Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии"

На правах рукописи

СОЛПОВ АЛЕКСЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

МЕХАНИЗМЫ ЛИМФОЦИТАРНО-ТРОМБОЦИТАРНОЙ

АДГЕЗИИ

03.00.13 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ЧИТА-2005

Работа выполнена ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия.

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор

Витковский Юрий Антонович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Цыбиков Намжил Нанзатович

кандидат медицинских наук

Папава Коба Михайлович

Ведущая организация

Российский НИИ гематологии и трансфузиологии МЗ РФ, г. Санкт-Петербург

часов на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия (672090, г. Чита, ул. Горького, 39-А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия (672090, г. Чита, ул. Горького, 39-А).

Защита диссертации состоится 2005 г. в

Автореферат разослан "

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.118.01 кандидат медицинских наук, доцент

¿tG3>o&

3 с %

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ* ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время широко изучаются межклеточные взаимодействия, в основе которых лежат механизмы сигнализации, опосредуемые цитокинами. Известно, что непосредственная адгезия играет существенную роль во взаимодействии между тромбоцитами и нейтрофилами. Установлено, что адгезивные взаимодействия между тромбоцитами и лейкоцитами являются важными звеньями механизмов, обеспечивающих миграцию лейкоцитов в зону повреждения, а следовательно воспаления и развития там иммунных и ре-паративных реакций.

Тромбоциты способны вступать в контакт с гранулоцитами в процессе остановки кровотечения и развития воспалительной реакции (Hawrylowich С.М. et al., 1991). Установлена взаимосвязь между гемостатическими и воспалительными реакциями при повреждении тканей, в которой ключевым звеном выступает взаимодействие полиморфноядерных лейкоцитов, тромбоцитов и эндотелиаль-ных клеток. Эту кооперацию с участием ряда интегринов, регулируют хемокины, цитокины, факторы роста, производные радикалов кислорода, вызывающие усиленную коагуляцию и репарацию тканей в месте их повреждения (Folkman J. et al, 2001; Hawrylowich С.М. et al., 1991; Kuijupes T.W. et al., 1991). Данный феномен может иметь определенное патофизиологическое значение, так как активация тромбоцитов на поврежденной поверхности сосудистой стенки может служить важным фактором в миграции лейкоцитов в толщу сосуда и дальнейшему формированию тромба. Так известно, что при активации нейтрофилы человека высвобождают микрочастицы, называемые эктосомами, непосредственно с поверхности клеточной мембраны. Микрочастицы тромбоцитов, эндотелиальных клеток и моноцитов поддерживают коагуляцию или модулируют сосудистый го-меостаз через активированные моноциты и эндотелиальные клетки (Gasser Q, Schifferli ДА, 2004).

Адгезия лейкоцитов и тромбоцитов к эндотелиальным клеткам вовлекается в патогенез ишемического повреждения сосудов (Ishikawa M. et al., 2004). Это связано с экспрессией тканевого фактора, перемещение которого к моноцитам может осуществляется через СП)62Р-опосредованную адгезию тромбоцитов или микрочастиц (Lösche W. et al, 2004). Тромбоциты повышают фагоцитоз лейкоцитов через факторы, высвобождаемые тромбоцитами, например ADP (Miyabe K.et al., 2004). Вместе с этим, активированные Т-лимфоциты усиливают экспрессию Р-селектина кровяными пластинками (Danese S. et al., 2004).

* Работа выполнена при поддержке фанта Президента РФ (приказ Минобразования РФ №1632 от 30.04.2002 г.)

Выражаем сердечную признательность профессору Борису Шенкману (Израиль) за помощь в выполнении работы.

Однако наряду с реакциями неспецифяческой защиты организма развивается иммунный ответ, главными участниками которого являются лимфоциты (Weyrich A.S., Zimmerman G.A., 2004). К сожалению, механизмы взаимодействия этих клеток с кровяными пластинками недостаточно изучены.

В последнее время установлено, что CD40L экспрессируется не только стимулированными Т-лимфоцитами, но также активированными тромбоцитами, причем растворимая фракция лиганда имеет исключительно тромбоцитарное происхождение (Nagasawa М, et al.. 2005), Более того, высказывается мнение, что кровяные пластинки являются провоспалительными клетками и принимают участие в иммунных реакциях, модулируя функции лимфоцитов, моноцитов, анти-генпрезентирующих клеток (Fricke I. et al., 2004; Weyrich A.S., Zimmerman G.A., 2004).

Однако до сих пор еще не ясен характер межклеточного контакта и механизмы передачи сигналов тромбоцитами. В связи с вышесказанным, изучение лим-фоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия является актуальной задачей, решение которой раскрывает новые возможности для понимания механизмов миграции клеток, развития иммунных реакций, патогенеза атеросклероза, воспаления, тромбоза и др.

Цель и задачи исследования

Основной целью нашего исследования явилось изучение механизмов лим-фоцитарно-тромбоцитарной адгезии в опытах in vitro.

В связи со сказанным нами решались следующие задачи.

1. Выяснить, какие субпонуляции лимфоцигов способны к спонтанной адгезии с интактными тромбоцитами. Изучить роль молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 в лимфоцитарно-пластиночном контакте.

2. Исследовать влияние цитокинов - IL-ip, IL-2, IL-4, IL-10,1L-16, TNFcc, IFNy на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию.

3. Исследовать влияние индукторов агрегации тромбоцитов (ADP, коллагена, адреналина, тромбина, PAF) на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию.

4. Получить С04+-субпопуляцию лимфоцитов методом иммуномагнитной сепарации и проследить влияние тромбоцитов на адгезию клеток к субэндоте-лиальному матриксу.

5 Выяснить роль тромбоцитов в адгезии клеточной линии CD4+ (HVST-клона) к экстрацеллюлярному матриксу в условиях статики и разных сдвигах тока жидкости.

6. Сравнить экспрессию интегринов а,|3, (VLA-1), а^ (VLA-2), а4р( (VLA-4), а5Р( (VLA-5) свежевыделенных и культивированных СБ4+-лимфоцитов доноров с HVST трансформированной линией CD4+ лимфоцитов. Изучить роль интегринов а,Р, (VLA-1), аД (VLA-2), а4Р, (VLA-4), а5Р, (VLA-5), CD40L и PSGL в опосредованной тромбоцитами адгезии СВ4+-лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу.

Научная новизна. Впервые установлено, что Т-хелперы (С04+) способны к спонтанной, а натуральные киллеры (СО 16+) - к 1Ь-2-индуцированной адгезии с интактными тромбоцитами. Адгезивную активность лимфоцитов стимулирует также 1Ь-1р. Ингибиторами ЛТА являются (1.-4, (Ь-10 и 1РМу . Агонисты агрегации кровяных пластинок коллаген и АОР повышают лимфоцитарно-тром-боцитарную адгезию. Лигандом лимфоцигарио-пластиночного контакта выступают молекулы межклеточной адгезии-1 (1САМ-1).

Впервые обнаружено, что тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости, но не в статическом состоянии. В этих условиях лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, сформированные на поверхности экстрацеллюлярного матрикса, являются главными триггерами адгезии лимфоцитов. Число лимфоцитов, вовлеченных в лимфоци-тарно-громбоцитарные кластеры, находится в прямой зависимости от скорости сдвига жидкости, тогда как количество единичных клеток - в обратной.

Впервые описаны механизмы лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия, включающие в себя образование ингегриновых и неинтегриновых мостов, таких как аИ1/Р3- и р,-связанные интегрины, Р-селектин-РЯС1, и СГ)40-С040Ь.

Впервые показано регулирующее действие интерлейкинов в формировании лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегагов на поверхности экстрацеллюлярного матрикса: (Ь-2 и 11,-16 повышают адгезивные свойства клеток в присутствии кровяных пластинок.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные сведения о субпон)ляциях лимфоцитов, адгезивных молекулах, принимающих участие в образовании лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов, роли цитоки-нов в регуляции функции ЛТА, раскрывают новые возможности для изучения механизмов миграции клеток, развития иммунных реакций, патогенеза атеросклероза, воспаления, тромбоза и др.

На основании исследований, разработанный и предложенный нами тест оценки лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии позволяет оценить функциональную активность иммунокомпетентных клеток, эффективность иммуномоду-лирующей терапии, проследить течение и прогноз заболевания.

Внедрение в практику. Теоретические сведения о функции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии, механизмах ее регуляции и биологическом значении внедрены в учебный процесс ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия. Тест лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии используется в диагностической лаборатории ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия.

Материалы по исследованию лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в норме и патологии вошли в отчет за 2003 год по федеральной программе "Совершенствование технологии трансплантации стволовых гемопоэтических кле-

ток, химио-, иммуно- и сопроводительной терапии заболеваний системы крови; разработка новых форм организации средств и методов трансфузионно-инфузи-онной терапии" (договор № 005/037/002 от 25.09. 2001 г.).

Апробация диссертации. Материалы диссертации доложены на: Фестивале "Студенческая медицинская наука '98" (Москва, 1998), 15, 16, 17, 18 Международных конгрессах по тромбозу (Antalya, Porto, Bologna, Lubljana, 1998,2000,2002, 2004), XVII, XVIII, XIX Конгрессах Международного общества по тромбозу и гемостазу - ISTH (Washington, 1999; Paris, 2001, Birmingham, 2003), на Международном симпозиуме "Platelets 2000" (Ma'ale Hachamisha, Israel), XVIII съезде Физиологического общества им.И.П. Павлова (Казань, 2001), Конференции международного цитокинового общества - ICS (Гаваи, 2001), на заседании проблемной комиссии по физиологии тромбоцитов (Университет Тель-Авива, Израиль, 2004), Второй Всероссийской научной конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (Москва, 2005).

Положения, выносимые на запилу:

1. Феномен лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии представляет собой одну из физиологических функций, присущую различным субпопуляциям лимфоцитов, и реализуемую посредством адгезивных молекул. Наиболее выраженной способностью к образованию коагрегатов с интактными лимфоцитами обладают Т-хелперы (CD4+) и NK-клетки (CD16+). Лигандом лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии выступают молекулы межклеточной адгезии-1 (1CAM-I).

2. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия регулируется цитокинами и индукторами агрегации тромбоцитов. Повышают эту функцию 1L-I р, 1L-2, коллаген, адреналин и ADP Ингибиторами лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии являются 1L-4, 1L-10 и IFNy.

3. Тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному мат-риксу в условиях тока жидкости, но не в статическом состоянии. При этом лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, сформированные на поверхности экстрацеллюлярного матрикса, являются главными триггерами адгезии лимфоцитов. Число лимфоцитов, вовлеченных в лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, находятся в прямой зависимости от скорости сдвига жидкости, тогда как количество единичных клеток - в обратной. Механизм лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия включает в себя образование интегрино-вых и неинтегриновых мостов, таких как Ищ/Р,- и Р^связанные интегрины, Р-селектин-PSGL и CD40-CD40L.

4. Интерлейкины 2 и 16 повышают число лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов на поверхности экстрацеллюлярного матрикса в условиях тока жидкости.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы обзора литературы, мате-

риалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения, выводов и указателя литературы, включающего 210 работ, из них - 92 отечественных и 118 зарубежных авторов, иллюстрирована 15 таблицами и 18 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Médical Association Declaiation of Helsinki (1964,2000 ред.). Объектами наблюдения явились:

1. Цельная кровь здоровых доноров в возрасте 18-35 лет (380 образцов).

2. Культивируемые лимфоциты здоровых доноров (96 образцов).

3. Очищенные тромбоциты здоровых доноров (68 образцов).

4. ЕСМ, полученный в культуре эндотелиальных клеток.

5. Культивируемые клетки линии CD4+ (HVST- трансформированный клон).

Определение показателя лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии. Свежую гепаринизированную кровь обследуемых больных наслаивали на градиент урографин-фикол (плотность 1,077) и выделяли лимфоциты. Собирали интерфазное кольцо, содержащие клетки и кровяные пластинки, однократно промывали фосфагно-солевым буфером (рН-7,4) и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3-4 мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок микроскопировали в камере Горяева. Подсчитывали число лимфоцитарно-тромбоцитарных коагре-гатов на 100 клеток. Степень адгезии определяли как число кровяных пластинок, адгезированных на поверхности одного лимфоцита.

Разделение лимфоцитов на субпопуляции. Предварительно лунки полистиролового планшета сенсибилизировали к субпопуляциям лимфоцитов. С этой целью в них вносили моноклональные антитела к клеткам, несущим маркеры CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD22+ (ДиагноТех, Москва). В планшеты вносили пул лимфоцитов, инкубировали 1 час, остатки плазмы и не связавшиеся с клетками тромбоциты удаляли осторожным двукратным промыванием лунок фос-фатно-солевым буфером (PBS) (рН = 7,4). Лунки планшета микроскопировали и определяли процент лимфоцитарно-тромбоцитарных агрегатов.

Краткосрочная культура лимфоцитов. Выделенные и отмытые лимфоциты в концентрации 2-3 х 10f' клеток в 1 мл, а также цельную гепаринизированную кровь здоровых доноров инкубировали с рекомбинантными цитокинами. Конечная концентрация цигокинов составляла для 1L-Ip - 2 нг/мл, IL-2 - 2 нг/мл, 1L-8 - 2 нг/мл, TNFa - 2 нг/мл, 1L-4 - 1 нг/мл, IL-10 - 1 нг/мл, IFNy - 1 нг/мл. Контролем служили интактные клетки, а также клетки, инкубируемые с моно-клональными антителами (МонАТ) против IL-2 или 1САМ-1. Время инкубации культуры выделенных лимфоцитов с 1L-2, МонА'Г против IL-2 и ICAM-I составляло 4 часа, а цельной крови с цитокинами - 2 часа.

Проведение CPA (Cone and Platelet) Analyzer) анализа. Исследования проводились с использованием CPA-анализа - оригинального метода оценки адгезии и агрегации тромбоцитов, предложенного Varón D. et al. ( 1997). Для экспериментов применялся CPA-анализатор (Cone and Plate(let) Analyzer) - новый прибор для анализа адгезивных и агрегационных свойств форменных элементов крови (Naphtali S, Israel).

Суспензия CD4+ лимфоцитов помещалась на покрытые ЕСМ четырехлу-ночные планшеты и инкубировалась в течение 30 мин при 37°С в условиях статики или в условиях тока культуральной жидкости. В ячейку пластикового планшета помещался свободно вращающийся тефлоновый конус. На приборе, в зависимости от поставленных задач, задавалась требуемая скорость вращения или скорость сдвига (от 200 до 1000 s1). Подсчет числа адгезированных лимфоцитов осуществлялся на 1 мм2 с помощью инвертированного светового микроскопа (Olympus, Tokyo, Japan) подключенного к компьютерной системе анализа изображения (Galai, Migdal Haemek, Israel).

Метод иммуномагнитного разделения клеток. Предварительно выделялся пул лимфоцитов из крови доноров на градиенте HISTOPAQUEM077 (плотность 1,077±0,001 g/ml). Клетки метились специфичными магнитными гранулами, конъ-югированными с моноклональными антителами против CD4 антигена человека (мышиные IgGl; клон: М-Т321, Miltenyi Biotec, Germany). Клеточная суспензия помещалась в магнитное поле MACS сепаратора в специальной разделительной колонке. Меченые CD4+ лимфоциты задерживались в колонке, а остальные мо-нонуклеары под действием силы тяжести проходили через нее. Клетки извлекались из магнитного поля и полученная фракция лимфоцитов рассматривалась как С04-положительная (Akdis A.C., 1995).

Клеточная линия (клон CD4+ лимфоцитов). В опытах использовались клетки долгоживущей линии CD4+ лимфоцитов (любезно предоставленные доктором I. Bank, медицинский центр Шеба, Израиль). ФГА- стимулированные Т-клетки инфицировались Herpesvirus saimirí (HVS) группы С (Saha К, 1996). Линия HVST-клеток обладала стабильными фенотипическими характеристиками CD4+ Т- лимфоцитов.

Приготовление гель-фильтрованных тромбоцитов. Получение чистой суспензии тромбоцитов проводилось методом гель-фильтрации (Walsh Р., 1977). Богатая тромбоцитами плазма помещалась в специальные гелевые разделительные колонки (AD1 Agel, American Diagnostica INC.). Взвесь кровяных пластинок отмывалась PBS (pH =7,4) и использовалась в экспериментах.

Проведение FACS-анализа. В исследовании использовались кроличьи моноклоиальные анти-Ts 2/7 (IgGl ; Endogen, Woburn, M А), CD49b, CD49d и CD49e антитела. Клетки в концентрации 1-2 х 107мл инкубировались в течение 30 мин при 4°С и дважды отмывались PBS, pH = 7,4, содержащего 1% телячьей сыворотки Затем добавлялись вторые мышиные антитела класса IgG, часть из кото-

рых была мечена FITC, часть фикоэритрином (РЕ). Оценка экспрессии клеточных рецепторов осуществлялась на FACS-анализаторе (Becton-Dickinson FACS 440).

Приготовление планшет покрытых ЕСМ. Пластиковые 4-х-луночные планшеты (Nunc, Germany) предварительно покрывались экстрацеллюлярным мат-риксом (ЕСМ) по методу предложенному Gospodarowicz et at (1980). Корнеаль-ный эндотелий быка выращивался на поверхности планшет, после чего клетки удалялись с помощью растворов Triton Х-100 и 0,1 М NH4OH с последующей интенсивной отмывкой дистиллированной водой. На месте роста клеток оставался ЕСМ, который в дальнейшем использовался в опытах. Полученный внеклеточный матрикс содержал полный набор коллагенов, адгезивных гликопро-теидов, и протеогликанов, свойственных сосудистому субэндотелиальному мат-риксу.

Длительная кулыура лимфоцитов. Из смеси мононуклеаров методом иммуномагнитного разделения выделялись С04+лимфоциты, которые в дальнейшем культивировались. Полученные лимфоциты представляли первую группу культивируемых клеток. В качестве второй группы использовалась линия CD4+ лимфоцитов (HVS инфицированный клон), которая предварительно в течение пяти суток находилась без активации стимуляторами роста. Клетки инкубировалась в течение 3-х и 7-суток в присутствии рекомбинантных цитокинов. Конечная концентрация цитокинов для IL-lß - 1 нг/мл, IL-2 - 1 нг/мл, IL-10 - 20 нг/мл, IL-16 -10 нг/мл (lmmunotech, Denmark). Контролем служили клетки с добавлением среды RPM1.

Сканирующая электронная микроскопия. Клетки фиксировались метанолом в течение нескольких минут, обрабатывались раствором таниновой кислоты и 0s04. Дегидратация образцов осуществлялась этанолом, а затем фреоном с возрастающей концентрацией (от 50-100%). После просушки препараты заливались эпоксидной смолой и микроскопировались в сканирующем электронном микроскопе.

Статистическая обработка материала. Полученные данные обработаны методом вариационной статистики для связанных и несвязанных между собой наблюдений и вычислен показатель достоверности различий (Венчиков А.И., Венчиков В. А., 1974). Статистическая обработка осуществлена при помощи электронной программы (Windows ХР Exel 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Субпопуляции лимфоцитов, принимающие участие в лимфоцитарно-трамбоцитарной адгезии и их регуляция

Как показали исследования, лимфоциты способны к спонтанному образованию коагрегатов с тромбоцитами. Установлено, что в общем пуле лимфоцитов, выделенных из крови доноров, находилось до 14+1% клеток, адгезировав-

ших на своей поверхности тромбоциты. Обнаружено, что клетками, спонтанно взаимодействующими с кровяными пластинками, являются Т-лимфоциты, несущие маркеры CD3+ и CD4+. Количественно число розеток С04+-лимфоцитов соответствовало содержанию таковых среди СОЗ+-клеток.

Выявлено, что после 4-х часовой инкубации с IL-2 в общем пуле лимфоцитов количество розеткообразующих лимфоцитов повысилось более, чем в 4 раза. После разделения клеток на твердой поверхности, обнаружено, что способностью взаимодействовать с тромбоцитами обладают не только лимфоциты, несущие детерминанты CD4+ (Т-хелперы), но и CD16+ (натуральные киллеры) Предварительная инкубация лимфоцитов с МонАТ против IL-2 полностью устраняла способность образовывать коагрегаты с кровяными пластинками для натуральных киллеров и значительно тормозила эту функцию у Т-хелперов.

Следует отметить, что интактные тромбоциты и пластинки после предварительного контакта с антителами против гликопротеидов (GP) IIb/Ша не утратили способность адгезировать с лимфоцитами. На процесс лимфоцитарно-тром-боцитарной адгезии не влияли ионы кальция, поскольку выделение тромбоцитов и реакция с лимфоцитами проводилась с использованием цитрата натрия или ЭДТА.

Мы изучили возможность участия ICAM-I, как молекулы адгезии быстрого реагирования, в лимфоцитарно-тромбоцитарном контакте. Известно, что она способна экспрессироваться не только на поверхности эндотелия, но и на мембране лимфоцитов после их активации интерлейкином-2 (Ярилин A.A., 1997, 1999). Обнаружено, что предварительная инкубация клеток с МонАТ против 1САМ-1 практически полностью устраняла способность лимфоцитов спонтанно вступать в контакт с кровяными пластинками. Так, выявлено, что после обработки моноклональными антителами только 1±0,1% клеток образовывали коагрегаты с тромбоцитами (р<0,001) Внесение в среду роста лимфоцитов интер-лейкина-2 на фоне МонАТ против ICAM-! не повышало адгезивную функцию инкубируемых клеток (р<0,001).

Полученные нами данные доказывают, что способность лимфоцитов спонтанно адгезировать на своей поверхности кровяные пластинки осуществляется за счет лиганда - молекулы межклеточной адгезии ICAM-1.

Воздействие интерлейкинов на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию не ограничивается только стимулирующим влиянием 1L-2, но и проявляется в эффектах других цитокинов. Обнаружено, что 2-х часовая инкубация цельной крови здоровых людей в присутствии IL-lß в 2,5 раза повышала число лимфоци-тарно-тромбоцитарных коагрегатов, которые составили 29*3% от общею пула лимфоцитов, в то время как в контрольной серии показатель клсточно-плас1и-ночной адгезии находился на уровне 15±1% (р<0,001) Другие провоспалитель-ные цитокины - IL-8 и TNFa, - не изменяли способности лимфоцитов образовывать коагрегаты с тромбоцитами (р>0,05). Противовоспалительные 1L4 и IL-

10 существенно ингибировали лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию. Так, добавление этих цитокинов в культуру цельной крови тормозило формирование лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов до 1+0,1% для IL-4 и до 3±0,2% для IL-10 (р<0,001). Подобно этому эффект IFNy также проявлялся в виде уменьшения количества лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов до 3±0,2% (р<0,001).

Таким образом, про- и противовоспалительные цитокины являются регуляторами взаимодействия лимфоцитов и тромбоцитов.

Естественно предположить, что со стороны тромбоцитов также присутствуют поверхностные рецепторы, опосредующие контакт с активированными лимфоцитами. Кроме того, экспрессия последних должна зависеть от функционального состояния кровяных пластинок. Известно, что повреждение кровеносных сосудов сопровождается немедленной активацией тромбоцитов, чго связано с появлением высоких концентраций ADP, а также обнажением субэндотелия, кол-лагеновых и фибриллярных структур.

В связи с этим, мы изучили роль ADP, коллагена, адреналина, тромбина и фактора активации тромбоцитов (PAF) в лимфоцитарно-тромбоцитарном взаимодействии Для предотвращения агрегации между тромбоцитами кровь предварительно инкубировалась в присутствии блокатора RGD- последовательности - тирофибана.

Установлено, что в контрольной серии количество лимфоцитарно-тромбо-

цитарных агрегатов (ЛТА) составило 14% Добавление ADP, адреналина и коллагена увеличивало ЛТА в 1,5 - 2 раза. После внесения PAF процент ЛТА поднялся только 3% по сравнению с контролем.

При подсчете количества тромбоцитов, вступивших в контакт с отдельным лимфоцитом, обнаружено, что в контроле их число составляло в среднем 4,7+0,8. Добавление тирофибана снижало количество кровяных пластинок в среднем до 2,0+0,3 на одном лимфоците. Однако внесение коллагена на фоне тирофибана увеличивало их число до 7,1 + 1,1 на единичной клетке р<0,001. Добавление других агонистов активации не изменяло характер лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии.

Таким образам степень лимоцитарно-тромбоцитарной адгезии зависит от функционального состояния кровяных пластинок, различные индукторы arpeia-ции являются участниками сложной системы регуляции данного взаимодействия

2. Лимфоцитарно-трамбоцитарная адгезия на поверхности экстрацеллюлярного матрикса

Биологическая целесообразность тромбоцитарно-лимфоцит арной адгезии становится очевидной. При нарушении целостности сосудистого русла повреждается сосудистый эндотелий и тем самым затрудняется экспрессия большинства известных молекул адгезии для лимфоцитов. В результате этого нарушаются

кооперация и миграция клеток в указанной зоне. В связи с этим расширяются функции тромбоцитов.

Нами предложена модель участия тромбоцитов в миграции лимфоцитов в участки сосудистого повреждения. Во-первых, пластинка обеспечивает контакт лимфоцита и коллагеновых волокон, во-вторых, снижает реакцию лимфоцитов на эти волокна как на антиген, проявляя супрессивные свойства, в-третьих, тромбоцит отчасти компенсирует недостающую антигенпрезентирующую функцию, в-четвертых, в результате ретракции способствует локомоции лимфоцитов через поврежденную стенку сосудов вглубь травмированного участка, в-пятых - осуществляет трофическую и репаративную функции, благодаря секреции фактора роста тромбоцитов.

Для подтверждения этой гипотезы дальнейшие исследования проводились на покрытой экстрацеллюлярным матриксом (ЕСМ) поверхности, моделирующей участок поврежденного сосуда. При этом создавались условия тока культу-ральной жидкости, соответствующим физиологическим. Исследования проводились с использованием оригинального метода оценки адгезии и агрегации тромбоцитов, предложенного Varón D. и соавт. (1997). Для экспериментов применялся CPA-анализатор (Cone and Plate(let) Analyzer) (Naphtali S, Israel).

В первой модели нами исследовалась адгезия PMA-активированных CD4+-лимфоцитов линии HVST к ЕСМ в присутствии тромбоцитов. В качестве контроля использовались CD4+- лимфоциты без тромбоцитов. Адгезия Т-клеток и тромбоцитов оценивалась в условиях статики и в состоянии тока со скоростью сдвига 200 s1, а также после добавления клеточного активатора форбол-12-ми-ристат 13-ацетата (РМА).

Установлено, что активация Т-лимфоцитов приводила к увеличению количества адгезированных клеток на поверхности ЕСМ как в состоянии статики, так и в условиях тока (в 2,6 и в 1,4 раза соответственно). При отсутствии кровяных пластинок, по сравнению с состоянием статики, в условиях тока адгезия Т-лимфоцитов снижалась в 5 раз (р< 0,001 ).

Внесение гель-филырированных тромбоцитов в условиях статики не изменяло число адгезированных Т- лимфоцитов, однако в условиях тока, тромбоциты повышали адгезию Т-лимфоцитов в 16,2 раза {\><~ 0,001 ) (табл. I ) Это увеличение наблюдалось за счет образования лимфоцитарно-тромбоцитарных кластеров на поверхности ЕСМ (рис. 1 и 2). При добавлении РМА число адгезированных лимфоцитов возрастало в 18 раз (р< 0,001), причем большая часть клеюк наблюдалась в составе кластеров.

Полученные данные доказывают, что активация РМА увеличивает степень адгезии Т-лимфоцитов к ЕСМ. Однако присутствие тромбоцитов усиливает адгезию CD4+ лимфоцитов к ЕСМ в условиях тока, но не статики. Кроме того, в условиях тока лимфоциты и тромбоциты способны образовывать совместные скопления - кластеры.

Таблица 1.

Роль тромбоцитов в адгезии С04+-лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях статики и тока жидкости (200 в"1)

Вариант опьпа Число клеток/мм2

п (M±SD) Р

Условия статики

Контроль 14 66+16

РМА 8 174+45 <0.001

Тромбоцит ы 9 82+22 >0.05

РМА + тромбоциты 7 148+24 < 0,001

Условия тока жидкости

Кон ! роль 14 10+2

РМА 6 14+5 0,05

Тромбоциты 12 162+43 <0,001

РМА + тромбоциты 11 231+64 < 0,001

Примечание: Р - достоверность различий по сравнению с контротем

Во второй модели ЕСМ предварительно инкубировался с бедной и богатой тромбоцитами плазмой. Контролем служили интактные Т-лимфоцигы. В состоянии статики, по сравнению с контролем, адгезия CD4+ лимфоцитов к ЕСМ покрытому бедной тромбоцитами плазмой возрастала в 2,3 раза Покрытие ЕСМ богатой тромбоцитами плазмой повышало количество Т-лимфоцитов в несколько меньшей степени (в 1,6 раза). Однако, в состоянии тока (скорость сдвига 200 s'1), тромбоциты усиливали ад1 езию Т-клеток в 3,3 раза. При этом не отмечалось образования клеточно-тромбоцитарных гетеротипичных кластеров.

Эти данные подтверждают сведения о том, что тромбоциты способствуют адгезии тромбоцитов в условиях тока, но не статики. Для образования лимфоци-тарно-тромбоцитарных кластеров кровяные пластинки предварительно должны находится в состоянии суспензии с Т-лимфоцитами.

В дальнейшем, нами была поставлена задача, изучить влияние напряжения сдвига на адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу и выяснить роль тромбоцитов в данном взаимодействии В опытах использовались интактные CD4+ Т-лимфоциты линии, и клетки, стимулированные PMA, а также лимфоциты в присутствии гель-фильтрированных тромбоцитов. Исследования проводились при разной скорости сдвига, которая изменялась в пределах от 200 до 1000 s"1. Установлено, что увеличение скорости сдвига сопровождалось уменьшением общего числа лимфоцитов на поверхности ЕСМ. Так при 400 s'1 в отсутствии кровяных пластинок на поверхности ЕСМ отмечались единичные интактные и РМА активированные лимфоциты. При 600 s 1 и более адгеми клеток к

Рис. 1. Лимфоцитарно-тромбоцитарный кластер на поверхности экстрацеллю-лярного матрикса. Электронограмма. Ув. х 10000.

Рис. 2. Т-лимфоцит, контактирующий с активированными тромбоцитами на поверхности экстрацеллюлярного матрикса. Электронограмма. Ув. х 10000.

ЕСМ не отмечалось. В присутствии тромбоцитов при скорости сдвига 400 s по сравнению с 200 s выявлено снижение количества ад!езированных лимфоцитов в среднем на 25%. При дальнейшем увеличении напряжения сдвига наблюдалось постепенное снижение CD4+ лимфоцитов на поверхности матрикса Так при 1000 s 1 количество клеток убавилось на 70% по сравнению с исходной скоростью. Причем, чем выше была скорость сдвига, тем меньше проявлялся стимулирующий эффект РМА в контроле, а при 1000 s 1 он вовсе не наблюдался.

Полученные нами данные доказывают, чго с увеличением скорости сдвша отмечается снижение степени адгезии лимфоцитов к ЕСМ. При высоких значениях данного показателя (600 s ' и выше) адгезия лимфоцитов к ЕСМ возможна лишь в присутствии кровяных пластинок. Эти данные указывают на то, ч го тромбоциты обеспечивают способность С04+-Т-лимфоцитов линии удерживаться на поверхности ЕСМ в условиях тока с высокой степенью напряжения сдвига

Известно, что для длительного поддержания роста клеточной линии CD4* лимфоцитов, помимо внесения определенных активаторов клеточного деления (МонАТ против CD3~), постоянно требуется добавляв 1L-2 (Bank 1, 2002) Поэтому, клетки в условиях хронической аимуляции, трансформируются в блаоы В таком состоянии на поверхности лимфоцитов наблюдается максимальная экспрессия адгезивных молекул. Поэтому для дока отел ьства адекватности применения используемой нами клеточной линии, проводилось сравнение адгезивных свойства клеток линии и свежевыделенных CD4+ лимфоцитов здоровых людей до и после стимуляции активаторами клеточного деления (ФГА).

CD4+ -лимфоциты выделены с помощью метода иммунома! ни гной сепарации на разделительных колонках Чистоту полученных клеток проверили методом FACS-анализа. Пул клеток делился на две части Адгезивные свойства первой порции лимфоцитов оценивались спустя сутки без предварительной активации. Вторая группа клеток подвергалась культивированию в течение 7 суток в присутствии 11,-2, с последующим и ¡учением адгезии к субэндотелиальному маг-риксу. Контролем служили лимфоциты без тромбоцитов.

Выявлено, что без тромбоцитов отсутствовала адгезия интактныч и РМА-активированных свежевыделенных лимфоциюв как в условиях статики, так и в состоянии тока. Внесение в исследуемую систему кровяных пластинок в условиях статики не изменяло количества приклеившихся Т-лимфоцитов Однако в состоянии тока, по сравнению с состоянием статики, количество адгезирован-ных тромбоцитов увеличивалось в 55 раз, что связано с формированием кластеров Добавление РМА к смеси лимфоцитов и тромбоцитов в условиях тока повышало степень адгезии Т-лимфоцитов в 1,8 pasa по сравнению с нестимулиро-ванными клетками. Как и в предыдущей серии экспериментов, в условиях тока большая часть лимфоцитов, вступивших в контактные взаимодействия с поверхностью ЕСМ, отмечалась в составе лимфоцитарно-тромбоцитарных кластеров

Установлено, что среди культивируемых лимфоцитов, в отличие от свеже-

I 5

выделенных, в условиях статики увеличивалось число адгезированных клеток как интактных, так и стимулированных с помощью РМА. В условиях тока адгезия лимфоцитов наблюдалась только в присутствии кровяных пластинок. Как и в случае со свежевыделенными лимфоцитами, в условиях тока образовывались лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры.

Вышеприведенные данные указывают на то, что ведущую роль в адгезии натуральных свежевыделенных Т-лимфоцитов к ЕСМ играют тромбоциты. Этот эффект проявляется в условиях тока, где первостепенное значение имеет способность С04+-лимфоцитов образовывать гетеротипичные кластеры с кровяными пластинками.

Таким образом, мы убедились, что культивируемая линия клеток приемлема для использования в исследованиях лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии.

В следующей серии опытов мы сравнили степень экспрессии а,-, а2-, а4- и оцР,-интегриновых рецепторов на поверхности покоящихся и активированных CD4+ лимфоцитов доноров, а также Т-клеток культивируемой линии HVST.

Степень экспрессии адгезивных молекул выявлялась методом FACS-ана-лиза. Установлено, что на поверхности покоящихся CD4+ лимфоцитов доноров отмечается сильная экспрессия молекулы а4рр средняя степень выраженности оцр, и низкая аД и агр, интегринов (рис. 3). После культивирования в присутствии IL-2 экспрессия интегрина, содержащего субъединицу а2, достигала среднего уровня, а молекул с аг а4 и а5 компонентами - не изменялась. На поверхности CD4+ лимфоцитов линии, в дополнение к высокой степени выраженности интегрина а4Р,, добавился высокий уровень экспрессии а}рг Кроме того, на мембране клеток линии экспрессия интегринов аД и а()Р, достигла среднего уровня.

Таким образом, в процессе активации клеток отмечался рост степени экспрессии молекул адгезии, в данном случае интегринов. Вероятнее всего этим объясняется более выраженные адгезивные свойства CD4+ Т-лимфоцитов линии к компонентам внеклеточного матрикса по сравнению со свежевыделенными клетками из крови доноров.

Исследование роли молекул CD40L и PSGL в лимфоцитарно-тромбоцитар-ном взаимодействии проводились на предложенной нами модели. Эта система включала совместную суспензию предварительно стимулированных РМА Т-лимфоцитов и гель-фильтрованных тромбоцитов, помещенную на поверхность платы, предварительно покрытой ЕСМ. Клеточная суспензия подвергалась действию тока жидкости с разной скоростью сдвига. В нашем исследовании функциональная блокада обоих лигандов на поверхности лимфоцитов в условиях тока с низкой скоростью сдвига (200 s'1), не изменяла степени адгезии Т-клеток. Однако, одновременная блокада этих молекул в условиях тока с высокой скоростью сдвига (600 s') снижала количество адгезированных лимфоцитов на 57%. При блокаде отдельно CD40L или PSGL адгезия лимфоцитов в присутствии кровяных пла-

Контроль СР4

ОС1Р1

СХ2Р1

ОЦр!

а5Р1

10° 10 10г 1(Г 1С ю3 ю' ю? ю3 10° ю1 1°3 1С юа ю' КИ ю3 Ю'

П * I

103 10' 10! 10э м4

С1 О I ЛЛ

ь!

11 ^

10° 10' 10' 10э 10 10' 10! 10г °10» 10' 10: 103 10 10° 10' 10! 10э 10-

Р11 10в

ри 1СКЗ

а1 юв

Р1.2 юв

1 '" М1I

ШШ

10" 10' '0: 101 10* РИ юэ

5 14 м

10й 10" 10: 103 10' РП иов

А

к« М1

10° 10 10: 103 1С Ю3 10' 10" 10 10' 10' Ю1 10* 10 1С 10' 10! 101 10"

РИ 100

Р12 1<ХЗ

Р12 ЮЗ

Р1.2 Юй

10° 10 101 103 10' РИ юв

10° 10 ю- 103 10* РИ юз

Рис. 3. Экспрессия интегринов на СЭ4+ Т-лимфоцитах.

а - первичные нормальные СЭ4+ Г-клетки (а4 - высокая, а,, а, - низкая, ос, - средняя) Ь - культивируемые нормальные С04^ Т-клетки (ад - высокая, а, - низкая, а„ а, - средняя) с - НУ5Т трансформированная линия С04+ Т-клеток (ос, и ос, - средняя, а4, а, - высокая).

стинок статистически не изменялась.

В использованной тест-системе блокада р^зависимых интегринов на поверхности Т-лимфоцитов при совместной инкубации с тромбоцитами, снижала количество адгезированных клеток на поверхности ЕСМ в условиях статики и тока с низкой скоростью сдвига (200 б'1) на 37% и 43% соответственно.

Одновременно с этим, мы изучили роль аПр3-интегрина (СРПЬ/Ша, отвечающего за агрегацию тромбоцитов) в механизмах формирования лимфоцитар-но-тромбоцитарных кластеров на поверхности ЕСМ. В качестве блокатора этого рецептора использовался тирофибан. После его применения отмечалось существенное снижение числа и размеров лимфоцитарно-тромбоцитарных кластеров (на 90%), а вслед за этим - и количества Т-лимфоцитов адгезированных на поверхности ЕСМ.

Таким образом, полученные нами данные доказывают, что в контакте С04+ Т-лимфоцитов с тромбоцитами участвуют два "моста" межклеточного взаимодействия: Р-5е1есПп - РБОЬ и С040 - С040Ь. Этот механизм обеспечивает способность Т-клеток удерживаться на поврежденной поверхности сосудистой стенки в условиях тока с высокой скоростью сдвига (при 600 в"').

