Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тромбоцитарная гуанилатциклаза и ее роль в регуляции процесса агрегации тромбоцитов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Тромбоцитарная гуанилатциклаза и ее роль в регуляции процесса агрегации тромбоцитов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

а о 1У.Л'

I -

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ химии

На правах рукописи УДК 577.152.6«

БЕЛУЖИНА НАТАЛЬЯ НИКОЛАЕВНА

ТРОМБОЦИТ АРНАЯ ГУАИЮАТЩОШЗА И ЕЕ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССА АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ

03.00.04. - Биологическая химия.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биомедицинской химии РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Северина И. С.

Официальные опоненты:

член-корреспондент РАМН, Коровкин Б.Ф. доктор химических наук, Мевх А.Т.

Ведущая организация:

Российский Университет Дружбы народов им. П. Лумумбы

Защита состоится " Я- " ОЗ 1995 г. на заседании специализированного Ученого Совета Д.001.10.01. Научно-исследовательского института биомедицинской химии РАМН по адресу: 119832, Москва, ул. Погодинская, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института биомедицинской химии РАМН.

Автореферат разослан: "¿У" 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета Д.001 кандидат биологических наук

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Повышенный интерес в последние годы вызывает возможность использования молекулярных подходов в изучении патогенеза, диагностике, профилактике и лечении патологии гемостаза. Нарушение процесса гемостаза может привести о одной стороны к избыточным кровотечениям и геморрагиям, с другой стороны к тромбозам.

К настоящему времени считается доказанным, что повышенная способность тромбоцитов к агрегации, определяет патогенез тромбоза при развитии атеросклероза, ишйшшвтти "ГЛ:"- ■■ иньйй-

пяесккх ангиопнтиях.

В соответствии с современными представлениями, агрегационная способность тромбоцитов находится под контролем систем циклических 3',5'-аденозинмонофосфата (цАШ) и 3', 5'-гуанозинмонофосфата (ЦГШ>). Установлено, что тромбоцитарная система цАШ? опосредует внешний сигнал к ограничению агрегации: воздействие на адеЕилатцкк-лазу простацикликом, прсстагландином Ei и другими первичными мес-оенджерами приводит к подавлению агрегации тромбоцитов (Гаврилов, 1981; Jaschonek, 1988).

О тромбоцитарной системе цГК® и ее ключевом ферменте гуанилат-циклазе (ГЦ) известно значительно меньше. В последние годы идут интенсивные исследования, определяющие роль цГШ> в агрегации тромбоцитов. Ранее считалось, что цГШ опосредует инициацию агрегации (Golberg, 1975, 1977), исследования последних лет позволили предположить, что система цГШ осуществляет негативный контроль агрегации тромбоцитов (Matsuoka, 1983; Mellion et al., 1981). При этом допускается, что сам процесс агрегации тромбоцитов может стимулировать систему цГШ, регуляторное действие которой осуществляется по принципу "отрицательной обратной связи". Имеющийся к настоящему времени экспериментальный материал в пользу такого предположения основан главным образом на двух группах фактов:

1) активаторы ГЦ, повышающие содержание цГМФ в тромбоцитах, проявляют антиагрегационное действие (Matsuoka, 1985; Waldman, 1989)j

2) при агрегации наблюдается повышение цГМФ в тромбоцитах (Haslam, 1974,1975,1978).

То, что тромбоцитарная система цРШ> мажет вовлекаться в регуляцию процесса агрегации, обусловило в последнее время повышенный интерес к ГЦ - ферменту биосинтеза цГШ> в клетке. При этил в литературе отсутствуют сведения о влиянии агрегации на активность ГЦ и ее регуляцию, нет стройной системы доказательств роли ЦП® в регу-

■ ляции процесса агрегации.

Изучение свойств ГЦ, особенностей функционирования тромбоци-тарной системы цГШ, ее роли в агрегации/дезагрегации тромбоцитов

■ представляются весьма перспективными как для понимания причин" нарушений^ возникащих в этих процессах, так и для разработки' путей ■воздействия на ГЦ с целью их нормализации.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось выявление взаимосвязи функционирования тромбоцитарной ГЦ с процессом агрегации тромбоцитов. В связи с этим представлялось необходимым решить следующие задачи:

1. Разработать метод изучения активности ГЦ при обратимой и необратимой фазах агрегации для сравнительной оценки функционирования гуанилатциклазы при этих двух процессах. '

2. Исследование активности ГЦ и ее способность к активации в присутствии нитропруссида натрия, протопорфирина IX, арахидоновой кислоты и Ь-аргинина в динамике агрегационного процесса, что позволит оценить изменения регуляции активности гуанилатциклазы при агрегации тромбоцитов.

3. Изучить роль цГШ в регуляции агрегационного процесса. Исследовать его влияние на обратимой и необратимой фазах агрегации.

4. Выяснить возможный механизм регуляции агрегации тромбоцитов циклическим ГШ.

5. Разработать новые подходы нормализации повышенной агрегаци-онной способности тромбоцитов на основе изучения функционирования ГЦ во время агрегации тромбоцитов.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые описано изменение функционирования ГЦ в процессе АДФ(аденозин- 5' -дифосфорная кислота)-индуцированной агрегации тромбоцитов человека: снижение базальной активности, увеличение способности фермента к активации соединениями стимулирующими активность как по гем-зависимому механизму (нитропруссид натрия, Ь-аргинин), так и по гем-независимому механизму (протопорфирин IX, арахидоновая кислота) с одновременным увеличением содержания цГШ в тромбоцитах.

Впервые показано, что одним из механизмов повышения стимулиру-емости ГЦ при АДФ- индуцированной агрегации является увеличение насыщенности фермента гемом.

Исследована роль цГШ> в регуляции процесса агрегации. Показано; что цГШ участвует в инициации процессов дезагрегации, т.е. регуляция осуществляется по принципу "отрицательной обратной связи",

что позволяет направленно воздействовать на активность ГЦ с целью коррекции агрегадионного процесса.

Установлено, что молекулярным механизмом регуляции процесса агрегации ГЦ системой является ингибирование высвобождения внутрит-ромбоцитарного кальция, необходимого для развития агрегации.

Исследовано и объяснено антиагрегационное действие М-(6-амино-гексил)-5-хдорнафталин-1-сульфамида (W-7) и его аналогов. Показано. что эти соединения в достаточно низких концентрациях (10"'' - ю-6 М) активировали тромбоцитарную ГЦ и ингибировали агрегацию тромбоцитов. Интенсивность янтиагрегационного деSziaia Сы^ь. арчиищи«»-нальна эффекти^н'^ти стимулируЕн-го влияния.

