Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь структуры, состава, биодоступности липосом, включающих антгельминтики, с их терапевтической активностью

ВАК РФ 03.00.20, Гельминтология

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь структуры, состава, биодоступности липосом, включающих антгельминтики, с их терапевтической активностью"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕЛЬМИНТОЛОГИИ ИМЕНИ К.И.СКРЯБИНА

На правах рукописи

01ИГИНА Светлана Феодосьевна

ВЗАИМОСВЯЗЬ СТРУКТУРЫ, СОСТАВА, БИОДОСТУПНОСТИ ЛИПОСОЫ, ВКЛЮЧАЮЩИХ АНТГЕЛЬШТИКИ, С ИХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Специальность 03.00.20 - Гельминтология

Автореферат -

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К.И.Скрябина (ШШС).

Научные руководители -

Официальные оппоненты:

Ведущая организация —

доктор биологических наук _ И.И.Бенедиктов

кандидат биологических наук Т.С.Нэвик

доктор ветеринарных наук Р.Т.Сафлуллин (ВИГИС)

доктор биологических наук Р.С.Кармалиев (МШ)

Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВС1Э)

Защита диссертации состоится

аль/чщг

1992 г.

в часов на заседании специализированного совета во Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К .И. Скрябина.

Адрес: 117259, г.Москва, БДеремушкинская ул., 28. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИШС. Автореферат разослан 1992 г.

Ученый секретарь специализированного

ювета, кандидат биолоигеских шерьЛ^&А_ МД:Вергинаеая

l-j ' .* f

r-до л

■ Oiruy.'l - —»—.

ВЗЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время в целях рационализации и оптимизации применения лекарственных препаратов в медицине и ветеринарии используют различные носители, в том чисче и липосомы. Липосомы имеют цэл*$ ряд преимуществ, а именно: возможность включения препаратов из самых различных химических классов, резкое снижение их дозы; они cüocoöctbj ят уменьшению частоты аллергических и иммунологических реакций (если не включен антиген), имеют внутриклеточную направленность, т.е. высокую биодостулность, обладают малой токсичностью. Возможности и области применения липосом постоянно расширяются вследствие большего разнообразия их состава, размеров и иных структурных параметров, что, в свою очередь, определяет широкую вариабельность их взаимодействия с клетками, биодостугность.

Универсальность описанных свойств в принципе делает их пригодными для лечепия и профилактики многих заболеваний, в том числе и гельминтозов.

В современной доступной нам литературе сведения об использовании антгельмпнтиков в липосомах практически отсутствуют. Подобные г.е исследования в паразитологии вообще довольно редки, причем, основное внимание сконцентрировано на лечении таких заболеваний, кат малярия и лейшманн-03 (c.D.Slaci et al., 1977; O.H.Alving , E .À .Steele, 1973).

Вследствие этого нам представлялось интересным тссле- . довать возмоашость применения липосом с аптгелькинтикамп против различных гелылинтозов загзоткых.

Пель и задачи работы. Цель настоящей работы - установление взаимосвязи метлу строением, составом, биодоступностью липосом с антгелъминтиками и их -"эрапевтической эффективностью.

Конкретно в задачи исследований входило:

- приготовление опытных образцов липосом с включением фенбендазола, оксфендазола, бифена, препарата СО-24, ацемидофена различней структуры и фссфолштадного состава;

- электронная микроскопия получении* образцов лило-

сом с аяттельминтаками, а также их морфологическая идентификация в печени крыс через различные интервалы времени после введения;

- разработка методики определения шкроколичеств оксфекдазола и его метаболитов в органах и тканях животного происхождения;

- изучение особенностей фарш.кокинетики и метаболизма оксфендазола в лилосомах различной структуры и состава при парентератаюм введении: внутримышечном и внутрибрю-шинном (в/гл, в/б) по сравнению с традиционным способом введения препарата через рот у крыс;

- выявление биодоступности липосом с онтгельшштиха-ки - бензимидазолами - путем их оценки на антиштотичвс-кое действие у крыс;

- оценка приготовленных образцов липосом на аптгель-минтную эффективность при фасциолззз, шшюстронгилэзе, эхкнококкозе лабораторных животных (гшля, крысы, морские свинки, кролики);

- вьямение антгелъминтной эффективности образцов липосом, показавших в опытах на лабораторных животных наиболее высокую антгелыягатную активность, на овцах, спонтанно инвазированных фасциолами, дикроцелиями, строн-гилятами пищеварительного тракта.

Научная новизна. Впервые приготовлены липосомы с антгельминтиками: фенбендазолом, оксфендазолом, мебенда-золом, бифеном, препаратом СО-24, ЕЛК, ацемидофеном; получены их электронные микрофотографии; проведена морфологическая идентификация липосом с вышеуказанная! ант-гелъминтихами в печени крыс; на основе жидкостной хроматографии высокого давления разработана оригинальная методика определения микроколичеств оксфендазола и его основных метаболитов в органах и тканях животного происхождения; изучены особенности фармалсокинетики и метаболизма оксфендазола при его вклняешш в липосоми; установлена антгельминтная эффективность липосомных форм изучаемых антгельминтиков при фасциолезе, ниппостронгилезе, эхино-коккозе лабораторных яиьотных, а также фасциолезе, дшсро-

целиозе, стронгилятозах желудочно-кишечпого тракта овец.

Совокупный анализ всех полученных данных позволил установить взаимосвязь между строением и составом лппо-сом, их биодоступкостью и антгельминтной активностью включешшх препаратов.

Практическая ценность работы. Разработаны методические рекомендации по определении лзпсрожшиеств оксфевда-зола и его осговных метаболитов в биопробах, которкэ могут быть вн' дрены в практику санитарно-гигиенического контроля за остатками препарата в продуктах питания животного происхождения.

На основе выявленной корреляции между составом, структурой липосом, их биодостушшстью и антгельминтной эффективностью били сформулированы рекомендации для рационального подхода к конструированию липосом с актгель-минтиками.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и одобрены на отчетных научных конференциях сотрудников Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института гельминтологии им. К.И.Скрябина (Москва, 1989, 1990, 1991), а также на научной конференции "Эколого-бкологические и фаунистические аспекты гельминтозов" (Ереван, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи.

Основные положения, выносимые наЛащиту.

1. Исследование ультраструктуры нативпкх образцов липосом различного состава и способа приготовления.

2. Изучение биодоступности липосом посредством электронномикроскопических, фарлакокинетических исследований, а также по специфическому антимитотичесхому действию включенных в липосомы бензимндазолкарб&чатов.

3. Оценка приготовленных образцов липосом га ант-гельминтную эффективность при различных гельминто-эах лабораторных животных и овец.

4. Выявление взаимосвязи между структурой и фосфо-липидным составом липосом, особенностями фармакокинети-ки, специфическим антимитотическим действием включенных

антгельминткков-бензшидазолкарбаматов и их антгелъминтной активностью.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на .-/57-страницах машинописного текста. Содержит таблиц и 3О рисукксв, состоит из введгшя, обзора литературы, собственных исследований с выводами, обсуждения, общих выводов у. практических предложений. Список литературы включает ¡8д источников, из них 40 отечественных и (40 зарубежных авторов.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Представлены общие сзедения о липосомах: составе, строении, методах изучения, взаимодействии с клетками и г „.частях применения. Приведены данные, касащиеся фарма-кокинетики и антгельмкнтной эффективности бензимидазол-карбаматов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2. МАТЕРИАЛЫ И мзтода

Работу выполняли в 19Б9-1981 гг. во Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте гельминтологии ил. К.И.Скрябина (ВИШС), Подольском опытно-производственном отделе ВИШС, а также в животноводческих хозяйствах Вологодской, Тверской, Ярославской, Орловской областей, Казахстане, Туркменистане (часть исследований проведена совместно со с.н.с., к.б.н. С.В.Березкиной и м.н.с. А.В.Поникаровым). В целом, в опытах использовано 220 белых беспородных крыс, 78 иьшвй,2( морски: свинок, 12 кроликов, 140 овец пород романовская и ставропольский меринос.

2.1. Приготовление липосом

Липосомы готовили методом механического встряхивания (а..Балхаш вt а!., 1965). В целя*, повышения стабильности липосом в ряде случаев применяли многократное (8-1и раз), замораживание суспензии липосом в жидком азоте

с последующим оттаиванием под струей теплой воды (3/от) или ультразвуковую обработку (УЗ-обработка) на высокочастотном дпспергаторе УЗДН-1 с частотой 22 кГц в течение 1-5 минут.

Для приготовления липосом использовали фосФолнллды промышленного производства: стандартнье растворы язгчного лецитина и в ряде случаев - фосфатидилинозита (г.Харьков). В липосомальщто мембрану вводили до ЗС$-моль холестерина, предварительн( триады перекристаллизованного из этилового спирта.

Включаемые антгельминтихи являлись в основном производными бензимидазола: фенбендазол, оксбендазол, бифен, БЖ, албендазол. . мебендазол, препарат СО-24, их сочетания с мет:1лкобала-,21ном, а также препарат из другой химической группы - ацемидсфен.

Варьировало соотношение меяиу количеством гг-тчаемого препарата и об^им содержанием фосфолипидов (Ц/$Л). По данному показателю липосомы можно условно разделить на 3 группы: с низким содержанием фосфолипидов (превышает содержание препарата в 3-5 раз), средним (в 8-10 раз) и высоким (в 15-20 раз п более).

Приготовленные липосомы использовали для электронно-микроскопических исследований(с целью установления структуры и стабильности получаег.ых образцов), а тагае сравнительных фармакокинетических, цитогенет-зеских и терапевтических исследований. В целом,приготовлено более 120 образцов липосом.

2.2. Петоды электронно-микроскопических исследований

2.2.1. Определение размеров и структуры кативных образцов липосом

Для определения размеров и структуры нативных образцов липосом использовали метод отпечатков с двойным негативным контрастированием 2^-ным водным раствором фосфо-вольфрамового натрия и 2^-ннм водным раствором уралилаце-тата.

На сетки с подложкой из парлодия и напыленные углеродом наносили каплю суспензия липоссм и проводили двойное контрастирование вышеуказанными растворами. Сетки 'изучали под T3J.1 cvssia us-;oo и j3:.:-2c0. Отпечатки липо-сом фотографировали на фотопленку иль фотопластинки. Определение размеров проводили по фотопленке или фотопластинкам ь соответствии со шкалой истинного увеличения микроскопа.

2.2.2. Идентификация лилосом в ткани печени крыс

С целью идентификации липосом, выявления характера их локализации in vivo было проведено электронно-мпкро-скопкческое изучение ткани печени крыс после введения суспензии липосом.

Каздый вариант липосом вводили трем белым беспородным крысам внутрибршшшо (в/б) однократно. Контрольной группе животных вводили соответствующее количество физиологического раствора. Убой и вскрытие проводили через 30 к 60 минд после введения.

Из печени крыс брали определенные участки ткани для олектронно-ют.роскопических исследований. Исследуемый материал фиксировали 2,5#~:шм глутаровим альдегидом на 0,2 М фосфатном буфере (рН=7,4), дофиксировали 1%-нш раг.твором четнрехокиси осмия на том же буфере, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заключали в эпоксидные сколы.-

Ультратонкие срезы контрастировали 2$-ным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца по РеИ.юльдсу (Б.Уикли, 1975).

Подготовленные таким образом срезы исследовали под трансессионным электронным микроскопом iusia bs-500 при увеличении от 4 до 32 тыс.

Полученный материал описывали по микрофотографиям, выполненным с различных участков ткани гечени опытных и контрольных животных.

2.3. Cxei.îi î! методы фармагокинети^есхих исследований

Фармакокинетические исследования были проведены с окс-фендазолом. Изучение особенностей фармакоккнетики оксфен-дазола, включенного в липосом, по сравнению с традиционным методом его введения через рот в гиде водной суспензии проводили на белых беспородных крысах массой 200-ЗС0 г.

.Липосомы различного фосфолппидного состава :: приго-товлешм с вк.' этением оксфендазола в дозе 2С :.п'/кг вводили парентерально (в/б, в/м). Через определенные промежутки вре-' мени крыс убивали. Дхя анализа на содержание препарата :: его метаболитов брали пробы крови, печени, почек, легких, селезенки, и содержимого толстого отдела китечника через 30, 60, 180 минут, 24 и 48 часов поело введения. На каждый вариант исследования брали по 3 крысы. Количественное и качественное определение микроколичеств оксфендазола и его метаболитов з органах и тканях проводили по разрабо-' танной нами методике на основе метода жидкостной хроматографии высокого давления.

3 целом^проаяа'шзировано ,<£&£оо'разца внутренних органов и тканей крыс.

2.4. Оценка мебендазола и препарата СО-24, включенных в липосомы, на антимитотическое действие

Данные исследования проводили в целях оценки влияния антгельминтиков - мебендазола и препарата СО-24, включенных в липосомы, в сравнении с звэдением препаратов в "чистс;.Г виде на митотическую активность популяции клеток костного мозга крыс.

Тестируемые липосога с мебендазолом и препаратом СО-24 в дозе 20 мг/'кг (в каждом случае в о'дельности) вводили крысам в/б. Одновременно другим животным мебенда-зол или препарат СО-24 применяли через рот в вцдз водной суспензии соответственно в дозах ТОО и 2С мг/кг или в/б на крахмальном клейстере в дозе 20 мг/кг. Выделение костного мозга и обработку материала проводили анафазнкм методом анализа ПО C.F.y-ord , J .L.Har.erton (1956).

2.5. Оценка лкпосом с включенными препаратами на антгельминтное действие при различных гельминтозах лабораторных и сельскохозяйственных животных

Изучали эффективность липосомных форм антгелы.интг-ков при йасциолезе, ниппостронгилезе, эхинохоккозе лабораторных животных, a тагае фасциолезе, дикроцелиозе, стронгилятозах желудочно-кишечного тракта овец.

2.5.1. Опыты на лабораторных животных

Для экспериментального заражения крыс, кроликов и морских свинок фасциолезом адолескарии получали путем культивирования мол/г "¡ков Galba trur.catuia в лабораторных условиях по методика!.!, описанным в литературе (A.A. Васильев, 1961; В.В.Горохов, 1963; Н.В.Де.лидов и др., 1972; A.M.Сазанов, 1972). Заражение опытных и контрольных /5Г.ВОТКДС проводили путем скармливания адолескариев фасциол с листьями пырея, одуванчика в дозе 30 экз. на голову. Через 1,5-2 месяца после заражения животным одытнкх групп в/м и в/б вводили образцы липосом с вклоте-■ нием оксфендазола и фенбендазола различього фосфолшшдно-го состава г. способа приготовления. Контрольных животных не лечили. Результата учитывали после лапаротомии и извлечения печени. Регистрировали количество фасциол в опытных и контрольных группах.

Культивирование личинок для заражения крыс ниппострон-галезом проводили по методу Корнвеляа (cornweii, 1965), модифицированному в лаборатории проф. А.И.Кротова (1984). В опыте использовал! белых беспородных крыс - самцов массой 50-80 г. Кивотных заражали подкожно в дозе 3Q0-500 инвазионных личинок на голову. Испытуемые образцы липсом в виде водной суспензии вводили крысам в дозе 0,3-1,0 иг/кг по ДВ в/м на 10-12 день после г>ара..енкя. Результаты учитывали на 5-7 день после лечения путем полного гельмин-тол-гического вскрытия кишечника животных. Предварительно за Cjгки до убоя крыс выдерживали на голодной диете.

- П -

Подсчитывали количество ниппостронгилксоп у крыс опытных и контрольных групп.

Эффективность действия лштосс.мшгх форм определяли' при помощи так называемого процента непрямой эффективности, который вычисляется по формуле:

ПНЭ = JLrJL х юей, где К

К - среднее число гельминтов в контрольной группе;

О - среднее число гельминтов в опытной группе квотных.

Для воспроизведения модели экспериментального эхпно-когскоза (е.granulosus ) использовали белых беспородных мышей - самцов массой 14-15 г.

Подготовка инвазионного материала (ларЕоцисты) и заражение мышей проведет, с.н.с., к.з.н. В.БЛстребом (лаб. зоонозов ВИШС) в I990-I99I гг. Животных делили на группы по 10 голов в каждой. Каждой мыши вводили внутрибршпнно по 1000+100 жизнеспособных протосколексов овечьего штамма Е.granulosus в 0,5 шг раствора Хенкса с антибиотиками.

Через 3-5 месяцев после заражения в течение 5-10 дней ежедневно в/м ив/б вводили мышам липосоиные формы бифена и бифена окисленного. Животным контрольной группы препаратов не вводили. Убой и вскрытие мышея проводили через 1-3 месяца после последнего введения. Подсчитывали количество развившихся ларвоцист у каждого животного, определяли их размеры, массу, локализации и физиологическое состояние. Жизнеспособными считали цисты, наполненные светлой пузырной жидкостью.