Ингибирующий эффект тирофибана (блокатора адгезии и агрегации тромбоцитов) на количество адгезированных СЭ4+-лимфоцитов еще раз подтверждает, что в условиях тока с высокой скоростью сдвига ведущее значение в прилипании клеток к ЕСМ играет формирование лимфоцитарно-тромбоцитарных кластеров. Следовательно, именно тромбоциты являются связующим звеном, которое обеспечивает адгезию Т-лимфоцитов к субэндотелиальному матриксу в этих условиях.

В следующей серии экспериментов мы выяснили роль отдельных интер-лейкинов в адгезии С04+ лимфоцитов в присутствии кровяных пластинок к ЕСМ. Исследования проводились на описанной ранее модели в условиях тока (скорость сдвига 200 б"'). В опытах использовались С04+-Т-лимфоциты, выделенные из крови здоровых доноров методом иммуномагнитного разделения клеток, а также СБ4+-Т-лимфоциты клеточной линии. Клетки обоих видов подвергались культивированию в течение 24-х и 72-х часов в присутствии 1Ь-1р, 2, 10 и 16. Перед внесением в лунки планшета, тромбоциты, выделенные из богатой тромбоцитами плазмы доноров, предварительно очищались на (елевых колонках.

Выявлено, что после культивирования свежевыделенных Т-лимфоцитов в течение 24-х часов в присутствии 1Ь-2 и 1Ь-16 степень их адгезии к поверхности ЭЦМ не изменялась. Однако на 3-й сутки присутствие этого цитокина в культу-ральной жидкости усиливало адгезивные свойства клеток в 1,5-2 раза по сравнению с контролем (р<0,001). Добавление 11,-1 р снижало, а 1Ь-10 не изменяло способности лимфоцитов доноров вступать в контакт с ЭЦМ на разных сроках культивирования.

Таким образом, в представленной нами модели выявлено разнонаправленное действие интерлейкинов на адгезивные свойства СЭ4+ Т-лимфоцитов. Учитывая, что адгезия лимфоцитов в условиях тока осуществляется в основном за счет формирования лимфоцитарно-тромбоцитарных кластеров, то, следовательно, эффекты интерлейкинов направлены именно на образование подобных клеточных скоплений на поверхности ЕСМ.

Представленные исследования позволяют утверждать, что феномен лим-фоцитарно-тромбоцитарной адгезии представляет собой одну из физиологических функций, присущую различным субпопуляциям лимфоцитов, и реализуемую посредством адгезивных молекул. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия регулируется цитокинами и индукторами агрегации тромбоцитов. Сами тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости, что позволяет им противостоять силе сдвига, способствуют миграции лимфоцитов. Полученные сведения о субпопуляциях лимфоцитов, адгезивных молекулах, принимающих участие в образовании лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов, роли цитокинов в регуляции функции ЛТА, раскрывают новые возможности для изучения механизмов миграции клеток, развития иммунных реакций, патогенеза атеросклероза, воспаления, тромбоза и др.

ВЫВОДЫ

1. Лимфоциты образуют коагрегаты с тромбоцитами. Т-хелперы (С04>) способны к спонтанному розеткообразованию с интактными тромбоцитами. Интер-лейкин-2. и 1Ь-1(3 повышают розеткообразующую способность хелперно-ин-дуцирующих клеток с интактными тромбоци тами и индуцирует ее у натуральных киллеров (С016+). Антитела против 1Ь-2 ликвидируют стимулирующее влияние 1Ь-2 на формирование лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов. 2 Ингибиторами лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии являются 1Ь-4, 1Ь-10 и 1Ь-8 и Т№а не оказывают влияния на лимфоцитарно-пласгиночные контакты.

3. Степень лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии зависит от функционального состояния кровяных пластинок. Коллаген, АЭР и адреналин наиболее выражено повышают лимфоцитарно-тромбоци гарную адгезию. Другие аго-нисты агрегации (РА Р и тромбин) не оказывают влияния на способность тромбоцитов прилипать к лимфоцитам.

4. Тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости, но не в статическом состоянии. При этом лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, сформированные на поверхности экстрацеллюлярного матрикса, являются главными трштерами адгезии лимфоцитов. Число лимфоцитов, вовлеченных в лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, находятся в прямой зависимости от скорости сдвига жидкости, тогда как количество единичных клеток - в обратной.

5. Экспрессия интегринов на лимфоцитах здоровых людей отличается от клеток культивируемой линии HVST. На поверхности покоящихся CD4+ лимфоцитов доноров наиболее сильно экспрессируются молекулы a4ß,, в меньшей степени - a,ß,, и практически отсутствуют интегрины c^ß, и a2ßr После культивирования в присутствии IL-2 повышается экспрессия интегрина ot2ß,, и не изменяется для молекул с a ßp a4ß( и a5ßr На поверхности CD4+ лимфоцитов линии HVST выявляются интегрины a4ßr a,ßr a(ß, и a2ßr

6. Лигандом лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии выступают молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-I) Механизм лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия включает в себя образование интегриновых и неинтегрино- « вых мостов, таких как allb/ß3- и р^связанные интегрины, Р-селектин-PSGL и CD40-CD40L. Блокада Р,-зависимых интегринов и комбинированная блокада PSGL и CD40L на мембране лимфоцита уменьшает адгезию лимфоцитов к 4 экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости (на 40% и 60% соответственно). Блокада allt/ß, (те агрегации тромбоцитов) тирофибаном предупреждает образование кластеров, тем самым подавляя 95% лимфоцитар-

ной адгезии к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости.

7. Интерлейкины 2 и 16 повышают число лимфоцитарно-тромбоцитарных коаг-регатов на поверхности экстрацеллюлярного матрикса в условиях тока жидкости. Присутствие IL-lß в среде роста культивируемых CD4+ лимфоцитов линии HVST снижает лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию, а IL-10 не изменяет адгезивные свойства клеток и кровяных пластинок.

8. Тромбоциты способствуют миграции лимфоцитов и их фиксации на поврежденной поверхности сосудистой стенки, что позволяет им противостоять силе сдвига протекающей жидкости. Феномен лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии занимает важное место в развитии атеросклероза, воспаления, тромбоза, иммунных реакций, репаративных процессов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Солнов A.B. и др. Влияние некоторых ингерлейкинов на свертывание крови и фибри-нолиз / A.B. Солнов, А.Г. Цыбденов, А В Федоюв, C.B. Мартынова, Ю А Вигков-ский//Эколоюзависимые заболевания Тез. докл Всеросс Научно-практической «

конференции - Чита, 1997. - С. - 246

2 Солнов A.B. Интерлейкины - важные регуляторы системы гемостаза // Фестиваль "Студенческая медицинская наука '98". XI,VI Итоговая студенческая научная конференция.-Москва, 1998 -С 64

3. Vitkovsky Yu., Kuznik В , Solpov A. The blocking of interleukins 4 and 10 changes haemostatic properties of lymphocytes //Abstracts of the 15th International Congress on Thrombosis. -October 16-21,1998,-Antalya, Turkey.-1998 - P 524

4. Витковский Ю.А.. Кузник Б И.. Солпов А. В Изменение состояния системы гемостаза при нейтрализации интерлейкинов 4 и 10 // Цитомедины, цигокины и антжены

главного комплекса гистосовместимости (HLA).Сборник рабочих трудов. Вьтуск 1-Чита, 1998-С. 41-42.

5. Витковский Ю.А., Кузник Б.И., Солпов А.В. Опосредованное Т- и В- лимфоцитами действие интерлейкинов на систему гемостаза. Цитомедины, цитокины и антигены главного комплекса гистосовместимости (НЬА).Сборник рабочих трудов. Выпуск 1-Чита, 1998-С. 42-43.

6. Витковский Ю.А., Солпов А.В. Влияние интерлейкина-2 на бластную трансформацию лимфоцитов in vitro // Актуальные вопросы акушерства, гинекологии и перинато-логии. Сборник научно-практических трудов. Выпуск 2 - Чита, 1998 - С. 134-135.

7. Юхно Т.Р. и др. Влияние интерлейкинов 1,2 и 8 на свертывание крови и фибринолиз/

Т.Р. Юхно, Д.Е.Бриль, Д.А. Еделев, А.В. Солпов, Ю.А. Витковский // Актуальные вопросы акушерства, гинекологии и неринатологии. Сборник научно-практических трудов. Выпуск 2 - Чита, 1998 - С.140-142.

8. Витковский Ю А, Кузяик Б И., Солпов А В. Модуляция лимфопитарно-тромбоцитар-

ного взаимодействия иятерлейкином-2 // Цитомедины, цитокины и антигены главною комплекса гистосовместимости (HLА) Сборник науч Трудов Выпуск 2. - Чита, 1999-С. 32-34.

9 SolpovA. eta! Influence ofinterleukin 4 and 10on haemostasis'A. Solpov, B. Kuznik. Yu Vitkovsky, D Yedelev // Thrombosis and Haemostasis. - Suppl. - Abstr. XVII Congress of thelSTH. Washington D.C.August 14-21,1999-P. 110.

10. Vitkovsky Yu, SolpovA., Kuznik B. Interleukin 2 influence on platelet-lymphocyte adhesion

// Thrombosis and Haemostasis - Suppl. - Abstr. XVII Congress of the ISTH. Washington D.C.August 14-21,1999.-P. 141-142.

11. Витковский Ю.А., Кузник Б.И., Солпов A.B. Феномен лимфоцигарно-тромбоцитар-

ного розеткообразования // Иммунология. - 1999. - № 4. - С. 35-37.

12. Витковский Ю.А. Блокировка интерлейкинов 4 и 10 изменяет гемостагшческие свойства лимфоцитов / Ю.А. Витковский, Б.И. Кузник, Д.А. Еделев, А.В. Солпов // Иммунология. - 1999. - № 5. - С. 20 - 23.