Исследован механизм антиагрегационного действш производных 1,2-диазетидин-1,2-ди-N-оксида - нового класса отечественных соединений, генерирующих оксид азота. Показано, что используемые соединения стимулировали ГЦ, ингибировали агрегацию тромбоцитов и обладали сильным дезагрегационным действием. Установлено, что в основе проявления антиагрегационных и дезагрегационных свойств исследуемых соединений лежит N0-зависимый механизм активации ГЦ и увеличения уровня цГШ в тромбоцитах.

Полученные результаты открывают возможность для разработки новых подходов к поиску и созданию эффективных антиагрегационных препаратов на основе изучения механизма направленной активации ГЦ.

Апробация работы состоялась на совместной научной конференции лаборатории энзимологии экстремальных состояний, лаборатории биохимии и патохимии углеводного обмена и лаборатории физиологически активных пептидов и гуанилатциклаэной системы 1 декабря 1994 года.

Материалы диссертационной работы были доложены на V Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимологии (Махачкала, 1986), на Всесоюзном симпозиуме "Проблемы клинической энзимологии" (Ужгород, 1989), I-Всесоюзной школе-семинаре "Тромбоцит как тест система физиологических и патологических состояний организма" (Москва, 1990), и на 39-Arnual Scientific Meeting of The Cardiac Society of Australia and New Zelrnd (Перт, Австралия, 1991).

По теме диссертации имеется 12 публикаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; обзора литературы, в котором рассмотрены общие представления о физиологии и биохимии процесса агрегации, основы регуляторной деятельности системой цГШ, ее возможная роль в агрегации тромбоцитов, свойства ГЦ и механизмы регуляции ее активности; материалов и методов исследования; экспериментальной части; обсуждения полученных

результатов; списка цитируемой литературы, содержащего 303 источника. Диссертация изложена на 124 стр. машинописного текста, содержит 20 рисунков и 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Объектом исследования были тромбоциты человека, выделенные ие крови здоровых доноров обоего пола в Еозрасте от 20 до 45 лет. Кровь предоставлялась станцией переливания крови ВГНЦ и отделением переливания крови ВНЦХ РАМН.

В качестве антикоагулянта использовали 3,8% раствор трехэаме-щенного цитрата натрия в 120 Ш NaOl (рН=7,4 при 20°С). в соотношении с кровью 1:9 по объему. Кровь центрифугировали 7 минут при 450 g и отбирали богатую тромбоцитами плазму. Подсчет клеток проводили микроскопированием в камере Горяева. При необходимости исходную концентрацию тромбоцитов в плазме разбавляли безтромбоцитарной плазмой (полученной в результате дополнительного центрифугирования оставшейся крови в течение 10 мин при 1000 g) до содержания тромбоцитов 2,5хЮ8 клеток в 1 мл плазмы.

Агрегацию тромбоцитов изучали с использованием турбидиметри-ческого метода Борна (Born ,1982), основыванного на изменении пропускания света (540 нм) через исследуемую плазму при ее постоянном перемешивании (1000 об/мин). В качестве образца сравнения использовали безтромбоцитарную плазму. Оптическую плотность светопролускания через безтромбоцитарную плазму принимали за 100%-ную агрегацию тромбоцитов.

Для проведения агрегации применяли агрегометр, сконструированный на основе двухлучевого фотозлектроколоркметра 253К-56М или агрегометр, разработанный в лаборатории биоорганической химии МГУ, соединенные с самописцем КСП-4.

В качестве индуктора агрегации использовали раствор АДФ в е конечной концентрации от 0,5 до 10,0 мкМ. Получаемые агрегограмыы представляют собой зависимость степени агрегации от времени, прошедшего после добавления индуктора агрегации.

Выделение тромбоцитов проводили по разработанному нами методу с использованием градиентного центрифугирования Ficoll-Paque ("Pharmacia", Швеция) в соотношении с плазмой 1:1 при 650^ в течении 20 мин. Полученный промытый осадок тромбоцитов ресуспендироали в 50 мМ трис-HCl буфере (рН=7.,6 при 4° С), содержащим 0,2 мМ ДТТ.

В случае выделения тромбоцитов, подвергшихся АДФ-индуцированной агрегации, на Ficoll-Paque наслаивали плазму с тромбоцитарными агрегатами. Градиентное центрифугирование при этом проводили в те-

- Б -

чении 5 минут при 550g:. Дальнейшую обработку суспензии агрегированных тромбоцитов проводили аналогично интактным тромбоцитам.

Тромбоциты подвергали разрушению на ультразвуковом дезинтеграторе МЗЕ 5-78 ( Великобритания) в течении 20 секунд при амплитуде 16 мкМ при 4° С и центрифугировали в течении 1 часа при 105000g на ультрацентрифуге (Beckman L-65, Австрия). Супернатант использовали в качестве ферментного препарата растворимой гуанилатциклазы.

Содержания белка определяли по методу Лоури (Lowry, 1951). В качестве белкового стандарта использовали бычий сывороточный альбумин .

Определение активности ГЦ проводили по методик» прзд^иА&нмой Sarbers, Мнг»/1, 1973. ^еи^гсниаи смесь С общий объем 150 мкя ) содержала 50 !.-{ три-HUI (рН=7.б при 37 С ), 1 мМ ГТФ, 4 Ш MgCl ,4 мМ креатинфосфат, 100 мкг -50 ед в мг) креатинфосфокиназы, 10 Ш тео-филлин, и супернатант 105000g (10-30 мкг по белку). ГЦ реакцию проводили при 37° С в водяном термостате в течении 15 минут.

Реакцию останавлиали выдерживанием проб в водяной бане при 90°С в течении 2 минут. Денатурированный белок отделяли центрифугированием в течении 15 минут при 1500g. В надосодочной жидкости определяли содержание образовавшегося цГШ>.

Количество цГМФ образовавшегося в ходе ферментативной реакции, а также содержание цГК® в тромбоцитах определяли радиоиммунным методом при помощи наборов реактивов "сШР RIA kit" (Amersham, Великобритания) по прилагаемой методике.

Для определения количества цГШ б тромбоцитах, последние ре-оуопендировали в 50 мМ трис-HCl буфере, рН=7.5, содержащим 4мМ ЭД-ТА, далее подвергали разрушения в течении 20 сек при амплитуде 16мкМ при 4° С на ультразвуковом дезинтеграторе М5Е-5-78 (Великобритания) и проводили термическую обработку в кипящей водяной бане в течении 5 мин. После дальнейшего центрифугирования в течении 10 мин. при 1500g- в надосадочной жидкости определяли содержание цГМФ.

Уровень Са2+ в тромбоцитах определяли согласно методике (Gynkilwiez et al., 1985) с использованием флуоресцентного зонда Fura~2AM. Флюоресценцию зонда измеряли на флюориметре "Hitachi-850" при длине возбуждения 350 нм и длине эмиссии 500 нм.

Результаты экспериментов обрабатывали статистически и представляли средними величинами + среднеквадратичная погрешность. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стыодента. Уравнения ре-регрессии для построения линейной зависимостей рассчитывали по методу наименьших квадратов, для оценки взаимосвязи между двумя переменными величинами определяли коэффициент корреляции г (Химмельблау,1973).