2.5.2. Опыты на сельскохозяйственных животных

Изучение эффективности лкпосомшх форм вышеуказанных антгельминтиков при фасциолезе, дикроцелиозе, строп-гилятозах пшцеварительного тракта проводили на спонтанно инваэированннх овцах пород романовская и ставропольский меринос. Животных отбирали по результатам копроскопии, формировали в группы по принципу аналогов с учетом массы, возраста, интенсивности заражения. Опытным животным

вводили образца липосом с фенбендазолом, оксфендазолом, Сифоном к ацемвдофеком соответственно в дозах 10; 24-3; 5; 10 мг/кг, а также их сочетания с метглкобаламином в дозе 0,2v0,3 мг/кг в/:л однократно из расчета на I кг массы тела. Контрольные животные препаратов не получали. Результаты при фасцполезе и дикроцелнозе учитывали через 30-45 дней, при стронгплятозах пищеварительного тракта -через 10-15 дней. Оценку эффект ¿явности липосзмкых форм антх'елылинтиксв прозодили путем сопоставления результатов гелъминтоовоскопкческих исследований фекалий до и после лечения. Для уточнения эффективности лекарственных форм часть опытных и контрольных животных подвергали убою и проводили полное гельминтологическое вскрытие сычуга, тонкого и толстого отделов кияечника и печени дал вдентифика-цга видов гельминтов.

При оценке эффективности препаратов определяли интервал вероятных значений интенс- и экстенсэффективности ("Методические рекомендации по проведению исследований в гельминтологии", 1986).

2.6. Статистическую обработку данных всех-исследований проводили по методу Фишера-Стьвдента с использованием •t -критерия (Н.А.Плохиксккй, I960), а также по методу K.H.MUller (I960).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБОТДЕНИЕ

3.1. Изучение структуры и определение размеров приготовленных липосом с оксфендазолом, ЕЖ, бифеном и препаратом СО-24

Целью электронно-микроскопических исследований натив-!шх образцов липосом было установление их структуры, размеров, формы и стабильности, а также характера вклотения ' препаратов в зависимости от состава, химической природы включаемых антгельминтиков ' и способа приготовления.

Проведенные исследования показали, что липосош, приготовленные методом механического встряхивания, имели мулыушмеллярную структуру везикул, размеры которых соо-

тавляли 60-250 нм.

Разг.:ер-г липосом после многократного 3/от были несколько меньше: 50-200 im. Мембрана липосом была более тонкой, т.е. прослеживалась тенденция к переходу мультш:а\:гллярнкх везикул в монослойные. УЗ-обработка суспензии способствовала образованию большего количества .мелких литюсом с тонкой мембраной, имелось большое количество невклженного препарата. Верзятно, для липосом с включением липофилькых препаратов УЗ-)бработка нежелательна, поскольку ведет к уменьшению процента включения препарата.

• На электронных микрофотографиях липосо:.: с низким содержанием фосфолипвдов (П/5Л=1:3) отмечено большое количество невключенксго препарата. 3 то ж а эрез образцах с высоким уровнем фосфолнпидов (П/ФЛ-Т:20) -тгбллда-ли избыточное количество лилпда з з:ще овальных пятен. Липосомы были стабильные, с равномерным включением препарата. Однако, избыток липидоз на сетке дает основание уменъ-' шить соотношение П/ФЛ до 1:10 или 1:5 с учетом химических свойств препаратов. Много невключенного препарата наблюдали также при высоком уровне холестерина (3Qf5 от общего количества ФЛ), что, вероятно, обусловлено трудностью вклю-чекия его в лшщдный бислой с более жесткой структурой. Препарат неравномерно распределялся в мембране - глыбкаки. После многократного 3/от в жидком азоте липосом с высоким содержанием холестерина в мембране отдельных везикул были отмечены мелкие дефекты: трещины и разрывы. В результате, в целом, липосомы оказались менее стабильными. Оптимальным оказалось соотношение фосфолипид/холестерин 9:1, при котором обеспечивалась, с одной стороны, более прочная структура везикул, с другой - равномерное распределение препарата.

Растворимость препарата в воде или органическом раст-зорителе влияет на степень включения его в липосомы. В зависимости от химической природы препарата наблюдали более равномерное включение ЕК и препарата С0-24 по сравнению з бяфеном. Изменение гидрофильности препаратов является >дним из способов увеличения степени их включения в липосомы. Предполагается, что совместное включение препарата з метилкобаламином (кофермент витамина Bj2> ведет к

образованию устойчивых комплексов, более растворимых в воде, чем исходные соединения. Действительно, в образцах лило сом с вкличени^йТЙо-24 и метилкобаламина возросло количество включенного антгельминтика. Лкпосоми были стабильные, равномерные, с высокой электр нной плотностью.

Тагам сбразом, в результате проведенных электронно-микроскопических исследований образцов липосом, различных по фосфолипкцному составу и содержанию холестерина, включенным антгельминтикам, а тшске способу приготовления, установлено, что лучшими яеляются образцы липосом с одновременным включением препарата и метилкобаламина, высоким содержанием фосфолипидов (1:20), с соотношением фосфолипид/ холестерин 9:1; худшие - с УЗ-обработкой суспензии, а также с высоким содержанием холестерина (30$).

3.2. Изучение биодоступности ляпосомных форм антгельминтиков

Другим аспектом наших исследований явилось изучение биодоступности приготовленных образцов липосом при их непосредственном обнаружении в ткшшх с помощью электронно-микроскопических исследований, по накоплению 'включенного препарата и его метаболитов в органах и тканях животного происхождения посредством фармакокинетичес-ких -«следований, а также по специфическому антимитотичес-кому действию лилосомкых форм бензимвдазолкарбаматов на популяцию клеток костного мозга крыс.

3.2.1. Морфологическая идентификация клеточного и

субклеточного распределения липосом различного состава в печени крыс после их 'внутрибрюшинного введения

Цель исследований заключалась в изучении пропивающей способности различных по фосфолипидному составу липосом, динамики их распределения и накопления в лечени крыс после внутрибршикного введения.

В организме липосомы поглощаются органами ретикуло-

эндотелиальной системы и, в большей степени, печенью. Вследствие этого, основное внимание было сосредоточено на данном органе.

Морфологическую идентификацию липосом в печени крыс через 30 и 60 минут после в/б введения проводили путем сравнения структурных компонентов гепатоцитов (ГЦ), звездчатых ретикулоэвдотелиоцитов (ЗРЭЦ), а также внеклеточных пространств - синуыидов - з печени контрольных и опытных животных.

Через 30 минут после введения липосомы обнаружили б основном в синусоидах. Особенно большое их количество отмечено для образца, содержащего в составе мембраны 30$ холестерина от общего количества фосфолшшдов. В цитоплазме 1Ц липосомы находились в фагоцитарных одномембранных вакуолях. Присутствие липосом наблюдали и в ЗРЭЦ, выстилаю-' щкх синусоиды печени. Более того, в цитоплазме ЗРЭЦ обнаруживали липосом больше, чем в ГЦ.

Через 60 минут после введения отмечено уменьшение количества липосом в синусоидах и соответствующее их увеличение как в ГЦ, так и в ЗРЭЦ. Последние были несколько более увеличены в размере, цитоплазма их сплошь заполнена вторичными лизосомами. В цитоплазме 1Ц такя.^ наблвдали увеличение количества лизосом и фагоцитарных вакуолей.

Таким образом, реакция клеток печени на введение липосом различного состава заключалась в увеличении по сравнению с контролем количества вторичных лизосом, а также фагоцитарных вакуолей, и была более выраженной через 60 минут после введения. В течение этого периода времени липосомы оставались ннтактннми.

Как было указано выше, нами изучались образцы различного состава с целью установления возможных особенностей в динамике накопления и распределения самих липосом в печени крыс. Важно отметить, что при низком содержании фосфолшшдов наблюдалось более быстрое накопление лилосоы в ЗРЭЦ и 1Ц. Подобная тенденция прослеживалась также и дня липосом, имелцих в составе мембраны заряженный фосфолшщд - фосфа-тидилннозвт.шм содержащих ЗС$ холестерина от общего коли-

чества фосфолшвдов.

¿'.иные факты свидетельствуют о том, что степень захвата и накопления липидных везикул находится в прямой зависимости от ах состава.

3.2.2. Изучение особенностей фармакокинетшш и

метаболизма оксфендазола в лкпосомных формах при различных путях введения

Для изучения фар;.:акокинетики оксфендазола в липосом-ных формах прежде всего был разработан метод определения самого препарата и его метаболитов в пробах животного происхождения.

Метод основан на извлечении оксфендазола и его метаболитов из гомогената анализируемых проб эталацетатом, очистке экстракта перераспределением в системе ацетонит-рил-гексан и количественном определении жидкостной хроматографией высокого давления. Чувствительность метода 0,05 мг/кг, определяемость 80+5^.

Фармакокинетические исследования были проведены с оксфендазолом. Выбор препарата был не случайным. Оксфен-дазол обладает широким спектром антгельмялтного действия: он эффективен против нематод, трематод и цестсд. Препарат интересен и тем, что в организме животных различных видов интенсивно метаболизируется в основном за счет Б -окисления в сульфон и я-восстановления в свой сульфид (фен-бендазол).

Для изучения особенностей фармакокиньгики и метаболизма оксфендазола в липосомных формах по сравнению с традиционным методом его введения через рот были приготовлены различные по составу образцы липосом, различающиеся в основном по уровню фосфолипидов. Варьировал также путь введен/л липосом (в/м, в/б).

Традиционным способом введения оксфендазола и сравнительным в данном случае являлось его применение через рот.

Почти во всех случаях, за исключением некоторых образцов, концентрация самого препарата при его введении в липосомах была в 3*10 раз выше по сравнению с оральным

путем применения.

Во всех вариантах опыта биодоступкость оксфендазола в анализируемых органах при в/3 введении, в зависимости от вида липосом, в 2*8 раз превышала таковую при в/м применении. Особенно резкие различия в этом случае установлены при сравнею'и образцов с более высоким содержанием фосфолипидов, в 10 и 20 раз превы^андим уровень самого препарата. В то же ¿ремя, следует отметить, что при в/б введении уровень фосфолипидов не оказывал столь существенного влияния на концентрацию оксфендазола в тканях. Напротив, при в/м пути введения с повышением уровня фосфолипидов последовательно уменьшалась концентрация оксфендазола в печени и друпрс органах крыс, и при высоком содержании фосфолипидов (1у$5=10т20) концентрация оксфендазола практически не только не отличалась от такового при перораль-ном пути введения, но и была даже ниже.

Имелись ли какие-либо особенности биотраноформации включенного препарата в зависимости от типа вводимых ли-посом? Как отмечалось выше, оксфендазол интенсивно мета-болизируется в организме животных. 3 данном случае можно отметить присутствие во всех случаях дзух основных метаболитов препарата - сульфона и сульфида (фекбендазола). При введении образцов липосом с более низкой биодоступностью уровень указанных продуктов метаболизма по отношению к самому препарату был выше. Например, при в/б пути ' введения с увеличением показателя соотношения содержания фосфолипидов к препарату (Й^Ю уровень сульфона и сульфида по сравнению с самим сульфоксидом (оксфендазолом) возрастал. При этом значение концентрации последнего, как было указано выше, нэ находилось в прямой зависимости от данного показателя. То ае самое касается д/м введения данных вариантов липосом, где эта тенденция проявилась еще более резко. Ваяно отметить также высокий уровень фенбен-дазола в печени при введения липосом с высоким содержанием холестерина (30$ вместо 10%) и составивший через I чао после введения соответственно 5,81+0,41 и 1,63+0,37 мг/кг.

Обращает г. а себя внимание довольно высокое содержа-

ние оксфендазола и его метаболитов наряду с печенью и в других органах крыс. Однако эта тенденция имела свои особенности в зависимости от типа липосом. Так, например, душ большинства образцов липосом различного состава, введенных в/б, характерен высокий уровень самого оксфендазола и его сульфона в селезенке и легких, что не вызывает удивления, т.к. последние входят в ретикулоэндотелиальную систему и потому наравне с печенью являются органами - мишенями для липосом. Причем, для образца, приготовленного с использованием приема 3/от, содержание самого препарата в этих органах превышало таковое в печени и составило через 0,5 часа после введения в селезенке и легких соответственно 31,75+2,15 и 14,33+1,7 против 6,16+0,45 мг/кг в печени. Высокий уровень оксфендазола в этом случае установлен та>сае и в содержимом толстого отдела кишечника: через I и 3 часа соответственно 78,1.1+3,12 и 73,10+5,01 мг/кг. Аналогичная картина распределения оксфендазола наблюдалась при введении липосом, содержащих помимо самого препарата - метилкобаламин (кофермент витамина В^), а также липосом, в мембрану которых был включен заряженный фосфолипид - фосфатидилинозит. Для образца липосом, не содержащего холестерин, можно отметить довольно высокий уровень оксфендазола в почках и мышцах в течение первых 3 часов, что, вероятно, является результатом перераспределения препарата и его метаболитов между органами после разрушения липосом.

Естественен вопрос: повлияют ли описанные особенности бйотрансформации препарата на его антгельминт. ую эффективность. Вероятно, да, так как сам оксфендазол и его метаболиты различаются по своей антгельминтной эффективности. Оксфендазол активнее сульфона, что же касается фенбендазола, то считается, что действувдпм началом является его сульфок-сид, т.е. первый. Исходя из этого, особенности биотрансформации оксфендазола в липосомах с более низкой биодоступностью могут непосредственно повлиять на антгельминтную эффективность препарата.

Таким образом, в результате фармакокинетических исследований мы установили различную биодоступность оксфендазо-

ла, включенного в ллпосомн разного состава. Наиболее высокое содержание замого препарата в отличие от его мзтаболи-тоз в тканях и органах крыс установили при введении липосом с низким уровнем фосфолкпндов. В/б путь введения липо-сом является более предпочтительны!.! с точки зрзнкя биодоступности оксфендазола по сравнению с в/м.

3.2.3. Оценка липосом с мебеядазолом и препаратом СО-24 на антимитотическое действие у крыс с целью изучения их биодоступности

В данном случае идеально сочеталось: специфическое антимитотическое действие бензимидазолкарбаматов, которое оценивалось у крыс на клетках костного мозга и их фагоцитирующие свойства, которые делают эту ткань мишенью для липосом•

Через 4 часа после введения липосом с мебендазолом происходило резкое увеличение митотпческого индекса (7,92+0,29$) с одновременным увеличением процентного содержания метафаз и снижением количества других стадий митоза: про-, ана- и телофаз. Напротив, при в/б взедении ме-бендазола на крахи; " " :ти-

При введении самого мебендазола через рот антимитотическое

столь выраженным, как при введении липосом, и митотичес-кий индекс в данном случае составил 2,13+0,14 против контрольного значения 0,85+0,092$.

Подобные исследования провели такае с лшгосоками, содержащими препарат СО-24, но различающимися по показателю П/ФЛ. В первом варианте он равнялся 1:3, во втором был значительно выше - 1:50. Препарат СО-24 в липосомах с относительно низким содержанием фосфолшшдов обладал более высокой биодостутшостью в тканях - мишенях по сравнению о липосо- зми* у которых данный показатель был равен 1:50. Значение митотического индекса соответственно равнялось 3,0+0,17 и 1,01+0,1 против контроля 0,87+0,09^. Что же ' касается сравнения введения препарата СО-24 в липосомах и

чески не отмечали

действие также регистрировали,

но оно не было

в"чисток"воде через рот, то как и с мебендазолом, в первом случае эфргкт выратсен значительно сильнее.

Та:;;::.: образом, ыебендаз'ол' 1^6-24 в липосомах обладали более высокой биодоступкостью по сравнению с введе-нием"чистых"препаратов в/б и через рот, причем, при низком содержании фосфолипидов эта тенденция проявлялась особенно резко.

3.3. Оценка антгельмпнтной эффективности оксфендазола, фенбендазола, бифена и препарата 00-24 в липосомных формах

Результаты фармакокинетических, электронно-микроско-пичсских и цктогенетических исследований, несмотря на различную методологическую основу, в принципе сочетались между собо?! и предоставляли почву для моделирования состава и структуры липосом. Но глав1шг.1 оставался вопрос: насколько они подтверждались данными по испытанию на антгельминтное действие. Данные исследования носили ограниченный характер, их следует рассматривать как предварительные и липь контролирующие выводы других вышеуказанных типов исследований. Липосомше формы антгельмгатпков тестировались при инвазиях с различной локализацией паразитов.

Рассмотрим, какое влияние оказывал уровень фосфолипи-дов на антгельминтную активность липосом. Наиболее высокую эффективность установили при низком уровне фосфолили-дов против всех видов инвазий, что, вероятно, объясняется более высокой биодостушюстью таких липосом. Так, для липосом с оксфендазолом в дозе 3 от/кг при уровне фосфолнпидов, в 3 раза превышающем содержание препарата, установили 100^-ную эффективность против стронгилят желудочно-кишечного тракта овец. Аналогичным образом оксфендазол при фасциолезе овец и бифен при дикроцелиозе овец соответственно в дозах 2 и 5 мг/кг проявили ЮО^-ную эффективность. Кроме того, при экспериментальном эхинококкозе мышей высокая терапевтическая активность также проявлялась при низком содержшши фосфолипидов.

Введение холестерина в состав липосомальной мембраны

в целях ее стабилизации не могло не отразиться на антгель-мянтной эффектитшостк лппосо:,21ых препаратов в целок. При дикроцелиозе ов^ц\'высокух) активность (ИЭ=66^) показа.™ ли-посомы с фенбендазолом, содержащие холестерина от об-, щего количества фосфолипкдов, тогда как в его отсутствие результат ИЭ составил всего 4053. Аналогичные результаты получили и при стронгилятозах желудочно-кишечного тракта овец для липосом с оксфендазоло:.: и метилкобаламинсм в дозе 0,8мг/чгпо ДВ, содержащих 10 и 2$ холестерина в составе липосомальной мембраны. При этом эффективность составила соответственно 75 и 5055. Таким образом, включение холестерина в состав мембраны липоссм приводило к увеличению ант-гельмннтной эффективности. Однако необходимо заметить, что эта зависимость проявлялась в определенных пределах. Так, по неопубликованным данным Т.С.Новик (1990) увеличение уровня холестерина до 30> в липосомах, содержащих албендазол, приводило к снижению эффективности препарата при фасциолезе овец.

Прием замораживания-оттаивания также способствовал увеличению антгельминтной эффективности'липосом. Так, при введении липосомных форм оксфендазола с метялкобаламином з дозе 0,3 мг/кг против стронгилят пищеварительного тракта овец в случае, когда суспензию липосом подвергали данной, обработке, эффективность была.выше и составила 70% по сравнению с 50% для липосом аналогичного состава, но без нее.

Включение в лшосомы метилкобаламина - кофермента витамина - в большинстве случаев и при различных гель-' кинтозах способствовало усилению терапевтического эффекта, прием, он проявлялся в очень низких дозах, на уровне ивер- . пектина (0,3-0,8 мг/кг). Так, если при пиппостронгилезе крыс эффективность липосом с одним оксфевдазолом в дозе 0,8 мг/кг составила 20$, то с одновременным включением метилкобаламина возросла дг 75$. Аналогичным образом, липо-сокц этого же состава показали наилучший эффект при трема-тодозах лабораторных животных и овец (ИЗ=80-100?3 и опять-таки з малых дозах: для оксфендазола и препарата С0-24 соответ-

ственно 0,8 и 0,3 мг/кг. Интересно отметить, что в данном случае эффективность в меньшей степени зависела не только от пути введения, но и соотношения содержания препаратов к фосфолипидам. Tai:, например, высокую эффективность при нип-постронгплезе крыс наблюдали в довольно широком диапазоне значения данного показателя 1:10 - 1:100. Чем можно объяснить подобный факт? На наш взгляд здесь могут играть роль два фактора. Первое: увеличение гидрофильности комплекса препаратов с витамином Bjg и повышенного в результате этого включения во внутреннее пространство липосом. Кстати, ото подтвердилось и электронно-микроскопическими исследованиями: увеличилось количество включенного препарата, сами липосомц были равномерные и стабильные. При анализе экстрактов органов и тканей крыс после введения липосом с оксфенда-золом в сочетании с метилкобаламшом установлена высокая концентрация препарата к продуктов его метаболизма, что указывает на высокую биодоступность подобных липосом. Если предположить, что усиление антгельминтной эффективности происходило только за счет комплексообразования, то, вероятно, можно кофермент витамина Bj-g заменить на более дешевые соли металлов. Нами были приготовлены и испытаны с довольно неплохим результатом - 61% - при ниппостронгилезе крыс липосо-мы на основе оксфендазола с FeCL^ или его комплекса, приготовленного заранее. Однако идея тождественности подобной замены нуждается в дальнейших доказательствах, так как второй возможной причиной усиления активности бензимидазолкарбама-тов в сочетании с метилкобаламином может быть активная роль последнего, через который осуществляется биологическое действие соединений данного химического ряда.

Интересным представлялся вопрос о том, как путь введения липосом влиял на их терапевтическую эффективность. Наиболее высокая активность липосом одинакового фосфолипид-ного состава с оксфендазолом против ииппостронгилюсов крыс проявлялась при в/в и в/б путях введения соответственно 94,9 и 88,9$, а наименьшая - при в/м (38,5$). Доза препарата при этом составляла I мг/кг. Аналогичным образом при фасциолезе морских свинок терапевтическая эффективность бы-

ла значительно выше при в/б пути введения как одного окс-фендазола, так и в сочетании с метилкобаламином и соответственно равнялась 60 и 100$. Это хорошо согласуется с результатами фармакокинетических исследований, из которых следует, что при в/м пути введения липосом отмечается более равномерный и менее целенаправленный характер распределения препарата по всем органам и тканям, особенно при высоком содержании фосфолипддов. Т.е. в данном случае использование оксфендазола в липосомах не дает каких-то преимуществ по сравнению с оральным путем применения и, вероятно, будет нецелесообразным. Однако это единственно приемлемый на практике способ их применения, поэтому нам оставалось выбрать наиболее оптимальный состав липосом. На наш взгляд^при рациональном подходе к приготовлению липосом для в/м введения следует предусмотреть следулцее: I) соотношение уровня фос-фолипидсв к препарату не должно превышать 1:3 - 1:5, 2) введение в липосомы метилксбаламина резко повышает антгельминт-ную эффективность входящих в их состав бензимидазолкарбама-тов, 3) возможно, включение солей металлов или заранее приготовленных комплексов с ними бензкмидазолкарбаматов, т.е. усиление гидрофильных свойств последних будет приводить к увеличению актгельминтного эффекта.

В ряд подобных рекомендаций также можно включить приготовление заряженных липосом, для чего в наших исследованиях использовался фосфатидилинозит, придающий липосомам некий отрицательный заряд. Электронно-микроскопическими исследованиями установлено более быстрое включение подобных липосом в печень. Вероятно, с этим связано усиление антгель-минтного эффекта липосом, * в частности,с фен-

бендазолом при фасциолезе кроликов по сравнению о липосома-ми, не содержащими фосфатидилинозит, эффективность которых соответственно составила 77 и 44/?.

. Конкретно выявленные закономерности отражены в разделе

"вывода".

вывода

1. Освоен способ приготовления мультилачеллярных липосом (с включением фенбендазола, оксфендазола, БМК, бифена, мебендазола, албевдазола, препарата СО-24, ацеми-дофена, их сочетания с метилкобаламином) методом механического встряхивания, а также с применением ультразвуковой обработки или многократного замораживания и оттаивания в жидком азоте.

2. Методом электронной микроскопии установлено, что размеры приготовленных липосом с оксфендазолом, КЖ, бифе-ном и препаратом 00-24 находились в пределах 50 * 250 ны.

3. Установлены различия в структуре, характере включения препаратов в липосомы в зависимости от состава и способа приготовления последних. Оптимальным соотношением между содержанием препарата и фосфолипидов является 1:5 -1:10; УЗ-обработка, увеличение уровня холестерина до 30% приводит к ухудшению качества липосом.

4. Электронно-микроскопическими исследованиями установлена высокая биодоступность липосом с оксфендазолом, албен-дазолом, бифеном и ацемидофеном в клетках печени крыс (гепа-тоцитах и особенно в звездчатых ретикулоэвдотелиоцитах) через 0,5-1 час после введения. Максимальное включение наблюдали для липосом с низким уровнем фосфолипидов, в 3-5 раз превышающим содержание препарата, а также содержащих фосфа-тидилинозит и 30£ холестерина.

5. Разработан метод определения оксфендазола и его основных метаболитов в пробах животного происхождения на основе жидкостной хроматографии высокого давления. Чувствительность метода 0,05 мг/кг, определяемость ВО±5%.

6. Установлены особенности накопления, распределения и биотрансформации включенного в липосомы оксфендазола в зависимости от их состава, структуры и способа приготовления. Наиболее высокая концентрация препарата в тканях и органах крыс отмечена при введении липосом с низким содержанием фосфолипидов (1:3 - 1:5) и в/б пути применения. Наименьший уровень самого препарата установлен' при в/и пути введения липосом с высоким уровнем фосфолипидов, в то время

как его метаболитов - сульфона и сульфида - наиболее высокий.

7. Специфическое антимитотическое действие небенда-зола и препарата СО-24 на клетки костного мозга крыс значительно выше при их введении в лппосомах, особенно с низким содержанием фосфолипидов, по сравнению с оральным путем применения.

8. Установлен широкий спектр антгельминтной эффективности оксфендазола и бифена при различных гельминтозах: ниппостронгилезе крыс, трематодозэх лабораторных и сельскохозяйственных животных, стронгилятозах желудочно-кишечного тракта овец, экспериментальном эхинококкозе мышей в дозах I- 20 мг/кг.

9. Включение в состав липосом с оксфендазолом и препаратом С0-24 мгтилкобалаллна приводило к значительному усилению антгельминтного действия препаратов при ниппостронгалезе крыс, трематодозах лабораторных и сельскохозяйственных животных, стронгилятозах желудочно-кишечного тракта овец, причем, в минимальных дозах 0,3+0,8 мг/кг.

10. Выявлена корреляция между составом, структурой липосом, их биодоступностью и антге/тьминтной эффективностью; на этой основе даны рекомендации для рационального подхода

к конструированию липосом с антгельминтиками.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРШОШШ

1. Разработанный метод определения микроколичеств оксфендазола и его метаболитов в тканях животного проис- . хождения можно использовать для контроля за остаточным содержанием препарата в санитарно-ветеринарных лабораториях.

2. Полученные данные по взаимосвязи между составом, структурой, биодоступностью и антгельминтной активностью липосом можно использовать для приготовления наиболее оптимальных вариантов данных лекарственных форы антгель-минтиксв.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Ожигина С.Ф., Скворцова Ф.К. Зависимость структуры и стабильности'липосом от их состава и способа приготовления // Тр. ВИ1ИС. - 1992. - T.3I. - В печати.

2. Ожигина С.Ф., Скворцова O.K. Морфологическое исследование клеточного и субклеточного распределения липосом различного состава в печени крыс после их внутрибршинного введения // Бш. ВКШС. - Вып.56. - В печати.

3. Ожигина С.Ф., Новик Т.С. Хроматографический метод определения микроколичеств оксфендазола и его метаболитов в пробах жиеотного происхождения // Ьол. ВИ1ИС. - 1991. -Вып.55. - C.I4I-I42.

4. Ожигина С.О. Особенности фармакокинетики оксфендазола в липосомных формах в сравнения с введением препарата через рот у крыс // "Эколого-биологические и фаунистические аспекты гелъминтозов". Тез. докл. научн. конф., Ереван, 20-22 мая 1991 г. - М., 1991. - С.87.

Подписано в печать и.03.92. Заказ 542 Формат 60x90/16 Тираж 100

Москва.Типография Российской академии с/х наук