Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Системные реакции организма на введение липосом (метаболические аспекты)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Системные реакции организма на введение липосом (метаболические аспекты)"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ

медицинскдо институт

На. правах рукописи

ЗАКРЕЕСКИИ Вадим Иванович

СИСТЕМНЫЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ВВЕДЕНИЕ ЛИПОСОМ (метаболические аспекты)

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой стетни доктора медицинских наук

,7

Ростов-на-Дону - 1992

\

Работа выполнена в Волгоградском ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте.

Научный консультанты: доктор ывдихрнских наук, профессор Ю.В. ГАЛАЕЗ, член-корреспондент РАЕН, доктор биологических наук, профессор Л.Б. МАРГОЛИС

Официальные оппоненты: лауреат Государственной прении СССР, доктор биологических наук профессор A.M. Поверенный,

Доктор медицинских наук, старший научный сотрудник О.А.Розенбе Доктор медицинских наук, профессор В.В. Давыдов.

Ведущая организация - Институт биологической и медицинской химии РАМН.

Защита состоится " 1992г. в ^ часов

на заседании специализированного совета Д 084.53.01 при Ростовском ордена Дружбы Народов медицинском институте (344700, г. Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер.,29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан 1992 г_

Ученыа секретарь специализированного

совета Н.Я.

Корганов

r W V* Г! #» '-» I . t < r

суда:-*'-' '' ; rh б г-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Перспективность использования ли-зсом в качестве транспортных средств определяется еозмож-зстьп включения в их внутренний объем водорастворимых,а в ли-вдную мембрану - водонерастворимых биологически активных ве-зств. и направленной доставка в клетки организма. При этом пинается токсическое действие с одновременным предохранением зкарственных веществ от быстрой инактивации во внутренней реде организма. В результате липосомы стали широко исгользо-зть в различных областях биологии и медицины - биофизикой для эдификации клеточных мембран; генной инженерши - для введена внутрь клеток генетического материала; иммунологией - для . спользования адыовантных свойств липосом в создании иммунно-огических и вакцинных препаратов; фармакологивя для обычного направленного транспорта лекарственных соединений в организ-е ГВ.Ф. Антонов и др.,1983, Г.С. Власов и др.,1982, Г.Грего-иадис,А.Аллисон,1983, в.н. тот. н. к. sijc.iqso, e.g. night,, 1061 , G. Gregoriadi2.1 B88J . ПОСЛеДНИВ ДВЭ НаПраВДВНИЯ аиболее перспективны.

Для достижения этих целая разрабатываются препараты ли-юсом, способные длительно существовать во внутренней сраде |рганизма в интакгаом состоянии, имещив. высокое сродство к ртанам и клеткам-мишеням, обладащив определенными иммуноген-ыми свойствами. Применение липосом в качестве носителей лз-:арственных веществ предполагает, что липвдная мембрана вези-:ул, приготовленная та природных липидов, является биодез-ради-зуемой и не вызывает побочных эффектов. Однако попадание во шутреннш среду организма липосомных фосфолипидов вызывает »акцию его систем, направленных на поддержание гомеостаза.

Успешное применение лкпосокныг препаратов в лечении, про-¡¡клакткка и диагностика заболеваний обязательно требует, выяснения деталей их поведения во внутренней среде организма. Реакция организма на введение липосом прежде всего направлена за поддержание постоянства внутренней среды организма. Характер С1'"тегЕыг рзапцкЕ опрздзлягтея

свойствами фосфэлшидной мембраны липосом, дозой к кратностью введения прзпгрзтев, а, коэкг того, ряд пргоэдпыг y. чзеккх фэсфзлкпкдэв обладают Еырэкзшюс бкологичеспоЕ атшпз-Ег-стыэ i Л.ЕЛ.'.арпш'.с;, Л.Д.БзргехьсоЕ,iss7 i. /J.i«-n. if*i:. g.

Сг едог 1 ае)1 2 еЪ а1. .1989] . ИзуЧвНИВ ГОМеОСТЭТИЧеСКИХ рваКЦИЙ, знанив закономерностей ответа организма являются необходимым условием конструирования и применения липосомных препаратов.

Многократные введения медицинских препаратов лило сом еще более осложняют ситуацию и вызывают усиленив реакций, направленных на поддержание гомеостаза. В таком случав исследования отдельных условий и реакций организма не способны дать полного ответа на вопрос взаимоотношения организма с липосомами. Необходимы иные концепция и методология решения этой проблемы. Ведущей методологией такого плана проблем является методология системного подхода.

Установление закономерностей ответа организма на уровне систем на оддократное и многократное введение липосомных препаратов является актуальной теоретической и практической проблемой. Исследование системных реакций организма необходимо как для понимания фундаментальных механизмов взаимодействия липид-ных комплексов с органами и клетками, так и для - конструирования высокоэффективных липосомных препаратов с заданными свойствами.

Цель и задачи исследования. Цзль работы - выявить и оцз-нить реакцию систем организма на различных уровнях: молекулярном - регуляция активности клеточных ферментов при однократном и многократном введении липосомных препаратов-, клеточном - изменение активности тромбоцитов в присутствии липосом различного липидного состава; установить закономерности ответа иммунной системы организма в целом на однократное и многократное введение липосом различного фосфолипидного состава липосом, несущих антигены и иммуномодуляторы.

Дм решения этих вопросов были поставлены следующие задачи-.

1.Исследовать интегральный иммунный ответ (защиту от инфекции) при иммунизации бактериальными антигенами, включенными в липосомы.

2. Выяснить роль физико-химических свойств мембраны липосом, а также способа иммобилизации антигена па интегральную иммунную реакцию организма.

З.Оцзшггь иммунные отват организма на введение липосомаль-ных препаратов веществ, обладающих антигенными и иммуностимулирующими свойствами.

Изучить судьбу азтагэнсодераадих .^шоссм з организгла при

дельных органов з поглсщетпм ~л угализации лишцяых везикул.

¿.лзуглть рзахщш ..;е..-;срг.:ссзнз£лпы1 ¡эрлентсз пвчеш!, а такие системы гормональной регуляции ферментов глюконеогенеза гачеки на введение липосом различного липидного состава.

6.Выявить реакцию систем регуляции активности ферментов печени на тсоютесксе ввегеяпе липсссм тззлгшогэ состава.

7.2ыяе:ггь реакцию системы свертывания крови на введение липосом различного липидного состава и установить закономерности взаимодействия везикул с тромбоцитами.

8. Определить влияние липидного состава липосом и наличия в них белкового антигена на реакцию :иццкоя часта и форменных элементов крови при однократном л повторном введении препаратов.

Научная новизна. Впервые сформулирован подход к проблеме взаимодействия организма с липосомами как совокупность системных реакция. В рамках этого подхода проведены экспериментальные исследования по оценке реакции иммунной системы, системы коагуляции и регуляции активности ферментов, в результате которых получены новые экспериментальные данные об общих закономерностях ответа организма на введение липосом.

Получены оригинальные данные о закономерностях реакции организма на введение холестерина в состава липосомной мембраны. Роль холестерина в составе липосом двояка, с одной стороны он стабилизирует мембрану везикул и способствует их взаимодействию с клетками, с другой стороны наличие холестерина нивелирует эффект индивидуальных биологически активных фосфоли-пвдов липосомной мембраны.

Впервые обнаружено влияние липосом различного липидного состава на активность мембраносвязанных ферментов, а также на гормональную индукцию ферментов печени. Показано стимулирующее действие липосом, содержащих фосфатидилсерин, на активность тирозинаминотрансферазы. Введенив стероидных гормонов на фоне липосом приводит к изменению з уровне индукции ферментов глю-конеогенеза - тирозинаминотрансферазы, серин- и треониндегид-ратаз.

Разработан оригинальный подход к оценке гомеостатическоя функции организма путем сравнительного исследования гормональ-

ноя индукции ферментов на фоне однократного и фонического введения дипосом. Обнаруженные различия позволяют сделать новый вьшод об адаптацда организма к многократному введению дя-посом, уровень которой зависит от фосфолипидаого состава везикул.

Установлены ранее неизвестные закономерности распределения антигенеодержащих липосом в иммунном организме. Повторное введение таких препаратов характеризуется иным уровнем поглощения липосом основными паренхиматозными органами. Снижается доля Еезикул, захваченных печенью, и возрастает накопление в селезенке и особенно в легких. На характер распределения влияет природа антигена.

Сформулированный нами системный подход позволил оценить вклад фосфолипидноа мембраны липосом, способа фиксации и вида антигенов в интегральную иммунную реакцию организма. Полученные оригинальные результата свидетельствуют о высоком протек-пшном эффекте липосомного препарата, содержащего бактериальные антигены и иммуностимуляторы, при заражении животных чумой.

Впервые выявлены основные закономерности влияния липосом на функциональную активность тромбоцитов. Установлено, что реакция тромбоцитов на присутствие липосом определяется главным образом их фосфалипидным составом. Выраженным действием на гемостаз обладают фосфатидилсерин и фосфатицкдинозит - основные биологически активные липиды мембраны тромбоцитов.

Подученные новые экспериментальные данные позволили сформулировать новую гипотезу об активации системной гомеостати-ческой реакции организма в результате многократного введения липосом, значительно модулирующая ожидаемый эффект препарата.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Многократное введение липосом приводит к иммунной перестройке организма, появлению антител к антигенным молекулам в составе везикул. Это вызывает более интенсивное разрушение липосом в крови и повышенный захват иммунокомпетентными клетками. Роль антифосфолипидных антител в повреждении везикул незначительна, основной ответ иммунной системы направлен на антигены нефосфолипидной природа, включенные в состав липосом.

2.Судьба антигенсодержащих липосом при повторном введении в иммуниэ1фованныа организм имеет значительные отличия, связанные

с реакцией органов и систем.Наряду с печенью больдие количества пез:кул ч этом случае поглодалтся селезенкой и лепсми. Накоп-лошв лппоссмного материала лексии при повторном введении специфично и макет быть использовано для целенаправленной доставки лечебных средств.

3.Одновременное включение в липосомы нескольких протектив-ных антигенов и иммуностимулятора значительно усиливают реакцию иммунной системы и способствует эффективной защите от развития инфекции.

4.Присутствующие в крови липосомы способны вступать во взаимодействие с тромбоцитами и изменять их способность к агрегации под деиствивм индукторов. Выраженность и направленность таких эффектов зависит от фосфолипидного состава и определяется концентрацией липосом.

5.Высокий уровень захвата липосом шченыо приводит к попаданию в клетки большого количества фосфолипвдов, изменяющих свойства клеточной мембраны и расположенных в них ферментов. Модификация фосфолипидного состава мембран вызывает изменения в гормональной регуляции ферментов печени особенно заметные при однократном введении. При хроническом поступлении липосом их влияние снижается за счет адаптации организма.

Теоретическое и практическое значение работы. Диссертация представляет собой экспериментальное исследованта системных реакций- организма на однократное и многократное введение липосом различного состава. Полученные результаты дает: возможность понять закономерности изменений, происходящих в организме при попадании липосом, роль отдельных компонентов везикул, дозы и кратности введения.

Разработаны теоретические основы для исследований системных реакций организма при многократном введении липосомных ' препаратов.

Обосновано предположение о влиянии фосфолипидов липосом на метаболический гомеостаз печени, в результате которого значительно изменяется активность ряда ферментов и их гормональная регуляция. Это позволяет огггамизировать конструирование и применение липосом в качестве транспортных средств, а также в виде самостоятельных биологически активных препаратов, способствующих стабилизации и улучшению обменных процессов в печени.

¿^¿•jjzzziu .i:-rrQrpa.iiiicj адаунаол раакцаи ор-

ганизма на введение лигосомиых препаратов ба:пэргладьныз: ттро-■гэ:гпЕ.Л1п; ант:1Гзаоз указывают на возможность создания эффективного препарата для профилактики инфекционных заболевания.

Теоретические результаты работы, а также методические подхода нашли применение в научных исследованиях и разработках новых иммунодиагностических препаратов для обнаружения бактериальных токсинов и антигенов.

По матзриалам исследования получены авторские свидетельства N 100S7Ô1. 23 ноября 1982т "Способ включения веществ в ли-посомы" и NI0355I8, 15.04.83т "Способ разделения биополимеров". Разработаны и изданы в соавторстве с В.И. Ефременко, И.И. Денисовым, В.Я. Куркшвым, Н.Г. Плехановой и К.А. Ротовым Методические рекомендации "При готовленив липосом, содержащих биологически активные вещества", утвержденные МЗ СССР.

Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались на i* Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Киев, 1983); Третьем Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран" (Бущино, 1984); i-й Bcecnnrmntt .-конференции "Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический конт-

rwntt. ................."¿...il". ■, í i. . .. ......

съезде (Киев, 1988); Всесоюзной научно-пракггичвскоа конференции "Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций" (Ставрополь, 1986 ) Всесднзном-димпозиуш- по - биохимии липидов (Алма-Ата, 1987); Всесоюзной конференции "Биохимия - медицине" (Ленинград, 1988); Международном симпозиума "Механизмы регуляции клеточной активности" (Ташкент, 1989); Всесоюзной конференции "Современные направления в создании медицинских даагностикумов" (Москва, 1990); на заседаниях Волгоградского отделения Всесоюзного биохимического общества (1981 -1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 научных работ, из них 10 в центральных журналах-. II во всесоюзных научных материалах; 4 в сборниках научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 303 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов ; содержит 39 рисунков и 12 таблиц. Библиография представлена 74 отечественными и 311 зарубежными работами.

!ШЕКШЫ 'Л МЕТОД! ИССЛЕДОВАНИЯ

В свсеа работа использовали .мадвнькиа-suv и большие -luv униламеллярные липосомы. РастЕор липидов органическом растворителе упаривали при пониженном давлении в роторном испарителе. Набуханив липидной пленки в буфере происходило в таченив 3-5 ч. Образовавшуюся суспензию мультиламеллярных липосом озвучивали при 22 кГц на ультразвуковом диспергаторе до полного просветлении взЕвси. Волынив униламеллярные липосом готовили методом выпаривания обращенных фаз из эмульсии "вода в масле"

[ F. Szcpka, D. Fapahadjopoupos, 1S7S).

В некоторых экспериментах бьт использован метод приготовления липосом с включением в мембрану гидрофобизоЕанного белка путем диализа смеси фосфолипиды, белок, дезоксихолат натрия Í Л. G. Gittis et al. ,1062} .

Для встраивания в мембрану липосом белка предварительно его подвергали гидрофобной модификации пальмитоилхлоридом по методу В.П.Торчилина и соавт.,1980. В экспериментах использовали препараты липосом, содержащие водорастворимые (ЭН-ЛМФ, 1251-поливинипироллвдон) или мембранный - ' *С-холестерилолеат радиоактивные маркеры.

Эксперименты по изучению влияния сыворотки крови на стабильность липосом проводили путем смешивания суспензии липосом с сывороткой в конечном объеме 0,3 мл и инкубировали при 37°С. По окончанию инкубации липосомы отделяли от несвязавшихся компонентов крови гель-хроматографивй на миниколонке (0,5x10,0 см) с сефарозоа cl-4b. Образцы, содержащие одновременно3Н и'^С изотопы радиометрировали методом разделения каналов на счетчике

"Rack Beta 1S17".

Спектр белков, адсорбировавшихся на мембране липосом, исследовали методом электрофореза в полиакриламидном геле.

Для исследования распределения липосом в организме готовили препараты везикул, содержащих пальмитоилированный белок -Ф1 и радиоактивный мембранный маркер. Белым мышам вводили липосомы, спустя 1,2,4,8 и 24 часа после инъекции отбирали пробы. Исследуемые органы и ткани растворяли по методу Neame D. .1S77 и подвергали жидкостному сцинтилляционному счету. Оценивали общее количество радиоактивной метки в каждом органе, а также концентрацию маркера в расчете на IDO мг ткани. Кроме того расчитывали градивнт концентрации 14 С-холестерило-

.леатз з органе по отшжэшго к ;срови.

Сцедг-у протеигп1Еност:1 .тжсссглны! препаратов проводили на морских свинках, которых однократно иммунизировали препаратом липосом. Через 21 день животных заражали высоковирулентной культурой y. pestis £31 в возрастающих дозах. Эффективность защита оценивали по методу Кербера, расчитывая величины edbq и idbo • а ТакЖ8 продолжительность'жизни погибших животных зараженных животных i И.П.Ашмарин, А.А.Воробьев,1962:.

Влияние липосом на агрегацию тромбоцитов изучали in vitro. Обогащенную тромбоцитами плазму крови крыс, а также суспензию ОТМЫТЫХ тромбоцитов получали методом J. F. Mustard, d. w. perry. 1б7г. Агрегацию тромбоцитов измеряли на 2- канальном агрегометре "labor араст" (Германия) при температуре 37 С. Агрегацию индуцировали добавлением АДО, коллагеном тип i или тромбином фирмы "Chrono-Log Corp." (США). РаСЧвТ ЕвЛИЧИН ОСУЩЕСТВЛЯЛСЯ автоматически по программе прибора.

Для оценки эффекта липосом на активность ферментов и их индукцию гидрокортизоном свежеприготовленные препараты липосом вводили внутрибрюпшшо белым мышам в объеме 0,2 мл. Через 0,5, I, 2, 4, 6 и 8 ч животных забивали, извлекали органы, промывали физиологическим раствором и гомогенизировали. Для оценки базального уровня активости фермента группе животных вводили 0,2 мл буфера.

В—экспериментах с многократным введением липосом доза препарата на одау инъекцию была 2 раза меньшей. Животным внут-рийрюшинно вводили по ОД мл взвеси липосом через день в течение 4 недель. Опытной группе в день исследования производили тринадцатую инъекцию липосом после чего исследовали активность фермента. Контрольной группе животных вместо липосом вводили физиологический раствор.

Оценку влияния липосом на индукцию ферментов печени стероидными гормонами осуществляли следующим образом: животным внутри5рюшинно вводили липосомы, через I ч после этого производили инъекцию гидрокорпизона из расчета ТООмг/кг веса животного/ активность ферментов оценивали через 0,5, I, 2, 4, 6 и 8 ч после введения гидрокортизона. Индукцию ферментов одним гидрокортизоном осуществляли аналогично, но на фона введения физиологического раствора, а не липосом. Назальный уровень активности ферментов определяли у интакгных животных.

Аналогично определяли влияние многократного введения

.дяпх:::.! за жрукпш ':зс.ме;?гоз :азртясссггсоэдса.

^онгзтггпг^го с*эл::п з ~::ст~ .хгэ .методе:« Лоуря

'I ^р. ,1'<;г2 л спектрсфотс.-.втрически (З.Л.Храмов, О.И.Дустовой-това, 1967.

Количественную оценку активности щелочной фосфатазы проводили с использованием набора реактивов для ее определения в крови (Lachema. ЧеХОСЛОВаКИЯ).

активность СД и ТД определяли т.е. Friedemann and g. е. haugon, 1963. Лкпшность тарозшашшотрансферазы оценивали гяетодом Ф.Б. 7.е вша, 1983.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Основными системами, подверженными воздействию липосом, являются: иммунная система, кровь и, в частности, ее свертывающая система, а также система регуляции активности ферментов, главным образом печени, куда попадает основная масса липосом.

Исходя из этого мы провели исследования реакции элементов иммунной системы на повторное введение липосом, содержащих антигенный материал, особенности их распределения в организме, воздействия липосом на систему гемостаза, а также модулирующего действия липидных везикул на активность ферментов и ее регуляцию гормонами.

СудыЗу вводимых парентерально липосом в значительной степени определяют компоненты крови, поскольку основная масса везикул переносится кровеносной системой. В свою очередь кровь содержит мощную систему транспорта липидов, которая способна взаимодействовать с липидаыми везикулами и нарушать их целостность. Присутствующие в крови компоненты иммунной системы: макрофаги, лимфоциты, иммуноглобулины, комплемент, при повторной встрече с антигенсодержащими липосомами стремятся нейтрализовать чужеродный материал.

Особенности взаимодействия антигенсодержащих липосом с кровью при их повторном введении.

Проведенные наш in vitro исследования взаимодействия липосом, нагруженных капсульным антигеном чумного микроба, с нормальной и иммунной сыворотками выявили различия в их повреждающем действии. Величина и характер нарушения целостности везикул при их повторном введении в значительной степени определялись появлением в сыворотке специфических иммуноглобули-

зсз. осеин» условиях лиаубацая лппгецсодерхадях

.г.л'.ссс м !:лу"шсл -^¡зоро-лсоа ярлво^пз з дзугжотзсау уззлпче-тпп "ГГ.^22ТП "ЗОЛИ „Т.1ПЖПОГО тлзркзрз лппоссм. "ос_;эднзэ

особенно заметно при сравнении с ¡мЩвятоа зораадьаол саворо-па (Таблица I).

Значительное различие было выявлено в судьбе внутреннего водного содержимого липосом. Удаление липидов из липосомальноа мембраны не приводило к полному разрушению большей части Еези-кул, но вызывало нарушение проницаемости и вытеканив внутреннего содеркимого. Это проявлялось в диспропорции удаления ли-пидпого и водного лиюсомных маркеров везикул в процессе инкубации препаратов как с нормальной, так и с иммунной сыворотками. Полученные нами данные свидетельствуют о специфическом нарушении проницаемости липидной мембраны автигенсодаркащих липосом компонентами иммунной сыворотки.

Таблица I. Влияние нормальной и иммунной сывороток на целостность антигенсодзржащих липосом

Состав инкуба- Содержание радиоактивной метки {% исходной )

ционной смеси Пик липосом Пик сыв. белков

3 Н-АМФ С—липид 3 Н-АМФ С—липид

Контр.ЛИПОСОМЫ+ норм. сыв-ка Опыта. липосомьн-норм. сыв-ка Контр.ЛИПОСОМЫ+ иммун.сыв-ка Опыта.липосомьи-иммун.сыв-ка

55.3 6,7 75,9 47,1 5,6 68,5

50.4 7,2 72,7

22.5 1,7 47,0

4,4 44,8

4,1 49,6

5,8 49,3

5,6 75,4

6.2 25,8 2,8

2.3 32,2 3,0 6,2 27,6 3,1

3.4 53,1 5,6

Примечание: Время инкубаиии 30 мин. л = 6. 3К-ЛМФ-внутренний водорастворимый маркер. О—липид — холестирилолеат. 100 мкл суспензии липосом инкубировали в течение 30 мин с 200 мкл сыворотки. Смесь ролЗеляли гель — хрома/погрофцей на колонке с ее— фарозой CL—4В, собирали фракиии, содерхатие липосомы (пик липосом) и белки (пик сывороточных белков). В каждом пике измеряли активность С и К—маркеров. Полученные величины относили к исходному соВерханию в липосомах и вырахали в проиентах.

Эффективность иммунизации в значительной степени зависит от взаимодействия антигенсодержаших липосом с иммунокомпетет-

Иг.:.ш устслса.:зпо, что деукратная в тзчешэ двух гз:л.:ь '.¡:,глуг.:злп:тя .л;ге?сп!гг.с jbkcoxübi 1:гг5г.~зтс:л пппсульзогэ airnirsna сп,"'.у--,.сот!а.'!3 спзиг^:г:2с:;у:э акптзнссть jz'.r.cionirron, узюлггп^ала :ес способность взаг-годепстзовать с Еззхпсудами. Инкубация лимфоцитов иммунных животных с антигенсодержапдми ли-посомами приводила к возрастанию в 2,5 раза количества адсорбированных клетками Еезикул. Избирательный захват антигенсодержащих везикул при низкой температуре свидетельствовал об опосредованном специфическими рецзпгорами связывании антигена, фиксированного в липоссмах.

Наличие специфических антител в крови способствует опсо-низации антигенсодержащих липосом при повторном введении, что облегчает и ускоряет их захват макрофагами. В присутствии IDS& иммунноа сыЕоротки связывание антигенсодержащих липосом макрофагами иммунных животных увеличивался в 1,9 раза. Следует отметать, что эффективность связывания зависела и от физико-химических свойств липосом. Использование везикул с более жесткой мембраной более чем в 3 раза повышало взаимодействие липосом с клетками.

Таким образом, используя гуморальные и клеточные факторы крови, организм старается сохранить постоянство внутренней среды. Попавшие в кровоток липидныэ Евзикулы подвергакггся разрушению и удалению. Однако нарушения целостности везикул, вызванные взаимодействием с белками и клетками крови, значительно снижают эффективность иммунногенных препаратов на основа липосом. Особенно отрицательно это сказывается при использовании композиция, содержащих водорастворимые иммуномодуляторы. Поэтому при разработка иммуногенных препаратов на основа липосом необходимо обязательно исследовать реакцию крови на их повторное введение и использовать полученные результаты для подбора оптимального липидного состава. Исследования реакции крови на повторное вЕеденив важно и в случае разработки лечебных препаратов липосом, содержащих адресные молекулы белковой природы, которые могут стать причиной иммунной атаки организма и преждевременного разрушения везикул.

Особенности распределения липосом при повторном введении.

Концентрация липосом в крови зависит от скорости их поступления и удаления (клиренса) из кровотока. При внутривенной инъекции вся доза препарата одномоментно попадает в цирку-

лятсрнсз русло п быстро удаляется. При других способах парентерального згадегсш создается депо откуда с рззлгинсд сксростъа лжоссмы поступают в кровоток. Создашз депо л длительнее прп-сутствке лилосом в оргашзме создает определенные преимуирства в применении иммунных и вакцинных липосомных препаратов.

Эффект лечебных и профилактических препаратов зависит от целенаправленной доставки антигена и иммуномодуляторов к органам и клеткам-мишеням. Повторная встреча клеток моноцигарно-фагоцитарноя системы с антигенсодержащими липосомами может изменить клиренс и характер их распределения по органам и системам. Это, в сеою очередь, повлияет на эффективность медицинского применения липосомных препаратов. В связи с этим исследования особенностей клиренса и распределения антигенсо-держащих липосом в неиммунном и иммунном организмах (при повторных введениях) имеет важное теоретическое и практическое значение.

Мы изучили поглощение липосом, содержащих белковый антиген, основными паренхиматозными органами - печенью, легкими, селезенкой и почками у интактных и иммунных животных. С целью установления роли органов и систем в реакции организма на введение липосом различными путями было проведано сравнительное изучение характера распределения больших униламеллярных липосом при внутрибрюшинном, внутримышечном и подкожном введении. Использовали Еезикулы с положительным (содержащие стеари-ламин) и отрицательным зарядом мембраны______________

Влияние заряда липидной мембраны на судьбу липосом было выявлено при внутрибрюшинном способе введения. Положительно заряженные везикулы обладали больней тропностыо к печени, в то время как легкие, селезенка и почки преимущественно захватывали дицзтилфасфатные липосомы. Избирательность поглощения отдельными органами связана, очевидно, с особенностями адсорбции белков плазмы крови липосомами, содержащими стеариламин или дицетилфосфат.

В случае внутримышечного и подкожного способов введения заметных различий в распределении положительно и отрицательно заряженных липосом не отмечалось.

Пошдешв аятигенсодержапцы липосом в иммунном организме практически не изучены. Мы провели исследования особенностей распределения больших униламеллярных липосом, содержащих капсульныа антиген чумного микроба, при внутрибрюшинном введе-

хм бзлься :ашпа, ^эдззрлгзльао хлмушвиссзазпыа зт:-л ::з препаратом. Были быяе."5еы знаиггельпке различия з р г с пр-э ге ла ш:: I -л з динамике накопления парензиматсзными органами, содержащих (опытных) и не содержащих (контрольных) антиген „плюсом (Рис.1). Если по абсолютному содержанию липосомного маркера на первом гесте в обоих случаях стояла печень (наиболее массивный орган), то наибольшей концентрирующей способностью в отношении антагенсодержащих препаратов обладала селезенка.

Повторное введение липосом с капсульным антигеном приводило к резкому увеличения поглощения везикул легкими. Концентрация меченного холвстерилолеата в легких возрастала в В раз по сравнению с его уровнем при введении контрольных липосом. В 2 раза увеличивалось количество липосом в почках. Общее содержание метки в легких, печени, селезенке и почках при введении опытных липосом составляло около 70% от введенной дозы. Для

Рис.1. Динамика накопления радиоактивного маркера "пустых" ( контроль) и знтигенсодоржащих (опыт) липосом в органах иммунных животных. Представлена в Ж от вводимой дозы. Контроль: а - 4 часа инкубации, в - в часов. Опыт: с - л часа, о-в часоЕ инкубации. 1-лагкив, 2-печень, 3-селезенка, 4.-почки, 5-осталь-ная часть введенной дозы.

„ишоссм эта величала из пргвыяада 47™. "арзжгссзэа сссг;оегют~:о рлегрэделвюя аягпгепсэдзркааси: . г: -клухцсгл ^ргс:-^:^. оиш ^^^лг^а времени накопления пропзрата з исследованных органах. Обьгшо при внутрибршинном введвкж уровень радиоактивной метки нарастал в течение первых 2. часов, посла_чего„происходило-быстрее•сни».еншИнтенсивное поглощение липосомы с капсульным анпппеном происходило в течение 4-8 часов.

Избирательность поглощение и длительное присутствие маркера з парагссматозных органах свидетельствует о специфичности взаимодействия иммуногенного препарата и сохранении структуры липоссмальной мембраны в течение длительного времени. Полученные нами данные наглядно свидетельствуют о высокой информативности и целесообразности изучения распределения липосом, несущих ;ммуногенные молекулы, при их повторном введении.

Интегральная иммунная реакция организма на введение липосом. содержащих бактериальные антигены. Основным преимуществом использования лигюсомных препаратов в качестве вакцин является возможность одновременной целенаправленной доставки в иммунокомпетентную клетку протективных антигенов и иммуностимуляторов. Эффективность вакцинных препаратов оценивается по уровню протективности - интегрального по. казателя реакции иммунной. системы на .внедрение болезнетворного агента с А. Ройт, 19913. Роль липосом в усилении протективности вакцинных препаратов складывается из двух основных моментов. . Липидные Евзикулы представляют собой средство целенаправленной доставки иммунного материала, одновременно защищая его от - преждевременного разрушения внутренней средой организма. С другой стороны сами липосомы обладают адъювантным действивм, важную роль в котором играют фосфолипида мембраны. Таким образом включение антигенов в липосомы позволяет одновременно решить целый ряд задач повышения эффективности вакцинных .препаратов.

Исходя из вышеизложенного мы провели серию исследований по выяснению роли основных факторов, влияющих на протективные свойства липосом, содержащих бактериальные антигены. Были изучены влияние жесткости липидной мембраны, роль отдельных фосфолшидов .в иммунном .ответе, .зависимость-■ протективных свойств от расположения и способа фиксации белкового антигена

з везикулах, а татка эффект совместного включения в липосомы иммуномодуляторов и антигенов бактериальной природа.

Присутствие холестерина в значительной мере определяет жесткость мембраны, тго является важным фактором, определяющим взаимодействие с клетками t Л.Б.Марголис, Л.Д.Бергельсон,12873. Проведенные нами эксперименты показали, что двукратное увеличение содержания холестерина в липосомах (с 20% до 403) практически не влияло на протективные свойства антигенсодержащего препарата.

Уровень протективного эффекта во многом зависит от взаимодействия липосомных вакцинных препаратов с клеточными и гуморальными факторами иммунитета. Большую роль в этом взаимодействии играет заряд фосфолипидноа мембраны. Наши эксперименты с липосомами, содеркащими капсульный антиген и заряженные липвды - дицзтилфосфат (отрицательный заряд) или стеариламин (положигельныа заряд), показали более низкую степень защиты от инфекции в случае включения в вакцинный препарат стеариламина. Такое положение можно объяснить особенностями использованных антигенов, способами получения иммуногенных липосом, техникой иммунизации, видом животных и т.п.

Наряду с адыовантными свойствами фосфолипидноа мембраны главным преимуществом липосомальных вакцинных препаратов является целенаправленная одномоментная доставка комплекса антигенов и иммуномодуляторов к иммуноксршетентной клетке и взаимодействие с ней. В этом процессе Еесьма важным является оптимальная локализация антигена на липосоме, способствующая его контакту с иммуноглобулинами и макрофагами. Однако, несмотря на многочисленные исследования, до настоящего времени нет однозначного отЕвта на вопрос о влиянии способа иммобилизации антигена в липосомах на иммуногенность препарата. Исследования по влиянию локализации иммуногенов в липосомах на интегральный иммунный ответ не проводились. Между тем оценка реакции всей системы иммунной защиты представляет большой теоретический и практический интерес.

Нами-проведены исследования защитного эффекта четырех типов антигенсодержащих липосом. Капсульный антиген был:

1) адсорЗирован на поверхности везикул,

2) фиксирован ховадентноа связью на поверхности липосом,

3) встроен з мембрану за счет г:1дрсфсбноа модификации пальмитиновой кислотой.

4) ',цг.:апс:у..:'дрован з сес6однс:л состоянии зо внутреннем сбье:ш.

Г.алусзппые результата выяв;1ли примерно одинаковый защитный сффз:гг зсзх препаратов липсссм независимо от ло:сал:пзац:1и антигена. У'г;ггиззя равнозначность конечного результата, ЕЫбор споссо'а иммобилизации может определяться исследователем в зависимости от природа антигена, необходимым соотношением имму-погэнных и фосфолипидных молекул в препарате и т.п.

Это особенно важно при включении в препарат нескольких антигенов и иммуномодуляторов. Активация клеток мононуклаар-но-фагоютараой системы в этом случае значительно ус:1ливается. Мы сравнили реакцию иммунной системы на различные антигены чу?лного микроба, введенные раздельно, в различных комоинациях и з составе липосом. Были использованы антигены различной химической природы, обладающие протекгивными свойствами = белковый - капсульный антиген, полисахаридный - основной соматический антиген (ОСА), гликолипидньш - липополисахарид (ЖС). Последний, наряду с антигенными, обладал и иммуностиму лиру щи-ми свойствами за счет липида А.

Иммунизация свободными антигенами раздельно или вместе не давала зысокого протективного эффекта. Включение отдельных антигенов в липосомы вызывало усиление иммунного отшта. Он заметно возрастал при иммобилизации двух видов антигенных молекул в одни и те же липосомы. Очень наглядно это проявлялось в случае иммунизации капсульным антигеном совместно с липопо-лисахаридом. В свободной форме они вызывали защиту такого же уровня, тго и один белок. При иммунизации липосомальной формой эффект возрастал более чем в 10 раз.

Наибольший уровень защипы был получен при иммунизации ли-посомным препаратом, содержащим все три протективных антигена. Величина ldso для этого препарата была в 15 раз выше, чем для комплекса свободных антигенов, и в 35 раз по сравнению с иммунизацией одним капсульным антигеном - наиболее активным иммуногеном.

Результаты наших исследований интегральной реакции иммунной системы на вшденив антигенсодержащих липосом свидетельст-зуш- о том, что организм отвечает на Еесь препарат в целом. Имеет место тесная взаимосвязь между физико-химическими свойствами мембраны Еезикул, природой и лммуногенностыо антигена, наличием группы антигенов или иммуномодуляторов. Орга-еизм воснржшмает и отвечает на липосомы с антигенами как на

la

здинса целее, где споЗстза антигена модифицированы фосфолипи-ца!Ш везикул и наоборот реакция на липосому во многом определяется присутствием конкретного антигена.

Таблица 2.

Влияние включения антигенов и иммуностимуляторов в липосомы на интегральную реакцию иммунной системы

Препарат lg LD 3 30 G+/G— ld5o (клетки)

Свободный антиген «к 2,60 - 397

'И в липосомах 3,34 0,4/0,6 2183

'51 + ОСА 3,17 0,4/0,7 1476

'К.ОСА в липосомах 3,44 0,4/0,6 2748

■И + ЛПС 2,51 - 323

'И.ЛПС в липосомах 3,74 0,5/0,5 5482

<1ч + ОСА + ЛПС 2,39 0,3/0,8 975

<К. ОСА, ЛПС в липосомах 4,16 0,7/0,4 14365

Контроль(неимм.живота.) 1,05 0,8/0,4 10

Число животных на каждую дозу заражения - 10.

Липосомы готовили из (¡Л-сфингоми&лин—хол&ст&рйн—Эии&тил-фосф12Л1=3:3: 3: I. Лоза антигенов и липиВав на оЭно хивотное? составляла: 10 мкг Ф1. 100 мкг ОСА, 100 мкг ЛПС и 12 пкмол&й липиЭов. Ч&р&з 21 сут после- поВкохнай иммунизаиии беглых мыпи-й их зарахали вазйуЭит&ле-м чумы в Эозах 500, 5000 и 50 000 клеток . Результаты обрабатывались по метоЭу Хербера [ Jf. П .Атмарин, И.Л.Воробьев,19823.

Влияние липосом на функциональную активность тромбоцитов.

Появление липосом в организме наряду с ожидаемым эффектом может еызывзть и другив не всегда желательные реакции. Так, липосомы, попавшие в кровоток, вступают во взаимодействие с форменными элементами крови, в том числе и тромбоцитами. В результате этого происходит модификация состава тромбоцигарной мембраны липидами ЛИПОСОМ IL. в. Margolls et al. .íeeoD. Состав и физико-химические свойства мембраны, особенно внешней поверхности бислоя, определяют функциональнее состояние тромбоцита, его способность К адсорбции И агрегации Г Bioeh«-)ídstl-y C.f piate-iets.issej. Кроме того, фосфолштады мембраны тромбоцита

:irps3T зонную роль в активации плазменных факторов коагуляте!, ¿ипслпяя роль тромбопластпна (фактора '-') во внутреннем дута еззртывапия ¡М.Ферстрате, ¿а.Оермилвн.ШШэ • Поэтому появление „тлпосом в крови, их взаимодействие с тромбоцитами могут изменять состояние системы гемостаза и нарушить нормальное протекание процесса свертывания крови. Интенсивность этих изменения во многом зазисиг от эффективности и способа взаимодействия липосом с тромбоцитами, степени модификации липидного состава, а также вида модифицирующего фосфолипида.

3 езязи с этим необходимо изучить реакции системы гемостаза, в частности тромбоцитов, на введение липосом, установить закономерности возникающих изменений з зависимости от физико-химических свойств и состава липосом.

Мы исследовали влияние липосом различного состава на агрегацию тромбоцитов, вызванную основными индукторами (ДДФ, коллагеном и тромбином). Принцип подбора состава липосом был следующим; липосомы общеупотребительной композиции (ЯД - ХОЛ -ДЦФ), липосомы, содержащие функционально активные фосфолипида - фосфатидилсерин и фосфатидилинозит, а также препараты с "жесткой" мембраной, аналогичные предыдущим, но с заменой яичного лецитина на дипальмиггоилфосфатиднлхо шш.

Все исследованные препараты липосом в опытах in vitro не вызывали значительных изменений функционального состояния тромбоцитов. Сами липосомы не способны индуцировать агрегацию тромбоцитов и нарушать гомеостаз системы свертывания крови. Положение меняется, если после предварительной инкубации везикул с плазмой обогащенной тромбоцитами вносить индукторы агрегации.

Липосомы ингибировали АДО-стимулированную агрегацию тромбоцитов в плазме крови в зависимости от физико-химических свойств и липидного состава препарата. "Жидкив" липосомы, содержащие в яичный фосфатидилхолин, оказывали различное действие в зависимости от вида заряженного липвда. Включение в липидную мембрану дицвтилфосфата или фосфатидалинозига практически не влияло на агрегацию тромбоцитов. В то же время присутствие фосфатидилсерина вызывало выраженный ингибирующий эффект. Его действие зависело от дозы и времени инкубации препарата в плазме обогащенной тромбоцитами.

Замена яичного лецитина на "твердый" дипальмигоилфосфати-далхолин резко изменяла характер действия липосом на arpera-

цлю. 3 этом случае все :шучешгь:а препараты оказывали ингяЗлру-:с2пй эффект, зависяпш от концентрации липидов в плазме. Различив з действии липосом с ДЦФ, ФИ или '1С нивелировалось.

Те же тенденции были от:,мечены при коллаген-индуцируемой агрегации. Коллаген более мощный индуктор агрегации тромбоцитов, имеющий несколько иной механизм действия. Различия в действии липосом в этом случае оказались значительно более выраженными. "Лидкнв" Еезикулы, содержащие фосфа-пзднлсерин, полностью ннг.пировали агрегацию тромбоцитов уже в дозе 1,4 мг/мл в то время, как ДЦФ и ФИ практически не оказывали действия.

"ТЕврдые" липосомы независимо от вида заряженного фосфо-липида достоверно снижали индуцирующий эффект коллагена. При этом действие ФС и ФИ-липосом было близким (различия недостоверны). Это особенно интересно, если учесть тот факт, что ЯЛ-ХОЛ-ФИ препараты не только не ингийировали, но даже несколько усиливали агрегацию тромбоцитов.

Присутствие фосфатидилинозита в "жидких" липосомах удлиняло время обратимой агрегации и резко снижало скорость и уровень дезагрегации. Обнаруженный нами эффект фосфатидилинозита можно объяснить включением этого липида в фосфоинозитидный цикл, регулирующий уровень кальция в клетке и, тем самым, активацию тромбоцита. Другой путь использования фосфатидилинозита - синтез тромбоксана в условиях наших экспериментов был не активен. Измерения концентрации тромбоксана и простациклина в инкубационной смеси на пике агрегации не выявили их увеличения по сравнению с контролем.

Фосфатидидсерш оказался единственным фосфолипидом в испытанных нами препаратах, который достоверно ингибировал агрегацию тромбоцитов в плазме крови, индуцированную как АДФ, так и коллагеном (Рис.2). Можно предположить наличие общего механизма ингибирования связанного с активацией плазменных факторов свертывания. Увеличение в крови концентрации ФС может приводить к снижению коагуляции за счет возрастания неэффективного комплексообразования факторов свертывания на поверхности фосфолипщщой эмульсии сО.А.Терсенов, М.К.Чабанов, 1981].

В наших экспериментах были использованы низкие концентрации агонистов, индуцировавши обратимую агрегацию. Поэтому появление или отсутствие тромбина на поверхности тромбоцитов за-

120' 100Н га л ю-20

120 '00

. Л

190 140 120 100 60 90 ■•0 20

С

»

_

' Щ/ЩМ

_ —М| у- //' —

Щ "'¡иМЩш Л'тт 'ичикаШ -т. —»Я —щт ~'ш> шя Ш -ш -У/,',} — / // ишк ч^/Жш'тГ г —■'Р'Ёяг '1,1,1,1,111*

ЗА

Рис.2. Эффект липосом различного состава на агрегацию, вызванную.- а) 5 мкМ АДО, ь) 4 шогуыл коллагеном. (0,23 мл ПБТ инкубировали 10 мин с 1,4 мг/мл липосом, после чего вносили индуктора.) с) агрегация суспензии отмытых тромбоцитов под действием 0,4 ед^мл тромбина (условия те же). По оси ординат-светопропусканив (56). К - контроль , оср-(ЯД-Х0Л-ДЦ5=7:2:1), Р1-(ЯЛ: ХОЛ: ФИ=4: 2: 4) , РЭ- (ЯЛ: ХОЛ: ФС=4: 2: 4) , £А-(ЯЛ: СА=9: I)

¿Со

::етно сказывалось за :штснс:!впостл процесса. Можно предположат», тго эффект липосом, содер^^сс фосфатздялсерж, на агре-гап:"о трсг'-Социтов з значительной стапели сзязан с злияшзм на плазменные фактора коагуляции л образование тромбина.

Для подтверждения этого предположения ш исследовали эффект липосом на агрегацию суспензии от.штыг тромбоцитов, индуцированную тромбином. Все изученные препараты, за исключением ЯЛ-ХОЛ-ФС, не оказывали сколь-нибудь значимого влияния на процесс агрегаций!, "Жидкие" фосфатидилсериноЕыв везикулы в этом случае не :впгж провали, а, напротив, значительно активировали агрегации. Их эффект был дсзозависимым, что подгверкдало специфичность действия препарата. Известно, что присутствие фосфатидилсерина в определенной концентрации за внешней поверхности тромбоцита является обязательным условием его активации I Р. СеопГиг1из е! . . 19893. "¡НИДКИВ" ЛИПОСОМЫ ВЗЭИМО-действуя с клетками путем слияния и обмена липидами обогащают их мембрану фосфатидилсерином и, тем самым, способствуют усилению агрегации.

Таким образом, введение липосом в кровоток приводит к их взаимодействию с тромбоцитами. Эффект липосом при этом зависит от их фосфолипидного состава. Традиционные для приготовления везикул фосфолипида - яичный лецитин, холестерин, дицетил-фосфат не оказывают заметного действия на агрегацию тромбоцитов, вызванную АДО, коллагеном или тромбином. Наибольшую активность проявлял фосфатидилсерин, причем он оказывал противоположный эффект на агрегацию тромбоцитов в плазме крови и без нее. Это указывает на участив в процессе плазменных факторов коагуляции, которые, видимо, блокировались фосфатидилсериновы-ми липосомами, что приводило к ингибированию агрегации, вызванной как АДФ, так и коллагеном..

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что при создании медицинских препаратов липосом, содержащих заряженные природные фосфолипиды или липиды с высокой температурой фазового перехода, необходимо учитывать и исследовать их влияний на тромбоциты и систему гемостаза в цзло?л.

Система регуляции метаболизма печении липосомы.

В судьбе липосом в организме основную роль ;прает печень. За исключением специально приготовленных липосом печень захватывает основную массу везикул, оказавшихся в кровотоке. В

основном они захватывается купферовсгами юзпсами, но часть липоссм, главным образом мелких, вступают во взаимодействие с гепатоцитами. В результате происходит модификация состава мембран гепатоцигов липидами липосом. Изменение состава цитоп-лазматической мембраны приводит к изменению ее функций, важнейшей из которых является регуляция метаболизма.

От вида липидов, вхиючившихся в мембрану клеток, и их физико-химических свойств зависит активность многих регулягор-ных ферментсе клетки, таких как аденилатциклаза, фосфодиэсте-раза, АТФ-аза и другив Œ.B. Буроакова и др.,1976, Э.И. Исаев И др. ,1976, R. N. Far 1 ¿s et al. .1970].

На примере щелочной фосфатазы нами было показано, что парентеральное введрнш липосом животным вызывало временное снижение активности фермента. Величина и длительность ингибирую-щвго эффекта зависела от присутствия в липосомах холестерина. Липосомы из яичного лецитина уже через 30 мин после внутрибрю-шинного введения оказывали достоверно ингиЗирующия эффект (pco.os). Максимальное действие препарата было через 1час после инъекции, активность фермента составляла в среднем 20% от исходного уровня. В последующие три часа происходило возвращение к норме. Действие препарата, состоящего из яичного лецитина и холестерина (6:4), было значительно слабее. Активность щелочной фосфатазы при этом достоверно не отличалась от исходной.

_ Присутствие в лигюсомной мембране 40 моль." холестерина приближает ее физико-химические свойства к природной цитоплаз-матяческой мембране. Модификация поверхности печеночных клеток такими липосомами незначительно изменяет ее жесткость и не вызывает выраженного ингибирования фермента.

Изменения жесткости мембраны, модификация липидного состава клетки могут повлечь нарушения нормального проникновения и действия стероидных гормонов. Для оказания своего действия стероидные гормоны должны пересечь цигошшзматическую и ядерные мембраны и связаться с определенными структурами ядра изменяя их активность. В этом сложном механизме определенную роль играют и фосфолипида, входящие в состав мембран и других образований В ядре клетки t £'. Capitani et al. .1978.

J. F. Pardon et al. . 1972].

Глюкокорггикоиды стимулируют синтез глюкозы за счет белков. Для этого необходимо активировать превращение аминокислот

з котокпслоты. Обязательными учас~:;;п:.с1 зпа процессах язля-:отсл '—трс^гнажгаотрансфераза. сарингэгчлрптпза *т трес^ггщэгггд-рат"?а. 3 свои очередь :сс активность рогулнруетсл глюкокорти-коидами через биосинтез бедка IA. У aar и др. ,19813.

На примере этих ферментов мы изучили модуляцию гормональной регуляции знзиматической активности лигосомами. Белым мышам однократно внутрибрюшинно вводили 0,2 мл взвеси липосом (7 мг липидов) после чего через 0,5, I, 2 и 4 часа животных застали и измеряли активность ферментов в гомогенате ткани печени. Контрольным животным вводили физиологический раствор. Активность ферментов у этих животных принимали за "базальную" в 0 ч.

Везикулы из яичного лецитина достоверно ингпбировали TAT и СД в течение первого часа посла инъекции (р<о,1). Введенив липосом, состоящих из лецитина и холестерина (В: 4 мол^мол), не вызывало заметных изменений в активности TAT, СД и ТД. В целом следует ответить слабое влияние липосом из яичного двцкпгаа на активность изученных ферментов.

Полотаниэ значительно изменялось, если на фона липосом вводить глтокоргпмовды. При введении гидрокортизона через I ч посла инъекции липосом индукция активности TAT увеличивалась в среднем в 2 раза (p<o.oi) по сравнению с инъекцией одного гормона. Такой эффект был Еыявлен как для лецитиновых, так и лецитин-холестериновых везикул, причем заметных различий между ними не было (Рис.3).

Подученные результаты свидетельствуют о том, что модификация липидного состава клеток печени дшосомами изменяет их реакцию на глзококортикоида. Усиление индукции ферментов может быть связано с одной стороны с облвгченнБМ прохождением стероидного гормона через клеточные мембраны, а с другой стороны с влиянием липидов на компоненты системы биосинтеза белка. .Зависимость действия липосом на индукцию ферментов пт эффективности действия самого гормона свидетельствует о неспецифическом влиянии Еезикул. Вероятно, их эффект в основном связан с модификацией липидного состава, клеточных мембран,-которая способствует или тормозит поступление гормона в клетку.

Модификация состава и свойств мембраны клеток и связанные с этим изменения активности ферментов и системы их регуляции может нарушить -нормальное'функционирование органов'при хроническом применении липосомных препаратов. Поставленные нами

2С0 ■

!С0 •

: со -

ÄWu.

3

SS]a Ob

2

Рис.3. Влияние лилосом различного состава на индукцию гидрокортизоном активности тирозинаминотрансферазы. (п = 7) Животным в^бр вводили лиггосомы, -через 1ч инъецировали гормон. Активность TAT определяли через 4 ч после введения гормона. По оси ординат - активность TAT (мкг/ч/нг белка). А - дипосомы из ЯЛ, В - лигосомы из ЯЛ-ХОЛ. I - базальный уровень фермента (К), 2 - эффект введения липосом, 3 - эффект введения гидрокортизона 4 - эффект введения липосом и гормона.

эксперименты показали, что многократное (12 инъекция в течение месяца) введение липосом из яичного лецитина или лецитина и холестерина приводило к незначительному снижению активности щелочной фосфатазы печени.

Для лацитшовых липосом оно было значительно (в 2-3 раза) меньшим по сравнению с однократным введением. Возможно,это связано с активацией метаболизма лецитина, способствующей быстрому восстановлению физико-химически свойств клеточной мембраны. Включение в состав Евзикул холестерина приводило к большему ингиЗированию щелочной фосфатазы при хроническом применении липосом, чем при однократном. Очевидно в условиях многократного поступления липосом реакции адаптации становятся более заметными.

Хроническое поступление липосом з организм не вызывало значительного изменения активности стероидиндуцируемых фермен-

тез. Длительнее поступление липосом в органам привело :: епп-:::оп:я) зго реакции на введение стероидного гормона. Подъем ак-•ппшсстл ТА! оказался тагам :ке как и при введении одного гормона (Рис.4).

300-1

гео-■¿оо-

ICO-100

Т

■ЧТО) гзи

-ж»

^ Н|| rfl

I ff I S

«

ж Ä

II

Па SHSa

га-

РИС. 4. Эффект многократного введения липосом на гормональную индукцию тирозинаминотрансферазы Животным вводили липосомы 12 раз в течение 24 даея. Активность фермента определяли через 4 ч после введения гормона. По оси ординат - активность фермента (шет/ч/тяг белка). А - липосомы из ЯЛ, В - липосомы из ЯЛ-ХОЛ. I - базальньш уровень фермента (К), 2 - контроль (не вводились липосомы перед определением активности фермента), 3 - активность в опытной группе, 4 - эффект многократного введения липосом, 5 - Действие одного гормона

На серин- и треониндегидратазы индуцирующее действие глюкокортикоидов выражено нерезко, поэтому ни однократное, ни многократное введения липосом не оказывали заметного эффекта.

Обнаруженные изменения активности TAI при введении липосом во многом определялись наличием или отсутствием холестерина.

Мы сравнили действие препаратов, имеющих одинаковый ли-пидный состав - (фосфатиднлхолин-холестерин-дипэтилфосфат = 7 : 2 : I), но отличающихся по температура фазового перехода фосфатидялхолина. "Твердые" липосомы содеркали дипальмитоил-фосфатидилхолин, "жидкие" - яичный фосфатлдилхолин. Однократное введенив таких липосом приводило к индукции ГАГ через 8 ч. Активность TAT на фоне липосом с ДПФХ возрастала на 40% по

n.r^?TLCV'YO С Г.СЯТрОЛйЛ 'Л ЙЫ.ЛЭ ДССГТОЕЗГНО , "2.М ПЗИ 22QZ2T.ZI

прг;:зрг,тоз :п одаого :пгшого лешгпнга и лзг.гпша с ".голзстрн-

Jj-h-iicr rxipoxoprasoaa за фона эЕедегшьц: .днпзсом такие эа-от лигыдного состава препаратов. Присутствие ДПФХ в ли-посомах в значительноа мере снижало индущрующня эффект гидро-корггизона. Замена его на яичный лецитин уменьшала, но не отменяла ингибируклцего действия липосом. Еероятно, эффект связан с количеством интактных везикул захватываемых гепатоцитами, а тают эффективностью их ЕзаимодеастЕия с клетками.

Индивидуальные фосфолипиды способны не только изменять физико-химическив свойства мембраны. Некоторые из них играют важпую роль в реализации важных функций хслетки, в том числа и регуляции метаболизма. Нами проведены исследования действия .липосомных препаратов, содержащих фосфатидилсерин и фосфатиди-линозит. Присутствие фосфатидилсерина резко усиливало индуцирующее действие липосом на TAT. Через А ч посла введения ФС-липосом происходило двукратное возрастание активности фермента. Эффект был аналогичен действию гидрокортизона. В то же время индукция TAT гормоном на фоне этих липосом оставалась на том же уровне, что и при введении одного гидрокортизона (Рис.5).

TIME -"-1 -*-э

Рис.5. Влияние индивидуальных кислых фосфолипидов в составе липосом на активность TAT. По оси ординат -активность фарманто (мкг/^тлг белка). Состав липосом.- 1-ЯЛ-ХОЛ-ФИ; 2-ЯЛ-ХОЛ-ДЦФ; З-ЯЛ-ХОЛ-ФС

Отсутствий сфректа OO-jskocom свидетельствует о неадщггивнсм ^оздзастз:Е1 :сс'Го„гггг.1дз :i гормона на процесс :шду:сц;1н. 2сз:лсл-:го, 5ccC:c-~iit:q :г гзрмсз :?.:е:зт сд:г.'1а::с2ь:з 'rcn^i гхгшсзенля, 20 различила механизмы действия, что приводит нивелированию их совкестпого эффекта.

Фосфатидилинозитоловые везикулы в меньшей стегани оказывали индуцируицее действие на TAT, но на их фоне действие гидрокортизона значительно усиливалось. Фосфатидилинозиг является вторичным посредником в ответе клетки на ряд сигналов в том числе и гормональных. Бе исключено, что в реализации регулирующего действия гидрокортизона важное место занимает и фосфатидилинозиг. Увеличение его концентрации в клеточной мембране за счет липосом может способствовать гормональной индукции фермента.

Резюмируя вышесказанное следует оплетать, что липосомы способны модифицировать не только физико-химические свойства ■ мембраны клеток. Они влияют на активность многих ферментов и систему их регуляции. Это влияние с одной стороны может быть опосредовано неспецифическим изменением свойств мембраны клетки, в частности ее текучести, с другой стороны оно определяется появлением физиологически активных фосфолипидов способных значительно изменить функциональной состояние . клетки. Организм стремится сохранить постоянство внутренней среда снимая нарушения метаболизма, вызванные многократным введением липосом.

Результаты наших исследований показали, что влияние, ли- ■ посом на внутреннюю среду организма опосредуется в основном следующими факторами: а) физико-химические свойства, определяющие длительность существования везикул в организме и возможность взаимодействия с клетками; б) доза и кратность введения, многократное введение вызывает выраженную реакцию иммунной системы, а также стимулирует механизмы адаптации, нейтрализующиз действие препарата-, в) присутствие в составе липосом биологически активных фосфолипидов, участвующих во многих процессах жизнедеятельности, искусственное изменение их концентрации в клетка может привести к значительному нарушении гомеостаза. Знание закономерностей реакции организма на введение липосом определенного состава позволит конструировать высокоэффективные медицинские средства на основе липо-сомной технологии.

1. 22ЭДОНЯ8 --шосом не остается безразличным для организма,

возникающие сдвиги гомеостаза стимулируют ответные системные реакции адагггации. Основными системами, реагирующими на введение липосом, являются иммунная, гемостаза, транспорта липидов, а также регуляция активности ферментов. Интегральные системные реакции, направленные на адаптацию и поддержание гомеостаза, могут усиливать лечебный эффект липосомных препаратов или оказывать неблагоприятное действие, осложняющее их применение.

2. Системный подход к исследованиям реакций позволяет оценить и прогнозировать ответ организма на введение лечебных липосомных препаратов. Знанив закономерностей ответа организма необходимо для создания композиция мембран Ее-зикул, конструирования медицинских препаратов, обладающих максимальным лечебным эффектом, и не вызывающих выраженную отрицательную реакцию организма.

3. В целом характер системных реакций организма определяется

физико-химическими свойствами липосом и присутствием в их состава индивидуальных биологически активных фосфолипи-дов. Более выраженный "ответ организма, как правило, был выявлен на везикулы с "жесткой" мембраной, способствующей эффективному взаимодействию липосом с клетками. Присутствие в мембране везикул холестерина в концентрации более 20 молХ усиливает реакции организма как на однократное, так и повторное их введенив, а также снижает эффект индивидуальных фосфолипидов.

4. Реакция иммунной системы организма, способствующая защите

от инфекции, в значительной степени стимулируется включением протективных антигенов в липосомы. Длительность пребывания в организме и избирательное шглошэнив липосом клетками ■ моноцигарно-фагоцитарной системы способствует более мощной иммунной реакции организма по сравнению с введением свободного антигена.

5. Локализация антигена внутри :1ли за поверхности липссс:лы

ш оказывает значительного влияния на иммуногенность препарата. В определенной степени эффект липосомных препаратов зависит от фосфолипидного состава, жесткости и заряда мембраны везикул. Однако основной эффект связан с • высокой эффективность!) доставки антигена иммунокомпе-тентным клеткам, возможность® одномоментного введения в макрофаги антигена и иммуностимуляторов.

6. На судьбу вводимых липосом основное влияние оказывает им-

мунная система. Повторное введение липосом, особенно содержащих антигенные молекулы, приводит к усилению их активного захвата моноцитарно - фагоцитарной системой и накоплению в органах богатых иммунокомготентными клетками. Особенности распределения при повторном введении определяются характером антигена и его тропностью к отдельным органам.

7. Повторное введение антигенсодержащих липосом приводит к усилению деструктивного действия компонентов крови на ш-зикулы, проявляющегося в удалении части мембранных фосфолипидов и вытекании внутреннего содержимого. Этот эффект имеет специфический характер и определяется взаимодействием иммуноглобулинов и имиунокомштентных клеток крови с антигенными молекулами в составе липосом. Взаимодействие антигенсодержащих. липосом с иммунокомпетент-ными клетками, в частности лимфоцитами и макрофагами, определяется липидным составом Еезикул и повторным появлением специфического антигена. Реакция иммунной системы на фосфолипиды мембраны липосом практически отсутствует и не влияет на судьбу везикул.

8. Реакция системы гемостаза на липосомы многофакторная.Они

не вызывают агрегацию тромбоцитов, но оказывают модулирующее действие на этот процесс, стимулированный индукторами. Выраженность эффекта определяется физико-химическими свойствами мембраны липосом и присутствием функционально активных фосфолипидов - фосфатидилсерина и фосфатидилинознгола. Характер модулирующего действия липосом зависит от присутствия плазменных факторов коагу-

ляции. Эффект липосом па суспензию отшгл тромбоцитов резко от.-ггсотся от того, что ;г,:еет место з присутствии плазмы. Модулирующий эффект проявляется при адсорбции везикул яа поверхности тромбоцита.

9. Липосомы способны влиять на активность ферментов клеток

печени как цитоплазматических, так и мембранных. Они модулируют индуцирующее действие стероидных гормонов на ферменты. Это влияние липосом с одной стороны может быть опосредовано неспецифическим изменением свойств мембраны клетки, в частности ее текучести, с другой стороны может определяется появлением физиологически активных фосфо-липидов способных значительно изменить функциональной состояние клетки.

10. Однократное введение липосом способно кратковременно, но значительно изменить активность клеточных ферментов и вызвать сдвиги гомеостаза. При многократных введениях препаратов организм включает адаптационные механизмы, которые снижают отрицательное действие липосом на активность ферментов и сохраняют постоянство внутренней среда. Адаптационная реакция организма зависит от величины изменений привносимых липосомами и направлена главным образом против физиологически активных липидов, способных значительно изменять каталитические возможности клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

I. Способ включения веществ в липосомы. (Подзолков В.П., Мельников В.А.). - Авторское свидетельство N 1005791.- 25. XI. 1982.

Липосомы и противочумный иммунитет// I у Всесоюзный симпозиум по биохимии липидов: Тезисы докл.- Кивв,1983.- С.50.

3. Способ разделения биополимеров. (Ефременко В.И., Климова И.М., Ломова Л.В.). - Авторское свидвльство N 1035518. 15. I* 1883.

4. Включение в липосомы капсульного антигена чумного микроба. (Ку рилов В.Я., Мельников В.А.).- /-/Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1983.-и 9.- С.33-36.

5. Липосомы и противочумный иммунитет^/в сб. раб. : Диагностам •л t/:üi, холеры, сапа л : вллондоза. - Волгоград, IS83. - G. 56.

6. Некоторые аспекты применения липосом в диагностасе профилактике и лечении инфекционных заболевания /V Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1985.- N 1. - С. 3 - 9.

7. Иммунный ответ к юлернсму онтеротоксину, фиксированному на поверхности ганглиозидсодержащих липосом. (Нарбутович Н.И., Еф-ременко В.И., Плеханова Н.Г., Подзолкова Г.Г.).- /V Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза: Матер. I Всесозозн.конф. 1-2 октября, IS85r. -M. ,1585. - С.76 - 77.

8. Влияние замораживания и оттаивания на монобислойЕые липосо-мы (Плеханова Н.Г., Ротов К.А., Ступина Е.Ф., Мельников В.А.). - /о' Липосомы. Применен»® з биологии и медицине. - М: Наука, 1985. - С.20 - 24.

9. Некоторые особенности включение белков в липосомы, приготовленные различными способами (Плеханова Н.Г., Смирнова В.И., Саямов O.P. Курилов В.Я.).- ✓✓ Матер, f Всес. биохимич. сМез-да, (Киев). - М.: Наука,1986. - т.2. - С. 267 - 268.

10. Использование иммобилизованных ганглиозидов для изучения структуры, функция и механизмов ( ЕфременкоВ.И., Долматова Л.А., Владнмцева И.В., НарбутоЕИЧ H.H., Подзолкова Г.Г., Го-лосеев Ю.А., Трофимов E.H., ПлехановаН.Г., Пушкарь В.1\

—Marapa г~ВсёсТ~(^нмш7~сНезда, (Киев). - М.: Наука, 1986. -т.2. - С. 192 - 193.

11. Изучение возможности использования липосом, содержащих ганглиозиды, для обнаружения холерного энтеротоксина.(Нарбуто-еич Н.И., Ефременко В.И.). - // Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекция.(Всес. научн.- практич. конф.26-27 мая 1986 г.): Тез. докл. - Ставрополь,1986. - ч.1.-С. 106 - 108.

12. Некоторые свойства уреазы, инкапсулированной в липосомы. (Плеханова Н.Г., Храмов В.А.). -✓v Украинский биохимический журнал. - 1986. - Т.58, N4. - С. 31 - 34.

13. Ячмобиализ-новьт способ разделения биополимеров. (Ефременко В.И., Климова И.М., Ломова Л.В.). - Депонированные рукописи ВИНИТИ 1986,N 4.6/0 &23.

14. Изучение протективных сеойств антнгеносодержащих липосом различного липидного состава при чуме. (Плеханова Н.Г.). -/v 5

2с5пс»пь:Я -г.тмпоз'.гум по йж~г.ш .ляпягэв 18-10 о:ггг.йря IC87: Тсзнсы докл. - Алма-Ата. 1987. - С. 91.

15. Получение высокоактивного меченого капсульного антигена чумного :.cr:pcöa. (Манолоз Л.Д., Васильев 3.11., Снегирез Е.А., Калеи Г.М.). - /V ¡8.микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 1987. - и 7. - С. 117 - 118.

IS. Влияние липосом на гормональную индукцию тирозинаминот-рансферазы печени в эксперименте. (Галаев Ю.В., Гончарова Л.В.).-//Биохимия - медицине. Молекулярные механизмы формирования .патологических состояния: Матер, конф. - Л., 1988.- С. ■ 62.

17. Включений гидрофобизованного капсульного антигена чумного микроба в большие олигослойные липосомы.(Плеханова Н.Г., Смирнова В.И.). - /v Украинский биохимический журнал. - 1989. -т.61, N 2. - С. 89 - 93.

18. Влияние фосфолипидного состава на гормональную индукцию тирозинаминотрансферазы. (Галаев Ю.В., Гончарова Л.В.). - // Механизмы регуляции клеточной активности: Матер, междунар. симпоз. - М., 1989. - С. 23 - 24.

19. Получение люминесцирующих липосом для твердофазного имму-ноанализа.(Плеханова Н.Г., Владимцева И.В., Смирнова В.И.). -/V Научн.конф.молодах ученых: Тез.докл. - Ростов н/Д, 1989. -С. 23 - 24.

20. Влияние липосом на гормональную индукцию тирозинаминотрансферазы в эксперименте.(Галаев Ю.В., Гончарова Л.В.). - // Вопросы медицинской химии. - 1990. - т.36, N 4. - С. 9 - II.

21. Изучение протективных свойств, содержащих антиген липосом различного липидного состава при чуме. (Плеханова Н.Г.). - // Вестник АМН СССР. - 1990. - N 8. - С.32-34.

22. • Липосомные тест-системы для определения холерного энтеро-. токсина. (Владимцева и.В., Плеханова Н.И., Нарбутович Н.И., Смирнова В.И., Греков Л.И.). - // Современные направления в создании медицинских диагностикумов: Матер.Всесоюзн. конф. .-М.,1990. - С. 27 - 28.

23. Радиоактивное меченив иммуноглобулинов. Сравнение различных методов введения радиоактивного йода. (Манолов А.Д.). - В сб. Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей. - Волгоград. - 1990. - вып.4. - С. 36 - 39.

24. Оптимизация условий гидрофобной модификации белков галоге-

ЧЗПГДЛГ'ИДЗМТТ 'KIIDULni ЮТ. ( P'ИГиПСТЗП В ТЛ '-СЙОТСиОЗ З.П. , Плеханова Н.Г.). - В cd. Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, прсриактнка :i биологачесхсз свойства возбудителей. - Волгоград. - 1990. - вып.4. - С. 91 - 95. 25. Синтез меченного холестерилолеата-11'<С из метилолеата-11',С и холестерилацетата. (Смирнова В.И., Ступина Е.Ф., Васильев В.П., Снегирев Е.А.).- В сб. Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителен. - Волгоград. - 1990. - был.4. - С. 86 - 90. 28. Конструирование диагностической тест-системы на основе магносорЗентов и липосом. (Владимцева И.В., Плеханова Н.Г., Смирнова В.И.). - /V Ш. микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 1990. - n 10. - С. 103 - 106.

27. Роль фосфолипидной мембраны липосом в модуляции функциональной активности тромбоцитов. (Кубативв A.A.). - // Биологические мембраны. - 1992. - т.9, мб. - С. 617 - 621.