Обнаружение и характеристика инсулиноподобных пептидов нервной ткани моллюска Anodonta cygnea

Шипилов, Валерий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Обнаружение и характеристика инсулиноподобных пептидов нервной ткани моллюска Anodonta cygnea
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение и характеристика инсулиноподобных пептидов нервной ткани моллюска Anodonta cygnea"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова

На правах рукописи

шипилов

Валерий Николаевич

ОБНАРУЖЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ИНСУЛИНОПОДОБНЫХ ПЕПТИДОВ НЕРВНОЙ ТКАНИ МОЛЛЮСКА/1ММ>0Л7И СЧвША.

Специальность 00.03.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии (заведующий лабораторией - доктор биологических наук, профессор Перцева М.Н.) Института эволюционной физиологии и биохимии им И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Бондарева Вера Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Пучкова Людмила Валентиновна доктор биологических наук Парнова Римма Германовна

Ведущая организация:

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург

[ *1Ъ УШЩ}Х 2оо5 г, в [{

Защита состоится . 2005 г. в * I_часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.127.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭФиБ, им И.М. Сеченова РАН

Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета ' ^

доктор биологических наук, профессор ./^/^-С- Маслова М.Н.

^' /

2.1ШЮ

ZCDG

(poej-

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Обнаружение инсулина, инсулиноподобных факторов роста (ИФР), релаксина и их рецепторов в ЦНС позвоночных привело к изменению представлений о происхождении и роли гормонов инсулинового суперсемейства. Однако, несмотря на идентификацию и выявление экспрессии генов инсулиноподобных пептидов (ИПП) в нервной ткани, их биологические свойства и функции изучены недостаточно. Таким образом, установление природы и роли ИПП, синтезируемых нервной тканью, остается одной из актуальных проблем современной нейроэндокринологии.

Известно, что обнаруженные в нервной ткани гормоны инсулинового суперсемейства регулируют утилизацию глюкозы по аутокринному и паракринному типу, а также осуществляют в ЦНС нейромодуляторные и нейромедиаторные функции. В их компетенцию также входят некоторые анаболические и анти-апоптотические функции, контроль процессов роста, дифференцировки нейронов и синаптогенеза, участие в регуляции пищевого поведения и ряда когнитивных функций (Schwartz et al., 1992, 2000; Schechter et al., 1999; Woods et al., 2000; Park, 2001; Schulingkamp et al., 2001; Gerozissis, 2003; Bondy, Cheng, 2004; McGowan et al., 2005). Что касается нейрокринной продукции гормонов инсулинового суперсемейства, то она показана для ИФР и релаксина, тогда как сведения, позволяющие однозначно ответить на вопрос о синтезе инсулина в ЦНС позвоночных до сих пор отсутствуют. Синтез инсулина у позвоночных показан только в эмбриональной нервной ткани (Devaskar et al., 1994).

Значительные успехи в изучении проблемы достигнуты в исследованиях на беспозвоночных, у которых основным местом синтеза ИПП является нервная ткань. С помощью методов молекулярной биологии расшифрованы гены, кодирующие ИПП, установлена первичная структура этих пептидов у представителей нескольких типов беспозвоночных, включая круглых червей, моллюсков и членистоногих (Robitzki et al., 1989; Hetru et al., 1991; Kondo et al., 1996; Smit et al., 1998; Floyd et al., 1999; Brogiolo et al., 2001; Li et al., 2003; Krieger et al., 2004). Принципиальное сходство структурной организации ИПП беспозвоночных с инсулином позволило включить эти молекулы в инсулиновое суперсемейство. Однако, в силу особенностей аминокислотной последовательности, нейропептиды беспозвоночных выделены в отдельную группу, и степень родства данных пептидов с другими членами суперсемейства инсулина еще предстоит выяснить.

РОС. НАЦИОНАЛЫ чй 1 БИБЛИОТЕКА 1

Ар1у.?1а саИ/пгтса) до 38 (нематода СаепогИаЬМЧв е^ага). Различия аминокислотных последовательностей между изоформами могут превышать 50 %, что предполагает разнонаправленность их действия. Немногочисленные данные свидетельствуют о проявлении метаболических и рост-стимулирующих эффектов ИПГТ нервной ткани беспозвоночных, однако, регуляторная роль большинства известных пептидов во многом остается не выясненной (СЛаеуэ й а1., 2002).

В данной работе впервые выявлена локализация инсулиноподобных пептидов в ганглиях пресноводного двустворчатого моллюска Апое1оп1а cygnea, показана способность нейронов к их синтезу, проведены выделение и очистка из ганглиев пептидов, обозначенных нами как родственные инсулину пептиды (РИП), оценена способность полученных РИП связываться с рецепторами инсулина и ИФР-1, а также влияние пептидов на активность аденилатциклазной сигнальной системы.

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы явилось обнаружение и характеристика родственных инсулину пептидов в нервной системе моллюска Лпо/1оп1а су^еа В соответствии с этим в конкретные задачи входило:

1. Установить локализацию клеток, синтезирующих родственные инсулину пептиды в ганглиях с помощью иммуногистохимического метода и показать присутствие мРНК, кодирующих пептиды моллюска.

2. Выделить с помощью ионообменной и высокоэффективной жидкостной хроматографий родственные инсулину пептиды из трех видов нервных ганглиев моллюска.

3. Дать сравнительную характеристику функциональных свойств выделенных пептидов, оценив их способность связываться с рецепторами инсулина и ИФР-1 тканей позвоночных, а также по регуляторному эффекту пептидов на внутриклеточный аденилатциклазный сигнальный каскад.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Обнаружение в нервных ганглиях моллюска А. су^еа клеток, содержащих пептиды, взаимодействующие с антителами к инсулину позвоночных, позволяет констатировать, что в нейронах этого вида присутствуют субстанции родственные инсулину.

2. Выделение РИП из ганглиев А. су^реа по оригинальной схеме получения инсулина и последующая ВЭЖХ очистка подтверждает присутствие в нервной ткани этого вида моллюска пептидов, сходных с инсулинами позвоночных.

3. Оценка способности РИП, полученных из ганглиев А. су%реа, взаимодействовать с рецепторами инсулина и ИФР-1 в специфичных радиолигандных тест-системах дает основание считать исследуемые пептиды функционально близкими к гормонам инсулинового суперсемейства. В тоже время низкое относительное сродство РИП моллюска к обоим типам рецепторов свидетельствует о значительных отличиях их структур от стандартных инсулина свиньи и ИФР-1 человека.

4. Способность РИП моллюска стимулировать активность аденилатциклазы и ГТФ-связывающей активности в-белков сходным с инсулином и ИФР-1 образом, указывает на возможность осуществления их регуляторных эффектов через аденилатциклазную сигнальную систему.

Научная новизна

1. Впервые выявлена локализация родственных инсулину пептидов в нервной системе моллюска А. су^еа

2. Впервые из нервной ткани представителя беспозвоночных, двустворчатого моллюска А су^еа, выделены и очищены родственные инсулину пептиды.

3. Впервые проведена оценка биологических и функциональных свойств родственных инсулину пептидов, присутствующих в клетках ганглиев моллюска А. су^еа.

Теоретическая и практическая значимость работы

Выявление в нервной ткани моллюска А cygnea пептидов, обладающих свойствами, как инсулина, так и ИФР-1, является вкладом в развитие представлений об эндокринной функции нервной ткани и представляется важным для понимания генезиса и эволюции регуляторных систем, продуцирующих инсулиноподобные пептиды.

Характеристика биологических свойств РИП, полученных из ганглиев А сур\еа в тест-системах млекопитающих позволяет приблизиться как к пониманию природы и роли этих субстанций, так и проиллюстрировать структурно-функциональную дивергенцию гормонов суперсемейства инсулина в филогенезе.

Обнаружение у моллюсков пептидов, обладающих свойствами инсулина и ИФР-1, в практическом плане может быть использовано для гормональной стимуляции роста и развития в процессе выращивания марикультур беспозвоночных.

Апробация работы

Результаты исследования доложены на Седьмой региональной конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных (Калининград-Светлогорск-

Отрадное, 2003); Международной научной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов (Петрозаводск, 2004); Двадцать второй конференции европейских сравнительных эндокринологов (Уппсала, Швеция, 2004); Седьмой Всероссийской конференции «Нейроэндокринология-2005» (С-Петербург, 2005).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных статей в рецензируемых российских и иностранных журналах и 5 тезисов докладов.

Личный вклад автора

Все экспериментальные данные, приведенные в диссертационной работе, получены лично автором или при его непосредственном участии.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, результатов, обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 105 страницах, включая 20 рисунков и 6 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 212 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Экспериментальные животные - двустворчатые пресноводные моллюски Anodonta cygnea и крысы линии Вистар. Исследования проводили на нервной и гладкомышечной ткани моллюска, скелетных мышцах, нервной ткани и печени крысы.

Выявление инсулин-иммунореактивных клеток в ганглиях моллюска иммуноцитохимическим методом. В исследованиях использовали стандартную гистологическую обработку ганглиев. Далее изготавливали серии чередующихся парафиновых срезов, сделанных во фронтальной плоскости, толщиной 6 мкм.

Выявление инсулин-иммунореаюгивных клеток проводили с помощью непрямого иммуноферментного метода (Polak, Van Noorden, 1983). В качестве первичных антител использовали поликлональную антиинсулиновую сыворотку, полученную после иммунизации морских свинок кристаллическим инсулином горбуши (О gorbusha) Вторичные антитела - стандартный набор антител к иммуноглобулинам морской свинки, конъюгированных с пероксидазой.

Выявление присутствия мРНК, кодирующих родственные инсулину пептиды моллюска методом ОТ-ПЦР. Для конструирования праймеров использовали известные нуклеотидные последовательности мРНК, кодирующие ИПП беспозвоночных, поиск

которых осуществляли в базе данных нуклеотидных последовательностей GeneBank Найденные последовательности выравнивали с помощью программы Clustal W для выявления в них консервативных участков. В результате в качестве шаблона использовали последовательности мРНК, кодирующие ИПП моллюска-прудовика Lymnaea stagnalis, на основе которых были сконструированы три пары праймеров. Амплификацию проводили методом обратной транскрипции совмещенной с ПЦР (ОТ-ПЦР). В экспериментах использовали кДНК, полученные в реакции обратной транскрипции на препаратах тотальной РНК, которые выделяли раздельно из каждого вида нервных ганглиев. На полученной из каждого вида ганглиев РНК проводили ОТ-ПЦР. Образующиеся продукты подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, сканировали и обрабатывали с помощью программы ACD See 5.0.

Родственные инсулину пептиды выделяли из ганглиев моллюска по схеме, разработанной в лаборатории для получения инсулинов из поджелудочной железы и внепанкреатических тканей позвоночных (Русаков, Бондарева, 1979; Бондарева и др., 1988). Грубую очистку препарата осуществляли ионообменной хроматографией на макропористом сульфокатионите КУ-23 в Н+ форме. Дальнейшую очистку проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке Диасорб С^Т. Значимые пептидные пики подвергали рехроматографии в аналогичных условиях. Получение материала для тестирования биологических свойств РИП моллюска Фракцию плазматических мембран печени крыс получали по методу Невилла с некоторыми модификациями (Neville, 1968). Гетерогенную фракцию клеточных мембран мозга крыс получали по методу Хавранковой (Havrankova et al., 1978). Фракцию плазматических мембран ганглиев выделяли по методу Hajos (Hajos, 1975). Сарколеммальную фракцию мышц ноги моллюска получали по методу Kidwai (Kidwai et al., 1973) с изменениями. Определения специфического связывания |251-инсулина и 1251-ИФР-1. Меченые инсулин и ИФР-1 получали хлораминовым методом с очисткой на целлюлозной колонке (Yalow, Berson, I960). Удельная активность меченых гормонов составляла 160-180 мкКи/мкг Специфическое связывание 1251-инсулина и ,251-ИФР-[ с соответствующими гормонам рецепторами анализировали методом конкурентного вытеснения меченых пептидов немечеными. Для этого использовали радиорецепторные тест-системы: 1) на основе |251-инсулина свиньи и обогащенной рецепторами инсулина фракции плазматических мембран печени крыс; 2) на основе 1251-ИФР-1 человека и обогащенной рецепторами ИФР-1 фракции клеточных мембран мозга крыс. Меченые инсулин или ИФР-1 инкубировали с соответствующим материалом в присутствии немеченых лигандов в возрастающих концентрациях (0.1-1000 нг/мл). Неспецифическое связывание определяли в присутствии 10

мкг/мл немеченого инсулина или ИФР-I. Смесь инкубировали 22 ч при 4° С, затем связанные с рецепторами |251-инсулин или |251-ИФР-1 отделяли центрифугированием, после чего считали радиоактивность проб. Величину относительного сродства РИП к рецепторам рассчитывали, исходя из IC50, оцениваемой по подавлению 50 % связывания меченого гормона исследуемым пептидом в сравнении со значением IC50 стандартных инсулина и ИФР-I, величину которой принимали за 100 %.

Определение активности аденилатциклазы и ГТФ-связывания G-белков. Определение активности АЦ проводили по методу Salomon и соавт. (Salomon et al., 1974), которое заключалось в измерении образующегося 32Р сАМФ за 1 мин на 1 мг белка. В экспериментах по определению типа G-белков проводили преинкубацию фракций мембран с искусственно синтезированными пептидами, соответствующими С-концевым участкам оц- и а,2-субъединиц G-белков млекопитающих. Определение общей ГТФ-связывающей активности G-белков проводили по методу Panchenko (Panchenko et al., 1987) и Mclntire (Mclntire et al., 2001). Специфическую ГТФ-связывающую активность определяли как разность между связыванием меченого [8-3H]Gpp[NH]p в пробе в присутствии и отсутствии ГТФ. Статистический анализ. Статистическую обработку результатов и построение графиков проводили с помощью программ Origin 7.0 и ANOVA, используя t-критерий Стьюдента для малых выборок. Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего из нескольких независимых экспериментов. Различия между контролем и опытными пробами оценивали как достоверные при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Иммуноцитохимическая идентификация в ганглиях моллюска нейронов, содержащих пептиды родственные инсулину.

Иммуногистохимическое окрашивание срезов ганглиев моллюска с помощью антиинсулиновой сыворотки выявило присутствие инсулин-иммунореактивных клеток во всех видах ганглиев (Рис. 1). Наиболее интенсивное окрашивание наблюдалось в корковом слое ганглиев, который соответствует телам нейронов. Более слабое окрашивание обнаружено во внутреннем слое (нейропиль), который соответствует аксонам нейронов. Расположение инсулин-иммунореактивных клеток не имело определенной упорядоченности, выявленные клетки были рассеяны по всему корковому слою, не образуя обособленных скоплений.

М'Т

-. ■¿афт ч

л* '

Рис. 1. Иммуноцитохимическое окрашивание ганглиев А су^еа антиинсулиновой сывороткой: А-цереброплевральные, Б-педальные, В-висцеропариетальные ганглии (стрелками обозначен корковый слой, включающий клетки, содержащие инсулин-иммунореактивные пептиды).

Таким образом, в ганглиях А. су%пеа было показано присутствие инсулин-иммунореактивных пептидов, имеющих общие иммунологические детерминанты с инсулином. Отсутствие упорядоченности расположения клеток, содержащих инсулиноподобные пептиды, характерные для более высокоорганизованных беспозвоночных отражает одну из ранних стадий развития в эволюции системы продуцирующей ИПП.

2. Амплификация участков мРНК, предположительно кодирующих РИП моллюска.

С целью подтверждения способности ганглиев моллюска к синтезу РИП нами была проведена амплификация мРНК, кодирующих РИП методом ОТ-ПЦР. Поскольку структура генов кодирующих РИП А.су^еа неизвестна, то для конструирования праймеров, использовали компьютерный поиск известных последовательностей кодирующих ИПП беспозвоночных (база данных ОепеВапк). В найденных последовательностях не содержалось протяженных консервативных участков, пригодных к использованию в качестве праймеров. Поэтому были использованы последовательности мРНК инсулиноподобных пептидов моллюска £ я/арта/м, вида филогенетически наиболее близкого к исследуемому. В результате были сконструированы три пары праймеров, перекрывающие область нуклеотидной последовательности мРНК моллюска Ь stagnalis, включающей часть В-домена, С-, А-домены и предполагаемый полиадениловый «хвост» (Табл.1 ).

Таблица 1. Последовательности праймеров, перекрывающих участки мРНК предположительно кодирующих инсулиноподобные пептиды моллюска Апос1оп1а су^пеа и

длина полученных ПЦР продуктов.

N5 пары Нуклеотидные последовательности верхнего и нижнего праймеров соответственно Длина продуктов ПЦР, п.н. ^отжига, °с

I. ¡¡аяраИз* А. су^еа**

1. 5'САТССССОТОССАТТТСТСОСЗ' 5'ОСА<ЗСАТТСАСАСАСТААОТГСО 3' 245 - 65.0

2. 5 'ССААСТТАОТСТСТСААТОСТСС 3' 5'ТПТНТГГГПТПТПТПТПТЗ' 167 -700 -400 50.0

3. 5 'САТСССССТОССАТТТОТСОС 3' 5ТПТПТПТПТПТНТГПТПТ 3' 390 -500 -400 50.0

* -для моллюска 1 slagna/is приведена теоретически рассчитанная длина ПЦР-продуктов. **-для моллюска Л. суяпеа приведена длина экспериментально полученных ПЦР-продуктов.

Амплификация участков мРНК моллюска А. су$пеа, предположительно кодирующих РИП, выявила по два ПЦР-продукта длиной около 700 и 400 пар нуклеотидов в цереброплевральных и педальных ганглиях при использовании второй пары праймеров, и по два фрагмента длиной около 500 и 400 п.н. в тех же видах ганглиев при использовании третьей пары, тогда как в висцеропариетальных ганглиях амплификат отсутствовал. Первая пара праймеров не выявила ПЦР-продуктов ни в одном из видов ганглиев (Рис. 2).

■ б в

[ II Т П

123 Х23123М

Рис. 2. Амплификация участков мРНК, предположительно кодирующих инсулиноподобные пептиды моллюска Л су%реа цереброплевральных (1), педальных (2) и висцеропариетальных (3) ганглиев с использованием трех пар праймеров (а - X? 1, б - № 2, в - № 3). М- ДНК маркеры - отЮО до1000 пар нуклеотидов (п.н.) +1500 п.н. а - неспецифический отжиг праймеров (-100 п.н.).

Обнаружение мРНК, предположительно кодирующих РИП, свидетельствует о наличии достаточно протяженных участков нуклеотидных последовательностей мРНК, кодирующих ИПП, консервативных среди разных классов моллюсков. С другой стороны отсутствие амплификата в висцеропариетальных ганглиях может указывать на значительные различия структуры РИП, синтезируемых в этом виде ганглиев.

3. Выделение и очистка родственных инсулину пептидов моллюска.

Родственные инсулину пептиды были раздельно выделены из каждого вида ганглиев, собранных от 4080 моллюсков. В результате ионообменной хроматографии кислотно-этаноловых экстрактов ткани на колонке с сульфокатионитом КУ-23 в условиях десорбции инсулина в каждом из препаратов были получены четкий единичный белковый пик.

Дальнейшую очистку выделенных инсулиноподобных субстанций проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. В результате ВЭЖХ-очистки в препарате из цереброплевральных ганглиев было идентифицировано семь мажорных пиков, различающихся по времени удержания на обратнофазном сорбенте в градиенте ацетонитрила и обозначенных как - РИП1 - РИП7 (Рис. 3.).

2.0

1.0

Инсулин и % сн3сяч в

пептиды зоне выхода

моллюска пептида

Инсулин 39.00-39.50

РИП

моллюска

1 32.60-33.57

2 34.66-36.97

3 37.56-38.09

4 38.09-39.47

5 39.97-40.65

6 41.06-42.47

7 45.47-47.60

10 30 <0 90

Время. ИНН

Рис. 3. Профили элюции РИП из цереброплевральных ганглиев моллюска Л сд^пеа, полученные с использованием ВЭЖХ (колонка Диасорб С|бТ). Скорость элюции 1 мл/мин. По оси абсцисс - время элюции, мин; по оси ординат - поглощение при длине волны 226 нм.

В качестве физико-химической характеристики пептидов были использованы два, тождественных по сути, критерия - время удержания на колонке и гидрофобность (% концентрации ацетонитрила). В соответствии с этим гидрофобность РИП1 составила 32.6 %,

РИП7 - 47 %. Для стандартного инсулина аналогичная величина составила 39 %.

Очистка препарата из педальных ганглиев вьмвила 6 мажорных фракций, обозначенных РИП8 - РИП13, их гидрофобность варьировала от 30.5 % до 49.4 % (Рис. 4).

Инсулин и % CHзCN в

пептиды зоне выхода

моллюска пептида

Инсулин 39.00-39.50

РИП

моллюска

8 30,43-31,03

9 34,93-37,00

10 39,59-40,47

И 41,03-43,00

12 45,11-47,50

13 47,53-49,42

60 Время, мин

Рис. 4. Профили элюции РИП из педальных ганглиев моллюска Л. cygnea, полученные с

использованием ВЭЖХ (колонка Диасорб С^Т). Скорость элюции 1 мл/мин.

По оси абсцисс - время элюции, мин; по оси ординат - поглощение при длине волны 226 нм.

ВЭЖХ-очистка препарата из висцеропариетальных ганглиев выявила 6 фракций, РИП14 - РИП19 (Рис. 5). Показатель гидрофобности варьировал от 36.1 % до 50 %.

2.0

1.0

Инсулин н % CHзCN в

пептиды зоне выхода

моллюска пептида

Инсулин 39.00-39.50

РИП

моллюска

14 36.13-39.00

15 39.00-40.35

16 42.00-43.58

17 45.50-46.95

18 46.95-49.10

19 49.10-50.00

ю 30

60 Время, мин

Рис.5. Профиль элюции инсулиноподобных пептидов из висцеропариетальных ганглиев моллюска Л. сургеа, полученный с использованием ВЭЖХ (колонка Диасорб С^Т).

Таким образом, использование двухступенчатой ВЭЖХ позволило получить из ганглиев моллюска 19 пептидных изоформ высокой степени очистки. Широкий диапазон гидрофобности выделенных РИП относительно инсулина предполагает различия их первичных структур. Сравнение зон выхода РИП из трех видов ганглиев выявило, что отдельные пептиды имели сходные зоны выхода, что предполагает возможность синтеза одних и тех же пептидов в разных видах ганглиев (Рис. 6).

инсулин 5 в

10| 11

12 13

-9-8-7 -6-6-4 -3 -2 -1 01 23456789

Рис. 6. Зоны выхода отдельных РИП цереброплевральных (1-7), педальных (8-13) и висцеропариетальных (14-19) ганглиев относительно зоны выхода инсулина, принятой за 0. Одна единица по оси абсцисс равна изменению концентрации ацетонитрила на 1 %.

4. Оценка способности РИП моллюска взаимодействовать с рецепторами инсулина и ИФР-1.

Для функциональной характеристики полученные РИП были протестированы в специфических радиорецепторных системах инсулина и ИФР-1, что могло указывать на проявление пептидами метаболических или рост-стимулирующей активностей.

В инсулиновой системе шесть из семи РИП полученных из цереброплевральных ганглиев взаимодействовали с рецептором инсулина плазматических мембран печени крыс. Ход кривых конкурентного вытеснения РИП указывает на способность данных пептидных изоформ связываться с рецептором в дозозависимой манере (Рис. 7). Среди анализированных пептидов наивысшим сродством к инсулиновому рецептору обладал РИП4; величина его 1С50 (17 нМ) составила 11.8 % относительно свиного гормона, величина 1С50 которого равнялась 2 нМ. Величина 1С50 РИП1 и РИП6 составила 330 и 420 нМ, соответственно. РИПЗ и РИП5 имели одинаковые значения ГС50 - 130 нМ. Изоформа РИП2 не проявила способности ингибировать связывание меченого гормона даже в концентрациях более 10мкг/мл, а те же количества РИП7 вытесняли менее 50 % связанного с рецептором гормона.

1000

10000

1С50, (нМ) Относительное сродство, (%)

Инсулин 2 100.0

РИП моллюска

1 330 0.6

2 .*

3 130 1.6

4 17 11.8

5 130 1.6

6 420 0.5

7 >1700 _**

10 100 [РИП], нг/мл

Рис. 7. Кривые конкурентного вытеснения ганглиев моллюска A. cygnea.

По оси абсцисс - концентрация родственных инсулину пептидов (РИП), нг/мл; по оси ординат - специфическое связывание |251-инсулина, % от максимума.

I-инсулина пептидами из цереброплевральных

РИП моллюска из педальных ганглиев (РИП8-РИП13) проявили способность к взаимодействию с рецептором инсулина (Рис. 8). Ход кривых конкурентного вытеснения указывает на слабое сродство пептидных изоформ к этому рецептору. 2?

«г в в

•ев я

IC50, (нМ) Относительное сродство, (%)

Инсулин 2 100.0

РИП моллюска

8 >1666 _**

9 >1666 _**

10 1166 0.17

11 833 0.24

12 >1666 _*»

13 1333 0.15

1000

[РИП], нг/мл

Рис. 8. Кривые конкурентного вытеснения |251-инсулина пептидами из педальных ганглиев моллюска Апос!ота сургеа.

В данной тест-системе величина ГС50 для РИП 10 составила 1167 нМ, для РИП 13 -1333 нМ. Более высоким сродством обладал РИП11, аффинность которого (833 нМ)

составила 0.24 % величины ГС50 стандартного инсулина. РИП8, РИП9, РИП12 при максимальной концентрации 104 нг/мл подавляли менее 50 % связывания с рецептором меченого гормона.

Тестирование РИП из висцеропариегальных ганглиев моллюска (РИП14-РИП19) ыявило их чрезвычайно слабое сродство к рецептору инсулина плазматических мембран печени крыс (Рис 9). В данной тест-системе пять из шести РИП при максимальной концентрации подавляли менее 50 % связывания меченого гормона с рецептором. Величина 1С$о была установлена только для РИП16 и равнялась 1700 нМ.

1С50, (нМ) Относительное сродство, (%)

Инсулин 2 100.0

РИП моллюска

14 >1700 _**

15 >1700 _**

16 1700 0.24

17 >1700 _**

18 >1700 _**

19 >1700

1000 10000

[РИП], нг/мл

Рис. 9. Кривые конкурентного вытеснения 1251-инсулина пептидами из висцеропариегальных ганглиев моллюска А. су^еа.

В радиорецепторной системе, специфичной для ИФР-1, каждый из семи пептидов цереброплевральных ганглиев проявил способность связываться с рецептором ИФР-1 (Рис 10). При этом, исследуемые РИП обнаружили разную активность. Так, в сравнении с величиной ГС50 стандартного ИФР-1 человека 2 нМ, значение 1С50 для РИП7 и РИП6 равнялось 500 нМ и 133 нМ, соответственно. Величины относительного сродства к рецептору ИФР-1 изоформ РИП2 и РИПЗ практически не различались (50 нМ и 83 нМ). Равновысокая конкурирующая способность (ТС50 17 нМ) отмечена для РИП 1, РИП4 и РИП5.

1С* (нМ) Относительное сродство, (%)

ИФР-1 2 100.0

РИП моллюска

1 17 11.8

2 50 4.0

3 83 2.4

4 17 11.8

5 17 11.8

6 133 1.5

7 >500 0.4

1000

10000

125

1-ИФР-1 пептидами из цереброплевральных

ю 100

[РИП), нг/нл

Рис. 10. Кривые конкурентного вытеснения ганглиев моллюска Anodonta cygnea.

По оси абсцисс - концентрация родственных инсулину пептидов (РИП), нг/мл; по оси ординат - специфическое связывание |251-ИФР-1, % от максимума.

Пептиды из педальных ганглиев также проявили активность в конкурировании с 1251-ИФР-1 человека за связывание с рецепторами ИФР-1 клеточных мембран мозга крыс (Рис. 11). В этой системе величина 1С5о для РИП8 и РИП12 составила 1666 нМ, РИП9 - 1500 нМ, РИП10 - 833 нМ, РИП13 - 500 нМ.

О.

е к F

1С50, (нМ) Относительное сродство, (%)

ИФР-1 2 100.0

РИП моллюска

8 1666 0.12

9 1500 0.13

10 833 0.24

11 83 2.4

12 1666 0.12

13 500 0.4

10 100 [РИП], нг/мл

Рис. 11. Кривые конкурентного вытеснения 1251-ИФР-1 пептидами из педальных ганглиев моллюска Л. cygnea.

Наибольшим сродством к рецептору ИФР-1 обладал РИП11; величина его ГС50 была равна 83 нМ, что составило 2,4 % от значения ГС50 стандартного ИФР-1.

Тестирование пептидов из висцеропариетальных ганглиев (РИП14-РИП19) в системе ИФР-1 выявило их слабое взаимодействие с рецепторами ИФР-1 (Рис. 12).

IC50. (нМ) Относительное сродство, (%)

ИФР-1 1.7 100.0

РИП моллюска

14 750 0.23

15 1300 0.13

16 >130 0 _»»

17 35 4.86

18 1150 0.15

19 750 0.23

10 100 1000 10000 (РИП]. нг/мл

Рис. 12. Кривые конкурентного вытеснения |251-ИФР-1 пептидами из висцеропариетальных ганглиев моллюска Anodonta cygnea.

Наибольшим сродством обладал РИП17 - IC50 35 нМ, что составило 4.86 % от величины 1С5о стандартного ИФР-1 (1.7 нМ). Величина 1С50 для РИП15 составила 1300 нМ, РИП18 - 1150 нМ, РИП 14 и РИП19- 750 нМ. Изоформа РИП 16 при максимальной концентрации вытесняла менее 50% меченого гормона.

Таким образом, выявленная в радиолигандном анализе способность пептидов моллюска специфически связываться с рецепторами инсулина и ИФР-1, указывает на функциональное родство РИП гормонам инсулинового суперсемейства и свидетельствует о возможном проявлении пептидами ростовой и метаболической активности Ход дозозависимых кривых свидетельствует о принципиально сходном характере действия исследуемых нейропептидов моллюска в обоих тест-системах, но, в тоже время, свидетельствует о разной возможности взаимодействия отдельных изоформ с рецепторами каждой из систем. Существенно, что 15 из 19 изоформ РИП имели более высокое сродство к рецептору ИФР-1, что может указывать на преобладание рост-стимулирующих эффектов этих пептидов (Рис 13).

Инсулииовая радиорецепторная система

1С

100 10 5

Относительное сродство, %

Иис^л

1ФР-1 РИП 1

ИФР-1 радиорецепторная система

5 10 100

Относительное сродство, %

Рис. 13. Относительное сродство РИП моллюска к рецепторам инсулина и ИФР-1.

Среди протестированных пептидов РИП4 и РИП 10 обладали практически одинаковым сродством к рецепторам инсулина и ИФР-1 («функциональные гибриды»), что предполагает близость строения активного центра этих молекул обоим типам рецепторов. При сравнении величин сродства РИП из разных видов ганглиев отмечается снижение аффинности к обоим типам рецепторов от пептидов цереброплевральных ганглиев к пептидам висцеропариетальных ганглиев, что предполагает различную функциональную роль ганглиев в контролируемых РИП процессах. Сравнение величин относительного сродства РИП выделенных из разных ганглиев и сопоставление их с зонами выхода пептидов относительно инсулина выявило сходство отдельных изоформ по данным параметрам. Эти данные указывают на то, что отдельные РИП могут синтезироваться в разных видах ганглиев. Однако однозначно ответить на этот вопрос можно, лишь проведя секвенирование каждого из таких пептидов.

5. Влияние РИП моллюска на активность аденилатциклазы и ГТФ-связывание в мышечной и нервной тканях.

Для характеристики действия нейропептидов моллюска на внутриклеточные сигнальные каскады была проведена оценка регуляторного влияния РИП1 и РИП7 цереброплевральных ганглиев на функциональную активность компонентов аденилатциклазной сигнальной системы (АЦ и О-белки) в нервной ткани, гладких мышцах моллюска и скелетных мышцах крысы в сравнении со стандартными инсулином и ИФР-1.

РИП1 и РИП7 дозозависимо стимулировали активность АЦ во фракции плазматических мембран гладких мышц моллюска (Рис. 14).

Наиболее мощным активатором АЦ в мышцах моллюска оказался РИП1, тогда как РИП7 по своей эффективности лишь незначительно превосходил инсулин и ИФР-1. В нервной ткани пептиды моллюска уступали по своей активности инсулину и ИФР-1.

* 7

•1од[гормон]

8 -1од[гормон]

в 7

-к>д[гормон]

Рис. 14. Стимулирующий эффект РИГИ - (1) и РИП7 - (2) на активность АЦ во фракциях плазматических мембран ганглиев (а) и гладких мышц моллюска (б), а также скелетных мышц крысы (в). По вертикали - стимулирующий эффект РИП на активность АЦ (%); по горизонтали - отрицательный логарифм концентрации гормона.

Базальная активность АЦ во фракциях плазматических мембран ганглиев моллюска, гладких мышц моллюска и скелетных мышц крысы составляла 63.8 ± 5.0, 28.5 ± 1.2 и 20.2 ±3.8 пмоль сАМР за 1 мин на 1 мг белка.

При этом действие обоих РИП, инсулина и ИФР-1 на АЦ в ганглиях было менее выраженным, чем в мышцах моллюска. Влияние РИП на активность АЦ в скелетных мышцах крысы практически не проявлялось, в то время как инсулин и ИФР-1 оказывали значительный стимулирующий эффект (Табл. 2).

Таблица 2. Влияние РИП, инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в мембранах нервных

Воздействие Активность А1 , пмоль сАМР за 1 мин на 1 мг белка

Нервные ганглии моллюска Гладкие мышцы моллюска Скелетные мышцы крысы

Контроль РИП1, ю-»м РИП7, Ю-8 М Инсулин, Ю-8 М ИФР-1,10-8 м 68.1 ±4.2(100) 101.3 ±7.1 (149) 97.9 ±6.0 (144) 124.0 ± 8.4 (182) 131.2 ±9.1 (193) 26.9 ±1.6 (100) 113.1 ±8.5 (420) 70.2 ±5.1 (261) 65.2 ±4.0 (242) 61.2 ±3.9 (228) 18.8 + 1.7(100) 23.0 ±2.1 (122) 22.3 ±1.6(119) 38.6 ±2.2 (205) 34.1 ±3.0(181)

Примечание. Контроль - базальная активность АЦ. Цифры в скобках - активность АЦ в % (базальная активность фермента принята за 100 %). Все значения активности АЦ достоверно отличаются от контрольных р < 0.05 (п = 6).

Для определения типа в-белков, опосредующих стимуляцию АЦ пептидами моллюска были использованы С-концевые пептиды а-субъединиц гетеротримерных О-белков, селективно разобщающих функциональное сопряжение между рецептором и О-белком. Стимулирующий эффект РИП1 на АЦ был чувствителен к действию С-концевого

пептида 385-394 а5-субъединицы О-белка, который способен нарушать функциональное сопряжение между активированным гормоном рецептором серпантинного типа и С5-белком. В присутствии Ю-5 М пептида эффект РИГИ снижался в гладких мышцах более чем на 50 %, в ганглиях - на 35 %. Стимулирующий эффект РИП7 в гладких мышцах заметно снижался только в присутствии сравнительно высоких концентраций пептида 385-394, а в ганглиях практически не менялся. Эффекты инсулина и ИФР-1 в присутствии пептида 385-394 во всем диапазоне концентраций менялись слабо. Пептид 346-355 а^-субъединицы О-белка, нарушающий функциональное сопряжение между рецептором серпантинного типа и О^ 2-белком, не влиял на стимуляцию АЦ ни одним из пептидов (Рис. 15).

Рис. 15. Влияние пептида 385-394 а8 (10"7-10"4 М) на стимуляцию пептидами РИП1 - (1) и

РИП7 - (2) (10"8 М) активности АЦ в мембранах нервных ганглиев (а) и гладких мышц моллюска (б).По вертикали - стимулирующий эффект РИП на активность АЦ (%); по горизонтали - отрицательный логарифм концентрации гормона.

Оба нейропептида, также как инсулин и ИФР-1, дозозависимо повышали уровень ГТФ-связывания в мышцах моллюска и, в меньшей степени в ганглиях (Рис. 16).

> 7

-¡од[горион]

» 7

-ОДгормон]

Стимуляция РИП1 - (а) и РИП7 - (б) (10-|0-10"7 М) ГТФ-связывания во фракциях плазматических мембран ганглиев и гладких мышц моллюска. По вертикали -стимулирующий эффект РИП на ГТФ-связывание (%); по горизонтали - отрицательный логарифм концентрации гормона.

Стимуляция ГТФ-связываиия РИГИ и РИП7 в значительной степени блокировалась сурамином (селективным блокатором гетеротримерных О-белков) (Рис.17).

Рис 17. Стимуляция РИГИ, РИП7, инсулина и ИФР-1 (КН М) ГТФ-связывания в мембранах а) нервных ганглиев и б) гладких мышц моллюска, а также в) скелетных мышц крысы в отсутствие (I) и в присутствии (П) ингибитора гетеротримерных О-белков сурамина (Ю-5 М).

1 - контроль; 2 - РИГИ; 3 - РИП7; 4 - инсулин; 5 - ИФР-1. По вертикали - ГТФ-связывание в процентах (ГТФ-связывание в контроле принято за 100 %).

Однако в гладких мышцах моллюска стимуляция ГТФ-связывания РИП7, была несколько менее чувствительна к этому специфичному ингибитору гетеротримерных О-белков, чем при использовании РИГИ.

Способность РИП стимулировать АЦ и ГТФ-связывание свидетельствует о возможности передачи сигнала, закодированного в структуре РИП, на сигнальные каскады Данные по стимуляции АЦ в различных тканях указывают на то, что РИП обладают тканеспецифичностью действия, а также что нервная ткань не является основной мишенью действия РИП. Суммируя данные по использованию синтетических пептидов и сурамина можно предположить, что действие РИП на АЦ может реализовываться через рецептор, функционально сопряженный с гетеротримерным О-белком стимулирующего типа, как это происходит в случае сопряженных с С8-белками рецепторов серпантинного типа. В то же время в гладких мышцах моллюска стимулирующее действие РИП7 менее чувствительно к

сурамину, в сравнении с РИП1. Это может свидетельствовать о том, что РИП7 активирует также ГТФ-связывающие белки, не являющиеся гетеротримерными и не участвующие в регуляции функциональной активности АЦ.

Выбор АЦ системы для оценки функциональной активности изучаемых пептидов моллюска был основан на открытом в лаборатории АЦ сигнального механизма действия инсулина и ИФР-1, который включает следующую сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа->01-белок-> фосфатидилинозитол-3-киназа->протеинкиназа С а-> Оя-белок->аденилатциклаза (Рег^еуа й а]., 2003).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью настоящей работы было установить локализацию, выделить и охарактеризовать пептиды родственные инсулину из ганглиев двустворчатого моллюска А. су£пеа. Мы показали, что, как и у других видов беспозвоночных, нервная ткань моллюска способна синтезировать РИЛ, которые обнаруживаются в клетках коркового слоя ганглиев Неупорядоченное расположение этих клеток в отличие от более высокоорганизованных беспозвоночных позволяет говорить о присутствии у данного вида начального этапа развития системы синтезирующей инсулиноподобные пептиды.

С использованием хроматографических методов, из ганглиев А. су^пеа было выделено 19 изоформ РИП. Полученные РИП проявили способность связываться с рецепторами инсулина и ИФР-1 млекопитающих, что предполагает присутствие на данном этапе филогенеза инсулиноподобных молекул, обладающих ростовыми и метаболическими функциями. Однако более высокое сродство РИП к рецепторам ИФР-1 свидетельствует о преобладании у нейропептидов моллюска ростовой активности. Для дальнейшей характеристики выделенных пептидов было показано участие аденилатциклазной системы, в передаче гормонального сигнала РИП. Отдельные пептиды оказали дозозависимое стимулирование активности АЦ и ГТФ-связывания О-бслков сходным с инсулином и ИФР-1 образом, что свидетельствует о консервативности механизмов передачи сигнала кодируемого ИПП в разных филетических линиях.

итоге приводит к появлению из общего пептида-предшественника инсулина, ИФР и релаксина. Микроуровень оперирует изменениями, как правило, не затрагивающими участки молекулы гормона, ответственные за связывающие места с рецептором, что позволяет пептиду сохранять принадлежность к определенному семейству.

Макро- и микроэволюционные модификации инсулиноподобных гормональных молекул и обеспечивающих их функционирование систем, прослеживается на примере исследованных нами РИП моллюска A cygnea. В первую очередь, на это указывает множественность пептидных изоформ, обладающих инсулиновой и ИФР-подобной активностью, что можно считать свидетельством в пользу существования на ранних этапах филогенеза белка-предшественника общего для гормонов инсулинового суперсемейства.

Выявленная способность множественных изоформ РИП моллюска взаимодействовать с рецепторами инсулина и ИФР-I говорит о принципиальной возможности осуществления сходных с гормонами позвоночных эффектов, что свидетельствует о консервативности конкретных функциональных свойств, сохраненных в процессе эволюции.

Дальнейшее изучение функций и установление структуры РИП моллюска могут оказаться существенными как для понимания регуляторной роли этих нейропептидов, так и эволюции гормонов инсулинового суперсемейства.

ВЫВОДЫ

1. В цереброплевральных, педальных и висцеропариетальных ганглиях пресноводного моллюска Anodonta cygnea выявлены нейроны, содержащие пептиды, способные взаимодействовать с антителами к инсулину позвоночных. Расположение инсулин-иммунореактивных клеток не имело упорядоченности, характерной для более высокоорганизованных беспозвоночных животных. Результаты ПЦР-анализа по выявлению мРНК, кодирующих родственные инсулину пептиды моллюска, показали различия в экспрессии пептидов в отдельных видах ганглиев.

2. Родственные инсулину пептиды выделены из ганглиев моллюска A cygnea с применением оригинального метода ионообменной хроматографии используемого для получения инсулина. Очистка пептидов с помощью двуступенчатой высокоэффективной жидкостной хроматографии выявила 19 пептидных изоформ, различающихся по величине относительной гидрофобности (30-49 % концентрации ацетонитрила в сравнении с 39% инсулина), что косвенно отражает различия первичных структур отдельных изоформ.

3. Полученные РИП моллюска при тестировании в видоспецифичной радиолигандной системе инсулина проявили принципиальную способность взаимодействия с рецептором инсулина позвоночных, при этом отдельные пептидные изоформы значительно различались по степени сродства к рецептору инсулина (IC50 17-1700 нМ).

4. РИП моллюска при тестировании в радиолигандной системе ИФР-I проявили способность конкурировать за связывание с рецептором ИФР-I. Показано, что большинство пептидов моллюска взаимодействовали с рецептором ИФР-I с более высоким сродством, чем с рецептором инсулина.

5. РИП дозозависимо стимулировали активность аденилатциклазы и ГТФ-связывания в мышечной и нервной тканях моллюска, оказывая эффекты сопоставимые с инсулином и ИФР-I. При этом выявлена ткане- и видоспецифичность действия РИП Использование синтетических пептидов соответствующих С-концевым участкам альфа-субъединиц G-белков показало, что пептиды моллюска преимущественно действуют через G-белки стимулирующего типа сходным с инсулином и ИФР-1 образом.

6 Выявленный функциональный полиморфизм и предполагаемое структурное разнообразие РИП моллюска свидетельствуют в пользу того, что эти пептиды являются одной из ключевых точек дивергенции гормонов инсулинового суперсемейства

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Русаков Ю.И. Колычев А.П. Шипилов В.Н., Бондарева В.М. Инсулиноподобные

пептиды цереброплеврального ганглия моллюска Anodonta cygnea: выделение, очистка и в

радиолигандный анализ И Ж. эвол. биохим. физиол. 2003. Т. 39. № 4. С. 339-345.

2. Шпаков А.О., Шипилов В.Н., Бондарева В.М., Кузнецова JI.A., Плеснева С.А , Русаков Ю.И., Перцева М.Н. Регуляторное действие родственных инсулину нейропептидов моллюска Anodonta cygnea на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы // Нейрохимия. 2004. Т. 21. № 4. С250-259.

3. Русаков Ю.И., Колычев А.П., Шипилов В.Н., Бондарева В.М.Очистка и лиганд-рецепторный анализ инсулиноподобных пептидов педального ганглия моллюска Anodonta cygnea // Цитология. 2004. Т. 46. № 5. С. 442-447.

4. Шнпилов В.Н. Инсулиноподобные нейропептиды моллюска Anodonta cygnea L.: функциональные свойства и амплификация специфичных мРНК // Вест. мол. уч. 2004. Т. 2. С.36-42.

5. Shipilov V. N., Shpakov А. О., Rusakov Y. I. Pleiotropic action of insulin-like peptides of mollusk, Anodonta cygnea H Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005. V. 1040. P. 464-465.

6. Шпаков A.O., Шипилов B.H., Гурьянов И.А., Кузнецова Л.А., Бондарева В.М., Плеснева С. А., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы регуляторного действия биогенных аминов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы в нервных ганглиях моллюска Anodonta cygnea Н Докл акад. наук. 2005. Т. 401. №6. С. 829-832.

7. Shipilov Valerii, Rusakov Yurii. Purification and characterization of insulin-related peptides from different ganlia of bivalve mollusc Anodonta cygnea II Abstr. VII east European conference of the international society for invertebrate neurobiology, "Simple nervous systems Kaliningrad-Svetlogorsk-Otradnoe. 2003. P. 102.

8. Spakov Alexander, Shipilov Valerii. Regulation of adenylyl cyclase system of bivalve mollusk Anodonta cygnea ganglions by biogenic amines and peptide hormones. // Abstr. VII east European conference of the international society for invertebrate neurobiology, «Simple nervous systems». 2003. Kaliningrad-Svetlogorsk-Otradnoe. P. 103.

9. Shipilov V.N., Spakov A.O., Rusakov Yu. I. Pleutropic effects of insulin-related peptides isolated from mollusc Anodonta cygnea И Abst. for The 22nd Conference of European Comparative Endocrinologists. Upsala J. Med. Sci. Suppl. 2004. N. 56. P. 90. Uppsala, Sweden.

10. Шипилов B.H., Шпаков A.O., Русаков Ю.И. Функциональные особенности инсулино-подобных пептидов пресноводного моллюска Anodonta cygnea И Международная научная конференция «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. 2004. Петрозаводск. С. 152.

11. Шипилов В.Н., Бондарева В.М., Русаков Ю.И. Иммуноцитохимическая идентификация родственных инсулину нейропептидов в ганглиях моллюска Anodonta cygnea II Тез. VII Всероссийской конференции «Нейроэндокринология - 2005». 2005. С.-Петербург. С. 190.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 21.10.2005. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 60. Заказ 124Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: 550-40-14 Тел./факс: 247-57-76

Р20124

РНБ Русский фонд

2006-4 18097

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шипилов, Валерий Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ГОРМОНОВ СУПЕРСЕМЕЙСТВА ИНСУЛИНА ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ.

1.1.1. Семейство инсулина.

1.1.2. Семейство ИФР-1.!.

1.1.3. Семейство ИФР-И.

1.1.4. Семейство релаксина.

1.1.5. Сигнальные пути действия гормонов инсулинового суперсемейства.

1.2. ИНСУЛИНОПОДОБНЫЕ ПЕПТИДЫ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ.

1.2.1. Структурно-функциональная организация ИПП беспозвоночных.

1.2.2. Клетки нервной системы, продуцирующие ИПП.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ.

2.2. ВЫЯВЛЕНИЕ ИНСУЛИН-ИММУНОРЕАКТИВНЫХ КЛЕТОК В ГАНГЛИЯХ МОЛЛЮСКА ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИМ МЕТОДОМ.

2.3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ мРНК ИПП РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ.

2.4. ПОДБОР ПРАЙМЕРОВ И АМПЛИФИКАЦИЯ мРНК МОЛЛЮСКА С ПОМОЩЬЮ ПЦР-АНАЛИЗА.

2.5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РИП ИЗ НЕРВНОЙ ТКАНИ МОЛЛЮСКА.

2.6. ПОЛУЧЕНИЕ ФРАКЦИИ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ПЕЧЕНИ КРЫС.

2.7. ПОЛУЧЕНИЕ ГЕТЕРОГЕННОЙ ФРАКЦИИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН МОЗГА КРЫС.

2.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАНИЯ РИП МОЛЛЮСКА С РЕЦЕПТОРАМИ ИНСУЛИНА И ИФР-1.

2.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ И ГТФ-СВЯЗЫВАНИЯ В МЫШЕЧНОЙ И НЕРВНОЙ ТКАНЯХ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ В ГАНГЛИЯХ МОЛЛЮСКА НЕЙРОНОВ, СОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДЫ, РОДСТВЕННЫЕ ИНСУЛИНУ.

3.2. АМПЛИФИКАЦИЯ УЧАСТКОВ мРНК, ПРЕДПОЛОЖИТЕЛЬНО КОДИРУЮЩИХ РИП МОЛЛЮСКА.

3.3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РОДСТВЕННЫХ ИНСУЛИНУ ПЕПТИДОВ МОЛЛЮСКА.

3.4. ОЦЕНКА СПОСОБНОСТИ РИП МОЛЛЮСКА ВЗАИМОДЕЙСТВОВАТЬ С РЕЦЕПТОРАМИ ИНСУЛИНА И ИФР-1.

3.5. ВЛИЯНИЕ РИП МОЛЛЮСКА НА АКТИВНОСТЬ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ И ГТФ-СВЯЗЫВАНИЯ О-БЕЛКОВ.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. КЛЕТКИ, СИНТЕЗИРУЮЩИЕ РОДСТВЕННЫЕ ИНСУЛИНУ ПЕПТИДЫ В ГАНГЛИЯХ А СУвЫЕА.

4.2. ПРИРОДНЫЕ ВАРИАНТЫ ГОРМОНОВ ИНСУЛИНОВОГО СУПЕРСЕМЕЙСТВА КАК ОТРАЖЕНИЕ СТРУКТУРНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ПЕПТИДОВ.

4.3. ПЛЕЙОТРОПНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ НЕЙРОПЕПТИДОВ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ КАК ПРИЗНАК ДИВЕРГЕНЦИИ ФУНКЦИЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Обнаружение и характеристика инсулиноподобных пептидов нервной ткани моллюска Anodonta cygnea"

Актуальность проблемы. Обнаружение инсулина, инсулиноподобных факторов роста (ИФР), релаксина и их рецепторов в ЦНС позвоночных привело к изменению представлений о происхождении и роли гормонов инсулинового суперсемейства (Бондарева и др., 1988; Бондарева, Лейбуш, 1997; Havrankova et al., 1978а; Baskin et al., 1988; McKelvie et al., 1992; Sytze van Dam et al., 2004). Однако, несмотря на идентификацию и выявление экспрессии генов инсулиноподобных пептидов (ИПП) в нервной ткани, их биологические свойства и функции изучены недостаточно. Таким образом, установление природы и роли ИПП, синтезируемых нервной тканью, остается одной из актуальных проблем современной нейроэндокринологии.

Известно, что обнаруженные в нервной ткани гормоны инсулинового суперсемейства регулируют утилизацию глюкозы по аутокринному и паракринному типу, а также осуществляют в ЦНС нейромодуляторные и нейромедиаторные функции (Schwartz et al., 1992; Schwartz, 2000). В их компетенцию также входят некоторые анаболические и анти-апоптотические функции, контроль процессов роста, дифференцировки нейронов и синаптогенеза, участие в регуляции пищевого поведения и ряда когнитивных функций (Баркан и др.,1992; Schechter et al., 1999; Woods et al., 2000; Park, 2001; Carro et al., 2003; Bondy, Cheng, 2004; McGowan et al., 2005). Что касается нейрокринной продукции гормонов инсулинового суперсемейства, то она показана для ИФР и релаксина, тогда как сведения, позволяющие однозначно ответить на вопрос о синтезе инсулина в ЦНС позвоночных до сих пор отсутствуют (Plisetskaya et al., 1993). Синтез инсулина у позвоночных показан только в эмбриональной нервной ткани (Schechter et al., 1990; Devaskar et al., 1994).

Особенностью ИПП беспозвоночных является полиморфизм генов, кодирующих множественные изоформы, что практически не встречается у позвоночных. Число изоформ пептидов, синтезируемых нейронами отдельных видов, может колебаться от 2 (моллюск Aplysia californica) до 38 (нематода Caenorhabditis elegans). Различия аминокислотных последовательностей между изоформами могут превышать 50 %, что предполагает разнонаправленность их действия. Немногочисленные данные свидетельствуют о проявлении метаболических и рост-стимулирующих эффектов ИПП нервной ткани беспозвоночных, однако, регуляторная роль большинства известных пептидов во многом остается не выясненной (Claeys et al., 2002).

В данной работе впервые выявлена локализация инсулиноподобных пептидов в ганглиях пресноводного двустворчатого моллюска Anodonta cygnea, показана способность нейронов к их синтезу, проведены выделение и очистка из ганглиев пептидов, обозначенных нами как родственные инсулину пептиды (РИП), оценена способность полученных РИП связываться с рецепторами инсулина и ИФР-I, а также влияние пептидов на активность аденилатциклазной сигнальной системы, реализующей действие гормонов инсулинового суперсемейства.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось обнаружение и характеристика родственных инсулину пептидов в нервной ткани моллюска Апо^Ша су^еа.

В соответствии с этим в конкретные задачи входило:

1. Установить локализацию клеток, синтезирующих инсулиноподобные пептиды в ганглиях с помощью иммуногистохимического метода и показать присутствие мРНК, кодирующих пептиды моллюска.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Обнаружение в нервных ганглиях моллюска А. cygnea клеток, содержащих пептиды, взаимодействующие с антителами к инсулину позвоночных, позволяет констатировать, что в нейронах этого вида присутствуют субстанции родственные инсулину.

2. Выделение РИП из ганглиев А. су^пеа по оригинальной схеме получения инсулина и последующая ВЭЖХ очистка подтверждает присутствие в нервной ткани этого вида моллюска пептидов, сходных с инсулинами позвоночных.

3. Оценка способности РИП, полученных из ганглиев А. cygnea, взаимодействовать с рецепторами инсулина и ИФР-1 в специфичных радиолигандных тест-системах дает основание считать исследуемые пептиды функционально близкими к гормонам инсулинового суперсемейства. В тоже время, низкое относительное сродство

РИП моллюска к обоим типам рецепторов свидетельствует о значительных отличиях их структур от стандартных инсулина свиньи и ИФР-1 человека.

4. Способность РИП моллюска стимулировать активность аденилатциклазы и ГТФ-связывающей активности О-белков, оказывая сопоставимые с инсулином и ИФР-1 эффекты, указывает на возможность осуществления их регуляторных эффектов через аденилатциклазную сигнальную систему.

Научная новизна

1. Впервые выявлена локализация родственных инсулину пептидов в нервной системе моллюска А су^еа

3. Впервые проведена оценка биологических и функциональных свойств родственных инсулину пептидов, присутствующих в клетках ганглиев моллюска А су^иея.

Теоретическое и практическое значения работы

Выявление в нервной ткани моллюска А. судреа пептидов, обладающих свойствами, как инсулина, так и ИФР-1, является вкладом в развитие представлений об эндокринной функции нервной ткани и представляется важным для понимания генезиса и эволюции регуляторных систем, продуцирующих инсулиноподобные пептиды.

Характеристика биологических свойств РИП, полученных из ганглиев А. су%пеа в тест-системах млекопитающих позволяет приблизиться как к пониманию природы и роли этих субстанций, так и проиллюстрировать структурно-функциональную дивергенцию гормонов суперсемейства инсулина в филогенезе.

Апробация работы

Результаты исследования доложены на Седьмой региональной конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных (Калининград-Светлогорск-Отрадное, 2003); Международной научной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов (Петрозаводск, 2004); Двадцать второй конференции европейских сравнительных эндокринологов (Уппсала, Швеция, 2004); Седьмой Всероссийской конференции «Нейроэндокринология-2005» (С-Петербург, 2005).

Публикации

Личный вклад автора

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шипилов, Валерий Николаевич

ВЫВОДЫ

1. В цереброплевральных, педальных и висцеропариетальных ганглиях пресноводного моллюска АпойоШа су^еа выявлены нейроны, содержащие пептиды, способные взаимодействовать с антителами к инсулину позвоночных. Расположение инсулин-иммунореактивных клеток не имело упорядоченности, характерной для более высокоорганизованных беспозвоночных животных. Результаты ПЦР-анализа по выявлению мРНК, кодирующих родственные инсулину пептиды моллюска, показали различия в экспрессии ПЦР-продуктов в отдельных видах ганглиев.

2. Родственные инсулину пептиды выделены из ганглиев моллюска А. сурреа с применением оригинального метода ионообменной хроматографии используемого для получения инсулина. Очистка пептидов с помощью двуступенчатой высокоэффективной жидкостной хроматографии выявила 19 пептидных изоформ, различающихся по величине относительной гидрофобности (30-50 % концентрации ацетонитрила в сравнении с 39% инсулина), что косвенно отражает различия первичных структур отдельных изоформ.

4. РИП моллюска при тестировании в радиолигандной системе ИФР-1 проявили способность конкурировать за связывание с рецептором ИФР-1. Показано, что большинство пептидов моллюска взаимодействовали с рецептором ИФР-1 с более высоким сродством, чем с рецептором инсулина.

5. РИП дозозависимо стимулировали активность аденилатциклазы и ГТФ-связывания в мышечной и нервной тканях моллюска, оказывая эффекты сопоставимые с инсулином и ИФР-1. При этом выявлена ткане- и видоспецифичность действия РИП. Использование синтетических пептидов соответствующих С-концевым участкам альфа-субъединиц О-белков показало, что пептиды моллюска могут действовать как через О-белки стимулирующего типа (РИП1), так и через другие типы О-белков (РИП7).

6. Выявленный функциональный полиморфизм и предполагаемое структурное разнообразие РИП моллюска свидетельствуют в пользу того, что эти пептиды являются одной из ключевых точек дивергенции гормонов инсулинового суперсемейства.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из результатов настоящей работы следует, что, как и у других видов беспозвоночных, нервная ткань моллюска способна синтезировать РИП, которые обнаруживаются в клетках коркового слоя ганглиев. Неупорядоченное расположение этих клеток в отличие от более высокоорганизованных беспозвоночных позволяет говорить о присутствии у данного вида начального этапа развития системы синтезирующей инсулиноподобные пептиды.

С использованием хроматографических методов, из ганглиев А. су^га было выделено 19 изоформ РИП. Полученные РИП проявили способность связываться с рецепторами инсулина и ИФР-1 млекопитающих, что предполагает присутствие на данном этапе филогенеза инсулиноподобных молекул, обладающих ростовыми и метаболическими функциями. Однако более высокое сродство РИП к рецепторам ИФР-1 свидетельствует о преобладании у нейропептидов моллюска ростовой активности. Для дальнейшей характеристики выделенных пептидов было показано участие аденилатциклазной системы, в передаче гормонального сигнала РИП. Отдельные пептиды оказали дозозависимое стимулирование активности АД и ГТФ-связывания О-белков сходным с инсулином и ИФР-1 образом, что свидетельствует о консервативности механизмов передачи сигнала кодируемого ИПП в разных филетических линиях.

Становится все более очевидным, что молекулярная эволюция относительно небольших инсулиноподобных молекул и систем, обеспечивающих их функционирование, происходили в крайне детерминированных условиях, ограничивающих вариации структуры этих пептидов. Филогенетические изменения гормонов инсулинового суперсемейства можно условно разделить на «макро-» и «микроэволюционные». Макроуровень отражает изменения структуры пептидов, связанные с приобретением новых функций и затрагивающие не только гормон, но и структуры обеспечивающие передачу гормонального сигнала, что в конечном итоге приводит к появлению из общего пептида-предшественника инсулина, ИФР и релаксина. Микроуровень оперирует изменениями, как правило, не затрагивающими участки молекулы гормона, ответственные за связывающие места с рецептором, что позволяет пептиду сохранять принадлежность к определенному семейству.

Макро- и микроэволюционные модификации инсулиноподобных гормональных молекул и обеспечивающих их функционирование систем, прослеживается на примере исследованных нами РИП моллюска А. су^пеа. В первую очередь, на это указывает множественность пептидных изоформ, обладающих инсулиновой и ИФР-подобной активностью, что можно считать свидетельством в пользу существования на ранних этапах филогенеза белка-предшественника общего для гормонов инсулинового суперсемейства.

Выявленная способность множественных изоформ РИП моллюска взаимодействовать с рецепторами инсулина и ИФР-1 говорит о принципиальной возможности осуществления сходных с гормонами позвоночных эффектов, что свидетельствует о консервативности конкретных функциональных свойств, сохраненных в процессе эволюции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шипилов, Валерий Николаевич, Санкт-Петербург

1. Баркан Р. С., Бондарева В. М., Русаков Ю. И. Митогенное влияние инсулина, выделенного из мозга млекопитающих, на клетки Swiss ЗТЗ // Цитология. 1992. Т.34. С. 84-89.

2. Бландел Т., Джонсон Л. Кристаллография белка. М.: Мир. 1979. 620 С.

3. Бондарева В. М., Лейбуш Б. Н. Инсулин мозга и его рецепторы в условиях естественного голодания у рыб и круглоротых // Журн. эвол. биохим. и физиол. 1997. Т. 33. С. 23-28.

4. Бондарева В. М., Лейбуш Б. Н., Русаков Ю. И. Выделение инсулина из ткани мозга крыс и его биологическая характеристика // Нейрохимия. 1988. Т. 7. С. 268273.

5. Верещагин С. М., Лапицкий В. П. Нейрофизиология беспозвоночных. Л.: изд-во Ленингр. ун-та. 1982. 96 С.

6. Гребенщиков Ю. Б., Мошковский Ю. Ш. Физико-химические свойства, структура и функциональная активность инсулина. М.: «Биоорганическая химия» (Итоги науки и техники. ВИНИТИ АН СССР). 1986.Т. 7. 296 С.

7. Колычев А. П. Инсулиноподобный фактор роста II (ИФР-П). Место среди регуляторных пептидов суперсемейства инсулина // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2000. Т. 36. С. 69-82.

8. Лейбсон Л. Г. Успехи и проблемы эволюционной эндокринологии // Журн. эвол. биохим. и физиол. 1981. Т. 17. С. 116-126.

9. Лейбуш Б. Н., Чистякова О. В. Рецептор инсулиноподобного фактора роста-1 в тканях моллюска Anodonta cygnea II Журн. эвол. биохим. и физиол. 2003. Т. 39. С. 128-133.

10. Осадчук М.А., Киричук В.Ф., Кветной И.М. Диффузная нейроэндокринная система: общебиологические и гастроэнтерологические аспекты. Саратов : изд-во Саратовского мед. ун-та. 1996. 128 С.

11. Перцева М. Н, Шпаков А. О. Консервативность инсулиновой сигнальной системы в эволюции беспозвоночных и позвоночных животных // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2002. Т. 38. С. 430-441.

12. Перцева М. Н., Шпаков А. О., Плеснева С. А. Современные достижения в изучении сигнальных механизмов действия инсулина и родственных ему пептидов //Журн. эвол. биохим. и физиол. 1996. Т. 32. С. 318-339.

13. Русаков Ю. И., Бондарева В. М., Карасев В. С., Лейбуш Б. Н., Баркан Р. С., Перцева М. Н. Некоторые биохимические характеристики инсулиноподобного вещества двустворчатого моллюска Anodonta cygnea II Биохимия. 1991. Т. 56. С. 718-726.

14. Русаков Ю.И., Бондарева В.М. Выделение и очистка инсулинов горбуши Oncorhynchus gorbuscha и минтая Theragra chalcogramma. 1979. Журн. эвол. биохим. физиол. Т. 15. С. 136-140.

15. Adamo М., Roberts С. Т. Jr., LeRoith D. How distinct are the insulin and insulinlike growth factor I signalling systems? // Biofactors. 1992. V. 3. P. 151-157.

16. Ailion M., Inoue Т., Weaver С. I., Holdcraft R. W., Thomas J. H. Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans II Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999. V. 96. P. 7394-7397.

17. Amoui M, Craddock B.P., Miller W.T. Differential phosphorylation of IRS-1 by insulin and insulin-like growth factor I receptors in Chinese hamster ovary cells // J. Endocrinol. 2001. V. 171. P. 153-162.

18. Baccari, M. C., Calamai F. Relaxin: new functions for an old peptide // Curr. Protein Pept. Sci. 2004. V. 5. P. 9-18.

19. Baker J., Liu J-P., Robertson E. J., Efstratiadis A. Role of insulin-like growth factors in embryonic and postnatal growth // Cell. 1993. V. 75. P. 73-82.

20. Barbieri M., Bonafe M., Franceschi C., Paolisso G. Insulin/IGF-I-signaling pathway: an evolutionarily conserved mechanism of longevity from yeast to humans // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2003. V. 285. P. 1064-1071.

21. Baron V., Kaliman P., Gautier N., Van Obberghen E. The insulin receptor activation process involves localized conformations changes // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 23290-23294.

22. Baskin D. G., Wilcox B. J., Figlewicz D. P., Dorsa D. M. Insulin and insulin-like growth factors in the CNS // Trends Neurosci. 1988. V. 11. P. 107-111.

23. Bathgate R. A., Samuel C. S., Burazin T. C., Gundlach A. L., Tregear G. W. Relaxin: new peptides, receptors and novel actions // Trends Endocrinol. Metab. 2003. V. 14. P. 207-213.

24. Baxter R. C. Insulin-like growth factor binding proteins in the human circulation: a review // Horm. Res. 1994. V. 42. P. 140-144.

25. Bedarkar S., Turnell W. G., Blundell T. L., Schwabe C. Relaxin has conformational homology with insulin //Nature. 1977. V. 270. P. 449-451.

26. Blundell T. L., Bedarkar S., Humbel R. E. Tertiary structures, receptor binding, and antigenicity of insulin like growth factors // Fed. Proc. 1983. V. 42. P. 2592-2597.

27. Blundell T. L., Bedarkar S., Rinderknecht E., Humbel R. E. Insulin-like growth factor: a model for tertiary structure accounting for immunoreactivity and receptor binding // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1978. V. 75. P. 180-184.

28. Bondy C. A., Cheng C. M. Signaling by insulin-like growth factor 1 in brain // Eur. J. Pharmacol. 2004. V. 490. P. 25-31.

29. Brogiolo W., Stocker H., Ikeya T., Rintelen F., Fernandez R., Hafen E. An evolutionarily conserved function of the Drosophila insulin receptor and insulin-like peptides in growth control // Curr. Biol. 2001. V. 11. P. 213-221.

30. Bryant-Greenwood G. D., Schwabe C. Human relaxins: chemistry and biology // Endocr. Rev. 1994. V. 15. P. 5-26.

31. Burazin T. C., Bathgate R. A., Macris M., Layfield S., Gundlach A. L., Tregear G. W. Restricted, but abundant, expression of the novel rat gene-3 (R3) relaxin in the dorsal tegmental region of brain // J. Neurochem. 2002. V. 82. P. 1553-1557.

32. Butler A.A., Yakar S, Gewolb I.H., Karas M, Okubo Y, LeRoith D. Insulin-like growth factor-I receptor signal transduction: at the interface between physiology and cell biology. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 1998. V. 121. P. 19-26.

33. Cao Q-P., Duguay S. J., Plisetskaya E. M., Steiner D. F., Chan S. J. Nucleotide sequence and growth hormone regulated expression of salmon insulin-like growth factor-I mRNA // Mol. Endocrinol. 1989. V. 3. P. 2005-2010.

34. Carro E, Trejo J. L, Nunez A, Torres-Aleman I. Brain repair and neuroprotection by serum insulin-like growth factor I // Mol. Neurobiol. 2003. V. 27. P. 153-162.

35. Chan C., Brown M. R. Localization of an insulin-like peptide in brains of two flies. // Cell Tissue Res. 2001. V. 304. P. 317-321.

36. Chan S. J., Nagamatsu S., Cao Q-P., Steiner D. F. Structure and evolution of insulin-like growth factors in chordates // Prog. Brain Res. 1992. V. 92. P. 15-24.

37. Chassin D., Laurent A., Janneau J.L., Berger R., Bellet D. Cloning of a new member of the insulin gene superfamily (INSL4) expressed in human placenta // Genomics. 1995. V. 29. P. 465-470.

38. Chen C., Jack J., Garofalo R. S. The Drosophila insulin receptor is required for normal growth//Endocrinology. 1996. V. 137. P. 846-856.

39. Claeys I., Simonet G., Poels J., Van Loy T., Vercammen L., De Loof A., Vanden Broeck J. Insulin-related peptides and their conserved signal transduction pathway // Peptides. 2002. V. 23. P. 807-816.

40. Clancy D. J., Gems D., Harshman L. G., Oldham S., Stacker H., Hafen E., Leevers S. J., Partridge L. Extension of life-span by loss of CHICO\^Drosophila insulin receptor substrate protein // Science. 2001. V. 292. P. 104-106.

41. Collip J. B. The demonstration of an insulin-like substance in the tissues of the clam

42. Myct arenaria) II J. Biol. Chem. 1923. V. 55. P. 39-39.

43. Conklin D., Lofton-Day C. E., Haldeman B. A., Ching A., Whitmore T. E., Lok S., Jaspers S. Identification of INSL5, a new member of the insulin superfamily // Genomics. 1999. V. 60. P. 50-56.

44. Conlon J. M. Evolution of the insulin molecule: insight into structure-activity and phylogenetic relationships // Peptides. 2001. V. 22. P. 1183-1193.

45. Conlon J. M., Bondareva V., Rusacov Y., Plisetskaya E. M., Mynarcik D. C., Whittaker J. Characterization of insulin, glucagon and somatostatin from river lamprey, Lampetra fluviatilis II Gen. Comp. Endocrinol. 1995. V. 100. P. 96-105.

46. Conn P. J, Kazmareck L. K. The bag cell neurons of Aplysia. Mol. Neurobiol. 1989. V. 3. P. 237-273.

47. Conover C. A. In vitro studies of insulin-like growth factor I and bone // Growth Horm. IGF Res. 2000. Y. 10. P. 107-110.

48. Constancia M., Hemberger M., Hughes J., Dean W., Ferguson-Smith A., Fundele R., Stewart F., Kelsey G., Fowden A., Sibley C., Reik W. Placental-specific IGF-II is a major modulator of placental and fetal growth // Nature. 2002. V. 417. P. 945-948.

49. Cooke R. M, Harvey T. S, Campbell I. D. Solution structure of human insulin-like growth factor 1: a nuclear magnetic resonance and restrained molecular dynamics study // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 5484-5491.

50. Daughaday W. H, Rotwein P. Insulin-like growth factors I and II. Peptide, messenger ribonucleic acid and gene structures, serum, and tissue concentrations // Endocr. Rev. 1989. V. 10. P. 68-91.

51. D'Ercole A. J., Ye P., O'Kusky J. R. Mutant mouse models of insulin-like growth factor actions in the central nervous system // Neuropeptides. 2002. V. 36. P. 209-220.

52. Devaskar S.U., Giddings S.J., Rajakumar P.A., Carnaghi L.R., Menon R.K., Zahm D.S. Insulin gene expression and insulin synthesis in mammalian neuronal cells // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 8445-8454.

53. Duguay S. J., Chan S. J., Mommsen T. P., Steiner D. F. Divergence of insulin-like growth factors I and II in the elasmobranch, Squalus acanthias IIFEBS Lett. 1995. V. 71. P. 69-72.

54. Duguay S. J., Milewski W. M., Young B. D., Nakayama K., Steiner D. F. Processing of wild-type and mutant proinsulin-like growth factor-IA by subtilisin-related proprotein convertases // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 6663-6670.

55. Dupont J., Holzenberger M. Biology of insulin-like growth factors in development // Birth Defects Res. Part C: Embryo Today. 2003. V. 69. P. 257-271.

56. Duret L., Guex N., Peitsch M. C., Bairoch A. New insulin-like proteins with atypical disulfide bond pattern characterized in Caenorhabditis elegans by comparative sequence analysis and homology modeling // Genom Res. 1998. V. 8. P. 348-353.

57. Fawcett J., Rabkin R. The processing of insulin-like growth factor-I (IGF-I) by a cultured kidney cell line is altered by IGF-binding protein-3 // Endocrinology. 1995. V. 136. P. 1340-1347.

58. Ferlin A., Foresta C. Insulin-like factor 3: a novel circulating hormone of testicular origin in humans //Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005. V. 1041. P. 497-505.

59. Fernandez R., Tabarini D., Azpiazu N., Frasch M., Schlessinger J. The Drosophila insulin receptor homolog: a gene essential for embryonic development encodes two receptor isoforms with different signaling potential // EMBO J. 1995. V. 14. P. 33733384.

60. Fernandez-Almonacid R., Rosen O. M. Structure and ligand specificity of the Drosophila melanogaster insulin receptor // Mol. Cell. Biol. 1987. V. 7. P. 2718-2727.

61. Fullbright G., Lacy E. R., Bullesbach E. E. Bombyxin: an insect neurohormone targets the ovaries in Lepidoptera // SAAS Bull. Biochem. Biotechnol. 1997a. V. 10. P. 37-41.

62. Fullbright G., Lacy E. R., Bullesbach E. E. The prothoracicotropic hormone bombyxin has specific receptors on insect ovarian cells // Eur. J. Biochem. 1997b. V. 245. P. 774-780.

63. Garofalo R. S., Rosen O. M. Tissue localization of Drosophila melanogaster insulin receptor transcripts during development // Mol. Cell. Biol. 1988. V. 8. P. 1638-1647.

64. Gerisch B., Weitzel C., Kober-Eisermami C., Rottiers V., Antebi A. A hormonal signaling pathway influencing C. elegans metabolism, reproductive development, and life span//Dev. Cell. 2001. V. 1. P. 841-851.

65. Gerozissis K. Brain insulin: regulation, mechanisms of action and functions // Cell. Mol. Neurobiol. 2003. V. 23. P. 1-25.

66. Gregoire F. M., Chomiki N., Kachinskas D., Warden C. H. Cloning and developmental regulation of a novel member of the insulin-like gene family in Caenorhabditis elegans II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 249. P. 385-390.

67. Guo Z. Y., Jia X. Y., Feng Y. M. Replacement of the interchain disulfide bridge-forming amino acids A7 and B7 by glutamate impairs the structure and activity of insulin //Biol. Chem. 2004.V. 385. P. 1171-1175.

68. Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity // Brain Res. 1975. V. 93. P. 485-489.

69. Havrankova J., Schmechel D., Roth J., Brownstein M. Identification of insulin in rat brain // Proc. Nat. Acad. Sci. 1978a. V. 75. P. 5737-5741.

70. Havrankova J., Roth J., Brownstein M. Insulin receptors are widely distributed in the central nervous system of the rat //Nature. 1978b. V. 272. P. 827-829.

71. Hawkes C., Kar S. The insulin-like growth factor-II/mannose-6-phosphate receptor: structure, distribution and function in the central nervous system // Brain Res. Rev. 2004. V. 44. P. 117-140.

72. Hayes E. S. Biology of primate relaxin: a paracrine signal in early pregnancy? // Reprod. Biol. Endocrinol. 2004. V. 2. P.36.

73. Heidenreich K. A., Zahniser N. R., Berhanu P., Brandenburg D., Olefsky J. M. Structural differences between insulin receptors in the brain and peripheral target tissues //J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 8527-8530.

74. Hetra C., Li K. W., Bulet P., Lagueux M., Hoffman J. A. Isolation and structural characterization of an insulin-related molecule, a predominant neuropeptide from Locusta migratoria II Eur. J. Biochem. 1991. V. 201. P. 495-499.

75. Hisaw F. L. Experimental relaxation of the pubic ligament of the guinea pig // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1926. V. 23. P. 661-663.

76. Hodgkin D. C. Insulin molecules: the extend our knowledge // Pure a. Appl. Chem. 1971. V. 26. P. 375-384.

77. Hua Q., Nagasawa S. H., Wilken J., Ramos R. R., Jia W., Bass J., Weiss M. A. A divergent INS protein in Caenorhabditis elegans structurally resembles human insulin and activates the human insulin receptor // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 826-831.

78. Ikeya T., Galic M., Belawat P., Nairz K., Hafen E. Nutrient-dependent expression of insulin-like peptides from neuroendocrine cells in the CNS contributes to growth regulation in Drosophila // Curr. Biol. 2002. V. 12. P. 1293-1300.

79. Ishizaki H., Suzuki A. The brain secretory peptides that control moulting and metamorphosis of the silkmoth Bombyx mori II Int. J. Dev. Biol. 1994.V. 38. P. 301-310.

80. Ivell R, Anand-Ivell R, Bartsch O. Relaxin signaling from natural receptors // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005a. V. 1041. P. 280-287.

81. Ivell R., Bathgate R. A. Reproductive biology of the relaxin-like factor (RLF/INSL3) // Biol. Reprod. 2002. V. 67. P. 699-705.

82. Ivell R., Einspanier A. Relaxin peptides are new global players // Trends Endocrinol. Metab. 2002. V. 13. P. 343-348.

83. Ivell R., Hartung S., Anand-Ivell R. Insulin-like factor 3: where are we now? // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005b. V. 1041. P. 486-496.

84. Iwami M., Furuya I., Kataoka H. Bombyxin-related peptides: cDNA structure and expression in the brain of the hornworm Agrius convolvili II Insect. Biochem. Mol. Biol. 1996. V. 26. P. 25-32.

85. Jonas E. A., Knox R. J., Kaczmarek L. K., Schwartz J. H., Solomon D. H. Insulin receptor in Aplysia neurons: characterization, molecular cloning, and modulation of ion currents // J. Neurosci. 1996. V. 16. P. 1645-1658.

86. Jonas E. A., Knox R. J., Smith T. C., Wayne N. L., Connor J. A., Kaczmarek L. KRegulation by insulin of a unique neuronal Ca2+ pool and of neuropeptide secretion // Nature. 1997. V. 385. P. 343-346.

87. Jones J. I, Clemmons D. R. Insulin-like growth factors and their binding proteins: biological actions // Endocr. Rev. 1995. V. 16. P. 3-34.

88. Kahn C. R. The molecular mechanism of insulin action. Annu Rev Med. 1985. V. 36. P. 429-451.

89. Kavsan V. M, Petrenko O. I. Evolution of insulin genes and their introns // Folia Biol. 1984. Y. 30. P. 65-71.

90. Kawano T., Ito Y., Ishiguro M., Takuwa K., Nakajima T., Kimura Y. Molecular cloning and characterization of a new insulin/IGF-like peptide of the nematode Caenorhabditis elegans II Biochem. Biophys. Res. Com. 2000. V. 273. P. 431-436.

91. Khandwala H. M, McCutcheon I. E., Flyvbjerg A., Friend K. E.The effects of insulin-like growth factors on tumorigenesis and neoplastic growth // Endocr. Rev. 2000. V. 21 P. 215-244.

92. Kidwai A. M., Radcliffe M. A., Lee E. Y., Daniel E. E. Isolation and properties of skeletal muscle plasma membrane // Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 298. P. 593-607.

93. Kimura K. D., Tissenbaum H. A., Liu Y., Ruvkun G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans II Science. 1997. V. 277. P. 942-946.

94. Kimura-Kawakami M., Iwami M., Kawakami A., Nagasawa H., Suzuki A., Ishizaki H. Structure and expression of bombyxin-related peptide genes of the moth Samia cynthia ricini II Gen. Comp. Endocrinol. 1992. V. 86. P. 257-268.

95. Krieger M. J., Jahan N., Riehle M. A., Cao C., Brown M. R. Molecular characterization of insulin-like peptide genes and their expression in the African malaria mosquito, Anopheles gambiae II Insect Mol. Biol. 2004. V. 13. P. 305-315.

96. Kuznetsova L, Plesneva S, Deqabina N, Omeljaniuk E, Pertseva M. On the mechanism of relaxin action: the involvement of adenylyl cyclase signalling system // Regul. Pept. 1999. V. 80. P. 33-39.

97. Lagueux M., Lwoff L., Meister M., Goltzene F., Hoffmann J. A. cDNAs from neurosecretory cells of brains of Locusta migratoria (Insecta, Orthoptera) encoding a novel member of the superfamily of insulins // Eur. J. Biochem. 1990. V. 187. P. 249-254.

98. Leevers S. J. Growth control: Invertebrate insulin surprises! // Current Biol. 2001. V. 11. P. 209-212.

99. LeRoith D., Baserga R., Helman L., Roberts C. T. Jr. Insulin-like growth factors and cancer // Arm. Intern. Med. 1995. V. 122. P. 54-59.

100. LeRoith D., Lesniak M. A., Roth J. Insulin in insects and annelids // Diabetes. 1981. V. 30. P. 70-76.

101. LeRoith D., Shiloach J., Heffron R., Rubinovitz C., Tanenbaum R., Roth J. Insulin-related material in microbes: similarities and differences from mammalian insulins // Can. J. Biochem. Cell. Biol. 1985. Y. 63. P. 839-849.

102. Li K. W., Geraerts W. P. M. Isolation and chemical characterization of a novel insulin-related neuropeptide from the freshwater snail, Lymnea stagnalis // Eur. J. Biochem. 1992. V. 205. P. 675-678.

103. Li W., Kennedy S. G., Ruvkun G. daf-28 encodes a C. elegans insulin superfamily member that is regulated by environmental cues and acts in the DAF-2 signaling pathway // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 844-858.

104. Liu C, Chen J, Sutton S, Roland B, Kuei C, Farmer N, Sillard R, Lovenberg TW. Identification of relaxin-3/INSL7 as a ligand for GPCR142 //J. Biol. Chem. 2003.V. 278. P. 50765-50770.

105. Lomedico P., Rosenthal N., Efstratidadis A., Gilbert W., Kolodner R., Tizard R. The structure and evolution of the two nonallelic rat preproinsulin genes // Cell. 1979. V. 18. P. 545-558.

106. Lowry O. H., Rosenbrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurements with folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

107. Marin-Hincapie M., Garofalo R. S. The carboxyl terminal extension of the Drosophila insulin receptor homologue binds IRS-1 and influences cell survival // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 24987-24994.

108. Masumura M., Satake S., Saegusa H., Mizoguchi A. Glucose stimulates the release of bombyxin, an insulin-related peptide of the silkworm Bombyx mori II Gen. Comp. Endocrinol. 2000. V. 118. P. 393-399.

109. Mathews L. S., Norstedt G., Palmiter R. D. Regulation of Insulin-Like Growth Factor I Gene Expression by Growth Hormone // PNAS. 1986. V. 83. P. 9343-9347.

110. McCulloch D., Gems D. Body size, insulin/IGF signaling and aging in the nematode Caenorhabditis elegans II Exp. Gerontol. 2003. V. 38. P. 129-136.

111. McGowan B.M., Stanley S.A., Smith K.L., White N.E., Connolly M.M., Thompson E.L., Gardiner J.V., Murphy K.G., Ghatei M.A., Bloom S.R. Central relaxin-3 administration causes hyperphagia in male Wistar rats // Endocrinology. 2005. V. 146. P. 3295-3300.

112. Mclntire W. E., MacCleery G., Garrison J. C. The G protein beta subunit is a determinant in the coupling of Gs to the beta 1-adrenergic and A2a adenosine receptors // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 15801-15809.

113. McKelvie P. A., Rosen K. M., Kinney H. C., Villa-Komaroff L. Insulin-like growth factor II expression in the developing human brain // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1992. V. 51. P. 464-471.

114. Meglasson M. D., Matschinsky M. F. Pancreatic islet glucose metabolism and regulation of insulin secretion // Diabetes Metab. 1986. V. 2. P. 163-214.

115. Meneses P., De los Angeles Ortiz M. A protein from Drosophila melanogaster with insulin-like activity // Comp. Biochem. Physiol. 1975. V. 51. P. 483-485.

116. Murray-Rust J., McLeod A. N., Blundell T. L., Wood S. P. Structure and evolution of insulins: implications for receptor binding // Bioessays. 1992. V. 14 P. 325-331.

117. Nakae J., Kido Y., Accili D. Distinct and overlapping functions of insulin and IGF-I receptors //Endocr. Rev. 2001. V. 22. P. 818-835.

118. Neville D. M. Jr. Isolation of an organ specific protein antigen from cell-surface membrane of rat liver // Biochim. Biophys. Acta. 1968. V. 154. P. 540-552.

119. Nijhout H. F., Grunert L. W. Bombyxin is a growth factor for wing imaginal disks in Lepidoptera // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 15446-15450.

120. O'Dell S. D., Day I. N. Insulin-like growth factor II (IGF-II) // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1998. V. 30. P. 767-771.

121. Ohlsson C., Sjogren K., Jansson J. O., Isaksson O. G. The relative importance of endocrine versus autocrine/paracrine insulin-like growth factor-I in the regulation of body growth // Pediatr. Nephrol. 2000. V. 14. P. 541-543.

122. Oldham S., Stocker H., Laffargue M., Wittwer F., Wymann M., Hafen E. The Drosophila insulin/IGF receptor controls growth and size by modulating PtdInsP(3) levels // Development. 2002. Y. 129. P. 4103-4109.

123. Osheroff P. L., Ling V. T., Vandlen R. L., Cronin M. J., Lofgren J. A. Preparation of biologically active 32P-labeled human relaxin. Displaceable binding to rat uterus, cervix, and brain 11 J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 9396-9401.

124. Panchenko M. P., Hoffenberg S. I., Tkachuk V. A. Purification and some properties of GTP-binding proteins from pig heart plasma membranes // Biomed. Biochim. Acta. 1987. V. 46. P. 452-455.

125. Park C.R. Cognitive effects of insulin in the central nervous system // Neurosci. Biobehav. Rev. 2001. V. 25. P. 311-323.

126. Perks C. M., Peters A. R., Wathes D. C. Follicular and luteal expression of insulinlike growth factors I and II and the type 1 IGF receptor in the bovine ovary // J. Reprod. Fertil. 1999. V. 116. P. 157-165.

127. Plisetskaya E. M., Bondareva V. M., Duan C., Duguay S. J. Does salmon brain produce insulin? // Gen Comp.Endocrinol. 1993. V. 91. P. 74-80.

128. Polak J. M., Van Noorden S /(eds.) Immunocytochemistry, practical applications in pathology and biology. Bristol.: John Wright and Sons. 1983.

129. Porte D. Jr., Baskin D. G., Schwartz M. W. Insulin signaling in the central nervous system: a critical role in metabolic homeostasis and disease from C. elegans to humans // Diabetes. 2005. V. 54. P. 1264-1276.

130. Rajah R., Khare A., Lee P. D., Cohen P. Insulin-like growth factor-binding protein-3 is partially responsible for high-serum-induced apoptosis in PC-3 prostate cancer cells // J. Endocrinol. 1999. V. 163. P. 487-494.

131. Recio-Pinto E., Ishii D. N. Effects of insulin, insulin-like growth factor-II and nerve growth factor on neurite outgrowth in cultured human neuroblastoma cells // Brain Res. 1984. V. 302. P. 323-334.

132. Riehle M. A., Brown M. R. Insulin stimulates ecdysteroid production through a conserved signaling cascade in the mosquito Aedes aegypti // Insect Biochem. Mol. Biol. 1999. V. 29. P. 855-860.

133. Riehle M. A., Brown M. R. Insulin receptor expression during development and a reproductive cycle in the ovary of the mosquito Aedes aegypti II Cell Tissue Res. 2002. V. 308. P. 409-420.

134. Riehle M. A., Brown M. R. Molecular analysis of the serine/threonine kinase Akt and its expression in the mosquito Aedes aegypti II Insect Mol. Biol. 2003. V. 12. P. 225232.

135. Riehle M. A., Garczynski S. F., Crim J. W., Hill C. A., Brown M. R. Neuropeptides and peptide hormones in Anopheles gambiae II Science. 2002. V. 298. P. 172-175.

136. Rinderknecht E., Humbel R. E. The amino acid sequence of human insulin-like growth factor-I and its structural homology with proinsulin // J. Biol. Chem. 1978a. V. 253. P. 2769-2776.

137. Rinderknecht E., Humbel R. E. Primary structure of human insulin-like growth factor-II // FEBS. Lett. 1978b. V. 89. P. 283-286.

138. Robitzki A., Schroder H. C., Ugarkovic D., Pfeifer K., Uhlenbruck G., Muller W. E. Demonstration of an endocrine signaling circuit for insulin in the sponge Geodia cydonium If EMBO J. 1989. V. 8. P. 2905-2909.

139. Roovers E., Vincent M. E., van Kesteren E., Geraerts W. P., Planta R. J., Vreugdenhil E., van Heerikhuizen H. Characterization of a putative molluscan insulin-related peptide receptor // Gene. 1995. V. 162. P. 181-188.

140. Rosen C. J. Serum insulin-like growth factors and insulin-like growth factor-binding proteins: clinical implications // Clin. Chem. 1999. V. 45. P. 1384-1390.

141. Ruan Y. C., Chen Y., Garofalo R. S. The Drosophila insulin receptor contains a novel carboxyl-terminal extention likely to play an important role in signal transduction // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 4236-4243.

142. Rusakov Y. I., Moriyama S., Bondareva V. M., Kolychev A. P., Amemiya Y., Yasuda A., Kawauchi H. Isolation and characterization of insulin in Russian sturgeon Acipenser guldenstaedti II J. Peptide Res. 1998. V. 51. P. 395-400.

143. Rusakov Yu. I., Karasev V. S., Bondareva V. M., Pertseva M. N., Pankov Yu. A. Isolation, primary structure, and biological and immunological properties of pink and chum salmon insulins // Comp. Biochem. Physiol. 1990. V. 95. P. 477-482.

144. Salomon Y., Londos C., Rodbell M. A highly sensitive adenylate cyclase assay // Anal. Biochem. 1974. V. 58. P. 541-548.

145. Sanger F. Chemistry of insulin // Science. 1959. V.129. P. 1340-1344.

146. Schechter R, Abboud M, Johnson G. Brain endogenous insulin effects on neurite growth within fetal rat neuron cell cultures // Brain Res. Dev. Brain Res. 1999.V. 116. P. 159-167.

147. Schechter R., Sadiq H. F., Devaskar S. U. Insulin and insulin mRNA are detected in neuronal cell cultures maintained in an insulin-free/serum-free medium // J. Histochem. Cytochem. 1990. V. 38. P. 829-836.

148. Schulingkamp R. J., Pagano T. C., Hung D., Raffa R. B. Insulin receptors and insulin action in the brain: review and clinical implications // Neurosci. Biobehav. Rev. 2000. V. 24. P. 855-872.

149. Schwabe C., Bullesbach E. E. Relaxin: structures, functions, promises, and nonevolution // FASEB J. 1994. V. 8. P. 1152-1160.

150. Schwabe C., McDonald J. K. Relaxin: a disulfide homolog of insulin // Science. 1977. V. 197. P. 914-915.

151. Schwartz M. W. Biomedicine. Staying slim with insulin in mind // Science. 2000. V. 289. P. 2066-2067.

152. Schwartz M. W. Figlewicz D. P. Baskin D. G. Woods S. C., Porte D. Jr. Insulin in the brain: a hormonal regulator of energy balance // Endocrine Rev. 1992. V. 13. P. 387414.

153. Sherwood O. D. Relaxin's physiological roles and other diverse actions // Endocr. Rev. 2004. V. 25. P. 205-234.

154. Shingleton A. W., Das J., Vinicius L., Stern D. L. The temporal requirements for insulin signaling during development in Drosophila // PLoS Biol. 2005. V. 3. P. 16071617.

155. Skorokhod A., Gamulin V., Gundacker D., Kavsan V., Muller I. M., Muller W. E. Origin of insulin receptor-like tyrosine kinases in marine sponges // Biol. Bull. 1999. V. 197. P. 198-206.

156. Smit A. B., Vreugdenhil E., Ebberink R. H., Geraerts W. P., Klootwijk J., Joosse J. Growth-controlling molluscan neurons produce the precursor of an insulin-related peptide //Nature. 1988. V. 331. P. 535-538.

157. Soares M. B., Schon E., Henderson A., Karathanasis S. K., Cate R., Zeitlin S., Chirgwin J., Efstratiadis A. RNA-mediated gene duplication: the rat preproinsulin I gene is a functional retroposon // Mol. Cell. Biol. 1985. V. 5. P. 2090-2103.

158. Sossin W.S., Chen C.S., Toker A. Stimulation of an insulin receptor activates and down-regulates the Ca2+-independent protein kinase C, Apl II, through a Wortmannin-sensitive signaling pathway in Aplysia // J. Neurochem. 1996. V. 67. P. 220-228.

159. Steiner D. F., Chan S. J., Welsh J. M., Kwok S. C. Structure and evolution of the insulin gene // Annul. Rev. Genet. 1985. V. 19. P. 463-484.

160. Steinetz B. G., Schwabe C., Callard I. P., Goldsmith L. T. Dogfish shark (Squalus acanthias) testes contain a relaxin // J. Androl. 1998. V. 19. P. 110-115.

161. Summerlee A. J., Ramsey D. G., Poterski R. S. Neutralization of relaxin within the brain affects the timing of birth in rats // Endocrinology. 1998. V. 139. P. 479-484.

162. Sunn N., McKinley M. J., Oldfield B. J. Identification of efferent neural pathways from the lamina terminalis activated by blood-borne relaxin // J. Neuroendocrinol. 2001. V. 13. P. 432-437.

163. Sytze van Dam P., Aleman A. Insulin-like growth factor-I, cognition and brain aging // Eur. J. Pharmacol. 2004. V. 490. P. 87-95.

164. Tatar M. The neuroendocrine regulation of Drosophila aging // Exp. Gerontol. 2004. V. 39. P. 1745-1750.

165. Tatar M., Kopelman A., Epstein D., Tu M. P., Yin C. M., Garofalo R. S. A mutant Drosophila insulin receptor homolog that extends life-span and impairs neuroendocrine function // Science. 2001. V. 292. P. 107-110.

166. Terasawa H., Kohda D., Hatanaka H., Nagata K., Higashihashi N., Fujiwara H., Sakano K., Inagaki F. Solution structure of human insulin-like growth factor II; recognition sites for receptors and binding proteins // EMBO J. 1994. V. 13. P. 55905597.

167. Tissenbaum H. A., Ruvkun G. An insulin-like signaling pathway affects both longevity and reproduction in Caenorhabditis elegans // Genetics. 1998. V. 148. P. 703717.

168. Torres A. M., Forbes B. E., Aplin S. E., Wallace J. C., Francis G. L., Norton R. S. Solution structure of human insulin-like growth factor II. Relationship to receptor and binding protein interactions // J. Mol. Biol. 1995. V. 248. P. 385-401.

169. Ullrich A., Gray A., Tam A. W., Yang-Feng T., Tsubokawa M., Collins C., Henzel W., Le Bon T., Kathuria S., Chen E., Jacobs S., Franke U., Ramachandran J., Fujita

170. Yamaguichi Y. Insulin-like growth factor I receptor primary structure: comparison with insulin receptor suggests structural determinants that define functional specificity // EMBO J. 1986. V. 5. P. 2503-2512.

171. Van den Berghe G. How does blood glucose control with insulin save lives in intensive care? // J. Clin. Invest. 2004. V. 114. P. 1187-1195.

172. Van Minnen J., Reichelt D., Lodder J. C. An ultrastructural study of the neurosecretory canopy cell of the pond snail Lymnaea stagnalis (L.), with the use of the horseradish peroxidase tracer technique // Cell Tissue Res. 1979. V. 204. P. 453-462.

173. Van Minnen J., Schallig H. Demonstration of insulin-related substances in the central nervous system of pulmonates and Aplysia californica II Cell Tiss. Res. 1990. V. 260. P. 381-386.

174. Van Obberghen E. Signalling through the insulin receptor and the insulin-like growth factor-I receptor // Diabetologia. 1994. V. 37. P. 125-134.

175. Wentworth B. M., Schaefer I. M., Villa-Komaroff L., Chirgwin J. M. Characterization of the two nonallelic genes encoding mouse preproinsulin // J. Mol. Evol. 1986. V. 23. P. 305-312.

176. White M. F., Kahn C. R. The insulin signaling system // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 1-4.

177. Winslow J. W., Shih A., Bourell J. H., Weiss G., Reed B., Stults J. T., Goldsmith L. T. Human seminal relaxin is a product of the same gene as human luteal relaxin // Endocrinology. 1992. V. 130. P. 2660-2668.

178. Woods S.C., Schwartz M.W., Baskin D.G., Seeley R.J. Food intake and the regulation of body weight // Annu. Rev. Psychol. 2000. V. 51. P. 255-277.

179. Yakar S., Wu Y., Setser J., Rosen G. J. The role of circulating IGF-I: lessons from human and animal models // Endocrine. 2002. V. 19. P. 239-248.

180. Yalow R. S., Berson S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man // J. Clin. Invest. 1960. V. 39. P. 1157-1175.

181. Yip C. C., Ottensmeyer P. Three-dimensional structural interactions of insulin and its receptor // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 27329-27332.

182. Zapf J. Physiological role of the insulin-like growth factor binding proteins // Eur. J. Endocrinol. 1995. V. 132. P. 645-654.

183. Zs.-Nagy I. New data on the anatomy of the visceral ganglion of fresh water mussel. Ibid. 1966. V. 33. P. 103-110.

Информация о работе

Шипилов, Валерий Николаевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Обнаружение и характеристика инсулиноподобных пептидов нервной ткани моллюска Anodonta cygnea - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы