Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антибактериальное действие пептидных компонентов гемолимфы личинок Galleria Mellonella в условиях специфической и неспецифической индукции

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Антибактериальное действие пептидных компонентов гемолимфы личинок Galleria Mellonella в условиях специфической и неспецифической индукции"

На правах рукописи

КОСТИНА ДИНАРА АЛЕКСАНДРОВНА

АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДНЫХ КОМПОНЕНТОВ ГЕМОЛИМФЫ ЛИЧИНОК GALLERIA MELLONELLA В УСЛОВИЯХ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИНДУКЦИИ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук 13 ПАЙ 2015

005568513

005568513

Работа выполнена на кафедре биохимии, биотехнологии и биоинженерии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный университет»

Научный руководитель:

Кленова Наталья Анатольевна Доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Генгин Михаил Трофимович Доктор биологических наук, профессор

Коннова Светлана Анатольевна Доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация:

Главный научный сотрудник НИИ Фундаментальных и прикладных исследований, профессор кафедры общей биологии и биохимии ФГБОУ ВПО «Пензенский государственный университет» Заведующая кафедрой биохимии и биофизики Национального исследовательского Саратовского государственного университета Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины» (ФГБНУ «ИЭМ»)

Защита диссертации состоится «17» июня 2015 г. в «14.00» часов на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (ИБГ УНЦ РАН) по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться на сайте ИБГ УНЦ РАН (ibg.anrb.ru/dissov.html) и в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, просп. Октября, д. 71)

E-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «_»_2015 г.

Учёный секретарь диссертационного

совета Д 002.133.01 ../"/'"

доктор биологических наук, доцент (/^¡г' Гульназ Фаритовна

Корытина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Разработка новых антимикробных лекарственных средств и технологии их производства составляет одну из наиболее актуальных проблем здравоохранения и фармацевтической промышленности (Черныш и др., 1999, 2008, 2011). В настоящее время распространение бактериальных штаммов с множественной устойчивостью к антибактериальным химиотерапевтическим препаратам стало повсеместным и превратилось в од[гу из центральных проблем современной медицины (Бриан и др., 1984; Машковский, 1993; Белоусов и др., 1998; Шабалов, 2004; Ferjani, 2015). В связи с этим в последние годы интенсивно ведется поиск более эффективных антибактериальных средств. Особый интерес представляют антимикробные пептиды, обнаруженные как компоненты неспецифичных врождённых механизмов борьбы с инфекциями у животных. При инфекции антимикробные пептиды составляют, как эффективная система защиты, первый защитный барьер против бактерий, грибов, протозоев, вирусов и нематод (Bulet et al., 2005). Беспозвоночные, в противоположность позвоночным, никакой дополнительной адаптивной иммунной системой не располагают, антимикробные пептиды у них выполняют ключевую функцию в иммунной защите. Поэтому в последние годы из насекомых было выделено большое число антимикробных пептидов по силе действия сопоставимых с уже известными антибиотиками. Перспективным объектом получения антибактериальных пептидов являются личинки восковой моли. В литературе имеется значительное количество данных, касающихся выделения и исследования биологически активных пептидов из личинок Gallería mellonella (Cytrinska et al., 2006, 2007; Mak et al., 2007; Zdybicka-Barabas et al., 2012; Correa et al., 2014). Нами была проведена совместная исследовательская работа с ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН г. Пущино и кафедрой органической, биоорганической и медицинской химии ФГБОУ ВПО «Самарский государственный университет». Индукция образования антибактериальных пептидов в условиях иммунизации насекомых бактериями в настоящее время — принятый способ обнаружения новых бактерицидных агентов (Таран и др., 2002). Определенный интерес представляло исследование возможности образования биологически активных пептидных соединений в условиях неспецифической индукции, так как действие ксенобиотиков может способствовать образованию

пептидных соединений, обладающих более широкой антибактериальной активностью. Одним из таких соединений является 1,1-диметилгидразин (гидразон), который применяется в качестве жидкого ракетного топлива. Данное соединение подвергается трансформации и может оказывать сильное неспецифическое повреждающее воздействие на живые организмы (Беклемишев и др., 2010). Представляло интерес изучить производство антибактериальных пептидов личинками Gallería mellonella в условиях специфической индукции грамположительными и грамотрицательными бактериями, а также неспецифического действия гидразоном.

Целью исследования стало изучение антибактериальных свойств биологически активных пептидных соединений гемолимфы личинок Gallería mellonella, выделенных в условиях специфической и неспецифической индукции, а так же изучение их влияния на ферментативную активность Escherichia coli.

Задачи исследования:

1. Определить антибактериальную активность спиртовых экстрактов личинок Gallería mellonella по отношению к Escherichia coli;

2. Осуществить воздействие на личинки Gallería mellonella суспензией Pseudomonas aerugenosa, Escherichia coli, суспензией смеси клеток Escherichia coli и Bacillus cereus, а также раствором 1,1-диметилгидразина;

3. Осуществить очистку, фракционирование и масс-спектрометрическое определение пептидных компонентов гемолимфы Gallería mellonella larvae, полученных в условиях специфической и неспецифической индукции методами обращено-фазной, ионообменной, высокоэффективной хроматографии, гель-электрофореза и МАЛДИ-анализа;

4. Изучить антибактериальную активность пептидных фракций гемолимфы личинок Galleria mellonella без воздействия и с воздействием по отношению к грамотрицательным и грамположительным бактериям;

5. Изучить влияние пептидных компонентов фракций гемолимфы личинок Galleria mellonella без воздействия и с воздействием на ферментативную активность Escherichia coli.

Научная новизна. Впервые проведено исследование антибактериальных свойств спиртовых экстрактов личинок восковой моли, используемых в народной медицине, а также биологически активной добавки «Натуральный экстракт

доктора Мухина». Изучена антибактериальная активность смеси пептидных компонентов, содержащихся во фракциях гемолимфы личинок восковой моли после индукции суспензией клеток Pseudomonas aerugenosa, Escherichia coli, суспензией смеси клеток Escherichia coli н Bacillus cereus, а также раствором 1,1-диметилгидразина по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям. Впервые изучено влияние пептидных соединений, содержащихся во фракциях гемолимфы интактных личинок восковой моли, а также после действия 1,1-диметилгидразина на активность ферментов Escherichia coli. Доказана антибактериальная активность пептидных фракций гемолимфы личинок Galleria mellonella в указанных условиях воздействия по отношению к Escherichia coli и Bacillus cereus. Показано влияние пептидных фракций гемолимфы интактных личинок восковой моли и личинок после воздействия гидразоном на активность маркерных ферментов Escherichia coli. В гемолимфе личинок Galleria mellonella обнаружены ранее неизвестные пептидные компоненты, обладающие антибактериальной активностью.

Научно-теоретнческая значимость. В связи с выделением новых антибактериальных пептидных компонентов перспективным и актуальным представляется дальнейшее более детальное их изучение с целью создания новых антибактериальных пептидов для последующей разработки нового класса антибактериальных лекарственных препаратов, предназначенных для лечения бактериальных инфекций. Обнаружение влияния пептидных компонентов гемолимфы Galleria mellonella Larvae на активность маркерных ферментов Escherichia coli свидетельствует о наличии второго механизма действия: поступления в клетку и регуляторного воздействия на метаболические системы бактерий.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Самарских областных научных конференциях студентов (Самара, 2009-2011), на Ломоносовской конференции МГУ (Москва, 2011), конференции «Высокие технологии, исследования в образовании, медицине и фармакологии» (Санкт-Петербург. 2012), 12-й Международной конференции, посвященной М.В. Ломоносову (Самара, 2012), VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013).

В 2011 году работа по теме диссертации победила на областном конкурсе «Молодой ученый», в номинации «студент», а в 2014 году в номинации «аспирант».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, 3 статьи опубликованы в рецензируемых журналах по перечню ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследований, главы данных собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками, содержит 14 таблиц и 23 приложения. В работе использовано 220 источников, из них 76 отечественных и 144 зарубежных.

Благодарности. Автор выражает благодарность к.х.н. Федоткиной Олесе Сергеевне (ФГБОУ ВПО «Самарский государственный университет», кафедра органической, биоорганической и медицинской химии) и д.х.н., заведующему лабораторией физико-химических основ хроматографии и хромато-масс-спектрометрии ФГБУН Института физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН Буряку Алексею Константиновичу за помощь в проведении хроматографического и МАЛДИ-анализа, а также к.б.н., старшему научному сотруднику ФГБУН Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН Литвиновой Елене Геннадьевне за идейную и практическую помощь и предоставление личинок восковой моли.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использованы личинки восковой моли, выращенные в естественной среде (пасека в Самарской области), в лабораторных условиях на искусственной питательной среде (ИТЭБ РАН г. Пущино), а также в лаборатории ФГБОУ ВПО «Самарский государственный университет». Личинки выращены из отложенных Gallería mellonella яиц на естественном корме (темная восковая сушь, содержащая пергу, прополис и остатки меда) в термостате, при температуре 30°С.

Экстракты №1 и №2 получали из целых и гомогенизированных личинок. Экстракцию биологически активных веществ (БАВ) проводили 34% раствором

этилового спирта. Полученные экстракты хранили в темноте при 4°С.

"Натуральный экстракт доктора Мухина" представлял собой биологически активную пищевую добавку, производимую в ИТЭБ РАН г. Пущино по запатентованной технологии спиртовой экстракции личинок Gallería mellonella, выращиваемых в лабораторных условиях на искусственной питательной среде (Патент РФ №2038086). Экстракт хранили в темноте при 4°С. Полученные экстракты содержали этиловый спирт в концентрации 34%.

Обработка личинок Gallería mellonella и получение гемолимфы. Для эксперимента были отобраны целые, подвижные особи, находившиеся в стадии развития, предшествующей окукливанию. Осуществляли специфическую индукцию личинок, вкалывая в брюшную полость микрошприцем по 0,5-1 мкл разведенной в физиологическом растворе суспензии Pseudomonas aerugenosaxt PAOl, Escherichia coli М-17 и смеси клеток Escherichia coli М-17 и Bacillus cereus АТСС 10792Т. Также личинки неспецифически индуцировали 0,01% раствором гидразона (производное 1,1-диметилгидразина с ацетоном), вводя каждой особи 0,5-1 мкл данного раствора. В качестве контроля использовали интактные личинки. Обработанные личинки 48 часов выдерживали в термостате при 30°С на естественном корме. Интактные личинки находились в тех же условиях, и дальнейшая их пробоподготовка проводилась аналогично.

Пробоподготовка гемолимфы. Для получения гемолимфы личинки окунали в 70%-ный этанол и охлаждали на льду. Гемолимфу собирали пипеткой, отрывая каждой личинке переднюю лапу, и слегка сжимая брюшную полость. Гемолимфу помещали в пробирку, содержавшую 0,5 мл раствора фенилтиомочевины (0,01мкМ) и ингибитора протеаз (20 мкг/мл). Клетки и дебрис осаждали центрифугированием при 100g в течение 5 мин. Супернатант повторно центрифугировали 30 мин при 2300g. Для делипидизации к супернатанту добавляли равный объем гексана, встряхивали в течение 10 мин, отстаивали 10 мин и центрифугировали 15 мин при 100g. После центрифугирования происходило разделение фракций. Гексановую фракцию (сверху) удаляли. К полученному раствору добавляли равный объем этилацетата, встряхивали 5 мин, отстаивали 5 мин и центрифугировали при 100g в течение 15 мин для расслоения. Фракцшо с этилацетатом удаляли. Для осаждения белков к полученному раствору

добавляли 5 мл смеси метанол-ледяная уксусная кислота-вода (90:1:9, по объему) и центрифугировали при 20 000g в течение 30 мин.

Фракционирование белков гемолимфы. Для фракционирования белков использовали методы хроматографического и электрофоретического разделения образцов полученной гемолимфы.

Гель-электрофорез осуществляли в щелочной боратной буферной системе (рН 9,2) в 7,5% полиакриламидном геле, используя реактивы, камеру фирмы «Reanal» и универсальный источник питания УИП-1.

Метод обращено-фазовой хроматографии. Супернатант подвергали обращено-фазовой твердофазной хроматографии с использованием картриджа Bakerbond spe С-18. Элюцию проводили 0,1М Na-фосфатным буфером, рН 7,2. Были получены 4 фракции по 1,5 мл, различающиеся временем элюции. Содержание пептидов во фракциях определяли по методу Лоури.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Подготовленные растворы подвергали разделению методом ВЭЖХ (Agilent 1200 Series, диодно-матричный детектор Agilent 1200 Series Diode Array and Multiple Wavelength (DAD) фирмы «Agilent Technologies» (США)). Для фракций, полученных после элюции 40% ацетонитрилом (Олдрич, США, марки HPLC с чистотой на 99,9%), градиент составил 10-50% за 0-20 мин и 50-80% за 20-22 мин. Фракции были отобраны со второй минуты по 1,5 мл. Хроматографировали образцы полученной гемолимфы и собирали фракции в режиме On Line. Объем пробы составлял 20 рл.

Катионообменную хроматографию проводили на колонке (16x0,8см), заполненной сефадексом КМ-50 и уравновешенной 0,1М ацетатом аммония рН 7,6, содержащим на каждые 100 мл по 10 мкл тритона Х-100. У всех полученных фракций было измерено поглощение при 210 и 280 нм на спектрофотометре ЛОМО СФ-46 (Россия), а также определено содержание белка по методу Лоури.

Масс-спектрометрический анализ полученных образцов проводили на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II Bruker (азотный лазер с длиной волны 337 нм и частотой импульса до 20 Гц) фирмы «Bruker Daltoniks» методом матричной лазерной десорбционной ионизации.

ВЭЖХ и МАЛДИ-анализ проводили в лаборатории ФГБУН Института физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН.

В качестве тестовых микроорганизмов использовались суточные инокуляты

Escherichia coli M-17 и Bacillus cereus АТСС 10792T.

Определение антибактериальной активности проводили диск-диффузионным методом. В качестве образцов сравнения для фракций гемолимфы использовали диски, пропитанные фракциями гемолимфы интактных личинок Galleria mellonella, диски, пропитанные стерильной дистиллированной водой, 34%-м этанолом, а также буфером различной молярности.

Изучение влияния пептидиых компонентов на ферментативную активность клеток Escherichia coli осуществляли стандартными методами. Определение общей дегидрогеназной активности по методу Романенко, 1974, каталазной активности по методу Королюка и соавт., 1988, активности сукцинатдегидрогеназы по методу Герхарда, 1984. Определение активности щелочной фосфатазы проводили, используя стандартный набор определения активности щелочной фосфатазы оптимизированным кинетическим методом (щелочная фосфатаза-03-ВИТАЛ).

При обработке полученных данных использовалась программа Statistica 5.0. Значение Р<0,05 использовали как минимум для определения статистической значимости (Фролов, 1997).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение антибактериальной активности спиртовых экстрактов личинок восковой моли

Личинки восковой моли содержат белки, обладающие лизоцим-подобной активностью, однако, по-видимому, не все компоненты переходят в препарат при экстракции. Было показано, что непосредственное воздействие «Натуральным экстрактом доктора Мухина» не оказывает бактерицидное действие на культуру Mycobacterium tuberculosis (Литвинова и др., 2006). Однако возможное наличие антибактериальных пептидов может определять его активность против грамотрицательных бактерий.

Нами была изучена антибактериальная активность спиртовых экстрактов гомогенизированных и цельных личинок восковой моли (Экстракт №1 и №2), а также «Натурального экстракта доктора Мухина» по отношению к Escherichia coli. Было установлено, что Экстракт №2 (гомогенизированные личинки) и

«Натуральный экстракт доктора Мухина» обладали небольшим антибактериальным эффектом по отношению к Escherichia coli, задерживая рост на 8-9%, тогда как Экстракт №1 не обладает антибактериальным эффектом. По-видимому, это связано с тем, что пептидные компоненты хуже проникают в спиртовой раствор без предварительной гомогенизации.

Так как для гемолимфы личинок Galleria mellonella характерно наличие пептидных соединений с антибактериальным действием, представляло интерес изучение состава гемолимфы личинок, полученной в различных условиях иммунизации.

2. Исследование антибактериальной активности пептидных компонентов гемолимфы личинок Galleria mellonella, индуцированных Pseudomonas aerugenosa

Гемолимфа, полученная из личинок, подвергнутых действию Pseudomonas aerugenosa, была очищена и разделена на 15 фракций с помощью катионообменной хроматографии. Основная часть белковых компонентов, содержащихся в гемолимфе личинок Galleria mellonella имела молекулярную массу в диапазоне от 5 до 20кДа.

Из полученных фракций гемолимфы были отобраны шесть, характеризующиеся концентрацией пептидных соединений, превышающей 0,4 мг/мл. Все они обладали бактериостатическим эффектом по отношению к Escherichia coli, процент задержки роста составлял от 8 до 50%.

Мы предположили, что данный эффект обусловлен наличием антибактериальных пептидных компонентов во фракциях. Проведенный гель-электрофорез фракций №3, №4, №7, №8 гемолимфы личинок Galleria mellonella, индуцированных культурой Pseudomonas aerugenosa позволил выявить четыре, пять, пять и два индивидуальных белковых компонентов соответственно (рис. 1).

47 кДа 34 кДа

20 кДа

J

627 Да

А Б В Г Д

Рисунок 1. Электрофореграммы фракций №3 (Б). №4 (В), №7 (Г), №8 (Д) гемолимфы личинок Galleria mellonella, индуцированных культурой Pseudomonas aerugenosa. Маркерные пептидные соединения (А): лизоцим 20кДа, карбоангидраза 34кДа, яичный альбумин 47кДа

Проведенный МАЛДИ-анализ, позволил выделить и оценить молекулярную массу белкового компонента, который, возможно, обусловливает антибактериальный эффект фракции №3. Молекулярная масса пептида составила 5627Да (рис.2).

Рисунок 2. Спектр фракции №3 гемолимфы личинок Galleria mellonella обработанных Pseudomonas aerugenosa (МАЛДИ-спектрометрия)

Предположение об антибактериальной активности данного пептида основано на имеющихся данных частого обнаружения в гемолимфе личинок восковой моли пептидов со сходными молекулярными массами, относящихся к группе цекропинподобных.

3. Исследование антибактериальной активности пептидных компонентов гемолимфы личинок Galleria meUonella, индуцированных Escherichia coli

Обнаружение в гемолимфе личинок, подвергнутых действию Pseudomonas aerugenosa антибактериальных пептидов, ограничивающих рост E.coli, позволяло предположить, что в условиях иммунизации культурой кишечной палочки, в ней могут появиться пептиды, проявляющиеся более эффективное действие на эти бактерии. С целью дальнейшего изучения образования антибактериальных пептидных соединений личинками восковой моли проведено специфическое действие на них суспензией клеток Escherichia coli и выделенная гемолимфа была подвергнута ионообменной хроматографии.

Фракции, полученные с помощью метода катионной хроматографии обладали достоверным антибактериальным эффектом по отношению к Escherichia coli по силе действия сопоставимой с фракциями, полученными из гемолимфы личинок, иммунизированных Pseudomonas aerugenosa (23-30%), но не оказывали бактериостатического эффекта по отношению к Bacillus cereus.

Полученные данные, позволяют предположить, что пептидные компоненты, содержащиеся в составах фракций, по-видимому, относятся к цекропинподобным белкам, так как все цекропнны в основном активны по отношению к грамотрицательным и только некоторым грамположительным бактериям (Bacillus megaterium, Micrococcus luteus), но неэффективны против стафилококков и большинства других видов рода Bacillus (Черныш и др., 2008).

4. Исследование антибактериальной активности пептидных компонентов гемолимфы личинок Galleria mellonella, индуцированных смесью культур Escherichia coli и Bacillus cereus

Действие на личинки восковой моли смесью культур Escherichia coli и

Bacillus cereus, а также использование гемолимфы интактных личинок для получения фракций методом ВЭЖХ показало, что антибактериальным эффектом обладают как фракции, полученные из гемолимфы индуцированных личинок, так и интактных личинок восковой моли. Фракции гемолимфы были активны в основном против Escherichia coli. После индукции уровень антибактериальной активности фракций гемолимфы значительно возрастает (табл.1).

Таблица 1 — Значения зон задержки роста Escherichia coli на плотной среде вокруг дисков, пропитанных фракциями ВЭЖХ гемолимфы личинок восковой моли

№ фракции Время, мин Интактная группа личинок Группа личинок, индуцированных смесью культур Escherichia coli и Bacillus cereus

Зона задержки роста Е. coli, мм Зона задержки роста Е. coli, мм

1 2-3,5 6,00±0,00 10,00 ±0,90 Р<0,01

2 3,5-5 7,30±0,40 Р<0,05 7,50 ± 0,60 Р<0,05

3 5-6,5 7,70±0,80 Р<0,01 7,80 ± 0,60 Р<0,05

4 6,5-8 6,8±0,4 8,8±0,4 Р<0,01

5 8-9,5 10,30 ± 2,20 Р<0,01 6,80 ± 0,40

6 9,5-11 7,00±0,50 Р<0,05 10,30±1,30 Р<0,01

7 11-12,5 6,00±0,00 8,5±0,02 Р<0,01

8 12,5-14 6,00±0,00 8,3±0,04 Р<0,01

10 15,5-17 9,30 ± 0,75 Г<0,01 9,00 ± 0,8 Р<0,05

11 17-18,5 7,2±0,3 Р<0,05 8,8±0,5 Р<0,01

13 20-21,5 9,00 ± 0,57 Р<0,01 6,00 ± 0,00

14 21,5-23 6,00± 0,00 8,5±0,9 Р<0,01

Контроль Буфер 6,00± 0,00 6.00± 0.00

Масс-спектрометрнческий анализ показал, что почти все фракции содержат смесь пептидов. Антибактериальный эффект фракций гемолимфы личинок восковой моли во многом, вероятно, обусловлен обнаруженными нами в их составе известными антибактериальными пептидами (табл. 2).

Таблица 2 - Молекулярные массы пептидных компонентов, обнаруженных в

составах фракций ВЭЖХ, обладающих антибактериальным эффектом по отношению к Escherichia coli и Bacillus cereas

№ фракции Время, мин Интактная группа личинок Группа личинок, индуцированных смесью культур Escherichia coli и Bacillus cereus

Обнаруженные пептиды, Да Обнаруженные пептиды, Да

1 2-3,5 875 875, 1013

2 3,5-5 875, 1062 1096, 1258, 6789

3 5-6,5 1480, 1979,2183, 4820 1064, 1226, 1682, 1845, 4820

4 6,5-8 988, 1100, 1355, 2744,3166, 3481,3664 813, 878, 988, 1355, 1451,2744, 2891,2985,3139,3166, 3481, 3664

5 8-9,5 814, 1144, 1231, 1411, 1696, 1798, 1856, 1983, 2397,2435, 2933 814, 1058, 1144, 1231, 1495, 1696, 1798, 1856, 1983, 2048, 2383, 2399, 2435, 2748, 2933, 4801,6155

б 9,5-11 1695, 2211, 5595, 6318,6459, 8340,9161 875, 1231, 1695, 2211, 5595, 6318. 6459, 8340,9161

7 11-12,5 1731, 1822, 2075, 2323, 2566, 6318,9161,6790 875, 1731, 1822, 2075,2323, 2566, 6318,9161,6790

8 12,5-14 1206, 1543, 1961,2153,2211, 2312, 2557, 2659, 2760, 2888, 3030, 3414,3577,3734, 4342, 6118,7151,8400, 9311,8023 1206, 1553, 1832, 1961, 2153, 2211, 2357, 2559, 2659, 2760, 3032, 3414, 3577,3734, 4342, 4900,7151,6118, 8400, 9311, 8023

10 15,5-17 982, 2563, 2620, 2734, 2819, 2919,3577, 4503,4714 982, 1129, 2494, 2563, 2620, 2733, 2819, 2919, 3577, 4585, 4714.5716,6113, 12222

11 17-18,5 1680, 2463, 2564, 2734, 2820, 2929, 3034, 3425, 3614, 3844, 4183,4463, 5039,5105,5710, 6980, 9082, 12230 2463, 2701, 2818, 2927, 3032, 3423,3612,3842,4180, 4461, 5035, 5576, 5732,6116, 6287, 6528, 6683, 6999, 9075, 12217

13 20-21,5 2276, 3284, 4819, 4837, 5039, 7036, 9048, 18088, 3146, 4255, 4819, 6979

14 21,5-23 3614, 4255, 4837, 5039,9048, 18088 3283,3647, 3973,4130, 4835, 5237, 5384, 9043,18088

Примечание. Полужирным шрифтом выделены уже известные

антибактериальные пептиды

В составе фракций №3 и №13 гемолимфы индуцированных и интактных личинок обнаружен Lebocin-like anionic peptide I LEB1 GALME (4820Да). Данный

антибактериальный пептнд активен против чувствительных микроорганизмов только в относительно высоких концентрациях, способен подавлять рост грамотрицательных бактерий, а также проявляет бактериостатическую активность в отношении некоторых грамположительных бактерий (Cytrynska et al., 2007). Проведенные нами исследования также показали наличие бактериостатического эффекта при добавлении компонентов фракций №3 и №13 гемолимфы интактных личинок по отношению к Escherichia coli и Bacillus cereus. Фракция №9 гемолимфы индуцированных и интактных личинок содержала в своем составе известный антибактериальный пептид - Defensin-like peptide (4949Да) (Cytrynska et al., 2006), проявляющий антимикробную активность против грамотрицательных и грамположительных бактерий, дрожжей и грибов. Однако в нашем исследовании данная фракция не проявляла антибактериального эффекта в отношении Bacillus cereus. Кроме того, фракция №9 содержала антимикробный пептид Proline-rich antimicrobial peptide 2 (4929Да) (Cytrynska et al., 2006) неактивный против грамотрицательных, но проявляющий антибактериальный эффект в отношении грамположительных бактерий и грибов. В составе фракции №10 индуцированных и интактных личинок восковой моли присутствовал известный

антибактериальный пептид Galleria-defensin DEF1GALME с массой 4714Да (Lee et al., 2004; Cytrynska et al., 2007). Данный пептид описан Lee и соавторами (Lee et al., 2004), они показали, что Galleria-defensin обладает антифунгалыюй активностью, но не эффективен против Escherichia coli и Bacillus cereus. Однако в лаборатории Cytrynska и сотрудников было показано, что Galleria-defensin помимо противогрибковой активности обладал и антибактериальной активностью (Cytrynska et al., 2007). Нашими исследованиями также показано наличие у него антибактериальной активности против Escherichia coli и Bacilus cersus.

Также нами были обнаружены фракции, проявляющие антибактериальную активность против Е. coli, но не содержащие известных антимикробных пептидов (табл. 3).

Таблица 3 - Значения зон задержки роста Escherichia coli на плотной среде вокруг дисков, пропитанных фракциями гемолимфы индуцированных и интактных личинок восковой моли, содержащие только ранее неописанные

пептнды

№ фракции Время, мин Интактная группа личинок Группа личинок, индуцированных смесью культур Escherichia coli и Bacillus cereus

Зона задержки роста Е. coli, мм Обнаруженн ые пептиды, Да Зона задержки роста Е. coli, мм Обнаруженные пептиды, Да

1 2-3,5 6,0±0,0 875 10,0 ±0,9 Р<0,01 875, 1013

2 3,5-5 7,3±0,4 Р<0,05 875, 1062 7,5 ± 0,6 Р<0,05 1096, 1258, 6789

4 6,5-8 6,8±0,4 988, 1100, 1355, 2744, 3166, 3481, 3664 8,8±0,4 Р<0,01 813, 878, 988, 1355,1451, 2744, 2891,2985, 3139, 3166, 3481,3664

Идентификация вновь обнаруженных антибактериальных пептидов была проведена с помощью поисковой машины Mascot О.С. Федоткиной (Федоткина О.С., 2009, 2010). Для каждого описанного ранее пептида была оценена вероятность случайного совпадения масс, которая оказалась невысокой. При помощи программы Biotools 3.0 (опция rapid de novo sequencing - быстрое определение аминокислотной последовательности) сделана разметка спектров по возможным аминокислотным последовательностям.

5. Исследование антибактериальной активности пептидных компонентов гемолимфы личинок Gallería melloneUa, индуцированных 1,1-диметилгидразином

Выделение и очистку антибактериальных компонентов гемолимфы личинок Galleria mellonella, индуцированных гидразоном, проводили с помощью ВЭЖХ. Все полученные фракции гемолимфы личинок Gallería mellonella обладали бактериостатическим действием по отношению к Escherichia coli. Наибольшим антибактериальным эффектом обладали фракции №2-6, №18-20, №22-24, №24-26, №30-32, процент задержки роста по сравнению с контролем составил от 58 до 79%. Таким образом, неспецифическое воздействие сопровождается более

16

значительным образованием пептидных соединений, обладающих антибактериальным действием по отношению к грамотрицательным бактериям.

Также был проведен МАЛДИ-спектрометрический анализ для определения массы отдельных пептидных компонентов. Масс-спектры фракций №2-6 и № 1820 гемолимфы личинок восковой моли, обработанных 1,1-диметилгидразином представлены на рис. 3, 4.

Jill

аЛ>

i

Рисунок 3. Спектр фракции №2-6 гемолимфы Gallería mellonella larvae, индуцированных 1,1-диметилгидразином. По оси у - степень поглощения, аи. По оси х — молярная масса, Да

lLMj H*NM В (J1 SlvSLm «.J.??sT7.T T Til. T Ь.

ем- 5 ^ ы в s о вм S . " - 2 • 2 £ 2 2 я S H-N\t9(J18)V1Un *--

Рисунок 4. Спектр фракции №18-20 гемолимфы Gallería mellonella larvae, индуцированных 1,1-диметилгидразином. По оси у — степень поглощения, аи. По оси х — молярная масса, Да

В составе спектров фракций имелось большое количество пиков различной интенсивности, характеризующих наличие пептидных компонентов.

Во фракциях №2-6, №30-32 не обнаружены известные антибактериальные пептиды, однако, пептидные компоненты или их сочетание обладают антибактериальным эффектом в отношении Escherichia coli. Фракции №18-20, №24-26 содержали в своем составе известные пептиды Lebocin-like anionic peptide 1 LEB1 GALME (4819Да), Anionic antimicrobial peptide 2 AP2_GALME (6979Да), Cecropin-D-like peptide CECD GALME (4255Да) (Cytrynska et al., 2007). Кроме известных пептидных компонентов, данные фракции содержали большое количество пептидов ранее не описанных в литературе (рис. 3, 4).

Однако не наблюдалось антибактериального эффекта данных фракций по отношению к Bacillus cereus. Возможно, это объясняется тем, что данные пептидные соединения действуют по механизму нейтрализации отрицательного заряда на поверхности наружной мембраны грамотрицательных бактерий (Леонов и соавт., 2012).

6. Исследование влияния пептидных компонентов гемолимфы личинок Gallería mellonella, обработанных 1,1-днмстилгпдразнном, а также интактных личинок на ферментативную активность Escherichia coli

Большинство изученных пептидов проявляют свою цитотоксичность путем повреждения мембраны, однако нельзя исключать также и возможности проникновения пептидов внутрь клетки и их взаимодействия с внутриклеточными детерминантами. Мишенью для антимикробных пептидов могут служить отрицательно заряженные молекулы, например нуклеиновые кислоты. Для многих пептидов доказано их негативное влияние на синтез ДНК, РНК и белков (Lehrer et al., 1989; Boman et al., 1993). В связи с тем, что большинство ферментов бактерий являются индуцибельными, представлял интерес изучение возможного поступления компонентов фракций в бактериальные клетки и их влияния на ферментативную активность.

Нами было обнаружено разнонаправленное действие пептидных соединений фракций гемолимфы, полученных в условиях индукции личинок восковой моли 1,1-диметилгидразином на активность всех изученных ферментов. Часть пептидных соединений, обнаруженных в составе фракции №2-6 и №24-26 повышали активность дегидрогеназ в три раза и на 13% (Р<0,05), действие

пептидных компонентов фракции №30-32, наоборот, сопровождалось уменьшением скорости дегидрогеназных процессов на 56% (Р<0,05). Однако действие всех трех фракций сопровождалось выраженным антибактериальным эффектом. Поэтому, как ускорение дегидрогеназных процессов, так и снижение irx активности, негативно сказывается на жизнедеятельности бактериальной клетки и приводят к ее гибели.

Изучение влияния компонентов фракций гемолимфы личинок Gaileria melonella, индуцированных 1,1-днметнлгидразш1ом, на активность сукцинатдегидрогеназы в основном показало уменьшение сукцинатдегидрогеназной активности клеток Escherichia coli (до 40% (Р<0,05)). Однако при воздействии составом фракции №24-26 наблюдалось повышение активности сукцинатдегидрогеназы на 37% по сравнению с контролем (Р<0,05). Сукцинатдегидрогеназа прочно связана с внутренней поверхностью плазматической мембраны и является компонентом электронотранспортной дыхательной цепи (Диксон и др.. 1982). Изменение активности сукцинатдегидрогеназы может свидетельствовать об изменении процессов дыхания под действием различных пептидных соединений.

Изучение влияния пептидных компонентов фракций гемолимфы личинок, индуцированных гидразоном на каталазную активность Escherichia coli, показало увеличение активности данного фермента на 29 и 43% (Р<0,05), либо тенденцию к увеличению, что свидетельствует об усилении окислительных процессов и индуктивном повышении концентрации активной каталазы в клетках.

Наблюдалась также повышение активности щелочной фосфатазы E.coli при воздействии компонентами фракции №2 гемолимфы интактных личинок на 82 и 62% (2-я и 4-я минуты кинетической кривой соответственно) (Р<0,05) и тенденция к увеличению скорости реакции, катализируемой щелочной фосфатазой только к 4-й минуте кинетической кривой при воздействии фракциями №3 и №4 (рис. 5).

О 1 2 3 A 5

Вреин. мин

Рисунок 5. Кинетическая характеристика активности щелочной фосфатазы E.coli при воздействии фракций № 1 и № 2 гемолимфы личинок Galleria mellonella

Активация данного фермента, которая обнаруживается даже в условиях неоптимапьного для фермента значения рН (7,2), может свидетельствовать о интенсификации метаболизма E.coli, так как щелочная фосфатаза обеспечивает транспорт большей части фосфатов клетку, а фосфаты - главный лимитирующий фактор интенсивности энергетического обмена.

Таким образом, действительно малые концентрации пептидных компонентов гемолимфы личинок восковой моли могут оказывать бактериостатическое действие не только на мембрану клеток, но и через модуляцию активности ключевых ферментов бактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В условиях специфической и неспецифической индукции личинок восковой моли были выделены с использованием методов электрофореза, ионообменной и ВЭЖХ, определена с помощью МАЛДИ-анализа молекулярная масса пептидных соединений, обладающих антибактектериальной активностью по отношению к Escherichia coli и Bacillus cereus. Среди обнаруженных пептидных соединений оказались как ранее известные, так и впервые найденные (5627, 1013, 1062Да). Антибактериальное действие проявлялось в малых дозах (10-15 мкМ/мл) и было наиболее значительным по отношению к Е. coli. Предположительным механизмом антибактериального действия является нейтрализация отрицательного заряда поверхности бактериальных клеток, приводящая к нарушению свойств клеточной стенки и гибели клетки, а также возможное проникновение некоторых пептидных

соединений внутрь бактериальной клетки и негативное влияние их на метаболические процессы.

Полученные результаты позволили получить новые сведения о антибактериальном и иммуностимулирующем действии биологически активной добавки «Натуральный экстракт доктора Мухина», также создали перспективу для применения пептидных компонентов гемолимфы личинок восковой моли в составе новых лекарственных средств и добавок.

ВЫВОДЫ

1. Спиртовой экстракт гомогенизированных личинок восковой моли и биологически активная добавка «Натуральный экстракт доктора Мухина» обладают низким бактериостатическим действием по отношению к Escherichia coli, процент задержки роста составил 8-9%.

2. При разделении гемолимфы личинок восковой моли, полученных в условиях специфической индукции культурой Pseudomonas aerugenosa, методом ионообменной хроматографии из пятнадцати фракций пять задерживали рост Escherichia coli на 8-50%. Проведенный гель-электрофорез и масс-спектрометр ический анализ фракции №3, проявляющей наибольшую активность, показал наличие в составе фракций ранее неизвестного пептида с молекулярной массой 5627Да.

3. При разделении гемолимфы личинок восковой моли, индуцированных суспензией Escherichia coli, методом ионообменной хроматографии из двадцати восьми фракций три задерживали рост Escherichia coli на 30-37%. Ни одна из изученных фракций не проявляла антибактериального эффекта по отношению к Bacillus cereus.

4. При разделении гемолимфы интактных личинок восковой моли методом ВЭЖХ из четырнадцати фракций семь задерживали рост Escherichia coli (17-55%) и одна фракция была активна в отношении Bacillus cereus, ограничивая рост на 28%. В условиях действия на личинки смесью культур Escherichia coli и Bacillus cereus десять задерживали рост Escherichia coli (25-72%) и две фракции были активны в отношении Bacillus cereus, ограничивая рост на 38 и 22%. В составах фракций обнаруживались известные антимикробные пептиды, а также

ранее не описанные в литературе, которые обладали антибактериальным эффектом (1013Да).

5. При разделении личинок восковой моли индуцированных 1,1-диметилгидразином, методом ВЭЖХ двенадцать из восемнадцати полученных фракций активны в отношении Escherichia coli, процент задержки роста составил 25-79%. Ни одна из изученных фракций не проявляла бактерицидного эффекта по отношению к Bacillus cereus. В составе полученных фракций имеются пептидные компоненты как уже известных бактерицидных пептидов, так и ранее неописанных.

6. Пептидные компоненты фракций гемолимфы личинок Gallería mellonella, индуцированных 1,1-диметилгидразином, способны проникать через цитоплазматическую мембрану в клетку Escherichia coli. Обнаружено под действием различных пептидных компонентов повышение общей дегидрогеназной активности на 13-300% и снижение на 56%; сукцинатдегидрогеназной — повышение на 37%, снижение на 25-40%; каталазной - повышение на 29-43%, снижение на 43%. Отмечено повышение активности щелочной фосфатазы Escherichia coli под действием низкомолекулярных пептидов на 62-82%.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах из перечня ВАК:

1. Костина, Д. А. Влияние биологически активных пептидных компонентов гемолимфы личинок Gallería mellonella на рост и ферментативную активность Escherichia coli / Д.А. Костина, О.С. Федоткина, Н.А. Кленова, П.П. Пурыгин, А.К. Буряк, Е.Г. Литвинова // Известия Самарского научного центра Российской Академии Наук. Проблемы прикладной экологии и биологии. - 2013.

— Т.15. —№1. — С.567-574.

2. Костина, Д.А. Действие биологически активных компонентов гемолимфы личинок Gallería mellonella на активность щелочной фосфатазы E.coli / Д.А. Костина, Н.А. Кленова. Е.Г. Литвинова // Вестник СамГУ. Ест.-науч. серия.

- 2013. - Т. 107. - №6. - С. 182-187.

3. Костина, Д.А. Стимуляция выделения антибактериальных пептидов в гемолимфу Gallería mellonella Larvae ацетон-деметилгидразоном и влияние их на

рост и окислительный метаболизм E.coli / Д.А. Костина, О.С. Федоткина, Н.А. Кленова, П.П. Пурыпш, А.К. Буряк, Е.Г. Литвинова // Вопросы биол., мед. и фарм. химии. - 2013. - №9. - С.61-66.

Статьи и тезисы:

4. Костина, Д.А. Бактерицидная активность пептидных соединений, выделенных из гемолимфы Galleria mellonella lai~vae, иммунизированных смесью культур Escherichia coli и Bacillus cereus / Д.А. Костина // Мат. XVTII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ». - Москва. - 2011. - С. 180-181.

5. Костина, Д.А. Влияние пептидных фракций гемолимфы Galleria mellanella Larvae на ферментативную активность Escherichia coli / Д.А. Костина, Н.А. Кленова, Е.Г. Литвинова // Мат. 12-й Международной конф. - Самара. - 2012. -С.39-42.

6. Костина, Д.А. Сравнительный анализ антибактериального действия спиртовых экстрактов гемолимфы и ее фракций личинок Galleria mellanella / Д.А. Костина, О.С. Федоткина, Н.А. Кленова, Е.Г. Литвинова // Высокие технологии, исследования в образовании, медицине и фармакологии. Сборник статей. Изд-во Политех.У ниверситета. - Санкт-Петербург. - 2012. - Т. 1. - С.9-11.

7. Костина, Д.А. Биологическая активность пептидных компонентов гемолимфы Galleria mellonella / Д.А. Костина, О.С. Федоткина, Н.А. Кленова, П.П. Пурыгин, А.К. Буряк, Е.Г. Литвинова // Мат. VI Российского симпозиума «Белки и пептиды». - Уфа - 2013. - С.230.

8. Костина, Д.А. Сравнительный анализ антибиотической активности вновь синтезированных производных адамантана и бензимидазола, а также природных антибиотиков пептидной природы / Д.А. Костина, Н.А. Кленова, В.А. Ермохин, З.П. Белоусова, Е.Г. Литвинова // Вестник молодых ученых и специалистов Самарского государственного университета. - 2014. — №1, — С. 16-20.

Подписано в печать 03 апреля 2015 года. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 261 443011, г. Самара, ул. Академика Павлова, 1 Отпечатано УОП СамГУ.