Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние трипептидов семейства Glu-Trp (EW) и их циклических аналогов на основе 2,5-дикетопиперазина на систему кроветворения интактных и облучённых животных

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние трипептидов семейства Glu-Trp (EW) и их циклических аналогов на основе 2,5-дикетопиперазина на систему кроветворения интактных и облучённых животных"

005531963

На правах рукописи

¿А/,

№

ГОРЯЧЕВА Александра Сергеевна

ВЛИЯНИЕ ТРИПЕПТИДОВ СЕМЕЙСТВА С1и-Тгр (Е\У) И ИХ ЦИКЛИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ НА ОСНОВЕ 2,5-ДИКЕТОПИПЕРАЗИНА НА СИСТЕМУ КРОВЕТВОРЕНИЯ ИНТАКТНЫХ И ОБЛУЧЁННЫХ ЖИВОТНЫХ

03.01.01 - Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

-8 АВГ 2013

Обнинск - 2013

005531963

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медицинский радиологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Жаворонков Леонид Петрович

Официальные оппоненты:

- Замулаева Ирина Александровна, доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр», Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая Лабораторией пострадиационного восстановления;

- Вайнсон Адольф Адольфович, доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук, и.о. заведующего Лабораторией лучевых методов лечения опухолей.

Ведущая организация: ФГБУ «Федеральный медицинский биофизический

центр им. А.И. Бурназяна» Федерального медико-биологического агентства России.

Защита состоится 22 октября 2013 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.132.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медицинский радиологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 249036, г. Обнинск Калужской обл., ул. Королёва, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Министерства здравоохранения России.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета

Палыга Геннадий Фёдорович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования.

Известно, что при воздействии на организм высших животных и человека ионизирующей радиации в сублетальных и минимальных летальных поглощённых дозах решающее значение для исхода лучевого поражения имеет постлучевое состояние системы гемопоэза. Общее облучение в указанном диапазоне доз, как показали события последних десятилетий, вполне возможно при возникновении аварийных ситуаций на объектах атомной энергетики. Методы широко применяемой в практической медицине лучевой терапии опухолей имеют тенденцию к использованию высоких разовых и суммарных очаговых доз локального лучевого воздействия. При этом реальным фактором, ограничивающим возможности последующего или параллельного с облучением химиотерапевтического воздействия на опухолевые клетки (а иногда и завершение запланированного курса лучевой терапии), является постлучевая супрессия кроветворения вследствие гибели значительной части гемопоэтических клеток, попадающих в зону облучения. Кроме того, широкое применение в онкологической практике получили цитостатические препараты, позволяющие добиться значительного повышения продолжительности и качества жизни больных. Однако большинство используемых современных цитостатических лекарственных средств не обладают избирательным воздействием на опухоль и оказывают токсический эффект на здоровые ткани организма. Особенно восприимчивы к повреждающему действию цитостатиков клеточные системы организма с высоким пролиферативным потенциалом, и в первую очередь, кроветворные клетки костного мозга.

Несмотря на определенные успехи в создании противолучевых средств, диапазон реальных возможностей борьбы с негативными последствиями облучения пока ограничен.

С учётом приведённых обстоятельств, можно считать, что для радиобиологии и радиационной медицины остаётся высоко актуальным поиск новых эффективных способов и средств борьбы с последствиями переоблучения, и в частности, создание препаратов и способов активации супрессированного облучением либо цитостатиками гемопоэза.

В последние годы интересные с научной и практической точек зрения результаты получены при изучении биологического действия синтетических пептидов различного аминокислотного состава. Обнаружение важной роли тимических пептидов в регуляции процессов иммуно- и гемопоэза послужило основанием для синтеза большого количества разнообразных пептидов и создания на их основе лекарственных препаратов («Тимоген », «Тимодепрессин®», «Стемокин®»).

Наряду с несомненными успехами в этом направлении, структурно-функциональные зависимости и конкретные механизмы реализации их

эффектов изучены явно недостаточно. Интересен также в практическом отношении вопрос о сохранении биологической активности пептидных соединений при «зацикливании» их цепочки, что позволяет перейти к пероральному введению препаратов. Получение новой научной информации в указанных направлениях и обусловливает актуальность избранного для выполнения диссертационной работы направления научных исследований.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлся анализ закономерностей влияния трипептидов семейства Glu-Trp (EW) и их циклических аналогов на основе 2,5-дикетопиперазина на систему кроветворения интактных и облучённых животных в зависимости от их химической структуры и варианта применения.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи исследования:

1. В экспериментах на животных оценить реакции интактного гемопоэза на введение вновь синтезируемых пептидов и пептидомиметиков. Отобрать препараты с наибольшей биологической активностью.

2. На модели общего гамма-облучения изучить радиомодифицирующие эффекты пептидных соединений при разных вариантах лучевого воздействия.

3. Оценить сохранность биологической активности соединений с циклической структурой при их парентеральном, а также пероральном введении.

4. На основе полученных данных попытаться установить зависимость функции от химической структуры и предложить соединения, наиболее перспективные для возможного клинического использования.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В результате проведённых исследований радиобиологической направленности впервые прослежены реакции интактного гемопоэза и облучённого (in vitro) костного мозга на введение новых пептидных соединений. Установлена зависимость функциональной активности трипептидов семейства Glu-Trp от оптической изомерии, варианта химической связи (а или у) и наличия дополнительного аминокислотного остатка (Ala, Val, Leu, Не). Показано, что преобразование структуры линейных трипептидов в производные 2,5-дикетопиперазина сохраняет биологическую активность препаратов. Получены стабильные при пероральном введении соединения без потери функциональных свойств. Впервые обнаружено новое свойство у некоторых пептидных соединений - стимуляция пролиферации интактного костного мозга.

Среди вновь синтезированных трипептидов на основе дипептидов Glu-Trp, а также пептидомиметиков обнаружены соединения, обладающие высокой биологической активностью по отношению к клеточной системе кроветворения. Изученные линейные трипептиды и их циклические аналоги на

основе 2,5-дикетопиперазина при введении мышам после облучения в сублетальных дозах стимулируют восстановление кроветворения, обеспечивая тем самым существенное ослабление проявлений костномозгового синдрома острой лучевой болезни. Установлено, что стимуляция процессов постлучевого восстановления гемопоэза при использовании пептидных соединений наиболее эффективна в условиях относительно небольшой глубины опустошения кроветворного пула, а также при фракционированном облучении, моделирующем сеансы лучевой терапии онкобольных при относительной сохранности гемопоэза, что позволяет увеличить суммарную дозу облучения. Отобрано пептидное соединение, ослабляющее миелосупрессию после цитостатического воздействия.

Комплексный анализ биологической активности исследованных соединений в зависимости от их химической структуры показывает перспективные направления дальнейших работ по созданию лекарственных препаратов нового поколения в целях модификации гемопоэза в условиях лучевого или цитостатического воздействия.

Положения, выносимые на защиту.

1. Характер влияния трипептидов, созданных на основе дипептидов семейства EW, на начальные этапы кроветворения интактного организма или облучённый (in vitro) костный мозг определяют аминокислотный состав, оптическая изомерия и природа пептидной связи.

2. Применение пептидных соединений даёт возможность ускорения восстановления гемопоэза, супрессированного сублетальными дозами ионизирующей радиации или введением цитостатика.

3. Пептидомиметики (производные 2,5-дикетопиперазина) обладают геморегуляторной активностью в отношении стволовых гемопоэтических клеток не только при инъекционном введении, но и при пероральном.

4. Cyclo- {Glu-(IleOH)-Glu-(TrpOH)} отобран в качестве лидерного соединения для дальнейших исследований в качестве потенциального лекарственного препарата.

Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательских работ ФГБУ МРНЦ Минздрава России.

Исследования проводились в рамках следующих плановых тем НИР ФГБУ МРНЦ Минздрава России: «Стволовые гемопоэтические клетки-предшественники и опухолевый процесс у человека и животных» (№ государственной регистрации темы 01.2.00. 501313) и «Биологические эффекты совместного действия ионизирующей и неоинизирующей радиации с индукторами окислительного стресса нелучевой природы и разработка средств коррекции выявленных нарушений» (№ государственной регистрации темы 01.2.00. 951616).

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на: VII региональной научной конференции «Техногенные системы и экологический риск» (Обнинск, 2010); VI съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2010); X международной школе по современным проблемам радиобиологии (Обнинск, 2010); третьем Российском симпозиуме с международным участием «Биофарма-2011 от науки к промышленности» (Тель-Авив, Израиль, 2011); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); XI международной школе по фундаментальным и прикладным проблемам радиобиологии «25 лет аварии на ЧАЭС -медицинские и биологические последствия» (Обнинск, 2011);

16 Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2012); летней школе для студентов и аспирантов «Биотехнологии будущего» (Москва, 2012); Российской конференции «Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация» (Москва, 2012); X региональной научной конференции «Техногенные системы и экологический риск» (Обнинск, 2013);

17 Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2013).

Работа отмечена почётным знаком II степени им. Е. Р. Дашковой (постановление губернатора Калужской области от 28.11.2011), получен грант «УМНИК-Сколковец» в кластере биологических и медицинских технологий на выполнение НИОКР «Структурно-функциональные исследования биологически активных пептидов и пептидомиметиков, влияющих на систему кроветворения интактных и облучённых животных» (2012-2013 гг.).

Результаты исследований представлены в грантах, поддерживаемых Министерством образования и науки Российской Федерации: «Структурно-функциональные исследования ряда потенциальных препаратов-корректоров заболеваний системы кроветворения у человека и животных» (№ государственного контракта 14.740.11.0116); «Новые подходы к лечению онкологических заболеваний на основе фундаментальных знаний о биологии нормальных и опухолевых стволовых клеток» (№ государственного контракта 14.740.11.0180).

Апробация диссертационной работы проведена на научной конференции Экспериментального сектора ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации 06 марта 2013 г. (протокол № 267).

Публикации.

По результатам проведённых исследований опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах согласно перечню ВАК МОиН РФ для кандидатских диссертаций.

Объём и структура диссертационной работы.

Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, обоснование выбора направления исследований и экспериментальных моделей, описание материалов и методов исследования, а также главы результатов собственных исследований и их обсуждение, выводы и указатель литературы, включающий 267 источника, из которых 90 зарубежных. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 17 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. В исследованиях использовано около 4700 мышей-самок (CBAxC57Bl/6)Fl, 2-3 месячных с массой тела 22-26 г., содержавшихся в стандартных условиях и на стандартном рационе на основе брикетированных кормов. Перед опытами животные находились на карантине в течение 2 недель.

Вводимые вещества. Тестируемые препараты были синтезированы и предоставлены ООО «Пептос Фарма» (г. Москва) в виде порошка. Пептидные соединения вводили либо парентерально с использованием иглы, минуя желудочно-кишечный тракт (внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно), либо перорально с использованием зонда в объёме 0,2 мл на животное. Контрольные группы животных получали среду 199 или физиологический раствор тем же способом и в то же время, что и подопытные группы животных. В большинстве проведённых экспериментов доза была выбрана 100 мкг/кг с учётом большого объёма предварительных опытов и ранее полученных данных [Сёмина О.В. и соавт., 2007] при изучении диапазона эффективных доз дипептидов на основе Glu-Trp.

Облучение. Облучение животных проводили в контейнерах из оргстекла у-лучами 60Со на установке «Луч» (Россия). При оценке влияния пептидных соединений на постлучевое восстановление, мышей облучали однократно в дозе 4, 5 или 6 Гр (мощность дозы около 50 сГр/мин) или фракционированно по 2 Гр или по 1 Гр, поглощённая доза - 4, 5, 6, 8 Гр. Мышей-реципиентов клеток костного мозга облучали в дозе 8 Гр (мощность дозы около 95 сГр/мин). Суспензию костномозговых клеток облучали в дозе 1 Гр in vitro (мощность дозы около 50 сГр/мин).

Гемостимулирующую эффективность исследуемых препаратов оценивали по критериям клеточности периферической крови (лейкоцитов, тромбоцитов и ретикулоцитов), костного мозга и селезёнки в фазе максимального опустошения костного мозга и восстановления, а также по селезёночному экзоколониеобразованию [Till J.E., McCulloch Е.А., 1961]. Мышей умерщвляли дислокацией шейных позвонков под эфирным наркозом, селезёнки извлекали, фиксировали в растворе Буэна, а затем подсчитывали число макроскопически

видимых на поверхности селезёнки колоний, диаметр которых превышал 0,4 мм.

Статистическая обработка результатов экспериментов. Для всех полученных вариационных рядов были подсчитаны средние арифметические значения и их стандартные ошибки. Для определения значимости межгрупповых различий были использованы параметрические критерии (t-критерий Стьюдента, F-критерий Фишера) и непараметрические (U-Вилкоксона-Манна-Уитни, медианный критерий Кси-квадрат и ранговый критерий Вардена). Различия между группами признавали статистически значимыми при значении интеграла вероятности Р, не превышающем 0,05.

Статистический анализ проводился с помощью программы Origin 6.0 («MicroCal Software», США).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние синтетических трипептидов на стволовые гемопоэтические клетки в норме и при гамма-облучении

В ходе выполнения первого этапа квалификационной работы было проведено исследование геморегуляторной активности Glu-Trp и yGlu-Trp-содержащих трипептидов, имеющих дополнительный аминокислотный остаток (lie, Leu, Val или Ala) в L- или D- конфигурации с a-пептидной (природной) связью и с у-пептидной (неприродной) связью. Проанализирована колониеобразующая способность интактного и облучённого in vitro (1 Гр) костного мозга при воздействии трипептидов. На основании анализа полученных результатов, представленных в таблице 1, можно заключить, что соединения, имеющие дополнительный аминокислотный остаток (в L- или D-конфигурации), различным образом влияют на популяцию КОЕ-С.

Из 10 новых соединений 6 трипептидов инертны в отношении коммитированных КОЕ-С интактного костного мозга, 2 трипептида блокируют колониеобразование, подобно дипептиду (D-yGlu-D-Trp) на основе которого они созданы, 2 трипептида при введении мышам за двое суток оказывают стимулирующий эффект на КОЕ-С-8. L-пептиды способствуют восстановлению колониеобразования облучённым костным мозгом, D-пептиды оказывают влияние на интактный костный мозг. Трипептид Z)-Ala-Z)-yGlu-D-Trp-OH стимулирует колониеобразование интактным костным мозгом и обладает радиомодифицирующими свойствами.

Таблица 1 - Анализ направленности эффектов трипептидов в зависимости от химического строения на колониеобразующую способность интактного и облучённого (1Гр) in vitro костного мозга

Структурная формула пептида Активность препа| эата по отношению к:

интактному к.м. облучённому (1 Гр) к.м.

£)-yGlu-Z)-Trp-OH «Тимодепрессин®» 1 0

Ile-Glu-Trp «Стемокин®» 0 t

Ile-D-Glu-D-TrpOH 0 т

Val-D-yGlu-.D-Trp-OH 0 т

Ala-D-Glu-D-TrpOH 0 t

Ala-£)-yGlu-Z)-Trp-OH 0 !

£>-Ala-£>-Glu-£>-TrpOH т 0

D-Ala-D-yGlu-D-Trp-OH т т

£>-Ile-Z)-yGlu-.D-Trp-OH i 0

Z3-Leu-Z)-yGlu-£)-Trp-OH i 0

Ile-D-yGlu-ZVTrp-OH 0 0

Leu-£>-yGlu-Z)-Tro-OH 0 0

Примечание - по умолчанию присоединённые аминокислотные остатки имеют ¿-оптическую изомерию.

Установленные закономерности являются основой для дальнейшей разработки новых лекарственных препаратов, в том числе, на этапе компьютерного моделирования.

Гемостимулирующая эффективность трипептидов и пептидомиметиков в условиях радиационного воздействия

В ходе дальнейшего выполнения квалификационной работы была исследована возможность ослабления повреждающего действия ионизирующей радиации на кроветворную систему мышей с помощью ряда низкомолекулярных линейных трипептидов (D-Ala-_D-yGlu-D-Trp-OH, D-Leu-D-yGlu-D-Trp-OH - a-e(w), l-e(w) - условные обозначения соединений) и пептидомиметиков - производных 2,5-дикетопиперазина (Cyclo-{(D-Ala-D-Glu)-D-TrpOH}, Cyclo-{(Z)-Leu-£»-Glu)-i)-TrpOH} - Cyclo-{(ae)-w}, Cyclo-{(le)-w} - условные обозначения циклических пептидных соединений). Показано, что введение пептидных соединений мышам в/б в разовой дозе 100 мкг/кг через 24 и 48 часов после облучения сопровождается статистически значимым повышением содержания миелокариоцитов в бедренной кости уже на 8-е сутки.

При этом абсолютные значения соответствующих показателей при применении низкомолекулярных трипептидов и их циклических аналогов составляли от 19-Ю6 до 23-106 клеток в костном мозге бедренной кости (облучённый контроль - около 16-106). Как видно из данных, приведённых на рисунке 1, в период максимального опустошения костного мозга (3-й сутки после радиационного воздействия) показатели контрольной и подопытных групп животных (нормированные на данные интактного контроля) практически не различаются (25% и 24-31%, соответственно). Однако к 8-м суткам (логарифмическая фаза роста популяции) клеточность костного мозга у мышей подопытных групп в 1,5 раза превышает показатели облучённого контроля, достигая уровня содержания миелокариоцитов в бедренной кости интактных животных.

3 сутки 8 сутки

Рисунок 1 - Влияние трипептидов и пептидомиметиков на

постлучевое восстановление клеток костного мозга у мышей, облучённых

в дозе 4 Гр (М±т)

Примечания: по оси ординат - общая клеточность костного мозга в бедренной кости (в % к показателю интактного контроля); по оси абсцисс - сутки после облучения; * — значимость различий (р < 0,05) по отношению к группе «облучение 4 Гр»; в каждой группе по 14-15 животных.

Следует отметить, что клеточность селезёнки мышей (рисунок 2) уже через 3-е суток статистически значимо выше в группах, в которых животные получали D-Leu-Z)-yGlu-Z)-Trp-OH и Cyclo- {OD-Leu-D-Glu)-Z)-TrpOH}, а к 8-м суткам после облучения количество спленоцитов статистически значимо (в 1,6 раза) превышает показатели облучённого контроля. При введении линейных трипептидов и пептидомиметиков содержание спленоцитов составляет около 51 -57-106 (облучённый контроль - 33 ■ 106).

Активация восстановления супрессированного облучением гемопоэза четко проявлялась через 8 суток не только по клеточности кроветворных органов, но и по содержанию тромбоцитов, примерно в 2 раза превышающему

уровень облучённого контроля и по увеличение в 2-3 раза в крови количества ретикулоцитов - предшественников эритроцитов.

3 сутки 8 сутки

Рисунок 2- Влияние трипептидов и пептидомиметиков, введённых облучённым в дозе 4 Гр мышам на постлучевое восстановление клеточиости селезёнки (М±ш)

Примечания: по оси ординат - содержание спленоцитов (в % к показателю интактного контроля); по оси абсцисс - сутки после облучения; * - значимость различий (р < 0,05 - 3 сутки, р < 0,001 - 8 сутки) по отношению к группе «облучение 4 Гр»; в каждой группе по 14-15 животных.

При облучении животных в более высокой дозе (6 Гр) выявленные эффекты проявляются слабее, но установленные закономерности позволяют рассчитывать на то, что гемостимуляция синтетическими пептидными соединениями может, наряду с другими подходами, занять своё место в комплексной терапии последствий действия ионизирующего излучения.

С учётом ритма проведения сеансов облучения при лучевой терапии, проанализирована эффективность пептидных препаратов при фракционированном облучении с разовой поглощённой дозой 1 Гр (до суммарной дозы 5 Гр), а также 2 Гр (до суммарной дозы 8 Гр). Установлено, что введение трипептида £>-Ala-D-yGlu-D-Trp-OH в интервалах между фракциями облучения приводит к существенному ускорению восстановления гемопоэза по всем изученным критериям. Следует отметить, что общая клеточность костного мозга у облучённых в суммарной дозе 4 Гр (2 Гр х 2) животных и получавших трипептид не отличается от показателей биологического контроля, а даже превышает его и составляет 25,4±1,0®106, а при воздействии суммарной дозой 6 Гр (2 Гр х 3) содержание миелокариоцитов у мышей, получивших трипептид, восстанавливается (20,0±0,2©106) до уровня, близкого к показателям биологического контроля (22,8 ±1,1о106).

Зарегистрированная гемостимулирующая активность испытанных препаратов при таких вариантах опыта позволяет надеяться на возможность эффективного ослабления повреждающего действия ионизирующей радиации на кроветворную систему на фоне фракционированного облучения, когда после каждого радиационного воздействия сохраняется относительно большее количество стволовых и пролиферирующих клеток, и в промежутках между фракциями идёт процесс восстановления гемопоэза, частично компенсирующий повреждающий эффект облучения.

Сравнение биологической активности синтетических трипептидов и их циклических аналогов на систему кроветворения интактных животных

Для низкомолекулярных пептидных препаратов сотрудниками лаборатории химии пептидов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Москва) запатентован способ, позволяющий создавать стабильные при пероральном приеме циклические пептидные соединения (производные 2,5-дикетопиперазина), называемые пептидомиметиками. Была проведена сравнительная оценка линейных трипептидов и их циклических аналогов на кроветворную систему. Было установлено, что биологическая активность сохраняется при переходе от линейного соединения к циклическому, которое более стабильно к энзиматическому расщеплению.

Сравнительный анализ гемотропной активности среди циклических пептидных соединений на основе 2,5-дикетопиперазина

Изучалось влияние производных 2,5-дикетопиперазина на стволовые кроветворные клетки нормального организма и облучённые in vitro (1 Гр) клетки костного мозга с целью изыскания среди них соединений, обладающих гемостимулирующим действием при различных путях введения в организм в сравнении с пептидными препаратами предыдущего поколения («Стемокин®» и «Тимодепрессин®»). Было протестировано 26 пептидомиметиков (производных 2,5-дикетопиперазина), среди них идентифицировано 17 соединений, модифицирующих радиационный эффект. Найдены соединения (Cyclo-{(Ala-Glu)-TrpOH} и Cyclo- {(Lys-Glu)-TrpOH\), способные увеличивать выход селезёночных колоний, образующихся после трансплантации облучённого in vitro (1 Гр) костного мозга мышам-реципиентам как при в/б (на 21%, 34%), так и при пероральном (на 32%, 29%) введении по сравнению с контрольной группой мышей, которые получали среду 199 через 1 час после облучённой костномозговой суспензии. В таблице 2 представлены результаты свидетельствующие о том, что пептидомиметик Cyclo- (GIu-(IleOH)-Glu-(ТгрОН)} способен увеличивать выход экзоколоний при введении его как в/б, так и перорально в широком диапазоне доз мышам-реципиентам после облучённого in vitro костного мозга. «Стемокин®», для которого также

характерно радиотерапевтическое действие [Семенец Т.Н. и соавт., 2002] на начальные этапы кроветворения, имеет более узкий диапазон эффективных доз, при этом эффект наблюдается только при инъекционном введении пептида. Кроме того Cyclo- {G lu-(IleOH)-Glu-(TrpOH)} оказывает стимулирующее влияние на популяцию коммитированных колониеобразующих клеток нормального костного мозга. Пептидомиметик Cyclo- {Glu-(IleOH)-Glu-(ТгрОН)} отобран в качестве лидерного соединения для дальнейших исследований в качестве потенциального лекарственного препарата.

Таблица 2 - Влияние пептидомиметика Cyclo-{Glu-(IleOH)-Glu-(TrpOH)} на образование экзогенных колоний облучённым in vitro (1 Гр) костным мозгом

№ Воздействие на трансплантат 1 Гр Обработка реципиента (доза мкг/кг) Способ введения Среднее кол-во колоний на селезёнке на 105 миелокариоцитов (М±ш)

1 - - - 14,9±0,5

2 + - - 7,4±0,4

3 + 100 в/б 11,9 ±0,4*

4 + 10 per os 11,6±0,8*

5 + 500 per os 14,5±0,6*

6 + 1000 per os 10,7±0,6*

7 + 2500 per os 12,4±1,1*

8 + 5000 per os 9,3±0,6*

9 + 10000 per os 7,7±0,4

Примечания: * - значимость различий (р < 0,05) по отношению к группе № 2 «облучённый контроль (1 Гр)»; в каждой группе по 14-16 животных.

Производные 2,5-дикетопиперазина в широком диапазоне доз и при различных способах введения мышам-реципиентам способны увеличивать выход селезёночных экзоколоний, образовавшихся из введённого облучённого костного мозга. Кроме того, некоторые из них оказывают стимулирующее влияние на популяцию коммитированных колониеобразующих клеток нормального костного мозга.

Гемостимулирующая эффективность Сус1о-{0;1и-(ИеО[1)-С1и-(ТгрОН)) на гранулоцитопоэз в условиях цитостатической миелосупрессии

Известно, что наиболее общие механизмы гемосупрессии после воздействия ионизирующей радиации и применении цитостатических препаратов принципиально сходны. Более того, в реальности оба этих воздействия часто применяются одновременно или с малым промежутком

13

времени. С учётом этого обстоятельства проведена серия экспериментов, в которых в качестве повреждающего агента применили стандартный цитостатик - циклофосфамид, который вводили мышам в/б дважды с двухсуточным интервалом в разовой дозе 200 мг/кг; пептидомиметик Cyclo- {Glu-(IleOH)-Glu-(ТгрОН)} вводили в/б в разовой дозе 100 мкг/кг на следующий день после каждой инъекции цитостатика. Влияние указанного соединения на восстановление гемопоэза на фоне действия цитостатика оценивали на 7 и 12-е сутки после последнего введения пептидомиметика по критериям клеточности костного мозга, селезёнки и периферической крови мышей. Установлено, что лечение мышей Cyclo- (GIu-(IleOH)-Glu-(TrpOH)} сопровождается статистически значимым повышением содержания миелокариоцитов в бедренной кости по сравнению с группой животных, которым после цитостатика вводился физиологический раствор (рисунок 3). На 7-е сутки клеточность костного мозга животных этой группы в 1,4 раза превышает показатели группы «Циклофосфамид», достигая уровня содержания миелокариоцитов в бедренной кости интактных мышей (интактный контроль -19,7±0,6-10б), а на 12-е сутки даже превышает его и составляет 23,9±0,7-10б. По-видимому, такое превышение отражает фазу так называемого «овершута», стандартно регистрируемую в динамике восстановления клеточных популяций после повреждений различного генеза.

140 120 100 80

гг?

60 40 20 о

7 сутки 12 сутки

Рисунок 3 - Модификация миелотоксического эффекта циклофосфамида пептидомиметиком Cyclo-{Glu-(IleOH)-Glu-(TrpOH)} (M±m)

Примечания: по оси ординат — общая клеточность костного мозга в бедренной кости (в % к показателю интактного контроля); по оси абсцисс - сроки исследования, сутки; * - значимость различий (р < 0,05) по отношению к группе «ЦФ»; ** - значимость различий (р < 0,05) по отношению к группе «Интактный контроль»; в каждой группе 12 животных.

Как видно из данных, приведённых на рисунке 4, фаза «гипервосстановления» клеточности селезёнки, которая у грызунов является

полноценным кроветворным органом, наступает даже раньше, чем в костном мозге. В нашей постановке опыта клеточность селезёнки мышей уже на 7-е сутки статистически значимо выше в группе, в которой животные были пролечены пептидомиметиком. При этом абсолютное значение этого показателя составляло 242,2±12,1Т06 спленоцитов (у контрольных животных, которым после цитостатика вводили физиологический раствор — 170,1±5,7-10 ). К 12-м суткам количество спленоцитов у подопытных мышей статистически значимо (в 1,3 раза) превышает показатели интактного контроля. Тот факт, что число спленоцитов в контрольной группе «Циклофосфамид» в эти сроки близко к показателю интактных животных, говорит о завершении у них фазы восстановления, в то время как стимулирующее действие пептидомиметика продолжается.

160 -

140 --

120 -100 -80 -

60 --

40 --

20 ---

0 --'

7 сутки 12 сутки

Рисунок 4 - Влияние пептидомиметика Cyclo-{Glu-(IleOH)-Glu-(TrpOH)} на восстановление клеточности селезёнки мышей на фоне воздействия

цитостатика (М±т)

Примечания: по оси ординат - содержание спленоцитов (в % к показателю интактного контроля); по оси абсцисс - сроки исследования, сутки; * - значимость различий (р < 0,05) по отношению к группе «ЦФ» и «Интактный контроль»; в каждой группе 12 животных.

Полученные данные позволяют надеяться, что параллельное применение Cyclo-iGlu-(IleOH)-Glu-(TrpOH)j во время сеансов высокодозной химиотерапии позволит существенно ускорить восстановление кроветворения или применять относительно большие дозы химиопрепаратов при равной степени гемосупрессии. Анализируя полученные результаты с практической точки зрения, можно заключить, что препараты подобного типа действия могут оказаться полезными для снижения системных негативных последствий цитостатической терапии онкологических заболеваний и вследствие этого могут быть предложены для включения в схему комплексной терапии опухолей.

выводы

1. Характер влияния трипептидов, созданных на основе дипептидов Z)-Glu-D-Тгр или Z)-yGlu-.D-Trp, на начальные этапы кроветворения интактного организма или облучённый (in vitro) костный мозг определяют дополнительный аминокислотный остаток (Не, Leu, Val, Ala), оптическая ориентация аминокислотных составляющих (L или D) и природа пептидной связи между остатком Тгр и карбоксилом Glu (а или у).

2. В сублетальном диапазоне доз (острое гамма-облучение животных в дозах 4 Гр или 6 Гр) реально существует возможность ускорения восстановления гемопоэза некоторыми синтетическими пептидными соединениями, применяемыми в ближайшие сутки после облучения.

3. Гемостимулирующая эффективность трипептидов и их циклических аналогов в условиях фракционированного облучения (2 Гр х 2) или (2 Гр х 3) существенно выше, чем при однократном облучении в той же интегральной дозе (4 Гр или 6 Гр). Полученные данные могут быть использованы при разработке средств и способов стимулирования кроветворения, супрессия которого осложняет проведение радио- и химиотерапии злокачественных новообразований.

4. Стабилизация пептидных производных путём превращения их в производные 2,5-дикетопиперазина сохраняет их биологическую эффективность. Показано, что циклические пептидные соединения обладают активностью в отношении популяции стволовых клеток кроветворения не только при инъекционном введении, но и при пероральном.

5. Пептидомиметик Cyclo- {Glu-(IleOH)-Glu-(TrpOH)} проявляет гемостимулирующую эффективность в отношении кроветворения, супрессированного воздействием цитостатического препарата циклофосфамида в высокой дозе. Пептидные соединения подобного типа действия могут оказаться полезными для снижения системных негативных последствий цитостатической терапии онкологических заболеваний и вследствие этого могут быть предложены для включения в схему комплексной терапии опухолей.

6. Пептидомиметик с формулой Cyclo-{Glu-(IleOH)-Glu-(TrpOH)} представляет собой новое поколение селективных стимуляторов гемопоэза, активирующих процессы гемопоэза как интактного костного мозга, так и повреждённого ионизирующей радиацией. Cyclo- (Glu-(IleOH)-Glu-(TrpOH)} отобран в качестве лидерного соединения и может быть рекомендован для дальнейших исследований в качестве потенциального противолучевого лекарственного препарата.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Дейгин, В.И. Изучение влияния пептидных производных дикетопиперазинов на стволовые кроветворные клетки нормального организма и облучённые in vitro клетки костного мозга / В.И. Дейгин, A.C. Саенко, Ю.А. Сёмин, A.C. Шевченко*, A.A. Лузянина, О.С. Изместьева, Л.П. Жаворонков // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2011. - Т. 51, № 5. - С. 530-535.

2. Лузянина, A.A. Изучение влияния синтетических трипептидов на стволовые гемопоэтические клетки в норме и при гамма-облучении / A.A. Лузянина, A.C. Горячева, Ю.А. Сёмин, О.С. Изместьева, В.И. Дейгин, A.C. Саенко, Л.П. Жаворонков // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2012. -Т. 52, № 3. - С. 257-260.

3. Горячева, A.C. Влияние пептидов на постлучевое восстановление гемопоэза / A.C. Горячева, A.A. Лузянина, О.С. Изместьева, Л.П. Жаворонков, В.И. Дейгин, A.C. Саенко // Бюллетень Национального радиационно-эпидемиологического регистра «Радиация и риск». - 2012. - Т. 21, № 4. - С. 4150.

4. Шевченко, A.C. Влияние триптаминсодержащих пептидов на интактный и облученный костный мозг животных / A.C. Шевченко, Л.П. Жаворонков, Ю.А. Сёмин, О.С. Изместьева, В.И. Дейгин, A.C. Саенко // Техногенные системы и экологический риск: Материалы докладов VII Региональной научной конференции. - Обнинск: ИАТЭ НИЯУ МИФИ, 2010. - Ч. 2 - С. 27.

5. Дейгин, В.И. Изучение влияние пептидных производных дикетопиперазинов на стволовые кроветворные клетки нормального организма и облучённые in vitro клетки костного мозга / В.И. Дейгин, A.C. Саенко, Ю.А. Сёмин, A.C. Шевченко, О.С. Изместьева // VI Съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность): Тезисы докладов. Том I (секции I-VII). Москва, 25-28 октября 2010 г. - М.: РУДН, 2010.-С. 89.

6. Shevchenko, A.S. Experimental Evidence for the Use of «Stemokin®» for Suppression of Tumoral Processes / A.S. Shevchenko, A.A. Luzjanina, U.A. Semin, O.S. Izmestyeva, L.P. Zhavoronkov, V.l. Deigin // Third International Symposium «BIOPHARMA - 2011: from science to industry» Proceeding, Tel Aviv, Israel. - P. 27-28.

7. Шевченко, A.C. Исследование гемостимулирующих свойств «Стемокина®» и его аналога на основе 2,5-дикетопиперазина / A.C. Шевченко, A.A. Лузянина, Ю.А. Семин, О.С. Изместьева, Л.П. Жаворонков, В.И. Дейгин // V Российский симпозиум «Белки и пептиды»: Тезисы докладов - Петрозаводск, 2011.-С. 355.

8. Дейгин, В.И. Влияние химической и оптической изомерии на биологические свойства низкомолекулярных пептидов и производных 2,5-

- фамилия до замужества

дикетопиперазинов / В.И. Дейгин, О.Б. Ксенофонтова, Е.С. Ефремов, A.C. Шевченко, Ю.А. Сёмин, О.С. Изместьева, A.A. Лузянина, A.C. Саенко // V Российский симпозиум «Белки и пептиды»: Тезисы докладов - Петрозаводск, 2011.-С. 139.

9. Горячева, A.C. Изучение восстановления гемопоэза трипептидом после воздействия ионизирующей радиации / A.C. Горячева, A.A. Лузянина, Ю.А. Сёмин, О.С. Изместьева, Л.П. Жаворонков, В.И. Дейгин // Сборник научных работ лауреатов конкурса им. Е.Р. Дашковой, выпуск 5 - Калуга, 2011. - С. 1017.

10. Горячева, A.C. Влияние пептидов на восстановления гемопоэза после воздействия ионизирующей радиации / A.C. Горячева, A.A. Лузянина, О.С. Изместьева, Л.П. Жаворонков, Ю.А. Сёмин, В.И. Дейгин // 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология -наука XXI века»: сборник тезисов - Пущино, 2012 - С. 305-306.

11. Горячева, A.C. Восстановление пептидами поврежденного ионизирующей радиацией кроветворения / A.C. Горячева, A.A. Лузянина, О.С. Изместьева, Л.П. Жаворонков, В.И. Дейгин // Российская конференция «Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация»: тезисы докладов - Москва, 2012 - С. 33.

12. Горячева, A.C. Гемостимулирующая эффективность пептидов и пептидомиметиков в условиях фракционированного облучения / A.C. Горячева,

A.A. Лузянина, О.С. Изместьева, Л.П. Жаворонков, В.Л. Иванов, О.Ф. Чибисова, В.И. Дейгин // 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века»: Сборник тезисов - Пущино, 2013-С. 110-111.

13. Горячева, A.C. Восстановление пептидными соединениями костномозгового кроветворения, супрессированного ионизирующем излучением или цитостатиком / A.C. Горячева, A.A. Лузянина, О.С. Изместьева,

B.Л. Иванов, О.Ф. Чибисова, Л.П. Жаворонков // Техногенные системы и экологический риск: Тезисы докладов X Региональной научной конференции. -Обнинск: ИАТЭ, 2013. - С. 79-81

Сокращения

в/б - (введение препарата) внутрибрюшинно КОЕ-С - колониеобразующая единица в селезёнке ЦФ - циклофосфамид per os - (введение препарата) перорально

Заказ № 1365. Тираж 100 экз. Объём 1 п.л. Формат 60x84 '/¡в. Печать офсетная.

Отпечатано в МП «Обнинская типография» 249035 Калужская обл., г. Обнинск, ул. Комарова, 6.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горячева, Александра Сергеевна, Обнинск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

МЕДИЦИНСКИЙ РАДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04201362588 На правах рукописи

ГОРЯЧЕВА АЛЕКСАНДРА СЕРГЕЕВНА

ВЛИЯНИЕ ТРИПЕПТИДОВ СЕМЕЙСТВА 01и-Тгр (Е\У) И ИХ ЦИКЛИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ НА ОСНОВЕ 2,5-ДИКЕТОПИПЕРАЗИНА НА СИСТЕМУ КРОВЕТВОРЕНИЯ ИНТАКТНЫХ И ОБЛУЧЁННЫХ ЖИВОТНЫХ

03.01.01- радиобиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук Л.П. Жаворонков

Обнинск 2013

Обозначения и сокращения

в/б - (введение препарата) внутрибрюшинно

в/в - (введение препарата) внутривенно

в/м - (введение препарата) внутримышечно

ГСК (СКК) - гемопоэтические (стволовые) клетки

ДКП - дикетопиперазин

ИК - интактный контроль

ИЛ - интерлейкин

к.м. - костный мозг

КОЕ-С - колониеобразующая единица в селезёнке

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГМ-КСФ- гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ОК - облученный контроль

ОЛБ - острая лучевая болезнь

ТНФ - туморонекротический фактор

ФУД - фактор увеличения (изменения) дозы

ЦНС - центральная нервная система

ЦФ - циклофосфамид

ad libitum - по желанию, по собственному усмотрению de novo - вновь, с самого начала

in silico - термин, обозначающий компьютерное моделирование (симуляцию) эксперимента

per os - (введение препарата) перорально

Обозначение структуры пептидного соединения

«Тимодепрессин®» - D-Glu-(D-Trp) = D-yGlu-D-Тф «Стемокин®» - Ile-Glu-Тф = L-lle-L-Glu-L-Trp EW - обозначение в 1-буквенном коде Glu-Trp Ala-D-Glu-D-TrpOH по умолчанию = L-Ala-D-Glu-D-TrpOH А1а-1)-01и-(£)-Тф)-0Н = Z-Ala-D-yGlu-D-Тф-ОН £>-А1а-£>-С1и-(£>-Тф)-ОН = D-Ala-D-yGlu-D-Тф-ОН = a-e(w) £>-Ьеи-£>-С1и-(£>-Тф)-ОН = D-Leu-D-yGlu-D-Тф-ОН = l-e(w) Cyclo {(D-А1а-£>-С1и)-1)-ТфОН} = Cyclo-{(ae)-w} Cyclo {(£)-Ьеи-/)-01и)-1)-Тф0Н} = Cyclo-{(le)-w}

СОДЕРЖАНИЕ

Введение........................................................................................................................................................................6

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................17

1.1 Современные представления о системе кроветворения..................................17

1.2 Радиобиологические основы костномозгового лучевого синдрома.. 20

1.3 Способы и средства профилактики и лечения лучевого поражения. 25

1.3.1 Физико-химическая защита от ионизирующих излучений..........26

1.3.2 Противолучевые средства природного происхождения..................29

1.4 Пептиды как биологически активные вещества....................................................33

1.4.1 Пептиды и лимфоидная регуляция кроветворения..............................38

Глава 2 ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ. 42

Глава 3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ................................................47

3.1 Материалы исследований............................................................................................................47

3.2 Облучение..................................................................................................................................................51

3.3 Методы исследований......................................................................................................................51

3.4 Статистическая обработка результатов экспериментов....................................52

Глава 4 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И

ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................................................................................................54

4.1 Влияние синтетических трипептидов на стволовые

гемопоэтические клетки в норме и при гамма-облучении......................................54

4.1.1 Влияние трипептидов на стволовые кроветворные клетки нормального организма................................................................................................................55

4.1.2 Влияние трипептидов на поврежденные (1 Гр) стволовые кроветворные клетки......................................................................................................................................58

4.2 Изучение механизмов регуляции начальных этапов гемопоэза трипептидом - £>-А1а-1)-01и-(£>-Тгр)-0Н..................................................................................65

4.3 Сравнение биологической активности синтетических трипептидов и их циклических аналогов на систему кроветворения интактных животных..............................................................................................................................................................76

4.4 Гемостимулирующая эффективность трипептидов

и пептидомиметиков в условиях радиационного воздействия.............. 81

4.4.1 Гемостимулирующая эффективность трипептидов

и пептидомиметиков в условиях острого гамма-облучения........... 81

4.4.2 Гемостимулирующая эффективность трипептидов

и пептидомиметиков в условиях фракционированного облучения. 94

4.5 Сравнительный анализ гемотропной активности среди циклических пептидных соединений на основе 2,5-дикетопиперазина.. 102

4.6 Гемостимулирующая эффективность

Сус10-{С1и-(11е0Н)-01и-(Тф0Н)} на гранулоцитопоэз в условиях

цитостатической миелосупрессии................................................ 110

Заключение................................................................................. 117

Выводы...................................................................................... 124

Список использованных источников................................................ 126

Введение

Актуальность темы исследования

Известно, что при воздействии на организм высших животных и человека ионизирующей радиации в сублетальных и минимальных летальных поглощенных дозах решающее значение для исхода лучевого поражения имеет постлучевое состояние системы гемопоэза. Общее облучение в указанном диапазоне доз, как показали события последних десятилетий, вполне возможно при возникновении аварийных ситуаций на объектах атомной энергетики. Методы широко применяемой в практической медицине лучевой терапии опухолей имеют тенденцию к использованию высоких разовых и суммарных очаговых доз локального лучевого воздействия. При этом реальным фактором, ограничивающим возможности последующего или параллельного с облучением химиотерапевтического воздействия на опухолевые клетки (а иногда - и завершение запланированного курса лучевой терапии), является постлучевая супрессия кроветворения вследствие гибели значительной части гемопоэтических клеток, попадающих в зону облучения [191, 211]. При проведении лучевой терапии больным злокачественными опухолями негативные эффекты на гемопоэз обусловлены не только сужением плацдарма кроветворения из-за гибели гемопоэтических стволовых и пролиферирующих клеток, но и токсическим влиянием продуктов, образовавшихся в результате распада клеток опухоли и не только её. Кроме того, широкое применение в онкологической практике получили антибластомные цитостатические препараты, позволяющие добиться значительного повышения продолжительности и качества жизни больных. Однако большинство используемых современных цитостатических лекарственных средств не обладают избирательным воздействием на опухоль и оказывают токсический эффект на здоровые ткани организма. Особенно восприимчивы к повреждающему действию цитостатиков клеточные системы организма с высоким пролиферативным потенциалом и, в первую очередь,

кроветворные клетки костного мозга и иммунокомпетентные элементы лимфоидной ткани [34, 212]. Можно заключить, что именно физиологическая система гемопоэза является «мишенью» указанных выше воздействий.

Из анализа литературы следует, что, несмотря на определенные успехи в создании противолучевых средств, диапазон реальных возможностей борьбы с негативными последствиями облучения пока ограничен, что не позволяет считать проблему решенной.

С учетом приведённых обстоятельств, можно считать, что для радиобиологии и радиационной медицины остается высоко актуальным поиск новых эффективных способов и средств борьбы с последствиями переоблучения, и в частности, создание препаратов и способов активации супрессированного облучением либо цитостатиками гемопоэза.

В последние годы интересные с научной и практической точек зрения результаты получены при изучении биологического действия синтетических пептидов различного аминокислотного состава [29, 114]. Установлено, что среди этого класса соединений, играющих важную роль в регуляции важнейших физиологических функций организма, имеются и соединения с высокой биологической активностью в отношении гемопоэза, причём их эффекты могут быть разнонаправлены (торможение либо стимуляция) [32, 50]. При этом имеет существенное значение вариант их применения (до или после лучевого воздействия). Кроме того, у некоторых из этих соединений выявлены отчётливые иммуномодулирующие и антистрессорные свойства. К препаратам подобного строения, уже применяемым в клинической практике, относятся, например, «Тимоген®», «Тимодепрессин®», «Стемокин®» [29, 80, 121, 142, 148]. Абсолютная нетоксичность, отсутствие побочных эффектов, широкая область применения низкомолекулярных пептидов побуждают исследователей продолжить поиск среди них активных соединений, а также совершенствовать уже созданные препараты.

Наряду с несомненными успехами в этом направлении, структурно-функциональные зависимости и конкретные механизмы реализации эффектов

пептидных соединений изучены явно недостаточно. Интересен также в практическом отношении вопрос о сохранении биологической активности при «зацикливании» цепочки пептидов, что позволяет перейти к пероральному введению препаратов. Получение новой научной информации в указанных направлениях и обусловливает актуальность избранного для выполнения диссертационной работы направления научных исследований.

Цель и основные задачи исследования

Целью настоящей работы являлся анализ закономерностей влияния трипептидов семейства 01и-Тгр (Е\\г) и их циклических аналогов на основе 2,5-дикетопиперазина на систему кроветворения интактных и облучённых животных в зависимости от их химической структуры и варианта применения.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи исследования:

1. В экспериментах на животных оценить реакции интактного гемопоэза на введение вновь синтезируемых пептидов и пептидомиметиков. Отобрать препараты с наибольшей биологической активностью.

2. На модели общего гамма-облучения изучить радиомодифицирующие эффекты пептидных соединений при разных вариантах лучевого воздействия.

3. Оценить сохранность биологической активности соединений с циклической структурой при их парентеральном, а также пероральном введении.

4. На основе полученных данных попытаться установить зависимость функции от химической структуры и предложить соединения, наиболее перспективные для возможного клинического использования.

Поставленные задачи решали путем проведения экспериментов на лабораторных животных. В качестве радиационного фактора использовали у-кванты 60Со. Оценку состояния системы кроветворения у животных проводили с помощью методов, общепринятых в современной радиационной гематологии.

Полученные данные обрабатывали статистическими методами, применяемыми при математической оценке результатов биологических экспериментов.

Научная новизна работы

В результате проведённых исследований радиобиологической направленности впервые прослежены реакции интактного гемопоэза и облучённого (in vitro) костного мозга на введение ряда новых пептидных соединений. Установлена зависимость функциональной активности трипептидов семейства Glu-Trp от оптической изомерии (L-, D-), варианта химической связи (а или у) и наличия дополнительного аминокислотного остатка (Ala, Val, Leu, Не).

Выявлено, что некоторые пептидные препараты оказывают гемостимулирующий эффект при назначении их после облучения; особенно выражен этот эффект в условиях фракционированного облучения, в результате чего существенно снижается постлучевая супрессия кроветворения.

Показано, что преобразование структуры линейных трипептидов в производные 2,5-дикетопиперазина сохраняет биологическую активность препаратов. Экспериментально обоснована концепция стабилизации низкомолекулярных пептидных соединений путём превращения их в производные 2,5-дикетопиперазина, получены стабильные при пероральном введении соединения, сохраняющие свою биологическую активность.

Впервые обнаружены новые свойства у некоторых пептидных соединений -стимуляция пролиферации интактного костного мозга.

Практическая значимость работы

В ходе выполнения квалификационной работы среди вновь синтезированных трипептидов и пептидомиметиков обнаружены новые оригинальные соединения, обладающие высокой биологической активностью по отношению к клеточной системе кроветворения.

Обнаружено, что новые соединения (линейные трипептиды и их циклические аналоги на основе 2,5-дикетопиперазина) при введении мышам* после облучения в сублетальных дозах стимулируют восстановление кроветворения, обеспечивая тем самым существенное ослабление проявлений костномозгового синдрома острой лучевой болезни. Установлено, что стимуляция процессов постлучевого восстановления гемопоэза при использовании пептидных соединений наиболее эффективна в условиях относительно небольшой глубины опустошения кроветворного пула, а также при фракционированном облучении, моделирующем сеансы лучевой терапии онкобольных при относительной сохранности гемопоэза, что позволяет увеличить суммарную дозу облучения. Поэтому свойство пептидных соединений ускорять постлучевое восстановление кроветворения может представлять значительный практический интерес. Пептидомиметик Сус1о-{01и-(11еОН)-С1и-(ТгрОН)}, отобранный в качестве лидерного соединения для дальнейших исследований, может оказаться полезным для снижения системных негативных последствий цитостатической терапии, онкологических заболеваний и вследствие этого может быть предложен для включения в схему комплексной терапии опухолей.

Комплексный анализ биологической активности исследованных соединений в зависимости от их химической структуры показывает перспективные направления дальнейших работ по созданию лекарственных препаратов нового поколения в целях модификации гемопоэза в условиях лучевого или цитостатического воздействия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

По результатам проведенных исследований опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 в рецензируемых научных журналах согласно перечню ВАК МОиН РФ для кандидатских диссертаций.

1. Дейгин, В. И. Изучение влияния пептидных производных дикетопиперазинов на стволовые кроветворные клетки нормального организма и

облучённые in vitro клетки костного мозга / В. И. Дейгин, А. С. Саенко, Ю. А. Семин, А. С. Шевченко*, А. А. Лузянина, О. С. Изместьева, Л. П. Жаворонков // Радиационная биология. Радиоэкология. -2011.-Т. 51, №5.-С. 530-535.

2. Лузянина, А. А. Изучение влияния синтетических трипептидов на стволовые гемопоэтические клетки в норме и при гамма-облучении / А. А. Лузянина, А. С. Горячева, Ю. А. Семин, О. С. Изместьева, В. И. Дейгин, А. С. Саенко, Л. П. Жаворонков // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2012. - Т. 52, №3.-С. 257-260.

3. Горячева, А. С. Влияние пептидов на постлучевое восстановление гемопоэза / А. С. Горячева, А. А. Лузянина, О. С. Изместьева, Л. П. Жаворонков, В. И. Дейгин, А. С. Саенко // Бюллетень Национального радиационно-эпидемиологического регистра «Радиация и риск». - 2012. - Т. 21, № 4. - С. 41-50.

4. Шевченко, А. С. Влияние триптаминсодержащих пептидов на интактный и облученный костный мозг животных / А. С. Шевченко, Л. П. Жаворонков, Ю. А. Семин, О. С. Изместьева, В. И. Дейгин, А. С. Саенко // Техногенные системы и экологический риск: Материалы докладов VII Региональной научной конференции. - Обнинск: ИАТЭ НИЯУ МИФИ, 2010. - Ч. 2 - С. 27.

5. Дейгин, В. И. Изучение влияние пептидных производных дикетопиперазинов на стволовые кроветворные клетки нормального организма и облучённые in vitro клетки костного мозга / В. И. Дейгин, А. С. Саенко, Ю. А. Семин, А. С. Шевченко, О. С. Изместьева // VI Съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность): Тезисы докладов. Том I (секции I-VII). Москва, 25-28 октября 2010 г. - М.: РУДН,

2010.-С. 89.

6. Шевченко, А. С. Исследование гемостимулирующих свойств «Стемокина®» и его аналога на основе 2,5-дикетопиперазина / А. С. Шевченко, А. А. Лузянина, Ю. А. Семин, О. С. Изместьева, Л. П. Жаворонков, В. И. Дейгин // V Российский симпозиум «Белки и пептиды»: Тезисы докладов - Петрозаводск,

2011.-С. 355.

- фамилия до замужества

7. Дейгин, В. И. Влияние химической и оптической изомерии на биологические свойства низкомолекулярных пептидов и производных 2,5-дикетопиперазинов / В. И. Дейгин, О. Б. Ксенофонтова, Е. С. Ефремов, А. С. Шевченко, Ю. А. Семин, О. С. Изместьева, А. А. Лузянина, А. С. Саенко // V Российский симпозиум «Белки и пептиды»: Тезисы докладов - Петрозаводск, 2011.-С. 139.

8. Горячева, А. С. Изучение восстановления гемопоэза трипептидом после воздействия ионизирующей радиации / А. С. Горячева, А. А. Лузянина, Ю. А. Семин, О. С. Изместьева, Л. П. Жаворонков, В. И. Дейгин // Сборник научных работ лауреатов конкурса им. Е.Р. Дашковой, выпуск 5 - Калуга, 2011. - С. 10-17.

9. Горячева, А. С. Влияние пептидов на восстановления гемопоэза после воздействия ионизирующей радиации / А. С. Горячева, А. А. Лузянина, О. С. Изместьева, Л. П. Жаворонков, Ю. А. Семин, В. И. Дейгин // 16-я Междун