Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теоретическое и экспериментальное исследование участия аденилатциклазной сигнальной системы в механизме действия инсулина и родственных пептидов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Теоретическое и экспериментальное исследование участия аденилатциклазной сигнальной системы в механизме действия инсулина и родственных пептидов"

Институт эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сачмюва Российской Академии Наук

На правах рукописи

РГ6 од

2 п.-.;

ШПАКОВ Александр Олегович

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ УЧАСТИЯ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ В МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ ИНСУЛИНА И РОДСТВЕННЫХ ПЕПТИДОВ

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1535

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и биохимии жени И.М.Сеченова Российской Академик Наук.

Научный руководитель -профессор, доктор биологических наук М.Н. Перцева

Официальные оппоненты: профессор, доктор химических наук В.П. Комов доктор медицинских наук Я.Ю. Багров

Ведущее учреждение: Кардиологический Научный Центр РАМН, Москва.

Защита состоится июня 1996 г. в ... час на заседании

специализированного совета К.002.89.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии ш. И.М.Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр.М.Тореза, 44.

О диссертацией можно ознакомиться а Научной библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. К.М.Сеченова РАН.

Автореферат разослан " " мая 1996 г.

Ученый секретарь споциа.пизировшшого совета,

кандидат биологических наук Зуева Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из актуальных задач совремэчной эндокринологии является исследование молекулярных механизмов действия инсулина, играющего ключевую роль в регуляции анаболических процессов в организме. Помимо теоретического интереса эта проблема имеет большое практическое значение для медицины. Ее решение будет способствовать еыяблэнию молекулярных дефектов, лежащих в основе патологии инсулиновой системы.

Как известно, в ходе эволюционного процесса у эукариот появились инсулин и группа родственных ему пептидов, которые по своим структурно-функциональным признакам объединяются в одно общее инсулиновое суперсемейство. Согласно эволюционной концепции Стей-нера (Stelner et al., 1984), все пептида иноулшового супэрсемей-ства являются продуктами генов, возникших в результата дивергенции от общего анцестрального гена, и могут быть сгруппированы в три кластера : 1) инсулина и инсуликоподобнае факторы роста (И5-Р) позвоночных, бомбиссиш насекомых; 2) релаксины рыб и млекопитающих; 3) инсулиноподооныэ пептида (КПП) моллюсков, в том числе ИЛИ моллюска Modcnta cygnea, шделенный и охарактеризованный в наямй лаборатории (Русаков и др., 1991).

К настоящему времени достигнуты значительные успехи в изучении структурной функциональной организации рецепторов инсулина и родственных ему пептидов, а также механизмов функционального сопряжения этих рецепторов с различными эффекторными системами (Ullrich, Schlesslnger, 1990; Cheatham, Kahn, 1995). Так, показано, что большинство биологических эффектов инсулина реализуется через каскад фосфорилирования белков по тирозину, катализируемого тиро-зинкинваой, присущей рецепторам этих пептидов. Установлено также, что в процессы трансдукции инсулинового сигнала вовлечены и другие сигнальные системы, з том числе включающие гетеротримерныо ГТФ-связыЕаищиэ белки (G-белки), например, связанные с обменом фосфоинозитолгликанов, фосфатидилхолина и др. (Перцева и др., 1996). '

Однако, несмотря на известный прогресс в современных представлениях о механизмах регуляторного действия инсуг'ча и других пептидов инсулиноЕого супэрсемэйства остается много брешей и нерешенных вопросов.' Одним из них является возможность участия в

реализации эффектов этих пептидов аденилатциклазной сигнальной система (4ЦС), роль которой в механизмах действия гормонов, активирующих рецепторы родопсинового типа (FFT) (семь раз пронизывающих мэмбрану), может считаться доказанной. Эта система включает, по крайней мэре, три функциональных блока: первый - рецептор, расположенный на поверхности клетки, второй - трансдуктор. представленный G-ö9jikom стимулирующего (Gs) или ингибирующего (С^ ) типа, который осуществляет сопряжение рецептора с третьим, каталитическим компонентом АЦС, представленным ферментом аденилатцик-лазой (АЦ) (Пэрцева, 1989; Simon et al., 1991; Neer, 1994, 1995).

Накоплошне за прошедший период весьма противоречивые данные о влиянии инсулина на активность АД свидетельствовали либо -об отсутствии такового, либо об ингибирупцем его действии (Houslay, 1991; Maklno et al., 1992). Согласно современным представлениям, регуляция активности АЦ, осуществляемая через РРТ (катехоламины, глюквгон), происходит за счет прямого взаимодействия рецептора с Ga или Gj-беляами, ведущего к их активации. В первичной структуре этих рецепторов идентифицированы участки, обеспечивающие указанное взаимодействие (Еатагезе, Fraser, 1992; Шпаков, 1995а, 1996).

В отношешш рецепторов-тирозинкиназ, вовлеченных в действие инсулина и некоторых ростовых факторов показано участие G-белков в реализации ре цеп-горных и псстрецепторных стадий транодукции гормонального сигнала. Однако, вопрос о том, происходит ли при втом npiiwoe взаимодействие между рецептором-тирозинкиназой и G-öe.TiCSMH, или оно носит опосредованный характер, остается открытым. Гак, но осуществлен в полной мере поиск в первичной структуре рецепторов инсулина и родственных пептидов молекулярных детерминант, которые могут обеспечивать процесс связывания и активации G-белков, в частности, Gs и Gj-белков - регуляторов АЦС. Имеются лишь единичные работы (Okamoto et al., 1993; Jo et al., 1993; Sun et al., !S95), в которых были предприняты попытки идентифицировать отдельные участки первичной структуры рецепторов инсулина и апидермалмого фактора роста (ЭФР), вклшеюше в специфическую активацию различных классов G-белков. Не проводился также широкий сравнительный анализ первичных структур рецепторов инсулина и

родствэа..... пептидов о таковыми РИГ, сопряженных с G-болками,

необходимый Wik обнаруквния потенциальных G-белок-связцвьюцих участков в молекулах рецепторов-тирозинкиназ.

