Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизма токсичности липосом

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизма токсичности липосом"

ШШСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФЗР ВТОРОЙ 1ÍQCK0BCKM ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ШШЖЖЙ8 ШЗТКТУГ имени К К ПИРОГОМ

На правах рукописи

УДК 616.36 - 085

УСТЬЯНЦЕВА КРШ!Л НАРГЮЗНД ИССЛЕДОВАНИЕ ШАШЗЫА ТОКСИЧНОСТИ ЛЮЮСОЫ оа СО. 04 - "биохимия"

-АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на сокскаииз ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991"

Работа выполнена в Экспериментальной лаборатории медико-биологических проблем при Кемеровском Государственном медицинском институте МЗ РСФСР

Научные руководители - доктор медицинский наук, профессор

А. М. Герасимов, кандидат медицинских наук RJL Крейнес.

Официальные оппоненты: докт. мед. наук, проф. A.A. Терентьев,

докт. мел. наук И. Е Марокко.

Ведущая организация - Институт питания АМН СССР

Защита состоится "__" Уcpe-V/> ___ 199.£г.

в£ часов на заседании Специализированного Ученого Совета N (К 034.14.05) 2-го псковского ордена Ленина Государственного медицинского института имени К И. Пирогова

Москва. 117437. ул. Островитянове, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 2-го МОЛГМИ

им. Е Я Пирогсва

Автореферат разослан ............................ }99 г.

Ученый секретарь Специализированного Ученого Совета

канд. мед. наук 1'.Я Клуамна.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Целью применения липосом в биологии и медицине является использование возможности целенаправленного воздействия на клеточные мембраны Известно, что фосфолилиды входят в состав меибраносвязанных ферментов и влияют на их активность (Бергельсон Л. Д. , Дятдовицкая Э. В.. 1981; Бурлакова Е. Б., 1977), определяют чувствительность клеток к действию гормонов и различных биологически активных веществ ( Таракулов Я. X. с соавт. ,1931), участвуют з процессах знергообраговакия (Kper.c Е. R , 1981) и синтеза белков ( Pignatti С. et al. ,1981). Эти и другие исследоваьия поаеолили применить липосомы как средство для регуляции функциональной активности ряда органов и систем. Наиболее показательными эти исследования выглядят при воздействии липосом на сердечно-сосудистую и дыхательную системы (Бергельсон Л.Д. и др. ,1981; KailyG. , 1983; Булгаков R Г. с соавт. ,1987). Кроме того, липосомы могут проявлять сорбционную активность по отношению к эк-80- и эндотоксинам ( Banghan A. D. et. al. ,1965; Стефанов А. Е с соазт,, 1985). На основании вышеизложенных данных, использование "пустых" липосом как лекарственного средства имеет несомненную актуальность и преляе всего для воздействия на поврежденные тканевые и клеточные структуры. Однако для эффективного использования липосом имеются ограничения, связгшные с их фармакокинетикой. Введен-Hue- внутривенно липосомы быстро выводятся из кровотока (Juliano R L. , Stanp û. ,1975; Hinkle G. H. et a.l. ,1978) и их основная масса обнаруживается s печени, селезенке, легких ( Segal А. Ч ot al. „ 1974; Sh\ro/.a*a S. et al., 1980). Бее попытки изменить распределение внутривенно ьведен - ных липосом по органам путем изменения

состава, варяда и размеров липосом привели лишь к незначительным успехам ( Tanaka Т. ot al. ,1075).

Принципиально новое распределение липосом в организме было подучено при их локальном введении ( Dlnple J.T. et al., 1978; ivey H. et al., 1977), Однако многие вопросы, связанные с возможностью местного применения лилосом ( степень окис,ценности липосомадьных липидов, биологическая эффективность и токсичность) до настояиего времени окончательно не решены. Известно, что даже "пустые" липосомы вызывают реакции при введении в организм: повышение уровня глюкозы в крови и мозге ( Bigon Е. et al.,1979), нарушение свертываемости крови ( Black С. D. V., Gregonadis Е ,1977), уменьшение содержания пролшстина в сыворотке ( Nicco М. С. et al. ,1978). В доступной нам литературе мы не встретили систематизированных данных о механизмах побочных изменения, которые вызывают липосомы. Вместе с тем это имеет не только теоретическое, но и практическое значение, так как знание механизмов побочных эффектов и ряд методических приемов позволят успешно применить липосомы в различных областях биологии и медицина

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Установить изменение биологических свойств липосом в зависимости от степени их окисленности, кратности введения в организм в Норме и в условиях зндогенпной интоксикации. Соответственно этому в работе были поставлены следующие задачи:

1. Выбрать состав и методы получения липосом разной степени окисленности.

2. Изучить некоторые эффекты действия липосом разной степени окисленности на клетки ' и гомогенаты тканей.

3. Исследовать динамику функционального состояния печени у ин-тактных животных после двукратного и длительного парентерального введения липосом с заданной степенью окисленности липидов.

4. Оценить состояние печени у животных с эндогенной интокеика-

шей.

5. Установить выраженность повреждения печени у животных с эндогенной интоксикацией пасхе двукратного и длительного парентерального введения липосом с заданной степенью окисленности липидов. новизна подученных результатов.

Разработан способ получения липосом, "позволяющий приготовить препарат с варанее заданным содержанием продуктов ПОЛ. бучены не-гатсрыз эффекты липосом равной степени окисленности на клети" и гоиогеиаты тканей. 1п у|1го показано, что липосомы разной степени окнслениости оказывает различное влияние на щетки и субклеточные фракции печени. Степень и направленность влияния липосом на резистентность эритроцитов, бластогекез Т- и В-: лимфоцитов, пере- ; кисное окисление Л!ШИдов печени и бактерицидное действие находится в прямой зависимости от степени окисленности липосомальных липидов.

Впервые проведено комплексное исследование Функционального состояния печени после двукратного и длительного подкожного введения липосом у интактных яиботных и аивотных с эндогенной интоксикацией, вызванной локальным гнойно-воспалительным процессом. Показа- * но, что длительное введение липосом вызывает повреждение печеночных клеток, определяемое по изменению активности органоспецифичных ферментов (гиствдазы и уроканинааы) к иояат приводить к изменение ив-таболической активности печени в белковой и лнпидном обмене. Подобные на изменения при двукратной введении липосом менее ' выражены и носят транаиторный характер. Установлена возможность использования двукратного введения "средне окисленных" липосом при эндогенной ин- " токсикации.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Результаты исследования имеют как-теоретическое, теки практическое значение, поскольку раскрывает новые аспекты в проявлении токсичности липосом при их использовании для лечения патологических • процессов. Существенную

роль при использовании липосоы имеет оценка функционального состояния печени, так как длительное применение лецитин-холестериновых липосом на фоне ваболеваний, сопровождающихся нарушением функционального состояния печени, может усилить проявление печеночной недостаточности. Показано, что биологическое действие липосом на клетки про- и эукариот может быть обусловлено степенью их окислеи-ности, что должно учитываться при воздействии на различные патологические процессы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Штериалы диссертации доложены и обсуадоны: .

- на совместной научно-методической конференции экспериментальной лаборатории медико-биологических проблем при. Кемеровском Государственном медицинском институте и кафедры биохимии КГМИ 14 сентября 1990 г.;

- на Международном симпозиуме "Лнпосома в биологии и медицине" в г. Тавкенте 12-16 ноября 1990 г.;

- на Всесоюзной конференции "Огнестрельная рана и раневая инфекция" в г.Ленинграде 19-21 февраля 1991 г.;

- на заседании областного хирургического общества в г. Кемерове 17-18 марта 1991 г.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ. ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация излоягва на 132 страницах машно-писного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных дачных, заключения, выводов и указателя литературы, включавшего 68 работ отечественных авторов и 116 работ зарубеиных авторов. Работа иллюстрирована цифровыми таблицами (3) и рисунками (29). '

материал и методы исследования

Работа выполнена на 290 поливсзр»лых кроликах обоего полз по-

- б -

юди "Шшниша" весом 1.65+-0.45 кг. Еивотиыэ были разделены на :емь групп. 1-о группу составили ннтактныз животные (п-1б); яивот-¡ым 2- ей группы (п-Б) для моделирования порагзиия печени в язлудок зднократно вводили 6Х маедянный раствор чэтыреххлористого углерода • :э расчета б мл/кг; яиаотныи 3-й группы (п»30) под местной анесте-ЗП2Л по наружной поверхности левой голени наносили резаную рану, .«яорую-инфицировал» взвесью суточной культуры золотистого стафило-гагаса (МэосЫб) и угашали наглухо. , Шзы сишгали через 24 часа. При зтои в области рани определяли гиперемию, отек, гнойно-некротическое отделяемое; гнтакгшш йтаогаш 4-ой группы (п-30) и животным : гнойной раной 5-ой группы (п -20) ввод!Ш1 днлосомы в дозе 25 ¿г/мл/ кг подкояга в область левого скакательного сустава ежедневно а течение 30 суток; интактным яивотным 6-ой группы (п-30) и животным с гнойной раной 7- ой группы (п-30) липосомы вводили аналогичным способом на 1 -ьге и 7-ыэ сутки от начала опыта. Кратность введения иотосои ответный 6-оЯ и 7-ой групп была равна периоду полуви-ведения яшюсоы из туевого депо. Еивотних с гнойной раной 8-ой (г*» 60) и 9-ой (п- 60) групп использовал! для изучения распределения лмпосом при виутрисосудистом и подкоаном введении соответствен-.

!50.

.йотосош готовила иэ яичного фосфатидияходяна и холестерина [7:6 ноль/моль) по методу ВапзЬат А.О. е! а1. (1965). Суспензию ли-пидов & 0.15 И НаС1 обрабатывали ультразвуки ( 22 кГц) при 0-4°С в течение Б минут. При этой степень окисденности липосоыадьиого препарата, определяемая по содерявяия шлонового диааьдегида(ЫДА)(Андреева ЛИ. и др., 1988), варьировала в пределах 46-58 икМ. Для получения меченых липосом в их состав включали фосфатидилходин из • -в

расчета 2*10 ерт/мг липида. Распределения препарата в организме кроликов ( совместно с Голубчиковой Н.А.) изучали путем определения уровня радиоактивности тканей че£ез 1,2,6,12,24 часа после введе-

■ - 6 - .

ния. Для исследования ферментов проводили аабор крови и TKaifti печени у животных 2-ой группы через 3 -ое суток после введения четы-реххлористого углерода, а у животных 3, 4, Б, 6 и 7 групп но 3, б, 9, 12, 20 и 30 сутки. В сыворотке крови и гомогенате печени определяли активность ферментов - гистидазы (Гк.Гл) « уроканиназц (Ук.Уп) (Еуробин Е А., Короткдаа Р. Н. ,1682). 15роые того а сыворотка крови определял!? активность псевдохолинэстеразы (ГОЭ) ( Vincent D., Бэеопзао G. ,1С5£), содержание средне-иодзкулярных пептидов (СШ) ( Габриэлян НИ., Липатова ЕЛ, 1984) и общего белка (Woiche&l-baun Т. Е., 1Q4.G). Исследование биологических свойств лашосо« D аа-висимости от степени их окисленности проводили in vitro, испольвуя ыузейкую культуру микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa (ютаму 2134), эритроциты, 1- й В -лимфоциты, гомогенаты печени крыс. Статистическую обработку цифровых данных проводили на компьютере IBM/'AT, применяя метод описательной статиститки и критерий Стыоден-та •

ССШШВ РЕЗУЛЬТАТЫ Я ОЕСУЯЩШЗ РАБОТЫ

Получение -теюсом разной степени окисдениости. . Для иэучэвия влияния рездшоь ультразвуковой обработки на содержание ЩА в -мао-сомах суспензию озвучивали 2. 5 минуты а токе газообразного азота (Р- 30 (trc/см2). ватем. прекращая подачу инертного газа до 5 , 15 и 30 минут по рдной минуте с 30 секундным интервалом при 22 кГц и 0 -4°С. (Рис.1). При этом, содержание 1Щ в исходной неозвученной суспензии липидов (35.39+-2.37 мкМ) после утразвуковой обработки в течение 2.5; б; 15 минут возрастало до 41.03+-0. 04 мкМ (Р< 0.02); 48.81+-0.81мкМ (Р< 0.001); 53, 56+-1,11 мкЫ (Р< 0.001) соответственно. При продолжении ул>тшэвуковой обработки дипосомальной. суспензии до 30 шнут уровень ИДА практичен: «е изменялся. Полученные таким образом липосомы по содержанию вторичных продуктлши

шделены на три группы: "наименее окисленные" (40-42 юШ ЫДА), 'срзднэ окисленные" (47- 60 мкЦ ЩА) и "окисленные" ( 52- 55 ккЫ ,ЩЛ). Для сравнительной оценки биологичесгаго действия липосом раа-:оП стэпзни огсислеииосги получав! "максимально окисленные" тпосо-т, ■ Для отсго "окнолешшэ" лщосом облучали УФ - светом в интервала "дяшг соли 2Е0-350 им з точение 30 минут. Такса облучение Езф1ект1Г2но стимулировало дальнейшее пакопленио окисленных Форм Данилов в.липосоказ,' которое в пересчете на 1ЩА составляло 81.0^-0.64 шШ (Р< 0.001) и на 50% превышало аналогичный показатель в "окио-

йзинщ" ллп0сошз (рис.1).

Таким- образом, разработан способ получения липосом , позволяюсь приготовить препарат с заранее заданным содержанием вторичных продуктов ГОЛ. ;

Сравнительная оценка влияния липосом разной степени окислен-кости на резистентность рритрошггов. "Ншша.чео огасдешшэ" липосош пкзызали незначительное разрушение зротроцитов иа протяжении всего периода наблюдения и после 60 ьашутной инкубации сохранялось до 95.09+-0.282 аротроцитоа. При добавлении к взвеси эритроцитов "средне окисленных" липосом процентное разрушение клеток оказывалось Солее выраженным. После 15, 30, 45 и 60 минут инкубации сохранялось соответственно 05.26+-0.6 X, 92.39+-0.82 %, 88.45+-1.04 % и 82.29+-1.20 % зритроцитоз (Р< 0.01). Значительное снижение устойчивости эритроцитов под действием ''машшаяьно окисленных" липосом было выявлено зз период с -15 по 60 минута При этом к концу наблюдения разрушнншя! оказалось 852 клеток (Р< 0.001) (Рис. 2). Различные значения процентного раз рутения эритроцитов после инкубации с "наименее", "средне" и "максимально окисленными" липосомами могут служить количественной мерой их вклада в "процесс, индущфованиого окисленными лнпидамн изменения структуры и функций клеточных мембран, а следовательно и резистентности клеток ,(РараЬагиорои1оз 0. оЬ

Рве. Д^Содераагаэ маховового дкагодегида & лшосошх развой стгпони окисланности.

1-"вааызи88и, 2- "среда", з-^задештне". ¿-"ыакеюшш)" окисдэн-нда жюсоиы. Звеадочкоа отиэчава гаачзвия ори Р<а 001по сразкенио с ковтродэи.

ы

60 40 20

О" тгпл

щщмитгтпч ппт^тп гпнгмпп

15 , 30 45

время инкубации (мин)

60

Рис.2. Динамика рьзп^ентности эритроцитов / в Й от исходной/ после инкубаши с липосои^с: пазной степени окисленностл 1-пна2К9неб-", 2-"средне-", ^"малслг^^ьно-" окисленное лппосот Звездочкой отмечена значения: * при Р<и. Л,1'*»те Р<0.СЭ1 по сравнению с контролем.

al. ,1678, 1979).

Таким образом, показано: чем выше степень окисленности лило-сом, 7»м более выражена их способность изменять устойчивость клеточных ыембран эритроцитов, взаимодействующих с ними .

Сравнительная оценка бактерицидного эффекта липосом рваной отепени окиолеиности, При инкубации Psaudomorias aeruginosa о "наименее окисленными" лилосои&ми в концентрации 1.6 и 3.1 мг/мл не обнаружили изменений роста данной культуры в каждом из периодов наблюдения. По мере увеличении концентрации "наименее окисленных" липосом в инкубационной среде отмечали последовательное уменьшение роста колоний после высева на твердую питательную среду. Использование данных липосом в концентрациях 12.5 цг/мв и 25 мг /ид вызывало снижение роста Pseudoironas aeruginosa череа б часов инкубации на 22-23 X, а после 12 часов • на ЗОХ и 11X соответственно. При продлении сроков инкубации до 24 часов было отмечено полное подавление бактериального роста. При использовании "средне окисленных" липосом подавление бактериального роста происходило более активно. Так, череа б часов инкубации с препаратом в концентрациях 6.2, 12.5 и 25 иг/мл рост культуры уменьшался на 25Х, 60Х и 70Х соответственно, а черев 12 часов даже концентрация липосом 3.1 ыг/мд вызывала полное подавление бактериального роста.: Наиболее выраявиный бактерицидный аффект наблюдался при использовании "максимально окисленных" липосом. Уха через 6 часов инкубации бактерицидной оказалась минимально используемая концентрация (1.5 ыг/кл) , которая позволила на Q6X уменьшить число жизнеспособных клеток. При увеличении концентрации препарата или времени инкубации рост бактериальных клеток полностью отсутствовал.

Проведенные исследования показали, что несмотря на наличие на поверхности бактерий клеточной стенкн, вышшяххцай барьерную функцию и препятствуюаэй непосредственному контакту липосом с мембраной

микроорганизма, лшюсоыы оказывали прямой,антибактериальный эффакт в отношении использованного гоамма микроорганизмов. При этом выраженность бактерицидного действия препарата возрастала по изрэ увеличения содержания в лшпосомах "вторичных" продуктов ПОЛ.

Сравнительная оценка влияния дипоаом разной степени окиедеи-ности на реакция блаоттрансформации Т и В-лимонитов. Уменьшив концентрации в инкубационной смеси лмпосом с наименьшей степенью о;шсхеяиости в пробелах с 5 иг/мл до 0,0781 >лг/г,1л сопровождалось увод1чо1!)!ом степени пролиферации лыфощгтов и прл минимальном содержании препарата бластная трансформация Т-лшгфощп'ов под дгйствн-еы Ш возрастала на 39Х, а В-лимфоцитов - на 837. в сравнении с исходной величиной (Р <0.01). При цспользованш "срзднеокислзетых" лишсом наблюдалось менее выраженная бласттрансфоркашга. В сравнении с исходной величиной этот рост для Т-дшфошяов составил всего 7Х, а для В-лимфоцитов- 65%. Наиболее виражэннн,! действием на ? и В клетки оказывали "максимально омсленныэ": лнпосо.мы. Пролиферация

ч -

под действием препарата увеличивалась па 101% и 02% соответственно. Ш-видимому, не одинаковое влияние кспольвуемых лшюсом .на мятоти-ческую активность Т- и В-лимфоцитов ыокзт быть связано с тем, что . раалнчное количество ошпосомалышх окислешшх липвдов в роеульт-ате юэточно-лтосомальиых . взаимодействий, изызияёт ЗЕирнокислотлкй состав сложных дшшдов мембраны . лимфоцитов (6Ш В., С1агк V. ,1680), и в следствие изменения ыикровяэкости кеыбран приводит к увеличений цитологической способности клатог» на активацию митогена-ыи. Это проявлялось б различной .выраженности бластогекеза Т- и В-лимфоцитов под действием липосо>,г разной степени огаюленности.

Сравнительная оценка влияния липосом разной степени окислен-ности на выраженность лср^кисного окисления лилпдов в томогенатах печени. "Наименее-" и "средне окисленн^с" *илосомы не вызывали индуцирования ПОЛ в гоыогенатах печени, по-видимому, за счет дсЛсг"?!.»-

печеночных аитиоксидаитов и ферментов антиоксшштной системы. ."Максимально окисленные" дптосош индуцировали ШЛ субклеточных фракция liXGToj? печени после 30 и 60 минутной инкубации, соответственно, .«а 77. и '132 , вероятно, за счет избытка окислителей по сравнению о мощность» антиоксидантноА системы гоиогенато.

1Ь-видаому, эффекты взаимодействия клеток с аллосомами разной степени окисденносш in vitro будут проявляться и при использовании яипоеом' в условиях ыакроорганизиа. Представляет зштерзс возможность использования в различных областях биологии я медицины "средне окисленных" гшпооом, которыэ наряду с выраженным антибакте-р-лальинм эффектом, в отлимми от "максимально окисленных" веэикуд, пе вызывают индукцию процессов ПОЛ в печеночной ткани и з значительно нэнЬЕей степени поврзпдвк? мембраны эритроцитов. Однако, яри . этом .необходимо "изучить; /возножость. • проявления побочных эффектов •вводимого в организм препарата, в том чксяз и токсического повреа-дения вечеия.' Поэтов в дальпойЕ&х • йссдодомошх ш изучив влияние ••двух-. и многократного вгэдезшя этого вида йгаосом па фушшиональное состояние печен» у интшдош животных л хввопж с моделью эндогенной интоксикацией,. зкэвйшоЗ острым гнойно-воспалительным процессом.' ;

Выбор- пугй пвсгетсл дптозон ь организм животных с гнойной ра-'пой"бедра. В отличие от внутриоооуднстого,подкояксе введение липо-ccs.f позволило обеспечить длительное, (более суток) и.в среднем 16.7 раза болъсее накопление препарата в патологически измененных тканях, в. региональных .и.отдаленных лимфатических узлах . При этом степень и скорость накопления меченого препарата в печени была н 4 раза меньше. Ере)«« полувыведения метки из тканевого депо составляло ■3-5-суток.. В связи с этим, для воздействия на процессы раневого воспаления, которые продолжаются', не менее 7 суток ( Кузин Si и. , Костюченок Б.R. 1980) мохет потребоваться 1-2- кратное (и более)

:■■ * 12 '"v

введение липосомального препарата С Щраер Т, И. и др., 1988).

Исследование функционального состояния" печенц при двукратном и многократном подкожном введении липосом интактньм животным. При ивучении активности гистидааы в печеночных гомогенатах в процэосе ежедневного подкожного введения оуспенвии липосом была варегистри-рована двухфазная реакция . В период от 1 до & суток наблюдения активность Гп у интактных животных постепенно снижалась о *12.5+-1.02 ед. до 4.64+-0.12 ед. (Р< 0.001). В дальнейшей до концазкспериман-та существенных изменений этого покавателя не происходило, хотя н отмечалась тенденция к его увеличение до 6.65+-1.80 ед.(Рис.30). Одновременно в печеночных гомогенатах отмечали тенденцию к уменыве-нию активности уроканииазы , которая к концу наблюдения составляла а 64+-0.80 ед. в сравнении с 4.03+-0.08 ед. до введения препарата (Р<0.01 ) (Рис. ЗД). Активность Гк прогрессивно увеличивалась с О.89 +-0.14 ед. до 6.14+-0.60 ед. (Р< 0.001) на протяжении всего периода наблюдения (Рис.ЗА). При атом в сыворотке крови появлялась активность Ук, которая постепенно возрастала и к 9 суткам достигала максимального аначения (5.08+-0.35 ед. Р< 0.001) (Рис. ЗБ) Затем до конца эксперимента существенных изменений зтого показателя не происходило к к 30 суткам активность Ук оставалась в 4 pasa визе, чем у животных I группы. Вдасте с тем, на протяжение всего периода наблюдения активность гистидавы и урокаииназы в крови оставалась на 30 -40Х и 25-60Х меньше активности данных ферментов у животных после введения CClt соответственно. Активность сывороточной ПХЭ при трехкратном подкожном введении липосом снижалась о 1102 +-26.90 ммоль/мин до 7БЗ+-22.60 ммодь/мин (Р< 0.001). В дальнейшем к 9 суткам отмечали некоторое увеличение ■ активности Фермента до 870 +-12. 40 ммоль/ыхн (Р< 0.001). В конце наблюдения активность ГОЭ снижалась еще более значительно (Я85+-19.57 ммодь /мин Р< 0.001). Содержание общего белка в сыворотке крови после 30-ти кратного введения

липосом изменялось соответственно изменениям ПХЗ с 78.60+-2.23 г/л до 69.Э0+-0.90 г/л (Р <0.001). Кроме того, при длительном подкожном введении липосом обнаружили накопление в кровяном русле физиологически активных пептидов, входящих в состав СУП, которое выражалось в постепенном увеличении их количества на протяжении всего периода наблюдения с 0.223+-0.004 у. е. до 0.430+- 0.03'у. е. (Р<0.001). Однако, содержание СУП оставалось в 2-4 раза меньше вначвния этого показателя, характерного для локальных гнойных процессов (Остапенко а А. н яр., 1980; Туликова а А. ,1983).

Вероятно, динамик изменений активности гистмдааы и уроканина-8Ы а печени связана с выходом этого фермента о кровь. Это подтверждалось увеличением активности Гк и Ук на протяяении всего периода наблюдения, что может быть следствием поражения клеток паренхимы печени (Ыардашев С. Р. .Буробин а А. ,1962), вызванного длительным введением липосом. Зарегистрированное уменьшение активности сывороточной ПХЗ и содержания общего белка, увеличение СШ при длительном подкожном введении липосом могли быть следствием снижения синтетической функции печени (VIШпзоп Н. ,1976) и деградации белков под действием лизосомальных ферментов.

При двукратном подковном введении липосом активность гистидазы а аИВШЩЦ гоыогенатах на 3-й сутки уменьшалась с 12.05+-1.02 ед. ДО Э^йа^йао вл(р<0.05) И на 9-е сутки до 9. 5+-0.08 ед. (Р<0.02). В дальнейшем активность, фермента восстанавливалась и к концу наблюдения достоверно не отличалась от активности у интактных животных (Рис.ЗС). При этом уменьшение активности Гп на 3-й и 9-е сутки сопровождалось увеличением его выхода в кровь до 1.58+-0.02 ед. (Р<0.001) и 1.67+-0.19 ед. СР<0.001), соответственно. Уменьшение активности Уп на 3-й и 9-е сутки с 4.03+-0.58 ед. до 1.60+-0. 50 ел. (Р<0.02) и 2. 43+ -0.70 ед. (Р<0. 02) тага? сопровождалось увеличением Ук в эти же периоды наблюдения. Активность Ук через 3 суток увели-

' чивалась до 0.67+-0.00 ед. (Р<0.001). а на 9-е сутки до 0.90+-0.02 е^ С Р< 0.001). При дальнейшем наблюдения до конца эксперимента отмечали тенденция данного показателя к увеличению й печеночных гошгеиатсис до 2.75+-0. ЪО ед. я ушньЕение его 5 сшорогко крови до 0.45^0.04 ед. (Рис. ЗБ.Д). При атоы, активность гистидозы м уроканиказы в средней на 75% и 602 была иеиьве аналогичных покйзатедзй у шшоташ после введения ом^соответствевно.'- Чареэ З суток наблюдалось падение уровня ПХЗ с 1102+-26.90 до 784+-&80 1а;оль/ШШ (Р<0.001), а к 6-« суткам активность фзркэнта составляла 754+-8, СЗ шоль Лсп! (Р <0.001). В э7я ЕЭ сроки отмэчалн уизньезщш в сыворотке креяш обоз-го бедка. Так, к 3-1Ш суткаи его концентрация снизилась до (И+-0.30 г/л (Р<0.031), а к 0-и суткам - до Б7.7+-2.Б0 г/а (Р<0.001). Накопление в крови СИП иыздо двузс<£ааиьй характер с мзкакнуьоы па 3- и и 9-е сутки (0.279+-0.02 у.е. Р<0.001 и 0.284+ -0.01 у.е. Р< 0.031). В яазьиейвеи содершлкв СШ1 в сцворотко крови постепенно уыояызалось и к 30-и суткам достоверна на отдалось ог аналогяшзого показателя у яятакпшх тзшотнше.

Учитывая, что пг-рнод полувиведешш яппосоа из депо составляет 3-0 суток, могшо прэдпододать, что повторное введений ллпосоы приводит к 1?уыухпшш на о клетках печэпя я обуславливает двухфазную рэакциз изизкеши $кзучазцьа биоиаиадских показателей ла 3-я к 0-е сутки.

При еопостазлзшш результатов исслгдовалш:, получаюшх при много- я двукратном введении "сродно окиедззпш" итогом, особое • бначение приобретав? нзмзиение баланса похиеновых кислот, Их пэре-кисей и антиоксида1ггой в ы«<йреша>; обешэчзк клзтек и иитохондрмй аа счйт поступления различного количества продуктов ПОЛ, входпких в их состав. Подтверждением этого явилось исследование активности гнетн-дазы в сыворотка крови иитоктных кроликов (п-б) после подкомюго введения "максимально окисленных" дклосом. На 3-й сутки поело вва-

- 1Б -

денйя таких липосом активность гистидаэы в 2.46 раза превышала активность аналогичного показателя у животных после введения "средне окисленного" препарата (Р<0.001). По-видимому, содержание продуктов ПОЛ и кратность введения липосом является существенным фактором, определяем проницаемость и стабильность клеточных мембран. Так, длительное поступление липосом способствует повышению проницаемости imt полной деструкции липидного остова печеночных щеток, в то время, Kait двукратное введение не вызывает подобного эффекта

Таким образом,проведенные исследования показали, что многократное подкояиое введение липосом сопровождается более выраженным повреждением печеночных клеток, чем их двукратное использование. Это молот ограничить их терапевтическое применение, особенно при патологических процессах, . сопровождаххцихся токсической нагруз!сой на печень. В связи с этим, представляет интерес изучение влияния липосом на функциональное состояние печени в условиях моделированного патологического процесса

Исследование функционального состояния печени у животных с эндогенной интоксикацией. вызванной гнойно- воспалительным процессом. В течение всего эксперимента у животных с гнойной раной активность Га и Уп была на 40-80% ыеныге значений, определяемых у интактных аивотных. R концу наблвдения активность этих ферментов в тканн печени животных с гнойной раной составляла 2.51+-0.34 и 2.73+-0.1бед.. Максимальная активность Гк и Ук была выявлена на 9 и 12 сутки { 8.56+-1.61 и 5.65+-1.72 ед. соответственно, Р< 0.01). Постепенно снижаясь, к 20 и 30 суткам активность этих фзрменто^ в крови достигала уровня интактных животных . Активность ПХЭ резко снижалась к 12 суткам до 199+-21.5 мтль/мин (F<0.001). Выход ..СМИ в кровь достигал максимума на 9 сутки, составляя 0.572+-0.02 у. е. (Р<0.001).

Таким образом, наличие локального гнойного очага оказывает ге-

патоповрзкдгадг^ действие, что подтверждается интенсивным выходом в кровь гнстндазы » урокаяинаэы на фоне ослабления шсгивности этих ферментов в печеночной ткани. Такие наруиешш ыогдн быть связаны со снижением шстивносги ферментных систем деааминирования и переамшш-рования С Лайтес С. Ы. .1078). Зто предподояание подтверждается умань-езниэы ПХЭ, oOtero белка и увеличением содержания СШ в крови у животных с гнойной раной.

Влияние многократного и двукратного введения липосом на функциональное состояние печени при эндогенной 5штокеикати, вызванной гнойно-воепаяитедьным процессом. В период развития гиойно-воспали-тедьного процесса (Серов B.R , Шзхтер А.Б.. 1981). в ткани печена происходило умеиьшиие активности гнстндазы после длительного под-гляюго введения липосоц с 12.50f-l.02 ед. да 5.60+-1.40 ед. (Р<0. 02) и после двукратного до 4.76+-1.70 ед (Р<0.01) (Рис. 30). В годе дальней!» го наблюдения активность Гп в sm группах сукестваи-во не наденядась и к концу набдяаешш оставалась иа доотоварво бо-дзе высокой уровне (163% и 110% соотватотве щю). чей у «зшотных с докальньш гнойным процессом, lia протяяэнин всего периода набдщенля активность уроканинааы в печени после длительного и двукратного введения дипосоц существенно не изменялась по сравнению с шггив-ностью зтого показателя у интактных «квотных (Рис. ЗД). В сравнении es с активностью фермента у животных с гнойней раной в период с 3-0 сутки активность Ул была меньше на 44- 432 и 63- 72Х соответственно, а к 30-и суткам зти различия нивелировались. Алсгивкость гисти-дазц и уроканиназы в крови после длительного и двукратного введения липосом постепенно увеличивалась на протяжении всего периода наблюдения (Рис. 3 А,В). При этом активность Гк и Ук при длительном введении липосом оставалась на 21-32Х и 69 -34% выше, чем у животных после двукратного введения препарата. В сравнении с активностью этих ферментов в крови т&тных с модельной.патологией, к концу

»1

<

л 4-

33

а.

.яа

в-1

А

4 г з к

■П*

а

ч ' Ч"-чЧ

Д1'

Т ^уг)

<

и 5

ха а оо

но. 1

в

са. »

Б

^ Г« • У

ч> чч Л /

V

ч ^

4 ч

[Й

сч

Г'у

* V

у

/ ✓

а

й

гй

к

N4-

Т(еут)

л

Е

-з-ч

ГЬ х

Л: X

ч

т.

о о о о

о

х> <•>

Т <.ЬуО.

»в

а

< .

I

гаг

».V

Ч>

«.V \ч

й

у

/ V У

Й

гЬ

м г

чч Т*

ч^ ' У

\4 •> /

ч^ V/

У У

чЛ * У

V4 'X

ч

ЙП щ к

£ У у ;чЧ"

Т л X > у XV

4-, у

.4 у

. ч N4-

Рис. 3. активность гистидмы (а,С) и уроканинагн (?.»} 5 крови и п--чгни кивотнух при длительном,- • двукрчт-")м ПОДЧОКНОМ 8?*Дг.ЧЛИ липосом иктйктккм лиготн^м ( ) и лйсотиг-м с гкойноп р*ной 3,4 .оВ-т&ДОЧКОй ОТМгу-НН^■ П0«уя5аТг-ЛИ При ?•> 0..05 ПО СРЙ5Н?ЯИ» С КО-И'^С'Лгм.

По осп орглнат; активность ферментов э Ч / ед. /

наблюдения активность Гк и Ук после длительного введения липосом оставалась выше в 8.8 и 7.8 , а после двукратного введения препарата в 6.1 и 5.1 раза. К этому же сроку активность сывороточной ПХЗ после обоих способов введения препарата на HOi и 110 X превышала соответственно значения у животных с гнойной раной. Различий в содержании общего белка в крови у животных вйех сравниваемых групп выявлено не было. После роста концентрации СЩ в период до 3 суток их содержание в кроаи после обоих способов введения липосом постепенно уменьшалось и к 30 суткам достоверно не отличалось от акаче-иия У '¿(равных животных.

Таким образом, многократное введение липосом на фоне модельной патологии ие исключало гепатотоксичаского воздействия. В свяаи с этим, длительное подкожное введение лецитин-холестериновых липосом при заболеваниях, солроаоядадаиссй иарусением функционального состояния печени, может усилить проявления печеночной недостаточности. В отличие от многократного введения, двукратное введение препарата сопровождалось значительно менее выраженным и тракаигорным выходом в кровь внутриклеточных ферментов с последующим восстановлением синтетической и детоксикационной функции печени.

Установленная зависимость накопления продуктов ПОЛ в липосом от времени их ультразвуковой и ультрафиолетовой обработки явилась основой для разработки метода получения липидных веэикул с ваданной степенью окисленности. Это поаволило изучить биологические свойства липосом в зависимости от степени Hit окмслеиности, кратности введения в организм в норме и в условиях эндогенной интоксикации.

Хотя механиамы и последствия взаимодействия липосом с клетками остаются предположительными, некоторые аффекты , зарегистрированные in vitro, могут бить полезными для обоснования использования липосом в биологии и медицине. Обнаруженные факты действия липосом разной степени окисленности она микробные клетки повволяюг думать,

ь

что в качестве антибактериального средства можно применять "максимально окисленные" липосомы. однако такие липосомы способны индуцировать процессы ПОЛ в печени. Чтобы набежать такой индукции наиболее рационально использовать in vivo "минимально окисленные" липосомы, но выраженность антибактериального эффекта при этом уменьшатся. В связи с этим, наибольший интерес' вызывает возможность использования "средне окисленных" липосом. Данные липосомы способны модифицировать клеточные мембраны про- и эукариот с последушим бактерицидным и мэмбранотропным действием, превышающим эти показатели для "минимально окисленных" липосом.

При применении липосом в условиях макроорганизма необходимо учитывать не только состав и особенности распределения препарата, но и проявление побочных эффектов. Многократнее подкожное введение липосом может встретить серьезные трудности при использовании в медицине, поскольку такое введение сопровождается повреждением печеночных клеток, снижением синтетической и детоксикационкой функции печени. Так как двукратное подкожное введение липосом не вызывает токсического поражения печени, по-видимому, краткость введения липосом и содержание в их составе продуктов ПОЛ являются важными факторами в сохранении определенной проницаемости и стабильности клеток печени. Подтьерядение этому было получено после введения липосом с высоким содержанием подуктов ПОЛ, которые вызвали значительный гепатотокСический эффект.

Многократное введение липосом на фоне модельной патологии усиливает гепатотоксическое повреждение. В. связи с этим, длительное подкожное введение лецитин-холестериновых липссом при заболеваниях, сопровождающихся каруиениеМ функционального состояния печени, может потенцировать проявления печеночной недостаточности. Поэтому при использовании больших доз. лецитин-холестериновых лклосич при заболеваниях, сопровоадавдихся нарушением функционального состояния пе-

чьни, необходимо назначение гелатопротекторных лекарственных

9 •

средств. В отличие от многократного использования, двукратное введение препарата сопровождается значительно менее выраженным и тран-ьиторцым выходом в кровь внутриклеточных ферментов с последующим восстановлением синтетической и детоксикационной функции печени.

ВЫВОДЫ

1. Биологические эффекты дилосом изменяются при окислении, входящих в них дипидов.

2. Присутствие продуктов перекисиого окисления дипидов з леци-тин-холестзриновых лииосомах обуславливает их бактерицидное действие, выраженность которого пропорциональна концентрации в суспензии липосом вторичных продуктов ПОЛ.

3. Увеличение степени окиеленности лецитин-холестериновых дилосом сопровождается усилением их гемолитической активности.

4. Подавдекиэ Оласгогенеза Т- и В- лимфоцитов при инкубации с лацитин-холестериновыми дипосомами повышается по мере увеличения степени окиеленности последних.

б. Лецитин-холестериновые дипосомы с содержанием МДА 82.62ч-6. 43 мкЫ индуцируют перекисное окисление дипидов ь гомогена-тах печени.

б. Ежедневное подкожное введение "средне окисЛенныу" лецитин-холестериновых лиг.осом в течение 30 суток сопровождается повреждением печеночных клеток, что может ограничить их использование в медицине, особенно, при патологических процессах е печени.

б. Двукратное подкожное введение таких дииосом с интервалом 7 суток не вызывает токсического поражения печени интактных животных и может быть ^йспольвовано на Фо>;е гепатетоксического повреждения!

- 21 -

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Длительное подкожное введение лецитин-холестериновых липосом при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функционального состояния печени, может усилить проявления печеночной недостаточности.

2. Биологическое действие липосом на клетки про- и эукяриот может быть обусловлено степенью их окисленности. что должно учитываться при использовании липосом для воздействия на различные патологические процесса.

3. Целесообразно проведение исследований по испытанию лецитин-холестериновых липосом различной степени окисленности в качестве противовоспалительных, антибактериальных и противоопухолевых препаратов.

Список работ, опубликованию; по теме диссертации

1. Шраер Т. И., Крейнео Е М., Устьянцева И. М., Голубчикова Н. А. Фунюшональное состояние печени при длительном подкожной введении липосом. - В кн.: Тев. докл. Всесоюзного симпозиума по биохимии ли-пидов. - Алма-Ата-1987.- С. 229-230.

2. Шраер Т. И.. Крейнес К Ы., Голубчикова Е А., БуйныЛ а В., Вамбург И. 11, Хромов А. С., Крикуновский К. а Применение вввееи липосом при экспериментальном локальном гнойном процессе. // Хирургия. - 1988.- N 4,- С. 30-34.

3. Крикуновский К К . Крейнес Е М., Хромов А. С., Вамбург И. Ы. , Кудрин 0. А. Нарушение функции сердечно-сосудистой системы при молниеносном сепсисе,// Пат. физиол. и экспер. те рал. - 3983. - N 1,- С. Ь2 -54.

4. Сергеев С. Г., Гиле в А. Ф., Устьянцева И. М. , Голубчикова Н. А. Влияние подкожного введения липосом на функциональное состояние органов и систем экспериментальных животных. // Вести. АМН СССР. 1990. - N 6. - С. 32-&5.

Б. Крейнее ЕМ.. Шапошников Ю. Г., УстьянцеЕа II. и.. Булгаков Е Г.. ЧернобаЯ Г. Н., Берченко Г, Н. Коррекции, процессов перекисного окисления липкдов с помощью липосом. // В кн.: Экспериментальная травматология и ортопедия.- Ы. , 1960. - 0.7-10.

6. Шраер Т. И., Кричевский А. к , Крейнее Е Ы , Голубчикова Н. А., Вамбург И. М., Крнкуновсиий К Е Способ моделирования детокси-кации организма.// АС М 1489022.- 1985.