- 6 -

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Исследование функционирования тромбоцитарной гуанидатцик-лазы в процессе АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов. Процесс агрегации протекает в две фазы: обратимая и необратимая (Гавридов, 1981, Weiss, 1975, Leung, Nachman, 1986). Считают, что цГМФ ингибирует агрегацию тромбоцитов, препятствуя реакции высвобождения, т.е. препятствует переходу в необратимую фазу агрегации (Mellion et al, 1984, Waldman, Walter, 1989).

Для выяснения роли ГЦ в агрегации тромбоцитов необходимо было разработать экспериментальный подход, позволяющий изучать раздельно обратимую и необратимую фазы агрегации. Для этой цели мы выбрали в качестве индуктора агрегации АДФ.

На рис. 1(A) изображены агрегограммы тромбоцитов в зависимости от концентрации АДФ. При содержании тромбоцитов в плазме (4,5-5,0)х10® в 1 мл. обратимая агрегация наблюдается при концентрации АДФ до 1,4 мкМ. Большие концентрации АДФ приводят к необратимому процессу агрегации.

Известно, что необратимая фаза агрегации обусловлена комплексом эндогенных факторов, высвобождаемых из гранул тромбцитов во внеклеточную среду в процессе реакции высвобождения (Brass, 1985; Weiss, 1975). Следовательно, концентрация этих факторов зависит от

время после добавления мин

Рисунок 1.

Зависимость степени АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов человека от концентроации АДФ и количества тромбоцитов в плазме. Содержание тромбоцитов в плазме - 4,5x10® клеток в 1 мл. (А), 2,5х108 клеток в 1 мл. (Б). Возле каждой агрегограммы указаны конечные концентрации АДФ. Представлены результаты 12 однотипных экспериментов.

количества тромбоцитов в плазме. Поэтому, разбавляя плазму обогащенную тромбоцитами до определенной концентрации клеток, можно ожидать проявления только обратимой фазы агрегации. Действительно, при разбавлении плазмы до концентрации клеток 2,5x10® в 1 мл обратимая фага агрегации регистрируется при добавлении АДФ в достаточно широком диапазоне коцентраций от0,б до 10 мкМ (рис. 1(Б)).

Таким образом, были подобраны условия, позволяющие изучать раздельно обратимую и необратимую фазы АДФ-индуцированной агрегации. В этих условиях исследовали участие ГЦ в регуляции процесса агрегации.

Функционирование ГЦ в динамике процесса агрегата оценивали по следующим критериям: банальная активность фермента, его способность к активации (коэффициент активации - отношение активности гуанилат-циклазы в присутствии активз'^я ее базальной активности) и содержание цГШ в тромбоцитах-.

Базальная аташгооть ГЦ, определяемая в супернатанте 105000е интактных тр.'!*^оцптов, составила 181+14 пмоль цГШ/1 мг белка за 1 мин, инкубации (37°С) (п=27). Концентрация цГШ интактных'тромбоцитов - 1,45+0,11 пмоль на 108 клеток. В качестве одного из ативато-ров ГЦ использовали нитропруссид натрия (NagtFeNOCCfOsl) - известный активатор ГЦ (Gerzer,1988; Ignarro et al 1981; Lad et al 1981). Наибольшая активация ГЦ наблюдается в присутствии 0,1 Ш нитропрус-сида натрия (Чирков и др., 1988). При этом коэффициент активации ГЦ составлял 10,9+0,83 (п=27).

При изучении этих параметров в процессе агрегации тромбоцитов использовали тромбоциты, находящиеся на пиках агреации (рис. 1.Б.1)

На рис. 2 представлены результаты по изменению базальной активности ГЦ и ее способности к активации нитропруссидом натрия в тромбоцитах, находящихся на пиках обратимых агрегаций различной интенсивности ( от 20 до 70% ) при одинаковой концентрации тромбоцитов в плазме - 2,5x10s клеток в 1 мл.

Еидно, что с увеличением степени агрегации тромбоцитов наблюдалось снижение базальной активности фермента и увеличение способности ГЦ к активации нитропруссидом натрия.

Эти изменения имели линейную зависимость (коэффициент регрессии для изменений базальной активности равен 0,89, для коэффициента активации нитропруссидом натрия - 0,9), которая сохранялась примерно до 50% агрегации. При большей степени агрегации, выше 50% зависимость изменяется и величины базальной активности ГЦ и коэффициента активации нитропруссидом натрия имеют тенденцию к нормализации.

Рисунок 2.

Изменения базальной активности ГЦ (1) и коэффициента активации ГЦ нитропруссидом натрия (2) в зависимости от степени агрегации тромбоцитов человека. По оси ординат изменения параметров ГЦ {% от контроля). Представлены средние значения 7 однотипных экспериментов.

Поскольку, при изучении обратимой АДФ-индуцируемой агрегации in vitro после достижения максимума агрегации ( как это видно на рис. 1.Б) следует фаза дезагрегации тромбоцитов, представляло интерес исследовать перечисленные выше параметры в динамике обратимых агрегаций различной степени интенсивности.

На рис.3 (А, Б, В, Г) представлены изменения базальной активности ГЦ, коэффициента активации ГЦ нитропруссидом натрия в динамике 20, 50 и 70% обратимых агрегаций и 70% необратимой АДФ-индуциро-ванных агрегаций тромбоцитов человека.

Видно, что практически сразу после индукции агрегации во всех случаях коэффициент активации ГЦ нитропруссидом натрия начинал возрастать и по истечении определенного времени достигал своего максимального значения ( см. рис. 3, кривая 2 ).

В последующие сроки наблюдалось практически полное возвращение к исходному значению коэффициента активации ГЦ нитропруссидом натрия. Базальная активность также изменяется: сначала наблюдалось снижение активности с минимальным значением в точке соответствующей максимуму активации фермента нитропруссидом натрия ( рис. 3, кривые 1 и 2 ), а затем - нормализация и возвращение к исходной величине активности.

Следует заметить, что пропорциональность изменений параметров ГЦ (базальной активности и способности к активаации нитропруссидом натрия) и времени достижения пика данных агрегаций (см. рис. 2) сохраняется только в пределах до 50% обратимых агрегаций. В этих пределах пик агрегации совпадает с максимумом активации ГЦ нитропруссидом натрия. Коэффициент активации ГЦ нитропруссидом натрия при этом составляет (155+4)% от исходного значения (Р<0,01; п=15). Ба-

Рисунок 3.

Динамика изменений базальной активности ГЦ (1), коэффициента активации нитропруссидом натрия (2) при 20 (А), 50 (Б) и 70% (В) обратимых и 70% необратимой (Г) АДФ-индуцированной агрегаций тромбоцитов человека в концентрациях 2,5x10е (А, В, В) и 4,5х103 тромбоцитов в 1мл. плазмы (Г), вызванных 1, 2, 5 мкМ (А, Б, В) и 2 мнМ (Г) АДФ. Агрегограммы - кршвые 3. По оси ординат - изменения параметров (а от контроля). Представлены результаты типичного эксперимента.

зальная активность составляет (73+2,5)% от исходного значения (Р<0.01; п«=15).

При дальнейшем увеличении степени обратимой агрегации, например при 70% (рис. 3(кривые 1, 2, 3)) максимум изменений параметров ГЦ находится в точке соответсвующей 50% обратимой агрегации. После этого, начинается нормализация бззальной активности и коэффициента активации ГЦ нитропруссидом натрия, несмотря на то, что 70% агрегация еще не достигла своего пика агрегации.

Итак, характер изменений параметров ГЦ как е случае обратимой, так и необратимой агрегации были одинаковыми. Основные изменения в функционировании фермента происходят на самых ранних этапах развития агрегационного процесса.

Таким образом, на основании полученных результатов об изменении функционирования ГЦ в процессе агрегации и непосредственной связи этих изменений с агрегационным процессом, а также, учитывая данные литературы (Andrew et al., 1980; Waldman et al., 1989) no ингибированию агрегации активаторами гуанилатциклаэы, модно предположить участие ГЦ и ЦТ® в регуляции процесса агрегации.

Известно, что активация ГЦ нитропруссидом натрия связана о его

свободно-радикальной группой N0 (оксид азота), которая нитрозилиру-ет гем ГЦ и стимулирует активнооть фермента (Mellion et al., 1983; Ignarro et al., 1981). В связи с лабильностью связи тема с белковой молекулой ГЦ, фермент в норме может быть частично гем-дефицитным. Чем больше выражена гем-дефицитность, . тем меньше стимулирующий эффект нитропруссида натрия и наоборот.

Добавление к гем-дефицитной ГЦ гем-содержащего белка (например 'гемоглобина) восстанавливает способность ГЦ к N0-активации. Это '.обусловлено дополнительным образованием комплекса нитрозил-гем ' за счет гемоглобина, переносом его на ГЦ и восполнением гем-дефицитности последней (Ignarro et al., 1986).

Исследование влияние гемоглобина на активацию ГЦ нитропруосидом- натрия в процессе агрегации/дезагрегации тромбоцитов выявило изменения в эффективности действия гемоглобина. Как видно на рис. 4 добавление гемоглобина (12 мкМ) (Тыщук, 1990) к ГЦ супернатанта 105000£ интактных тромбоцитов приводило к повышению активирующего действия нитропруссида натрия до ( 151+5 )% (п=10) , что указывает на частичную гем-дефицитность тромбоцитарной ГЦ в норме. При добавлении гемоглобина к препаратам ГЦ, полученным из тромбоцитов подвергшихся агрегации, происходило снижение эффекта, вызванного гемоглобином. В момент времени, когда наблюдалась максимальная активация ГЦ нитропруосидом натрия (рис. 4, кривая 2) повышения активирующего действия нитропруссида натрия, вызываемого добавлением гемоглобина практически не наблюдается - (106+5)%. (п=б) (кривая 3). Это мажет свидетельствовать об увеличении насыщенности фермента ге-мом. В дальнейшем насыщенность ГЦ гемом снижалась и геы-дефицит-

350 •

Рисунок 4.

2

3

Динашка изменений уровня цГШ> в тромбоцитах (1), коэффициента активации ГЦ нитропруосидом натрия без добавления гемоглобина (2), в присутствие гемоглобина (3) при 50Х обратимой агрегации тромбоцитов человека.

X

По оси ординат - изменения параметров (X от контроля).

время после добавлении АД05, мин.

О

3 4

Приведены средние значения 5 однотипных экспериментов.

- 11 -

ность возвращалась к исходному значению.

Таким образом, инициация агрегации сопровождается увеличением насыщенности ГЦ гемом, что может объяснить наблюдаемое повышение чувствительности ГЦ к нитропруссиду натрия (донору N0) с одновременным повышением уровня ЦГМФ в тромбоцитах (рис, 4, кривая 1).

Влияние L-аргинина, протоясрфирина IX, арахидоновой кислоты на активность гуанндзтциклаеы в динамике развития процесса агрегации тромбоцитов.

Аналогичный гем-зависимый ¿¿ианм!««* ГЦ лихоопрусоидсы

-ú-fáix- « ? ох-имупит^! фармента эндогенным оксидом азо-

та (По), который образуется из L-аргинина под действием L-арги-нин-КО-синтазы) (Palacios et al., 1989; Radomski et al.s 1990) в различных клетках и тканях, в том числе и в тромбоцитах. Механизм активации ГЦ протопорфирином IX (Ignsrro et al., 1984) и арахидоновон кислотой (Mittal, 1984) не связан с гемом ГЦ. Поэтому мы сопоставили влияние L-аргинина, протопорфирина IX и арахидоновой кислоты о влиянием нитропрусоида натрия на функционирование ГЦ в процессе агрегации/дезагрегации тромбоцитов.

Были подобраны условия активации ГЦ L-аргинином (1 мМ) и ара-хидоновой кислотой (10 мкМ) в супернатанте 105000g интактных тромбоцитов. При этом коэффициент активации ГЦ L-аргинином составляет 1,1+0,04 (п=15), арахидоновон кислотой - 1,88+0,08 (п=5). Условия активации протопорфирином были подобраны ранее (Тыщук, 1990).

Исследование проводили в динамике 501 обратимой агрегации (2,5x10® тромбоцитов/2~2,1мкМ АДФ), т.к. при этой агрегации были получены наибольшие изменения базальной активности и способности к активации нитропруссидом натрия (рис. 2 и 3),

Ka?; видно на рисунке 5 сразу после индукции агрегации начинает возрастать степень акти вации гуанилатциклазы не только нитропруссидом натрия, но и L-аргинином, протопорфирином IX, арахидоновой кислотой. Характер изменений во всех этих случаях одинаковый: с развитием процесса агрегзции происходит увеличение активации с максимально выраженным эффектом примерно на 2-ой минуте процесса. Максимум изменений на пике агрегации составляет (% от исходных значений, Р<0,05 - по сравнению с контролем): (155+4)X (п=15) -для коэф-фициенциента активации L-аргинином; (136+3,5)Х (п=8) - для коэффициента активации протопорфирином IX; (144+5)Х (п=б) - для коэффициента активации арахидоновой кислотой. К 5-ой минуте агрегационного процесса наблюдается нормализация способности к активации ГЦ этими

Рисунок 5.

степень агрегации, 2

Динамика изменений коэффициентов активации ГЦ нитропруссидом натрия (0,1мМ) (1), арахидоновой кислотой (ЮмкМ) (2), протопор-фирином IX (5мкМ) (3), Ь-аргинином (0,1мМ) (4) при 45% обратимой агрегации тромбоцитов человека, индуцированной 1,5-2мкМ АДФ (агрегограмма - кривая 5).

ю

2

3

4

По оси ординат коэффициенты активации ГЦ (% от контроля).

о

+

adp

Представлены средние результаты 4 однотипных экспериментов.

время после добавления АДО, шм

1-J—!->-!-j. I.

0 1 2 3 4 5

соединениями. Для выяснения возможного механизма этого феномена мы исследовали изиенения других параметров в процессе агрегации/дезагрегации тромбоцитов, и, в частности, изменения содержания Са2+.

Известно, что процесс агрегации тромбоцитов сопровождается увеличением концентрации катионов кальция в цитоплазме тромбоцитов; на ранней стадии агрегация обратима ва счет реинтеграции Caz+ (Са-мадь и др., 1989; Steen, 1987). Поэтому» можно была предположить, дао регуляция процесса агрегации ЦГШ сопровождается изменением содержания Caz+. Было обнаружено, что содержание катионов кальция в интактных тромбоцитах составляет (65,0+5,1) нМ (п=4). Эта величина была принята еа 100%. После инициации агрегационного процесса 5 мкМ АДФ, в тромбоцитах увеличивается концентрация катионов кальция до (87,2+2,6) нМ (п=4), что составляет (134+4)% от исходного значения. При добавлении к тромбоцитам до добавления АДФ (5мкМ) нитропрусида натрия в концентрации 0,1 мМ предупреждающей развитие агрегации (более подробно этот вопрос будет исследован в дальнейших разделах) увеличения концентрации катионов кальция не наблюдается: (58,5+4,6) нМ (п=4), что составляет (90+7)% от исходного значения.

Таким образом, мы показали, что подавление агрегации тромбоцитов активаторами.ГЦ связано с ингибированием мобилизации внутрит-ромбоцитарного кальция, необходимого для развития агрегационного процесса. Предложенная ранее Севериной И.О. гипотетическая схема возможных точек приложения действия ЦГШ как регулятора процесса агрегации тромбоцитов (Severina I.S., 1992) показала, что цГ'Ш? пре-

дупреждает распад фосфолипидов (в том числе фосфоинозитидов) и ин-гпбирует активацию тромбоцитов через общий механизм торможения накопления Са?'+. Эта схема позволяет предположить и возможный механизм увеличения стимулируемости ГЦ различными активаторами при агрегации (рис. 5).

Усиленный распад фосфолипидов инозитола при агрегации, накопление Са£+ и 1,2-диацилглицерола приводят к стмуляции активности протеинкиназы С и интенсификации процессов фосфорилирования. Вероятно, что одним из субстратов протеинкиназы С может быть ГЦ

С7л17111р>Г, 1ЧЯП1 . Иядрг.тнп. итп фопфОПИЛИрПРЯНИР ГП плпппипжгтяотпя

лирование ГЦ является одним из первых ответов клетки на инициацию агрегации, направленной на повышение уровня цГМФ и ингибирование агрегации.

Роль активаторов гуанилатциклазы в регуляции процесса агрегации тромбоцитов.

Если система цГШ участвует в регу-

о

ляции агрегации, то применение соединений - активаторов ГЦ должно приводить к ослаблению агрегации. С этой целью использовали активатор ГЦ - нит-ропруссид натрия, который предварительно инкубировали с тромбоцитами для получения эффекта полного предотвращения агрегации.

Т 6 5 .4 з

-1г нн, м

о

Зависимость ингибирования 50% обратимой АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов человека (А), коэффициента активации ГЦ нитропруссидом натрия (НН) в супернатанте 105000Е (Б) от концент-ращш НН, Корреляция между этими параметрами (В). Тромбоциты преинкубирова-ли с НН 3 мин. до добавления АДФ. Представлены результаты 5-6 однотипных экспериментов.

Рисунок 6.

7 6 5 4 3

- ¡в НН, м

о

20 40 60 80 100 активация гуаиилатчкклазы, X

Была обнаружена, зависимость ингцбирования АДФ- индуцированной агрегации (2,5х103 тромбоцитов/2-2,1 мкМ АДФ) от концентрации нит-ропруссида натрия. Полное (100%) предотвращение данной агрегации наблюдется при использоании нитропруссида натрия в концентрации не меньше 0,1 мМ (рис. 6.А). Следует заметить, что активация ГЦ в су-пернатанте 105000^ также зависит от концентрации нитропруссида натрия (Чирков, 1988). Максимальная стимуляция ГЦ наблюдается при использовании 0,1 мМ нитропруссида натрия (рис. 6. Б).

фи сопоставлении полученных результатов нитропруссид-зависимого предотвращения агрегации и стимуляции ГЦ нитропруссидом в ферментном препарате была обнаружена сильная корреляция (г=0,98) между активацией ГЦ и ингибированием агрегации нитропруссидом натрия (рис. 6.В). Данные результаты свидетельствовуют о непосредственном участии ГЦ в нитропруссид-зависимом ингибировании агрегации.

Учитывая сложность и многостадийноетъ процесса агрегации, при котором процесс агрегации сопровождается дезагрегацией, в следующей серии экспериментов мы исследовали более подробно вопрос о том на какую именно стадию агрегационного процесса влияет нитропруссид т.е. связано ли его действие с ингибированием агрегации или с инициацией дезагрегации.

Исследование дезагрегационного дейотвия нитропруссида натрия.

Для исследования дезагрегационного действия нитропруссида натрия последний добавляли к тромбоцитам с максимально возможной сте-

Рисунок 7. Влияние нитропруссида натрия (НН) на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека. ю'^Меох необратимая агрегация (4,5х10э клеток в 1 мл./2-2,1 мкМ Ада) (А), 50% обратимая агрегация (2,5x10е клеток в 1 мл./2-2,1 мкМ АДФ) (Б).

Стрелкой обозначен момент добавления АДФ и НН.

Возле каждой агрегограммы указаны соответствующие концентрации НН. Приведены средние значения из 5 однотипных экспериментов.

100

80

еи

° 40

20

0

Ю'7 М

10"° и

0 4 8 12 16

враля после добавления Й/&, мин

О

пенью агрегации при данной концентрации АДФ, т.е. на пике обратимой агрегации или при выходе на плато необратимой агрегации.

При этом мы предположили, что если нитропруссид натрия ингиби-рует только агрегацию тромбоцитов и не влияет на дезагрегацию, то на пике или на плато агрегации действие нитропруссида натрия прояв-лятся не будет. Если же нитропруссид натрия инициирует дезагрегацию тромбоцитов, то добавление нитропруссида натрия к тагам тромбоцитам будет стимулировать дезагрегацию.

С этой целью нитропруссид натрия в различных концентрациях до-

Аптютг.«*« crrvv — л —----—-*- — — р,-----■—- - ---------- ^ ^

: / Z-Z, 1 АД1/ л на алато 70". нёоСрахимои агрегации

(4,5x10е клеток в 1 мл. плазмы / 2 мкМ АДФ).

На рис. 7 представлены агрегограммы нитропруссид-стимулированной дезагрегации тромбоцитов в условиях обратимой и необратимой агрегации. Видно, что независимо от фазы агрегации, действие нитропруссида натрия проявляется в инициации дезагрегации тромбоцитов.

Таким образом, нитропруссид натрия предотвращает агрегацию тромбоцитов инициируя их дезагрегацию.

Исследование влияния соединений, содержащих оксид азота на активность гуанилатцикдазы и агрегацию тромбоцитов.

Способность эндогенного N0 и N0-содержащих соединений активировать ГЦ и проявлять дезагрегационное действие обосновывает перспективность поиска новых антиагрегационных средств на основе химических структур, обеспечивающих возможность образования в организме оксида азота.

К соединениям подобного типа принадлежат, по-видимому, производные 1,2-диагетид1ш-1,2-ди-Ы-оксида, которые разлагаются в условиях биохимического эксперимента неферментативно с образованием N0 согласно уравнению:

/

Н2

_N №

3 2|!

Л 1 N

2no + с-сх

r4

Химическая структура использованных соединений и влияние их на активность тромбоцитарной ГЦ (Беуег1па, 1993) приведена в табл. 1.

Были сопоставлены величины стимулирующих эффектов исследуемых соединений при концентрации 0,1 Ш. Наиболее сильным активатором ГЦ

Таблица 1.

Химические структуры соединении 1,2-диазетидин-1,2-ди-Н-оксидов и их влияние на активность гуанилатциклазы тромбоцитов человека.

Яо.

Химическая

Активация гуанилатциклазы

1. 3-Бром-3-этил-4,4-дше-тил-1,2-диаэетидин-1,2-ди-Ы-оксид

2. 3-Бром-3-мзткд-4,4-ди-метил-1,2-диагетидин--1,2-ди-Ы-оксид

3. 3-Бром-3-фенил-4,4-ди-метил-1,2-диазетидин--1,2-ди-Н-оксид

4. 3-Бром-4-ыетил-3,4-твт-раиетилен-1,2-диазети-дин-1,г-ди-Ы-оксид

Б, 3,'4-пентаметилев-1,2~ диагетидин-1,2-ди-Н-ок-сид

6. 3-фенил-4,4-диметил-1,2-диазетидин-1, г-ди-Ы-ок-

сид

7. 3-метил-4,4-диметид-1,2-_ диазвтидин-1,2-ди-Ы-оксид

НН. нитропруссид-натрия

Сгн5-СН3"

СН5-сн3-

сл-

сн5-

сн3

Вг

сн,

-0

гЬ^-_—

СН,

сн.

СНз

На3[РеЫ0ССЫ)я1

о

12,6+1,96 (36,5%)

27,7+3,68 (80,3%)

13,2+2,34 (38,47.)

34,5+2,07 (1001)

5,4+1,0 (15.62)

28,7+3,8 (83,2%)

10,2+1,82 (29,6%)

14,8+2,0

Примечание: активация ГЦ соединением 4 принята га 100%.

тромбоцитов человека является соединение 4. Его коэффициент активации составляет 34,5+2,07 (п=б), что на 217% превышает стимулирующий эффект ГЦ нитропруссидом натрия (14,8+2,0) (п-5)). Наименьшим стимулирующим эффектом - 5,4+0,4 (п=6) - обладает соединение 5. Его степень активации составляет 49,5% от активирующего действия нит-ропрусоида натрия.

По степени актигации ГЦ этими соединениями последние можно расположить в следующий ряд: 5<7<"1<3<2«б<4.

Полученные данные об активирующем действии на тромбоцитарную ГЦ исследованных производных 1,2-диазетвдин-1,2-ди-М-оксида обусло-

n52 №3 '

Зависимость ингибирования 50% обратимой АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов человека от концентрации соединений 1-7 и нитропруссида натрия (НН). По оси абсцисс концентрация

GOOMfiUwUVlri t i и. m I .

Рисунок 8.

6

тт

5

4

вили изучение их влияния на агрегацию тромбоцитов.

На рис. 8. представлены результаты по предотвращению АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов. В этих опытах исследуемые соединения в конечных концентрациях от 1 мкМ до 0,1 мМ добавляли к тромбоцитам за 1 минуту до АДФ в концентрации инициирующей 50% агрегацию (2,0-2,1 мкМ/2,5х108 клеток в 1 мл.).

Можно видеть, что по увеличению степени тормозящего действия на агрегацию тромбоцитов исследуемыми соединениями можно расположить в следующий ряд: 5<7<1<б<3 = 2<4

Следует отметить, что эффект по ингибированию агрегации соединениями 6; 3; 2 и особенно 4 превосходит по интенсивности дезагре-гационного действия нитропруссида натрия (рис. 8).

Исследование влияния попользованных соединений на процесс дезагрегации тромбоцитов изучали на 50% обратимой АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (2-2,1 мюМ АДФ/2,5х108 тромбоцитов).

На рис. 9 представлены агрегограммы АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов и дезагрегационный эффект исследуемых производных диаэетидин-1,2-ди-Н-оксида. Результаты, полученные при использовании соединений в концентрации 0,1 кй,1_, сравнивали о эффектом нитропруссида натрия.

Видно, что наибольший эффект зарегистрирован при использовании исследуемых соединений в концентрации 0,1 мМ ( также как и в случае о нитропрусоидом натрия). Наибольшим дезагрегационным действием, превосходящим эффект нитропруссида натрия, обладает соединение 4 и наименьшим ( точнее полностью отсутствующим) - соединение 5.

По степени увеличения влияния на скорость дезагрегации тромбоцитов исследуемые соединения можно расположить в следующий ряд

Рисунок 9.

: Агрегограммы 50% обратимой АДФ-индуцированной агрегации тромбоците человека и дезагрегирующий эффект соединений 1, 5, 6, 7 и нитрон руссида натрия (НН) (А), соединений 2, 3, 4 (Б). Спонтанная дезагрегация (контороль без этанола) (А), контроль присутствии этанола (Б).

Номера соединений [(1-7) и ННЗ (0,1 мМ) указаны возле соответствую щих агрегограмм. Время добавления соединений указано стрелкой. Приведены результаты 5 однотипных экспериментов.

время после добавления АЯё, мт

(рис. 10); 5 < 7 < 1 < 3 < 6 < 2 < 4.

Сопоставление этих данных с результатами антиагрегационноп действия этих соединений ( рис. 8), а также с эффективностью активации ими тромбоцитарной ГЦ (табл. 1) показывает полное- соответствие в ряду соединений: 5 < 7 < 1 < 4.

Т.е. во всех случаях представленные ряды соединений начинаются с самого неактивного во всех отношениях соединения 5 (3,4-пентаме-тилен-1,2-диазетидин-1,2-ди-Ы-оксид) и заканчивается наиболее активным соединением 4 (3-6ром-4-метил-3,4-тетраметилен-1,2-диазети-дин-1,2-ди-Ы-оксид).

„Некоторое несовпадение в проявлении указанных свойств мевд соединениями 6; 3 и 2 не снижают значимость выявленной нами закономерности дезагрегационных свойств тромбоцитов от функционированш ГЦ. Количество соединений не является достаточным, что бы установить взаимосвязь между химической структурой соединений и их способность генерировать N0 и активировать ГЦ. Можно лишь отметить,

Рисунок 10. Зависимость максимальной скорости дезагрегации тромбоцитов человека от концентрации соединений 1-7 и нитропруссида натрия (НН). По оси абсцисс концентрация соединений ("1£Г, М). По оси ординат отношение в (2) мзг^^^хтьни* пютоостей дезагрегации 2 Присут^т^»!" и.и.пИНвШШ Г") к спонтанной агрегации (Уо). скорость дезагрегации выражена в X дезагрегации в мин.

что наймемте активное соединение Б является, по-видимому, наимение

стерически напряженным (речь идет о пространственном взаимодействии заместителей в положении 3 и 4 четырехчленного цикла). В то же время для наиболее активного соединения 4, а также соединений 2 и б характерно наличие объемных заместителей, что дестабилизирует основное состояние и облегчает деградацию молекул с образованием N0.

Таким обрззом, наблюдается хотя и не полное, но все же весьма убедительное, с нашей точки зрения, соответствие между способностью соединений активировать тромбоцитарную ГЦ и ингибировать агрегацию тромбоцитов, а также способствовать их дезагрегации.

Исследование влияния N- (б-ачшогексид)-5-хдорнафтадин-1-сульфамида (Ы-7) и его аналогов на активность гуанидатциклазы и агрегацию тромбоцитов.

Известно, что соединение W-7 ингибирует агрегацию тромбоцитов, индуцированную тромбином, коллагеном, АДФ и рядом других физиологически активных соединений, и предотвращает реакцию высвобождения серотонина (Levy, 1983).

Окончательный механизм ингибирующего действия W-7 не известен. Мы исследовали влияние W-7 и ряда его аналогов на активность ГЦ , а также на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Все использованные соединения были условно сгруппированы по принципу соответствия их химических структур на две группы, представленные в таблице 2.

•7 «о л - 200

100 юоо

300 -I 800700 600-

I'JO

300 200 100

5 4

(-igM) .

8

7

В

Таблица 2.

Химическая структура $-7 и его аналогов.

Мо.

Название

Химическая формула

1.

W-7 Ы-(б-аминогексил)-5-хлорнафталин-1 -сульфамид

1. И- (8-ашшогексид) -5-хлорнафтааин-1 - сульфамид

2. N - (8-аминооктил) -4-хлорнафталин-1-сульфамид

/\/Ч

I в ]

502-МН-(СНг),,-МНг- НС1

С1

гУ

о

50г-МН-(СНг),-МНг-На

а

гл

ч/у

50г-ш-(сн2),-мн2-на

4. Я-С (3- аминопропил) -8- (5-хлорнафталин- 2 -сульфонил) амино] -гек-санамин

II. 5. Ы-С(3-аминогексил)-б-

- (Б-хлорнафталЕн-1-сульфонил) аминоЗ - гек-санамин

6. . Ы-Е (8-аминооктил)-8-

- (5-хлорнафталин-1-сульфонил) амино] - гек-санамин

С1

Ал

I 1 I Ч/Ч/

¿г-мЧсН^-СО-М-^Н^- • НС1

У

ГУ)

w

С1 1

СР-

V

I

50г

•жЧсНгУ-со-мЧснЛ-м^-Н!

Исследование влияния на активность ГЦ соединений проводили в. диапазоне их концентраций 10~8-10~3 М. Как видно на рис. 11 (А, Б), наиболее эффективными активаторами ГЦ оказались соединения , относящиеся к 1 группе, наиболее близкие по химической структуре к а также сам V-7. Из соединений 2 группы аналогичное стимулирующее действие на ГЦ оказывал только соединение 4.

Рисунок 11.

Влияние У-7 и его проигЕодньк на активность ГЦ тромбоцитов человека: \'г7 (0), 1 (1), 2 (2) (А). 4 (4), 5 (5) (Б). Приведены средние значения из Б однотипных экспериментов.

активация гуаяидатцичлазы, 7.

концентрация соединений, М

Рисунок 12.

Ингибированле АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов человека №-7 и его производными. Обозначения как на рис. 11, Приведены средние знзченкя из 5 однотипных экспериментов.

-ю"4 •м"-5м

концентрация соединений, М

Таким образом, нами было показано, что соединения IV-7 и соединения 1, 2 в диапазоне концентраций 10~7-10_бМ, а соединения 4-6 в диапазоне концентраций 10~6-10-бМ оказыают выраженное активирующее действие на ГЦ.

Учитывая полученные результаты об активирующем действии ЭД-7 и его аналогов на активность ГЦ мы сочли целесообразным изучить возможность ингибирования агрегации тромбоцитов этими соединениями.

При этом исследуемые соединения в концентрациях от 10~5 до 10~3 M добавляли к тромбоцитам до АДФ, необходимого для инициации 50% обратимой агрегации. Как изображено на рис. 12 (В), W-7 и его ближайшие структурные аналоги - соединения 1 и 2 из 1 группы в концентрации 2х10-4М - практически полностью (на 100%) ингибируют 50% АДФ-зависимую агрегацию тромбоцитов. Эти данные хорошо согласуются с тем фактом, что именно эти соединения являются наиболее эффективными активаторами ГЦ (рис. 12.А). Ингибирование агрегации соединениями 4, 5, 6 (2 группа) хорошо соответствует их способности активировать ГЦ. Чем выше степень активации фермента, тем больший инги-бирующий эффект на агрегацию оказывают эти соединения, соединение 4 в концентрации 6хЮ_4М подавляет агрегацию на 100%, в то время как соединения 5 и 6 в той же концентрации - только на 40 и 35% соответственно.

Таким образом, представленные результаты показывают, что в ряду соединений - производных нафталин-1-сульфамида, выявлены вещества, обладающие способностью в достаточно низких концентрациях (10~8М-10_6М) активировать ГЦ тромбоцитов и одновременно ннгибиро-вать АДФ-зависимую агрегацию. Полученные результаты позволяют установить некоторые особенности химической структуры молекул в ряду нафталин-1-сульфамидных производных,, определяющих их фармакологическую активность.

Способность исследуемых производных ¥-7 тормозить агрегацию тромбоцитов, а также наши данные о том, что во время АДФ-индуцированной агрегации повышается чувствительность ГЦ к любому из использованных активаторов, вне зависимости от участия гема в механизме активации фермента (рис. 5), указывает на то, 'что для проявления активаторами ГЦ антиагрегационных свойств гемзависимый механизм активации фермента необязателен.

Таким образом, приведенные данные позволяют рассматривать тромбоцитарную ГЦ как защитный механизм на пути развития агрегации. Регуляторная роль цГШ, проявляющая на самых ранних стадиях развития процесса, открывает возможность направленного фармакологического воздействия на тромбоцитарную ГЦ для нормализации патологически повышенной агрегации тромбоцитов. При этом следует подчеркнуть, что созданные на основе стимуляции растворимой ГЦ новые активатроы фермента будут не только ослаблять гиперагрегацию тромбоцитов, но и (что особенно важно!) предупреждать их спонтанную агрегацию, а следовательно, возникновение и развитие сосудистых осложнений.

- 23 -ВЫВОДЫ.

1. Показано изменение функционирования гуанилатциклазы во время АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов человека: снижение ба-зальной активности, увеличение способности фермента к активации соединениями стимулирующими активность как по гем-зависимому механизму (нитропруссид натрия, Ь-аргинин), так и по гем-независимому механизму (протопорфирин IX, арахидоновая кислота) с одновременным увеличением содержания цРМФ в тромбоцитах.

2. Пакагзкг, *тт" одним йо л^лакпгг.?? стимулируемости гуанилатциклазы при АДФ-индуцирован кой лгрэгацгпт яялятед

гем-дефицитности фермента.

3.Исследована роль цГМ-5 в регуляции процесса агрегации. Показано, что цГМФ участвует в инициации процессов дезагрегации, т.е. регуляция осуществляется по принципу "отрицательной обратной связи", что позволяет направленно воздействовать на активность гуанилатциклазы о целью коррекции агрегационного процесса.

4. Установлено, что молекулярным механизмом регуляции процесса агрегации гуанилатциклазной системой, является ингибирование высвобождения внутритромбоцитарного кальция, необходимого для развития агрегации.

6. Исследовано и объяснено антиагрегационное действие М-(5-аминогексил)-5-хлорнафталин-1-сульфамида (М-7) и его аналогов. Показано, что эти соединения в достаточно низких концентрациях (Ю-7- 10_бМ) активировали тромбоцитарную гуанилатциклазу и ингиби-роваяи агрегацию тромбоцитов. Интенсивность антиагрегационного действия была пропорциональна эффективности стимулирующего влияния.

7. Исследован механизм антиагрегационного действия производных 1,2-диазетидин-1,2-ди-Ы-оксида - нового класса отечественных соединений, генерирующих оксид азота. Показано, что используемые соединения стимулировали гуанилатциклазу, ингибировали агрегацию тромбоцитов и обладали сильным дезагрегационным действием.

Установлено, что в основе проявления антиагрегационных и дезагрегационных свойств исследуемых соединений лежит N0-зависимый механизм активации гуанилатциклазы и увеличения уровня цГШ в тромбоцитах.

- 24 -СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ Велушкиной Н.Н. по теме диссертации:

1. Мирошниченко В.П., Чарахчьян 1/1.к,, Ряпосова И.К,, Белушкина Н.Н., Тытук И. А., Северина И. А. Активность гуанилатциклазы сердца и тромбоцитов в норме и при аллергическом миокардите. -Тезисы V Всесоюзного симпозиума по медицинской энзимологии, Махачкала, 1986, - с. 70.

2. Чирков Ю.Ю., ТыщукИ.А., Белушкина Н. Н., Северина И. С. Гуани-латциклаза тромбоцитов человека // Биохимия,- 1987.- т.52. -с.956-953.

3. ТьпцукИ.А., Белушкина Н.Н., Чирков Ю.Ю. Вьщеление тромбоцитов из крови человека для определения активности гуанилатциклазы. // Депонирована ВИНИТИ. - 1987. - No. 2870-В87. Реферат опубликован в Библиографическом указателе ВИНИТИ "Депонирование рукописи". - 1987. - No. 8. - б/о 221.

4. Чирков Ю. Ю., ТыщукИ.А., Белушкина Н.Н., Северина И.О. Гуани-латциклаза тромбоцитов с повышенной способностью к агрегации. // В кн. "Проблемы клинической энзимологии" / Тезисы докл. на Всесоюзном симпозиуме (Ужгород, 1989). - М. - 1989. - с. 158-159.

5. Северина И. С., Чирков Ю.Ю., Белушкина Н.Н., ТыщукИ.А., Кулагин С. В., Хропов Ю.В. Влияние N- (б-аминогексил)-5-хлорнафта-лин-1-сульфамида (W-7) и его аналогов на активность растворимой Форш гуанилатциклазы и агрегацию тромбоцитов человека // Биохимия.- 1990. - Т.55. - вып.9. - с.1717-1723,

6. Чирков Ю.Ю., Белушкина Н.Н., ТыщукИ.А., Северина И. С. Изменения в активности гуанилатциклазы тромбоцитов человека при АДФ-индуцируемой агрегации // Бюлл. Экоп. Биол. Мед, - 1991. -No.2. - с.152-154.

7. Chirkov Yu.Yu., Bslushkina ¡MI., Tyshchuk I.A., Severina I.S., Horowitz J.D. Increase in reactivity of human platelet guanylate cyclase during' aggregation potentiates the disaggregating capacity of sodium nitroprusside // Clinic. Exptl. Pharmacol. Physyol. - 1991. -v.18. - p.517-524.

8. Chirkov Yu.Yu., Belushkina N.N., Tyshchuk I.A., Severina I.S., Horowit2 J.D. Guanylate cyclase - mediated inhibition of aggregation and induction of disaggregation in human platelets. // Austral. & N.Zeland J. Medicine. - 1991. - v.21. - p.509.

9. Чирков Ю.Ю., Белушкина Н.Н., ТыщукИ.А., Северина И.О. Роль гуанилатциклазы в регуляции агрегации тромбоцитов. // Вестник АМН СССР. - 1991. - N0.10. - с.51-54,

10. Severina I.S., Belushkina M.N. Increase in activating ability of human platelet guanylate cyclase during aggregation // Biochem, Internat. - 1992. - v. 28. - p. 621-631.

11. Severina I.S., Belushkina N.N. Inhibition of ADP- induced human platelets aggregation by new compounds capable of nitric oxide generation // Biochem. a. molecul. biol. Internat. - 1994.-v.33.- p. 957-967.

12. Белушкина Н.Н., Григорьев H.Б., Северина И.С. Ингибирование агрегации тромбоцитов человека новым классом активаторов гуанилатциклазы, генерирующих оксид азота. // Биохимия. - 1994. -т.59. - вып. 11. - с. 1689-1697.