Проведенный нами детальнкй анализ современного состояния проблемы сигнальных механизмов действия инсулина и родственных пептидов, опосредуемого через рецегсторц-тирозинкиназы, указывает на то, что одним из спорных и недостаточно изученных еэ вопросов является возможность участия АЦС в реализации регуляторного действия этих пептидов. В связи с этим, основной целью настоящей работы было исследование участия АЦС в механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства, а также возможности взаимодействия рецепторов этих пептидов с G-белками, вовлеченными в регуляцию этой системы.

Основываясь на результатах многолетних исследований нашей лаборатории структуры инсулинов и ИПП различного происхождения, а также сигнальных механизмов- гормонального действия у позвоночных и беспозвоночных животных, мы в своей работе применили эволюционный подход. Он реализовался в двух направлениях: 1) исследозали участие АЦС в действии инсулина л ИФР млекопитающих, а также ИПП моллюска /l.cygnea, животных, далеко отстоящих в филогенетическом плане; 2) в качестве тканей-мишнэй регулирующего действия этих, пептидов была избрана мышечная ткань как позвоночных (крысы), так и беспозвоночных (моллюски) животных.

Основные задачи работы состояли в следущем:

1. Провести теоретический анализ аминокислотных последовательностей (АКП) рецепторов инсулина к родственных пептидов в сравнении с таковыми PFT, функционально сопряженных с G3 и Gj-болками, с целью обнаружения в АКП рецепторов пептидов иксулинового супэрсв-мейства участков, потенциально способных взаимодействовать с этими G-бэлками.

2. Экспериментально исследовать влияние 'пептидов инсулинового супорсемеЯсгва на функциональную активность АЦС в мышечных тканях представителей позвоночных и беспозвоночных животных.

3. Выяснять вопрос о вовлеченности G-белков в реализацию регуляторного действия инсулина и родственных пептидов на АЦС.

Основные результаты, научная новизна работы.

На основе разработанного алгоритма для попарного сравнения АКП в первичной структура р-субъеданиц (р-СЕ) рецепторов инсулина (ИР) и ИФР1 впервые обнаружены АКП, гомологичные тэкоеым РРГ, включенным в связывание и активацию молекул Gg- и ...^-белков -компонентов АЦС. Эти АКП могут претендовать на роль молекулярных

детерминант, ответственных за прямое взаимодействие рецепторов пептидов инсулинового суперсемейства с этими G-белками.

Разработок новый графический метод анализа АКП белков, предназначенный для поиска в их первичной структуре внутренней симметрии зеркального типа. Использование этого метода для анализа рецепторов инсулина и родственных пептидов позволило впервые обнаружить, что участки этих рецепторов, потенциально включенные во взаимодействие с Gg~ и Gj-бвлками, имеют симметричную структуру, что по современным взглядам может свидетельствовать об их важности для функциональной активности рецепторов.

Впервые показано, что инсулин, ИФР1, ИПП моллюска A.cygnea и ЭФР оказывают ГТФ-зависимый стимулирующий эффект на базальную активность АЦ в мышечной ткани моллюска анодонты-и крысы. Обнаруженные эффекты были быстродействующими (максимальная стимуляция АЦ активности достигалась уже через 2.5 минуты) и осуществлялись в физиологическом диапазоне концентраций пептидов, что может указывать на присутствие этих эффектов в клетке. Обнаружено, что исследованные пептиды наиболее эффективно стимулируют АЦ в тканях rex животных, в которых они присутствуют: ИГО моллюска был наиболее эффективен в ткани анодонты, а инсулин и МФР1 млекопитающих -в тканях крысы. На основании этого был сделан вывод о видоспеци-фичности действия пептидов инсулинового суперсемейства. Установлено, что стимулирующий АЦ эффект пептидов потенцируется (усиливается) гуашшовыми нуклеотидамк (ГН) (порядок эффективности ГТФ78>ГИДФ>ГТФ), что указывает на вовлеченность в реализацию этого эффекта G-белков и конкретно G-белка стимулирующего типа.

Сделано заключение об обнаружении ранее неизвестной системы транодукцш сигналов, генерируемых инсулином и родственными пептидами, с участием AUG.

Апробация работы проходила на заседании секции молекулярных основ эволюции и функций ИЭФиБ им.7.М.Сеченова РАН. Результаты работы докладывались на Симп. стран СНГ "Пути передачи внеклет. сигнала", Звенигород, 1993, 7th Oonl. of Eur.comparative endocrinologists, Cordoba, Spain, 1994; ivth Symp. on Molluscan Neurobiology (Syraon IV), Amsterdam, 1994; Meeting "Tyrosine Phosphorylation ar ' Cell Signalling", Cold Spring Harbor, USA, 1995; Конф. "Биох. и биофиз. иох.-ш физкол. функций", С-Потербург, 1995; 1Ш) Мвкд. совет, и школа по звол. физиол., С-Пвтарбург, 1996.

Публикации. По теме диссертации опуб.ликовЕио 16 paöoT.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на ... страницах машинописного текста; состоит из введетая, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения теоретических и экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы (... источников). Материалы диссертации иллюстрированы .. рисунками и .. таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

А. Теоретические метода.

Для поиска гомологичных последовательностей в первичной структуре рецепторных белков использовали метод попарного сравнения их АКП по модифицированным автором (Шпаков, 19956) методам (McLachlan, 1971; Lawrence, Goldman, 1988; Фришман, 1992), учитывая как идентичные, так и консервативные замещения аминокислотных остатков (АКО). В качества меры консервативности замен АКО применяли степень подобия физико-химических свойств их боковых цепей. На основе анализа полученных в результате такого сравнения точечных матриц, проводили идентификацию и отбор гомологичных АКП. Последние соответствовал! диагональным элементам на поверхности этих матриц. Критериями отбора были: степень гомологии обнаруженных участков, их протяженность и доля разрезов, вводимых для оптимизации выравнивания.

Для идентификации центров внутренней симметрии зеркального типа и симметричных сегментов в первичной структуре белков был разработан новый графический метод, основанный на сравнении прямых и обращенных АКП, а также последовательностей корней кодоноа аминокислот (ККА). Последовательность ККА, представляющих собой вторые основания кодонов, кодирующих АКО, содержит в себе икфар-. мацию как о нуклеотидной, так и аминокислотной последовательностях. Результатом такого анализа является точечная матрица, диагональные элементы которой, пересекающие вторую диагональ этой матрицы, соответствуют симметричным сегментам АКП. Степень симмотрии оценивали в соответствии а ранее описанными критериями (Шпаков, 1995в; Ипгаков, Шпаков а, 1995), осуществляя выравнивание 'антипараллельных последовательностей с точкой инициации, совпадающей с центром симметрии. '

Б. Экспериментальные методы.

В опытах использовали следующих животных: 1) преснсводашх двустворчатых моллюсков анодонт (Anodcmta cygnea); 2) белых бео-породных самцов крыс Ratus norveglсиз линии fllstar.

Фракцию сарколемальных мембран гладких мышц ноги A.cygnea и скелетных мышц крыс выделяли в соответствии с методом (Kldwal et al., 1973). Для получения одной фракции брали по 25-30 моллюсков и 4-6 крыс. Исходный гомогенат получали гомогенизированием тканей с помощью Политронв (30 сек, 3-4 раза) в Трис-НС1-буфере (10 тМ, рН Т.5), содержащем 5 тК MgC!l2, 0.25 М сахарозы (буфер А). Цвнт-рифух'ировалп его в ступенчатом (0.25-0.8 М) градиенте сахарозы на ультрацентрифуге (Beckman, ротор SW-27, 110000 g, 60 мин). Полученную мембранную фракцию дважды переосаждали (SW-27, 110000 g, 75 мин), осуществляя отмывку буфером А без сахарозы. Мембраны ресуспендировали в сходном буфере и использовали в экспериментах.

Определение активности АЦ (НФ 4.6.1.1) осуществляли с ис-

пп о

пользованием в качестве субстрата [а- Р1АТФ (А) шш 18- Н1АТФ (Б) при 30°С (моллюски) шш 37°0 (крысы) и времени инкубации 2.5, 5 и 10 мин по модифицированным методам (Salomon et al., 1974; Ткачук, Белденков, 1.978) в инкубационной среде следующего состава: 50 шМ Грис-HCl, рН 7.5, 0.1 тМ АТФ, 1 шМ цАМФ, 20 тМ креатин-фоофата, 0.2-0.5 мг/мл креатинфосфакиназы, 5 шМ MgOlg, 1-2 цКю [а- РЗАТФ (А) или 0.5-1 цКю [8-3НЗАГФ (Б) на пробу. Реакцию начинали добавлением мембранных, белков: А). При использовании Га-"'2? J АТФ реакцию останавливали внесением в пробу 0.5 N НС1, кипятили, нейтрализовали кислоту 1.5 Ы имидазолом и хроматографи-ровади на окиси алюминия, элюируя 1^АМФ Ю шМ тшдазол-НС1-буфором, рН 7.4, в соответствии о методом (White, 1974). Радиактивность измеряли по методу Черенкова. Б). При использовании са-3Н1АТФ реакцию останавливали смесью этанола и хлороформа (1:2)., осаждали денатурированный белок центрифугированием и аляквоту хроматографировала в режиме тонкослойной хроматографии на силикагеле. Пятна, соответствующие цАЫФ, вырезали, помещали в виалы с сцинтилляционной смесью и измеряли в ню. радиактивность на счетчике Raekbeta. Активность АЦ выражали в пМ цАМФ/мин/мг болка.

Для исследований использовали инсулин млекопитающих (24 1ДМ (Lilly, США), ИФР'1, рекомбгатнтный (Amersham, Англия), ИПП

моллюска A.cygnea, выделенный в нашей лаборатории (Русаков и др., 1991)*'. Для сравнения был взят ЭФР, выделенный из субмаксилляр-ных желез мышей (Никольский и др., 1987)*'.

Для иммунологических исследований использовали внтиинсулпно-вую сыворотку (АИС), выработанную в результате иммунизации морских свинок инсулином млекопитающих*'. Количество АИС, добавляемое в инкубационную смесь рассчитывали, принимая во внимание, что. 1 мл АИС нейтрализует 3U инсулина млекопитающих. Перед добавленном инсулина, мембранные белки преишсубировали с АИС в точение 15 мин.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ .И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Сравнительный анализ АКП цигоплазмагических доменов рецепторов инсулина и ШР1 с таковыми рецепторов родопсинового типа.

Для обнаружения в первичной структура рецепторов инсулина и ИФР1 молекулярных детерминант, которые потенциально могут участвовать в сопряжении с G-белками, был осуществлен сравнительный анализ АКП цигоплазмагических доменов р-СЕ этих рецепторов с третьими цитоплозмагачэсними доменами (ЦЦЗ) FFT (ß1, р5, р3 и р4С-адренороцепторов (АР), а^, а^д и c^q-AP, m1 -Шд-мускариновых холинорецепторов (МХР), НТ1С и Ш^-сэротониновых (CP) и П2 11 0з~дофаминошх (ДАР) рецепторов). Известно, что ЦЦЗ РР7 играют ключевую роль в сопряжении этих рецепторов с С-белками.

Непосредственно следующие за трансмембракным доменом участки рецепторов инсулина и ИФР1 оказались гомологичными по своей первичной структуре N-ковдевым участкам ЦЦЗ' некоторых типов FFT (Рис. 1 А). Эти участки топологически идентичны, располагаясь вблизи мембраны. Известно, что N-концевые сегменты ЦЦЗ PFT в большинстве случаев включены в связывание G-белков. Следовательно, не исключено, что сходную функцию могут выполнять гомологичные то отношения к ним АКП рецепторов инсулина и ИФР1.

С-концевой домен р-СЕ ИР был гомологичен по отношении к ЦДЗ РРТ. Сравнительный анализ 1301-1346 ИР с АКП центрального и С-

"^Выражаю благодарность за предоставление ЭФР - проф.- Чикольскому H.H. (ИНЦ), ИПП моллюска A.cygnea - Русакову Ю.и. (ИЭФБ); АКС -Бондаревой В.М. (ИЭФБ).

А.

Ф ft 4 ф•♦ ♦ ♦ • ♦ •♦ ♦ •

ИФРР 925 IYYFHHJffl-NN-SR-lGNGVbYASVN-PEYÏSAAD ИР {32Р вЗР DSP mlP m2P шЗР Б. ИР 62Р ВЗР В4СР 02 АР ЮМОР

* *** ***

---VYV—PHEWEVA 965

948 IYLFLRKR-QP-BGPLGP—LYASSN-PEY1SASDYPPCSVYV—PDEWEYS 992

222 WQEAKRQIÛKIDKSEGR---FHVQNLSQ-VEUDG 252

227 VFVYArRÛIiRIiliRGELGR---FPPEESPPAPSRS-LAPAPVGTCAPPE 270

212 IYIVLRRR-RKRVNT-KR----SSHAFRAHLRAP-L-KGNCTH—PEDMKLC 253

211 IY---RSr-EMEARSLAA—LQGSET-PGKGGGSS 238

214 KSRIKK-DKK-EP—V-ANQE-F—VSPSLV-QGRIV—KPNNNNUP 249 253 IY----KET-EKRTKELAG—IQASGT—E-AEAENVHPTG 283

1291 236 241

228 347 253

EMEFEDMEfiVPbDRSSHCQREE---AGGRD-GGSS----LGF

SEGKF--HVQ1ÍLS---QVEQD-GRTG----HGL

ELGRFP---PEESPPAPSRSLATAP----VGT

KV-RF—LQ-EN-PSLSSR—GGR------RW

Q----GRGR—SASG----LPH

ИГЕ-ВйШШЗШР-ШССЮШ----GGEE-ENAPNPNPQKP

продолжение <BBXXB>

KHSYKEHIPYTHM---NGGKKNGRIITLPRSNPS 1355

RRS—SK--ÏC-L---KE-HKALKT 274

CAPPEG-VP-------ACGRRPARLLPL-REHRA 290

RRP—SKL-LA-I---KE-HKA1KT 263

RRA—G----------AGGÜNLEKRFÍF 374

RRKKKEKRPRGTMQA INNÏKKASKVL 313

Mí»

ß2F 63P

адср 0(2 АР HÎ1CP В. ИР m1P m3P

1325 258 266 247 359 288

1294 212 429

т5Р 215/269 продолтещге ИР 1329 m1P 247 шЗР 462 т5? 280 Г.

ИФРР 983 ИР 1010 <32Р 222 ß4CP 213 продолжение

ИФРР 1011

ИР 1038

Ö2P ' 254

В4СР 240

PEDMENVPID—RS-SHGC№EEAGGRDGGS-SLGFKESY-

YKETEN-RA---KELAAIQGSETPGKGGGS-SSSSERSqP

QLES-AVDTGKT-SDT-NSSAD -KPTATLPISPKEAT-YRETEK-RT---KDLADIQGSDSVTK /AS-BSSSRRSTS

-EEHIPYT-HMNG—GK—KNGRIL-TLPBSNPS 1355

GAEGSPET-P-PCRCCRCGRAPRLLQAYSVfKEEE 275

-LAK-RFALKTRSQITK—RK-RM—SLIKEKKA 488

-TTGKPSQ—ATCPSAWAKAEQ1I-XC-SSYPS 308

Ф9* * -4c ** * ** * #

VYEGVAKGV—V-KDEPETRV-AIKTVNEAAS VYEGNARDI—I-KGEAETRV-AVKTVNESAS VFQEAKRQLQKIDKSEGRTUVQNbSQV-EQDG V¥AVATRHVQLIGKDKVR—F—ЩЕ-NPSIS

<BBXXB> *» * « ** ** ** *****

MRS-RiEFUfEAS—VM-KEPNCHHTVIÎ 1034

LKE-niEFLNEAS—VM-KGPTCHHWR 1061

-RT-C-HGLRRSSKFCL-KE---HKALK 273

SRGGR-RÄ-RRPSRLLAIKE---HKALK 262

aem u+ +a+aa + +о+ао <юо -tat- oa

KP 980 PCSVYTPDEWSVS-REKITLLREIjGOGSFGM—VYEGNAHDIIKG

HÏ2P 24? EATLCVSD—ISTHAKLASI'SFIJOSSLSSESOPQ---FSI-HR

продоляб1..-> +е>ад e+ ^a av + ö+ aaoa+a

ИР 1022 EiVb'rRVAV-KTVWKSASLRERIEi'LNEASVM 1051 KT2P £79 EPCS-YAGRRTM-QSIS-NEQ-----КАСШ, 303

концевого участков ВДЗ р2- (236-274), р3- (2<И- 290) и Р40-АР (228-263) обнаружил 17-24% идентичных и 64-72% эквифугасционалышх (ЭФ) АКО (Рис. 1Б). 1312-1349 ИР также обладает существенной гомологией по отношению к С-концевому участку ЦЦЗ о^д-АР. С-конце-вой домен ИР характеризуются гомологией на уровне первичной структуры по отношению к центральному и С-концевому участкам ЦЦЗ НТ1С-СР , располагая 2255 идентичных и 72% ЭФ АКО (16% делеций) (Рис. 1Б).

Существенная гомология была также выявлена при сравнении АКП С-концевого домена И о К- и С-концевыми участками ЦЦЗ МХР /ш^/ш^-тодтштов. Так, АКП 1294-1355 ИР при выравнивании с 212275 трМХР имела 26% идентичных и 71% ЭФ АКО (16% делеций) (Рис. 1В). Пара 1320-1355 ИР/269-308 Шд-МХР характеризовалась 23% идентичных и 85% ЭФ АКО (16% делеций). АКП 1296-1355 р-СЕ ИР гомологична и по отношению к С-концевому сегменту ЦЦЗ гпд-МХР (429-488) - 15% идентичных и 76% ЭФ АКО (Рис. 1В).

Таким образом, С-концевой домен ИР обладал существенной гомологией по отношению к большинству участков ЦДЗ РРГ (преимущественно С-концевых, включенных в связывание и активации С-белков), которая была наиболее выражена для участка, расположенного недалеко от С-конца ИР, содержащего ВДНЗ-мотив (КЮТСЯ13,41-1345). Известно, что ВВХХВ-ыотивы являются основными сайтами, определяющими сопряжение различных рецепторов и й-белков. Полученные результаты хорошо согласуются о данными Окапк^о и соавт. (1993), которые показали, что пептид, соответствующий участку 1325-1345 ИР, оказывает стимулирующий эффект на и С0-болки.

Консервативные АТФ-связыввшиа домены рецепторов инсулина и

Рис. 1. Гомология различных по локализации участков рецепторов инсулина и ИФР1 по отношению к ЦДЗ РРГ. Условные обозначения: ИР и ИФРР - рецепторы инсулина и ШР1 человека; (32Р и (ЗЗР - и

Р3~АР человека; р4СР - р4С--АР индюка; mlP, ю2Р, иЗР и п4Р - ш1,

rng, m3 и Пд-МХР человека; а2АР - с^д-АР человека; HTICP - НТ1С-СР

крысы; НТ2Р - НТ2-СР человека; D2P - Dg-ДАР человека. Жирным

шрифтом в структуре РРГ выделены АКО, идентичные или ЭФ по отношению к таковым рэцепторов-тирозинкиназ. Звездочками отмечены наиболее консервативные позиции АКО в первичной структуре Бсех выравненных рецепторов. На Рис. 2Д: "+" - идентичные; "в" - ЭФ AKD. .

15'iPl оказались гомологичны ДДЗ р-АР. Так, например, при сравнении 1010-1Q61 ИР с ЦДЗ р2- (222-273) и Р4С~АР (213-262) было обнаружено 20-22% идентичных и 66-74% ЭФ АКО (Рис. 1Г). В С-концевсй части указанных АКП РТК локализованы ВВХХВ-мотивы (HHWR), которые совпадают с соответствующими мотивами, локализованными в ЦЦЗ р-АР. Обнаруженное сходство первичной структуры АТФ-связывающего домена рецепторов-тирозинкиназ и ЦЦЗ р-АР, сопряженных с АЦ через Сч-белок, согласуется с данными Okamoto и соавт. (1993) о том, что пептид 1039-1061 ИР способен специфически активировать Са-болок. Таким образом, обнаруженный участок рецепторов инсулина и ИФР1, по всей видимости, ответственен за сопряжения этих рецепторов с G3- Наконец, участок 980-1051 ИР обладал гомологией {&% идентичных и 70% ЭФ АКО) по отношению к ЦЦЗ НТг-СР, сопряженному с Gq-белком, который структурно близок Gg (Рис. 1Д).

Таким образом, в результате проведенного анализа в первичной структуре цитсшгазматических доменов рецепторов инсулина и ИФР1 бы.}ей впервые обнаружены протяженные участки (до 40 и более АКО), гомологичные ЦДЗ РРТ (в отдельных случаях более 20% идентичных АКО) и по аналогии с ними способные включаться в связывание и активацию С0 и С1/0~белков, участвующих в регуляции АДО (Рис. 2).

■•пму

[TZZ

с**] &

юксгамамб-ранный

' АТФ-СВЯ-/ зывающий./

'\Р-концевой; \ '

гирозинкиназный

с* t

J

■■ПМ-:

гомологичен 222-273 р2-АР

гг% ид., 74% эф

гомологичен 347-374 ctg-AP

2U ид., 63Ж ЭФ

Рис. 2. Схема рецептора инсулина. Показаны участки 1010-1061 и 1312-1349 р-СЕ ИР, гомологичные участкам р2- и с^-АР, потенциально спосо -¿а взаимодействовать с С3 и в^-белками, включенными

в регуляцию активности АЦ. Условные обозначения: ПМ - плазматическая мембрана; юкстамембранный - соседний с мембраной.

ч

2. Исследование внутренней симметрии зеркального типа в первичной структуре р-СЕ рецепторов инсулина и ИФР1

Известно, что в первичной структуре белков и полипептидов присутствуют симметричные сегменты, при этом центры гаутрекней симметрию! локзлизоваш преимущественно в наиболее важных для функциональной активности белков сегментах их первичной структуры. Для доказательства функциональной важности обнаруженных участков был проведен анализ распределения внутренней симметрии в АНП р-СЕ рецепторов инсулина и ИФР1. Оквзвлось, что участки, потенциально включенные во взаимодействие с С-белками, обладают симметричной структурой. Бри " этом, центры внутренней симметрии были локализованы либо в непосредственной близости (Рис. ЗА), либо совпадали (Рис. ЗБ) с ВВХХВ-иоттат, функциональная важность которых 'для сопряжения рецепторов с С-белками доказана в настоящее время.

(а) <бвххв>

ифрр ир ир ифрр 1021 1048 1077 1050 ---> ---» 4--- <--- абумгоыишуувх--абушотсшут» агттрдскзууск-емттрдмбууск- 1035 1062 1063 1036

ифрр ир ир ифрр 1309 1327 1355 1337 ---» ---> 4--- <--- <в брвикоруаймшж- бхешри'емшж- б-рширьтыксикс-с-гзбйрьриишк^- 1323 1341 1342 1324

<аххв

Рис. 3. Симметричные структуры, локализованные в рецепторах инсулина и ИФР1, и совпадающие с участкам, потенциально включенными во взаимодействие с гетеротримервдми С-белками. Представлено выравнивание антипараллэльных относительно центров симметрия (ЬЬ 1062-1063 ИР и ЬЬ 1035-1036 1ИРР (А) И КК 1341-1342 ИР И ЯК 13231324 ИФРР (Б)) АКП. Условные обозначения те ке, что и на Рис. 1.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Общая функциональная характеристика АЦС моллюска А.суфгеа и крысы.

В мембранной фракции пресноводного двустворчатого моллюска А.су%пеа выявлена базальная АЦ активность, зависшая от двухва лентных катионов (Мп2+ и ) и стимулируемая форсколином и ор-тованадатом натрия (Рис. 4). Эти факты свидетельствуют о наличии в атой ткани функционально активного каталитического компонента

АЦС. Показана активация фермента ГН - ГТФ и его негидролизуемыми аналогами ГЩФ и ГТФ^Б, а также НаР, которая указывает на функциональное сопряжение каталитического компонента с С-белками. Дозо-зависимая кривая стимулирующего эффекта ГН на АЦ активность имела Б-образный вид. По способности стимулировать АЦ, оцениваемую как 1то величина максимального стимулирующего эффекта, так и по значению ИЭдд (концентрация ГН, необходимая для полумаксимальной активации фермента), наиболее эффективным оказался ГТФуБ (+183%, Е050 3x10~®М) и наименее эффективным - ГТФ (+52%, 'й)50 9х10-8М). Наличие стимулирующего АЦ влияния серотонина и потенцирование его ГН указывают на эффективное функциональное взаимодействие всех компонентов АЦС: рецептора, С0-белка и АЦ (Рис. 4).

Активность АЦ,. % 400

300"

200

100

X

I 2 34 5 67 89 10 II

Рис. 4. Бааальная активность АЦ в мембранной фракции гладких мышц А.сувпво. ж влияние на нее веществ негормональной и гормональной природы. Условные обозначения: 1 - Оазальная АЦ активность (добавки отсутствуют); 2-11 -гактивность АЦ в присутствии добавек (2

- ГТФ,10_&М; Зк- ГМДФ.10 М; 4 - ГТО-уЗИСГ^Й; 5 - ГДФрЗ.Ш °М; 6

- форскодин.10~°М; 7 - ИаР.Ю тМ; 8 ортованадат натрия,

9 - Мп _гЮ пМ; 10 - серотонш,10~'М;. 11 - серотонин.Ю И + ГТФ7З, 10 а. По оси ординат - степень активации АЦ (%, базальная активность АЦ принята за 1008). Заштрихованный участок - потенцирующий эффект ГТФ7З (+-41%) на стимуляцию АЦ серотонмном.

Исследование АЦС мембранной фракции скелетных мышц крыс показало, что по своим функциональным свойствам и чувствительности

к агентам негормональной природа (ГН, иаР, форсколин) эта система сходна с таковой мышечной ткани анодонты (Рис. 5). р-Агонист изо-протеронол стимулировал базальную АЦ активность, и этот эффект потенцировался ГН, что указывает на функциональное сопряжение всех компонентов АЦС в мышцах крысы.

Активность АЦ, %

300

200

100

1 23456789

Рис. 5. Назальная активность АЦ в мембранной фракции скелетных мышц крыс- и влияние на нее веществ негормональнои и гормональной

.... , .. то 0 и нд pjjC_ д _

ренол, 10 'М + ГТФ^З.Ю По (%, базальная активность АЦ принята за 10056). Заштрихованный участок - потенцирующий эффект iWyS (+44%) на стимуляцию АЦ изопротеренолом.

2. Влияние пептидов инсулипового суперсемейства и ЭФР на

Оазальную активность АЦ в мышцах моллюсков и крнс.

Было обнаружено, что инсулин, ИФР1 и ШТП моллюска A.cygnea в

диапазоне концентраций от Ю-'1 до 10~"7К в условиях In vitro оказывали стимулирующий эффект на Оазальную активность АЦ как в гладких мышцах моллюска (Рис. 6А), так и в скелетных мышцах крысы (Рис. 6Б). Аналогичный эффект оказывал и ЭФР, рецептор которого, также как и рецепторы пептидов инсулинового суперсемейства, обла-

дает тирозинюгназной активностью (Рис. 6 А,Б). Инсулин, ИФР1 ЭФР стимулировали АЦ активность в области своих физиологических

концентраций, что свидетельствует в пользу существования этих эффектов в клетке.

Эффект, % к контр. gQQ

зос

100 400

Эффект,

Ж к контр. 300

200

100

(А) анодонта

12 II 10 9 8 7 6 Рис. 6. Дозозависимое стимулирующее действие инсулина, ИФР1, ИПП моллюска и ЭФР на активность АЦ в мембранных фракциях мышц анодонты (А) и крысы (В). Условны» обозначения: ( • ) - инсулин, (а ) - ИФРГ, ( о ) - КПП, (л ) - ЭФР. По оси ординат: степень активации АЦ {%, базальнзя активность фермента принята зе 0%); по оси абцисс - (-1о§[пептид)).

Во всех, случаях дозозависимпэ кривые стимулирующего эффекта пептидов на активность фермента имели колоколообразную форму (Рис. б А,Б). Подобная форма кривых была многократно описана в фармакологических исследованиях систем рецептор/агонист (Kahl, 1994), и объясняется тем фактом, что агонист при супрамгксималь-ных концентрациях вследствие десенситизации рецептора часто инга-бирует эффект, индуцированный этим же огонистом при низких концентрациях. Не исключено также, что колоколообразная форма кривых может быть связана с присутствием ке одного, а двух классов рецепторов, с высокой и низкой аффинностью, которые сопрякены со , стимулкрухщим и ингпбируюцим сигнальными путями регуляции АЦС, соответственно.

Эффективность стимулирующего действия пептидов на АЦ была

различной (Рис. 6 А,Б). По своей способности стимулировать АЦ, оцениваемой по величине максимального эффекта исследованных пептидов, их можно расположить в следующий убывающий ряд: в гладких мышцах A.cygnea - ИПП > ИФР1 > инсулин, а в скелетных мшцах крысы - инсулин > МСИ > ИПП. Получанные дашше указывают к-i наличие видовой специфичности в действии пептидов инсулинсвого сухюрсе-мейства. Так, наибольшей эффективностью в мышцах моллюска обладает ИПП, выделенный из атого же объекта, а наименьшей ИФР1 и инсулин млекопитающих. И, наоборот, в мышечной ткани крысы инсулин и ИФР1 более эффективны, чем ИПП моллюска A.oygnea. В то же время, ЭФР обладал примерно одинаковой эффективностью в мышцах моллюсков и крыс (Рис. б А,Б).

Для всех четырех пептидов была исследована временная динамика их стимулирующего действия на АЦ как в мышцах моллюсков, так и крыс."Оказалось, что в обеих тканях наибольший эффект наблюдался через 2,5 мин экспозиции с гормоном, через 5 мин этот эффект сохранялся, но был менее выражен, а через 10 мин практически угасал. Следовательно, стимулирующее влияние изученных пептидов не АЦ реализуется очень быстро - в минутном, а может быть и более коротком временном интервале.

Для подтверждения специфичности стимулирующего влияния инсулина т активность АЦ были проведены эксперименты с использованием антиинсулиновой сыворотки, выработанной против инсулина млекопитающих. В качестве контроля использовалась нормальней сыворотка. В присутствии последней инсулин увеличивал активность АЦ в мышцах анодонты на 41%, а в ска-четных мышцах крыс - на Ш%. В мембранных фракциях, обработанных АИС, гормональный эффект блокировался практически полностью. Эти данные демонстрируют специфичность действия инсулина на АЦС в исследованных тканях моллюсков и крыс.

3. Влияние ^уаниновнх нуклеотмдов на стимулирующий АЦ эффект пептидов кнсулинового суперсемейства.

Как известно, наличие влияния П1 является функциональным тестом на участие G-белков в изучаемом процессе. В связи с этим, исследовали влияние ГН на реализацию стимулирующего АЦ эффекта пептидов.

Оказалось, что ГТФ и его негидролизуемые аналога потенциро-

вали стимулирующий АД эффект инсулина в мышечной ткани как моллюсков, так и крыс (Рис. 7). В то же время ГДФ(ЗБ ингибировал этот эффект гормона. Порядок эффективности потенцирующего влияния ГН на стимулирующий АЦ эффект инсулина (ГТФ78>ГИДФ>ГТФ), обнаруженный в мембранных фракциях обоих тканей, является типичным для РРТ, функционально сопряженных с G-белками.

Рис. 7. Влияние ГН^и га аналогов (Ю М) на стю«улируший АЦ эффект инсулина (10"°М) в мышцах анодонты (А) и крысы (Б). Условные обозначения: 1 - базальная АЦ активность; 2 - инсулин; 3 - ГК7Ц; 4 - ГВДФ; £ - ГТФ; 6 - ГДФрБ; Т - инсулин + ГТФтБ; 8 - инсулин + ГЙДФ; 9 - инсулин + ГГФ; 10 - инсулин + ГДФрЗ. Активность АЦ выражена в пМ цААФ/мин/мг белка. Цифры над столбиками - потенцирующее действие ГН на эффект пептида (прирост в % над аддитивным эффектом пептида и ГН фи их раздельном действии).

Сходные результаты били получены и в отношении стимулирующего АД эффекта других пептидов. Так, в мембранной фракции мшц анодонты ГйДФ потенцировал этот эффект ИЛИ моллюска, ИФР1 и ЗФР (Рис. 8). Вое эти данные свидетельствуют о вовлеченности С-белков и, конкретно, Од-белков в реализацию стимулирущего АЦ эффекта всех исследованных пептидов. Этот вывод хорош согласуется с тем фактом, что а кааей лаборатории в мышцах моллюска анодонта были вд&нтифицировЕна. субстраты холерного токсина - С-3-белки с Мг 4560 кДа, которые могут выполнять эту функцию (РехЧзеуа ей &1., 1992).

Рис. 8. Лотенцироввнив ГИДФлСтимулируадего АЦ эффекта ИПП моллюска «СГ^М) (А), ИФР1 (10_ИЙ) (Б), инсулина (10-иМ) (В) "и ЭФР (10 УМ) (Г) в гладких мышцах А.су&геа. Условные обозначения: 1 -базальная АЦ вктивность в отсутствие дойавок; 2-4 - активность АЦ с добавками (2 - ГИДФ; 3 - пептид; 4 - ГИДФ + пептид). Заштрихованные участки - потенцирующий эффект ГИДФ на стимулирующее АЦ действие пептида. Активность АД выражена в пМ цАМФ/мин/мг белка. Цифры над столбиками - потенцирующее действие ГН на эффект пептида (прирост в % над аддитивным эффектом пептида и ГН при их раздельном действии).

Таким образом, в результате проведенных исследований впервые показана способность пептидов инсулинового суперсемейсчвэ (инсулин, ИФР1, ИПП А. су£?хеа) стимулировать ГТФ-завиоишм образом активность АЦС. Ко основании' собственных теоретических и экспериментальных данных, а также результатов, полученных в нашей лаборатории, об ингибируюцем действии бдокатороа тирозинкиназной активности (тирфостин-47, генистеин) на стимулирующий АЦ эффект пептидов (Рег'.зеуа а1., 1995), сделан вывод об обнаружении нового механизма трансдукции сигналов, генерируемых указанными пептидами, реализуемого через аденилвтциклазную сигнальную систв му и включающего следующие функциональные блоки: рецептор тирозигаомаза - Сд-белок - АЦ.

18

вгаоды

1. На основа сравнительного анализа аминокислотных последовательностей цитоплчзматических доменов рецепторов пептидов инсули-нового суперсемейства с таковнми рецепторов родопсинового типа в них впервые выявлены участки, потенциально способные взаимодействовать с гетеротркмэрными С-белками (С0 и С^), включенными в регуляцию аденилатциклазной сигнальной системы..

2. Разработан новый графический метод для идентификации внутренней симметрии в первичной структуре бэжов. Его. использование позволило идентифицировать в р-субгэдиницах рецепторов пептидов инсулкноЕого суперсемейства центры внутренней симметрии, совпадающие с молекулярными детерминантами, включенными во взаимодействие с С-белками.

3.-Дана сравнительная характеристика'аденилатциклазной сигнальной системы в гладких мышцах двустворчатого моллюска А.оу^-еа и в скелетных мыщ крысы. Показано, что по своим функциональным свойствам эти системы сходны между собой.

Впервые обнаружен стимулирующий эффект инсулина и родственных ему пептидов (ИФР1, ШШ моллюска А.су^а) на базальную активность адэншгатциклазы в гладких мышцах моллюска анодонты и скелетных мышцах крысы. По степени эффективности, оцениваемой по величине максимального стимулирующего аденилатциклазу эффекта, исследованные пептида располагаются в следующий ряд: в мышцах моллюска - МПП > ИФР1 > инсулин, в мышцах крысы - инсулин > ИФР1 > МПП. Сделано заключение о видосгоцифичности регулирующего действия пептидов инсулипового суперсемейства.

5. Установлена зависимость от гуашшовых нуклеотидов стимулирующего адэнилатциклазу эффекта пептидов иисулинового суперсемейства. По степени его потенцирования гуанияовыми нуклеотидемн, последние располагаются в еде .дующий ряд: ГТФ^З > ГЭДФ > ГТФ. На основе отих данных сделан вывод об участии гетеротримерных С-балков и, конкретно, С-бэлка стимулирующего типа в реализации стимулирующего еденилатцкклазу эффекта инсулина, ИФР1 и Ш1 моллюска. Таким образом, экспериментально подтверждена теоретически найденная потенциальная возможность взаимодействия рецепторов пептидов инсулшювого суперсемейства с С3-белкаш1, а через его

посредство с аденилатциклазой.

6. Сделан вывод об обнаружении нового молекулярного механизма действия инсулина, ИПП моллюска и ИФР1, включающего аденилатцик-лазную сигнальную систему.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Структурно-функциональная характеристика ГТФ-связнвагацих белков беспозвоночных' животных // К. эвол. биохим. и физиол. 1993. Т. 29. N 5-6. С. 635-653.

2. Plesneva S.A., Shpakov А.О., Rusakov Yu.I., Kuznetsova L.A., Pertseva M.N. The Involvement of adenylate cyclase signalling system In the action oí Insulin, epidermal growth factor and ln-sulin-like peptide of mollusc // Proc. 17th Conference of Eur. comparative endocrinologists. Cordoba, Spain. Septemer 5-10, 1994. Abstract No 135.

3. Plesneva S.A., Shpakov A.O., Pertseva M.N., Rusakov Yu.I., Bondareva V.M. The adenylate cyelase-stimulatlng effect of lnsu-lln-llke peptide from mollusc Anodonta cygnea // The Fourth Symposium on Molluacan Neurobiology (Symon IV). Amsterdam. 1994. Abstracta. P. 143.

л. Шпаков A.O., Даркач К.В. Влияние катионов тяжелых мета,плов на активность аденилатциклазной системы гладких мышц и гепатопан-креаса некоторых двустворчатых и брюхоногих моллюсков // Ж. эвол, биохим. и физиол. 1994. Т. 30. N 4. С. 516- 524.

5. Шпеков А.О. Молекулярные основы функционального сопряжения рецепторов и ГТФ-связывагацих белков // Биол. мембраны. 1995. Т. 12. N 5. С. 453-471.

6. Pertseva M.N., Pleaneva S.A., Kuznetsova L.A., Shpakov A.O. About the possible role of tyrosine kinase mechanism in the stimulating action of Insulin on muscle adenylate cyclase // Meeting "Tyrosine Phosphorylation and Cell Signalling", May 3-7,'1995. Cold Spring Harbor, N.Y. Abstract.

7. Перцева М.Н., Плеснева С.А., Шпаков А.О., Русаков Ю.И , Кузнецова Л.А. Новые данные, свидетельствующие об участии аденилатциклазной системы в механизме действия инсулина и родственных пептидов // Доклада РАН. 1995. Т. 342. N 3. С. 410-412.

8. Шпаков А.О. Комплексный графический метод анализа первичных структур белков, используемый для идентификации в них внутренней симметрии и повторявшихся последовательностей // Материалы конф. "Биохим. и биофиз. механизмы физиологических функций", С- Петербург,. 1995. С. 201.

9. Pertseva M.N., Plesneva S.A., Shpakov A.O., Rusakov Yu.I., Kuznetsova I.A. Involvement of adenylyl cyclase signalling system in the action ol insulin and mollusc insulin- like peptide // Сотр. Blochem. Physiol. 1995. V. 112B. P. 689-695.

10. Перцева M.H., Шпаков A.O., Плеснева O.A. Современные достижения в изучении сигнальных механизмов действия инсулина и род стванных ему пептидов // Ж. эвол. биохим. я физиол. 1996. Т. 32. И 3. С. 318-339.

11. Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты рецепторов и ГГФ-свя-зыващих белков, определяющие специфичность взаимодействий между ними U Журн. эвол. биохим. и физиол. 1996. Т. 68. N 4. 0. ООО-ООО <" печати).

12. Шлаков А.О. Новый метод, используемый для идентификации внутренней симметрии в первичной структура белков // Cö. "1(Х1> Междунвр. совещание и школа по ввол. физиологии", С- Петербург, 1996. С. 271-272.

13. Шпаков А.О. Участки цитоплазматического хвоста инсулинозого рецептора, потенциально включенные во взаимодействие с гетеротри-мерными G-белками // Сб. "I(XI) Между нар. совещание и школа по .эвол. физиологии", С-Петербург, 1996. С. 272-273.

14. Плэснава С.А., Кузнецова Л.А., Шпаков А.О., Перцева М.Н. У»астие рецопторной тирозшшиназы ь механизме стимулирующего аде-нилатциклазу действия инсулина и некоторых ростовых факторов // Сб. nI(XI) Междунар, совещание и школа по эвол. физиологии", С-Петербург, 1996. С. 181-182.

15. Шпаков А.О. Гомология первичной структуры третьих цито-плазматичэских доменов рецепторов родопсинового типа и цитоплазматического хвоста р-субъединицы иисулинового рецептора // Цитология. 1996. Г. 38. N 0. С. 000-000 (в печати).

16. Шпаков А.О. Структурные элементы молекул ГТФ-связывающих белков и оффакторов, опосредующие сопряжение между ниш // Укр. биохим. ж. 1996. Т. 68. N о. С. 000-000 (в печати).