Murad F. Guanylate cyclase assay: methods // Adv. Cycl. Nucleotide Res. .-10, 57-67.

74. Чирков Ю.Ю., Тыщук И.А., Белушкина H.H., Северина И.С. Гуанилатциклаза тромбоцитов крови человека. // Биохимия.-1987.-52, 956-963.

75. Кирилова Г.В., Яшунский В.Г., Бабушкина Т.А., Пономарев Г.В. // БИ, А.с.857138 СССР.-1981 .-№31,115.

76. Жамкочан Г.А., Кирилова Г.В., Пономарев Г.В., Сухин Г.М., Романычев Ю.А., Черненко О.В., Ярцев Е.И., Яшунский В.Г. // БИ, А.с.1160710 СССР.-1984.

77. Ignarro L.J., Ballot В., Wood K.S. Regulation of soluble guanylate cyclase activity by porphyrins and metalloporphyrins. //J.Biolog.Chem.-l 984.-259, 6201-6207.

78. Perachi M., Toschi V., Bamonti-Catena F., Lombardi L., Baregg В., Catelezzi A., Colombi M., Maiole А.Т., Polli E.E. Plasma cyclic nucleotide levels in acute leukemia patients. // Blood.-l 987.-69, 1613-1616.

79. Schmidt H.H., Lohmann S.M., Walter U. The nitric oxide and cGMP signal transduction system: regulation and mechanism of action. // Biochim Biophys Acta.-1993.-1178(2), 153-175.

80. Morbidelli L., Chang C.H., Douglas J.G., Granger H.J., Ledda F., Ziche M. Nitric oxide mediates mitogenic effect of VEGF on coronary venular endothelium. // Am. J. Physiol. 1996.-270, H411-415.

81. Clo C., Tantini В., Pignatti C., Caldarera C.M. Increased cyclic GMP content in confluent and serum-restricted heart cell cultures exposed to polyamines. // J. Mol. Cell Cardiol.- 1983.-15(2), 139-143.

82. Clow A., Davidson J., Glover V., Halket J.M., Milton A.S., Sandler M., Watkins P.J. Isatin and tribulin concentrations are increased in rabbit brain but not liver following pentylenetetrazole administration. //Neurosci Lett.-1989.- 107(1-3),327-30.

83. Medvedev A.E., Glover V. Tribulin and endogenous MAO-inhibitory regulation in vivo. //Neurotoxicology.-2004.-25(l-2), 185-192.

84. Medvedev A.E., Buneeva O.A., Glover Y. Interaction of pyruvate kinase with isatin and deprenyl. // Biologies Targets a Therapy .- 2007.- (2), 1-12.

85. Medvedev A.E., Sandler M., Glover V. The influence of isatin on guanylyl cyclase of rat heart membranes. // Eur. J. Pharmacol.-1999.-384, 239-241.

86. Glover V., Medvedev A., Sandler M. Isatin is a potent endogenous antagonist of guanylate cyclase-coupled atrial natriuretic peptide receptors. // Life Sci.- 1995.- 57 , 20732079.

87. Medvedev A.E., Clow A., Sandler M., Glover V. Isatin: a link between natriuretic peptides and monoamines? // Biochem Pharmacol.-1996.- 52, 385-391. •

88. Medvedev A.E., Bussygina O.G., Pyatakova N.V., Sandler M., Severina I. Effect of isatin on nitric oxide-stimulated soluble guanylate cyclase from human platelets. // Biochem. Pharmacol., 63, 763-766.

89. Chapman J.G., Magee W.P., Stukenbrok H.A., Beckius G.E., Milici A.J., Tracey W.R. A novel nonpeptidic caspase-3/7 inhibitor, (S)-(+)-5-l-(2-methoxymethylpyrrolidinyl)sulfonyl]isatin reduces myocardial ischemic injury. // Eur. J.Pharmacol., 456, 59-68.

90. Verma M., Pandeya S.N., Singh K.N., Stables J.P. Anticonvulsant activity of Schiff bases of isatin derivatives. // Acta Pharm.-2004.-54,49-56.

91. Sriram D., Bal T.R., Yogeeswari P. Aminopyrimidinimino isatin analogues: design of novel non- nucleoside HIV-1 reverse transcriptase inhibitors with broad-spectrum chemotherapeutic properties. // J.Pharm. Pharmaceut. Sci., 8, 565-577.

92. Chohan Z.H., Pervez H., Rauf A., Khan K.M., Supuran C.T. Isatin-derived antibacterial and antifungal compounds and their transition metal complexes. // J.Enzyme Inhib. Med. Chem.- 2004.- 19, 417-423.

93. Severina I.S., Bussygina O.G., Pyatakova N.V., Khropov Y.V., Krasnoperov R.A. Ambroxol as an inhibitor of nitric oxide-dependent activation of soluble guanylate cyclase. // Eur.J. Pharmacol.-2000.- 407, 61-64.

94. Северина И.С. NO: Новый взгляд на механизм действия старых лекарств. // Биомед. химия.-2005.-51, 19-29.

95. Григорьев Н.Б., Левина В.И., Азизов О.В., Пятакова Н.В., Паршин В.А., Арзамасцев А.П., Северина И.С., Граник В.Г. NO-донорные свойства химиотерапевтического средства "Метронидазол". // Вопр. биол. мед. фармацевт. химии.-2002.- 4,10-14.

96. Левина В.И., Азизов О.В., Пятакова Н.В., Северина И.С., Арзамасцев А.П., Григорьев Н.Б. Генерация оксида азота при гидролитических превращениях химиотерапевтического препарата "Нитазол". // Вопр. биол. мед. фармацевт, химии.-2002.- 4,6-10.

97. Левина В.И., Трухачева Л.А., Пятакова Н.В., Арзамасцев А.П., Северина И.С., Григорьев Н.Б., Граник В.Г. Исследование NO-донорной активности антимикробного препарата тинидазол. // Химико-фармацевтический журнал.-2004.-38, 15-18.

98. Северина И.С., Пятакова Н.В., Щеголев А.Ю., Пономарев Г.В. YC-1-аналогичное потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы производными протопорфирина IX. // Биохимия.-2006.-том 71,вып.3,с.426-431.

99. Северина И.С., Пятакова H.B., Щеголев А.Ю. Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы полиаминами. // Биохимия.-2007.-53,1,44-49.

100. Hoenicka М., Becker Е.М., Apeler Н., Sirichoke Т., Schroder Н., Gerzer R., Stasch J.P. Purified soluble guanylyl cyclase expressed in a baculovirus/Sf9 system: stimulation by YC-1, nitric oxide, and carbon monoxide. // J.Mol. Med., 77, 14-23.

101. Блинов Н.П., Громова Е.Г. Современные лекарственные препараты. // 3-е издание, Спб: Питер (2003), с.881-882,884.

102. Щеголев А.Ю., Сидорова Т.А., Северина И.С. Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы левомицетином, тетрациклином и оксолином. // Биомед. химия.-2009.-55, 331-337.

103. Tulis D.A. Salutery properties of YC-1 in the cardiovascular and haematological systems. // Curr. Med. Chem. Cardiovasc. Hematol. Agents.-2004.-2, 343-359.

104. Tsai I.F., Lin C.Y., Huang C.T., Lin Y.C., Liao C.H. Modulation of human monocyte-derived dendritic cells maturation by a soluble guanylate cyclase activator, YC-1, in a cyclic nucleotide independent manner. // Int. Immunopharmacol.-2007.-7,1299-1310.

105. Resvani A.N., Peyton K.J., Durante W., Schafer A.I., Tulis D.A. The cyclic GMP modulators YC-1 and zaprinast reduce vessel remodeling through antiproleferative and proapoptotic effects. //J. Cardiovasc. Pharmacol. Ther.-2009.-14, 116-124.

106. Liu X.M., Peyton K.J., Mendelev N.N., Wang H., Tulis D.A., Durante W. YC-1 stimulates the expression of gaseous monoxide-generating enzymes in vascular smooth muscle cells. И Mol. Pharmacol.-2009.-75,208-217.

107. Martin N.I., Derbyshire E.R., Marietta M.A. Syntesis and evaluation of phosphonate analogue of the soluble guanylate cyclase activator YC-1. // Biorg. Med. Chem. Lett.-2007.-17,4938-4941.

108. Stasch J.P., Hobbs A.J. NO-independent, haem-dependent soluble guanylate cyclase stimulators. // Handb. Exp. Pharmacol.-2009.-191, 277-308.

Информация о работе

Щеголев, Алексей Юрьевич
кандидата медицинских наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы"

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Щеголев, Алексей Юрьевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Щеголев, Алексей Юрьевич

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Щеголев, Алексей Юрьевич, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия