Иммунный ответ, состояние антиоксидантной и детоксицирующей систем личинок большой вощинной огневки Galleria mellonella L. (Lepidoptera, Pyralidae) при бактериозах, вызванных Bacillus thuringiensis

Гризанова, Екатерина Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунный ответ, состояние антиоксидантной и детоксицирующей систем личинок большой вощинной огневки Galleria mellonella L. (Lepidoptera, Pyralidae) при бактериозах, вызванных Bacillus thuringiensis
ВАК РФ 03.02.05, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Иммунный ответ, состояние антиоксидантной и детоксицирующей систем личинок большой вощинной огневки Galleria mellonella L. (Lepidoptera, Pyralidae) при бактериозах, вызванных Bacillus thuringiensis"

На правах рукописи

ГРИЗАНОВА Екатерина Валерьевна

ИММУННЫЙ ОТВЕТ, СОСТОЯНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ И ДЕТОКСИЦИРУЮЩЕЙ СИСТЕМ ЛИЧИНОК БОЛЬШОЙ ВОЩИННОЙ ОГНЕВКИ GALLERIA MELLONELLA L. (LEPIDOPTERA, PYRALIDAE) ПРИ БАКТЕРИОЗАХ, ВЫЗВАННЫХ BACILLUS THVRINGIENSIS

03.02.05 - энтомология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 ДЕК 2012

Новосибирск - 2012

005056831

Работа выполнена в лаборатории патологии насекомых Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных СО РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Дубовский Иван Михайлович (Институт систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск, с.н.с.)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Штерншис Маргарита Владимировна (Новосибирский государственный аграрный университет, г. Новосибирск, проф. каф. энтомол. и биологической защиты растений)

доктор биологических наук, профессор Пономарев Василий Иванович (Ботанический сад УрО РАН, г. Екатеринбург, зав. лаб. лесовосстановления, защиты леса и лесопользования)

Санкт-Петербургский государственный аграрный университет, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение:

Защита состоится 14 декабря в _12_ часов яа заседании диссертационного совета Д 003.033.01 при Институте систематики и экологии животных СО РАН по адресу: 630091, г. Новосибирск, ул. Фрунзе, 11.

Факс: (383)2170-09-73, e-mail: dista;eco.n.sc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института систематики и экологии животных СО РАН.

Автореферат разослаїИЗіноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

.уг-v

Л.В. Петрожицкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. В динамике популяций насекомых существенную роль играют энтомопатогенные микроорганизмы (бактерии, грибы, вирусы, микроспоридии), среди которых широко представлены бактерии группы Bacillus thuringiensis/cereus. Данные бактерии встречаются повсеместно и могут вызывать эпизоотии которые могут существенно влиять на численность насекомых.

В ходе эволюции у насекомых сформировались различные защитные механизмы, предотвращающие проникновение и развитие инфекций. Данные механизмы могут быть условно разделены на отологические, экологические, морфо-физиологические и биохимические. В свою очередь патогены выработали множество способов, обеспечивающих успешное проникновение и развитие в организме хозяина. Кристагглообразующие бактерии Bacillus thuringiensis (БТ) синтезируют различные метаболиты токсичные для насекомых, в том числе кристаллический белковый Ö-эндотоксин. Предполагается, что наличие данного токсина обладающего также антибактериальной активностью, помогает бактериям занимать различные экологические ниши в природе однако, было показано, что он может вызывать токсикоз у насекомых' Первым эффективным барьером для предотвращения возникновения кишечных инфекций являются морфологические структуры кишечника. В частности, передний и средний отделы кишечника выстланы хитиновой интимой, а в среднем отделе кишечника имеется перитрофическая мембрана, которая может защищать от механических повреждений и инфекционных агентов Кроме того, в кишечнике существуют и биохимические барьеры в первую очередь пищеварительные ферменты, которые способны разрушать бактерии и их метаболиты. У некоторых насекомых отряда Lepidoptera, Díptera, Coleóptera пищеварительные ферменты могут активировать бактериальный кристаллический белковый Ö-эндотоксин БТ, вызывающий повреждения эпителиальных клеток кишечника. Существуют небольшое количество работ, в которых показано, что при незначительном инфицировании насекомых происходит активизация процессов репарации, способствующих избеганию бактериальной инфекции (Buchón et al., 2009). При этом вопрос о роли иммунной системы насекомых при сублетальных и полулетальных инфекциях БТ остается малоизученным

антиоксидантной и детоксицирующей активностью. Эти соединения особенно важны на первых этапах кишечной инфекции, вызванной БТ когда происходит генерация большого количества АКМ. Существуют лишь единичные работы по изучению антиоксидантнои и детоксицирующей систем насекомых при бактериозе (Dubovskiy et al 2008) и вклад этих защитных систем в формирование устойчивости насекомых к БТ практически не изучен. При этом следует отметить, что в природных популяциях насекомых редко отмечаются острые инфекции. В тоже время слабое инфицирование насекомых различными микроорганизмами регистрируется постоянно. К настоящему времени не изучено, каким образом, подобного рода инфекционная нагрузка может влиять на организм насекомых. В связи с этим нами были поставлены следующие цель и

задачи исследования.

Цель исследования - изучить вклад механизмов клеточного и гуморального иммунитета, компонентов антиоксидантнои и детоксицирующей системы в конституционную и индуцированную резистентность большой вощинной огневки Galleria mellonella к кристалообразующим бактериям Bacillus thuringiensis.

Задачи исследования:

1 Изучить показатели клеточного и гуморального иммунного ответа личинок G. mellonella при развитии острых и сублетальных бактериальных инфекций, вызванных В. thuringiensis.

2 Оценить активность реакций клеточного и гуморального иммунного ответа, антиоксидантной и детоксицирующей системы личинок G. mellonella при селекции на устойчивость к бактериям В. thuringiensis.

3 Изучить показатели клеточного и гуморального иммунного ответа антиоксидантной и детоксицирующей системы у селектированных на устойчивость к бактериям В. thuringiensis личинок G. mellonella при развитии бактериоза

4. Оценить активность и вклад неспецифических эстераз в формирование устойчивости личинок огневки С те11опе11а к бактериям В.

Научная новизна работы. Установлено, что заражение личинок Ст. теиопеиа сублетальной дозой бактерий В. Игигт&ет18 приводит к стимуляции активности клеточных и гуморальных реакций иммунной системы насекомых. Впервые установлено, что формирование устойчивости личинок О. те11опе11а к бактериям В. ^ипп&етгв приводит к увеличению уровня экспрессии антимикробных пептидов в жировом теле насекомых. Получены уникальные данные свидетельствующие о том, что у устойчивых к бактериям В. Мипп&еп*,* личинок С. те11опе11а при заражении данным патогеном наблюдается усиленная экспрессия антимикробных пептидов в кишечнике. Выявлено, что ингибирование неспецифических эстераз кишечника личинок <7. теНопеИа приводит Кв чУ-вительности насекомых к бактериям

Практическая значимость работы. На основе полученных данных, показывающих увеличение чувствительности насекомых к оактериям В. Липп&ем* при ингибировании неспецифических эстераз кишечника, можно разработать рекомендации по введению в состав биопрепаратов на основе бактерий В. Липп&етт химических ингибиторов эстераз, что в дальнейшем может быть использовано при создании новых комплексных препаратов используемых в регуляции численности насекомых - вредителей сельского и лесного хозяйства и безвредных для окружающей среды. Результаты, представленные в диссертации, могут быть использованы при чтении лекций по экологической физиологии насекомых и интегрированной защите растении в различных высших учебных заведениях России.

Апробация работы. Материалы, полученные в ходе исследований, были представлены на IV Съезде паразитологического общества РАН «Паразитология в XXI веке: проблемы, методы решения» (Санкт-Петербург, 2008), съезде королевского энтомологического общества «Иммунитет насекомых» (Шеффилд Великобритания, 2009), III Межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 80-летию проф. К.П. Федорова (Новосибирск, 2009), IX европейском конгрессе

энтомологов (Будапешт, Венгрия, 2010), VIII Межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2010), Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2011) XIV съезде русского энтомологического общества (Санкт-Петербург, 2012) и межлабораторных семинарах ИСиЭЖ СО РАН (2010, 2012).

Публикации По результатам исследований опубликовано И научных работ, в том числе 7 статей в изданиях, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста; состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 33 рисунками. Список литературы включает 216 работ, из них 186 на иностранных языках.

Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю к.б.н. И.М. Дубовскому за участие и всестороннюю поддержку, неоценимую помощь на всех этапах исследования; д.б.н., профессору В.В. Глупову за помощь при обсуждении результатов и ценные критические замечания при подготовке диссертации; к.б.н. НА Крюковой за ценные замечания, сделанные при работе с рукописью; Бурцевой Л.И. и Ходыреву В.П. за помощь в проведении микробиологической части работы. Особую благодарность автор выражает Богомоловой Н.В. за поддержку на всех этапах выполнения работы За помощь в проведении экспериментальной работы автор признателен всем сотрудникам лаборатории патологии насекомых (ИСиЭЖ СО РАН), Адамовой А. (НГАУ), а также сотрудникам Отдела прикладной энтомологии (Swansea University, Wales, Great

Britain).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В литературном обзоре дана характеристика

кристаллообразующих бактерий Bacillus thuringiensis, их токсинов и механизмов действия на насекомых, отражены различные механизмы адаптации этих бактерий к природным условиям. Рассмотрены

механизмы резистентности насекомых к инфекциям на физиологическом и биохимическом уровне. В первую очередь рассмотрена иммунная, антиоксидантная и детокеицирующая системы организма насекомых. Особое внимание уделено роли бактерии в понуляционной динамике насекомых, а также формированию устойчивых к бактериям линий насекомых. Проведен анализ работ по изучению механизмов резистентности насекомых к бактериям В. thuringiensis.

Глава 2. Материалы и методы

Объектом исследований служили личинки большой вощинной огневки Gallería mellonella лабораторной популяции (ИСиЭЖ СО РАН). Для заражения насекомых использовали споро-кристаллическую смесь бактерий Bacillus thuringiensis ssp. gallerías и ssp. tompsom из коллекции лаборатории патологии насекомых ИСи^Ж СО РАН. Заражение личинок G. mellonella проводили перорально. Селекцию личинок G. mellonella на устойчивость к бактериям В. thuringiensis проводили каждую генерацию при содержании насекомых на искусственной питательной среде в которую была добавлена споро-кристаллическая смесь бактерий В. thuringiensis ssp. galleriae. Для ингибирования неспецифических эстераз кишечника использовали химический ингибитор неспецифических эстераз трифенилфосфат (трифениловый эфир фосфорной кислоты) (Досон и др.,1991).

Приготовление образцов органов и тканей для измерения активности ферментов проводили по стандартным методикам (Dubovskiy et al., 2010, 2011). Общая РНК из образцов жирового тела и ткани кишечника была выделена с использованием гуанидин тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции (TRIzol®). Определение уровня экспрессии генов, отвечающих за синтез антимикробных тштидов, проводили с помощью реакции обратной транскрипции 11ЦР в реальном времени (Vogel et al., 2011). Интенсивность инкапсуляции у насекомых оценивали по степени потемнения нейлоновых имплантантов (Dubovskiy et al., 2008, 2010, 2011) Активность фагоцитоза определяли с помощью инъекции' ФИТЦ-меченных клеток Escherichia coli в гемоцель насекомых (Dubovskiy et al., 2008). Активность фенолоксидаз в гемоцитах и плазме определяли, используя метод Ashida и Söderhäll (1984) с изменениями (Dubovskiy et al., 2008). Антибактериальную активность гемолимфы определяли по методу описанному Wojda et al. (2004). Определение

индекса коагуляции гемолимфы насекомых проводили по степени изменения концентрации красителя при инъекции раствор* амарантового красного в гемоцель насекомых (Harne et al., Активность каталазы в кишечнике насекомых определяли спектрофотометрически при 240 нм по скорости разложения перекиси водорода (Wong et al., 1991). Активность супероксиддисмутазы определяли спектрофотометрически при 560 нм по подавлению скорости восстановления нитросинего тетразолия супероксид-анионом, образующимся в процессе окисления ксантина ксантиноксидазой (McCord, Fridovich, 1969). Для определения концентрации восстановленных (RSH) и окисленных (RSSR) тиолов использовали спектрофотомстрический метод, основанный на окислении RSH 2-нитро 5-тиобензойной кислотой (Khramtsov et al., 1989 1997) Активность неспецифических эстераз оценивали спектрофотометрически по образованию нитрофенила при длине волны 410 нм по методу Prabhakaran et al. (1995) с изменениями (Dubovskiy et al., 2010, 2011). Активность глутатион-Б-трансфераз ГГСТ) определяли спектрофотометрически по образованию 5-^-4-динитрофенил)-глутатиона при длине волны 340 нм, по методу Хабига (Habig et al., 1974) с изменениями (Dubovskiy et al., 2010, 2011) Концентрацию белка в образцах насекомых определяли по методу Бредфорда (1976). Активность ферментов выражали в единицах изменения оптической плотности (ЛА) инкубационном смеси в ходе реакции в расчете на 1 мин и 1 мг белка.

Полученные данные обрабатывали статистически, рассчитывая среднее арифметическое и его ошибку (SE). Для проверки нормальности распределения данных использовали W критерии Шапиро-Уилка. Для анализа выживаемости насекомых при заражении бактериями использовали Cox-Mantel тест. Статистическую значимость различий изучаемых параметров с нормальным распределением определяли с помощью t-критерия Стьюдента и однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом (post-hoc Tykey HSD). Для определения статистической значимости различий для не нормально распределенных данных использовали Mann-Whitney U-test (лизоцим подобная антибактериальная активность) и однофакторпыи дисперсионный анализ (Kmskal-Wallis) с последующим (Dunns) тестом (экспрессия АМП) (STATISTICA 6.0; Prism 5.0).

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Иммунный ответ личинок Galleria mellonella при полулетальной и сублетальной бактериальной инфекции вызванной Bacillus thuringiensis

При изучении влияния бактериальной инфекции на иммунную систему насекомых мы моделировали сублетальную (Ж 15) и полулетальную (ЛК50) кишечную инфекцию, для чего насекомых перорально заражали различными концентрациями бактерий Bacillus thuringiensis ssp. galleriae (БТ). Заражение личинок G. mellonella сублетальной концентрацией БТ приводило к достоверному увеличению активности реакций клеточного иммунного ответа -фагоцитоза и инкапсуляции (рис. 1Б, 1В). При инфицировании личинок G. mellonella полулетальной дозой бактерий было отмечено достоверное снижение активности фагоцитоза (рис 1Б) инкапсуляции (рис. 1В), а также активности фенолоксидаз в гемоцитах (рис. 1Г). Было показано, что питание личинок meUo"eUa кормом с содержанием сублетальной и полулетальной концентрации бактерий БТ приводит к достоверному (р < 0 05) снижению общего количества гемоцитов (рис. 1 А).

S _ 2БОО£ЮОО J

\о S SOOOOOO J

■ -в- J

¡н

_II л

11 ;■ .

I 1 Контроль I. \ БТ ЛК15

Рис. 1. Активность реакций клеточного иммунного ответа и общее число гемоцитов у личинок О. теЧопеНа при заражении сублетш,ьной (БТ ЛК15) и полулетальнои (БТ ЛК50) дозой бактерий В. Ошгщре^Ь на третьи сутки после инфицирования: (А) общее количество гемоцитов; (Б) активность фагоцитоза (В) интенсивность инкапсуляции; (Г) активность фенолоксидаз в гемоцитах (*р < 0 ¿5 по сравнению с контролем). 4 н ~

Полученные данные согласуется с результатами других исследователей (ВиЬоу3кіу еі аі., 2008). Вероятно, снижение общего числа гемоцитов происходит за счет снижения гемопоэза на фоне инфекции и/или участия клеток гемолимфы в репарационных процессах.

* 2.5 Б

|—1— н * 1Л g 1 1 5 <-°J ä З га С °-5 _, 0.0

В Hq *

ІІІ

AjLji^Mj^

Iі

Jjjjj.

З Контроль Ш

1 БТЛК15

1. Галлеримицин 2. Галиомицин БТ ЛК50 з. Гловерин 4. Цекропин Д 5. Тох

Рис 2 Активность реакций гуморального иммунного ответа личинок G mellonella нри заражении^ублетальной (БТ ЛК15) и полулетальной (БТ ЛК50) лозой бактерии "п" на третьи сутки после инфицирования: (А) активность Ф-олоксида в плазме fs) лизоцим-подобная активность плазмы; (В) индекс коагуляции гемолимфы ?*р < 0 05 но сравнению с контролем); (Г) уровень экспрессии »тибактериальнь« пептшюв в жировом теле инфицированных насекомых относительно контроля, (Д) уровень зкс^ессии антибактериальных пептидов в кишечнике инфицированных насекомых относительно контроля (*р < 0.05 по сравнению насекомыми, зараженными БТ ЛК15).

При заражении личинок G. mellonella как сублетальной, так и полулетальной концентрацией БТ было зафиксировано увеличение фенолоксидазной (рис. 2А) и антибактериальной активностей плазмы (рис 2Б) на первые, вторые и третьи сутки после заражения. Однако заражение насекомых высокой концентрацией бактерии (JIK5U) приводило к стабильному снижению индекса коагуляции гемолимфы у инфицированных насекомых (р<0.05) по сравнению с контролем. Увеличение активности реакций гуморгшьной иммуннои системы у насекомых, инфицированных сублетальной дозой БТ, может быть связано со стимулирующим эффектом низких концентрации бактерии на иммунный ответ насекомых. Наблюдаемое снижение активности коагуляции (рис. 2В) на фоне высокой фенолоксидазной активности

плазмы при полулетальной бактериальной инфекции (рис. 2А) может оыть связано с недостатком клеточного компонента коагуляции -гемоцетина, вследствие уменьшения общего количества гемоцитов Кроме того, не исключено, что при интоксикации кишечник может вырабатывать специфические ингибиторы, например ингибиторы протеаз, которые будут непосредственно блокировать каскад активации коагуляции в результате ограниченного протеолиза что соответственно скажется на образовании коагулогена. Также нами Ьыло показано, что уровень синтеза антимикробных пептидов значительно увеличивается в жировом теле и кишечнике у насекомых в ответ на полулетальную пероральную бактериальную инфекцию

Таким образом, иммунная система может существенно влиять на формирование индуцированной резистентности насекомых к оактериям БТ и может принимать участие в защите организма насекомого при бактериальной кишечной инфекции.

3.2. Иммунная, антиоксидантная и детоксицирующая системы личинок G. mellonella при селекции на устойчивость к оактериям В. thuringiensis

При селекции личинок G. mellonella на устойчивость к бактериям В. thuringiensis было показано, что уже у пятого поколения происходит достоверное (р<0.05) снижение чувствительности селектированных насекомых к бактериям на 15% по сравнению с насекомыми контрольной линии. Выживаемость насекомых десятого поколения селектированной линии при заражении бактериями БТ Оыла на 30/о больше по сравнению с контрольной линией (р<0 05) Увеличение устойчивости насекомых при селекции бактериями зарегистрировано в многочисленных исследованиях (Oppert et al 1994; Forcada et al., 1996; Rahman et al., 2004; Sarjan et al., 2009)" Однако в большинстве случаев отмечается многократное увеличение устойчивости (в 10-100 раз) и при этом показано, что ключевыми факторами, определяющими столь сильный эффект, являются неполное растворение кристалла эндотоксина, неправильное расщепление протоксина в результате ограниченного протеолиза а так же мутации рецепторов для связывания токсина (Bravo et al

да

И СЛ vs КЛ в жировом геле Я СЛ vs КЛ в кишечнике

л.

rfi

rtl

□ СЛ+БТ vs СЛ ИСЛ+БТ vs КЛ+БТ

* * АЛ

1. Галлеримицин 2. Галиомицин 3. Гловерин 4. Цекропин Д 5. Тох

Рис 3 ГА) Экспрессия антимикробных пептидов в кишечнике и жировом теле ли чинок G Almila Десятого поколения (F10) ™ирова„ной линии по сравнению с контрольной линией (*р < 0.05 по сравнению с уровнем в жировом теле), <ь) Экспре^ия антимикробных пептидов в кишечнике личинок селектированной линии G ™e¿/onSa десятого поколения (F10) при заражении бактериями В. thunng^ (С/Г+БТ) относительно не зараженнь« насекомых селектированной линии (СЛ) и контрольной линии, зараженной бактериями В. thunngiensis (КЛ+БТ) ( р < 0.05 сравнению с вариантом СЛ+БТ vs КЛ+БТ).

Было установлено, что заражение насекомых селектированной линии полулетальной концентрацией бактерий БТ приводит к активации уровня экспрессии антибактериальных пептидов в кишечнике (рис. ЗБ), т.е. непосредственно в месте развития инфекции, по сравнению с зараженными насекомыми контрольной линии. Также следует отметить, что уровень экспрессии АМП в жировом теле и кишечнике не зараженных насекомых селектированной линии был выше, чем у насекомых контрольной линии (рис. ЗА). Вероятно, локальная индукция экспрессии AML1 в кишечнике личинок G. mellonella селектированной линии может быть одним из механизмов устойчивости насекомых к бактериям при

развитаи инфекции^ ^^^ компонентов антиоксидантной

системы у личинок G. mellonella селектированной линии было зарегистрировано достоверное увеличение активности

супероксиддисмутазы (рис. 4А) и отношения окисленных тиолов к восстановленным (RSSR/RSH) (рис. 4В) в кишечнике насекомых пятого и десятого поколения обоих линий, инфицированных полулетальной концентрацией бактерий БТ. Кроме того, было отмечено достоверное (р<0.05) снижение активности каталазы в кишечнике зараженных личинок G. mellonella ™тог0 " поколения селектированной и контрольной линии (рис. 4Б). Однако наблюдалось достоверное (р<0.05) увеличение активности каталазы в

кишечнике не зараженных насекомых десятого поколения селектированной линии при сравнении с контролем (рис. 4Б).

0.4-1 0.4-

Рис. 4. Активность компонентов антиоксидантной системы в кишечнике личинок G. mellonella пятого (F5) и десятого (F10) поколения селектированной (СЛ) и контрольной линии (КЛ) при заражении бактериями В. thuringiensis (СЛ+БТ; КЛ+БТ) на вторые сутки после инфицирования: (А) - активность супероксиддисмутазы; (Б) -активность каталазы; (В) - соотношение тиолов RSSR7RSH (*р<0.05 по сравнению с не зараженной контрольной линией, **р<0.05 по сравнению с не зараженной селектированной линией).

Смещение баланса в сторону образования окисленных тиолов (увеличение отношения RSSR/RSH), а также увеличение активности супероксиддисмутазы на вторые сутки после заражения насекомых полулетальной концентрацией бактерий может свидетельствовать о повышенной активности радикальных окислительных процессов в кишечнике личинок G. mellonella под действием 5-эндотоксина бактерий БТ. При этом повышенная активность каталазы у незараженных личинок G. mellonella десятого поколения селектированной линии, вероятно, дает преимущество насекомым к быстрой и эффективной защите организма от АКМ, в частности,

перекиси водорода на начальном этапе развития бактериальной инфекции.

Рис. 5. Активность компонентов детоксицирующей системы в кишечнике личинок G. melloneüa пятого (F5) и десятого (F10) поколения селектированной (СЛ) и контрольной линии (KJI) при заражении бактериями В. thuringiensis (CJI+БТ; КЛ+БТ) на вторые сутки после инфицирования: (А) - активность глутатион-8-трансферазы; (Б) - активность неспецифических эстераз (*р<0.05 по сравнению с не зараженной контрольной линией, **р<0.05 по сравнению с не зараженной селектированной линией).

Активность глутатион-8-трансферазы (ГСТ) была достоверно (р<0.05) выше на вторые сутки эксперимента в кишечнике зараженных бактериями БТ личинок G. mellonella пятого и десятого поколения контрольной линии и не изменялась у насекомых селектированной линии по сравнению с незараженными насекомыми (рис. 5А). Однако, было показано достоверное (р<0.05) увеличение активности данного фермента у незараженных личинок G. mellonella десятого поколения селектированной линии по сравнению с насекомыми контрольной линии (рис. 5А). Активность неспецифических эстераз кишечника у селектированных личинок G. mellonella десятого поколения была достоверно выше (р<0.05) по сравнению с насекомыми контрольной линии (рис. 5Б). При заражении насекомых бактериями БТ в полулетальной дозе наблюдалось достоверное снижение активности неспецифических эстераз кишечника (р<0.05) у личинок G. mellonella пятого и десятого поколения селектированной и контрольной линий (рис. 5Б).

Отмеченный повышенный уровень активности ГСТ у насекомых селектированой линии без воздействия бактерий, вероятно, свидетельствует о повышенной способности организма к инактивации органических гидроперекисей клеток и, соответственно, к защите

тканей от потенциального повреждения продуктами перекисного окисления липидов. Полученные данные согласуются с результатами других исследователей, свидетельствующих о снижении активности неспецифических эстераз у насекомых при заражении бактериями БТ, а так же у насекомых, устойчивых к токсину БТ (Gunning et al., 2005; Dubovskiy et al., 2008). Кроме того, при заражении устойчивых насекомых бактериями БТ также было показано достоверное снижение уровня эстераз (Gunning et al., 2005). Исходя из выше изложенного, можно предположить, что снижение активности фермента связано с его участием в процессах детоксикации метаболитов бактерий и продуктов, образующихся при токсикозе в клетках кишечника. При этом повышенный базовый уровень активности неспецифических эстераз, вероятно, является ключевым механизмом формирования устойчивости личинок селектированной линии к бактериям БТ.

Таким образом, было показано, что вместе с увеличением устойчивости происходит повышение активности ферментативных антиоксидантов (каталаза) и детоксикантов. (ГСТ, эстеразы). Это может увеличивать защиту насекомых от АКМ при развитии бактериоза, особенно на начальных этапах инфекции. Кроме того, показано, что у насекомых десятого поколения, обладающих повышенной устойчивостью к бактериям, развитие окислительного дисбаланса в кишечнике при заражении БТ менее выражено, чем у насекомых контрольной линии.

3.3. Вклад неспецифических эстераз кишечника в формирование резистентности личинок Gallería mellonella к бактериальной инфекции Bacillus thuringiensis

Для изучения вклада неспецифических эстераз кишечника насекомых в устойчивость насекомых к бактериальной инфекции БТ мы проводили ингибрование активности ферментов в кишечнике и последующую оценку чувствительности насекомых к бактериям БТ. При однократном скармливании ингибитора неспецифических эстераз трифенилфосфата (ТФФ) личинкам G. mellonella и заражении насекомых бактериями БТ было показано достоверное увеличение (р<0.05) чувствительности насекомых к бактериям БТ (рис. 6А). В контроле и варианте со скармливанием только ингибитора гибель отсутствовала (рис. 6А). При этом необходимо отметить, что используемая доза ингибитора не приводила к снижению веса насекомых.

Г~1 Контроль ■ ТФФ0,2мг/мл ЕЭ Заражение БТ О ТРР 0,2мг/ыл -Заражение БТ

2 3

Сутки после заражения

Сутки эксперимента

Рис. 6. (А) Чувствительность личинок G. mellonella к бактериям В. thuringiensis (БТ) (1 - насекомые, зараженные бактериями; 2 - насекомые, зараженные бактериями при предварительном скармливании ингибитора неспецифических эстераз; 3 - не зараженные насекомые (контроль); 4 - не зараженные насекомые при скармливании ингибитора) (п=200; **р < 0.01 по сравнению с зараженными БТ насекомыми); (Б) Активность неспецифических эстераз кишечника у личинок G. mellonella при однократном скармливании ингибитора эстераз трифенилфосфата (ТФФ); при заражении бактериями В. thuringiensis (БТ); при скармливании ТРР и последующем заражении бактериями В. thuringiensis (БТ) (*р < 0.05 по сравнению с контролем).

Однократное скармливание ингибитора ТФФ с последующим заражением насекомых бактериями БТ не приводило к достоверно большему снижению активности фермента по сравнению со скармливанием только ингибитора или отдельным заражением бактериями (рис. 6Б). Кроме того, было показано, что при заражении личинок G. mellonella бактериями БТ также происходит снижение (р<0.05) активности неспецифических эстераз кишечника в течение трех дней развития инфекции (рис. 6Б).

Снижение активности неспецифических эстераз кишечника также было показано другими исследователями при скармливании насекомым протоксина БТ или при питании насекомых трансгенными растениями, синтезирующими активированный токсин БТ. Исследователи предполагают, что может происходить взаимодействие протоксина или активированного токсина с эстеразами, вследствие чего наблюдается снижение активности данного фермента (Gunning et al„ 2005), но в тоже время может происходить инактивация токсина, что приведет к повышенной устойчивости насекомых к бактериям БТ.

Кроме того, нами было проведено сравнение двух внутривидовых форм личинок G. mellonella, отличающихся по географическому месту происхождению и интенсивности меланизации кутикулы. Обнаружено достоверное (р<0.05) отличие в выживаемости этих популяций личинок G. mellonella при заражении бактериями БТ.

Насекомые светлой окраски (европейская популяция) были достоверно (р<0.05) более устойчивы к бактериям БТ по сравнению с насекомыми темной окраски (западно-сибирская популяция). При изучении активности неспецифических эстераз кишечника у личинок двух внутривидовых форм показаны достоверные различия (р<0.05). Насекомые светлой окраски с более высоким уровнем активности неспецифических эстераз кишечника оказалась достоверно менее чувствительна к бактериям БТ (р<0.01).

Таким образом, проведенное нами сравнение активности эстераз у насекомых с повышенной устойчивостью к бактериям БТ, а также зарегистрированное увеличение чувствительности насекомых к бактериям БТ при ингибировании эстераз кишечника, свидетельствуют о значительном вкладе данных ферментов в механизмы резистентности насекомых к бактериям БТ. Полученные данные позволяют предположить, что неспецифические эстеразы, наряду с антиоксидантной системой могут выступать одними из важнейших механизмов, определяющих формирование устойчивости насекомых к бактериям БТ.

Заключение

Популяции насекомых постоянно находятся под воздействием бактерий встречающихся в природе, а так же присутствующих в кишечнике интактных насекомых. Одними из широко распространенных бактерий являются представители группы Bacillus thuringiensis/cereus. Данные бактерии могут быть выделены из различных субстратов: почвы, воды, с поверхности листьев, непосредственно из растений, а так же из насекомых. Бактерии Bacillus thuringiensis (БТ) способны вызывать кишечные токсикозы, воздействующие в свою очередь на иммунитет и общее физиологическое состояние насекомых. Бактерии БТ в процессе вегетативного роста синтезируют различные токсины, действующие непосредственно на эпителиальные клетки кишечника насекомых, вызывая дисфункции и их лизис. В ходе эволюции у насекомых сформировались различные защитные механизмы, предотвращающие проникновение и развитие инфекции непосредственно в кишечнике (перитрофический матрикс, пищеварительные ферменты, регенерация эпителия), а также сформировалась мощная иммунная система, которая предотвращает развитие большинства микроорганизмов.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что проникновение бактерий в кишечник насекомых вызывает не только лизис эпителиальных клеток кишечника и нарушение процессов пищеварения (что было установлено ранее другими авторами), но и изменение активности антиоксидантных ферментов, а также соотношение неферментативных антиоксидантов. Кроме того происходит снижение активности ферментов детоксицирующей системы, в частности неспецифических эстераз. При этом возможно, происходит выброс в гемолимфу различных активаторов (медиаторов) иммунной системы, источником которых могут служить эпителиальные клетки кишечника. Данный процесс может происходить в первую очередь при вялотекущих инфекциях. Во время острого токсикоза, в гемолимфу также могут попадать компоненты разрушенных эпителиальных клеток и представители вульгарной микрофлоры. Под действием медиаторов, выделяемых эпителиальными клетками кишечника, компонентов разрушенного кишечника и проникших микроорганизмов происходит увеличение активности фенолоксидаз, реакций фагоцитоза и инкапсуляции в гемолимфе, а также антибактериальной активности в гемолимфе, жировом теле и кишечнике насекомых. Причем при остром бактериозе наряду с активацией гуморальных иммунных реакций, отмечено подавление клеточного звена иммунитета. Системная стимуляция иммунитета может происходить за счет мембранотропного действия токсинов БТ (6-эндотоксин, Уф токсины), у которых при активации образуются сайт-специфические компоненты, взаимодействующие непосредственно с рецепторами эпителиальных клеток, и запускающие процессы лизиса этих клеток. Подавление клеточных реакций иммунитета при острой инфекции, вероятно, связано с истощением пула гемоцитов, что может быть опосредовано их активным участием в репарационных процессах кишечника, а так же в изоляции проникающих в гемолимфу компонентов разрушенных клеток кишечника, бактерий и сопутствующей кишечной микрофлоры. Следует отметить, что острые инфекции крайне редко встречаются в природе, т.к. они могут приводить к быстрой элиминации, как хозяина, так и возбудителя инфекций из природной среды, что, в конечном счете, ведет к резкому сокращению численности, и в первую очередь высоковирулентных микроорганизмов. Однако, в природе насекомые, постоянно сталкиваются с бактериями, в том числе со слабовирулентными и авирулентными. Вполне закономерно, что данные бактерии могут

развиваться в кишечнике, и их токсины также будут активироваться. Однако при недостаточной дозе и низкой вирулентности будут возникать так называемые вялотекущие инфекции, которые не приводят к гибели насекомых, но при этом могут существенно влиять на активность, как иммунной, так и антиоксидантной и детоксицирующей систем кишечника. Это в свою очередь приведет к повышенной устойчивости насекомых к вторичным инфекциям различной природы, в том числе бактериальным. Подобные взаимодействия могут сопровождаться взаимовыгодным сосуществованием популяций насекомых и микроорганизмов.

При определенных условиях и постоянном контакте насекомых с бактериями БТ возможно формирование устойчивых популяций. Подобное взаимодействие, как мы уже отмечали выше, может происходить в природе при постоянном контакте с низкими дозами БТ. В условиях современного мира это может также происходить при применении биологических препаратов на основе БТ или при питании насекомых на трансгенных растениях, экспрессирующих гены токсинов БТ. В многочисленных исследованиях показано, что данная устойчивость обусловлена факторами, закрепленными генетически, и связана с мутациями сайтов связывания токсина (Rie et al., 1990; Oppert et al., 1994; Forcada et al., 1996; Bravo et al., 2005). Однако при селекции насекомых на устойчивость к бактериям БТ нами было показано, что на ранних этапах отбора (пятое-десятое поколение) повышение устойчивости к бактериям может происходить также вследствие повышенной активности антиоксидантной и детоксицирующей системы в кишечнике и синтеза антимикробных белков в жировом теле и кишечнике. Вероятно, увеличение активности данных систем позволяет насекомым эффективно инактивировать токсины, свободные радикалы и эндобиотики, образованные в собственных эпителиальных клетках при кишечных токсикозах, в том числе за счет локализации защитных реакций непосредственно в кишечнике, т.е. месте проникновения и развития инфекционного процесса. Комплексное действие антиоксидантной и детоксицирующей систем, а также систем иммунитета насекомых способно приводить к локализации повреждений кишечника, предотвращать действие токсина на эпителиальные клетки кишечника, защищать от вторичных инфекций, что, в конечном счете, приводит к выздоровлению насекомых.

Таким образом, системный иммунный ответ насекомых является одним из индуцибельных механизмов, обеспечивающих устойчивость

насекомых к бактериальным кишечным инфекциям. Вместе с тем наши исследования на устойчивых к БТ насекомых свидетельствуют, что локальное увеличение активности иммунного ответа, и повышение уровня антиоксидантной и детоксицирующей защиты кишечника также может играть важную роль в конституциональной защите против кишечной инфекции БТ.

Выводы

1. Развитие сублетальной кишечной бактериальной инфекции В. thuringiensis приводит к активации клеточных и гуморальных реакций иммуннитета личинок G. mellonella. При развитии острого бактериоза на фоне активации гуморальных реакций иммунитета происходит снижение активности клеточного иммунного ответа.

2. Селекция личинок G. mellonella на устойчивость к бактериям В. thuringiensis приводит к увеличению устойчивости насекомых на ранних этапах отбора (пятое-десятое поколение). У десятого поколения селектированных насекомых в кишечнике .отмечено усиление базовой активности компонентов антиоксидантной и детоксицирующей систем (каталазы, глутатион-8-трансферазы и неспецифических эстераз). Кроме того в жировом теле и кишечнике насекомых селектированной линии регистрируется повышенный базовый уровень экспрессии антимикробных белков.

3. При развитии бактериоза В. thuringiensis у селектированных к бактериям личинок G. mellonella происходит индукция синтеза антимикробных белков, а также менее выраженное развитие окислительного дисбаланса в кишечнике, по сравнению с насекомыми контрольной линии.

4. Ингибирование неспецифических эстераз кишечника приводит к увеличению чувствительности личинок G. mellonella к бактериям В. thuringiensis. Показано, что личинки G. mellonella, более устойчивые к бактериям В. thuringiensis, обладают повышенной активностью неспецифических эстераз кишечника.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Дубовский И.М., Гризанова Е.В., Боярищева Е.А., Исмаилов В.Я., Глупов В.В. Изучение протеиназ в кишечнике имаго клопа

вредная черепашка Eurygaster integriceps Put. (Hemiptera, Scutelleridae) различных поколений // Евразиатский энтомологический журнал. 2006. Т.5. С.271-275.

2. Комаров Д.А., Слепнева И.А., Дубовский И.М., Гризанова Е.В., Храмцов В.В., Глупов В.В. Генерация супероксидного радикала и перекиси водорода в гемолимфе насекомых в процессе иммунного ответа // ДАН. 2006. Т.411. №3. р. 420-423.

3. Крюкова Н.А., Дубовский И.М., Гризанова Е.В., Глупов В.В., Наумкина Е.А. Формирование клеточного иммунного ответа Gallería mellonella (L.) (Lepidoptera: Piralidae) при паразитировании Habrobracon hebetor (Say) (Hymenoptera: Braconidae) // Евразиатский энтомологический журнал. 2007. V. 6(4). Р. 361-364.

4. Dubovskiy I.M., Martemyanov В.В., Vorontsova Y.L., Rantala M.J., Gryzanova E.V., Glupov V.V. Effect of the bacterial infection on the antioxidant activity and lipid peroxidation in the midgut of larvae Gallería mellonella L. (Lepidoptera, Pyralidae) // Comparative Biochemistry and Physiology. 2008. V. 148. P. 1-5

5. Бахвалов С.А., Бахвалова B.H., Крюкова H.A., Гризанова Е.В., Наумкина Е.А., Шаталова Е.И. Изучение показателей клеточного и гуморального иммунитета непарного шелкопряда (Lymantria dispar L) при питании на ранее дефолиированной берез повислой (Betula péndula Roth). И Евразиатский энтомологический журнал. 2008 V 7(3). Р. 203-206.

6. Дубовский И.М., Гризанова Е.В., Черткова Е.А., Слепнева И.А., Комаров Д.А., Воронцова Я.Л., Глупов В.В. Генерация активированных кислородных метаболитов и активность антиоксидантов в гемолимфе личинок Gallería mellonella (L.) (Lepidoptera: Piralidae) при развитии процесса инкапсуляции // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2010 V 46(1) Р 3543.

7. Dubovskiy I.M., Grizanova E.V., Ershova N.S., Rantala M.J., Glupov V.V. The effects of dietary nickel on the detoxification enzymes, innate immunity and resistance to the fungus Beauveria bassiana in the larvae of the greater wax moth Gallería mellonella II Chemosphere 2011 V. 85. P. 92-96.

Материалы конференций:

реакции капсулообразования у личинок Galleria mellonella І/ Материалы V Всероссийского съезда паразитологического общества при российской академии наук «Паразитология в XXI веке -проблемы, методы, решения». СПб. 2008. Т.З. С. 245-246.

9. Гризанова Е.В., Дубовский И.М., Глупов В.В. Изучение показателей резистентности и жизнеспособности популяции Galleria mellonella при селекции на устойчивость к бактериям Bacillus thuringiensis II Материалы III межрегиональной научной конференции «Съезд паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященная 80-летию профессора Константина Петровича Федорова». Новосибирск, 2009.

10. Гризанова Е.В., Дубовский И.М., Крюкова H.A., Глупов В.В. Изучение реакций клеточного и гуморального иммунитета у личинок вощиной огневки Gallería mellonella в течение бактериальной инфекции Bacillus thuringiensis II Материалы международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке». СПб: Изд-во С.-Петербургского ун-та, 2011. С. 182.

11. Гризанова Е.В., Дубовский И.М., Глупов В.В. Роль неспецифических эстераз кишечника в механизмах резистентности личинок Galleria mellonella (Lepidoptera, Pyralidae) к бактериям Bacillus thuringiensis II Материалы XIV съезда русского энтомологического общества. Санкт-Петербург, 27 августа - 1 сентября 2012 г.

Подписано в печать 06.11.2012. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура "Times New Roman". Печ. л. ) Д Тираж ! 10 экз. Заказ № 407.

Издательство «Любава» 630090, Новосибирск, ул. Академическая 27

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гризанова, Екатерина Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Энтомопатогенные бактерии Bacillus thuringiensis.

1.1.1. Распространение.

1.1.2. Токсины и другие метаболиты.

1.1.3. Механизмы действия 5-эндотоксина.

1.1.4. Симптомы действия 5-эндотоксина.

1.2. Механизмы резистентности насекомых к инфекциям.

1.2.1. Внешние системы защиты.

1.2.2. Иммунная система насекомых.

1.2.3. Антиоксидантная и детоксицирующая системы насекомых.

1.3. Механизмы резистентности насекомых к бактериям

Bacillus thuringiensis.

1.3.1. Иммунный ответ насекомых в течение бактериальной инфекции.

1.3.2. Антиоксидантная и детоксицирующая системы кишечника насекомых в течение бактериальной инфекции.

1.3.3. Вклад неспецифических эстераз в формирование резистентности насекомых к бактериям.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунный ответ, состояние антиоксидантной и детоксицирующей систем личинок большой вощинной огневки Galleria mellonella L. (Lepidoptera, Pyralidae) при бактериозах, вызванных Bacillus thuringiensis"

В динамике популяций насекомых существенную роль играют энтомопатогенные микроорганизмы (бактерии, грибы, вирусы, микроспоридии), среди которых широко представлены бактерии группы Bacillus thuringiensis/cereus. Данные бактерии встречаются повсеместно и могут вызывать эпизоотии, которые могут существенно влиять на численность насекомых.

Первым эффективным барьером для предотвращения возникновения кишечных инфекций являются морфологические структуры кишечника. В частности, передний и средний отделы кишечника выстланы хитиновой интимой, а в среднем отделе кишечника имеется перитрофическая мембрана, которая может защищать от механических повреждений и инфекционных агентов. Кроме того, в кишечнике существуют и биохимические барьеры, в первую очередь пищеварительные ферменты, которые способны разрушать бактерии и их метаболиты. У некоторых насекомых отряда Lepidoptera, Díptera, Coleóptera пищеварительные ферменты могут активировать бактериальный кристаллический белковый

5-эндотоксин БТ, вызывающий повреждения эпителиальных клеток кишечника. Существуют небольшое количество работ, в которых показано, что при незначительном инфицировании насекомых происходит активизация процессов репарации, способствующих избеганию бактериальной инфекции (Buchón et al., 2009). При этом вопрос о роли иммунной системы насекомых при сублетальных и полулетальных инфекциях БТ остается малоизученным.

У насекомых, как и у позвоночных, при воспалительных кишечных инфекциях происходит генерация активированных кислородных метаболитов (АКМ), обладающих высокой реакционной способностью. Они способны уничтожать бактерии, но в тоже время могут деструктивно воздействовать на ткани и органы хозяев. Для нейтрализации этих соединений, в процессе эволюции возникла группа ферментов и соединений не ферментативной природы (белки, пептиды, гликопротеины, липопротеины), обладающих антиоксидантной и детоксицирующей активностью. Эти соединения особенно важны на первых этапах кишечной инфекции, вызванной БТ, когда происходит генерация большого количества АКМ. Существуют лишь единичные работы по изучению антиоксидантной и детоксицирующей систем насекомых при бактериозе (Dubovskiy et al., 2008), и вклад этих защитных систем в формирование устойчивости насекомых к БТ практически не изучен. При этом следует отметить, что в природных популяциях насекомых редко отмечаются острые инфекции. В тоже время слабое инфицирование насекомых различными микроорганизмами регистрируется постоянно. К настоящему времени не изучено, каким образом подобного рода инфекционная нагрузка может влиять на организм насекомых. В связи с этим нами были поставлены следующие цель и задачи исследования.

Цель исследования - изучить вклад механизмов клеточного и гуморального иммунитета, компонентов антиоксидантной и детоксицирующей системы в конституционную и индуцированную резистентность большой вощинной огневки Galleria mellonella к кристалообразующим бактериям Bacillus thuringiensis.

Задачи исследования:

1. Изучить показатели клеточного и гуморального иммунного ответа личинок G. mellonella при развитии острых и сублетальных бактериальных инфекций, вызванных В. thuringiensis.

2. Оценить активность реакций клеточного и гуморального иммунного ответа, антиоксидантной и детоксицирующей системы личинок G. mellonella при селекции на устойчивость к бактериям В. thuringiensis.

3. Изучить показатели клеточного и гуморального иммунного ответа, антиоксидантной и детоксицирующей системы у селектированных на устойчивость к бактериям В. thuringiensis личинок G. mellonella при развитии бактериоза.

4. Оценить активность и вклад неспецифических эстераз в формирование устойчивости личинок огневки G. mellonella к бактериям В. thuringiensis.

Научная новизна работы. Установлено, что заражение личинок G. mellonella сублетальной дозой бактерий В. thuringiensis приводит к стимуляции активности клеточных и гуморальных реакций иммунной системы насекомых. Впервые установлено, что формирование устойчивости личинок G. mellonella к бактериям В. thuringiensis приводит к увеличению уровня экспрессии антимикробных пептидов в жировом теле насекомых. Получены уникальные данные, свидетельствующие о том, что у устойчивых к бактериям В. thuringiensis личинок G. mellonella при заражении данным патогеном наблюдается усиленная экспрессия антимикробных пептидов в кишечнике. Выявлено, что ингибирование неспецифических эстераз кишечника личинок G. mellonella приводит к увеличению чувствительности насекомых к бактериям В. thuringiensis.

Практическая значимость работы. На основе полученных данных, показывающих увеличение чувствительности насекомых к бактериям В. thuringiensis при ингибировании неспецифических эстераз кишечника, можно разработать рекомендации по введению в состав биопрепаратов на основе бактерий В. thuringiensis химических ингибиторов эстераз, что в дальнейшем может быть использовано при создании новых комплексных препаратов используемых в регуляции численности насекомых -вредителей сельского и лесного хозяйства и безвредных для окружающей среды. Результаты, представленные в диссертации, могут быть использованы при чтении лекций по экологической физиологии насекомых и интегрированной защите растений в различных высших учебных заведениях России.

Апробация работы. Материалы, полученные в ходе исследований, представлены на IV Съезде Паразитологического общества РАН «Паразитология в XXI веке: проблемы, методы, решения» (Санкт-Петербург, 2008), Съезде королевского энтомологического общества «Иммунитет насекомых» (Шеффилд, Великобритания, 2009), III Межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 80-летию проф. К.П. Федорова (Новосибирск, 2009), IX европейском конгрессе энтомологов (Будапешт, Венгрия, 2010), VIII Межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2010), Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2011), XIV съезде русского энтомологического общества (Санкт-Петербург, 2012) и межлабораторных семинарах ИСиЭЖ СО РАН (2010, 2012).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 11 научных работ, в том числе 7 статей в изданиях, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Дубовский И.М., Гризанова Е.В., Боярищева Е.А., Исмаилов В.Я., Глупов В.В. Изучение протеиназ в кишечнике имаго клопа вредная черепашка Eurygaster integriceps Put. (Hemiptera, Scutelleridae) различных поколений // Евразиатский энтомологический журнал. 2006. Т.5. С.271-275.

3. Крюкова H.A., Дубовский И.М., Гризанова Е.В., Глупов В.В., Наумкина Е.А. Формирование клеточного иммунного ответа Galleria mellonella (L.) (Lepidoptera: Piralidae) при паразитировании Habrobracon hebetor (Say) (Hymenoptera: Braconidae) // Евразиатский энтомологический журнал. 2007. V. 6(4). P. 361-364.

4. Dubovskiy I.M., Martemyanov B.B., Vorontsova Y.L., Rantala M.J., Gryzanova E.V., Glupov V.V. Effect of the bacterial infection on the antioxidant activity and lipid peroxidation in the midgut of larvae Galleria mellonella L. (Lepidoptera, Pyralidae) // Comparative Biochemistry and Physiology. 2008. V. 148. P. 1-5

5. Бахвалов С.А., Бахвалова B.H., Крюкова H.A., Гризанова E.B., Наумкина Е.А., Шаталова Е.И. Изучение показателей клеточного и гуморального иммунитета непарного шелкопряда (Lymantria dispar L) при питании на ранее дефолиированной берез повислой (Betula pendula Roth). II Евразиатский энтомологический журнал. 2008. V. 7(3). Р. 203-206.

Материалы конференций:

8. Дубовский И.М., Гризанова Е.В., Черткова Е.А., Слепнева И.А., Комаров Д.А., Воронцова Я.Л., Глупов В.В. Участие активированных кислородных метаболитов и антиоксидантов в реакции капсулообразования у личинок Gallería mellonella II Материалы V Всероссийского съезда паразитологического общества при российской академии наук «Паразитология в XXI веке - проблемы, методы, решения». СПб. 2008. Т.З. С. 245-246.

9. Гризанова Е.В., Дубовский И.М., Глупов В.В. Изучение показателей резистентности и жизнеспособности популяции Gallería mellonella при селекции на устойчивость к бактериям Bacillus thuringiensis II Материалы III межрегиональной научной конференции «Съезд паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященная 80-летию профессора Константина Петровича Федорова». Новосибирск, 2009.

10. Гризанова Е.В., Дубовский И.М., Крюкова Н.А., Глупов В.В. Изучение реакций клеточного и гуморального иммунитета у личинок вощиной огневки Gallería mellonella в течение бактериальной инфекции Bacillus thuringiensis II Материалы международной научной конференции

Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке». СПб: Изд-во С.-Петербургского ун-та, 2011. С. 182.

Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю к.б.н. И.М. Дубовскому за участие и всестороннюю поддержку, неоценимую помощь на всех этапах исследования; д.б.н., профессору В.В. Глупову за помощь при обсуждении результатов и ценные критические замечания при подготовке диссертации; к.б.н. H.A. Крюковой за ценные замечания, сделанные при работе с рукописью; Бурцевой Л.И. и Ходыреву В.П. за помощь в проведении микробиологической части работы. Особую благодарность автор выражает Богомоловой Н.В. за поддержку на всех этапах выполнения работы. За помощь в проведении экспериментальной работы автор признателен всем сотрудникам лаборатории патологии насекомых (ИСиЭЖ СО РАН), Адамовой А. (НГАУ), а также сотрудникам Отдела прикладной энтомологии (Swansea University, Wales, Great Britain).

Заключение Диссертация по теме "Энтомология", Гризанова, Екатерина Валерьевна

Выводы

1. Развитие сублетальной кишечной бактериальной инфекции В. 1кипп^1еп818 приводит к активации клеточных и гуморальных реакций иммуннитета личинок & те11опе11а. При развитии острого бактериоза на фоне активации гуморальных реакций иммунитета происходит снижение активности клеточного иммунного ответа.

2. Селекция личинок & теПопеПа на устойчивость к бактериям В. 1кипщ1епз1з приводит к увеличению устойчивости насекомых на ранних этапах отбора (пятое-десятое поколение). У десятого поколения селектированных насекомых в кишечнике отмечено усиление базовой активности компонентов антиоксидантной и детоксицирующей систем (каталазы, глутатион-8-трансферазы и неспецифических эстераз). Кроме того в жировом теле и кишечнике насекомых селектированной линии регистрируется повышенный базовый уровень экспрессии антимикробных белков.

3. При развитии бактериоза В. thuringiensis у селектированных к бактериям личинок & теПопеПа происходит индукция синтеза антимикробных белков, а также менее выраженное развитие окислительного дисбаланса в кишечнике, по сравнению с насекомыми контрольной линии.

4. Ингибирование неспецифических эстераз кишечника приводит к увеличению чувствительности личинок С. теПопеПа к бактериям В. 1кигт£1ет{8. Показано, что личинки (7. теПопеПа, более устойчивые к бактериям В. 1Нипп2}епз18, обладают повышенной активностью неспецифических эстераз кишечника.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что проникновение бактерий в кишечник насекомых вызывает не только лизис эпителиальных клеток кишечника и нарушение процессов пищеварения (что было установлено ранее другими авторами), но и изменение активности антиоксидантных ферментов, а также соотношение неферментативных антиоксидантов. Кроме того происходит снижение активности ферментов детоксицирующей системы, в частности неспецифических эстераз. При этом возможно, происходит выброс в гемолимфу различных активаторов (медиаторов) иммунной системы, источником которых могут служить эпителиальные клетки кишечника. Данный процесс может происходить в первую очередь при вялотекущих инфекциях. Во время острого токсикоза, в гемолимфу также могут попадать компоненты разрушенных эпителиальных клеток и представители вульгарной микрофлоры. Под действием медиаторов, выделяемых эпителиальными клетками кишечника, компонентов разрушенного кишечника и проникших микроорганизмов происходит увеличение активности фенолоксидаз, реакций фагоцитоза и инкапсуляции в гемолимфе, а также антибактериальной активности в гемолимфе, жировом теле и кишечнике насекомых. Причем при остром бактериозе наряду с активацией гуморальных иммунных реакций, отмечено подавление клеточного звена иммунитета. Системная стимуляция иммунитета может происходить за счет мембранотропного действия токсинов БТ (5-эндотоксин, Уф токсины), у которых при активации образуются сайт-специфические компоненты, взаимодействующие непосредственно с рецепторами эпителиальных клеток, и запускающие процессы лизиса этих клеток. Подавление клеточных реакций иммунитета при острой инфекции, вероятно, связано с истощением пула гемоцитов, что может быть опосредовано их активным участием в репарационных процессах кишечника, а так же в изоляции проникающих в гемолимфу компонентов разрушенных клеток кишечника, бактерий и сопутствующей кишечной микрофлоры. Следует отметить, что острые инфекции крайне редко встречаются в природе, т.к. они могут приводить к быстрой элиминации, как хозяина, так и возбудителя инфекций из природной среды, что, в конечном счете, ведет к резкому сокращению численности, и в первую очередь высоковирулентных микроорганизмов. Однако, в природе насекомые, постоянно сталкиваются с бактериями, в том числе со слабовирулентными и авирулентными. Вполне закономерно, что данные бактерии могут развиваться в кишечнике, и их токсины также будут активироваться. Однако при недостаточной дозе и низкой вирулентности будут возникать так называемые вялотекущие инфекции, которые не приводят к гибели насекомых, но при этом могут существенно влиять на активность, как иммунной, так и антиоксидантной и детоксицирующей систем кишечника. Это в свою очередь приведет к повышенной устойчивости насекомых к вторичным инфекциям различной природы, в том числе бактериальным. Подобные взаимодействия могут сопровождаться взаимовыгодным сосуществованием популяций насекомых и микроорганизмов.

Таким образом, системный иммунный ответ насекомых является одним из индуцибельных механизмов, обеспечивающих устойчивость насекомых к бактериальным кишечным инфекциям. Вместе с тем наши исследования на устойчивых к БТ насекомых свидетельствуют, что локальное увеличение активности иммунного ответа, и повышение уровня антиоксидантной и детоксицирующей защиты кишечника также может играть важную роль в конституциональной защите против кишечной инфекции БТ.

Кутикула

4 §

ГУ о с

Синтез Жиоовое тело) антимикробных«^ пептидов и белков

Гемолимфа да

Активность реакций клеточного иммунного ответа

Обогащение гемолимфы активаторами иммунного ответа

Активность J ( ) \ " 9

•••". t реакции гуморального иммунного ответа

5с I 5а> £ рецептор V .ТГеретрофическая мембрана

Споры БТ

I Активность антиоксидантной и детоксицирующей систем

Кристаллы БХ. Токсин J К

Активация токсина БТ t

Синтез антимикробных пептидов и белков

V-V

S А А

Y—Y—Y—У—Y^^YTY—У—^ оХ °1 öl °X °I о чо

Рис. 33. Схема биохимических изменений в кишечнике и иммунная система насекомых при токсикозах, вызванных кристаллобразующими бактериями Bacillus thuringiensis (БТ).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гризанова, Екатерина Валерьевна, Новосибирск

1. Барбашова Н.М., Владимирова Г.А. Антагонистические свойства и продуцирование экзотоксина Bacillus thuringiensis II Тр. ВНИИСХМ. 1981. Т.51. С.151-158.

2. Бурцева Л.И., Штерншис М.В, Калмыкова Г.В. Бактериальные болезни насекомых. В кн.: Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты (Под ред. В.В. Глупова). М.: Круглый год, 2001. С. 189-246.

3. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1991. Т. 29. С. 1-249.

4. Глупов B.B., Бахвалов С.А., Соколова Ю.А., Слепнева И.А. Механизмы резистентности насекомых // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / ред. Глупова B.B. М.: Круглый год, 2001. С. 475-557.

5. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982. 1120с.

6. Досон Р., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.

7. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М.: Агропромиздат, 1985. 351с

8. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. М.: МАИК, 2001. 343 с.

9. Иванов Г.М. Сравнение турицинов по интенсивности антагонизма в различных трофических условиях // Микроорганизмы в защите растений. Новосибирск, 1981. С.53-72.

10. Ивинскене B.J1. Фосфолипаза и термолабильный экзотоксин Bacillus thuringiensis II Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений: Сб. науч. тр. /ВАСХНИЛ. Сиб.отд-ние. Новосибирск, 1987. С.57-75.

11. Кандыбин Н.В. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми. М.: Агропромиздат, 1989. 175 с.

12. Лескова А.Я., Рыбина Л.М. Термостабильный экзотоксин Bacillus thuringiensis II Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений: Сб. науч. тр. / ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. Новосибирск, 1987. С.31-42.

13. Лозинская Я.Л., Слепнева И.А., Храмцов В.В., Глупов В.В. Изменение антиоксидантного статуса и системы генерации свободных радикалов в гемолимфе личинок Galleria mellonella при микроспоридиозе // Журн. эвол. биохим. физиол. 2004. Т.2. С.99-103.

14. Мориг В., Месснер Б. 1969. Значение лизоцима в антибактериальном иммунитете насекомых. // Журнал общей биологии Т.ХХХ, № 1. 62-72.

15. Полтев В.И., Гриценко И.Н., Егорова А.И., Кальвиш Т.К., Туркевич Л.Л., Ушакова Н.В. Микрофлора насекомых. / Под ред. В.И. Полтев. Новосибирск: Наука, 1969. 272с.

16. Рославцева С.А., Баканова Е.И., Еремина О.Ю. Эстеразы членистоногих и их роль в механизмах детоксикации инсектоакарицидов // Изв. РАН. Сер. биол. 1993. № 3. С. 368-375.

17. Свистунова О.И., Титов В.Н. Гликозилированные белки сыворотки крови: тест фруктозамин // Клин, лаб.диагностика. 1992. №11-12. С.22-30.

18. Серебров В.В., Киселев A.A., Глупов В.В. Изучение некоторых факторов синергизма между энтомопатогенными грибами и химическими инсектицидами // Микология и фитопатология. 2003. Т. 1. Вып. 37. С. 7682.

19. Соколова Ю.Я., Сундуков О.В. Подавление активности эстераз как особенность патогенеза микроспоридиоза сверчков Gryllus bimaculatus II Паразитология. 1999. Т. 33. Вып. 6. С. 527-536.

20. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифической реакции организма на экстремальное воздействие // Вопр. мед. химии. 1988. №6. С.2-11.

21. Тамарина H.A. Техническая энтомология новая отрасль прикладной энтомологии // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Энтомология. 1987. Т. 7. С. 248-258.

22. Честухина Г.Г., Залунин И.А., Костина М.П. Протеиназы, связанные с кристаллами Bacillus thuringiensis II Биохимия. 1978. Т.43. Вып.5. С.857-864.

23. Штерншис М.В. Повышение эффективности микробиологической борьбы с вредными насекомыми. Новосибирск: Новосиб. гос. аграр. ун-т., 1995. 194с.

24. Штерншис М.В. Энтомопатогены основа биопрепаратов для контроля численности фитофагов. Новосибирск, 2010. 160с.

25. Штерншис М.В., Джалилов Ф.С., Андреева И.В., Томилова О.Г. Биологическая защита растений. М.: Колос, 2004. 264с.

26. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни: Учебник. 5-е изд., перераб. И доп. - М.: Медицина, 2001. 624с.

27. Янковский О.Ю. Токсичность кислорода и биологические системы (Эволюционные экологические и медико биологические аспекты). Санкт Петербург: "Игра", 2000. 294 с.

28. Ahmad S. Biochemical defense of pro-oxidant plant allelochemicals by herbivorous insects // Biochem. Syst. Ecol. 1992. V. 20. P.269-296.

29. Ahmad S., Larval J.F. and Pardini R.S. Adult housefly carboxylesterase: isozyme composition and tissue pattern // Insect. Biochem. 1976. V. 6. P. 541547.

30. Ahmad S., Pardini R.S. Antioxidant defense of the cabbage looper, Trichoplusia ni\ Enzymatic responses to the superoxide-generating flavonoid, quercetin, and photodynamic furanocoumarin, xanthotoxin // Photochem. Photobiol. 1990. 51. P.305-311.

31. Allen R.G., Balin A.K. Oxidative influence of on development and differentiation: An overview of a free radical theory of development // Free Radical Biol. And. Med. 1989. V. 6. P. 631-661.

32. Andrews R.E., Bibilos M.M., Bulla L.A. Protease activation of the entomocidal protoxin of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki II Appl. Environ. Microbiol. 1985. V.50. P. 737-742.

33. Aptosoglou S.G., Sivropoulou A., Koliais S.I. Distribution and characterization of Bacillus thuringiensis in the environment of the olive in Greece // Microbiologica. 1997. V.20. P. 69-76.

34. Asperen K., Van. A. Study of housefly esterase by means of a sensitive colorimetric method // J. Insect Physiol. 1962. V. 8. P. 401-416.

35. Au C., Dean P., Reynolds S.E., Constant R.H. Effect of the insect pathogenic bacterium Photorhabdus on insect phagocytes // Cellular Microbiology. 2004. V. 6 (1). P. 89-95.

36. Aucoin R.R., Philogene B.J.R., Arnason J.T. Antioxidant enzymes as biochemical defenses against phototoxin-induced oxidative stress in three species of herbivorous lepidoptera // Arch. Insect Biochem. Physiol. 1991. V. 16. P. 139-152.

37. Ayres J.S. and Schneider D.S. A signaling protease required for melanization in Drosophila affects resistance and tolerance of infections. // PLoS Biol. 2008. V. 6 (12). P. 305.

38. Basset A., Khush R.S., Braun A., Gardan L., Boccard F., Hoffmann J.A., Lemaitre B. The phytopathogenic bacteria Erwinia carotovora infects Drosophila and activates an immune response // PNAS. 2000. V. 97. No. 7. P. 73376-3381.

39. Beck M.A., Levander O.A. Dietary oxidative stress and the potentiation of viral infection // Annu Rev Nutr. 1998. V.18. P. 93-116.

40. Beebee T., Korner A., Bond R.P.M. Differential inhibition of mammalian ribonucleic acid polymerases by an exotoxin from Bacillus thuringiensis II Biochem. J. 1972. V. 227. P. 619-625.

41. Bernays E.A., Chamberlain D.J. // J. Insect Phisiol.1980. V. 26. P. 415-420.

42. Bi J.L., Felton G.W. Foliar oxidative stress and insect herbivory -primary compounds, secondary metabolites, and reactive oxygen species as components of induced resistance // Journal of Chemical Ecology 1995. V. 21. P. 1511— 1530.

43. Boctor I.Z., Salama H.S. Effect of Bacillus thuringiensis on the lipid content and compositions of Spodoptera littoralis larva // J.Invert.Pathol. 1983. V.51.P. 381-384.

44. Bohn H. Hemolymph clotting in insects // Immunity in invertebrates: cells, molecules, and defense reactions / Ed. M. Brehelin. Berlin: Springer-Verlag. 1986. P. 188-207.

45. Boman H.G., Nilsson-Faye I., Paul K., Rasmuson T.Jr. Insect Immunity I. Characteristics of an inducible cell-free antibacterial reaction in hemolymph of Samia cynthia pupae // Infection and immunity. 1974. P. 136-145.

46. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

47. Bravo A., Koen H., Jansens S. Immunocytochemical analysis of specific binding of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins to lepidopteran and coleopteran midgut membranes // J. Invertebr. Pathol. 1992. V.60. P. 247-253.

48. Bravo A., Gill S.S., Soberon M. Bacillus thuringiensis: mechanisms and use. In: Gilbert, L.I., Kostas, I., Gill, S.S. (Eds.), Comprehensive Molecular Insect Science, vol. 6. Elsevier, Amsterdam. 2005. P. 175-205.

49. Broderick N.A., Raffa K.F., Handelsman J.R. Chemical modulators of the innate immune response alter gypsy moth larval susceptibility to Bacillus thuringiensis II BMC Microbiology. 2010. V. 10. P. 129.

50. Broderick N.A., Welchman D.P., Lemaitre B. Recognition and response to microbial infection in Drosophila // Insect infection and immunity. Ed. Rolff J. Oxford univerrity press. 2009. PP. 254.

51. Brown A.E., Baumbach J., Cook P.E., Ligoxygakis P. Short-Term Starvation of Immune Deficient Drosophila Improves Survival to Gram

52. Negative Bacterial Infections // PLoS ONE. 2009. V. 4(2): e4490. doi: 10.137 l/journal.pone.0004490

53. Brown S.E., Howard A., Kasprzak A.B, Gordon K.H., East P.D. A peptidomics study reveals the impressive antimicrobial peptide arsenal of the wax moth Galleria mellonella II Insect Biochemistry and Molecular Biology. 2009. V. 39. P. 792-800.

54. Brownbrige M. and Onyango T. Screening of exotic and locally isolated Bt (Berliner) strains in Kenya for toxity to the spotted stem borer, Chilo partellus (Swinhoe) // Trop. Pest menag. 1992. V. 38. P. 77-81.

55. Buchon N., Broderick N.A., Poidevin M., Pradervand S., Lemaitre B. Drosophila intestinal response to bacterial infection: activation of host Ddfense and stem cell proliferation // Cell Host & Microbe. 2009. V. 5. P. 200-211.

56. Buffinton G.D., Doe W.F. Depleted mucosal antioxidant defences in inflammatory bowel disease // Free radical biology and medicine. 1995. V. 19, 6. P. 911-918.

57. Bulet P., Hetru C., Dimarcq J.-L., Tomann D.A. Antimicrobial peptides in insects; structure and function // Developmental and Comparative Immunology. 1999. V. 23. P. 329-344

58. Burges H.D. Teratogenicity of the thermostable beta exotoxin of Bacillus thuringiensis in Galleria mellonella II J. Invertebr. Pathol. 1975. V.26. P.419-420.

59. Candas M., Loseva O., Oppert B., Kosaraju P., and Bulla L.A. Insect Resistance to Bacillus thuringiensis // Molecular & Cellular Proteomics 2.1. 2002. DOI 10.1074/mcp.M200069-MCP200

60. Carey M.P., Nolan B., Anilkumar K., Moar W.J. Esterase activity associated with Cry 1 Ac-resistant Helicoverpa zea II International congress on invertebrate pathology and microbial control. 2011. 07-11 August. P. 14.

61. Carroll J., Li J., Ellar D.J. Proteolytic processing of a coleopteran-specific 5-endotoxin produced by Bacillus thuringiensis var. tenebrionis II Biochem. J. 1989. V.261. P.99-105.

62. Cerenius L., Lee B.L., Soderhall K. The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity // Trends in Immunology. 2008. V. 29. No. 6. P. 263-271.

63. Cerenius L., Soderhall K. Prophenoloxidase-activating system // Immunological Reviews. 2004. Vol. 198. P. 116-126.

64. Chak K.F., Chao D.C., Tseng M.Y. Determination and distribution of cry-type genes of Bt isolates from Taiwan // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 2415-2420.

65. Chilcott C.N., Wigley P.J. Isolation and toxicity of Bacillus thuringiensis from soil and insect habitats in New Zealand // J. Invertebr. Pathol. 1993. V.61. P. 244-247.

66. Crickmore N. The diversity of Bacillus thuringiensis ô-endotoxins // Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field application. Kluwer Academic Publishers, 2000. P. 65-78.

67. Crickmore N., Zeigler D.R., Feitelson J. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins // Microbiol. Molec. Biology Rev. 1998. V. 62. P. 807-813.

68. Cross A.R., Jones O.T.G. Enzymic mechanisms of superoxide production // Biochim. Et biophys. acta. 1991. V.1057. P. 281-298.

69. Dalhammar G., Steiner H. Characterization of inhibitor A, a protease from Bacillus thuringiensis which degrades attacins and cecropins, two classes of antibacterial proteins in insect // Eur.J.Biochem. 1984. V. 139. P.247-252.

70. Damgaard P.H. Chapter 1.2. Natural occurrence and dispersal of Bacillus thuringiensis in the environment P. 23-40 // Entomopathogenic bacteria from laboratory to field application. Kluwer academic publishers. Netherlands. 2000. 510pp.

71. Darmgaard P.H., Abdel-Hameed A., Eilenberg J. Natural occurrence of Bt on grass foliage // World J Microbiol and Biotech. 1998. V. 14. P. 239-242.

72. Darmgaard P.H., Hansen B.M., Pedersen J.C. Natural occurrence of Bt on cabbage foliage and in insects associated with cabbage crops // J Appl Bact. 1997. V. 82. P. 253-258.

73. Dean R.T., Shanlin F.U., Stocker R., Davies M.J. Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation // Biochem. J. 1997. V. 324. P. 1-18.

74. Donovan W.P., Tan Y., Slaney A.C. Cloning of the nprA gene for neutral protease A of Bacillus thuringiensis and effect of in vivo deletion of nprA on insecticidal crystal protein // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V.63. P. 23112317.

75. Dubovskiy I.M., Krukova N.A., Glupov V.V. Phagocytic activity and encapsulation rate of Gallería mellonella larvae hemocytes during bacterial infection by Bacillus thuringiensis II J. Invertebr. Pathol. 2008. V. 98/3. P. 360362.

76. Edlund T., Siden I., Boman H.G. Evidence for two immune inhibitors from Bacillus thuringiensis interfering with the humoral defense system of saturniid pupae // Infect. Immun. 1976. V. 14. P. 934-941.

77. El-Aziz N.M.Abd, Awad H.H. Changes in the haemocytes of Agrotis Ípsilon larvae (Lepidoptera: Noctuidae) in relation to dimilin and Bacillus thuringiensis infections // Micron. 2010. V. 41. P. 203-209.

78. Eleftherianos I., Revenís C. Role and Importance of Phenoloxidase in Insect Hemostasis // Journal of Innate Immunity. 2011. V. 3. P. 28-33.

79. Ericsson J.D., Janmaat A.F., Lowenberger C., Myers J.H. Is decreased generalized immunity a cost of Bt resistance in cabbage loopers Trichoplusia nil i I Journal of Invertebrate Pathology. 2009. V. 100. P. 61-67.

80. Feeny P.P. Plant apparency and chemical defense, pp. 1-40, in J. Wallace and R. L. Mansell (eds.). Biochemical Interactions Between Plants and Insects. Recent Advances in Phytochemistry. 1976. V.10. Plenum Press, New York.

81. Felton G.W., Gatehouse J.A. Antinutritive plant defence mechanisms in Lehane M.J., Billingsley P.F. Biology of the insect midgut Chapman&Hall. 1996. P. 486.

82. Flanders S.E. and Hall I.M. Manipulated bacterial epizootics in Anagasta populations // J invert path. 1956. V. 7. P. 368-377.

83. Forcada C., Alcacer E., Garcera M.D., Tato A., Martinez R. Resistance to Bacillus thuringiensis Cry 1 Ac toxin in three strains of Heliothis virescens:proteolytic and SEM study of the larval midgut // Arch Insect Biochem Physiol. 1999. V. 42. P. 51-63.

84. Frankenhuyzen K. Interactions between Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 and midgut bacteria in larvae of gypsy moth and spruce budworm / Journal of Invertebrate Pathology. 2010. V. 103. P. 124-131.

85. Gatehouse J.A. Plant resistance towards insect herbivores: a dynamic interaction // New Phytologist 2002. V.156: P. 145-169.

86. Gill S.S., Cowles E.A., Pietrantonio P.V. The mode of action of Bacillus thuringiensis endotoxins // Annu. Rev. Entomol. 1992. V. 37. P. 661-636.

87. Gillespie J.P., Kanost M.R. Biological mediators of insect immunity // Annu. Rev. Entomol. 1997. V. 42. P. 611-643.

88. Gonzalez-Cabrera J., Escriche B., Tabashnik B.E., Ferre J. Binding of Bacillus thuringiensis toxins in resistant and susceptible strains of pink boll worm (.Pectinophora gossypiella) II Insect Biochem Mol Biol. 2003. V. 33. P. 929-935.

89. Griffits J. S. and Aroian R.V. Many roads to resistance: how invertebrates adapt to Bt toxins // BioEssays. 2005. V. 27. P. 614-624.

90. Gunning R.V., Dang H.T., Kemp F.C., Nicholson I.C., Moores G.D. New Resistance Mechanism in Helicoverpa armigera Threatens Transgenic Crops Expressing Bacillus thuringiensis CrylAc Toxin // Appl. environ, microbiol. 2005. Vol. 71. No. 5. P. 2558-2563.

91. Gupta A.P. Immunology of Invertebrates: Cellular // Encyclopedia Of Life Sciences. Nature Publishing Group, 2001. P. 1-6.

92. Gupta A.P. Cellular elements in the hemolymph // Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. V. 3. / eds. Kerkut G.A., Gilbert L.I. Oxford: Pergamon, 1985 P. 401-451.

93. Gupta A.P. Insect immunocytes and other hemocytes: roles in cellular and humoral immunity // Immunology of Insects and Other Arthropods / ed. Gupta A.P. CRC Press, 1991. P. 19-118.

94. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. Glutathione-S-transferases // J. Biol. Chem. 1974. V. 249. P. 7130-7139.

95. Haine E.R., Rolff J., Siva-Jothy M.T. Functional consequences of blood clotting in insects // Developmental and Comparative Immunology. 2007. V. 31. P. 456^64.

96. Hajek A.E., St. Leger R.J. Interactions between fungal pathogens and insect hosts // Annu. Rev. Entomol. 1994. V. 39. P. 293-322.

97. Hansen B.M., Darmgaard P.H., Eilenberg J. Bt Ecology and envaromental effects of its use for microbial pest control // Danish EPA Project 1996. No. 316. P. 125.

98. Heckel D.G. The complex genetic basis of resistance to Bacillus thuringiensis toxin in insects // Biocontrol Sci Tech. 1994. V. 4. P. 405-417.

99. Herbert D.A., Harper J.D. Bioassay of a beta-exotoxin of Bacillus thuringiensis against Geocoris punctipes (Hemiptera: Lygaedae) // J. Econ. Entomol. 1986. V.79. P.592-595.

100. Hirayama K., Yasutake A., Inoue M. Effect of oxidative stress on interorgan metabolism of glutathione // Med.Biochem.Chem.Asp.FreeRad. 1989. P.559-562.

101. Hodgman T. C., Ellar D.J. // Models for the structure and function of the Bacillus thuringiensis delta-endotoxins determined by compilational analysis DNA Seq. 1990. V. 1(2). P. 97-106.

102. Hoffman M.E., Mello-Filho A.C., Meneghini R. Correlation between cytotoxic effect of hydrogen peroxide and the yield of DNA strand breaks in cells of different species // Biochim. Etbiophys. Acta. 1984. V.781. P.234-238.

103. Jamieson D. Oxygen toxicity and reactive oxygen metabolites in mammals // Free Radic Biol Med. 1989. V. 7(1). P. 87-108.

104. Jiang H.B., Kanost M.R. Characterization and functional analysis of 12 naturally occurring reactive site variants of serpin-1 from Manduca sexta // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. № 2. P. 1082-1087.

105. Jurat-Fuentes J.L., Adang M.J. Cry toxin mode of action in susceptible and resistant Heliothis virescens larvae // J Invertebr Pathol. 2006. V. 92(3). P. 16671.

106. Khramtsov V., Yelinova V., Weiner L., Berezina T., Martin V., Volodarsky L. Quantitative determination of SH groups in low and high molecular weight compounds by an EPR method // Analytic . Biochem. 1989. V. 182. P. 58-63.

107. Knowles B.H., Ellar D.J. Colloid-osmotic lysis in general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis endotoxins with different insect specificity//Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 924. P. 509-518.

108. Kono Y. and Fridovich I. Superoxide radical inhibits catalase. Plants // J. Biol. Chem. 1982. 257, 5751-5753.

109. Kramer K.J., Muthukrishnan S. Insect chitinases: molecular biology and potential use as biopesticides // Insect Biochem.Molec.Biol. 1997. V.27. P. 887900.

110. Kruidenier L., Verspaget H.W. Review article: oxidative stress as a pathogenic factor in inflammatory bowel disease — radicals or ridiculous? // Aliment Pharmacol Ther. 1997. V. 16. P. 2015.

111. Ma G., Sarjan M., Preston C., Asgari S., Schmidt O. Mechanisms of inducible resistance against Bacillus thuringiensis endotoxins in invertebrates // Insect Science. 2005. V. 12. P. 319-330.

112. Maagd R.A., Bravo A., Berry C., Crickmore N., Schnepf H.E. Structure, diversity, and evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria // Annu. Rev. Genet. 2003. 37. P. 409-33.

113. Maagd R.A., Bravo A., Crickmore N. How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world // Trends in Genetics, 2001. Vol. 17. No. 4. P. 146

114. Mak P., Zdybicka-Barabas A., Cytry'nska M. A different repertoire of Galleria mellonella antimicrobial peptides in larvae challenged with bacteria and fungi // Developmental and Comparative Immunology. 2010. V. 34. P.l 129-1136.

115. Mamidala P., Susan C.J., Mittapalli O. Review. Metabolic resistance in bed bugs // Insects. 2011. V. 2. P. 36-48.

116. Marmaras V.J., Charalambidis N.D., Zervas C.G. Immune Response in Insects: The Role of Phenoloxidase in Defense Reactions in Relation to Melanization and Sclerotization // Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 1996. V. 31. P. 119-133

117. Marshall OJ. PerlPrimer: cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR // Bioinformatics. 2004. V. 12; P. 20(15).

118. Martin J.S., Martin M.M., Bernays E.A. Failure of tannic acid to inhibit digestion or reduce digestibility of plant protein in gut fluids of insect herbivores: Implications for theories of plant defense // J. Chem. Ecol. 1987. V. 13. P. 605-621.

119. McCord J. M., Fridovich I. Superoxide dismutase: an enzymic function for erythro-cuprein (hemocuprein) // J. Biol. Chem. 1969. V. 244. P. 6049-6055.

120. Morin S., Biggs R.W., Sisterson M.S., Shriver L., Kirk C.E. Three cadherin alleles associated with resistance to Bacillus thuringiensis in pink bollworm // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V. 100. P. 5004-5009.

121. Morris-Coole C. Bt: Ecology, the significance of natural genetic modification, and regulation // World J. Microbiol. And Biotech. 1995. V. 11. P. 471-477.

122. Nappi A.J., Ottaviani E. Cytotoxity and cytotoxic molecules in invertebrates // BioEssays. 2000. V. 22. P. 469-480.

123. Nappi A.J., Vass E. Hydrogen peroxide production in immune-reactive Drosophila melanogaster // J. Parasitol. 1998. V. 84. № 6. P. 1150-1157.

124. Nappi A.J., Vass E., Frey F., Carton Y. Superoxide anion generation in Drosophila during the melanotic encapsulation of parasites // Eur. J. Cell Biol. 1995. V. 68. P. 450-456.

125. Ohba M., Aizawa K. Serological identification of Bt and related bacterial isolated in Japan // J Invert Path. 1978. V. 32. P. 303-309.

126. Okstad O.A. Sequence analysis of three Bacillus cereus loci carrying PicRregulated genes encoding degradative enzymes and enterotoxin / Gominet M., Pumelle B. //Microbiology. 1999. V. 145. P. 3129-3138.

127. Oppert B., Kramer K.J., Johnson D.E., Macintosh S.C., McGaughey W.H. Altered protoxin activation by midgut enzymes from a Bacillus thuringiensis resistant strain of Plodia interpunctella II Biochem Biophys Res Commun. 1994. V. 198. P. 940-947.

128. Pavlick K.P., Laroux F.S., Fuseler J., Wolf R.E., Gray L., Hoffman J., Grisham M.B. Role of reactive metabolites of oxygen and nitrogen in inflammatory bowel disease // Free Radical Biol. Med. 2002. V. 33. No. 3. P. 311-322.

129. Paw M. and Travers R.S. Worldwide abundance and distribution of Bt isolates // Appl Environ. Microbiol. 1991. V. 55. P. 2437-2422.

130. Pigott C.R.; Ellar D.J. Role of Receptors in Bacillus thuringiensis Crystal Toxin Activity // Microbiology and molecular biology reviews. 2007. P. 255281.

131. Qazi S., Trimmer B.A. The role of nitric oxide in motoneuron spike activity and muscarinic-evoked changes in cGMP in the CNS of larval Manduca sexta II J.Comp. Phisiol. 1999. V.185. P. 539-550.

132. Rahman M.M., Harry L.S., Schmidt R.O. Tolerance to Bacillus thuringiensis endotoxin in immune-suppressed larvae of the flour moth Ephestia kuehniella. II J. Invertebr. Pathol. 2007. V. 96. P. 125-132.

133. Rahman M.M., Roberts H.L.S., Saijan M., Asgari S., and Schmidt O. Induction and transmission of Bacillus thuringiensis tolerance in the flour moth Ephestia kuehniella IIPNAS. 2004. V. 101. No. 9. P. 2696-2699.

134. Rantala M.J., Roff D.A. Analysis of the importance of genotypic variation, metabolic rate, morphology, sex and development time on immune function in the cricket, Gryllus firmus II J. Evol. Biol. 2006. V. 19. P. 834-843.

135. Raymond B., Johnston P.R., Nielsen-LeRoux C., Lereclus D., Crickmore N. Bacillus thuringiensis: an impotent pathogen? // Trends in Microbiology. 2010. Vol.18 No.5. P. 189-194.

136. Regev A., Keler M., Strizhov N. Synergistic activity of a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin and a bacterial endochitinase against Spodoptera littoralis larvae //Appl.Env.Microbiol. 1996. V. 62. P. 3581-3586.

137. Reuter A., Klinger W. The influence of systemic hypoxia and reoxygenation on the glutathione redox system of brain, liver, lung and plasma in newborn rats // Exp.Toxicol. and Pathol. 1992. V.44. P. 339-343.

138. Richards D.M., Dean R.T., Jessup W. Membrane proteins are critical targets in free radical mediated cytolysis // Biochim. Et. biophts. acta. 1988. V.946. P. 281-288.

139. Rowley A.F., Ratcliffe N.A. A histological study of wound healing and hemocyte function in the wax-moth Galleria mellonella II J Morphol. 1978. V. 157. P. 181-200.

140. Roy B.A., Kirchner J.W. Evolutionary dynamics of pathogen resistance and tolerance. Evolution. 2000. 54. P. 51-63.

141. Rozen S., Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers // Methods Mol Biol. 2000. V. 132. P. 365-86.

142. Rukmini V. Bacillus thuringiensis crystal-endotoxin: role of proteases in the conversion of protoxin to toxin / Reddy C.Y., Venkateswerlu G. // Biochimia. 2000. V.82. P. 109-116.

143. Sampson M.N., Gooday G.W. Involvement of chitinases of Bacillus thuringiensis during pathogenesis in insects // Microbiology. 1998. V. 144. P. 2189-2194.

144. Sarjan M., Ma G., Rahman M.M., Schmidt O. Resistance Against Bacillus thuringiensis Endotoxins in a laboratory Population of Helicoverpa armigera is Based on an Elevated Immune status. // J. Ilmu dasar. 2009. V. 10. No.l. P. 7784.

145. Schnepf E.A., Crickmore N., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Feitelson J., Zeigler D.R., Dean D.H. B. thuringiensis and its pesticidal crystal proteins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. Vol. 62. P. 45-52

146. Smirnoff W.A., Randall A.P., Martineau R. Field test of the effectiveness of chitinase additive to Bacillus thuringiensis Berliner against Choristoneura fumiferana II Can. J. For. Res. 1973. V. 3. P. 226-236.

147. Smith R.A. and Couche G.A. The phylloplane as a sourse of Bt variants // Appl Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 311-315.

148. Staheli J.P., Boyce R., Kovarik D., Rose T.M. CODEHOP PCR and CODEHOP PCR primer design // Methods Mol Biol. 2011. V. 687. P. 57-73.

149. Strand M.R., Pech L.L. // Annu. Rev. entomol. 1995. V. 40. P. 31-56.

150. Tabashnik B.E., Liu Y.B., Malvar T., Heckel D.G., Masson L. Global variation in the genetic and biochemical basis of diamondback moth resistance to Bacillus thuringiensis. Proc Natl Acad Sci USA. 1997. V. 94. P. 1278012785.

151. Tan Y., Donovan W.P. Deletion of aprA and nprA genes for alkaline protease A and neutral protease A from Bacillus thuringiensis: effect on insecticidal crystal proteins // J. Biotechnol. 2000. V.84. P. 67-72.

152. Tang H. Regulation and function of the melanization reaction in Drosophila // Landes Bioscience. 2009. Vol. 3 (1) www.landesbioscience.com (дата обращения 21.09.2012)

153. Thamthiankul S., Suan-Ngay S., Tantimavanich S. Chitinase from Bacillus thuringiensis subsp. Pakistani II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 56. P. 395-401.

154. Theopolda U., Li D., Fabbri M., Scherfera C., Schmidt O. The coagulation of insect hemolymph // Cellular and Molecular Life Sciences, 59. 2002. 363372.

155. Vallet-Gely I. Bacterial strategies to overcome insect defences // Nature Reviews Microbiology. 2008. V. 6. P. 302-313.

156. Rie J.V., McGaughey W.H., Johnson D.E., Bamett B.D., Van Mellaert H. Mechanism of insect resistance to the microbial insecticide Bacillus thuringiensis II Science. 1990. V. 247. P. 72-74.

157. Rie J.V., Jansens S., Hofte H. Specificity of Bacillus thuringiensis deltaendotoxins. Importance of specific receptors on the brush border membrane of the midgut of target insects // Eur. J. Biochem. 1989. V. 186. P. 239-247.

158. Vankova J. and Purrini K. Natural epizootic caused by bacilli of the species Bt and В cereus // Zeits Angew Entom. 1979. V. 88. P. 216-221.

159. Vogel H., Altincicek В., Glöckner G., Vilcinskas A. A comprehensive transcriptome and immunegene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella II Vogel et al. BMC Genomics. 2011. 12:308.

160. Wang Q., Liu Y., He H.J., Zhao X.F., Wang J.X. Wang et al. Immune responses of Helicoverpa armígera to different kinds of pathogens // BMC Immunology. 2010. V. 11:9.

161. Wang Y., Oberley L.W., Murhammer D.W. Antioxidant defense systems of two lipidopteran insect cell lines // Free radical biology and medicine. 2001. Vol. 30 No 11, P. 1254-1262.

162. Willson R.L. Organic peroxy free radicals as ultimate agents in oxygen toxicity // Oxidative Stress. L.:Acad. Press. 1985. P.41-72.

163. Wilson K., Cotter S.C., Reeson A.F., Pell J.K. Melanism and disease resistance in insects // Ecology Letters. 2001. V. 4. P. 637-649.

164. Wojda I., Jakubowicz T. Humoral immune response upon mild heat-shock conditions in Gallería mellonella larvae // Journal of Insect Physiology. 2007. V. 53. P. 1134- 1144.

165. Wojda I., Kowalski P., Jakubowicz T. Humoral immune response of Gallería mellonella larvae after infection by Beauveria bassiana under optimal and heat-shock conditions // Journal of Insect Physiology. 2009. V. 55. P. 525531.

166. Wojda I., Kowalski P., Jakubowicz T. JNK MAP kinase is involved in the humoral immune response of the greater wax moth larvae Gallería mellonella II Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 2004. V. 56. P. 143-154.

167. Wong G. W., McHugh T. M., Weber R., Goeddel D. V. Tumor necrosis factor alpha selectively sensitizes human immunodefi ciency virus-infected cells to heat and radiation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. 88:4372-4376.

168. Xu X.X., Zhong X., Yi H.Y., Yu X.Q. Manduca sexta gloverin binds microbial components and is active against bacteria and fungi // Dev Comp Immunol. 2012. 38(2):275-84.

169. Yamamoto T., Dean D.H. Chapter 2.2. Insecticidal proteins produced by bacteria pathogenic to agricultural pests p. 81-100 // Entomopathogenic Bacteria from Laboratory to field Application. Kluwer academic publishers. Netherlands. 2000. 510pp.

170. Yamvrias C. Contribution a l'tude du mode d'actiion de Bacillus thuringiensis vis-a-vis de la teigne de la farine, Anagasta kuhniella Zell.(Lepidoptera) // Entomophaga. 1962. V.7. P. 101-159.

171. Zaidman-Re'my A., Poidevin M., Herve' M., Welchman D.P., Paredes J.C., et al. Drosophila Immunity: Analysis of PGRP-SB1 Expression, Enzymatic Activity and Function // PLoS ONE. 2011. V. 6(2): el 7231. doi: 10.1371/journal.pone.0017231

172. Zdybicka-Barabas A., Мак P., Klys A. Synergistic action of Galleria mellonella anionic peptide 2 and lisozyme against Gram-negative bacteria // Biochimica et Biophysica acta. 2012. V. 1818. P. 2623-2635.

173. Zhang M.-Y., Lovgren A. Cloning and sequencing of a lactamase-encoding gene from the insect pathogen Bacillus thuringiensis II Gene. 1995. V. 158. P. 83-86.

Информация о работе

Гризанова, Екатерина Валерьевна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2012
ВАК 03.02.05

Диссертация

Иммунный ответ, состояние антиоксидантной и детоксицирующей систем личинок большой вощинной огневки Galleria mellonella L. (Lepidoptera, Pyralidae) при бактериозах, вызванных Bacillus thuringiensis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы