Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка антипаркинсонического липосомного препарата допамина с повышенным соотношением активное вещество/носитель

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Жигальцев, Игорь Валерьевич, Москва

¿> о

к/

Московская Государственная Академия тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова

Кафедра Биотехнологии

На правах рукописи

ЖИГАЛЬЦЕВ ИГОРЬ ВАЛЕРЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА АНТИПАРКИНСОНИЧЕСКОГО ЛИПОСОМНОГО ПРЕПАРАТА ДОПАМИНА С ПОВЫШЕННЫМ СООТНОШЕНИЕМ АКТИВНОЕ

ВЕЩЕСТВО/НОСИТЕЛЬ

03.00. 23. - Биотехнология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук

Научные руководители: д.х.н., проф. А.П. Каплун к.б.н. В.Г. Кучеряну

Москва -1999

Список сокращений.............................................................................................4

Введение.............................................................................................................................................5

1. Литературный обзор "Методы загрузки липосом лекарственными и другими биологически активными соединениями"

Введение................................................................................................ 8

1.1. Биологические факторы, определяющие выбор липосомной системы................11

1.2. Традиционные методики загрузки липосом............................................................14

'.Л '> :

1.2.1. Загрузка малых одноламеллярньшшпосом................................................17

1.2.2. Загрузка больших одноламеллярных липосом............................................19

1.2.3. Загрузка мультиламеллярных липосом........................................................20

1.3. Методики активной загрузки липосом.....................................................................21

1.3.1. Градиенты рН как движущая сила загрузки липосом................................22

1.3.2. Кинетика АрН - зависимой загрузки слабых оснований в липосомы.....23

1.3.3. Загрузка липосом липофильными аминами с помощью градиента рН.... 27

1.3.4. Трансбислойная миграция липидов в присутствии градиента рН............32

1.3.5. Роль рН - индуцированной липидной асимметрии в процессах агрегации и слияния липосом...................................................................................................34

1.3.6. Трансбислойный перенос аминокислот и пептидов в присутствии градиента рН.............................................................................................................36

1.3.7. Трансбислойный перенос катионов в присутствии градиента РН............37

1.3.8. Градиенты рН в биологических системах...................................................38

1.3.9. Загрузка липосом слабыми основаниями с помощью трансмембранного градиента сульфата аммония.....................................39

1.3.10. Загрузка липосом слабыми кислотами с помощью

трансмембранного градиента ацетата кальция.........................................43

2. Обсуждение результатов

2.1. Разработка методики загрузки липосом допамином с помощью трансмембранного градиента сульфата аммония..............................................46

2.1.1. Получение липосом с трансмембранным градиентом сульфата аммония.........................................................................................50

2.1.2. Кинетика активной загрузки допамина в липосомы...........................52

2.1.3. Перекисное окисление липидов в липосомах...................................56

2.1.4. Влияние концентрации липидов на эффективность включения допамина в липосомы........................................................................58

2.1.5. Влияние липидного состава на эффективность включения

вещества в липосомы........................................................................60

2.1.6. Влияние свойств включаемого вещества на эффективность

процесса активной загрузки................................................................62

2.2. Влияние липосомной формы допамина на двигательную активность животных при моделировании экспериментального МФТП-индуцированного паркинсонического

синдрома...............................................................................................64

2.3. Влияние липосом с повышенной удельной загрузкой на обмен допамина в стриатуме у животных с экспериментальным МФТП-индуцированным паркинсоническим синдромом...................................................................68

2.4. Количественная оценка роли липосом в проникновении катехоламинов

в мозг...................................................................................................73

3. Экспериментальная часть.................................................................................77

4. Выводы........................................................................................................88

5.Список литературы.......................................................................................................................89

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БОЛ большие одноламеллярные липосомы

ГС гидрогенизированный соевый

ГЭБ гематоэнцефалический барьер

ГВК гомованилиновая кислота

ДА допамин

ДМФХ димиристоилфосфатидилхолин

ДОБА 3,4-дигидроксибензиламин

ДОПА 3,4-дигидроксифенилаланин

ДОФГ диолеилфосфатидилглицерин

ДОФК диолеилфосфатидная кислота

ДОФУК 3,4-дигидроксифенилаланинуксусная кислота

ДОФХ диолеилфосфатидилхолин

ДОФЭ диолеилфосфатидилэтаноламин

ДПФХ дипальмитоилфосфатидилхолин

ДСПХ дистеароилфосфатидилхолин

млл мультиламеллярные липосомы

мол малые одноламеллярные липосомы

МФТП 1 -метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин

олл олиголамеллярные липосомы

пол перекисное окисление липидов

ПС паркинсонический синдром

РЭС ретикулоэндотелиальная система

см сфингомиелин

Хол холестерин

ФГ фосфатидилглицерин

ФИ фосфатидилинозит

ФК фосфатидная кислота

ФС фосфатидилсерин

ФХ фосфатидилхолин

яФХ яичный фосфатидилхолин

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Паркинсона - одно из наиболее распространенных заболеваний ЦНС, для которого точно установлен молекулярный дефект - выраженный дефицит допамина в черном веществе мозга. Рост заболеваемости и наблюдаемое "омоложение" паркинсонизма выдвигают данную патологию в ряд актуальных медико-социальных проблем.

Основным подходом в лечении паркинсонизма остаётся заместительная терапия сравнительно легко проникающим в мозг предшественником допамина - ДОПА, поскольку допамин не способен преодолевать ГЭБ и проникать в мозг. Однако клиническая нестабильность, периферические и центральные побочные эффекты, обусловленные колебаниями концентрации ДОПА в крови и мозге, интенсивным периферическим декарбоксилированием препарата и развитием гиперчувствительности ДА-рецепторов стриатума, значительно затрудняют корректировку дозы и ритма введения ДОПА. Для решения этих проблем предпринимались различные методические подходы к заместительной терапии паркинсонизма, но, несмотря на достигнутые успехи, разработка но вых подходов к заместительной терапии паркинсонизма, направленных на увеличение ее эффективности, сохраняет свою актуальность.

Одним из способов защиты лекарственных веществ от периферической биотрансформации, увеличения времени циркуляции в кровотоке и снижения дозы является их инкапсуляция в липосомы. Липосомы лишены ограничений по химическому и структурному диапазону переносимых веществ, а их липидные компоненты подвержены полной биодеградации. Успешное применение липосом было продемонстрировано ранее для ряда противосудорожных препаратов, которые не способны самостоятельно преодолевать ГЭБ. Показана возможность коррекции двигательных нарушений при

экспериментальном ПС у крыс на фоне интрастриатной имплантации липосом с ДА [1,2]. Недавно был проведен ряд успешных экспериментов по системному применению липосомных форм ДОПА и допамина, полученных в нашей лаборатории, для терапии экспериментального ПС [3]. Продолжение исследований потребовало создания липосом с повышенным соотношением ДА/носитель, что позволило бы значительно увеличить эффективность действия липосомных форм препарата. Экспериментальной проверке этого предположения и посвящена данная диссертация.

Цель настоящей работы заключалась в разработке методики активной загрузки допамина в липосомы с помощью трансмембранного градиента сульфата аммония, а также выяснении эффективности системного применения полученного липосомного препарата допамина для терапии экспериментального МФТП - индуцированного ПС.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Осуществить подбор оптимального липидного состава и условий для осуществления загрузки липосом допамином с помощью трансмембранного градиента сульфата аммония.

2. Охарактеризовать физико-химические свойства полученных липосом с допамином (размеры, степень включения и кинетику загрузки допамина, соотношение ДА/липиды, стабильность липосом и кинетику перекисного окисления липосомных липидов).

3. Изучить влияние липосом с повышенной удельной загрузкой на параметры двигательной активности животных при экспериметальном ПС.

4. Исследовать влияние липосом с повышенной удельной загрузкой на нейрохимические параметры обмена катехоламинов в стриатуме животных с экспериментальным ПС.

5. Оценить количественые параметры проникновения липосомной формы допамина в стриатум.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Методы загрузки липосом лекарственными и другими биологически активными соединениями

ВВЕДЕНИЕ

Липосомы представляют собой достаточно простые замкнутые структуры, состоящие из одного или нескольких липидных бислоев [4]. Биомембраны и липосомы обладают сходными физико-химические принципами структурной организации: в основе формирования и тех и других лежит фосфолипидный бислой, ориентация молекул которого в окружающем водном пространстве определяется структурной уникальностью самих молекул. Как оказалось, липосомы представляют собой едва ли не идеальную упрощенную модельную систему для изучения структуры и свойств биомембран [5,6,7]. К середине 70-х годов липосомы стали использовать как инструменты для изучения клеток и воздействия на их метаболизм, т. е. для введения различных веществ внутрь клеток [5,6,8]. В мембранологии липосомы начали рассматривать как инструмент для внедрения в клеточную мембрану рецепторов, канальных белков, ферментов [6,9,10], в молекулярной биологии - для введения генетического материала в клетку [11]. К тому же времени относятся и первые попытки использования липосом, загруженных биологически активными соединениями, в качестве транспортеров лекарств к органам и тканям, вовлеченным в патологический процесс [6,8,12]. Впоследствии в ходе многочисленных исследований было показано, что с помощью липосом можно значительно снизить токсичность и/или повысить эффективность действия традиционно используемых лекарственных препаратов [13]. Наиболее перспективные направления применения липосом как потенциальных лекарственных форм включают в себя использование их в качестве средств доставки противоопухолевых, фунгицидных, бактерицидных и антивирусных препаратов. Кроме того, липосомы могут быть использованы для доставки контрастирующих агентов при получении диагностических рентгеновских и томографических снимков [14].

Липосомы как средства доставки лекарственных препаратов имеют ряд преимуществ по сравнению с другими носителями, так как:

•Способны доставлять широкий спектр лекарственных веществ, т. е. они универсальны [6].

•Дают возможность доставлять лекарственное вещество точно к месту действия [8,12,15,16].

•Обладают адгезивностью, т. е. свойством эффективно связываться с поверхностью клеток-мишеней [17,18].

•Дают возможность осуществлять направленную доставку, т. е. способны передавать лекарственное вещество конкретному типу клеток при соответствующей модификации липосомной мембраны: введение в мембрану рецепторов, антител, повышающих сродство липосом к мишени [15,18].

•Обладают относительной стабильностью в жидких средах организма при правильном подборе липидного состава липосом [8,19].

•Нетоксичны и биодеградируемы [15,20].

•Защищают заключенное в липосомы от воздействия ферментов и других высокомолекулярных и полярных веществ [20].

Применение липосом позволяет решить две основные фармакотерапевтические задачи:

•Действие на клетки и органы с целью такого вмешательства в их функции, которое по каким-либо причинам не может быть реализовано при использовании лекарственного вещества самого по себе [8,15].

•Изменение фармакокинетики лекарственного вещества с целью улучшения его действия, что особенно актуально для токсичных лекарственных препаратов [21,22].

В ходе решения этих задач, что было неоднократно показано экспериментально, становится возможным:

а) Уменьшить суммарную терапевтическую дозу используемого лекарственного препарата, тем самым увеличив диапазон его эффективной терапевтической концентрации, и исключить его нежелательное воздействие на не вовлеченные в патологический процесс органы и ткани [8,21,23].

б) Увеличить концентрацию лекарственного вещества непосредственно в органе и ткани-мишени в 50-100 раз [12,22].

в) Увеличить время циркуляции лекарственного вещества в кровотоке, значительно уменьшив вероятность его метаболической деградации [8,19,22,23].

г) Увеличить время задержки лекарственного препарата в клетках-мишенях в 10100 раз [8,15,16,23].

Разработано множество методов получения липосом и включения в них лекарственных и других биологически активных веществ, однако использование липосомных лекарственных форм в клинической практике в настоящее время представляется довольно ограниченным. Особые требования к липосомной лекарственной форме возникают в зависимости от типа включаемого вещества, ожидаемого биологического эффекта вещества в организме, а также от поведения липосом в конкретной биологической системе.

Тем не менее, за последние пять лет появилось более десятка лекарственных липосомных препаратов, не меньшее количество находится на различных стадиях клинических испытаний [24,25]. Это свидетельствует о том, что липосомные исследования перешли на качественно другой уровень - уровень конструирования реальных препаратов.

1.1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ВЫБОР ЛИПОСОМНОЙ СИСТЕМЫ

К настоящему времени описаны десятки доступных и эффективных методов приготовления и загрузки липосом, различных по структуре, форме, составу и размерам [26]. В каждом конкретном случае выбор методики приготовления определяется типом включаемого вещества, требуемым размером и липидным составом липосом, а также их удерживающей способностью. Последний фактор играет важнейшую роль при использовании липосом в биологических системах. Судьба введенных в организм липосом существенно зависит от таких параметров, как скорость выведения липосом из кровотока, стабильность липосом в кровотоке, распределение липосом между органами и тканями, а также доступность клеток-мишеней для липосом. Скорость выведения зависит от размера липосом: чем меньше размер липосом, тем дольше они циркулируют в кровотоке [21]. С другой стороны, отрицательно заряженные липосомы удаляются из кровотока быстрее, чем нейтральные и положительно заряженные [20]. Время циркуляции липосом также зависит от активности ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) печени и селезенки [27]: липосомы довольно быстро захватываются РЭС. Это происходит вследствие взаимодействия липосом с белками плазмы - опсонинами (в основном, компонентами комплемента), которые "метят" липосомы, делая их мишенями для клеток РЭС. Очевидно, что увеличение времени циркуляции должно еще больше повысить эффективность липосомных препаратов. С этой целью несколько лет назад было предложено поверхность липосом модифицировать полимерами с гибкой гидрофильной цепью, например полиэтиленгликолем [28], получая так называемые "стелс"-липосомы феакЬ-Нрозотез), т.е. липосомы, невидимые для РЭС. Для этого используются специальные модифицированные липиды, например, ФЭ, конъюгированный с

полиэтиленгликолем. Полиэтиленгликолевые остатки создают стерический барьер с наружной стороны мембраны, затрудняя взаимодействие липосом с опсонинами и липопротеинами, благодаря чему "стелс"-липосомы остаются в кровотоке в 100 раз дольше обычных [29].

Стабильность липосом в кровотоке зависит от микровязкости липидного бислоя, от уровня липопротеидов высокой плотности, от заряда липосом [7,8,13]. Так, было показано, что липосомы, состоящие исключительно из фосфатидилхолина, обладают очень низкой удерживающей способностью в плазме крови [30], обусловленной липидным обменом между липосомами и липопротеидами высокой плотности. Распределение липосом между органами и тканями носит неравномерный характер: большая часть липосом захватывается купферовскими клетками печени и макрофагами селезенки (до 70%). О распределении липосом по другим органам и тканям из данных литературы следует, что лучше всего в головной мозг, селезенку и костный мозг попадают положительно заряженные липосомы [8,20,21], в легкие маленькие отрицательно и большие положительно заряженные липосомы [8,21].

Время циркуляции липосом в кровотоке также зависит от дозы и способа введения липосом. Так, увеличение липидной нагрузки и уменьшение размеров везикул способствует снижению скорости вывода липосом из кровотока при внутривенном введении. Липосомы, введенные внутримышечно или подкожно, аккумулируются в лимфатической системе и затем возвращаются в кровоток, где и поглощаются клетками РЭС. Внутримышечное введение липосом обычно применяют в том случае, когда желательна как можно более длительная задержка липосом в точке инъекции. Большие мультиламеллярные липосомы наиболее пригодны для этой цели [30]. Подкожное введение малых одноламеллярных липосом (