13. Vitkovsky Yu. et al. Lymphocytesmediated influence of interleukins 4 and 10 on haemostasis

/Yu. Vitkovsky, B. Kuznik, D. Edelev, A. Solpov//Haemostasis. - Suppl.-16th International Congress on Thrombosis. - Porto, Portugal, May 5-8,2000. - P. 60.

14. Vitkovsky Yu., Kuznik В., Solpov A. Role of interleukin-2 in lymphocytes rosette formation with platelet // Platelets 2000 Symposium. 18-22 May 2000, Ma'ale Hachamisha. Israel -P32.

15. Витковский Ю.А Влияние интерлейкинов 4 и 10 на систему гемостаза in vitro / Ю А.Витковский, Б.И., Кузник Б.И., Д.А.Еделев, А.В.Солпов // Иммунология -2001. - № 1.- С. 43-45.

16. Vitkovsky Yu., Kuznik В , Solpov A. Cytokine influence on lymphocyte-platelet adhesion /

/Thrombosis and Haemostasis. - Suppl. - July, 2001. - P. 2711.

17 ВитковскийЮ А., Кузник Б И., Солпов А.В. Влияние интерлейкинов 1 и8на секрецию Т- и В-лимфоцитами прокоагулянтов и фибринолитических агентов // Иммунология. - 2001. - № 6. - С. 24-27.

18. Витковский Ю А, Кузник Б И., Солпов А.В. Феномен лимфоцитарно-томбоцитарной

адгезии // XVIII съезд Физиологического общества им.И.П. Павлова. - Тез. докл. -Казань. - 25-28 сентября 2001 г. - С. 319.

19 Vitkovsky Yu. Lymphocyte-platelet adhesion in IL-2 therapy of patient with laryngeal carcinoma/Yu. Vitkovsky, L. Ilynykh, A. Solpov, B. Kuznik- //Journal ofLeukocyte Biology. -Suppl.-2001.-P.66.

20. Солпов A.B. Влияние про- и противовоспалительных цитокинов на лимфоцитарно-тромбоцитарнуго адгезию // Забайкальский медицинский вестник - 2002,- № 1.- С. 14-17.

21. Солпов А.В. Влияние цитокинов на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию // Тромбоз, гемостаз, реология. -2002.- № 1 .-С. 34-36.

22. Витковский Ю.А., Солпов А.В., Кузник Б.И. Влияние цитокинов на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию //Медицинская иммунология. - 2002.-Т.4, № 2.- С. 135136.

23. Vitkovsky Yu. Cytokine effects on lymphocyte-platelet adhesion / Yu Vitkovsky., A Solpov, В Kuznik, O. Klimenko // Haemostasis. - Suppl.-17th International Congress on Thrombosis. - Bologna, Italy. June, 2002. - P. 155.

24. Solpov A, Bobrovich V. Influence of monocyte on lymphocyte-platelet adhesion//Thrombosis

and Ha.emostasis. - Suppl. - Abstr. XIX Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis Biimingham,UK July, 2003. - CD 060.

25. Солпов А В Влияние цитокинов на адгезивную и агрегационпую функцию тромбоцитов // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Чита. - 2003. - С 300.

26 Солпов А.В Влияние различных активаторов кровяных пластинок на лимфоцитар-но-тромбоцитарную адгезию / А В. Солпов. А.Н. Перелыгин, М А. Аветисян, П.В. Чупров, О.В. Степанова// Материалы 63-й Всероссийской итоговой научной ciy-денческой конференции им. Н.И. Пирогова. Сборник статей.- Томск, 2004. - С. 22.

27. Vitkovsky Yu., Solpov A. Influence of recombinant interleukin 2 on platelet aggregation and lymphocyte-platelet adhesion // Haemostasis. - Suppl.-18th International Congress on Thrombosis. - Lubljana, Slovenia. June, 2004. - P. 180.

28. Solpov A., Govorin A., Gorbunov V. Lymphocyte platelet adhesion in acute coronary syndrome // Haemostasis. - Suppl.-18th International Congress on Thrombosis. - Lubljana, Slovenia. June, 2004. -P 181.

29. Solpov A. Platelets enhance CD4+ lymphocyte adhesion to extracellular matrix: role of CD40 ligand and P-selectin glycoprotein ligand/ A. Solpov, B. Shenkman, Yu. Vitkovsky, B. Kuznik // Забайкальский медицинский вестник. - 2004.- №4 - С. 95-97.

30. Solpov A. Platelets enhance CD4+- lymphocyte adhesion to extracellular matrix: role of CD40 ligand and P-selectin glycoprotein ligand / A Solpov, B. Shenkman, Yu. Vitkovsky, B. Kuznik//Тромбоз, гемостаз и реология. - 2004 -№4 -С.25-27

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЛТА - лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия

ФГА - фитогемагглютиитин

ADP -АДФ

CD - кластер дифференцировки клеток

CD40L - лиганд СЭ40

ЕСМ - экстрацеллюлярный матрикс

HVST - культивируемая линия Т-лимфоцитов, инфицированная вирусом

герпеса.

ICAM-1 - молекула межклеточной адгезии-1

IFN - интерферон

EL -интерлейкин

PAF - фактор, активирующий тромбоциты

РМА - форбол-12-миристат 13-ацетата

PSGL - Р-селектин-гликопротеиновый лиганд

TNF - фактор некроза опухолей

Интегрины:

«А - VLA-1 (very late adhesion 1- молекула очень поздней адгезии-1)

- VLA-2 (very late adhesion 2 - молекула очень поздней адгезии-2)

- VLA-4 (very late adhesion 4 - молекула очень поздней адгезии-4)

- VLA-5 (very late adhesion 5 - молекула очень поздней адгезии-5)

«ИьРз - GPIIb/IHa (гликопротеиновые рецепторы на тромбоците)

) 4,

л"

I

Лицензия ИД №03077 от 23.10.00. ' Подписано в печать 05.04.05. Бумага офсетная.

' Формат 60 х 84 '/[6. Усл.печ.л-1,0 Тираж 100. Заказ № 552005.

Отпечатано в информационно-издательском центре ЧГМА 672090, Чита, ул. Горького, 39а.

РНБ Русский фонд

200М 46308

i »

f

- fi

1 2

2

Р гч

* Î У

2271

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Солпов, Алексей Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ И ТРОМБОЦИТОВ

Обзор литературы).:.

1.1. Тромбоциты способны контактировать с нейтрофилами и моноцитами

1.2. Тромбоциты высвобождают цитокины, противомикробные факторы, вазоактивные субстанции и ростковые факторы.

1.3. Роль адгезивных молекул во взаимодействии лейкоцитов и тромбоцитов с сосудистой стенкой.

1.3.1. Семейство интегринов.

1.3.1.1. УЬА-интегрины.

1.3.1.2. Лейкоцитарные интегрины.

1.3.1.3. Цитоадгезины.

1.3.2. Суперсемейство иммуноглобулинов.

1.3.3. Семейство кадгеринов.

1.3.4. Семейство селектинов.

1.3.5. Другие адгезивные молекулы.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Выделение лимфоцитов.

2.2. Определение показателя лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии.

2.3. Разделение лимфоцитов на субпопуляции.

2.4. Выделение тромбоцитов.

2.5. Оценка лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в планшетах

2.6. Краткоскрочная культура лимфоцитов.

2.7. Проведение CPA (Clone and Plate(let) Analyzer) анализа.

2.8. Метод иммуномагнитного разделения клеток.

2.9. Клеточная линия (клон CD4+ лимфоцитов).

2.10. Приготовление гель-фильтрованных тромбоцитов.

2.11. Проведение FACS-анализа.

2.12. Приготовление планшет, покрытых ЕСМ.

2.13. Длительная культура лимфоцитов.

2.14. Сканирующая электронная микроскопия.

2.15. Статистическая обработка материала.

Глава 3. ЛИМФОЦИТАРНО-ТРОМБОЦИТАРНАЯ АДГЕЗИЯ

КАК НОВАЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ФУНКЦИЯ (РЕЗУЛЬТАТЫ

СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ).

3.1. Субпопуляции лимфоцитов, принимающие участие в лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии, и их регуляция.

3.2. Значение индукторов агрегации тромбоцитов в лимфоцитарно-пластиночной адгезии

3.3. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия на поверхности экстрацеллюлярного матрикса.

3.3.1. Роль тромбоцитов в адгезии к ЕСМ Т-лимфоцитов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии"

Тромбоциты способны вступать в контакт с гранулоцитами в процессе остановки кровотечения и развития воспалительной реакции (На\\ту1о\у1сЬ С.М. а!., 1991). Установлена взаимосвязь между гемостатическими и воспалительными реакциями при повреждении тканей, в которой ключевым звеном выступает взаимодействие полиморфноядерных лейкоцитов, тромбоцитов и эндотелиальных клеток. Эту кооперацию с участием ряда интегринов, регулируют хемокины, цитокины, факторы роста, производные радикалов кислорода, вызывающие усиленную коагуляцию и репарацию тканей в месте их повреждения (РоИстап I. а1.„ 2001; На\\гу1о\у1с11 С.М. а1., 1991; КиуиреБ ТЖ й а1., 1991). Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ (приказ Минобразования РФ № 1632 от 30.04.2002 г.)

Выражаем сердечную признательность профессору Борису Шенкману (Израиль) за помощь в выполнении работы.

Данный феномен может иметь определенное патофизиологическое значение, так как активация тромбоцитов на поврежденной поверхности сосудистой стенки может служить важным фактором в миграции лейкоцитов в толщу сосуда и дальнейшему формированию тромба. Так известно, что при активации нейтрофилы человека высвобождают микрочастицы, называемые эктосомами, непосредственно с поверхности клеточной мембраны. Микрочастицы тромбоцитов, эндотелиальных клеток и моноцитов поддерживают коагуляцию или модулируют сосудистый гомеостаз через активированные моноциты и эндотелиальные клетки (Gasser О., Schifferli J.A., 2004).

Адгезия лейкоцитов и тромбоцитов к эндотелиальным клеткам вовлекается в патогенез ишемического повреждения сосудов (Ishikawa M. et al., 2004). Это связано с экспрессией тканевого фактора, перемещение которого к моноцитам может осуществляется через CD62P-опосредованную адгезию тромбоцитов или микрочастицы (Lösche W. et al., 2004).

Тромбоциты повышают фагоцитоз лейкоцитов через факторы, высвобождаемые тромбоцитами, например АДФ (Miyabe К. et al., 2004). Вместе с этим, активированные кровяные пластинки усиливают экспрессию Р-селектина Т-лимфоцитами (Danese S. et al., 2004).

Однако наряду с реакциями неспецифической защиты организма развивается иммунный ответ, главными участниками которого являются лимфоциты. К сожалению, механизмы взаимодействия этих клеток с кровяными пластинками недостаточно изучены.

В последнее время установлено, что CD40L экспрессируется не только активированными Т-лимфоцитами, но также активированными тромбоцитами, причем растворимая фракция лиганда имеет исключительно тромбоцитарное происхождение (Nagasawa M, et al. 2005).

Более того, высказываются мнения, что кровяные пластинки являются провоспалительными клетками и принимают участие в иммунных реакциях, модулируя функции лимфоцитов, моноцитов, антигенпрезентирующих клеток (Fricke I. et al., 2004; Weyrich A.S., Zimmerman G.A., 2004).

Однако до сих пор еще не ясен характер межклеточного контакта и механизмы передачи сигналов тромбоцитами. В связи с вышесказанным изучение лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия является актуальной задачей, решение которой раскрывает новые возможности для понимания механизмов миграции клеток, развития иммунных реакций, патогенеза атеросклероза, воспаления, тромбоза и др.

Цель и задачи исследования

Основной целью нашего исследования явилось изучение механизмов лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в опытах in vitro.

В связи со сказанным нами решались следующие задачи.

1. Выяснить, какие субпопуляции лимфоцитов способны к спонтанной адгезии с интактными тромбоцитами. Изучить роль молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 в лимфоцитарно-пластиночном контакте.

2. Исследовать влияние цитокинов - IL-lj3, IL-2, JL-4, IL-10, IL-16, TNFa, IFNy на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию.

3. Исследовать влияние индукторов агрегации тромбоцитов (ADP, коллагена, адреналина, тромбина, PAF) на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию.

4. Получить С04+-субпопуляцию лимфоцитов методом иммуномагнитной сепарации и проследить влияние тромбоцитов на адгезию клеток к субэндотелиальному матриксу.

5. Выяснить роль тромбоцитов в адгезии клеточной линии СБ4+ (НУБТ-клона) к экстрацеллюлярному матриксу в условиях статики и разных сдвигах тока жидкости.

6. Сравнить экспрессию интегринов ОС1Р1 (УЬА-1), (Х2Р1 (УЬА-2), 014Р1 (УЬА-4), а5Р1 (УЬА-5) свежевыделенных и культивированных С04+-лимфоцитов доноров с НУБТ трансформированной линией СБ4+ лимфоцитов. Изучить роль интегринов 011Р1 (УЬА-1), ОС2Р1 (УЬА-2), а4Р1 (УЬА-4), а5Р1 (УЬА-5), СБ40Ь и РБвЬ в опосредованной тромбоцитами адгезии С04+-лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу.

Научная новизна

Впервые установлено, что Т-хелперы (СБ4+) способны к спонтанной, а натуральные киллеры (СБ 16+) - к 1Ь-2-индуцированной адгезии с интактными тромбоцитами. Адгезивную активность лимфоцитов стимулирует также 1Ь-1р. Ингибиторами ЛТА являются ГЬ-4, 1Ь-10 и ШМу. Агонисты агрегации кровяных пластинок коллаген и АБР повышают лимфоцитарно-тромбоцигарную адгезию. Лигандом лимфоцитарно-пластиночного контакта выступают молекулы межклеточной адгезии-1 (1САМ-1).

Впервые обнаружено, что тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости, но не в статическом состоянии. В этих условиях лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, сформированные на поверхности экстрацеллюлярного матрикса, являются главными триггерами адгезии лимфоцитов. Число лимфоцитов, вовлеченных в лимфоцитарно-тромбоцитарные коагрегаты, находится в прямой зависимости от скорости сдвига жидкости, тогда как количество единичных клеток - в обратной.

Впервые описаны механизмы лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия, включающие в себя образование интегриновых и неинтегриновых мостов, таких как ссць/Рз- и Р ¡-связанные интегрины, Р-сел ектин-Р Б вЬ и СБ40-СБ40Ь.

Впервые показано регулирующее действие интерлейкинов в формировании лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов на поверхности экстрацеллюлярного матрикса: 1Ь-2 и 1Ь-16 повышают адгезивные свойства клеток и кровяных пластинок.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные сведения о субпопуляциях лимфоцитов, адгезивных молекулах, принимающих участие в образовании лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов, роли цитокинов в регуляции функции ЛТА, раскрывают новые возможности для изучения механизмов миграции клеток, развития иммунных реакций, патогенеза атеросклероза, воспаления, тромбоза и др.

На основании исследований, разработанный и предложенный нами тест оценки лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии позволяет оценить функциональную активность иммунокомпетентных клеток, эффективность иммуномоду пирующей терапии, проследить течение и прогноз заболевания.

Внедрение в практику

Теоретические сведения о функции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии, механизмах ее регуляции и биологическом значении внедрены в учебный процесс ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия. Тест лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии используется в диагностической лаборатории ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия.

Материалы по исследованию лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в норме и патологии вошли в отчет за 2003 год по федеральной программе «Совершенствование технологии трансплантации стволовых гемопоэтических клеток, химио-, иммуно- и сопроводительной терапии заболеваний системы крови; разработка новых форм организации средств и методов трансфузионно-инфузионной терапию) (договор № 005/037/002 от 25.09. 2001 г.).

Апробация диссертации

Материалы диссертации доложены на: Фестивале «Студенческая медицинская наука '98» (Москва, 1998), 15, 16, 17, 18 Международных конгрессах по тромбозу (Antalya, Porto, Bologna, Lubljana, 1998, 2000, 2002, 2004), XVII, XVIII, XIX Конгрессах Международного общества по тромбозу и гемостазу - ISTH (Washington, 1999; Paris, 2001, Birmingham, 2003), на Международном симпозиуме «Platelets 2000» (Ma'ale Hachamisha, Israel), XVIII съезде Физиологического общества им.И.П. Павлова (Казань, 2001), Конференции международного цитокинового общества - ICS (Гаваи, 2001), на заседании проблемной комиссии по физиологии тромбоцитов (Университет Тель-Авива, Израиль, 2004), Второй Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2005).

Положения, выносимые на защиту

1. Феномен лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии представляет собой одну из физиологических функций, присущую различным субпопуляциям лимфоцитов, и реализуемую посредством адгезивных молекул. Наиболее выраженной способностью к образованию коагрегатов с интактными лимфоцитами обладают Т-хелперы (CD4+) и NK-клетки

СО 16+). Лигандом лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии выступают молекулы межклеточной адгезии-1 (1САМ-1).

2. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия регулируется цитокинами и индукторами агрегации тромбоцитов. Повышают эту функцию 1Ь-1р, 1Ь-2, коллаген, адреналин и АБР Ингибиторами лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии являются 1Ь-4,1Ь-10 и ПТЧу.

3. Тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости, но не в статическом состоянии. При этом лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, сформированные на поверхности экстрацеллюлярного матрикса, являются главными триггерами адгезии лимфоцитов. Число лимфоцитов, вовлеченных в лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, находятся в прямой зависимости от скорости сдвига жидкости, тогда как количество единичных клеток - в обратной. Механизм лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия включает в себя образование интегриновых и неинтегриновых мостов, таких как ащ/Рз- и Р ¡-связанные интегрины, Р-селектин-РБОЬ и С040-СБ40Ь.

4. Интерлейкины 2 и 16 повьппают число лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов на поверхности экстрацеллюлярного матрикса в условиях тока жидкости.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Солпов, Алексей Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Лимфоциты образуют коагрегаты с тромбоцитами. Т-хелперы (СБ4+) способны к спонтанному розеткообразованию с интактными тромбоцитами. Интерлейкин-2 и 1Ь-1|3 повышают розеткообразующую способность хелперно-индуцирующих клеток с интактными тромбоцитами и индуцирует ее у натуральных киллеров (СБ16+). Антитела против 1Ь-2 ликвидируют стимулирующее влияние 1Ь-2 на формирование лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов.

2. Ингибиторами лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии являются 1Ь-4,1Ь-10 и 1РЫу. 1Ь-8 и ТЫБа не оказывают влияния на лимфоцитарно-пластиночные контакты.

3. Степень лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии зависит от функционального состояния кровяных пластинок. Коллаген, АБР и адреналин наиболее выражено повышают лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию. Другие агонисты агрегации (РАБ и тромбин) не оказывают влияния на способность тромбоцитов прилипать к лимфоцитам.

4. Тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости, но не в статическом состоянии. При этом лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, сформированные на поверхности экстрацеллюлярного матрикса, являются главными триггерами адгезии лимфоцитов. Число лимфоцитов, вовлеченных в лимфоцитарно-тромбоцитарные коагрегаты, находятся в прямой зависимости от скорости сдвига жидкости, тогда как количество единичных клеток - в обратной.

5. Проявление интегринов на лимфоцитах здоровых людей отличается от клеток культивируемой линии НУБТ. На поверхности покоящихся СЭ4+ лимфоцитов доноров наиболее сильно экспрессируются молекулы а4Рь в меньшей степени - а5|3ь и практически отсутствуют интегрины 011Р1 и а2Рь После культивирования в присутствии 1Ь-2 повышается экспрессия интегрина а^Рь и не изменяется для молекул с «гРь 014Р1 и а5Рь На поверхности СБ4+ лимфоцитов линии НУ8Т выявляются интегрины а4рь а5Рь (Х1Р1 и а2Рь

6. Лигандом лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии выступают молекулы межклеточной адгезии-1 (1САМ-1). Механизм лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия включает в себя образование интегриновых и неинтегриновых мостов, таких как аць/Рз- и Ргсвязанные интегрины, Р-селектин-РЗвЬ и С040-С040Ь. Блокада ргзависимых интегринов и комбинированная блокада РБОЬ и СБ40Ь на мембране лимфоцита уменьшает адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости (на 40% и 60% соответственно). Блокада аць/Рз (т.е. агрегации тромбоцитов) тирофибаном предупреждает образование кластеров, тем самым подавляя 95% лимфоцитарной адгезии к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости.

7. Интерлейкины 2 и 16 повышают число лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов на поверхности экстрацеллюлярного матрикса в условиях тока жидкости. Присутствие 1Ь-1р в среде роста культивируемых СБ4+ лимфоцитов линии НУБТ снижает лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию, а 1Ь-10 не изменяет адгезивные свойства клеток и кровяных пластинок.

8. Тромбоциты способствуют миграции лимфоцитов и их фиксации на поврежденной поверхности сосудистой стенки, что позволяет им противостоять силе сдвига протекающей жидкости. Феномен лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии занимает важное место в развитии атеросклероза, воспаления, тромбоза, иммунных реакций, репаративных процессов.

Заключение

Представленные исследования позволяют утверждать, что феномен лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии представляет собой одну из физиологических функций, присущую различным субпопуляциям лимфоцитов, и реализуемую посредством адгезивных молекул. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия регулируется цитокинами и индукторами агрегации тромбоцитов. Сами тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости, что позволяет им противостоять силе сдвига, способствуют миграции лимфоцитов.

Полученные сведения о субпопуляциях лимфоцитов, адгезивных молекулах, принимающих участие в образовании лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов, роли цитокинов в регуляции функции ЛТА, раскрывают новые возможности для изучения механизмов миграции клеток, развития иммунных реакций, патогенеза атеросклероза, воспаления, тромбоза и др.

На основании исследований, разработанный и предложенный нами тест оценки лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии позволяет оценить функциональную активность иммунокомпетентных клеток, эффективность иммуномодулирующей терапии, проследить течение и прогноз заболевания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Солпов, Алексей Владимирович, Чита

1. Александров A.B., Джексон А. М., Румянцев А. Г. Анализ механизма модуляции межклеточных молекул адгезии ICAM // Иммунология,-1997,- №1.- С. 4-13.

2. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. Кузник Б.И. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Томск, 1980. - 314 с.

3. Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. М.: Медицина, 1988.-480 с.

4. Белокриницкая Т.Е. Взаимосвязь систем иммуногенеза, гемостаза и эритронау беременных с анемиями: Автореферат дисс. . канд. мед. наук. Омск, 1990. - 20 с.

5. Бережная Н.М. Нейтрофилы и иммунологический гомеостаз / Н.М. Бережная//Киев.: Наукова думка, 1988. 158 с.

6. Витковский Ю.А. Роль цитокинов в регуляции системы гемостаза: Авт. дисс. . докт. мед. наук. Чита, 1997. -40 с.

7. Взаимосвязанные этапы транскрипции гена, трансляции мРНК и секреции биологически активного интерлейкина-lß моноцитами периферической крови человека / Симбирцев A.C., Конусова В.Г., Варюшина Е.А., Кетлинский С.А. // Иммунология. -1995.-№ 5.-С. 4857.

8. Витковский Ю.А. Цитокины и гемостаз. Забайкальский медицинский вестник. - 2003 - № 3. — С. 24 — 26.

9. Витковский Ю.А., Кузник Б.И. Влияние интерлейкина-1 на способность лимфоцитов выделять факторы, влияющие на адгезию и агрегацию тромбоцитов, свертывание крови и фибринолиз // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. т. 88. - № 4 -С. 468-475.

10. Витковский Ю.А., Кузник Б.И., Белокриницкая Т.Е. Интерлейкин I -модулятор системы гемостаза // Съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока: Тез. науч. сообщений. Новосибирск, 1995 г. - С. 72-73.

11. Витковский Ю.А., Федорова А.И. Состояние защитных систем при гипертензиях и ишемической болезни сердца. Чита, 1999.-88 с.

12. Влияние рекомбинантного интерлейкина-1 на функции интактных и поврежденных нейтрофильных гранулоцитов в системе in vitro / Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А. и др. // Иммунология. 1993. - N4. - С. 36-39.

13. Голодных Ю.В. Патогенетическое обоснование использования ронколейкина® при тяжелом течении пневмонии. Автореферат дисс. . канд. мед. наук. - Чита, 2002. - 24 с.

14. Голодных Ю.В. Влияние препарата рекомбинантного интерлейкина-2 (ронколейкина) на состояние иммунитета при тяжелом течении пневмонии // Читинская гос. мед. академия. Чита. - 2002. -18 с.-Деп. в ВИНИТИ - В2002.

15. Голодных Ю.В. Обмен цитокинов при пневмонии (обзор литературы) // Читинская гос. мед. академия. Чита. - 2002. - 22 с. - Деп. в ВИНИТИ -В2002.

16. Земсков В.М., Земсков A.M. Принципы дифференцированной иммунокоррекции// Иммунология. 1996. - № 3. - С. 4 - 6.

17. Золотарев A.B. Патогенетическое обоснование применения рекомбинантного интерлейкина-2 при остром гематогенном остеомиелите. Автореферат дисс. . канд. мед. наук. - Иркутск, 2002.-24 с.

18. Золотарев A.B., Жгенти Г.Р., Яцеева Е.И. Влияние рекомбинантного препарата интерлейкина-2 (ронколейкина) на состояние иммунитета при остеомиелите у детей М. 2001. - 11 с. - Деп. в ВИНИТИ.

19. Золотарев A.B., Жгенти Г.Р. Использование рекомбинантного интерлейкина-2 (ронколейкина) для лечения острого гематогенного остеомиелита у детей. Сборник трудов Всероссийской конференции по иммунологии. 2002. - СПб.- С. 12.

20. Золотарев A.B., Жгенти Г.Р., Яцеева Е.И. Опыт использования рекомбинантного интерлейкина-2 (ронколейкина) при хроническом гематогенном остеомиелите у ребенка // Забайкальский медицинский вестник. 2002. - № 1. - С. 24 - 25.

21. Игнатьева Г.А. Иммунная система и патология // Патол. физиол. эксперим. мед. 1997. - № 4. - С. 25 - 37.

22. Игнатьева Г.А. Иммунная система и патология (продолжение) // Патол. физиол. эксперим. мед. 1998. - № 1. - С. 35 - 42.

23. Изменение индуцированной фитогемагглютинином экспрессии рецепторов к интерлейкину 2 на лимфоцитах под влиянием иммуномодуляторов / Мельникова JI.A., Новиков Д.К., Гресь A.A., Доценко Э.А.// Иммунология. - 1994. - № 5. - С. 57 - 59.

24. Иммуноферментный анализ. / Под ред. Нго Т.Т., Ленхофф Г.М. (Ngo Т.Т., Lenhoff Н.М.) М.: Мир. - 1988. - 444 с.

25. Иммунологические методы. / Под ред. Фримеля Г. (Friemel Н.). М.: Медицина, 1987. - 472 с.

26. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета. // Иммунология. 1995. - № 6. - С. 30 - 44.

27. Клименко O.B. Влияние оксида азота на иммунитет и гемостаз в норме и при некоторых патологических состояниях. Автореф. . дисс. кандидата мед. наук. Чита. -2002. - 20 с.

28. Клименко О.В. Роль оксида азота в регуляции физиологических функций // Деп. в ВИНИТИ. 06.02.2002.- № 247 - В2002.

29. Клименко О.В., Витковский Ю.А. Влияние различных цитокинов на синтез оксида азота // Проблемы биорегулирующей терапии в эксперименте и клинике: Сб. науч. трудов. Чита.- 2002. - С. 8.

30. Клименко О.В., Витковский Ю.А. Влияние оксида азота на реакцию лимфоцитарно-тромбоцитарного розеткообразования // Проблемы биорегулирующей терапии в эксперименте и клинике: Сб. науч.трудов. Чита. - 2002. - С. 9.

31. Кондратенко И.В., Ярилин A.A., Хахалин Л.Н. Интерлейкин-2 и его роль в развитии иммунодефицитов и других иммунопатологических состояний // Иммунология. 1992. - № 1. - С. 6 - 9.

32. Коновалова H.A. Патогенетическое обоснование применения кортексина у терапевтически резистентных больных параноидной шизофренией. Автореферат дисс. . канд. мед. наук. - Чита. -2004.-24 с.

33. Кузник Б.И., Витковский Ю.А. Иммунный ответ и система гемостаза. Проблемы физиологии и патологии системы гемостаза. Барнаул. -2000. - С. 119-127.

34. Кузник Б.И., Витковский Ю.А. Цитокиновые механизмы развития и ликвидации ДВС-синдрома. XVIII съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. - Казань. - 2001. - 369.

35. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. В кн.: Поражение сосудистой стенки и гемостаз. Минск, 1983. -С. 253-254.

36. Кузник Б.И., Цыбиков H.H. Гемостаз и иммунные реакции // Актуальные проблемы гемостазиологии. М., 1981. - С. 186-197.

37. Кузник Б.И., Цыбиков H.H. Иммунологические механизмы регуляции физиологических функций // II Всесоюз. съезд гематологов и трансфузиологов / Тез. докл. М., 1985. - С. 444-445.

38. Кузник Б.И., Цыбиков H.H. Взаимосвязь между иммуногенезом и системой гемостаза: единая система защиты организма // Успехи соврем, биологии. 1981. - Т. 92. - Вып. 2/5. -С. 243-260.

39. Кузник Б.И., Цыбиков H.H., Витковский Ю.А. Неспецифическая резистентность, иммунитет и гемостаз единая защитная гуморальная система. - Тромбозы, кровоточивость и болезни сосудов.