Двустворчатые моллюски родов Unio и Anodonta - компоненты биологических ресурсов р. Урал и участие их лизоцима в процессах регуляции бактериоценозов

Минакова, Виктория Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Двустворчатые моллюски родов Unio и Anodonta - компоненты биологических ресурсов р. Урал и участие их лизоцима в процессах регуляции бактериоценозов
ВАК РФ 03.00.32, Биологические ресурсы

Автореферат диссертации по теме "Двустворчатые моллюски родов Unio и Anodonta - компоненты биологических ресурсов р. Урал и участие их лизоцима в процессах регуляции бактериоценозов"

Направахрукописи

МИНАКОВА Виктория Валерьевна

ДВУСТВОРЧАТЫЕ МОЛЛЮСКИ РОДОВ UNIO И ANODONTA КОМПОНЕНТЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ Р. УРАЛ И УЧАСТИЕ ИХ ЛИЗОЦИМА В ПРОЦЕССАХ РЕГУЛЯЦИИ БАКТЕРИОЦЕНОЗОВ

03.00.32 - «Биологические ресурсы»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оренбург - 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургской государственной медицинской академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Оренбург и Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь.

Научные руководители: Заслуженный работник высшей школы

доктор биологических наук, профессор Соловых Галина Николаевна

кандидат медицинских наук, доцент Коробов Владимир Павлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Сафонова Валентина Афанасьевна

доктор медицинских наук, профессор Красиков Сергей Иванович

Ведущая организация: ГОУ «Оренбургский государственный

университет»

Защита состоится « ¿V » ¿¿ЮНЛ- 2005 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 220.051.06 в ГОУ ВПО «Оренбургском государственном аграрном университете» по адресу: 460795, г. Оренбург, ул. Челюскинцев, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Оренбургского государственного аграрного университета.

Автореферат разослан .М&Л 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

О.Н. Немерешина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Двустворчатые моллюски по своим физиологическим особенностям являются естественными фильтраторами водной среды (Догель В.А., 1975; Скопцова Г.Н., 1984), основным компонентом «рациона» которых служит бактериопланктон (Жадин В.И., 1954; Сорокин Ю.И., 1971). Следовательно, будучи трофически связанными с бактериями, они участвуют в формировании бактериоресурсной компоненты водоемов (Бульон В.В., 2002).

При анализе биотических связей между гидробионтами и бактериями установлено, нто среди антибактериальных факторов особое место принадлежит лизо-циму - важнейшему ферменту естественной резистентности, который, гидролизуя гликозидные связи полисахаридных комплексов стенок бактерий, вызывает нарушение муреинового слоя и лизис их клеток и, тем самым, элиминирует их из биоресурсов (Кокряков В.Н., 1999).

Принимая во внимание имеющиеся литературные данные о лизоциме, как о факторе, участвующем в формировании гидробиоценозов (Соловых Г.Н., 1995; Немцева Н.В., 1998; Устинова Г.М., 2004), можно рассматривать данный фермент и как один из возможных показателей адаптации двустворчатых моллюсков к условиям антропогенного загрязнения водной среды. Однако, двустворчатые моллюски, несмотря на их особую роль в водоеме, связанную с фильтрационно-окисляющей способностью, в этом отношении мало изучены (Ломакин М.С., 1990; CarbaИab в(. ак, 1997). В доступной литературе нет сведений о роли лизоци-ма моллюсков в процессах формирования бактериальной компоненты биологических ресурсов, а также о лизоциме как о факторе адаптации этих организмов к среде обитания.

Все сказанное свидетельствует об актуальности проведения данного исследования.

Цель работы - изучение биоразнообразия и динамики развития моллюсков и бактерий; выделение, характеристика и оценка роли лизоцимного фактора пресноводных двустворчатых моллюсков родов Шю и ЛпойоМа в механизмах формирования бактериоресурсного потенциала и охране от антропогенного загрязнения р. Урал.

Задачи исследования:

1. Исследовать биоразнообразие и динамику развития малакофауны и бактерий в составе биологических ресурсов р. Урал.

2. Оценить бактериолитическую активность двустворчатых моллюсков родов Шю и Anodonta.

3. Изучить роль лизоцимной активности моллюсков в механизмах регуляции бак-териоресурсным потенциалом водоемов.

4. Выделить, очистить и охарактеризовать физико-химические свойства лизоцима - как молекулярно-генетического ресурса двустворчатого моллюска Anodonta cygnea.

5. Выявить спектр антибактериальной активности препаратов лизоцима двустворчатых моллюсков иторШогыш и Anodonta cygnea.

6. Исследовать влияние антропогенного загрязнения среды тяжелыми металлами на продукцию лизоцима моллюсками Шюрк^гит и Anodonta cygnea как биологического показателя устойчивости к токсикантам.

Научная новизна. Выявлены дигрессивные сукцессионные изменения в ма-лакофауне р. Урал, характеризующиеся обеднением биоразнообразия двустворча-

тых моллюсков, исчезновением ранее господствующих видов Sphaeriastrum rivicola, Euglesa supina и заменой их видом Uniopictorum. В бактериоресурсах р. Урал прослежена динамика в смене автохтонной микрофлоры на аллохтонную.

Во всех тканях моллюсков обнаружена лизоцимная активность; наивысшая активность лизоцима выявлена в экстрактах жаберной ткани, достигающая 1,7 -4,1 ед./мг белка, при этом активность фермента у Anodonta cygnea в 4,7 — 6,5 раз ниже у по сравнению с моллюсками Unio pictorum. Исследована сезонная динамика изменения лизоцимной активности жаберной ткани двустворчатых моллюсков.

цимной активности жаберной ткани и количеством сапрофитов на их поверхности Выявленные закономерности позволили обосновать существование системы управления микроборесурсным потенциалом пресных водоемов, основанной на сопряженном взаимодействии «уровня лизоцимной активности двустворчатых моллюсков уровня численности бактерий в водоеме».

Показано, что токсическое действие металлов на лизоцимную активность моллюсков подчиняется теории стресса, но зависимость «доза-эффект» по металлу для каждого вида моллюсков является видоспецифической.

Впервые получен препарат лизоцима пресноводного двустворчатого моллюска Anodonta cygnea и исследованы его физико-химические и антибактериальные свойства. Показано, что препараты лизоцима моллюсков Unio pictorum и Anodonta cygnea действуют на широкий спектр грамположительных и грамотрица-тельных бактерий, но в отношении последних они в 2 - 4 раза активнее яичного лизоцима.

Теоретическая и практическая значимость работы. Расширены представления о биоресурсном потенциале моллюсков и бактерий р. Урал.

Получены данные о распространении, физико-химических и антибактериальных свойствах лизоцима среди пресноводных двустворчатых моллюсков и его роли в трофических взаимоотношениях с бактериями. Обоснована система управления процессами регуляции бактериоценозами водных экосистем.

Выявлен неодинаковый дозовый эффект тяжелых металлов на лизоцимную активность разных видов моллюсков. Предложены методические подходы к охране водных ресурсов от антропогенного загрязнения тяжелыми металлами (положительное решение о выдаче патента Российской Федерации от 20 января 2005 на заявку № 2003126248/13 (028088)).

Реализация результатов исследования. Результаты исследования используются в системе вузовского образования студентов на кафедре химии и методики преподавания химии и кафедре зоологии ГОУ ВПО «Оренбургский государственный педагогический университет» (акты внедрения от 05.05.2005 г.); на кафедре биохимии с курсом физической и коллоидной химии ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Росздрава» (акт внедрения от 10.03.2005 г).

«Способ оценки степени очистки сточных вод от хрома, цинка, меди» внедрен в работу Федерального государственного учреждения здравоохранения «Центра гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области» (акт внедрения от

18.04.2005), лабораторий городских очистных сооружений г. Оренбурга (акт внедрения от 21.03.05).

Апробация диссертации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях: Межрегиональной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002; II Международной конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий», Оренбург, 2002; Региональных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов, г. Оренбург, 2003, 2004, 2005; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и биологии», Оренбург, 2003; Межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов - до внедрения в клиническую практику и производство», г. Оренбург, 2003; конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004; I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биоэлементы», г. Оренбург, 2004; II Всероссийской конференции «Экосистемы малых рек: биоразнообразие, экология, охрана», ИБВВ РАН, п. Борок, 2004; Областной выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2005» Оренбург, 2005; Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ - 2005», Москва, 2005.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 2 журнальные статьи, получено положительное решение на изобретение «Способ оценки степени очистки сточных вод от хрома, цинка, меди» от 20 января 2005 на заявку №2003126248/13 (028088).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, 4 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, приложение. Указатель литературы содержит 150 отечественных и 52 зарубежных источников литературы. Текст иллюстрирован 16 таблицами, 29 рисунками и 16 фотографиями.

Связь работы с научными программами. Диссертационное исследование выполнено в ГОУ ВПО «Оренбургской государственной медицинской академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН в соответствии с открытым планом научно-исследовательской работы (государственный регистрационный номер темы 01.2.00 316166).

Положения, выносимые на защиту:

1. Биологическое разнообразие малакофауны и бактерий в системе биологических ресурсов р. Урал.

2. В управлении микроборесурсным потенциалом пресных водоемов существует система, основанная на взаимодействии «уровня лизоцимной активности двустворчатых моллюсков уровня численности бактерий в водоеме».

3. Лизоцимы пресноводных двустворчатых моллюсков вида К рШотш и вида А. упеа - новые представители семейства лизоцимов беспозвоночных, проявляющие высокую антимикробную активность в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом для проводимых исследований явились двустворчатые моллюски, населяющие гидробиоценозы среднего течения р. Урал в районе г. Оренбурга и микрофлора данных биоценозов.

Сбор моллюсков осуществлялся весной, летом и осенью принятыми в малакологии методами (Шкорбатов Г.Л., Старобогатов Я.И., 1990). На стрежни реки моллюсков собирали, используя скребок-сачок, у берегов - вручную. При определении видовой принадлежности моллюсков были использованы следующие источники: Жадин В.И. (1952), Определитель пресноводных беспозвоночных СССР (планктон и бентос) (1977). По общепринятым методам в воде и смывах с жабр моллюсков определяли общую численность сапрофитных микроорганизмов (Ро-маненко В.И., 1979). Смывы с жабр моллюсков проводили по методике О.Н. Труновой (1982).

Идентификацию выделенных из гидробиоценозов штаммов микроорганизмов осуществляли на основании морфологических, тинкториальных, культураль-ных и биохимических свойств. В качестве руководства по идентификации бактерий использовался «Определитель бактерий Берджи» (Хоулт Дж. и др., 1997). При определении биохимических свойств выделенных микроорганизмов использовали коммерческие тест-системы фирмы LACHEMA (Чехия): «ENTEROtest» (1 и 2), «NEFERMtest», «STAPHYtest».

Для выявления бактериолитической активности и получения препарата лизо-цима готовили экстракты тканей моллюсков путем растирания в 0,1 М фосфатном буфере (рН 6,2) с кварцевым песком на холоду в фарфоровой ступке с добавлением ингибитора протеаз - фенилметилсульфонилфторида 300 мкг/мл (Остерман Л.А., 1981). Полученные гомогенаты подвергали замораживанию и оттаиванию. Центрифугировали при 9000g в течение 15 минут.

Определение литической активности экстрактов тканей моллюсков и элюатов проводили спектрофотометрическим методом (Thammasirirak S. et. al, 2001) с использованием суспензии лиофилизированных клеток индикаторной культуры Micrococcus. lysodeikticus (штамм № 2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича).

Для получения препарата лизоцима моллюсков применяли метод катионооб-менной хроматографии с использованием катионитов - карбоксиметилцеллюлоза («Reanal») и Sourse S-30 («Amersham») (Bashali S., Muriel J., Jolles P., 2002); концентрирование и последующая очистка полученных препаратов лизоцима проводилась в ультрафильтрующих системах фирмы «Amicon» (USA) трех типов: Сеп-tricon-30, Centricon-10, Centriplus YM-Ъ. Концентрацию белка в экстрактах и элюа-тах определяли по методу Брэдфорда (Досон и др., 1991).

Для оценки гетерогенности полученного препарата лизоцима и локализации антибактериальной активности во фракциях препарата непосредственно в геле проводили электрофорез в 10%-ном ПААГ с мочевиной в 5%-ной уксусной кислоте по методу "gel overlay " (Lehrer R.I. et al., 1991).

Спектр антибактериальной активности полученного препарата определяли методом серийных разведений с использованием жидкой питательной среды (МПБ) в отношении культур микроорганизмов (табл. 1):

Список культур микроорганизмов, используемых в исследованиях

Название микроорганизма Источник получения

Arthrobacter globiformis штамм №11 ГИСК им. JI.A. Тарасевича, г. Москва

Bacillus subtilis ИЭГМ 869 Уральская профилированная коллекция алкано-трофных микроорганизмов, ИЭГМ, г. Пермь

Corynebacterium ammoniagenes ИЭГМ 1862 ' Уральская профилированная коллекция алкано-трофных микроорганизмов, ИЭГМ, г. Пермь

Enterobacter cloacae штамм № 17 ГИСК им. JI.A. Тарасевича, г. Москва

Escherichia coli — М-17 НПО «БИОМЕД», г. Пермь

Klebsiella pneumoniae (клинический штамм) Лаборатория микробной экологии МКБ № 2, г. Оренбург

Micrococcus lysodeikticus штамм № 2665 ГИСК им. JI.A. Тарасевича, г. Москва

Proteus mirabilis (клинический штамм) Лаборатория микробной экологии МКБ № 2, г. Оренбург

Proteus vulgaris (клинический штамм) Лаборатория микробной экологии МКБ № 2, г. Оренбург

Pseudomonas aeruginosa (клинический штамм) Лаборатория микробной экологии МКБ № 2, г. Оренбург

Rhodococcus ruber ИЭГМ AC 83 Уральская профилированная коллекция алкано-трофных микроорганизмов, ИЭГМ, г. Пермь

Rhodococcus ruber ИЭГМ AC 90 Уральская профилированная коллекция алкано-трофных микроорганизмов, ИЭГМ, г. Пермь

Rhodococcus ruber ИЭГМ AC 222 Уральская профилированная коллекция алкано-трофных микроорганизмов, ИЭГМ, г. Пермь

Rhodococcus ruber ИЭГМ AC 377 Уральская профилированная коллекция алкано-трофных микроорганизмов, ИЭГМ, г. Пермь

Rhodococcus ruber ИЭГМ AC 386 Уральская профилированная коллекция алкано-трофных микроорганизмов, ИЭГМ, г. Пермь

Salmonella enteriditis (клинический штамм) Лаборатория микробной экологии МКБ № 2, г. Оренбург

Shigella sonnei (клинический штамм) Лаборатория микробной экологии МКБ № 2, г. Оренбург

Staphylococcus epidermidis штамм № 33 ГИСК им. Л.А. Тарасевича, г. Москва

Для оценки влияния токсикантов на лизоцимную активность моллюсков использовали модельные экосистемы. Опытных животных делили на 3 группы по 24 особи в каждой. Первая группа животных служила контролем и содержалась в аквариуме с водопроводной водой, вторая группа - была помещена в аквариум, содержащий ионы свинца, третья группа - ионы кадмия. Все группы содержались при одинаковых условиях освещения, температуры и аэрации, без кормления. Было проведено 3 серии экспериментов для разных концентраций токсикантов. Для опытов брались концентрации токсикантов соответствующие значениям ПДК, 10 ПДК, 100 ПДК соответственно для вод открытых водоемов (Новиков, 1990). Экспозицию опытных животных проводили в течение 24 суток. Через определенные промежутки времени (на 3-й, 8-ые, 12-ые, 16-ые, 20-ые и 24-ые сутки) из каж-

дого аквариума отбирали животных для определения уровня лизоцимной активности жаберной ткани спектрофотометрическим методом. Гомогенаты жаберной ткани получали, объединяя органы 3 особей, что существенно снижает коэффициент вариации показателей ферментативной активности (Попов В.В., 2002).

Исследования на содержание тяжелых металлов в воде и тканях двустворчатых моллюсков были проведены в отделе санитарно-гигиенических исследований Центра Госсанэпиднадзора в г. Оренбурге по следующим стандартам: ГОСТ 26929 - 94 «Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения токсических элементов» (способ сухой минерализации), ГОСТ 30178 - 96 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсических элементов» (способ сухого озоления), ИСО 8288 — 86 «Качество воды: определение токсических элементов, пламенные атомно-абсорбционные спектрометрические методы».

Математическая обработка полученных результатов проведена с использованием пакета компьютерных программ Exsel 2000 (Microsoft Inc., 1999), Statistica for Windows, v.5.0 (Statsoft Inc., 1995).

Результаты исследования и их обсуждение.

Изучение биологического разнообразия гидробионтов среднего течения р. Урал (малакофауны и бактериопланктона).

На исследуемом участке были выделены три основных типа биоценоза, отличающихся особенностями грунта и характером заселения моллюсками: песчаный, галечно-песчаный, илистый. Большие скопления моллюсков были обнаружены на сильно заиленных песчаных отмелях в прибрежной зоне, численность двустворок колебалась от 12 до 30 экз/м2; на галечно-песчаном грунте моллюски встречались реже - 1-2 экз/м2. В данных биотопах русла Урала присутствовали двустворчатые моллюски семейства Unionidae. Род Unio (Перловицы) был представлен качественно и количественно обильнее в отличие от рода Anodonta (Беззубки). Постоянно в биотопах присутствовали Unio pictorum и Unio tumidus, а на некоторых участках присутствовали Unio crassus. Соотношение видов на разных станциях отличалось: в районе станции «Водозабор» господствующую роль в малакофауне данного биотопа играли моллюски U. pictorum (7-10 экз/м2), представители рода Anodonta были немногочисленны (2-3 экз/м2). На станции "Ж/д мост" U. pictorum и U. tumidus присутствовали в равных соотношениях (10 - 15 экз/м2), беззубки отсутствовали. Ни на одном из участков мы не обнаружили моллюсков Sphaeriastrum rivicola, многочисленность которых отмечали Воронцовский П.А. (1922), Мартынова Е.Г., Никитина Л.П. (1974); в пробах отсутствовали также моллюски Euglesa supina.

Проводимые нами исследования бактериопланктона по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим свойствам позволили выделить 26 родов микроорганизмов, из которых 16 были определены до вида (табл. 2):

Группы основных категорий водных микроорганизмов р. Урал

Группы микроорганизмов Род Вид

Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки сем. ЕгЛегоЬасЛепасеае Enterobacter Enterobacter cloacae

Citrobacter Citrobacter freundii

Escherichia Escherichia coli

Hafnia Hafnia alvei

Klebsiella Klebsiella ozaenae

Morganella Morganella morgani

Proteus spp. -

Providencia spp. -

Serratia spp. -

Shigella spp. -

сем. \ПЬпопасеае Aeromonas spp. -

Грамотрицательные аэробные палочки Pseudomonas spp. -

Грамотрицательные палочковидные и кокко-видные бактерии Azotobacter Azotobacter vinilandii

Одноклеточные палочковидные скользящие бактерии Flexibacter Flexibacter ßexilis

Сероокисляющие скользящие бактерии Beggiatoa Beggiatoa alba

Обладающие чехлом бактерии Sphaerotilus Sphaerotilus natans

Нокардиоформные актиномицеты Nocardia spp. -

Грамположительные палочки Bacillus Bacillus cereus

Грамположительные кокки Micrococcus spp. -

Enterococcus Enterococcus faecalis

Staphylococcus St. epidermidis; St. aureus

Грамотрицательные изогнутые бактерии Ancylobacter Ancylobacter aquaticus

Alcaligenes spp. -

Грамположительные неспорообразующие палочки Arthrobacter spp.

Corynebacterium spp.

Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки Cardiobacterium Cardiobacterium hominis

По определителю Д. Берги (1997) выделенные нами виды были разделены на 9 групп:

факультативные анаэробные грамотрицательные палочки, к ним относятся представители сем. Enterobacter. На их долю приходится 48% от общего числа определенных видов;

грамположительные бактерии составили 12% от общего числа определенных видов, к ним отнесены представители родов Bacillus, Mi-crococcus, Enterococcus, Staphylococcus;

грамположительные неспорообразующие палочки составили 8%, к ним отнесены представители родов Arthrobacter и Corynebacterium;

грамотрицательные изогнутые бактерии - 8%, к ним отнесены представители родов Ancylobacter и Artrobacter;

грамотрицательные аэробные/микроаэрофильные палочки и кокки — 8% (рода Azotobacter, Pseudomonas);

нокардиоформные актиномицеты, образующие эндоспоры - 4% (род Nocardia);

обладающие чехлом бактерии составили 4% (род Sphaerotilus); сероокисляющие скользящие бактерии - 4% (род Beggiatoa); одноклеточные палочковидные скользящие бактерии - 4% (род Flexibacter).

Наиболее многочисленными являются факультативно анаэробные грамотрицательные палочки (48% от общего числа выделенных микроорганизмов); большую часть выделенных микроорганизмов можно отнести к микрофлоре аллохтон-ного происхождения.

В водных биоценозах реки Урал в весенне-летний период постоянно присутствовали микроорганизмы 4-х родов (Enterobacter, Proteus, Providencia, Pseudomonas), а в осенний период- 3-х родов (Arthrobacter, Cardiobacterium, Nocardia).

Таким образом, в биоценозах изучаемого участка р. Урал выявлены дигрессивные сукцессионные изменения, заключающиеся в обеднении видового разнообразия малакофауны, а также прослеживается сукцессионная замена автохтонной микрофлоры на аллохтонную, что приводит к изменению разнообразия природно-биологических ресурсов водных экосистем.

Роль лизоцима двустворчатых моллюсков родов Unio и Anodonta в системе управления бактериоресурсным потенциалом водных экосистем. Принимая во внимание литературные данные о лизоциме как об антибактериальном факторе, участвующем в формировании гидробиоценозов (Багнюк В.М., 1980; 1983), был проведен ряд экспериментов по исследованию бактериолитической активности экстрактов тканей моллюсков.

Результаты исследования показали, что препараты экстрактов тканей моллюсков U. pictorum и A. cygnea оказывают выраженное литическое действие в отношении суспензии клеток М. lysodeikticus. Экстракты тканей U. pictorum проявляли достаточно высокую литическую активность, вызывая похожее падение оптической плотности суспензии клеток М. lysodeikticus, при этом наиболее высокое значение удельной активности наблюдалось в экстрактах жаберной ткани -4,1+0,13 ед./мг белка, в то время как соответствующий показатель в экстрактах внутренностей составлял лишь ед./мг белка. Бактериолитическая актив-

ность тканевых экстрактов A. cygnea была заметно ниже. Так, удельная активность экстрактов жаберной ткани имела значение 1,7+0,19. Следует отметить, что у обоих представителей моллюсков максимальными были значения литической активности в экстрактах жабр, что, вероятно, не является случайным, так как именно здесь происходит фильтрация микроорганизмов, и именно жабры испытывают максимальную микробную нагрузку, являясь барьерным органом моллюсков. Поэтому для дальнейших исследований использовали только жаберную ткань (табл. 3).

Сравнительная характеристика бактериологической активности экстрактов различных тканей моллюсков семейства Unionidae

Экстракт ткани Виды моллюсков семейства итотЛае

\Jnio рШогит Апо(1оп1а судпеа

Е (уд. акт.) Е (уд. акт.)

Мантии 3,8±0,21 0,5±0,05

Жабр 4,1±0,13 1,7±0,19

Внутренностей 1,1 ±0,06 1,0±0,11

Примечание: Е уд акт (ед/мг белка) - удельная литическая активность, вычисленная по формуле Д0/0,001х 30/мг белка, где ДО - падение оптической плотности клеточной суспензии за 30 минут.

Установленное нами литическое действие экстрактов тканей моллюсков в отношении тест-культуры М. lysodeikticusможет быть обусловлено продукцией лизоцима и, таким образом, в дальнейшем может рассматриваться как проявление лизоцимной активности.

Лизоцим — это фермент, который является одним из ключевых факторов неспецифического иммунитета позвоночных и беспозвоночных животных (Лукья-ненко В.И., 1983; Купер Э., 1980; Микряков В.Р., 1979, 1990). Было показано, что содержание и активность лизоцима человека и позвоночных животных меняется под действием факторов окружающей среды, таких как температура, а также времени года и возраста (Бухарин О.В., 1974). Поэтому представлялось актуальным изучить изменение лизоцимной активности двустворчатых моллюсков, как одной из форм антибактериальной активности, в зависимости от сезона года.

Проведенные эксперименты показали, что изменение лизоцимной активности жаберной ткани моллюсков имеет выраженный сезонный характер. Так, в мае экстракты жаберной ткани двустворчатых моллюсков К pictorum HA. cygnea имели минимальный уровень удельной лизоцимной активности, который составил в среднем 1,0±0,03 ед./мг белка / м г белка соответственно. Затем про-

исходило постепенное повышение уровня соответствующего показателя в июне до 1,3±0,05 (0,24±0,01), в июле до 2,7±0,05 (0,6±0,04). В августе было зафиксировано максимальное значение уровня лизоцимной активности унионид - 5,6±0,06 ед./мг белка а в сентябре наблюдалось его резкое снижение до

ед./мг белка (0,2+0,01) (рис. 1).

Были отмечены и видовые различия в сезонной динамике бактериолитической активности жаберной ткани моллюсков. Как видно из представленной диаграммы (рис. 2), активность экстрактов жаберной ткани моллюсков вида A. cygnea была в 4,7-6,5 раз ниже соответствующего показателя у моллюсков вида К pictorum.

Рис 1. Сезонная динамика уровня лизо- Рис. 2. Сравнение уровня лизоцимной ак-цимной активности (ЛА) моллюсков: тивности (ЛА) моллюсков:

1 - ЛА жаберной ткани моллюсков и. р1с1отт; □ — ЛА жаберной ткани моллюсков А. су§пеа\

2 - ЛА жаберной ткани моллюсков А. су^пеа. Ц - ЛА жаберной ткани моллюсков и. рШогит.

Установление факта динамических изменений лизоцимной активности моллюсков под влиянием природных абиотических факторов водной среды, а также многочисленные литературные данные о трофических взаимосвязях моллюсков и бактерий (Жадин В.И., 1952; Рамад Ф., 1981; Говорин И.А., 1991) определи следующий этап исследований — изучение роли лизоцимной активности двустворчатых моллюсков родов Шю и Ана<1оМа в динамике и развитии бактериоресурсов водоемов.

Полученные данные о численности сапрофитных бактерий в воде р. Урал на станциях «Водозабор» и «Железнодорожный мост» в период 2003 - 2004 гг. показали, что их количество колебалось - от 232 КОЕ/мл до 7300 КОЕ/мл. Наибольшая численность бактерий на обеих станциях отмечалась в августе (800 КОЕ/мл, 7300 КОЕ/мл), а наименьшая в июне (232 КОЕ/мл, 402 КОЕ/мл). Наиболее высокая численность сапрофитных бактерий отмечалась на станции «Железнодорожный мост» (от 387 КОЕ/мл до 7300 КОЕ/мл), а наименьшее их количество фиксировалось на станции «Водозабор» (от 232 КОЕ/мл до 5780 КОЕ/мл).

Исходя из того, что моллюски являются естественными фильтраторами, в силу чего способны быть центром концентрирования микробов, а также выявленные различия в содержании бактерий в воде на разных станциях р. Урал, возникла необходимость оценить степень микробной обсемененности поверхности жабр моллюсков вида и. рШогиш и А. cygnea.

Результаты исследования микробной обсемененности поверхности жабр моллюсков показали, что в жабрах и. рШогиш и А. cygnea не происходит накопления микроорганизмов, так как общее число сапрофитов в жабрах животных было на порядок ниже, чем в воде р. Урал (рис. 3). Однако большее количество бактерий отмечалось на поверхности жабр А. cygnea (269±48 КОЕ/мл), чем на поверхности жабр и. рШогиш (102±25 КОЕ/мл). Это, вероятно, связано с выявленными видовыми различиями в литической активности тканей данных видов моллюсков: уровень лизоцимной активности в жабрах моллюсков вида и. рШогиш в 4,7 - 6,5 раз выше соответствующего показателя у моллюсков вида А. cygnea.

13 б

КОЕ/мл КОЕ/мл

Рис. 3. Содержание сапрофитных микроорганизмов в природной воде и в смывах с жабр моллюсков (я -Л cygnea, 6-1/ рШогит) - среднегодовое значение за 2003 год-

сапрофитные бактерии в смывах с жабр моллюсков, Ц сапрофитные бактерии природной воды

Полученные данные позволяют предположить, что в условиях повышенного бактериального прессинга моллюски активизируют антибактериальную литиче-скую (лизоцимную) активность жаберной ткани, что способствует более активному лизису бактерий на их поверхности и, как следствие, снижению численности микроорганизмов.

Последующие исследования подтвердили данное предположение, т.к. уровень лизоцимной активности жаберной ткани моллюсков, обитающих в гидробиоценозах с различной микробной нагрузкой, значительно отличался. Так, удельная бак-териолитическая активность жаберной ткани моллюсков U. pictorum, отобранных на станции «Железнодорожный мост» и испытывающих большую микробную нагрузку, была значительно выше соответствующего показателя у моллюсков, взятых со станции «Водозабор» (1,5 -6,5 ед./мг белка и 0,5 - 3,4 соответственно). Данная зависимость подтверждается высоким коэффициентом корреляции (0,99) между этими показателями. Проведенные далее сопоставления данных по изменению значений уровня лизоцимной активности и численности сапрофитов в разные месяцы года подтвердили выявленную закономерность: чем выше была численность сапрофитов в природной воде, тем выше была лизоцимная активность жаберной ткани у моллюсков в этот период (рис 4 а, б). Так, если в июле и августе количество сапрофитной микрофлоры на обеих станциях было максимальным (3987 - 5780 КОЕ/мл и 4991 - 7300 КОЕ/мл), высокой была и лизоцимная активность жаберной ткани моллюсков К pictorum (0,8 - 3,4 и 2,0 - 6,5 ед./мг белка). При низкой численности микроорганизмов в мае, июне и сентябре (232 - 680 КОЕ/мл и 400 - 786 КОЕ/мл), резко снижался и уровень лизоцимной активности жаберной ткани моллюсков (0,5 -1,8 и 1,5-3,2 ед/мг белка).

Таким образом, установление факта участия лизоцимной активности двустворчатых моллюсков в управлении бактериоресурсным потенциалом водоемов позволила обосновать существование одной из систем управления микробными ресурсами водных экосистем. Установлено, что высокая бактериальная обсеме-ненность воды в водоеме стимулирует повышение уровня лизоцимной активности моллюсков, а высокая лизоцимная активность их тканей определяет повышение процесса лизиса бактерий на поверхности жабр моллюсков, что усиливает процесс их элиминации из воды и, как следствие, ведет к снижению микроборесурсного потенциала водоемов. Падение же численности бактерий в водной среде ведет к снижению уровня лизоцимной активности моллюсков, а это, в свою очередь, уменьшает процессы лизиса сапрофитов на поверхности их жабр, в результате чего снижается процесс элиминации бактерий из воды водоемов и возрастает бактериальная обсемененность природной воды (рис. 5).

Рис. 5. Схема системы управления микроборесурсным потенциалом водоема.

Следовательно, в водоемах существует сопряженная система управления микробными ресурсами, основанная на взаимодействии «уровня лизоцимной активности двустворчатых моллюсков <=> уровня численности бактерий в водоеме», что

позволяет поддерживать гомеостатическое равновесие микроборесурсного потенциала в водоемах.

Влияние тяжелых металлов на лизоцимную активность двустворчатых моллюсков родов Бтв иЛпойоШа. Моллюски и бактерии в природных водоемах находятся не только в постоянном взаимодействии друг с другом, но и испытывают на себе влияние антропогенных факторов среды, которые могут нарушать эти взаимоотношения: через изменение активности их ферментных систем, а также характеристик видового разнообразия, численности организмов, смену представительства господствующих видов, и, в итоге, нарушать систему управления процессами формирования бактериоресурсов водоемов.

Анализ литературных данных о качестве воды р.Урал (Боев В.М. и др., 2000; 2002) и собственные исследования показали, что уровень загрязнения воды был выше ПДК по большинству показателей, в том числе и по содержанию тяжелых металлов: никеля на 74,9%, цинка на 53,1%, меди на 16,2%, кадмия на 39,7% и свинца на 11,7%. Поэтому, представлялось важным проведение в процессе исследования анализа содержания металлов, как в тканях моллюсков, так и в среде их обитания — воде. На основании полученных данных были рассчитаны коэффициенты биологического накопления металлов (Ы).

Результаты исследования показали, что различные металлы неодинаково накапливаются в тканях исследуемых видов моллюсков (табл. 4):

Таблица 4.

Содержание тяжелых металлов в воде и в тканях двустворчатых моллюсков

Объект исследования Си т РЪ Сй Мп

Вода (мг/л) 0,005±0,001 0,029±0,003 0,012±0,002 0,003±0,001 0,021±0,003

и. ркШит (мг/кг) 0,24±0,08 15,86±3,08 0,81 ±0,21 - 0,06±0,003 43,53±4,7

А. су^пеа (иг/кг) 0,78+0,19 9,31+2,4 0,8+0,21 - 0,17±0,08 30,0+1,7

Примечание: уровень значимости данных р<0,05, значения даны как средние арифметические и их

стандартные отклонения

В наибольших количествах данные гидробионты накапливают марганец и цинк, однако отмечено, что концентрация марганца в теле U. pictorum в 1,5 раза выше, а цинка в 1,7 раза выше, чем у А. cygnea. Содержание меди и кадмия в теле Upictorum было в 3,25 и 2,8 раза ниже, чем содержание данных металлов в тканях A. cygnea. Рассчитанные И подтверждают проведенные анализы, чем выше И, тем больше аккумуляция металла:

- для и рШогит - Кс1сц (48) > Кс1№ (66) > Кс^ (20) > Кс12п (547) > Кс1Мп (2072);

- для А. сурип - Кйсл (57) > Кс1№ (67) > КаСи(156) > Кс12п (321)> ИМп (1428).

Таким образом, моллюски поглощают весьма значительные количества тяжелых металлов. Коэффициенты биологического накопления свидетельствуют не только о загрязнении среды этими металлами, но и о биологической доступности их ионов в данных условиях, а также указывают на видоспецифичность аккумуляции микроэлементов моллюсками, которые затем могут включаться во все физиологические и биохимические процессы организма.

Полученные нами результаты определили выбор и решение следующей задачи исследования - провести изучение микроэлементного состава мягких тканей моллюсков U. piclorum в условиях модельного эксперимента при однократном введении ионов кадмия (как наиболее токсичного микроэлемента) и ионов свинца (как элемента, который отсутствовал в тканях моллюсков природных биоценозов, но также являющегося приоритетным загрязнителем) в концентрации, превышающей ПДК по данным металлам в 100 раз. Результаты анализов показали, что в тканях моллюсков V. pictorum кадмий обнаруживался в концентрации 2,26 мг/кг, что в 37,7 раза выше концентрации данного металла в тканях моллюсков природного биоценоза; содержание свинца в тканях достигает концентрации 2,8 мг/кг.

В связи с обнаружением эффекта накопления данных токсикантов в тканях моллюсков на следующем этапе представляло интерес изучить реакцию лизоцим-ной активности двустворчатых моллюсков на присутствие ионов свинца и кадмия в искусственно созданной экосистеме, т.к. установление характера этой реакции позволило бы оценить работу системы управления бактериоресурсным потенциалом в условиях антропогенного загрязнения тяжелыми металлами водных экосистем, а также оценить потенциальные возможности устойчивости и сохранения исследуемых видов моллюсков в структуре биологических ресурсов р. Урал.

Любой токсический фактор, в том числе и тяжелые металлы, вызывает развитие «классического» стресса, который сопровождается закономерными фазными изменениями биохимических показателей организма (Селье Г., 1960; Строганов Н.С., 1979; Вьючинский К.К., Щербаков Ю.А., 1983; Самуилов В.Д., 2000). Динамика большинства биохимических процессов при стрессе проходит три основные закономерные фазы («тревоги», «стимуляции», «депрессии»), описываемые S-образной кривой (Строганов Н.С., 1979; Немова Н.Н., 1990). В наших исследованиях стрессовые факторы вызывали различные по амплитуде и скорости изменения активности фермента, что отличалось от плавных и незначительных колебаний в контроле. В аквариуме с концентрацией ионов металлов на уровне ПДК изменения лизоцимной активности для обоих видов моллюсков" характеризовались плавными колебаниями, которые на 12-ые сутки завершались стабилизацией процессов жизнедеятельности на уровне, близком к исходному (рис. 6а). Увеличение концентрации токсикантов приводило к изменениям в ответной реакции моллюсков К pictorum. Были отмечены более резкие колебания значений удельной активности. Изменение исследуемого показателя имело вид волнообразной кривой, с тенденцией к повышению активности с начала эксперимента сверх нормального уровня к 8-ым суткам, с затухающей амплитудой к 24-ым суткам экспозиции (рис.66). Картина изменения лизоцимной активности жаберной ткани моллюсков А. cygnea при концентрации ионов токсикантов превышающих ПДК в 10 раз была сходной с таковой для моллюсков U. pictorum при концентрации ионов превышающих ПДК в 100 раз. В этих условиях динамика изменения лизоцимной активности жаберной ткани моллюсков характеризовалась более выраженными фазами снижения и повышения: на 3-й сутки отмечалось снижение исследуемого показателя. Затем происходили волнообразные изменения активности фермента с более выраженным эффектом затухания амплитуды соответствующего показателя (рис.7 а, б).

200

180

£ 160

1.140

Ё120

* 100 х

$ 80

60 о 40 | 20 £ 0

3 8 12 16 20 24 экспозиция, сут

350

300

2 ч

о о. 250

X 9 200

К 150

А 100

X О 50

Б я 0

318,2

* 132,3 »80,7

/ (7

49,7 51,Г*-/ 34,

1 3 8 12 16 20 24 экспозиция, сут

Рис. 6. Изменение ЛА жаберной ткани (на примере ионов кадмия): а - А. су^пеа (1 - контроль; 2 - ПДК), б -V. ркЮгит (3 - контроль; 4-10 ПДК)

250

£200 5

§150

1?100

14,6

300 250

[200

* 150 а

* 100

| 50

Ё 0

2516

3 8 12 16 20 экспозиция, сут

1 3 8 12 16 20 экспозиция, сут

Рис. 7. Изменение ЛА жаберной ткани моллюсков (на примере ионов свинца): а - А. су%пеа (1 - контроль; 2- 10 ПДК); б - V. р!с1огит (3 - контроль; 4 - 100 ПДК).

Экспозиция двустворчатых моллюсков вида A. cygnea в среде, содержащей ионы свинца и кадмия в концентрации превышающих ПДК в 100 раз, сопровождалась достоверным снижением показателя с последующей гибелью организмов на 16-ые сутки в аквариуме с ионами свинца и на 12-ые - с ионами кадмия (рис. 8).

2 120

1,100

I 0 £

3 8 12 16 20 24 экспозиция, сут

Рис. 8. Изменение ЛА жаберной ткани моллюсков А. cygnea при концентрации ионов металлов превышающих ПДК в 100 раз (на примере ионов свинца): 1-конгроль; 2-100 ПДК.

В проведенных опытах обнаруженные закономерности изменения лизоцимной активности жаберной ткани моллюсков хорошо вписываются в обобщенную схему фаз стресса, что, вероятно, является результатом взаимодействия двух процессов — поражения и компенсаторно-адаптивного ответа биологической системы. Снижение ферментативной активности на начальных этапах интоксикации, что мы наблюдали при действии металлов в концентрации 10 ПДК на моллюсков А. cygnea и концентрации токсикантов 100 ПДК на моллюсков U. pictorum и A. cygnea, соответствует первой фазе адаптивного ответа организма на стрессовое воздействие, известный как «.эффект затаивания». Вторая стадия адаптации тест-организма к токсическому воздействию характеризуется ростом ферментативной активности лизоцима, которая может продолжаться разное время и характеризоваться либо стабилизацией процессов жизнедеятельности на уровне, близком к исходному (адаптация моллюсков к изменившимся условиям как в случае с концентрациями, взятыми на уровне ПДК), либо сопровождаться волнообразными изменениями функциональных показателей с постепенно затухающей амплитудой и переходить в третью фазу реакции организма на стрессовое воздействие - фазу угнетения, которая сопровождается прогрессирующим снижением биохимических и физиологических показателей, что может привести к гибели животного, что мы и наблюдали в случае экспозиции моллюсков A. cygnea в среде, содержащей ионы металлов в концентрации 100ПДК.

Таким образом, наблюдаемые изменения лизоцимной активности моллюсков являются, вероятно, отражением происходящих в организме подопытных животных процессов неспецифической адаптации. Ответная реакция организмов на токсическое воздействие зависит от особенностей животных: «доза - эффект» для каждого вида моллюсков своя, т.к. однотипная ответная реакция для вида А. cygnea наблюдается при превышении ПДК по металлам в 10 раз, а для вида К pictorum - 100 раз. Это свидетельствует о различной устойчивости унионид к антропогенным воздействиям, а также о том, что в условиях хронического загрязнения пресных вод тяжелыми металлами возможны нарушения в системе управления бактериоресурсным потенциалом водных экосистем.

Обнаруженная нами система управления бактериоресурсным потенциалом водоемов, ведущим фактором которой является молекулярно-генетический ресурс -

лизоцим, продуцируемый моллюсками, обусловила необходимость постановки следующего этапа исследования - выделения лизоцима моллюсков и изучения его физико-химических и антибактериальных свойств.

Выделение и характеристика лизоцима двустворчатых моллюсков. Для выделения и очистки антибактериального фактора моллюсков A. cygnea предполагаемой мурамидазной природы был использован метод катионообменной хроматографии (Bashali S., Muriel J.} Jolles P., 2002) с применением сорбентов: карбок-симетилцеллюлоза - КМЦ-52 («Reanal») и Sourse S-30 («Amersham»).

Результаты колоночной хроматографии экстрактов моллюсков A. cygnea показали хорошую воспроизводимось метода. Большая часть белковых фракций выходила одним пиком во фракциях 7-11 (рис. 9). Бактериолитическая активность была локализована в этих же фракциях.

Рис. 9. Выделение лизоцима моллюсков А. cygnea на колонке с КМЦ (один из типичных экспериментов).

Таблица 5.

Результаты хроматографии экстрактов тканей А. cygnea на колонке с КМЦ

Исследуемый материал Объем, мл Активность, ед./мл Е (уд. акт.) ед./мг белка Общая активность, Ед.активности

Экстракт тканей моллюсков 10 0,78 0,1 0,78x10 = 7,8

Элюат 5 1,15 11,5 1,15x5 = 5,75

Данные табл. 5 отражают результаты типичного хроматографического эксперимента по выделению лизоцима из тканей моллюсков: при нанесении на колонку 10 мл экстракта с относительной лизоцимной активностью 0,78 ед./мл (удельная активность 0,1 ед./мг белка), вся активность элюируется в объеме 5 мл. Относительная лизоцимная активность элюата составляет 1,15 ед./мл, а его удельная активность характеризуется величиной 11,5 ед./мг белка. Таким образом, хромато-графическая очистка достигает 115 раз, с выходом по ферментативной активности 73 %. Полученные результаты указывают на то, что метод катионообменной хроматографии на КМЦ эффективен для выделения и очистки лизоцима моллюсков А. cygnea, позволяя получить препарат фермента, очищенный в 100 — 150 раз. Очищенный препарат подвергали рехроматографированию с использованием ка-тионита Sourse S-30 («Amersham») с целью еще более глубокой очистки. Для кон-

центрирования препарата лизоцима моллюсков A cygnea после рехроматографии использовали ультрафильтрацию

Характеристика степени гетерогенности полученного препарата и доказательство его мурамидазной природы были получены после проведения электрофоре-тического исследования активных элюатов в 10%-ном ПААГ по методу «gel overlay» (Lehrer RI el al, 1991) Результаты электрофореза показали, что, содержащие лизоцимную активность элюаты сохраняют гетерогенность, т к содержат и другие белки Однако, как видно из рис 10, в них присутствует существенная фракция, которая в условиях разделения в геле имеет подвижность, практически совпадающую с подвижностью фракции яичного лизоцима При помощи техники «gel overlay» на основании сопоставления расположения зон лизиса бактерий индикаторного газона было выявлено, что именно эта фракция элюата проявляет антибактериальную активность в отношении тест-культуры М lysodeikticus (рис 11)

При изучении некоторых физико-химических свойств выделенного препарата лизоцима моллюсков A cygnea были выявлены отличия от соответствующих характеристик лизоцима моллюсков U pictorum и яичного лизоцима (табл 6) Полученный препарат активен в более узком диапазоне рН - от 3,5 до 6,5, в отличие от лизоцима моллюсков U pictorum, активность которого проявляется в широком диапазоне рН - от 4,0 до 9,0 Максимальную активность препарат лизоцима моллюсков A cygnea проявляет при рН 5,25 Препарат лизоцима моллюсков А cygnea проявляет более выраженную зависимость от температуры, чем препарат лизоцима моллюсков Upictorum и яичный лизоцим Так, препарат яичного лизоцима проявляет одинаково высокую активность при температуре от 25°С до 60°С

(100%-ный лизис), в то время как такая же активность препарата лизоцима моллюсков U. pictorum проявляется при температуре от 25°С до 37°С, а у лизоцима моллюсков Л. cygnea лишь при 25°С (рис. 12). Лизоцим моллюсков Л. cygnea не выдерживает кипячение в кислой среде (рН 5,0-6,0) даже в течение 30 секунд, его активность в этих условиях снижается более чем на 70%.

Таблица 6.

Сравнительная характеристика некоторых физико-химических свойств лизоцима моллюсков Л. су§иеа, лизоцима моллюсков и. рШогит и яичного лизоцима

Свойство Лизоцим Лизоцим Яичный

моллюсков моллюсков лизоцим

A. cygnea U. pictorum

Активность в интервале рН 3,5-6,5 4,0-9,0 5,0-9,0

Оптимум рН 5,25 5,0 6,2

Термостабильность не выдерживает кипячение в слабо кислой среде даже в течение 30 секунд выдерживает кипячение в течение 3-х минут в слабо кислой среде

Оптимум температуры (°С) 20-25 20-25 37-40

5"С 10°С 25°С 37"С 50"С 60"С температура

Рис. 12. Зависимость бактериолитической активности препаратов лизоцима от температуры:

1 - яичный лизоцим; 2 - препарат лизоцима моллюсков и. рШогиш; 3 - препарат лизоцима моллюсков Л. cygnea.

Исследование действия препаратов лизоцима моллюсков Л. ^ива и К рШо-гиш на индикаторную культуру и условно-патогенные микроорганизмы позволило выявить некоторые их биологические особенности (табл. 7).

Действие лизоцимов на грамположительные микроорганизмы. Как видно из табл. 7, в отношении тест-культуры микрококка действие препаратов лизоцима моллюсков Л. ^ива и и. рШогиш было сходно с действием яичного лизоцима. В то же время в отношении вpidвrшidis и В.жЫШъ препараты лизоцима моллюсков Л. cygnвa и и. рШогиш проявляли более низкую активность: яичный лизоцим ингибировал рост данных культур в разведении 1/256, а исследуемые препараты в разведении 1/32 - 1/64. Оба препарата подавляли рост культуры С. aшшoniagвnвs в разведении 1/2 — 1/32, в то время как яичный лизоцим проявлял активность в разведении 1/2 - 1/4. Неодинаковым было действие на разные штаммы микроор-

ганизмов R. ruber. наиболее чувствительным к бактериолитическому действию яичного лизоцима и препаратов лизоцима моллюсков A. cygnea и U. pictorum оказался штамм ИЭГМ АС 83, их действие было сходным с действием на индикаторную культуру М. lysodeikticus. Яичный лизоцим и тестируемые препараты проявили низкую активность в отношении штаммов ИЭГМ АС 90, ИЭГМ АС 386, ИЭГМ АС 377 и были активны в разведении 1/2 -1/16 и 1/2 -1/8 соответственно.

Действие лизоцимов на грамотрицательные микроорганизмы. Особого внимания заслуживает тот факт, что исследуемые препараты были активны в отношении всех исследуемых грамотрицательных культур, а яичный лизоцим действовал только на E.coli в разведении 1/2. Так, в отношении культур S. enteriditis и Sh. sonnei оба препарата проявляли сходное действие — задерживали рост культур в разведении от 1/2 до 1/8 соответственно. Лизоцим моллюсков А. cygnea ингибировал рост культур Е. cloacae, P. vulgaris, Ps. aeruginosa и P. mirabilis в разведении 1/8 - 1/16, а лизоцим U. pictorum - 1/2 - 1/4. В отношении культур Е. coli и К. pneumoniae лизоцим моллюсков V. pictorum был в 3 — 4 раза активнее лизоцима Л. cygnea.

Таблица 7.

Сравнительная характеристика антибактериальной активности препаратов яичного лизоцима, лизоцима моллюсков U. pictorum и A. cygnea

Тестовая культура Яичный лизоцим Лизоцим моллюска U. pictorum Лизоцим моллюска A. cygnea

Действующее разведение

Грамположительные микроорганизмы

Mikrococcus lysodeikticus Л» 2665 1/2 -1/256 1/2 -1/128 1/2 -1/128

Staphilococcus epidermidis M 33 1/2 -1/256 1/2 -1/32 1/2 -1/64

Corynebacterium ammoniagenes ИЭГМ 1862 1/2 - 1/4 1/2 -1/32 1/2 -1/32

Bacillus subtilis ИЭГМ 869 1/2 -1/256 1/2-1/32 1/2 -1/32

Грамотрицательные микроорганизмы Действующее разведение

Enterobakter cloaceaeXs 17 1/2 -1/4 1/2 -1/16

Proteus vulgaris - 1/2 -1/4 1/2 -1/16

Proteus mirabilis - 1/2 1/2 - 1/8

Salmonella enteriditis - 1/2 1/2

Escherichia coli M-17 1/2 1/2 -1/8 1/2 - 1/4

Shigella sonnei - 1/2 - 1/8 1/2-1/8

Klebsiella pneumoniae 1/2 - 1/4 1/2

Pseudomonas aeruginosa - 1/2 1/2-1/16

Вид Rhodococcus ruber Действующее разведение

ИЭГМ AC 386 1/2 1/2 -1/8 1/2 - 1/8

ИЭГМ AC 377 1/2 -1/4 1/2-1/8 1/2 - 1/8

ИЭГМ AC 222 1/2-1/8 1/2 - 1/64 1/2 -1/64

ИЭГМ AC 90 1/2-1/16 1/2-1/8 1/2 - 1/8

ИЭГМ AC 83 1/2 -1/256 1/2 -1/128 1/2-1/128

Примечание: Учитывая гетерогенность белкового состава препаратов, в экспериментах использовали такие образцы препаратов лизоцимов моллюсков, в которых содержание фермента приводило к бактериолитическому действию, эквивалентному эффекту препарата яичного лизоцима фирмы «Ферейн», содержащего белок в концентрации 1 мкг/мл.

Таким образом, лизоцимы моллюсков A. cygnea и U. pictorum проявляют антибактериальную активность в отношении широкого спектра микроорганизмов; лизоцимы моллюсков оказались активнее яичного лизоцима в 2 - 8 в отношении грамотрицательных бактерий, что, вероятно, связано с высокой долей присутствия данных микроорганизмов в биоценозах р. Урал.

Выводы

1. Ретроспективный анализ литературных данных и собственных исследований (1922 -2004 гг.) выявил дигрессивные сукцессионные изменения в малакофауне р. Урал: произошло обеднение биоразнообразия двустворчатых моллюсков с 17-ти видов до 4-х и смена господствующих видов (исчезли ранее господствующие виды Sphaeriastrum rivicola, Euglesa supina, их место занял вид Unio pictorum).

2. Микроборесурс р. Урал представлен 26 родами, 16 видами, относящимися к 9 таксономическим группам; выявлена сезонная динамика в бактериальном разнообразии - в весенне-летний период постоянно присутствовали микроорганизмы 4-х родов (Enterobacter, Proteus, Pseudomonas, Providentia), а в осенний период бактерии 3-х родов (Arthrobacter, Cardiobacterium, Nocardia).

3. В структуре бактериоресурсов р. Урал представлена как автохтонная микрофлора (роды Caulobacter и Artrobacter), так и аллохтонная (роды Escherichia, Klebsiella, Staphylococcus, Enterobacter, Cardiobacterium и др.) и прослеживается сук-цессионная замена автохтонной микрофлоры на аллохтонную; в бактериоценозах преобладают кокковые (49%) и палочковидные (14%) формы бактерий над нитевидными (0,5%).

4. Установлено, что экстракты всех тканей двустворчатых моллюсков A. cygnea и U. pictorum проявляют лизоцимную активность; наибольшая лизоцимная активность наблюдается в экстрактах жаберной ткани (1,7-4,1 ед./мг белка), при этом активность фермента в 4,7 - 6,5 раз ниже у моллюсков A. cygnea по сравнению с U. pictorum; изменение ЛА жаберной ткани двустворчатых моллюсков имеет выраженный сезонный характер с максимумом в августе (0,9 и 5,6 единиц/мг белка) и минимумом в мае (0,2 и 1,0 единиц/мг белка).

5. Установлены прямая корреляционная зависимость между численностью са-профитов в воде и уровнем лизоцимной активности жаберной ткани (Ккорр = 0,99) и обратная корреляционная связь между бактериальной обсемененностью воды и обсемененностью поверхности жабр моллюсков установлено, что высокий уровень лизоцимной активности жаберной ткани моллюсков снижает концентрирование сапрофитных бактерий на их поверхности

6. Обоснована система управления микроборесурсным потенциалом пресных водоемов, основанная на сопряженном взаимодействии «.уровня лизоцимной активности двустворчатых моллюсков О уровня численности бактерий в водоеме»: высокая обсемененность воды водоема стимулирует повышение уровня ЛА моллюсков, а это, в свою очередь, вызывает повышение процесса лизиса бактерий на поверхности жабр и последующую их элиминацию из воды (снижение микробо-ресурсного потенциала), в то время как падение численности бактерий в воде ведет к понижению уровня ЛА моллюсков, замедляет лизис сапрофитов на их жабрах и снижает процесс элиминации бактерий из водоема (повышение микроборе-сурсного потенциала).

7. Получен препарат л изоцима двустворчатого моллюска Л. cygnea; показано, что температурные оптимумы лизоцимов моллюсков A. cygnea и ^ pictorum совпадают и лежат в пределах 20 - 25°С; оптимумы рН активности исследуемых ферментов практически совпадают: рН 5,25 {A. cygnea), рН 5,0 (К pictorum). Вместе с тем, выявлены некоторые отличия в физико-химических свойствах лизоцимов моллюсков разных видов (лизоцим моллюсков A. cygnea проявляет активность в узком диапазоне рН - от 3,5 до 6,5, не термостабилен, т.к. не выдерживает кипячение в слабокислой среде даже в течение 30 секунд). Лизоцимы моллюсков А. cygnea и ^ pictorum действуют на широкий спектр грамположительных и грамот -рицательных бактерий, но в отношении последних в 2 - 4 раза активнее яичного лизоцима.

8. Разные виды двустворчатых моллюсков обладают различной способностью к аккумуляции тяжелых металлов, что отражают рассчитанные коэффициенты их биологического накопления моллюсками (Кё), при этом, чем выше значение Кё, тем выше аккумуляция металла:

- для и. рШогит Кс1си (48) > Кс1м, (66) > Кс1са (20) > Кс12п (547) > ММп (2072);

- для А. су%пеа - К<1са (57) > Кс1м, (67) > Кс1си (156) > Кс17п (321)> Кс1Мп (1428).

9. Изменение лизоцимной активности моллюсков под токсическим воздействием металлов носит характер классической синусоидной кривой и подчиняется теории стресса; характер зависимости «доза - эффект» для каждого вида моллюсков специфичен, т.к. однотипная ответная реакция для вида A. cygnea наблюдается при превышении ПДК по металлам в 10 раз, а для вида ^ pictorum — в 100 раз.

10. Выявленные изменения лизоцимной активности моллюсков как антибактериального фактора в условиях токсического загрязнения воды тяжелыми металлами' свидетельствует о возможности нарушения системы управления бактериоресурс-ным потенциалом пресных водоемов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Минакова В.В. Влияние свинца и кадмия на бактериолитическую активность лизоцимов различного происхождения /В.В. Минакова, И.В. Карнаухова //Межрегиональная конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии»: Тез. докл. - Пермь, 2002. - С. 13-14.

2. Минакова В.В. Лизоцимная активность как фактор адаптации двустворчатых моллюсков в гидробиоценозе /В.В. Минакова, И.В. Карнаухова, Г.Н. Соловых //II международная конференция «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий»: Тез. докл. - Оренбург, 2002. - С. 189 - 190.

3. Минакова В.В. Действие токсических элементов на бактериолитическую активность лизоцимов различного происхождения на примере кадмия /В.В. Мина-•кова //Региональная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов: Сб. матер.-Оренбург, 2003.-ч. 1.-С. 166-168.

4. Карнаухова И.В. К вопросу об аминокислотном составе и молекулярной массе лизоцимов различного происхождения /И.В. Карнаухова, Г.Н. Соловых, В.В. Минакова, В.П. Коробов, Л.М. Лемкина, Т.В. Полюдова //Межрегиональная конференция биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов до внедрения в клиническую практику и производство»: Сб. матер. - Оренбург, 2003. - С. 96 - 99.

5. Соловых Г.Н. К вопросу о роли лизоцима как возможного фактора адаптации двустворчатых моллюсков в гидробиоценозе /Г.Н. Соловых, В.В. Минакова, И.В. Карнаухова //Межрегиональная конференция биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов до внедрения в клиническую практику и производство»: Сб. матер. - Оренбург, 2003. -С. 114-117.

6. Карнаухова И.В. К вопросу о молекулярной массе лизоцимов различного происхождения /И.В. Карнаухова, В.В.Минакова //III конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины»: Сб. тез. - Научно-исследовательский центр ММА им. И.М. Сеченова, Москва, 2004. - С. 51.

7. Минакова В.В. Уровень лизоцимной активности двустворчатого моллюска вида Шю pictorum как биохимический фактор адаптации к ионам свинца /В.В. Минакова //Региональная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов: Сб. матер. - Оренбург, 2004. - ч. 1. - С. 9 - 11.

8. Соловых Г.Н. Закономерности реагирования двустворчатого моллюска Шю pictorum на токсическое воздействие свинца /Г.Н.Соловых, В.В. Минакова, И.В. Карнаухова //Вестник ОГУ, приложение «Биоэлементология». - Оренбург. - № 4, 2004.-С. 80-81.

9. Минакова В.В. Изучение ответной реакции двустворчатого моллюска Шю рШогит на воздействие ионов свинца и кадмия /В.В. Минакова, ЕА Кануникова, И.В. Карнаухова // Всероссийская конференция «Экосистемы малых рек: биоразнообразие, биология, охрана»: Тез. докл. - Борок, 2004. - С. 62.

10.Соловых Г.Н. Лизоцим моллюсков ШюрСогит и чувствительность к нему алканотрофных родококков /Г.Н. Соловых, В.П. Коробов, И.В. Карнаухова, Л.М. Лемкина, Е.И. Ушакова, Г.М. Устинова, В.В. Минакова // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - Т. 40, № 5. - С. 558 - 566.

11.Минакова В.В. Микроэлементный состав мягких тканей двустворчатых моллюсков рода Шю и Апо(1оМа биоценозов среднего течения р. Урал /В.В. Ми-накова // Региональная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов: Сб. матер. - Оренбург, 2005. - ч. 2. - С. 15-16.

12.Соловых Г.Н. Способ оценки степени очистки сточных вод от хрома, цинка, меди / Г.Н. Соловых, Е.А. Рябцева, В.В. Минакова / положительное решение от 20 января 2005 г. (заявка №2003126248/13 (028088)).

МИНАКОВА

Виктория Валерьевна

Двустворчатые моллюски родов Unio пЛпойоМа -компоненты биологических ресурсов р. Урал и участие их лизоцима в процессах регуляции бактериоценозов

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оригинал-макет изготовлен с помощью текстового редактора Microsoft Word 2000 for Windows. Гарнитура Тайме. Подписано в печать 19.05.2005. Печать офсетная. Усл. печ. л. - 1,0. Тираж 150 экз.

1716

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Минакова, Виктория Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Моллюски и бактерии как экологические компоненты природно-биологических ресурсов водных экосистем.

1.2. Экологические факторы среды и их влияние на биологические ресурсы (моллюски) водных экосистем.

1.2.1. Механизмы адаптации двустворчатых моллюсков к абиотическим факторам среды.

1.2.2. Механизмы адаптации двустворчатых моллюсков к биотическим факторам среды.

1.2.3.Биохимические механизмы адаптации двустворчатых моллюсков к антропогенным факторам среды.

1.3. Лизоцим как молекулярно-биологический ресурс гидробионтов и его участие в жизнедеятельности организмов.

1.3.1. Распространение лизоцима в природе.

1.3.2.Роль лизоцима как биологического фактора адаптации.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Характеристика объекта и места отбора проб.

2.2. Определение литической активности моллюсков.

2.3. Выделение и очистка лизоцима моллюсков Anodonta cygnea.

2.4. Электрофоретическое исследование препаратов лизоцима Anodonta cygnea.

2.5. Определение численности сапрофитных бактерий.

2.6. Опреление спектра антимикробного действия лизоцима.

2.7. Моделирование экосистемы для оценки влияния токсикантов на лизоцимную активность двустворчатых моллюсков.

2.8. Методы определения тяжелых металлов в исследуемых объектах.

2.9. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИДРОБИОЦЕНОЗОВ СРЕДНЕГО ТЕЧЕНИЯ Р. УРАЛ.

3.1. Гидрофизическая и гидрохимическая характеристика биоценозов среднего течения реки Урал.

3.2. Характеристика малакофауны как компоненты биологических ресурсов среднего течения реки Урал.

3.3. Характеристика микробиоценоза среднего течения реки Урал.

ГЛАВА 4. ЛИЗОЦИМ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ РОДОВ UNIO И ANODONTA В СИСТЕМЕ УПРАВЛЕНИЯ БАКТЕРИОРЕСУРСНЫМ ПОТЕНЦИАЛОМ ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ.

4.1. Бактериолитическая активность двустворчатых моллюсков родов JJnio и Anodonta.

4.2. Роль лизоцимной активности двустворчатых моллюсков родов Unio и Anodonta в регуляции бактериоре-сурсного потенциала водоемов.

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА ЛИЗОЦИМ-НУЮ АКТИВНОСТЬ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮС

КОВ РОДОВ UNIO ИANODONTA.

5.1. Микроэлементный состав мягких тканей двустворчатых моллюсков родов XJnio и Anodonta.

5.2. Реакция лизоцимной. активности жаберной ткани двустворчатых моллюсков родов Unio и Anodonta на токсическое воздействие ионов свинца и кадмия.

ГЛАВА 6. ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИЗОЦИМА ДВУСТВОРЧАТЫХ

МОЛЛЮСКОВ.

6.1. Выделение и очистка антибактериального фактора пресноводного двустворчатого моллюска Anodonta cygnea.

6.2. Электрофоретическое подтверждение лизоцимной природы антибактериального фактора пресноводного двустворчатого моллюска Anodonta cygnea. ЮЗ

6.3. Сравнительная характеристика физико-химических свойств препаратов лизоцима двустворчатых моллюсков Unio pictorum и Anodonta cygnea.

6.4. Характеристика спектра антибактериальной активности препаратов лизоцима двустворчатых моллюсков Unio pictorum и Anodonta cygnea. Ill

Введение Диссертация по биологии, на тему "Двустворчатые моллюски родов Unio и Anodonta - компоненты биологических ресурсов р. Урал и участие их лизоцима в процессах регуляции бактериоценозов"

Двустворчатые моллюски по своим физиологическим особенностям являются естественными фильтраторами водной среды (Догель В.А., 1975; Скоп-цова Г.Н., 1984), основным компонентом «рациона» которых служит бактерио-планктон (Жадин В.И., 1954; Сорокин Ю.И., 1971). Следовательно; будучи трофически связанными с бактериями, они участвуют в формировании бакте-риоресурсной компоненты водоемов (Бульон В.В., 2002).

При анализе биотических связей между гидробионтами и бактериями установлено, что среди антибактериальных факторов особое место принадлежит лизоциму - важнейшему ферменту естественной резистентности, который, гид-ролизуя гликозидные связи полисахаридных комплексов стенок бактерий, вызывает нарушение муреинового слоя и лизис их клеток и, тем самым, элиминирует их из биоресурсов (Кокряков В.Н., 1999).

Принимая во внимание имеющиеся литературные данные о лизоциме, как о факторе, участвующем в формировании гидробиоценозов (Соловых Г.Н., 1995; Немцева Н.В., 1998; Устинова Г.М., 2004), можно рассматривать данный фермент и как один из возможных показателей адаптации двустворчатых моллюсков к условиям антропогенного загрязнения водной среды. Однако, двустворчатые моллюски, несмотря на их особую роль в водоеме, связанную с фильтрационно-окисляющей способностью, в этом, отношении мало изучены (Ломакин М.С., 1990). В доступной литературе нет сведений о роли лизоцима моллюсков в процессах формирования бактериальной компоненты биологических ресурсов, а также о лизоциме как о факторе адаптации этих организмов к среде обитания.

Все сказанное свидетельствует об актуальности проведения данного исследования.

Цель работы — изучение биоразнообразия и динамики развития моллюсков и бактерий; выделение, характеристика и оценка роли лизоцимного фактора пресноводных двустворчатых моллюсков родов Unio и Anodonta в механизмах формирования бактериоресурсного потенциала и охране от антропогенного загрязнения р. Урал.

Задачи исследования:

2. Оценить бактериолитическую активность двустворчатых моллюсков родов Unio и Anodonta.

3. Изучить роль лизоцимной активности моллюсков в механизмах регуляции бактериоресурсным потенциалом водоемов.

4. Выделить, очистить и охарактеризовать физико-химические свойства лизоцима — как молекулярно-генетического ресурса двустворчатого моллюска Anodonta cygnea.

5. Выявить спектр антибактериальной активности препаратов лизоцима двустворчатых моллюсков Unio pictorum и Anodonta cygnea.

6. Исследовать влияние антропогенного загрязнения среды тяжелыми металлами на продукцию лизоцима моллюсками Unio pictorum и Anodonta cygnea как биологического показателя устойчивости к токсикантам.

Научная новизна. Выявлены дигрессивные сукцессионные изменения в малакофауне р. Урал, характеризующиеся обеднением биоразнообразия двустворчатых моллюсков, исчезновением ранее господствующих видов Sphaeriastrum rivicola, Euglesa supina и заменой их — видом Unio pictorum. В бактериоресурсах. р. Урал прослежена динамика в смене автохтонной микрофлоры на аллохтонную.

Во всех тканях моллюсков обнаружена лизоцимная активность; наивысшая активность лизоцима выявлена в экстрактах жаберной ткани, достигающая 1,7-4,1 ед./мг белка, при этом активность фермента у Anodonta cygnea в 4,7 -6,5 раз ниже по сравнению с моллюсками Unio pictorum. Исследована сезонная динамика изменения лизоцимной активности жаберной ткани двустворчатых моллюсков.

Впервые выявлены прямая корреляционная зависимость между численностью сапрофитов в воде и уровнем лизоцимной активности жаберной ткани моллюсков (Ккорр= 0,99) и обратная между бактериальной обсемененностью воды и обсемененностью жабр моллюсков (Ккорр = - 0,88); показана обратная корреляция между уровнем лизоцимной активности жаберной ткани и количеством сапрофитов на них (Ккорр- = - 0,93). Выявленные закономерности позволили обосновать существование системы управления микроборесурсным потенциалом пресных водоемов, основанной на сопряженном взаимодействии «уровня лизоцимной активности двустворчатых моллюсков <=> уровня численности бактерий в водоеме».

Получен препарат лизоцима пресноводного двустворчатого моллюска Anodonta cygnea и исследованы его физико-химические и антибактериальные свойства. Показано, что препараты лизоцима моллюсков Unio pictorum и Anodonta cygnea действуют на широкий спектр грамположительных и грамотрица-тельных бактерий, но в отношении последних они в 2 - 4 раза активнее яичного лизоцима.

Получены данные о распространении, физико-химических и антибактериальных свойствах лизоцима среди пресноводных двустворчатых моллюсков и его роли в трофических взаимоотношениях с бактериями. Обоснована система управления процессами регуляции микробиоценозами водных экосистем.

Выявлен неодинаковый дозовый эффект тяжелых металлов на лизоцимную активность разных видов моллюсков. Предложены методические подходы к охране водных ресурсов от антропогенного загрязнения тяжелыми металлами положительное решение о выдаче патента Российской Федерации от 20 января 2005 на заявку № 2003126248/13 (028088)).

Способ оценки степени очистки сточных вод от хрома, цинка, меди» внедрен в работу Федерального государственного учреждения здравоохранения «Центра гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области» (акт внедрения от 18.04.2005), лабораторий городских очистных сооружений г. Оренбурга (акт внедрения от 21.03.05).

Апробация диссертации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях: Межрегиональной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002; II Международной конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий», Оренбург, 2002; Региональных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов, г. Оренбург, 2003, 2004, 2005; Межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов - до внедрения в клиническую практику и производство», г. Оренбург, 2003; конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004; I Всероссийской научно-практической конференции с международным, участием «Биоэлементы», г. Оренбург, 2004; II Всероссийской конференции «Экосистемы малых рек: биоразнообразие, экология, охрана», ИБВВ РАН, п. Борок, 2004; Областной выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2005»

Оренбург, 2005; Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2005», Москва, 2005.

Заключение Диссертация по теме "Биологические ресурсы", Минакова, Виктория Валерьевна

129 ВЫВОДЫ

1. Ретроспективный анализ литературных данных и собственных исследований выявил дигрессивные сукцессионные изменения в малакофауне р. Урал: произошло обеднение биоразнообразия двустворчатых моллюсков с 17-ти видов до 4-х и смена господствующих видов (исчезли ранее господствующие виды Sphaeriastrum rivicola, Euglesa supina, их место1 занял вид Unio pictorum).

2. Микроборесурс р. Урал представлен 26 родами, 16 видами; относящимися к 9 таксономическим группам; выявлена сезонная динамика в бактериальном разнообразии,- в весенне-летний период постоянно присутствовали микроорганизмы 4-х родов (Enterobacter, Proteus, Pseudomonas, Providencia), а в осенний период бактерии 3-х родов {Arthrobacter, Cardiobacterium, Nocardia).

3. В структуре бактериоресурсов р. Урал представлена как автохтонная микрофлора (роды- Caulobacter и Artrobacter), так и аллохтонная (роды Escherichia, Klebsiella, Staphylococcus, Enterobacter, Cardiobacterium и др.) и прослеживается сукцессионная замена автохтонной микрофлоры на аллохтонную; в бактериоценозах преобладают кокковые (49%) и палочковидные (14%) формы бактерий над нитевидными (0,5%).

4. Экстракты всех тканей двустворчатых моллюсков A. cygnea и U. pictorum проявляют лизоцимную активность; наибольшая лизоцимная активность наблюдается в экстрактах жаберной ткани (1,7 - 4,1 ед./мг белка), при этом активность фермента в 4,7 - 6,5 раз ниже у моллюсков A. cygnea по сравнению с U. pictorum; изменение JIA жаберной-ткани двустворчатых моллюсков имеет выраженный сезонный характер с максимумом в августе (0,9 и 5,6 ед./мг белками минимумом в мае (0,2 и 1,0 ед./мг белка).

5. Имется прямая корреляционная зависимость между численностью са-профитов в воде и уровнем лизоцимной активности жаберной ткани (Ккорр. = 0,99) и обратная корреляционная связь между обсемененностью воды и обсе-мененностью поверхности жабр моллюсков (Ккорр. = - 0,88); установлено, что высокий уровень лизоцимной активности жаберной ткани моллюсков снижает концентрирование сапрофитных бактерий на их поверхности (FQcpp=-0,93).

6. Обоснована система управления микроборесурсным потенциалом пресных водоемов, основанная на сопряженном взаимодействии «уровня лизоцим-ной активности двустворчатых моллюсков <=> уровня численности бактерий в водоеме»: высокая обсемененность воды водоема стимулирует повышение уровня JIA моллюсков, а это, в свою очередь, вызывает повышение процесса лизиса бактерий на поверхности жабр и последующую их элиминацию из воды (снижение микроборесурсного потенциала), в то время как падение численности бактерий в воде ведет к понижению.уровня JTA моллюсков, замедляет лизис сапрофитов на их жабрах и снижает процесс элиминации бактерий из водоема (повышение микроборесурсного потенциала).

7. Получен лизоцим двустворчатого моллюска A. cygnea; температурные оптимумы лизоцимов моллюсков A. cygnea и U. pictorum совпадают и лежат в пределах 20 — 25°С; оптимумы рН активности исследуемых ферментов также практически совпадают: рН 5,25 (A. cygnea), рН 5,0 (U. pictorum). Вместе с тем, выявленььнекоторые отличия в физико-химических свойствах лизоцимов моллюсков разных видов (лизоцим моллюсков A. cygnea проявляет активность в узком диапазоне рН - от 3,5 до 6,5, не термостабилен, т.к. не выдерживает кипячение в слабокислой среде даже в течение 30 секунд). Лизоцимы моллюсков A. cygnea и U. pictorum действуют на широкий спектр грамположительных и грамотрицательных бактерий, но в отношении последних в 2 — 4 раза активнее яичного лизоцима.

8. Разные виды двустворчатых моллюсков обладают различной способностью к аккумуляции тяжелых металлов, что отражают рассчитанные коэффициенты их биологического накопления моллюсками (Kd), при этом, чем выше значение Kd, тем выше аккумуляция металла:

- для U. pictorum - KdCd (20)^KdCu (48)->KdNi (66)->KdZn (547)->KdMn (2072);

- для A. cygnea - Kdcd (57) ->KdNi(67)->KdCu(156) ->KdZn (321) ->KdMn (1428).

9. Изменение лизоцимной активности моллюсков под токсическим воздействием металлов носит характер классической синусоидной кривой и подчиняется теории стресса; характер зависимости «доза — эффект» для каждого вида моллюсков специфичен, т.к. однотипная ответная реакция для вида A. cygnea наблюдается при превышении ПДК по металлам в 10 раз, а для вида U. pictorum - в 100 раз.

10. Выявленные изменения лизоцимной активности моллюсков как антибактериального фактора в условиях токсического загрязнения воды тяжелыми металлами свидетельствует о возможности нарушения системы управления бактериоресурсным потенциалом пресных водоемов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Форма JVs ОНО -201

Фндш'ллиплисдужил u попппиии^ктуллмюйс'оигтниноа'п. L 0 ппЬ /UuD

11ЛТ1-1ГГЛМ И ТОМЛ1Ч II.IM il 1ЛКЛМ

Ч>КД.\СГЛ.1И»ПЫЙ ИНСТИТУТ ПРОМЫШЛЕННОЙ СОБСТВЕННОСТИ xw

1>срсжконскйя nafv, .40, кори. I. Мискп;). Г-5Ч, ГСП-5. 12.1У95

ГТбОООО, г. Оренбург,

Телефон 2<10 fit) 15. Телекс 1 MS 18 ПДЧ. Факс 2-1.1.13 .47 ул. CoBCTCKtUl, 6,

Оренбургская Государственная медицинская

На № - от - академия, патентный о тдел

21) Наш № 2003126248/13(028088)

При переписке просим ссыкши.ся пи помер тяти и | споГш/шнь Липу попучения данной корреспонденции . j

V Е 1L1 К II И 1С О В Ы Д Л Ч Е

ПАТЕНТА НА ИЗОБРЕТЕНИЕ (21) Заяпка № 2003126248/13(028088) (22) Дата подачи заяпкн 27.08.2003

2<1) Дам начала отсчета срока дснстнпя патента 27.08.2003 (85) Дата качала рассмотрения международной заявки па национальной фазе

ПРИОРИТЕТ УСТАНОВЛЕН ПО ДАТЕ

0 (22) нодамп заяпкн 27.08.2003

23) поступления дополнительных материалов от к ранее поданной заявке № от

62) □ приоритета изобретения но первоначальной заявке № от из которой данная заявка выделена подачи первоначальной заявки № от , из которой данная заяпка выделена (66) подачи ранее поданной заявки № от (30) подачи нерпой заявки и государстве-участнике Парижской конвенции

31) Номер (32) Дата подачи) (33) Код Пупкт(ы) нерпой (ых) заявкп(ок) псрпон(ых) заяпки(ок) страны формулы

1. 2. 3.

86) Заяпка №РСТ/ (96) Заяпка №ЕА

87) Номер публикации п дата публикации заяпкн РС.Т

72) Лвтор(ы) Содовых Г.Н., Рябцевп Н.А., Мииакова 13.В., RU

А9Ж1Л>

73) ГIатентооблалатель(и) Оренбургская Государственная медицинская академияуЯи уктать код стра

51) Mi iK 7 С 02 F 3/34, С 12 Q 1/04,G01 N33/18//(С 12Q 1/04,С 12 R 1:00)

54) Название изобретения Способ оценки степени очистки сточных вод от хрома, цинка, меди

01 02 дом 19.11.2004

133701 I ft-*/ "<t i>f4,/'

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Минакова, Виктория Валерьевна, Оренбург

1. Алекин О.А. Методы исследования физических свойств и химического состава воды /ОА. Алекин // Жизнь пресных вод. М.-Л.: АН СССР, 1959. -Т. 4, ч. 2-С. 346-369.

2. Алексеев А.Н. К вопросу о бактерицидном факторе желудочно-кишечного тракта блох /А.Н. Алексеев, В.А. Бибикова, Н.М. Хрусцелевская //Проблемы дезинфекции и стерилизации. М. - 1969. - Вып. 20. - С. 367 - 371.

3. Алемов С.В. О создании искусственных поселений мидий в целях гидробиологической очистки морских нефтесодержащих вод /С.В. Алемов //Искусственные рифы для рыбного хозяйства: Тез. докл. — М.: ВНИРО. -1987.-С. 69-71.

4. Алимов А.Ф. Функциональная экология пресноводных двустворчатых моллюсков /А.Ф. Алимов //Тр. Зоол. ин-та АН СССР. Т. 96. - 1981. - 248 с.

5. Багнюк В.М. Исследование экологической роли литических бактерий в активном иле /В.М. Багнюк, О.А. Закордонец //Доклады АН СССР. 1980. - Т. 254, №4.- С. 1018-1021.'

6. Багнюк В.М. Литические бактерии в активном иле станции биохимической очистки сточных вод /В.М. Багнюк, Л.С. Новоженко, О.А. Закордонец //Микробиологический журнал. 1983. - Т. 45, № 2. - С. 15 -21.

7. Балабанова JI.В. Ультраструктура клеток иммуной системы карпа Cyrpinus carpio в норме и при иммунизации /Л.В. Балабанова, Е.А. Заботкина //Цитология. 1988. - Т. 39, № 8. - С. 657 - 661.

8. Ю.Банникова О.М. Микробиологические превращения соединений фосфора и металлов в природных и сточных водах: Дисс. канд. биол. наук /О.М. Банникова. Пермь, 1998. - 114 с.

9. Бедова П. В. Использование моллюсков в биологическом мониторинге состояния водоемов /П. В. Бедова, Б. И. Колупаев //Экология. 1998. — № 5. — С. 410-411.

10. Бергер В .Я. Методологические аспекты изучения адаптивных явлений /В.Я. Бергер //Вопросы теории адаптации. Тр. Зоол. ин-та АН СССР. Л., 1987. -Т. 160.-С. 13-30.

11. Березов Т.Т. Биологическая химия: Учебник /Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. -М.: Медицина, 1998. 704 с.• М.Биргер Т.И. Метаболизм водных беспозвоночных в токсической среде /Т.И, Биргер. Киев: Наукова думка, 1972. - 456 с.

12. Боев В.М. Гигиеническая характеристика влияния антропогенных и природных геохимических факторов на здоровье населения Южного Урала /В.М. Боев // Гигиена и санитария. 1998. - № 6. - С. 3 - 8.

13. Боев В.М. Химические канцерогены среды обитания и злокачественные новообразования /В.М. Боев' В.Ф. Куксанов, В.В. Быстрых. М.: Медицина, 2002.-342 с.

14. Браун А.Д. Неспецифический адаптационный-синдром клеточной системы /А.Д. Браун, Т.П. Моженок. Л.: Наука, 1987. - 232 с.

15. Булашов Ф.Я. Влияние подогретых вод на санитарный режим водоема /Ф.Я. Булашов, Н.Ф. Лоскутов, Ю. Т. Лошаков // Мат-лы второго симпозиума. -Борок, 1974.-С. 24-26.

16. Бульон В.В.Структура и функция микробиальной «петли» в планктоне озерных экосистем / В.В. Бульон // Биология внутренних вод. — 2002. №2. - С. 5-14.

17. Бунич П.Г. Ресурсно-экологические проблемы Мирового океана /П.Г. Бунич // Проблемы экономики моря. Киев: Институт экономики АН УССР, 1978. -Вып.7. — С. 19-28.

18. Бухарин О.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине /О.В. Бухарин, Н.В. Васильев. Томск: Изд-во Томск, ун-та, 1974. - 208 с.

19. Бухарин О.В. Патогенные бактерии в природных экосистемах /О.В. Бухарин, В.Ю. Литвин. Екатеринбург: УрО РАН, 1997. - 270 с.

20. Быстрых В.В. Гигиеническая оценка влияния питьевой воды на здоровье населения /В.В.Быстрых //Гигиена и санитария. 1998. - № 6. - С. 20 -22.

21. Быстрых В.В. Комплексная гигиеническая оценка факторов риска отдаленных последствий антропогенного воздействия: Автореф. дисс. д-ра мед. наук /В.В. Быстрых. — Оренбург, 2000. 42 с.

22. Валявская Г.И. Современные эколого-гигиенические проблемы загрязнения моря /Г.И. Валявская, А.А. Рыбак // Экологическое состояние рекреационной зоны юга европейской части СССР: Тез. док. Тбилиси, 1990. - С. 77 - 78.

23. Вернадский В.И. Живое вещество /В.И. Вернадский. -М.: Наука, 1978. 358 с.

24. Ветров А.С. География Оренбургской области /А. С. Ветров, Н. В. Попов. -Челябинск: ЮУКИ, 1971. 73 с.

25. Виселина» Т. Н. Изменение активности ферментов углеводного обмена у моллюсков под действием кадмия /Т. Н. Виселина, О. Н. Лукьянова // Биология моря. 2000. - Т. 26, № 4. - С. 278 - 280:

26. Вихман А.А. Системный анализ иммунологической реактивности рыб в условиях аквакультуры /А.А. Вихман. -М.: Экспедитор, 1996. 176 с.

27. Воронцовский П. А. Материалы к познанию моллюсков окрестностей г. Оренбурга /П. А. Воронцовский //Тр. Общества изучения Киргизского края. 1922. - Вып. III. - С. 31 - 39.

28. Воронцовский П. А. Материалы к изучению фауны моллюсков (mollusca) окрестностей города Оренбурга /П. А.Воронцовский //Изв. Оренбургского отд. ИРГО. 1912. - Вып. XXIII. - С. 23 - 25.

29. Воскресенский К.А. Пояс фильтраторов как биологическая система моря /К.А. Воскресенский //Тр. ГОИН. 1948. - Вып. 6, № 18. - С. 55 - 119.

30. Вьючинский К.К. Оценка действия веществ на водные организмы с учетом фазности токсичности /К.К. Вьючинский, Щербаков Ю.А. //Теоретические проблемы водной токсикологии. Норма и патология. М.: Наука, 1983. - С. 36-41.

31. Галаев И.Ю. Новые методы аффиной очистки белков /И.Ю. Галаев, Б. Мат-тиассон //Биохимия. 1997. - Т. 62, № 6. - 669 - 676.

32. Галактионов В.Г. Очерки эволюционной иммунологии /В.Г. Галактионов. — М.: Наука, 1995.-256 с.

33. Гаретова JI.A. Потенциальная активность микробных сообществ донных отложений р. Амур к деструкции нефти и монофенола /JI.A. Гаретова // Меж-дунар. конф. «Экол. пробл. бассейнов круп, рек»: Тез. докл. Тольятти, 1998.- С. 130.

34. Герлах С.А. Загрязнение морей: Диагноз и терапия /С.А. Герлах. JL: Гид-рометеоиздат, 1985.-263 с.

35. Говорин И.А. Влияние подводного выпуска коммунально-бытовых стоков на бактериологические характеристики прибрежных вод в северо-западной части Черного моря /И.А. Говорин, В.В. Адобовский //Гигиена и санитария. -1992.-№2.-С. 20-22.

36. Говорин И.А. Роль двустворчатых моллюсков в очищении морской среды от бактериального загрязнения /И.А. Говорин //Биология моря. 2000. - Т. 26, № 2. - С. 77-85.

37. Говорин И.А. Роль черноморских мидий в процессе элиминации аллохтон-ных бактерий из морской среды /И.А. Говорин //Гидробиол. журн. 1991. -Т. 27, №4.-С. 33 -38.

38. Голиков А.Н. Угнетение и стимуляция как фазы процесса адаптации /А.Н. Голиков, Н.В. Голиков //Вопросы теории адаптации. Труды Зоол. ин-та АН СССР. Л., 1987. - Т. 160. - С. 4 - 12.

39. Диксон М. Ферменты /М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. - Т. 1.-387 с.

40. Дин Р. Процессы распада в клетке /Р. Дин. М.: Мир, 1981. - 120 с.

41. Догель В. А. Зоология беспозвоночных животных /В. А. Догель. М.: Высш. шк., 1975.-560 с.

42. Досон Р. Справочник биохимика /Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. -М.: Мир, 1991.-544 с.

43. Драбкин Б.С. Гидробиология реки Урал /Б.С. Драбкин. Челябинск: ЮжноУральское книж. изд-во, 1971. - 102 с.

44. Драбкова В.Г. Микробиологические показатели интенсивности процессов самоочищения озерных вод / В.Г. Драбкова. Самоочищение воды и миграция загрязнений по трофической цепи. М.: Наука, 1984. - С. 55 - 60.

45. Ермольева З.В. Лизоцим /З.В. Ермольева7/Успехи современной биологии. — 1938. Т. 9, № 1. - С. 5 - 8.

46. Жадин В. И. Моллюски пресных вод СССР /В. И. Жадин. М., Л.,: Изд-во АН СССР, 1952.- 450 с.

47. Жадин В.И. Пресноводные моллюски СССР /В.И. Жадин. Л.: Ленснабтех-издат, 1954.-200 с.

48. Жадин В.И. Реки, озера, водохранилища СССР, их фауна и флора /В.И. Жадин, С.В. Герд.-М.: Учпедиз., 1961. 135 с.

49. Жужиков Д.П., Ульченко В.М. Лизоцим термитов /Д.П. Жужиков, В.М. Ульченко //Тр. энтомол. сектора. 1972. - Вып. 2. - С. 179- 185.

50. Кадмий: экологические аспекты //Гигиенические критерии состояния окружающей среды 135. Женева: Всемирная организация здравоохранения, 1994.- 160 с.

51. Карнаухова И. В. Лизоцимный фактор пресноводного двустворчатого моллюска- U. pictorum: выделение, характеристика, функции: Дисс. канд. биол. наук /И. В. Карнаухова. — Оренбург, 2000. 110 с.

52. Козиненко И.И. Гуморальные факторы неспецифической защиты рыб /И.И. Козиненко, Н.М. Исаев, И.А. Балахнин //Вопр. ихтиологии. 1999. — Т. 39, №3.-С. 394-400.

53. Кокряков В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения /В.Н. Кокряков. СПб.: Наука, 1999. - 162 с.

54. Константинов А.С. Общая гидробиология /А.С. Константинов. М.: Высшая школа, 1986.-470 с.

55. Кузнецов С.И. Микробиологические процессы в водоемах и озерах /С.И. Кузнецов, А.И. Саралов, Т.Н. Назина. -М.: Наука, 1985. 213 с.

56. Купер Э. Сравнительная иммунология. /Э.Купер. М.: Мир, 1980. - 422 с.

57. Куюкина М.С. Антибиотикочувствительность алканотрофных родококков и возможные пути формирования их неспецифической антибиотикорезистент-ности: Дисс. канд. биол. наук /М.С. Куюкина. Пермь, 1997. - 174 с.

58. Лаптева Н.А. Морфологическая характеристика и численность нитчатых микроорганизмов в пресных водоемах /Н.А.Лаптева, О.А. Дульцева // Инф. бюлл. ИБВВ. 1986. - № 70. - С. 15 - 19.

59. Ломакин М.С. Иммунобиологический надзор /М.С. Ломакин. М.: Медицина, 1990.-256 с.

60. Лукьяненко В. И. Токсикология рыб /В. И. Лукьяненко. М.: Высш. шк., 1967.-245 с.

61. Лукьяненко В.И. Иммунология рыб: врожденный иммунитет /В.И. Лукьяненко. М.:Агропромиздат, 1989.-271 с.

62. Лукьяненко В.И. Общая ихтиотоксикология /В.И. Лукьяненко. М.: Гидро-метеоиздат, 1983. — 415 с.

63. Львович М.И. Мировые водные ресурсы и их будущее /М.И. Львович. М.: Мысль, 1974.-448 с.

64. Макрушин А.В. Биологический анализ качества вод /А.В. Макрушин. Л.: Гидрометеоиздат, 1974. -389 с.

65. Малофеева Э.В. Сезонные изменения некоторых показателей естественной резистентности организма: Дисс.канд. биол. наук /Э.В. Малофеева. Челябинск, 1971.-124 с.

66. Мартынова Е.Г. Бентос реки Урал в районе Оренбурга /Е.Г. Мартынова //Гидробиол. журн. 1967. - № 3. - С. 66 - 69.

67. Микряков В.Р. Влияние солей некоторых тяжелых металлов на картину белой крови молоди ленского осетра Acipenser baeri Brandt /В.Р. Микряков, Т.Б. Лапирова //Вопр. ихтиологии. 1997. - Т. 37, № 4. - С. 538 - 542.

68. Микряков В.Р. Клеточные основы иммунитета рыб /В.Р. Микряков, Л.В. Балабанова //Физиология* и паразитология пресноводных животных. Л.: Наука, 1979.-С. 105- 124.

69. Миловидова Н.Ю. Черноморский макрозообентос в санитарно-биологическом аспекте /Н.Ю. Миловидова, Л.Н. Кирюхина. Киев: Наукова думка, 1985.- 104 с.

70. Миронов О.Г. К вопросу об использовании гидробионтов в борьбе с загрязнением моря /О.Г. Миронов //Гидробиол. журн. — 1985. — Т.2Г, № 5. С. 24 - 28.

71. Миронов О.Г. Мидии как элемент гидробиологической системы очистки загрязненных морских вод /О.Г. Миронов //Водн. ресурсы. — 1988. — № 5. С. 104-111.

72. Мисетов И.А. Факторы персистенции бактериофлоры воды и их использование в санитарно-гигиенической практике: Автореф. дисс.канд. биол. наук /И.А. Мисетов. Оренбург, 1999. - 19 с.

73. Можаев Е.А. Биомониторинг металлов /Е.А. Можаев, А.Н. Литвинов //Гигиена и санитария. 1988. - № 7. — С. 53 - 56.

74. Мориг В. Значение лизоцима в антибактериальном иммунитете насекомых /В. Мориг, Б. Месснер • //Журнал общей биологии. М. - 1969. - Т. 30, № 1. -С. 62-72.

75. Мур-Д. Тяжелые металлы в природных водах. Контроль и оценка влияния /Д. Мур, С. Рамамурти. М.: Мир, 1987. - 250 с.

76. Небел Б. Наука об окружающей среде /Б. Небел. М.: Мир, 1993. - Т. 1. - 420 с.

77. Немова Н!Н. Влияние некоторых токсических факторов на лизосомальные протеиназы пресноводных рыб /Н.Н. Немова, B.C. Сидоров //Гидробиол. журн. 1990. - Т. 16, № 4. - С. 69 - 73.

78. Немцева Н. В. Микробиологическая характеристика биоценотических взаимоотношений гидробионтов и ее значение в санитарной оценке водоемов: Автореф. дисс. д-ра мед. наук /Н. В. Немцева. Челябинск, 1998. - 38 с.

79. Нефедова Е.М. Роль лизоцима гидробионтов в процессах самоочищения водоемов: Дисс. . канд. биол. наук /Е.М. Нефедова. Оренбург, 2001. - 174

80. Ыижегородова Л.Е. Бактериальная флора мидий Одесского залива /Л.Е. Ни-жегородова, Л.М. Нидзвецкая //Гидробиол. журн. 1980. - Т. 16, № 1. - С. 85-89.

81. Нижегородова JI.E. Влияние стока реки Дунай на микробиоценоз северозападной части Черного моря /Л.Е. Нижегородова, Л.М. Нидзвецкая /ЯП Всесо-юз. конф. по морской биологии: Тез. докл. Киев, 1988. -Ч. 2. - С. 126 - 127.

82. Никаноров A.M. Биомониторинг тяжелых металлов в пресноводных экосистемах/A.M. Никаноров, А.В. Жулидов. Л.: Гидрометеоиздат, 1991. - 312 с.

83. Никитина Л. П. Моллюски р. Урала и его притоков /Л. П. Никитина, В. М. Кононова, Е. Г. Мартынова //Гидробиол. журн. 1974. - Т. X, №. 2. - С. 76 - 79.

84. Николайкин Н.И. Экология: учеб. Для вузов /Н.И. Николайкин, Н.Е. Нико-лайкина, О.П. Мелехова. М.: Дрофа, 2003. - 624 с.

85. Новиков Ю.В. Методы исследования качества воды водоемов /Ю.В. Новиков, К.О. Ласточкина, З.Н. Болдина. -М.: Медицина, 1990.-400 с.

86. Определитель пресноводных беспозвоночных СССР (планктон и бентос). -Л.: Гидрометеоиздат, 1977. — 360 с.94.0стерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот /Л.А. Остерман. -М.: Наука, 1981. 163 с.

87. Павлова Е.С. Моллюски-индикаторы миграции и распределения металлов в шельфовых экосистемах /Е.С. Павлова //Док. МОИП: Зоол. и ботан. М.: Изд-во МГУ. - 1987. - С. 24 - 26.

88. Панин Л.Е Биохимические механизмы стресса /Л.Е. Панин. Новосибирск: Высшая школа, 1983. - 232 с.

89. Пешкур Т.А. Оптимальные условия эффективного извлечения цезия бактериями рода Rhodococcus /Т.А. Пешкур //Охрана природы и здоровья человека: сб. тезисов. Оренбург: ОГМА, 2000. - С. 50 - 52.

90. Плецитый Д.Ф. Биологическая роль лизоцима и его лечебное применение /Д.Ф. Плецитый. Караганда: Наука, 1972. - 167 с.

91. Погорелова Н. П. Микробиологическая оценка загрязнения водных объектов дельты волги /Н. П. Погорелова, JL В. Ларцева, А. В. Бойко, И. Е. Смирнова, Т. М. Жигарева, Л. А. Журавлева, Е. Н. Меркина //Гигиена и санитария. 1993. - №7. - С. 35 -38.

92. Подборонов В.М. Иммунные реакции организма клещей О. papillipes на введение бактерий и фагов /В.М. Подборонов, В.М. Бондаренко, В.В. Евдокимов //Паразитология. 1982. - Т. 16, № 3. - С. 238 - 241.

93. Подборонов В.М. Изучение действия лизоцима аргасовых клещей на клетки линии Нер-2 /В.М. Подборонов, В.М. Бондаренко, И.М. Гроховская, Т.П. Журавлева, Т.А. Ревина, И.А. Курбатова // Антибиотики. 1978. - № 8. -С. 726-731.

94. Попов А.П. Множественные формы ферментов живородки речной как маркеры токсического загрязнения воды: Дисс.канд. биол. наук /А.П. Попов. М, 2002. - 171 с.

95. Разумов А.С. Микробиальные показатели сапробности водоемов, загрязненных промышленными сточными водами. 111. О систематике нитчатых бактерий /А.С. Разумов // Микробиология. 1961. - Т. 30, вып. 6. - С. 1088 - 1096.

96. Рамад Ф. Основы прикладной экологии /Ф. Рамад. Л: Гидрометеоиздат, 1981.-544 с.

97. Реймерс Н.Ф. Экология (теории, законы, правила, принципы и гипотезы) /Н.Ф. Реймерс. М.: Россия молодая, 1994. - 367 с.

98. Родина А.Г., Кузьмицкая Н.К. Численность бактериопланктона в реке Неве и ее притоках /А.Г.Родина, Н.К. Кузьмицкая //Тр. Зоол. Ин-та АН СССР. -1968.-Т. 45.-С. 231-242.

99. Романенко В.И. Микробиологические показатели качества воды и методы их определения /В.И. Романенко //Водные ресурсы. 1979. - № 6. - С. 139 — 153.

100. Ротт Г. М. Содержание металлтионеинов у пресноводных моллюсков, обитающих в водоемах средней полосы России /Г. М. Ротт, В. А. Романцова, Б. И. Сынзыныс //Экология. 1999. - № 4. - С. 306 - 308.

101. Русин В, Я. Механизмы повышения неспецифической сопротивляемости организма /В. Я. Русин //Актуальные вопросы промышленной токсикологии. 1970.-№ 4.-С. 108- 127.

102. Русинова О.С. Сезонные изменения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в тканях черноморской мидии /О.С. Русинова //Гидробиол. журн. 1999. - Т. 35., № 2. - С. 69 - 73.

103. Саенко Г.Н. Металлы и галогены в морских организмах /Т.Н. Саенко. — М.: Наука, 1992.-199 с.

104. Саенко Г.Н. Роль марикультуры в охране биосферы /Т.Н. Саенко //Междунар. симпоз. по современным проблемам марикультуры в социалистических странах: Тез. докл. Большой Утриш, 1989. - С. 17-18.

105. Самуилов В.Д. Программируемая клеточная смерть /В.Д. Самуилов //Биохимия. 2000. - Т. 65, Вып. 8. - С. 1029 - 1046.

106. Северин Е.С. Биохимия /Е.С. Северин, Т.А. Алейникова, Е.В. Осипов. — М.: Медицина, 2000г. 356 с.

107. Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме /Г. Селье. М.: Медицина, 1960.-254 с.

108. Скопцова Г.Н. Роль зообентоса в самоочищении воды водохранилища /Г.Н.Скопцова. Самоочищение воды и миграция загрязнений по трофической цепи. -М.: Наука, 1984. С. 81 - 85.

109. Скоупс Р. Методы очистки белков /Р. Скоупс. М.: Мир, 1985. - 358 с.

110. Смирнова Н.Ф. Экологическая характеристика некоторых массовых видов двустворчатых моллюсков в районе Костромской ГРЭС /Н.Ф. Смирнова //Влияние тепловых электростанций на гидрологию и биологию водоемов: Сб. тр. Борок, 1974. - С. 168 - 170.

111. Соловых Г. Н. Система лизоцим-антилизоцим микроорганизмов в формировании водных сообществ пресных водоемов: Дисс. д-ра биол. наук /Г. Н. Соловых. — Челябинск, 1995. 216 с.

112. Сорокин Ю.И. Бактерии как пища фауны кораллового рифа /Ю.И. Сорокин //Океанология. 1972. - Т. 12, № 2. - С. 195 - 204.

113. Сорокин Ю.И. Количественное исследование пищевой роли морского бактериопланктона /Ю.И. Сорокин, Т.С. Петипа, Е.В. Павлова //Океанология. 1970. - Т. 10, № 2. - С. 332 - 340.

114. Степановских А.С. Общая экология /А.С. Степановских. М.: ЮНИТИ, 2001.-509 с.

115. Страйер Л. Биохимия /Л. Страйер. М.: Мир, 1994. - T.I. - 287с.

116. Строганов Н. С. Моделирование возможных изменений экосистемы при загрязнениях по чувствительности гидробионтов к токсикантам /Н. С. Строганов //Влияние загрязняющих веществ на гидробионтов и экосистемы водоемов.-Л. 1979. - С. 142-Г49.

117. Строганов Н. С. Некоторые общие вопросы анализа действия оловоорга-нических соединений на гидробионтов /Н. С. Строганов /Юловоорганические соединения и жизненные процессы гидробионтов. М. -1975.-С. 241 -259.

118. Строганов Н. С. Токсикология водных животных в связи с действием сточных промышленных вод на водоем /Н. С. Строганов //Зоол. журн. -1940. Т. 19, № 4. - С. 566 - 579.

119. Субботкина Т.А. Активность лизоцима в тканях осетра и белуги в при-плотинной зоне Волгоградской ГЭС /Т.А. Субботкина //II симп. По экол. биохимии рыб: Тез. докл. Ярославль, 1990. - С. 244 - 246.

120. Теплова С.Н. Биохронометрия сывороточного лизоцима кроликов /С.Н. Теплова. Факторы естественного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях. М: Наука, 1972. - С. 57 - 60.

121. Ткачева Р.И. Динамика санитарного состояния речной и морской воды в условиях южной зоны РСФСР /Р.И. Ткачева, М.Н. Строев, В.И. Серенко //Экологическое состояние рекреационной зоны юга европейской части СССР: Тез. док. Тбилиси, 1990. - С. 83 - 84.

122. Трунова О.Н. Взаимоотношения простейших и патогенной микрофлоры в непроточных водоемах. // Ветеринария. 1971. № 4. - С. 28-30.

123. Устинова Г.М. Характеристика мактофитно-бактериальных взаимоотношений в водных биоценозах: Дисс.канд. биол.наук /Г.М. Устинова. Оренбург, 2004.-150 с.

124. Фабарисова Л.Г. Разработка способа микробиологического контроля температуры тепловых сбросов электростанций в водоемы-охладители: Авто-реф. дисс. канд. биол. наук /Л.Г. Фабарисова. Оренбург, 2000. - 24 с.

125. Флеров Б. А. Изучение адаптации гуппи к фенолу /Б. А. Флеров //Гидробиологический журнал. 1970. - № 3. - С. 104 - 106.

126. Флоренсов В. А. Очерки эволюционной иммуноморфологии /В.А.Флоренсов, И.М. Пестова. — Иркутск: Изд-во Иркутск, ун-та, 1990. — 248 с.

127. Хоулт Дж. Определитель бактерий Берджи /Дж. Хоулт, Н. Криг, П. Снит, Дж. Стейли, С. Уильяме. М.: Мир, 1997. - в 2-х томах, 799 с.

128. Хочачка П. Биохимическая адаптация /П. Хочачка, Д. Сомеро. М.: Мир, 1988.-567 с.

129. Христофорова Н.К. Биоиндикация ■ и мониторинг загрязнения морских вод тяжелыми металлами /Н.К. Христофорова. М.: Мир, 1989. - 267 с.

130. Челомин В. П. Биохимические механизмы адаптации мидии Mytilus tros-sulus к ионам кадмия и меди /В. П. Челомин, Н. Н. Бельчева,- М. В. Захарцев //Биология моря. 1998:-Т. 24, № 5.-С. 319-325.

131. Черкасов И.А. Усовершенствованный способ выделения лизоцима методом фермент-субстратной хроматографии /И.А. Черкасов, Н.А. Кравченко //Биохимия.-1969.-Т. 33, №5.-С. 1089- 1091.

132. Чибилев А.А. Физико-географический очерк /А.А. Чибилев //Степной заповедник «Оренбургский». Екатеринбург, 1996. С. 19 - 27.

133. Шевкунова B.C. Фагоцитарные реакции и бактерицидное действие гемолимфы насекомых /В.С.Шевкунова //Изв. Сибирского отделения АН СССР. Сер. паразитол. 1968. - № 5. - С. 90 - 941

134. Шилов И.А. Экология: учеб. для биол. и мед. спец. вузов /И.А. Шилов. -М.: Высшая шк., 2001.-512 с.

135. Шкорбатов Г.Л. Методы изучения двустворчатых моллюсков /Г.Л. Шкор-батов, Я.И. Старобогатов. Л.: Зоологический ин-т АН СССР, 1990. - 205 с.

136. Шостак Е.И. Характеристика ответных реакций актинобактерий рода Rhodococcus на воздействие факторов водной среды: Дисс. канд. биол. наук /Е.И. Шостак. 2004. - 164 с.

137. Щербак В.П. Защитные реакции гемолимфы клопов /В.П.Щербак, Л.Ф. Ромашева, Э.Р. Видомский //Изв. АН Кирг. ССР. 1972. - № 4. - С. 76 - 79.

138. Экологические проблемы Верхней Волги: Коллективная монография. — Ярославль: Изд-во ЯГТУ, 2001. 427 с.

139. Amouroxs J.-M. Preliminary study on the consumption of dissolved organic matter (exudates) of bacteria and phytoplankton by marine bivalve Venus verrucosa /J.-М. Amouroxs //Mar. Biol. 1984. - V. 82, № 2. - P. 109 - 112.

140. Anigstein L. Antibakterial activity of a substance present in ticks (Ixodoidae) of Texas /L. Anigstein, D.M. Whitney, D.W. Mick //Nature. 1950. - V. 166. - P. 141 - 145.

141. Avery S.V. Preliminary study on the consumption of dissolved organic matter (exudates) of bacteria /S.V. Avery, G.A. Codd, G.M. Gadd //J. Gen. Microbiol. -1992.-V. 137.-P. 405-413.

142. Bachali S. Philogenetic analysis of invertebrate lysozymes and the evolution of lysozyme function /S. Bachali, M. Jager, P. Jolles, A. Fiala-Medioni //J. Mol. Evol. 2002. - V. 54. - P. 652 - 664.

143. Bernard F.R. Uptake and elimination of coliform bacteria by four marine bivalve mollusks /F.R. Bernard //Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1989. - № 46. - P. 1592 - 1599.

144. Birkbeck Т.Н. Characterization of the lysozyme of Mytilis edulis /Т.Н. Birk-beck, I.G. McHenry //Mar. Biol. 2000. - V. 22, № 5. - P. 7 - 14.

145. Birkbeck Т.Н. Degradation of bacteria by Mytilis edulis /Т.Н. Birkbeck, I.G. McHenry //Mar. Biol. 1982. - V. 72, № 1. - P. 7 - 15.

146. Bradley R.W. Acclimation of rainbow trout. Saimo gairdneli Richardson, to zinc: kinetics and mechanism of enhanced tolerance induction /R.W. Bradley, C. Duqiiesnay, J.B. Spragne //J. Fish Biol. 1985. - V. 27. - P. 367 - 379.

147. Brix H. The influence of size upon the concentration of Cd, Cr, Cu, Hg, Pb and Zn in the common mussel (Mutilus edulis) /Н. Brix, J.E. Lyngby //Heavy metals in water organism: Simposia biologica Hungarica. Budapest, 1985. — P. 23 - 28.

148. Capellato M. Fattori di immunita aspecifica nellamolimfa di Bombyx mori /M.Capellato, A. Narpossi //Bull. 1st. Sicdroteah., Milano. 1960. - V. 39. - P. 40-73.

149. Castelli J. Flora bakteriana marine heterotrofika em ostras Mytilis edulis /J. Castelli //Invest. Pesq. 1966. - № 30 - P. 639 - 651.

150. Castro A. Presencia de Salmonella en ostiones /А. Castro, J. Gonsalez, C. Espeleta, J. Can-era //Rev. Cub. Hig. Epidemiol. 1990. - V. 1990, № 1. - P. 88 -93.

151. Cherian M.G. Cellular adaptation in metal toxicology and metallothionein /M.G. Cherian, M. Nordberg //Toxicology. 1983. V. 28. - P. 1 - 15.

152. Chung J.C. Purification and properties of a bacteriolytic enzyme from a soil amoeba Hartmanella glebae /J.C.Chung //Arch. Biochem. Biophys. 1969. - V. 135.-P. 244-252.

153. Clegg I.S. Biochemical adaptations associated with the embryonic dormancy of DNAs /I.S. Clegg //Biochem. Biophys. Res. commun. 1994. - V. 205. - P. 368 -374.

154. Duncan J.T. On a bactericidal principle presant in the alimentary canal of insects and arachnids /J.T. Duncan //Parasitology. 1926. - V. 18, № 2. - P. 238 -252.

155. Eaton D.L. Dose-response effects of various metal ions on rat liver metallothionein, glutathione, heme oxygenase and cyto-chrome P-450 /D.L. Eaton, N.H. Stacey, K. L. Wong, C.D. Klaasen //Toxicoi. Appl. Pharmacol. 1980. - V. 55. — P.393 -402.

156. Flemming A. On a remarcable bacteriolytic element found tissues and secretions /A.Flemming //Proc.Roy.Soc. 1922. - Bd. 93. - S. 306 - 317.

157. Frings H. Antibacterial action of the blood of the large milkweed bug /Н. -Frings, E. Goldberg, J.C. Arentzen //Science. 1948. - V. 108, № 4. - P. 689 - -690.

158. Frings H. Antibacterial action of the blood of the large milkweed bug /Н. Frings, E. Goldberg, J.C. Arentzen //Science. 1948. - V. 108, № 4. - P. 689 -690.

159. Frings H. Antibacterial action of the blood of the large milkweed bug /Н. Frings H., E. Goldberg, J.C. Arentzen //Science. 1948. - V. 108, № 4. - P. 689 -690.

160. Fukino H. Mechanism of protection by zinc against mercuric chloride toxicity in rats: effects of zinc and mercury on glutathione metabolism /Н. Fukino, M. Hirari, Y.M. Hsueh et al. //J.Toxicoi. Environ. Health. 1986. - V. 19. - P. 75 -89.

161. Gauthier M.E. La pollution bakterienne de la Mutilus edulis /М.Е. Gauthier, Y.A. Bryttimayer //Recherche. 1990. - V. 21, № 223. - P. 910 - 912.

162. Hamer D.H. Metallothionein/D.H. Hamer//Annu. Rev. Biochem. 1986. - * V. 55. -P.913 - 951.

163. Hogstrand C. Binding and detoxification of heavy metals in lower invertebrates with reference to metallothionein /С. Hogstrand, C. Haux //Сотр. Biochem. Physiol. 1991.-V, 100-P. 137-141.

164. Hultmark D. Immune reaction in Drosophila and other insects: a model for innate immunity /D. Hultmark //Trends in Genetics. 1993. - V. 9, № 5. - P. 178 -182.

165. Jolles P. Lysozyme from human milk /Р. Jolles, J. Jolles // Nature. — 1961. -V. 192.-P.1187- 1199.

166. Jolles P. Rapports entre la structure et lactivite de quelques lysozymes /Р. Jolles//Bull. Soc. Chim. Biol. 1967.-V. 49, №8. -P. 1001 - 1012.

167. Jolles P. Relations hip between chemical structure and biological activity of -hen-egg-wite lysozyvt and Lysozymes of different species /Р. Jolles // Proc. Roy. -Soc. 1967. -№ 1009.-P. 350-354.

168. Kang Yu.-J. Glutathione is involved in the early cadmium cytotoxicity response in human lung carcinoma cells /Yu.-J. Kang, M.D. Enger //Toxicology. -1988. V. 48. - P. 93 - 101.

169. Klaverkamp J.F. Acclimation to cadmium toxicity by white suckers: cadmium binding capacity and metal distribution in gill and liver cytoso /J.F.Klaverkamp, D.A. Duncan //Environ. Toxicol. Chem. 1987. - V.6. - P.275 - 289.

170. Koch G. Characterization of an Enzyme of Phage T2 as a lysozyme /G. Koch, W. Dreyer //Vyrology. 1958. - № 6. - P. 291.

171. Kosower N.S. The glutathione status of cells /N.S. Kosower, E.M. Kosower //Int. Rev. Cytol. 1978. - V. 54.-P. 109- 160.

172. Krishnakumar P.K. Carotenoid content and tolerance of green mussel Perna viridis (Linnaeus) to acute mercury and zinc toxicity /Р.К. Krishnakumar, R. Damodaran, P.N.K. Nambisan //Indian J. Mar. Sci. 1987. - V. 16. - P. 155 - *

173. ШхЙгег R.I. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polipeptides /R.I. Lehrer, M. Rosenman, S. Harwig, R. Jackson, P. Eisenhauer //Journal of Im-mounological Methods. 1991. - V. 137. - P. 167 - 173.

174. Malek E.A. Medical and Economic Malacology /Е.А. Malek, T.C. Cheng. -New York et Londres.: Academie Press. Publ., 1974. 398c.

175. Malke H. Uber des Vorcommen von Lysozym in Insekten /Н. Malke //Z. all-gem. Microbiol. 1965. - Bd. 5, № 1. - P.42 - 47.

176. Meister A. Glutathione /А. Meister, M.E. Anderson //Annu. Rev. Biochem. -1983.-V. 52.-P. 711-760.

177. Mohrig W. Antibacterielles Abwehrsystem im Darmtrakt von Insekten /W. Mohrig, B. Messner //Biol. Rasch. 1969. - Bd.6. - S. 136 - 138.

178. Mohrig W. Lysozym im humoralen Abwehrmechanismus Spezifisch und anspezifisch immunisierter Insectelarven /W. Mohrig, B. Messner //Biol. Rasch. -1967. -Bd.5. S. 181-183.

179. Norman A. A. Multiple genes for lysozyme in birds /А.А. Norman, S. Richard //Arch. Bioch. a. Biophys. 1970. -V. 141, № 2. - P. 656.

180. Perrin D. D. Complex formation of zinc and cadmium with glutathione /D. D.Perrin, A. E. Walt //Biochim. Biophys. Acta. 1971. - V. 230. - P. 96 - 104.

181. Petit J.F., Jolles P. Purification and analysis of human saliva lysozyme /J.F. Petit, P. Jolles // Nature. 1963. - V. 200. - P. 168 - 169.

182. Postal W.S. The binding of copper (II) and zinc (II) to oxidized glutathione /W.S. Postal, E.J. Vogel, C. Young, F.T. Greenawav //J. Inorg. Biochem. 1985. -V. 25.-P. 25-33.

183. Posthuma L. Heavy metal adaptation in terrestrial invertebrates: a review of occurrence, genetics physiology and ecological consequences /L. Posthuma, N. M. Van Straalen //Сотр. Biochem. Physiol. 1993. - V. 106C. - P. 11 - 38.

184. Schumacher H. Neue Erkenntnisse uber die Biochemie des Lysozyms und ihre klinische Bedeutung fur Augenheilkunde /Н. Schumacher //For Fortschr. Augen-heilk. 1958. - Bd. 8, № 2. - S. 142 - 211.

185. Seagrave J.C. Effects of cadmium on glutathione metabolism in cadmium sensitive and cadmium resistant Chinese hamster cell lines /J.C. Seagrave, C.E. Hildebrand, M.D. Enger //Toxicology. 1983. - V.29. - P.101 - 110.

186. Thammasirirak S. Purification and characterization of goose type lysozyme from cassowary (Casuarius casuarius) /S. Thammasirirak, T. Torikata, K. Ta-kami, K. Murata, T. Araki //Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001. - V. 65, № 3. -P. 584-592.

187. Thompson R. Lysozyme and relation to antibacterial properties of various tissues and secretions /R.Thompson //Arch. Path. 1940. - V. 30. - P. 1036 - 1134.

188. Tomioka N. Cesium accumulation and growth characteristics of Rodococcus erythropolis CS 98 said Rhodococcus sp. strein CS 402 /N. Tomioka, H. Uchi-yama, O. Yagi //Appl. Env. Microbiol. 1994. - Vol. 60. - P. 2227 - 2231.

189. Tripp M.R. Immunity in invertebrates /M.R.Tripp //Aspects of the Biology of Simbiosis. Baltimore: University Park Press., 1971. - P. 275 - 281.i

Информация о работе

Минакова, Виктория Валерьевна
кандидата биологических наук
Оренбург, 2005
ВАК 03.00.32

Диссертация

Двустворчатые моллюски родов Unio и Anodonta - компоненты биологических ресурсов р. Урал и участие их лизоцима в процессах регуляции бактериоценозов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы