Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическая характеристика эффективности липосомных форм фенотерола

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимическая характеристика эффективности липосомных форм фенотерола"

ГГб ОД 2 5 ГЕН 71(11

На правах рукописи

Корякова Анжела Григорьевна

БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛИПОСОМНЫХ ФОРМ . ФЕНОТЕРОЛА

03. 00. 04. - Биохимия АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

ВЛАДИВОСТОК 2000

J

/ Работа выполнена в государственном учреждении - ¡Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН, и ' Владивостокском государственном медицинском университете)

1

Научный руководитель: кандидат химических наук,

Лукьянов П.А.

Научный консультант: доктор медицинских наук,

Невзорова В.А.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Соловьева Т.Ф.

кандидат медицинских наук Суровенко Т.Н.

Ведущая организация: Государственное учреждение

Институт биологии моря

РАН

Дальневосточного отделения

Зашита состоится « 18 >> декабря 2000 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 003.99.01 в государственном учреждении -Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект i 00-летия Владивостока, 159, ГУ-ТИБОХ ДВО РАН

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН (690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ГУ-ДВГИ ДВО РАН)

Автореферат разослан « » ноября 2000 г

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 003.99.0W

кандилат химических наук_¿-г-^*/

старший научный сотрудник / ^ £ 11рокопенко ГтИт

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Успешное применение лекарств для лечения или

предотвращения заболеваний во многом зависит от их селективности. Вопрос доставки лекарственного препарата в место его действия без побочных эффектов на остальные органы до сих пор остается открытым. В настоящее время признано, что одним из универсальных носителей, увеличивающих эффективность лекарственных средств, снижающих их токсичность и системное действие, являются липосомы.

Исследования последних лет открывают перспективу использования липосомных аэрозолей для лечения болезней органов дыхания. Эпидемиологические сведения во многих странах об увеличении летальных исходов бронхиальной астмы в результате использования агонистов ß2-aapeHopeuenTopoB вызвали широкую дискуссию по поводу эффективности и безопасности антиастматических лекарственных средств. Использование липосомной формы ингаляционных р2-агонистов, возможно, окажется новым направлением совершенствования препаратов данного класса.

Создание наиболее оптимальной и стабильной липосомной формы препарата обеспечивает широкая возможность выбора величины, структуры и липидной композиции везикул. Специфичность липпдного состава липосом в значительной степени определяет механизм и степень их связывания с клетками. В ряде работ отмечалось, что наибольший контакт липосом с клетками достигается при формировании липосом из фосфолипидов тканей-мишеней [Саатов 1990, Розенберг, 1993]. В связи с этим становится очевидной высокая аффинность липосом, полученных на основе фосфолипидов легкого теплокровных к клеткам бронхиального дерева, что позволит использовать их в качестве носителя бропхолитических препаратов.

Стратегия направленного транспорта липосом заставляет обратить внимание на типы соединений, способных служить векторами в доставке везикул к клеткам-мишеням. Одна из морфофункционачьных особенностей респираторного тракта - наличие сурфактанта легких, главной белковой составляющей которого является сурфактантный белок А (SP-A), относящийся к семейству коллагеновых лектипов. Уникальные свойства эюй молекулы привлекаю!" к ней большой ингерес исследователей в последние годы. SP-А участвует в процессах организации сурфактантных мембранных структур, обладая свойствами для связывания, транспорта и даже "сортировки" легочных фосфолипидов [Johansson, 1997]. В то же время, SP-A взаимодействует через специфические рецепторы с члкппфаг.-шн Ii упетичиирл-т их фагшштярную яктинность [Ояупог^ IOOS \УокяЬяг.Ь 1994] При таком сочетании функций, вероятно, существует потенциальная возможность активного участия эндогенного SP-A в доставке липосом к клеткам-мишеням

дыхательных путей. Этот вопрос в настоящее время не изучен. Однако исследования в этом направлении могут оказаться полезными в понимании механизма взаимодействия липосом с клетками респираторного тракта, что в свою очередь укажет пути повышения эффективности липосомных лекарственных форм в терапии заболеваний органов дыхания.

Цель и задачи исследования. Работа выполнена с целью получения наиболее эффективной липосомной формы агонисга р2-адренорецепторов - фенотерола и уточнения механизма ее действия в дыхательных путях. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить различные липосомные формы фенотерола, варьирующие по микровязкости бислоя и заряду.

2. Оценить эффективность действия полученных липосомных препаратов в сравнительном плане на различных моделях для выявления наиболее оптимальной формы.

3. Изучить биофизические свойства липидного бислоя полученных липосом (фазовое состояние, поверхностный заряд) и оценить их влияние на лечебное действие липосомного фенотерола.

4. Выяснить роль вР-А в доставке липосомных препаратов к клеткам-мишеням.

Научная новизна работы

Получена новая лекарственная форма р2-агониста - фенотерола, широко используемого для лечения острых проявлений бронхиальной астмы, в виде липосомного препарата. Исследована ее эффективность на экспериментальной модели бронхообструкции у крыс и на культурах клеток, установлена острая токсичность липосомного фенотерола.

Исследовано биофизическое состояние липидного бислоя различных липосомных форм фенотерола. Определены оптимальные параметры микровязкости и поверхностного заряда мембраны липосом для достижения наибольшей эффективности фенотерола.

Впервые выявлено активное участие эндогенного БР-А в целенаправленной доставке липосом из фосфолипидов легкого теплокровных к клеткам дыхательных путей - тучным клеткам и моноцитам.

Практическая значимость работы:-------

Созданы наиболее оптимальные липосомные формы фенотерола из суммарных фосфолипидов легкого свиньи а на основе яичного лецитина с добазлением холестерина и дицетил фосфата.

Количественное определение параметров состояния липидного бислоя липосом из суммарных фосфолипидов легкого свиньи, влияющих на их эффективность, расширяет возможность получения лилосомлых препаратов с таким же лечебным действием на основе других липидных композиций, более доступных и удобных.

Изучение некоторых механизмов взаимодействия липосом с клетками дыхательных путей, возможно, окажется полезным в решении проблемы целенаправленного транспорта липосомкых препаратов для лечения заболевании органов дыхания.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены на 3-ем Национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996), 6-ом Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Новосибирск, 1996), XV Word Congress of Asthmology (Montpellier, France, 1996), II Дальневосточной региональной конференции с всероссийским участием "Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке" (Владивосток, 1998), II съезде биофизиков России (Möckss, 1 í)99).

По материалам исследования опубликовано 13 работ, 1 находится в печати.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 142 стр. машинописного текста, содержит 8 таблиц и 14 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4-х глав, в которых приводятся результаты исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 77 отечественных источников и 140 иностранных, и приложения.

Используемые в работе сокращения. АНС - 1,8-аншшннафтолсульфокислота, БА - бронхиальная астма, БАС - бронхоальвеолярный смыв, БО - бронхообструкция, ДМХ -/?-диметиламинохалкон, ДФГТ - 1,6-дифс1шл-1,3,5-гсксатриен, МДА - малоновый днальдегид, ПОЛ - перекисное окисление липидов, СФ - сфингомиелин, ФГ -фосфатидилглицерин, ФИ - фосфатидщшнозит, ФС - фосфатидилсерин, ФХ -фосфатидилхолин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, ЭДТА - эпшендиаминтетрауксусная кислота, DCP - дицетилфосфат, ЕРС - яичный фосфатидилхолин, Кс - константа связывания флуоресцентного зонда с мембраной, LPL — фосфолипиды легкого свиньи, N -число мест связывания зонда с мембраной, NOS - нитроксид-синтаза, ROS - активные формы кислорода, SP-A - сурфактантный белок А, Тс - температура фазового перехода.

Материалы и методы исследования

В работе использовали фенотерол фирмы «Boehringer Ingelheim» (Германия). Липосомы получали из яичного лецитина (ЕРС), суммарных фосфолипидов легкого свиньи (LPL), а также на основе ЕРС с добавлением холестерина и дицетилфосфата (DCP), варьируя содержание двух последних компонентов. Анализ фосфолипидов проводили методом двумерной тонкослойной хроматографии (Vaskovsky et al., 1975).

Мультиламеллярпые липосомы получали по методу Huang (1976), малые одноламеллярные - по методу Batzri & Korn (1973), большие одноламеллярные — методом обращения фаз (Szoka, 1978).Соотношение фосфолипиды:фенотерол составляло 1:0,05 (по молям).

SP-A выделяли из броихоальвеолярных смывов (БАС) крыс по методу Dethloff (1986). Основные стадии выделения белка включали процедуру делипидации, аффинную хроматографию на маннозил-сефарозе 6В и гель-проникающую хроматографию на еефарозе CL-4B. Гомогенную фракцию SP-A диализовали и лиофильно высушивали.

Исследование эффективности липосомных форм фенотерола проводили in vivo (на крысах) и in vitro (на органной культуре медиастиналыюй плевры крыс и на миеломоноцитарной клеточной линии «Wehi-3»),

В эксперименте in vivo использовались практически здоровые белые крысы, у которых была создана модель бронхообструкции (БО) по методу Andersson (1980). Группа ' из 5 здоровых крыс использовалась в качестве контрольной. Фенотерол в свободной и лппосомной формах, а также недогруженные липосомы, вводили в дыхательные пути животных с помощью ультразвукового ингалятора "Thoraex L2". Доза фенотерола составляла 0,6 мкг на крысу в день. Ингаляции проводили 5 дней подряд, на 6-е сутки крыс декапитировали для биохимического анализа БАС и морфологических исследований тучных клеток.

При биохимических исследованиях использовали методы определения биогенных аминов (гистамина, серо тонина) (Ахмеджанова, 1991,Yoshimura, 1987), малонового диальдегида (МДА) (Гаврилов, 1987), суммы метаболитов окиси азота (NO) '(Stainton, 1974, Thomsen, 1991), белка по методу Лоури. Методы использовались с небольшими модификациями.

На клеточной культуре миеломоноцитов изучали влияние фенотерола на активность индуцибельной нитроксид-сицтазы (iNOS). Для стимуляции ¡NOS клетки (10'' клеток/ил) обрабатывались в течение 24 ч лип о г i ол и сах ар идо м Е. coli 055 :В5 в концентрации 1мкг/мл. Далее клетки инкубировались с одним из следующих препаратов: свободным фснотсролом (1мкг/мл), пустыми липосомами (20 мкг/мл) и липосомным фенотеролом на основе LPL и ЕРС с таким же содержанием компонентов. В качестве контроля и^п^пи"^ткчупир^ряннн'' кчртки ^рз дальнейшей обработки. Через 24 и 120 ч после добавления препаратов в супернатанте культуры определяли метаболиты NÖ1

Также стимулированные липополисахаридом Е. coli клетки обрабатывались липосомной формой фенотерола на основе LPL в присутствии различных концентраций

SP-A (0-10мкг/мл). Через 24 ч определяли содержание метаболитов N0 и активных форм кислорода (reactive oxigen species - ROS).

На органной культуре медиастиналыюй ллеврм крыс изучали влияние фенотерола на состояние тучных клеток. У крыс с моделью БО после деканитации извлекали медиастикальную плевру, помещали на предметное стекло и обрабатывали одним из следующих препаратов: фенотеролом в свободной форме (0,003 мкг), липосомной из ЕРС, LPL, липосомами из ЕРС, LPL (фенотерол: фосфолипиды 1:10), а также липосомной формой фенотерола на основе LPL в присутствии SP-A (0,02 мкг). Затем плевру инкубировали при 37°С в течение 2 ч, промывали 70% этиловым спиртом и окрашивали толуидиновым синим для идентификации тучных клеток. Определяли количество тучных клеток, их размеры, коэффициент дегрануляции как отношение числа дегранулирующих клеток к их общему числу на 1 мм2, оптическую плотность гранул в цитоплазме. Ультраструктурные исследования выполнялись методом сканирующей электронной микроскопии.

При проведении биофизических исследований использовали методы флуоресцентной спектроскопии (Добрецов,1989, Лакович, 1986).Температуру фазового перехода (Тс) липидного бислоя липосом определяли по изменению поляризации флуоресценции 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена (ДФГТ), встроенного в липосомную мембрану. Поверхностный заряд липидного бислоя оценивали по параметрам связывания зонда 1,8-анилиннафтолсульфокислоты (АНС) с липосомами Кс и N.

Связывание SP-A с липосомами изучали по изменению светорассеяния липосомной суспензии в режиме временного сканирования, а также исследуя тушение флуоресценции триптофановых остатков белка липосомами, несущими акцептор флуоресценции - р-диметилхалкон (ДМХ). Влияние SP-A на эффективность липосомных форм фенотерола изучали in vitro на культурах миеломоноцитов и тучных клеток.

Количественные данные обрабатывали методом вариационной статистики (Лакин, 1968).

Автор искренне признателен научному руководителю д.х.н. Лукьянову П.А. за всестороннюю поддержку исследования и сотрудникам Владивостокского медицинского университета за помошь в проведении биологического эксперимента.

Результаты и их обсуждение

1. Эффективность липосомных форм фенотерола в коррекции_проявлений

......

VJ j <i 'I I A V'V ' Vf ^ ip »ПИЦЦ.

При использовании любых типов липосом в терапевтических целях важно, чтобы везикулы с включенным в них препаратом достигали места назначения неразрушенными.

Во многом это определяется способом получения линосом, от которого зависят их стабильность и степень включения препарата. Нам удалось получить дипосомные формы фенотерола на основе ЕРС и ЬРЬ в виде .мультиламелляриых, а также одноламеллярных больших и малых везикул. Однако при ультразвуковой обработке большие и мультиламеллярные липосомы разбиваются на малые одноламеллирные, что сопровождается значительной потерей инкапсулированного материала (Марголис, 1986). Поскольку для коррекции проявлений БО у экспериментальных животных предполагалось использование метода ультразвуковой ингаляции, мы остановили свой выбор на получении липосомных форм фенотерола в виде малых одноламеллярных везикул.

Проведенные нами исследования показали, что острая токсичность липосомного фенотерола как минимум в 15 раз меньше по сравнению со свободной его, формой (табл.1). В группе мышей, которым внутрибрющинно вводили неинкапсулированный фенотерол, доза 30 мг препарата на кг массы тела вызывала через сутки гибель половины животных, а при дозе 45 мг/кг погибли все грызуны. В то время как в группе мышей, которым ввели липосомную форму препарата в дозе 450 мг фенотерола/кг, из 6 животных в живых осталось 4. Очевидно, это обусловлено более медленным высвобождением лекарства из фосфолнпидных везикул. Таким образом, при использовании фенотерола в липосомкой форме существенно снижается вероятность его токсического эффекта при передозировке.

Таблица 1. Исследование острой токсичности липосомной и свободной форм фенотерола.

№ п/п Доза, мг/кг Погибло/выжило животных

липосомная форма . фенотерола свободная .форма. фенотерола

1 5 0/6

2 15 - 1/5

3 30 0/6 3/3

4 45 0/6 6/0

5 60 0/6 -

—6_ _120_. 0/6 -

7 240 1/5 -

8 300 1/5 -

9 450 2/4 -

* - данные не определялись

Действие липосомных препаратов мы исследовали на экспериментальной модели БО у белых нелинейных крыс и кроликов. Ранее в опытах,- проведенных на кроликах, нами было показано, что лилосомная форма фенотерола обеспечивает выраженный бронхолитический эффект уже через 10 мин после ингаляции препарата. При этом длительность его действия была больше по сравнению со свободным фенотеролбм, а также отсутствовали побочные эффекты со стороны сердечно-сосудистой системы (Архипенко, Корякова, 1996).

В настоящем исследовании было изучено, действие липосомного фенотерола на состояние биохимических процессов в дыхательных путях при экспериментальной БО. Одним из методов получения комплексной оценки в этом отношении является анализ БАС как органоспецнфнческой жидкости. У крыс с БО по сравнению со здоровыми животными отмечается резкое увеличение уровня основных биохимических маркеров нарушения бронхиальной проходимости и воспаления в дыхательных путях - биогенных аминов (гистамина, серотонина), МДА, являющегося одним из конечных продуктов перекисного окисления лллидов (ПОЛ), метаболитов окиси азота, отражакмцих активность NOS (табл.2).

Гистамиц и серотонин относятся к группе первичных медиаторов, непосредственно вызывающих бронхоспазм и участвующих в формировании воспалительного процесса (Федосеев, 1995). При ингаляции фенотерола, как в свободной, так и в липосомной форме наблюдалось снижение содержания этих биогенных аминов в БАС. Однако, липосомный фенотерол был эффективней, чей свободный, а максимальное действие достигалось при использовании LPL-липссомной формы. Фенотерол в липосомах из LPL, по сравнению со свободным препаратом, в 1,5 раза эффективней снижал уровень гистамина и в 1,3 раза -серотонина (табл 2).

Любые формы нарушения вентилляционной функции легких приводят к активизации процессов ПОЛ, которые способствуют развитию воспаления и обструкции бронхов (Кубышкин, 1989, Болевич, 1995). При БО происходит увеличение содержания МДА в дыхательных путях в 2,2 раза. Однако после ингаляции свободной формы фенотерола концентрация МДА достоверно возрастала. Вероятно, фенотерол усиливает процессы ПОЛ или способствует угнетению антирацикальной защиты. Достоверное снижение МДА наблюдалось только при использовании ненагруженных липосом, что свидетельствует об их антиоксидантных свойствах. При этом результаты действия обоих типов липосом были примерно одинаковыми. Содержание МДА в БАС крыс после лечения липосомпым фелотсролом достоверно не отличалось от контрольного значения при БО. Тем не менее необходимо отметить, что фосфолипнды, обладая антиоксидантным действием, сдерживают эффект актцвации ПОЛ фенотеролом.

Таблица 2. Биохимические показатели БАС крыс с экспериментальной БО (нмоль/мл)

Группы крыс Гистамин Серотонин МДА КгО„"

Здоровые 0,054±0,011 0,154+0,009 0,038±0,004 1,79±0,10

сБО 0,118+0,016 0,400+0,020 0,085±0,005 2,79±0,27

р,<0,05 р,<0,01 р,<0,01 Р/<0,01

Получавшие: фенотерол 0,099±0,01 0,376±0,017 0,232±0,014 2,87±0,35

Р1 <0,05 р, <0,0] Р] <0,01 Р1 <0,05

р2<0,01 Р2>0,1 р2<0,01. Р2>0,1

ЛФФ на основе ЕРС 0,087±0,007 0,362+0,015 0,074±0,005 1,94+0,26

Р/<0,1 Р/<0,01 Р1<0,01 Р1>0,1

р2<0,01 Р2>0,1 Р2>0,1 Р2 <0,02

рз <0,01 Р;>0,1 рз<0,01 Рз <0,05

Р4<0,1 Р4 < 0,02 РА <0,05 РА>0,1

ЛФФ на основе 1.РЕ 0,064±0,008 0,288+0,011 0,104±0,007 1,96+0,3

р,>0,1 р,<0,01 р/ <0,01 Р,>0,1

Р2<0,01 р2<0,01 Р2>0,1 р2<0,02

Рз<0,01 Рз <0,01 Рз <0,01 Рз <0,05

ЛФФ на основе ЕРС/СЬо1/ОСР (1:0,85:0,50:0,05 в молях) 0,075+0,006 РА >0,1 0,297+0,002 РА >0,1 0,115+0,006 РА >0,1 1,83+0,12 Ра >0,1

ЕРС 0,Ю6±0,011 0,331+0,018 0,093+0,005 2,55+0,20

р, <0.05 р, <0,01 р1 <0,01 р, <0.02

Р2 <0,01 р2 <0,05 Р2>0,1 рг<0,02

рз <0,01 Рз<0,1 Рз<0,01 Рз>0,1

РА <0.05 04 <0.1 РА <0,05 п,<0 1

ЕРЕ 0,086+0,009 0,348±0,010 0,060±0,005 2,83+0,42

Р1<0,1 р, <0,01 р, <0,05 р, <0,05

Рз<0,01 г,<-пт р2<0.1 Рз>0,1 Р2 <0.02 Рз <0,01 р2<0,02 рз> 0,1

РА>0,1 РА <0,01 _РА<Ц02 РА <0,1

р1 - по отношению к здоровым крысам, р2 - по отношению к крысам с БО, рз - по отношению к крысам, получавшим феиотерол,/)^ - по отношению к крысам, получавшим ЛФФ на основе ЬРЬ

В последние годы в регуляции легочных функций большое внимание уделяется роли окиси азота (N0), которая образуется в организме из аминокислоты L-аргинина под действием ферментов NO-синтаз (Вознесенский, 1998, Невзорова, 1997). В ответ на действие эндо-, экзотоксинов и некоторых цигокидав в клетках экспрессируется индуцибельная NOS (iNOS), способная продуцировать в тысячи раз большие, чём конститутивная NOS количества N0. Избыточно накапливаясь в клетке, N0 может давать провоспадительный эффект (Nijkamp, 1994). В то же время в очаге воспаления ' присутствуют активные формы кислорода, при взаимодействии которых с N0 образуется пероксинитрит - сильнейший медиатор окислительного клеточного повреждения (Freeman, 1995, Granger, 1994).

При определении активности iNOS в БАС у крыс с БО отмечено достоверное увеличение в 1,6 раза метаболитов N0, которое после ингаляций неинкапсулированного фенотерола практически не менялось (табл.2). Напротив, содержание метаболитов N0 в БАС крыс, получавших липосомные формы фенотерола, достоверно не отличалось от контрольного показателя у здоровых животных.

Итак, анализ состояния биохимических процессов в дыхательных путях при БО после ингаляционного введения препаратов фенотерола животным свидетельствует о том, что фенотерол, инкапсулированный в липосомы, в особенности, на основе LPL, обладает более выраженным бронхолитическим и противовоспалительным эффектом но сравнению со свободным препаратом. Полученные результаты были подтверждены ' при исследовании морфофункционального состояния тучных клеток крыс с БО:

Тучным клеткам принадлежит ведущая роль в формировании воспалительного процесса в органах дыхания. В специфических гранулах, которыми плотно заполнена их цитоплазма, содержатся различные биологически активные вещества. Активация тучных клеток иммунным комплексом аллерген-IgE ведет к их дегрануляции и выбросу различных медиаторов реакций гиперчувствительности немедленного типа (Магош, 1991, Holgate, 1992, Федосеев, 1995). При БО в состоянии тучных клеток происходят резкие изменения. Количество клеток на 1ммг препарата увеличивается в 1,8 раз, преобладающими становятся умеренно и активно дегрануяирующие формы (75%). Клетки увеличиваются в размерах, плотность расположения гранул в цитоплазме падает. Поверхность клеток становится неровной в результате появления многочисленных выпячиваний.

После инкубации медиастинапьной ппеяпы с фенотепопом r пипосомах из F.PC число дегранулирутощих форм тучных клеток составило 38%, что достоверно отличается от результата после воздействия свободного препарата (49%) и ненагруженпых липосом

из ЕРС и LPL (62% и 64%, соответственно). После аппликации на медиастинальную плевру крыс с БО фенотерола в липосомах из LPL число дегранулирующих элементов снизилось в 3 раза по сравнению с контролем и составило 25%. В экспериментах in vivo после ингаляционного применения фенотерола в липосомах из ЕРС количество дегранулирующих форм в медиастинальной плевре уменьшилось в 2,3 раза и составило 32%, а после ингаляций фенотерола в липосомах из LPL дегранулирующие клетки составили 21%, что достоверно не отличается от такового показателя у здоровых животных. После применения липосом поверхность клеток становилась более ровной. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о более выраженном стабилизирующем действии на тучные клетки липосомных форм фенотерола, в особенности из LPL, по сравнению со свободным препаратом.

В формировании бронхообструктивного синдрома, активное участие принимают клетки макрофагической системы, в частности альвеолярные макрофаги и моноциты (Маянский, 1989, Потапнев, 1998, Романова, 1992). Альвеолярные макрофаги в силу своей локализации в легких одними из первых контактируют с аллергенами и антигенами, попадающими в дыхательные пути. Активация альвеолярных макрофагов легких IgE и специфическими аллергенами сопровождается выделением ряда медиаторов: тромбоцит-активирующего фактора, активных форм кислорода, продуктов липоксигеназной реакции и др. В последние годы установлено, что активированные макрофаги способны продуцировать большие количества N0 в результате действия iNOS (Ванин, 1998, Невзорова, 1997).

Мы исследовали влияние фенотерола и его липосомных форм на NO-синтазную активность мышиной миеломоноцитарной клеточной линии «Wehi-3». Миеломоноциты являются предшественниками моноцитов и макрофагов и таким образом представляли собой модель-аналог этих клеток. Для стимуляции активности iNOS клетки обрабатывались липополисахаридом E.coli в течение 24 ч, при этом синтез нитрит-иона усиливался в 3 раза. При инкубации клеток в течение следующих 24 ч со свободным фенотеролом, его липосомными формами, а также с нёнагруженными липосомами уровень синтеза N0 достоверно снижался. Эффект фенотерола возрастал при использовании его в липосомной форме, причем при длительной инкубации (120 ч) фенотерол в липосомах из LPL в оольшей стеиени-сохранял-подавление-активиогта NOS по сравнению с ЕРС-липосомной формой и свободным препаратом (таблЗ).

Таблица 3 .Влияние фенотерола и его липосомных форм (ЛФФ) на нитроксид-сицтазную активность клеток "Welii-3", стимулированных липополисахарндом Е. coli 055:В5.

Препарат Уровень нитрит-иона, % к контролю

24 ч 120 ч

Контроль 100+7 100+9

Фенотерол 54+2* 74±4

ЕРС 51+5* 84+5

ЛФФ на основе ЕРС 11+2* 130+11

LPL 28+3* 85±12

ЛФФ на основе LPL 11+1* 56+8*

* - различия достоверны в сравнении с контролем (п=3, р<0,05)

Достоверное снижение активности NOS липосомным фенотеролом и сдерживание процессов ПОЛ свидетельствуют о том, что липосомная форма препарата оказывает противовоспалительное действие. Проведенные нами исследования показали, что фосфолипидные везикулы обладают самостоятельной способностью участвовать в стабилизации мембран тучных клеток, они эффективно подавляют процессы ПОЛ, снижают секрецию биогенных аминов. При воспалительных процессах происходит повышение микровязкости мембран за счёт расходования ненасыщенных фосфолипидов в процессе перекисного окисления липидов и под действием мембранных фосфолипаз. Накапливающиеся сфингомиелин (СФ) и холестерин, увеличивая микровязкость мембраны, нарушают барьерную и матриксную функцию бислоя (Марголис, 1986). Длительное состояние повышенной микровязкости мембран приводит к нарушению функции клеток.Таким образом, положительный эффект липосом может быть связан с возможностью встраивания их в цитоплазматическую мембрану или обмена с ней фосфатидилхолином (ФХ), что при воспалении устраняет повышенную микровязкость мембраны и способствует восстановлению ее функций .

Итак, проведенная комплексная оценка эффективности липосомного фенотерола свидетельствует о том, что заключение р2-агонистл в лмпосомную форму значительно улучшает и расширяет его действие. Эффективность липосомных препаратов во многом обусловлено липидным составом, который определяет уникальность структуры и

поверхностные свойства липосомной мембраны. В связи с этим, большой интерес представляло изучение биофизических параметров липидного бислоя, в первую очередь его фазовое состояние и поверхностный заряд.

2. Роль биофизического состояния липидного бислоя в эффективности липосомных форм фенотерола

В составе ЬРЬ в среднем содержится (%): ФХ - 51, СМ - 21, фосфатидилэтаноламин (ФЭ) - 10, фосфатидилсерин (ФС) - 9, фосфатидилинозит (ФИ) - 8, фосфатидилглицерин (ФГ) - 1. По сравнению с ЕРС ЬРЬ отличаются большей насыщенностью жирных кислот. Преобладающей в ЬРЬ является пальмитиновая кислота (38,9%), тогда как в ЕРС -олеиновая (48%). Доля насыщенных жирных кислот ЬРЬ составляла 58%, что на 15% выше, чем в ЕРС.

но

ОН СН

I 3

, .■>—СНСН ИНСНСН-(! :>— ОН

2 2 Х4-'/

/ х НВг

НО

Рис. 1. Химическая структура фенотерола

Степень включения фенотерола в липосомы из ЬРЬ и ЕРС составила, соответственно, 98% и 83%.Очевидно, фенотерол, являясь амфифильным соединением (рис.1), встраивается в липидный бислой везикул, удерживаясь в нем своими гидрофобными участками. Степень связывания зависит также от электоростатических взаимодействий. Наличие отрицательно заряженных фосфолипидов в составе суммарных ЕРЬ (ФС, ФИ, ФГ), возможно, способствует не только высокому проценту включения фенотерола, несущего положительный заряд, но и удерживанию препарата.

При исследовании стабильности липосомных препаратов обнаружена быстрая утечка (за 14 ч) одной трети фенотерола из липосом на основе ЕРС, в то время как липосомы из ЬРЕ отличались более сильным удерживанием препарата (рис.2). Вероятно, стабильность липосом зависит от фазового состояния (микровязкости) липидного бислоя. Для липосом из ЕРЬ фазовый переход начинается при 30°С, в то время как для липосом из ЕРС Тс ниже 10°С (табл 4). Включение фенотерола в липосомы практически не влияло на -тиа-рлагзи-пге-!. нрмбрпн» в КОМПОЗИЦИИ i_.Pl, СМ, ФЭ И ФС, СМСщаЮ1ЦИХ Тс Б

сторону увеличения (Шевченко, 1993, Бергельсон, 1986), и большое содержание насыщенных жирнокислотных остатков в молекулах фосфолипидов определяет высокую микровязкость мембраны липосом из ЕРЕ, что уменьшает диффузию фенотерола из этих везикул (рис.2).

Известно, что сходство по фазовому состоянию контактирующих мембран способствует их слиянию (Грегориадис, 1983). Установлено также, что с клеточной поверхностью лучше связываются липосомы с жидкокристаллической мембраной (Грегориадис, 1983, Марголис, 1986). Очевидно, что максимально эффективными окажутся липосомные препараты, у которых фазовый переход липидов бислоя происходит при физиологической температуре. Для липосом из ЬРЬ Тс гораздо ближе к интервалу физиологических температур, в отличие от препарата на основе ЕРС. Кроме того микровязкость бислоя определяет латеральную подвижность молекул фенотерола в липосомцой мембране, что, вероятно, отражается на контакте фенотерола и клеточных^ 2-рецепторов.

о 8-

—■—А —ж— Б

Время, ч

Рис.2. Стабильность липосом из ЕРС (А) и ЬРЬ (Б) в физиологическом растворе натрия хлорида. Кривые отражают изменение содержания фенотерола (%) в липосомах в зависимости от времени. Величины представляют собой среднее 3 экспериментов.

Немаловажное значение имеет и поверхностный заряд везикул. В сумме на долю кислых фосфолипидов в препарате ЬРЬ прихидигся почти 20%, таким образом, становится ясно, что отрицательно заряженные липвды ФС, ФИ и ФГ будут определять соответствующий заряд липосомных препаратов. Количественно это подтвердилось при определении параметров связывания (Кс и К) флуоресцентного зонда АНС, заряженного отоииателыю ппи Лизиогсоги ЧР,(*,КИХ значениях р", с ЛИПОСОМНЫМ И М£ М бр2Н 2М и. С липосомами из ЬРЬ АНС связывался гораздо меньше, чем с липосомами из цвигтер-ионного ЕРС, Об этом свидетельствуют более низкие значения Кс и N для липосомных

70 -

65 -

55 -

препаратов из 1Л'Ь (табл 4). Таким образом, в отличие от липосом из ЕРС, суммарный отрицательный заряд липидного бислоя липосом. из ЬРЦ очевидно, способствует взаимодействию их с клетками-мишенями бронхиального дерева.

Для выяснения влияния биофизического состояния мембраны на терапевтическую эффективность липосомного фенотерола нами были получены липосомные препараты, варьирующие Тс бислоя и заряд мембраны. На основе ЕРС с использованием холестерина для повышения вязкости бислоя и БСР для придания необходимого заряда мембране нами был получен препарат с биофизическими показателями близкими для липосомной формы из ЬРЬ (№ 8, табл 4). По результатам проведенного биохимического анализа БАС крыс с БО (табл.2) и экспериментов ¡п \ilro с тучными клетками оказалось, что фенотерол в составе этих липосом не уступает по терапевтической эффективности препарату на основе ЬРЬ.

Таблица 4. Состав и биофизические параметры липосомных форм фенотерола

Препарат Состав, в молях Тс,°С Кс, мМ"' Ы, нмоль/мольРЬ

I. ЕРС - < 10 98 43

2. ЕРСЮСР 1:0,05 <10 22 33

3. ЕРС/фенотерол 1:0,05 <10 132 620

4. ЕРС/холестерин 1:0,85 28

5. ЕРС/ОСР/фенотерол 1:0,05:0,05 < 10 56 63

6. ЕРС/холестерин/ОСР 1:0,85:0,05 29

7. ЕРС/холестерин/феногерол 1:0,85:0,05 28 112 249

8. ЕРС/холестеринЯ)СР/фенотерол 1:0.85:0.05:0.05 30 52 53

9. ЬРЬ - 30 63 30

10.1.Р1_/фенотерол 1:0,05 30 64 40'

' - параметры не определялись

терапевтического " действия липосомных форм фенотерола лежат определенные биофизические показатели состояния липосомного бислоя, такие как, оптимальные значения микровязкости и заряда мембраны.

3. Роль сурфактантного белка А ч доставке липосом к клеткам-мишеням

На основании структурно-функциональных особенностей БР-А правомерно предположить его участие в эндогенной доставке липосом к клеткам дыхательных путей. Нами было изучено взаимодействие ЭР-А с липосомами и его влияние на эффективность липосомных форм фенотерола.

Методом светорассеяния липосомной суспензии оценивалась агрегация липосом в присутствии БР-А в зависимости от его концентрации. Вид полученных кинетических кривых свидетельствовал о том, что БР-А взаимодействует с липосомами из ЕРС и агрегирует их, что отражалось на увеличении светорассеяния. Однако, время жизни этого комплекса невелико: в течение 2-х минут он распадался, о чем свидетельствовало дальнейшее падение светорассеяния липосомной суспензии. Добавление новых порций БР-А практически картину не изменяло. Напротив, комплекс БР-А с липосомами из ЕРЬ был стабильным и распадался только в присутствии хелатора ионов кальция - ЭДТА.

Помимо агрегации, связывание 8Р-А с липосомами оценивали по степени тушения флуоресценции остатков триптофана белка ДМХ, встроенным в. мембрану липосом (рис 3). Константа тушения флуоресценции (К<з) рассчитывалась в соответствии с теорией Штерна-Фольмера как обратная величина концентрации .тушителя, при .которой интенсивность флуоресценции снижается на 50% (Ео/Е=2). белка самим ДМХ составляет 8,6 нМ"'. При инкубации же ' белка с ' липосомами, несущими мембраносвязанный ДМХ. скорость тушения возрастата, что отражается на увеличении Кс] до 110 нМ"'. При инкубации 8Р-А с липосомами из ЕРС, меченными ДМХ, стабильного тушения флуоресценции не наблюдалось.

Таким образом, проведенные исследования показали, что 8Р-А взаимодействует с липосомами из ЬРЬ и образует с ними стабильный комплекс, в отличие от липосом из ЕРС.

Одной из важнейших характеристик липидного бислоя является его фазовое состояние. Возможно, упаковка ненасыщенного ЕРС приводит к большой латеральной подвижности полярных головок, неустойчивому образованию липидных доменов, что и обуславливает слабое связывание ЯР-А с липосомами из ЕРС. Насыщенность ЖК ЕРЬ по сравнению с ЕРС больше всего на 15%, однако, за счет фосфолипидкого состава Тс липосом из ЕРЬ гораздо выше, чем липосом из ЕРС. Более жесткое положение фосфохолнионых групп п бислсе ЕРЬ, очевидно, способствует стабильному взаимодействию ЯР-А с этой липосомной мембраной.

ДМХ, цМ

Рис. 3. Тушение собственной флуоресценции SP-A р-диметиламинохалконом (ДМХ) и липосомами, меченнными ДМХ. К 1,8 мл раствора SP-A в HBS-Ca (33,3 мкг/мл HBS-Ca) последовательно добавляли по 5 мкл раствора ДМХ (40 мкг/мл HBS-Ca) или суспензии липосом (2 мг/мл) с тем же количеством ДМХ. После каждого добавления регистрировали значение интенсивности флуоресценции SP-A при длинах волн возбуждения 296 нм и эмиссии 354 им.

Роль SP-A в целенаправленной доставке липосом к клеткам изучалась на тучных клетках органной культуры медиастиналыюй плевры крыс с БО. и клетках миеломоноцитарпой линии «Wehi-З». При оценке состояния тучных клеток установлено, что под воздействием липосомного фенотерола на основе LPL в присутствии SP-A содержание тучных клеток в 1 мм2 поверхности плевры практически не изменяется по сравнению с аналогичным экспериментом без белка. Однако число дегранулирующнх клеток в присутствии SP-A снизилось в 1,7 раза. Одновременно наблюдалась тенденция к увеличению плотности цитошшматических гранул. Таким образом, SP-A усиливает мембраностабилизирующее действие фенотерола в липосомной форме на тучные клетки.

Как отмечено выше, липосомные формы фенотерола, в особенности на основе LPL, достоверно снижают активность NOS в миеломоноцитах. Мы исследовали этот пячястииыруштиЙ -»ффрит пяттгтппячт—ф^цлтяррг,? ря 0ГН"нС LPL В ПрИСуТСТВИИ различных концентраций SP-A. При этом реактивность клеток без SP-A принималась как-контрольная (100%). Присутствие SP-A в диапазоне концентраций 0,01-0,1 мкг/мл существенно не сказывается на эффективности липосомного фенотерола (рис.4). При инкубации клеток с липосомами в присутствии 1мкг/мл SP-A наблюдалось снижение

активности NOS, а также ROS па 14% и 17%, соответственно, по сравнению с экспериментом без белка. Еше больший эффект наблюдался в присутствии 10 мкг/мл SP-А, в этом случае NO-синтазная активность снизилась на 35%, a ROS на 45%.

40 -,-:--,

0,01 0,1 1 10 SP-A,мкг/мл

Рис. 4. Влияние липосомного фенотерола на основе LPL на активность NO-синтазы (NOS) и генерацию реактивных видов кислорода (ROS) клетками "Wehi-3" в присутствии различных конценраций SP-A. Клетки стимулировали обработкой ЛПС (1 мкг/мл) в течение 24 ч, активность NOS и ROS определялась через 24 ч после добавления липосом.

Итак, полученные результаты in vitro свидетельствуют о том, что SP-A .способен усиливать захват клетками липосом. Возможно, что этот эффект проявляется и in vivo. В респираторном тракте концентрация SP-A достаточно высока. Среднее содержание белка в БАС составляет 2,5 мкг/мл, однако его истинная концентрация в альвеолярной гипофазе, вероятно, гораздо выше, поскольку процедура получения БАС приводит к 10-100 кратному разбавлению действительного содержания компонентов бронхоальвеолярного секрета, iipn ингаляционном введении липосом из LPL эндогенный SP-A, вероятно, может связываться с ними. Затем, иммобилизованный на липосомах SP-A взаимодействует через специфические рецепторы с макрофагами и, таким образом, способствует более тесному контакту липосом с этими клетками. В результате осуществляется более быстрая доставка включенного в липосомы лекарственного препарата', в частности, Рг-адренергического агониста, соответствующим рецепторам на клеточной поверхности.

ВЫВОДЫ:

1. Получены различные липосомные формы фенотерола на основе фосфолшшдов легкого свиньи, яичного лецитина и смеси яичного лецитина с холестерином и дицетилфосфатом. Показано, что острая токсичность липосомного фенотерола, как минимум, в 15 раз меньше по сравнению со свободной его формой.

2. При аэрозольном введении целесообразно использовать малые одколамелляркые липосомы на основе суммарных фосфолшшдов легких свиньи. По сравнению с липосомами из яичного лецитина, они характеризуются более высоким процентом включения фенотерола и и более высокой степенью удерживания препарата.

3. Действие липосомных форм фенотерола исследовано на экспериментальной модели бронхообегрукции у крыс. При ингаляции липосомного фенотерола, в сравнении со свободным препаратом, уровень биомаркеров воспаления (гистамина, серотонина, МаЛОКОВОГО ДИаЛЬДСГИДЗ, МСТаиОЛИТОБ ОКИСИ аЗОТа) СуЩССТВСННО СНИЖаСТСЯ. В экспериментах in vitro на стимулированных миеломоноцитах отмечается большая продолжительность подавления активности индуцибельной NO-синтазы. Фенотерол, заключенный в липосомы из суммарных фосфолипидов легкого свиньи является наиболее эффективным в коррекции проявлений экспериментальной бронхообегрукции.

4. Биохимическая оценка эффективности липосомных форм фенотерола подтверждена гистофизиологическими данными. У крыс с моделью бронхообструкции липосомная форма фенотерола по сравнению со свободной формой препарата оказывает большее стабилизирующее действие на тучные клетки дыхательных путей. Эффект более выражен при включении фенотерола в липосомы из фосфолипидов легкого.

6. Эффективность липосомной формы фенотерола на основе яичного лецитина усиливается при включении в состав мембраны, с одной стороны, холестерина для повышения микровязкости бислоя и, с другой стороны, дицетилфосфата для увеличения отрицательного поверхностного заряда. Биофизическое состояние липидного бислоя липосом из суммарных фосфолипидов легкого свиньи, в отличие от липосом из яичного лецитина, характеризуется близкой к физиологической температуре точкой фазового перехода и оптимальным отрицательным поверхностным зарядом.

7. Гурфяь-тяитный fiptrnu- а (^Р-А) ирпдртгд чцгтгртл^Уучгтрмпм^пшц^уплй r nnnTflRKP. липосомных форм фенотерола из суммарных фосфолипидов легкого свиньи к клеткам дыхательных путей - тучным клеткам и представителям системы мононуклеарных фагоцитов. В его присутствии, под воздействием липосомного фенотерола, более выражено снижение количества деграиулирующих форм тучных клеток, уменьшаются

активность индуцибельной NO-синтазьг и концентрация реактивных форм кислорода в стимулированных мнеломоноцитах.

8. Стабильность взаимодействия липосом с SP-A зависит от микровязкости липидного бислоя липосомной мембраны. SP-A слабо связывает липосомы из яичного лецитина с низкой температурой фазового перехода липидов и образует долгоживущий комплекс с липосомами из фосфолипидов легкого свиньи, у которых этот параметр более высокий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Arkhipenko I., Podgorbunskaya (Koryakova) A., Geltser В., Lukyanov P. Detnnination of acute toxicity of the liposomal fomi of fenoterol //Abs. The Third International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange Foundation and the Japan-Russia Medical Collaborative Organization on the Methods and Processes of Japan-Russia Medical Exchange. Osaka, Japan. 1995. P.27.

2. .Архипенко И.В., Гельцер Б.И., Подгорбунская (Корякова) А.Г., Лукьянов П.А. Сравнение терапевтической эффективности свободной и липосомалыюй форм фенотерола // Материалы юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию медицинской службы Дальневосточного бассейна. Владивосток, 1996. С.74-76.

3. Архипенко И.В., Гельцер Б.И., Корякова А.Г., Лукьянов П.А. Влияние липосомальной формы фенотерола на функциональную активность тучных клеток // Сборник резюме III Национального конгресса «Человек и лекарство». Москва. 1996. СЛ.

4. Гельцер Б.И., Архипенко И.В., Невзорова В.А., Корякова А.Г., Лукьянов П.А. Аутологичные липосомы — наиболее эффективный носитель лекарственных средств // Там же. С. 16.

5. Архипенко И.В., Гельцер Б.И., Подгорбунская (Корякова) А.Г. Регуляция функции тучных клеток органов дыхания липосомальным фенотеролом// Сборник резюме 6-го Национального конгресса по болезням органов дыхания. Новосибирск. 1996. С.8.

6. Гельцер Б.И., Архипенко И.В., Подгорбунская (Корякова) А.Г., Невзорова В.А. Реакция тучных клеток на введение фенотерола в свободной и инкапсулированной в липосомы формах // Там же. С. 361.

7. Geltser В., Motavkin P., Arkliipenco I., Podgorbunskaya (Koryakova) A., Lukyanov P. The effect of the liposomal form of fenoterol on the state of mast cell at bronchial asthma //XV-th word congress of asthmology. Montpellier, France. 1996. P.91.

8.Корякова А.Г., Кобелев C.C., Кулакова H.B., Невзорова В.А., Лукьянов П.А. Биофизические параметры терапевтической эффективности липосомалыюй формы фенотерола//Материалы 11 Дальневосточной региональной конференции с всероссийским

участием «Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке. Владивосток. 1998. С.26-27.

9.Корякова А.Г., Архипенко И.В.. Невзорова В.А., Гельцер Б.И., Лукьянов П.А. Сурфактантный протеин А как векторная молекула при взаимодействии липосом с. клетками-мишенями // Там же. С.28.

10. Корякова А.Г., Хоменко A.B., Лукьянов П.А., Нежевая Е.К., Невзорова В.А. Активная роль сурфактантного белка А в векторной доставке липосомных форм фенотерола клеткам-мишеням // Тез. докл. II съезда биофизиков России. Москва. 1999. С.518-519.

11. Arkhipenco I., Koryakova A., Lukyanov P.,Geltser В. Surfactant protein A as the vector in the liposomal cellular interaction//Eur. Respir. J., 1999. V.12.P.175.

12. Корякова А.Г., Кулакова H.B., Кобелев C.C., Нежевая Е.К., Хоменко A.B., Невзорова В.А., Гельцер Б.И., Лукьянов П.А. Некоторые аспекты терапевтической эффективности липосомальяых форм фенотерола// Тихоокеанский медицинский журнал. 1999..Ks 2. С.32-34.

13. Корякова А.Г., Кулакова II.В., Кобелев С.С., Невзорова В.А., Гельцер Б.И., Лукьянов П.А. Биохимическая оценка эффективности липосомных форм фенотерола // Химико-фармацевтический журнал.2000.№6.С.З-5.

14. Корякова А.Г., Лукьянов П.А., Хоменко A.B. Роль сурфактантного протеина А в векторной доставке липосом к клеткам // Биологические мембраны. 2000. (в печати).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Корякова, Анжела Григорьевна

Введение

Список сокращений

Глава 1. Проблемы и перспективы использования липосом для направленного транспорта лекарств к органам дыхания

1.1 .Строение липосом и способы их получения

1.2.Применение липосом в пульмонологии

1.3 .Взаимодействие липосом с клетками-мишенями дыхательных путей 2 5 1.4. Состав и молекулярные взаимодействия сурфактантной системы легких

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Получение липосомной формы фенотерола

2.2. Экспериментальные модели и биологические объекты

2.3. Исследование острой токсичности липосомного фенотерола

2.4. Ингаляционное введение препаратов животным с экспериментальной моделью бронхообструкции

2.5. Выделение БР-А из биологических объектов

2.6. Биохимические исследования

2.7. Биофизические исследования

2.8. Морфологические исследования

2.9. Статистическая обработка результатов

Глава 3. Биохимическая оценка эффективности липосомных форм фенотерола

3.1. Степень инкапсуляции фенотерола в липосомы и стабильность его липосомных форм

3.2. Острая токсичность липосомной формы фенотерола

3.3.Биохимическое исследование БАС крыс с экспериментальной моделью бронхообструкции до и после воздействия липосомных форм фенотерола

3.4. Влияние фенотерола и липосомных препаратов на активность N08 мышиной миеломоноцитарной линии клеток «\УеЫ-3»

Глава 4. Влияние липосомных форм фенотерола на состояние тучных клеток органов дыхания крыс с экспериментальной моделью бронхообструкции

4.1. Общая характеристика тучных клеток органов дыхания крыс в норме и при экспериментальной БО

4.2. Состояние тучных клеток после воздействия фенотерола

4.3. Состояние тучных клеток после воздействия липосом из ЕРС и ЬРЬ

4.4. Состояние тучных клеток после воздействия липосомных форм фенотерола

Глава 5. Роль биофизических параметров липидного бислоя в эффективности липосомных форм фенотерола

5.1. Фосфолипидный состав липосом и его связь с биофизическими параметрами липидного бислоя

5.2 Связь эффективности липосомных форм фенотерола в коррекции проявлений экспериментальной бронхообструкции с биофизическим состоянием липидного бислоя липосом

Глава 6. Роль сурфактантного белка А в векторной доставке липосомных форм фенотерола

6.1. Взаимодействие БР-А с липосомами

6.2. Влияние 8Р-А на эффективность действия липосомных форм фенотерола 93 Обсуждение 97 Выводы 115 Литература 117 Приложение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимическая характеристика эффективности липосомных форм фенотерола"

Успешное применение лекарств для лечения или предотвращения заболеваний во многом зависит от их селективности. Вопрос доставки лекарственного препарата в место его действия без побочных эффектов на остальные органы до сих пор остается открытым. В настоящее время признано, что одним из универсальных носителей, увеличивающих эффективность лекарственных средств, снижающих их токсичность и системное действие, являются липосомы.

Исследования последних лет открывают перспективу использования липосомных аэрозолей для лечения болезней органов дыхания. Эпидемиологические сведения во многих странах об увеличении летальных исходов бронхиальной астмы в результате использования агонистов (32-адренорецепторов вызвали широкую дискуссию по поводу эффективности и безопасности антиастматических лекарственных средств. Использование липосомной формы ингаляционных (32-агонистов, возможно, окажется новым направлением в совершенствовании препаратов данного класса.

Создание наиболее оптимальной и стабильной липосомной формы препарата обеспечивает широкая возможность выбора величины, структуры и липидной композиции везикул. Специфичность липидного состава липосом в значительной степени определяет механизм и степень их связывания с клетками. В ряде работ отмечалось, что наибольший контакт липосом с клетками достигается при формировании липосом из фосфолипидов тканей-мишеней [55,57]. В связи с этим становится очевидной высокая аффинность липосом, полученных на основе фосфолипидов легкого теплокровных к клеткам бронхиального дерева, что позволит использовать их в качестве носителя бронхолитических препаратов.

Стратегия направленного транспорта липосом заставляет обратить внимание на типы соединений, способных служить векторами в доставке везикул к клеткам-мишеням. Одна из морфофункциональных особенностей дыхательных путей - наличие сурфактанта легких, главной белковой составляющей которого является сурфактантный белок A (SP-A), относящийся к семейству коллагеновых лектинов. Уникальные свойства этой молекулы привлекают к ней большой интерес исследователей в последние годы. SP-A участвует в процессах организации сурфактантных мембранных структур, обладая свойствами для связывания, транспорта и даже сортировки легочных фосфолипидов [135]. В то же время, SP-A взаимодействует через специфические рецепторы с некоторыми клетками (альвеолярными макрофагами, моноцитами, альвеолоцитами), увеличивает фагоцитарную активность макрофагов [111, 211]. При таком сочетании функций, вероятно, существует потенциальная возможность активного участия эндогенного SP-A в доставке липосом к клеткам дыхательных путей. Этот вопрос в настоящее время не изучен. Однако исследования в этом направлении могут оказаться полезными в понимании механизма взаимодействия липосом с клетками респираторного тракта, что в свою очередь укажет пути повышения эффективности липосомных лекарственных форм в терапии заболеваний органов дыхания.

Список сокращений

АНС - 1,8-анилиннафтолсульфокислота

БА - бронхиальная астма

БАС - бронхоальвеолярный смыв

БО - бронхообструкция

ДМХ - /7-диметиламинохалкон

ДФГТ -1,6- дифенил-1,3,5-гексатриен

МДА - малоновый диальдегид

MJIJI - мультиламеллярные липосомы

МОЛ - малые одноламеллярные липосомы

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СФ - сфингомиелин

ФГ - фосфатидилглицерин

ФИ - фосфатидилинозит

ФС - фосфатидилсерин

ФХ -фосфатидилхолин

ФЭ - фосфатидилэтаноламин

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

CRD - углевод-узнающий домен

DCP - дицетилфосфат

ЕРС - яичный фосфатидилхолин

Кс - константа связывания флуоресцентного зонда с мембраной

Kq- константа тушения флуоресценции

LPL - фосфолипиды легкого свиньи

N - число мест связывания зонда с мембраной

NOS - нитроксид-синтаза

ROS - активные формы кислорода

SP-A - сурфактантный белок А

Тс - температура фазового перехода б

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Корякова, Анжела Григорьевна

ВЫВОДЫ:

1. Получены различные липосомные формы фенотерола на основе фосфолипидов легкого свиньи, яичного лецитина и смеси яичного лецитина с холестерином и дицетилфосфатом. Показано, что острая токсичность липосомного фенотерола, как минимум, в 15 раз меньше по сравнению со свободной его формой.

2. При аэрозольном введении целесообразно использовать малые одноламеллярные липосомы на основе суммарных фосфолипидов легких свиньи. По сравнению с липосомами из яичного лецитина, они характеризуются более высоким процентом включения фенотерола и и более высокой степенью удерживания препарата.

3. Действие липосомных форм фенотерола исследовано на экспериментальной модели бронхообструкции у крыс. При ингаляции липосомного фенотерола, в сравнении со свободным препаратом, уровень биомаркеров воспаления (гистамина, серотонина, малонового диальдегида, метаболитов окиси азота) существенно снижается. В экспериментах in vitro на моноцитах отмечается большая продолжительность подавления активности индуцибельной NO-синтазы, экспрессированной в клетках в ответ на действие стимулирующих факторов. Фенотерол, заключенный в липосомы из суммарных фосфолипидов легкого свиньи является наиболее эффективным в коррекции проявлений экспериментальной бронхообструкции.

4. Биохимическая оценка эффективности липосомных форм фенотерола подтверждена гистофизиологическими данными. У крыс с моделью бронхообструкции липосомная форма фенотерола по сравнению со свободной формой препарата оказывает большее стабилизирующее действие на тучные клетки дыхательных путей. Эффект более выражен при включении фенотерола в липосомы из фосфолипидов легкого.

6. Эффективность липосомного носителя тем больше, чем ближе его биофизические параметры к таковым у клеточной мембраны теплокровных. Лечебное действие липосомной формы фенотерола на основе яичного лецитина усиливается при включении, с одной стороны, холестерина для повышения микровязкости бислоя и, с другой стороны, дицетилфосфата для увеличения отрицательного поверхностного заряда. Биофизическое состояние липидного бислоя липосом из суммарных фосфолипидов легкого свиньи, в отличие от липосом из яичного лецитина, характеризуется близкой к физиологической температурой фазового перехода липидов и оптимальным отрицательным поверхностным зарядом.

7.Сурфактантный белок А (8Р-А) является эндогенной векторной молекулой в доставке липосомных форм фенотерола из суммарных фосфолипидов легкого свиньи к клеткам дыхательных путей - тучным клеткам и представителям системы мононуклеарных фагоцитов. В его присутствии, под воздействием липосомного фенотерола, более выражено снижение количества дегранулирующих форм тучных клеток, уменьшается активность индуцибельной >Ю-синтазы и концентрация реактивных форм кислорода в стимулированных моноцитах.

8. Стабильность взаимодействия липосом с БР-А зависит от микровязкости липидного бислоя липосомной мембраны. ЭР-А слабо связывает липосомы из яичного лецитина с низкой температурой фазового перехода липидов и образует долгоживущий комплекс с липосомами из фосфолипидов легкого свиньи, у которых этот параметр более высокий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Корякова, Анжела Григорьевна, Владивосток

1. Абросимов В.Н., Порядин Г.В. Воспаление и гиперреактивность дыхательных путей при бронхиальной астме // Тер. арх., 1994. №11. С. 60-64.

2. Ахмеджанова С.Б., Балаболкин И.И., Васильева Е.М. Определение гистамина и серотонина в цельной крови методом высокоэффективной жидкостной хромотографии // Лабораторное дело. 1991, №11, с. 10-13.

3. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В, Молотковский Ю.Г. и др Препаративная биохимия липидов. М.: Наука, 1981. 260 с.

4. Березовская Л.Н, Грязнова Н.С., Баирашвили Д.И., Яроцкий СВ. Проблема создания липосомных лекарственных форм антибиотиков // Антибиотики и химиотерапия, 1990. Т.10. С. 31-35.

5. Болевич С.С., Даниляк И.Г., Коган А.Х. и др. Роль свободнорадикальных процессов в патогенезе бронхиальной астмы // Пульмонология. 1995. №1. С.18-23.

6. Болезни органов дыхания. Под ред. Палеева Н.Р. М. Медицина, 1989. 640 с.

7. Бронхиальная астма. Глобальная стратегия. Совместный доклад НИЗ (США) и ВОЗ (1993) // Пульмонология. 1996. Приложение. С. 1-165.

8. Брыгинский С.А., Зубаренко A.B., Лишко В.К. и др. Применение липосом для коррекции респираторной гипоксии при экспериментальной пневмонии//Бюлл. эксперим. биол. мед., 1988. Т.106. №10. С. 421-423.

9. Бурлакова Е.В., Архипова Г.В., Молочкина Е.М. Мембрана как интегратор клеточного метаболизма // V Всесоюзный биохимический съезд. Тез. докл. М., 1986. Т.2. С. 181-182.

10. Ванин А.Ф., Меньшиков Г.Б., Мордвинцев П.И. и др. Образование окиси азота в активированных макрофагах //Бюлл. эксп. биол. мед. 1991. № 6. С.588-590.

11. Виноградов В.В., Воробьева Н.Ф. Тучные клетки. Новосибирск: Наука, 1973. 127с.

12. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М., Наука, 1972. 252 с.

13. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука, 1980. 274 е.

14. Вознесенский H.A., Чучалин А.Г., Антонов Н.С. Окись азота и легкие //Пульмонология. 1998. №2. С.6-11.

15. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. М.: Медицина, 1982. 304 с.

16. Волкова О.В., Шахламова В.А., Миронова A.A. Атлас сканирующей электронной микроскопии клеток, тканей и органов. М.: Медицина, 1987. 464с.

17. Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль JIM. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой //Вопр. мед. химии. 1987. Т.37. №1. С. 118122.

18. Гембицкий Е.В., Синопальников А.И., Алексеев В.Г. Возможности и ограничения применения ингаляционных симпатомиметиков у больных бронхиальной астмой в старших возрастных группах // Тер. арх., 1988. №1. С. 131-134.

19. Голубчикова H.A., Сидоров В.М., Крейнес Т.Н. Взаимодействие липосом различного состава с компонентами сыворотки крови // Вестн. АМН СССР, 1990. №6. С.36-44.

20. Горячкина JI.A., Ненашева Н.М., Пужко С.Г. и др. Опыт применения дитека в клинике аллергических заболеваний // Тер. арх., 1994. №3. С. 19-23.

21. Грегориадис Г., Аллисон А. Липосомы в биологических системах. М. Медицина, 1983. 384с.

22. Дарбре А. Практическая химия белка. М.: Мир. 1989.

23. Демчук Е.С., Демчук В.М. Побочное влияние беротека // Врач, дело, 1982. №9. С. 90-91.

24. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М.: Наука. 1989. 277 с.

25. Ивков В.Т, Берестовский Т.Р. Липидный бислой биологических мембран. М.: Наука, 1982. 294 с.

26. Караулов A.B., Сильвестров В.П., Помойнецкий В.Д. и др. Роль эйкозаноидов: простагландинов, простациклина, тромбоксана и лейкотриенов в патогенезе бронхиальной астмы и других заболеваний легких // Тер. архив. 1986. №3. С.123-130.

27. Кейтс М. Техника липидологии. М., Мир, 1975. 324 с.

28. Кобринский Г.Д. Липосомы транспортеры лекарств (Новое в жизни, науке, технике). Сер. "Медицина". М.: Знание, 1989. №2. 64 с.

29. Кокосов А.Н., Гольденберг Ю.М., Мищенко В.П. Перекисное окисление липидов и гемостаз на этапах формирования хронического бронхита и бронхиальной астмы //Пульмонология. 1995. №1.С. 38-40.

30. Краснопольский Ю.М., Степанов А.Е., Швец В.И. Некоторые ^аспекты технологии получения липосомных форм лекарственных препаратов //Хим -фарм. ж. 1999. Т.ЗЗ. № Ю. С.20-23.

31. Крейнес В.М., Мельникова В.М., Марголин Я.М. и др. Противовоспалительные эффекты липосом // Вестн. АМН СССР. 1990. №6. С. 44-47.

32. Крепе Е.М. Липиды клеточных мембран. Л., 1981.

33. Кубышкин A.B. Значение свободнорадикального окисления в развитии ронхолегочныхзаболеваний//Сов. медицина, 1989. №6. С. 26-30.

34. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1968. 287 с.

35. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир. 1986. 496 с.

36. Ландышев С.Ю. Микровязкость мембран эритроцитов у больных остротекущей и затяжной пневмонией и ее коррекция фосфолипосомами // Пульмонология, 1993. № 2. С. 66-69.

37. Лахтин В.М. Лектины в исследовании углеводной части гликопротеинов и других природных гликоконъюгатов //Биохимия. 1995. Т.60. вып.2. С. 187-217.

38. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир. 1974. 958 с.

39. Линдер Д.П., Поберий И.А., Розкин М.Я., Ефимов B.C. Морфометрический анализ популяции тучных клеток // Арх. патологии, 1980. №6. С. 60-64.

40. Лишко В.К., Шевченко М.И. Мембраны и жизнь клетки. К.: Наук, думка, 1987. 104 с.

41. Любешкин A.B., Себякин Ю.Л. Проблемы структурного моделирования плазматических мембран на основе липосом: стабильность и направленный транспорт in vivo II Успехи биологической химии, 1994. С. 131165.

42. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М.: Наука, 1986. 240 с.

43. Масуев К.А., Сиротин Е.А., Лимаренко Е.А. Двойное слепое исследование эффективности фосфолипидных липосом в лечении бронхообструктивного синдрома//Пульмонология, 1993. № 4. С. 51-55.

44. Маянский А.И., Маянский Д.И. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск. 1989.

45. Мотавкин П.А., Пиголкин Ю.И., Каминский Ю.В. Гистофизиология кровообращения в спинном мозге. М.: Наука, 1994. 233с.

46. Накачаки М. Физическая химия мембран. М., 1991.

47. Невзорова В.А., Зуга М.В., Гельцер Б.И. Роль окиси азота в регуляции легочных функций // Тер. архив. 1997. №3. С. 68-73.

48. Несытова Н.Ю., Палева Н.С., Ильина Е.В. и др. Тенденции в развитии исследований в области липосом (обзор патентной литературы) // Вестн. АМН СССР, 1990. №6. С. 8-19.

49. Новикова Р.И., Черний В.И., Стефанов A.B., Ахланова Ю.И. Липосомы в комплексном лечении больных с хроническим обструктивным бронхитом // Тер. арх., 1993. №3. С. 40-43.

50. Ноников Д. От беротека до беродуала // Мед. газ. №41. 2.06.95. С. 18.

51. Посте Дж. Взаимодействие липосом с клетками в культуре и их использование как переносчиков лекарств и макромолекул. В кн.: Липосомы в биологических мембранах / Г. Грегориадис, А. Аллисон. М.: Медицина, 1983. С. 107-155.

52. Потапнев М.П., Печковский Д.В. Молекулярные механизмы иммунопатологии при бронхиальной астме // Пульмонология. 1998 . №3. С. 6873.

53. Реутов В.П., Каюшин Л.П., Сорокина Е.Г. Физиологическая роль цикла окиси азота в организме человека и животных // Физиология человека и животных. 1994. Т.20. № 3. С. 165-174.

54. Розенберг O.A., Бекренева В.Ю., Лошакова Л.В. и др. Специфичность захвата липосом из липидов клеток-мишеней //Бюлл. эксперим. биол. мед. 1984. № 6. С. 670-672.

55. Романова Л.К., Овчаренко С.И., Младковская Т.Б. и др. Особенности клеточных реакций в легких во время обострения бронхиальной астмы.// Пульмонология. 1992. №1. С. 20-27.

56. Саатов Т.С., Исаев Э.И., Бурханов С.А. Аутологичные липосомы // Вестн. АМН СССР, 1990. №8. С.47-49.

57. Саликаева Ю.О., Волкова Л.И., Плешко Р.И. и др. Характеристика бронхиальных смывов у больных с различными формами бронхиальной астмы и хроническим обструктивным бронхитом // Пульмонология. 1998. №2. С. 5963.

58. Сибиряк C.B., Сергеева С.А., Хлоиушина Т.Г. и др. Влияние различных по составу липополисахаридов граммотрицательных бактерий на активность макрофагов //Бюлл. эксп. биол. мед. 1998. №2. С.183-186.

59. Скипский И.М., Березный Е.А., Скипская Л.Г. и др. Влияние бета-2-агонистов на ритм сердца у больных гипертонической болезнью и ишемической болезнью сердца // Кардиология: успехи, проблемы и задачи. Санкт-Петербург, 1993. С. 345-346.

60. Скипский И.М., Скипская Л.Г. Клинические эффекты в2-адреномиметиков //Клиническая фармакология и терапия, 1995. №4. С. 83-88.

61. Стефанов A.B., Пожаров В.П., Миняйленко Т.Д. и др. Биологический эффект липосом при гипоксических состояниях различной этиологии // Вестн. АМН СССР, 1990. №6. С. 47-51.

62. Сыновец O.A., Лапшин Д.Е., Руденко Ю.В. О перспективах использования липосом в медицинской практике // Врачебное дело, 1991. №6. С. 16-18.

63. Федосеев Г.Б., Жихарев С.С., Гончарова В.А. и др. Роль серотонина, гистамина и калликреин-кининовой системы в патогенезе приступов удушья при бронхиальной астме //Тер. архив. 1992. №1. С. 47-53.

64. Федосеев Г.Б. Механизмы обструкции бронхов. С.-Петербург, 1995. 333с.

65. Фендлер Дж. X. Оптимизация включения лекарственных препаратов в липосомы. Химические и биофизические подходы. В кн.: Липосомы в биологических мембранах / Г. Грегориадис, А. Аллисон. М.: Медицина, 1983. С. 94-106.

66. Фрешни Р. Культуры животных клеток. Методы. М., Мир, 1989. 333 с.

67. Хасина М.А. Регионарная топография липидов лекгих и сурфактанта и ее связь с локализацией патологических процессов. Дисс.доктора мед. наук. Л. 1989.

68. Хышиктуев Б.С., Иванов В.Н., Соловьева Н.В. и др. Показатели перекисного окисления липидов в конденсате выдыхаемого воздуха простой иобъективный метод оценки повреждений в сурфактантной системе легких // Лаб. дело. 1990. №5. С. 18-21.

69. Цой А.Н., Гавриленко Л.Н., Титова Е.В. Профилактическое действие аэрозолей дитека на бронхоспазм, вызываемый физическим напряжением // Пульмонология. 1993. №1. С. 62-65.

70. Цой А.Н. Эффективность и небезопасность применения антиастматических лекарственных средств //Тер. архив. 1998. №3. С. 81-84.

71. Черняк A.B., Княжеская Н.П., Волошина И.А. и др. Эффективность сальметерола при длительной терапии у больных бронхиальной астмой// Пульмонология. 1996. №1. С. 47-50.

72. Черток В.М., Коцюба А.Е. Поверхность тканевых базофилов перитонеальной жидкости крыс (данные сканирующей электронной микроскопии)//Морфология, 1992. №1. С.84-90.

73. Швец В.И., Краснопольский Ю.М. Липиды в лекарственных препаратах // Вестн. АМН СССР, 1990. №6. С. 19-28.

74. Шихнебиев Д. А. Гиперчувствительность и гиперреактивность холинергических рецепторов бронхов и неспецифические заболевания легких // Пульмонология, 1994. №2. С. 89-92.

75. Шевченко Е.В., Смирнова Е.Ю., Какушкина М.А. и др. Фазовый переход липидов как способ регулирования проницаемости липосом //Фармация, 1993. № 3. С. 7-13.

76. Юхимец В.А. Когосова Л.С. Клинико-иммунологические аспекты применения липина у больных неспецифическими заболеваниями легких // Пульмонология, 1993. №4. С. 56-59.

77. Abrains М.Е. Isolation and quantitative estimation of pulmonary surface active lipoprotein //J. Appl. Physiol.1966. Vol.21. №6. P. 718-720.

78. Agarwal A., Kandpan H., H.P. et.al. Tuftsin-bearning liposomes as rifampin vehicles in treatment of tuberculosis in mice //Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1994. Vol.38. №3. P. 588-593.

79. Agostini C., Chilosi M., Zambello R. et.al. Pulmonary immune cells in health and disease: lymphocytes //Eur. Respir. J. 1993. Vol.6. P. 1378-1401.

80. Ahmad I., Sarkar A.K., Bachhawat B.K. Effect of cholesterol in varios liposomal composition on the in vivo toxicity, therapeutic efficasy and tissue distribution of amfotericin B //Biotechnol. Appl. Biochem. 1990. Vol.12. №5. P. 550556.

81. Andersson P. Antigen-induced bronchial anaphylaxis in actively sensitized guinea pigs // Allergy. 1980. Vol.35. P. 65-71.

82. Asthma mortality: summary of round-table discussion, New York, January 1997//Eur. Respir. J. 1999. Vol.13. P. 221-224.

83. Ausborn M., Nuhn P., Schreier H. Stabilization of liposomes by freeze-thaw and lyophilization techniques: problems and opportunities //Eur. J. Pharmaceut. 1992. Vol.38. P. 133-139.

84. Barker S.A., Taylor K.M., Short M.D. The deposition and clearance of liposome entrapped Tc-dtPA in the human respiratory tract // Int. J. Pharm., 1994. Vol. 102, p. 159-165.

85. Batzri S., Korn E.D. Single bilayer liposomes prepared without sonication //Biochim. Biophys. Acta.1973. Vol.298. P. 1015-1019.

86. Bentzmann S. G., Pierrot D., Fuchey C. et al. Distearoyl phosphatidylglycerol liposomes improve surface and transport properties of CF mucus//Eur. Resp. J. 1993. №6. P. 1156-1161.

87. Betagery G.V., Burrell L.S. Stability of antibody-bearing liposome containning dideoxynosine triphosphate IIInt. J. Pharmaceut. 1993. Vol.98. P. 149155.

88. Blume G., Cevc G. Molecular mehanisn of the lipid vesicle longevity in vivo //Biochim. Biophys. Acta. 1993. Vol. 1146. P. 157-168.

89. Broun-Augsburgen P., Hartshorn K., Chang D. et. al. Site-direct mutagenesis of Cys-15 and Cys-20 of pulmonary surfactant protein D //J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 13724-13730.

90. Brusasco V., Ringdal N, Ekstrom et T. al.Effect of fenoterol 6 mg B.I.D.via turbuhaler for 3 mouths in asthma: comparison with terbutaline and placebo // Eur. Resp. J. 1995. Vol. 8. Sept. Suppl. 19. P. 158S.

91. Burnett I., Donnell D., Oliver S.D. Effects of single doses of a new long-acting B2-agonist, TA-2005, in healthy, male subjects // Eur. Resp. J. 1995. Vol. 8. Sept. Suppl. 19.P. 258S. (Abstract).

92. Clarck J.C., Wert S.E., Bachurski C.J. et. al. Targeted disruption of the surfactant protein B gene disrupts surfactant homeostasis, causing respiratory failure in newborn mice //Proc. Natl Acad. Sci. USA 92. 1995. P. 7794-7798.

93. Clarke P.S., Ratowsky D.A. Effects of fenoterol hydrobromide and sodium cromoglycate individually and in combination on postecercise asthma // Ann. Allergy. 1990. Vol. 64. №2. Pt. 2. P. 187-190.

94. Clarke's Isolation and identification of drugs. London. The Pharmaceutical Press. 1986. Vol.2. P. 616.

95. Clerex A., Vandenbussche G., Curstedt T. et. al. Structural and functional importance of the C-terminal part of the pulmonary surfactant protein SP-C //Eur. J. Biochem. 1995. Vol. 229. P. 566-568.

96. Cochrane G.V. Bronchial asthma and the role of B2-agonists // Lung. 1990. Vol. 168. Suppl. P. 66-70.

97. Cochrane C.G., Revak S.D. Pulmonary surfactant protein B: structure-functional relationships // Science. 1991. Vol. 254. P. 566-568.

98. Crane J., Burgess C., Pearce N., Beasley R. The B2-agonist controversy: a perspective // Eur. Respir. Rev. 1993. Vol. 3. №15. P. 475-482.

99. Chroneous Z.C., Abdolrasulnia R., Whitsett J.A., Rice W.R., Shepherd V.L. Purification of a cell-surface receptor for surfactant protein All J. Biol. Chem.1996. Vol. 271. P. 16375-16383.

100. Dahl R. Comparative studies of inhaled salmeterol with other bronchodilators //Eur. Respir. Rev., 1995. Vol. 27, №5, p. 138-141.

101. Deol P.,Khuller G.K. Lung specific stealth liposomes: stability, biodistribution and toxicity of liposomal anitubercular drugs in mice // Biochim. Biophys. Acta. 1997. Vol. 1334. P. 161-172.

102. Dethloff L.A., Gilmore L.B., Brody A.R., Hook G.E.R. Induction of intra-and extra-cellular phospholipids in the lungs of rats exposed to silica // Biochim. J. 1986. Vol. 233. P. 111-118.

103. Donnell D., Burnett I., Oliver S.D. Bronchodilator activity of single doses of a new long-acting B2-agonist, TA-2005, in male asthmatics // Eur. Resp. J. 1995. Vol.8. Sept. Suppl. 19. P. 258S.

104. Emanuel N., Kedar E., Bolotin E.M. et. al. Targeted delivery of doxorubicin via sterically stabilized immunoliposome pharmacokinetiks and biodistribution in tumor-bearning mice //Pharmaceut. Res. 1996. Vol.13. №6. P. 861868.

105. Farr S.J.,. Kellaway IW., Parry-Jones D.R. et al.Technetium as a marker of liposomal deposition and clearance in the human lung // Int. J. Pharm., 1985. Vol. 26, p. 303-316.

106. Fielding R.F. Delivery of drags to the lungs and systemic circulation via inhaled liposome formulation // Proc. Western Pharmacol. Soc. 1989. Vol. 32. P. 103-106.

107. Freeman B.A. Nitric oxide: a central regulatory species in pulmonary oxidant reactions // Am. J. Physiol.1995. Vol. 268. №12. P. L697-L698.

108. Gabison A., Papahadjiopoulos D. The role of surface charge and hydrophilic groups on liposome clearance // Biochim. Biophys. Acta. 1992. Vol. 1130. P. 94-100.

109. Gao X., HuangL. Cationic liposome-mediated gene-transfer //Gene Therapy. 1995. Vol. 2. № 10. P. 710-722.

110. Gaynor C.D., McCormac F.X., Voelker D.R. et. al. Pulmonary surfactant protein A mediated enhanced phagocytosis of mycobacterium tuberculosis by a direct interaction with human macrophages//J. Immunology. 1995. Vol. 155. P. 5343-5351.

111. Geertsma M.F., Nibbering P H., Haagsman H.P. et. al. Binding of Surfactant protein A to Clq receptor mediates phagocytosis of Staphylococcus aureus by monocytes //Am. J. Physiol. 1994. Vol. 267. № 11. P. L578-L584.

112. Gilbert B. E., Six H.R., Wilson S.Z. et. al. Small particle aerosols of enviroxime-containing liposomes //Antiviral Res. 1988. № 9. P. 355-365.

113. Girod de Bentzmann S., Pierrot D., Fuchey C. et al. Distearoyl phosphatidylglycerol liposomes improve surface and transport properties of CF mucus //Eur. Resp. J. 1993. №6. P. 1156-1161.

114. Grainger. J., Woodman K., Pearce N. et al.Prescribed fenoterol and death from asthma in New Zealand, 1981-1987: a furter case control study // Thorax. 1991. Vol. 46. P. 105-111.

115. Goins B., Phillips W.T., Klipper R. Blood-pool imaging using Tc-99m-labeled liposomes //J. Nuclear Medcine. 1996. Vol.37. №8. P. 1374-1379.

116. Goldbach P., Brochart H., Stamm A. Spray-drying of liposomes for a pulmonary administration //Drug Development and Industrial Pharmacy. 1993. Vol.19. P. 2611-2636.

117. Goldbach P., Dumont S., Kessler R. et. al. In-situ activation of mouse alveolar macrophages by aerosolized liposomal INF-Gamma and muramil tripeptide //Am. J. Physiol. 1996. Vol.14. №3. P. L429-L434.

118. Gonda I. Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract //Therap. Drug Carrier Syst. 1990. №6. P. 273-313.

119. Gonzalez-Rothi R.J., Straub L., Cacace J.L. et al. Liposomes and pulmonary alveolar macrophages: functional and macrophagic interaction // Exp. Lung Res. 1991. Vol. 17. P. 687-705.

120. Gonzalez-Rothi R.J., Suarez S., Hochhaus G., Schreir H. et. al. Pulmonary targeting of liposomal triamcinolone acetonide phospate //Pharmaceut. Research/ 1996. Vol.13. № 11. P. 1699-1703.

121. Goren D., Horowitz A.T., Zalipsky S. et. al.Targeting of steals liposomes to erbB-2 (Her/2) receptor in-vitro and in-vivo studies. // British J. Cancer. 1996. Vol. 244. P. 675-693.

122. Gupta A., Majumdar S,Sanyal S.N. Effect of lung surfactant liposomes on the rabbit fetal lung type-II cell antioxidant enzymes following prenatal dexametasone treatment//Res. Exp. Med. 1996. Vol.196. № 1. P. 67-76.

123. Haagsman H.P., White R.T, Schilling J. et.al. Studies of the structure of lung surfactant protein Sp-A //Am. J. Physiol. 1989. Vol. 257. №6. P. L421-L429

124. Hattori A., Kuroki Y., Sohma H. Human surfactant protein A with two distinct oligomeric structures which exibit different capacities to interact with alveolar type II cells //Biochem. J. 1996. Vol. 317. P. 939-944.

125. Hawgood S, Efrati H, Schilling J. et. al. Chemical characterization of lung surfactant apoproteins: amino acid composition, N-terminal sequence and enzymic digestion. //Biochem. Soc. Trans. 1985. Vol. 13. P. 1092-1096.

126. Heard B. E., Nunn A.J, Kay A.B. Mast cells in human lungs // J. Pathol. 1989. Jan. Vol. 157. №1. P. 59-63.

127. Higham M.A, Sharara A.M., Wilson P. et al. Dose-equivalence of salmeterol and salbutamol in protection against methacholine challence in asthma // Eur. Resp. J. 1995. Vol. 8. Sept. Suppl. 19. P. 260S. (Abstract).

128. Holgate S.T. Asthma: past, present and future // Eur. Respir. J. 1993. №6. P. 1507-1520.

129. Holgate S.T, Church M.K. Asthma. The mast cell // Br. Med. Bull. 1992. Vol. 48. №1. p. 40-50.

130. Holgate S.T. The role of mast cells in the pathogenesis of asthma // Bull, europ. physiopath. resp. 1985. Vol. 21. №6. P. 449-462.

131. Holm B.A, Wang Z.D., Egan E.A. et. al. Content of dipalmitoilphosphatidilcholine in lung surfactant-ramification for surface activity // Pediatr. Res. 1996. Vol. 39. P. 805-811.

132. HolmskovU, MalhortaR, Sim R.B. et. al. Collectins: collagenous C-type lectins of the innate immune defense system //Immunol. Today. 1994. Vol. 15. P. 6774.

133. Johansson J, Curstedt T, Robertson B. The protein of surfactant system // Eur. Respir. J. 1994. №7. P. 372-391.

134. Johansson J., Curstedt T. Molecular structures and ijteractions of pulmonary surfactant component//Eur. J. Biochem. 1997. Vol. 244. P. 675-693.

135. Johnson M. Pharmacology of long-acting B-agonists // Annals of allergy, asthma, immunology. 1995. Vol. 74. №8. P.

136. Jurimaromet M., Barber R.F., Shek P.N. Liposomes and bronchoalveolar lavage fluid-release of vesicle-entrapped glutation //Int. J. Pharmaceut. 1992. Vol. 88. № (1-3). P. 201-210.

137. Kellaway I.W., Farr S.J. Liposomes as drug delivery systems to the lung // Adv. Drug. Deliv. Rev. 1990. Vol. 5, p. 149-161.

138. Kiely D.G., Cargill R.I., Grove A. and Lipworth B.J. Abnomal myocardial repolarisation during hipoxaemia and B-agonist therapy // Eur. Res. J. 1995. Vol.8, sept., suppl. 19. P. 258S. (Abstract).

139. Kim S., Martin G. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution // Biochim. Biophys. Acta, 1981. Vol. 646, p. 1-9.

140. Kremlev S.G., Umstead T.M., Phelps D.S. Effects of surfactant protein A and surfactant lipids on lymphocyte proliferation in vivo //Am.J.Physiol. 1994. Vol. 267. №11. P. L357-L364.

141. Kremlev S.G.„ Phelps D.S. Surfactant protein A stimulation of inflammatory cytokine and immunoglobulin production //Am.J.Physiol.1994. Vol. 267. № 11. P. L712-L719.

142. Kronberg B., Dahman A., Carlfors J. et. al. //J. Pharm. Sci. 1990 Vol. 79. №8. P. 667-671.

143. Kuroki Y.,Akino T. Pulmonary surfactant protein-A (Sp-A) specifically binds dipalmitoylphosphatidylcholine //J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P. 3068-3073

144. Kuroki Y., Shiratori M., OgasawaraY. et. al. Characterization of pulmonary surfactant protein D: its copurification with lipids //Biochim. Biophys. Acta. 1991. Vol. 1086. P. 185-190.

145. Kuroki Y., Tsutahara S., Shijubo N. et.al. Elevated levels of lung surfactant protein-A in sera from patients with idiopathic pulmonary fibrosis and pulmonary alveolar proteinosis //Am. Rev. Resp. Disease. 1993. Vol.147. №3. P.723-729.

146. Kuroki Y., McCormac F.X., OgasawaraY et. al. Epitope mapping for monoclonal antibodies identifies functional domains of pulmonary surfactant protein A that interact with lipids //J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 29793-29800.

147. Kuroki Y., Shiratori M., OgasawaraY., Hattori. A. et. al. Interaction of phospholipid liposomes with plasmamembrane isolated from alveolar type-II cells -effect of pulmonary surfactant protein A//BBA-Biomembrane. 1996. Vol. 1281. № 1. P. 53-59.

148. Lu J., Willis A.C., Reid K.B.M. Purification, characterization and cDNA cloning of human pulmonary surfactant protein D // Biochem. J. 1992. Vol. 284. P. 795-802. .

149. Malhorta R., Haurum J. S., Thiel S. et. al. Binding of human collectins (SPA and MBP) to influenze virus // Biochem. J. 1994. Vol. 304. P. 455-461.

150. Manz-Keinke H., Plattner H., Schlepper-Shafer J. Lung surfactant protein A (SP-A) enhances serum independent phagocytosis of bacteria by alveolar macrophages // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 57. P.95-100.

151. Marom Z.M. The role of mast cells in bronchial asthma: mechanisms and possible therapeutic implications // Mt. Scinai J. Med. 1991. Nov. Vol. 58. №6. P. 472-482.

152. McCalden T.A., Radhakrishnan R. A comparative study of the bronchodilator effect and duration of action of liposomal encapsulated beta-adrenergic agonists in the guinea-pig // Pulmonary pharmacology. 1991. №4. P. MOMS.

153. McCalden T.A., Abra B., Mihalko P. Efficacy of a liposome formulation of the bronodilator metaproterenol in guinea-pig // J. Liposome Res. 1989. № 1. P. 211222.

154. Meyboom A., Maretzki D., Stevens P.A. et. al. Reversible calcium-dependent interaction of liposomes with pulmonary surfactant protein A //J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 14600-14605.

155. McFadden E.R. Are there risks associated with B2-agonists? 2: The data reviewed // International Respiratory Forum. 1994. Vol. 1. P. 27-33.

156. Milloning G. Futher observation on a phosphate buffer for osmium solution in fixation // "5-th International Congress for Electron Microscopy" Cr. Acad. Press. New Yore. 1962. Vol. 2. P. 8.

157. Miyamura K., Leight L.E., Lu J. et.al. Surfactant protein D binding to alveolar macrophages //Biochem. J. 1994. Vol. 300. P. 237-242.

158. Muller W.J., Zen K., Fisher A.B. et.al. Pathways for uptake of fluorescently labeled liposomes by alveolar type II cells in culture // Am. J. Physiol. 1995. Vol. 13. P. L11-L19.

159. Myers M. A., Thomas D.A., Straub L. et al. Pulmonary effects of chronic exposure to liposome aerosols in mice / Exp. Lung Res. 1993. Vol. 19. №1. P. 1-19.

160. New R.R., Chance M.L., Thomas S.C. et.al. //Nature. 1978. Vol. 272. P. 55-56.

161. Nijkamp F.P., Folkerts G. Nitric-oxide and bronchial reactivity //Clin. Exp. Allergy. 1994. Vol. 24. № 10. P. 905-914.

162. Ninio S., Yamboliev I., Kovacheva S. High lung uptake of Tc-99m multilamellar liposomes after intravenous administration in rats and rabbits //Pharmazie. 1994. Vol.49. №5. P. 353-356.

163. Niven R.W., Schreier H. Nebulization of liposomes. 1. Effect of lipid composition //Pharm. Res. 1990. Vol.7. P. 1127-1133.

164. Niven R.W., Speer M.,Schreier H. Nebulization of liposomes. 2. The effect of solute release profiles //Pharm. Res. 1991. Vol.8. P. 217-221.

165. Niven R.W., Carvajal M.T.,Schreier H. Nebulization of liposomes. 3. Effect of operating conditions //Pharm. Res. 1992. Vol.9. P. 515-520.

166. Nogee L.M., DeMello D.E., Dehner L.P. et. al. Deficiency of pulmonary surfactant protein B in congenital pulmonary alveolar proteinosis //N. Engl. J. Med.1993. . Vol.328. P. 406-410.

167. Oosterlaken-Dijksterhuis, M.A., Vaneijk, M., Vanbuel, B.L.M. et. al. Surfactant protein-composition of lamellar bodies isolated from rat lung // Biochem. J. 1991. Vol. 274. P.l 15-119

168. Ogasawara Y., McCormac F.X., Mason R.J. et. al. Chimeras of surfactant protein A and D identify the carbohydrate recognition domain as essential for phospholipid interaction //J/ Biol. Chem.1994. Vol. 269. P.29785-29792.

169. Pauwels R. The international consensus report on the diagnosis and management of asthma // Eur. Respir. Rev. 1993. Vol. 3. №15. P. 483-489.

170. Phelps D.S., Rose R.M. Increased recovery of surfactant protein A (SP-A) in AIDS related pneumonia//Am. Rev. Respir. Dis.1991. Vol. 143. P.1072-1075.

171. Pison U., Wright J., Hawgood S. Spicific binding of surfactant apoprotein A to rat alveolar macrophages //Am. J. Physiol. 1992. Vol. 262. P. L412-L417.

172. Pearlman D.S., Liddle R. Controlling asthma symptoms: salmeterol compared with salbutamol in large-scale multicentre studies // Eur. Respir. Rev.1994. Vol. 4. №21. P. 301-305.

173. Poulain F.R., Allen L., Williams M.C., Hamilton R.L. et. al.//Effect of surfactant apoproteins for tubular myelin formation IIAm. J. Physiol. 1992. Vol. 262. № 6. P. L730-L739.

174. Ross G.F., Sawyer J., Oconnor T., Whitsett, J.A. Intermolecular cross-links mediate aggregation of phospholipid-vesicles by pulmonary surfactant protein Sp-A //Biochemystry. 1991. Vol. 30. №3. P.858-865

175. Sacket D.L., Shannon H.S., Browman E.W. Fenoterol and fatal asthma // Lancet, 1990, i, p. 45-46.

176. Sano Y., Watt G., Townley R.G. Decreased mononuclear cell beta-adrenergic receptors in bronchial asthma: parallel studies of lymphocyte and granulocyte desensitization// J. Allergy, 1983. Vol. 72. №5. Pt 1. P. 495-503.

177. Schreirer H., Gonzales-Rothi R.J., Stecenko A.A. Pulmonary delivery o liposomes // J. Controlled Release. 1993. Vol. 24. P. 209-223.

178. Schreier H., McNicol K.J., Ausborn M. et al. Pulmonary delivery of amikacin liposomes and acute liposome toxicity in the sheep // Int. . Farmaceut., 1992. Vol. 87, p. 183-193.

179. Schwartz L.A., Johnson J.H., Black M. et.al. Delivery of DNA-cationic liposome complexes by small-particle aerosol //Human Gene Therapy. 1996. Vol. 7. №6. P. 731-741.

180. Sears M.R., Taylor D.R., Print C.G. et al. Regular inhaled beta-agonist treatment in bronchial asthma// Lancet, 1990. Vol. 336, p. 1391-1396.

181. Shou-Hwa Y., Possmayer F. Effect of pulmonary surfactant protein Sp-A and neutral lipids accretion and organization of dipalmitoilphosphatidilcholin in surface films // J. Lipid Res. 1996. Vol. 37. P. 1278-1288.

182. Stainton M.P. Simple, efficient reduction column for use in automated determination of nitrate in water. /Analytical chemistry. 1974. Vol.46. №11. P. 1616.

183. Stecenco A.A., Walsh E.E., Schreier H. Fusion of artificial viral envelopes containing respiratory syncytial virus (RSV) attachment (G) and fusion (F) glycoprotein with Hep-2 cells//Pharm.Pharmacol. Lett. 1992. №1. P. 127-129.

184. Sterk P.J. Are there risks associated with B2-agonists? 1: A physiological perspective I I International Respiratory Forum. 1994. Vol. 1. P. 21-26.

185. Stolley P.G, Schinnar R. Association between asthma mortality and isoproterenol: a review//Prev. Med., 1978. Vol. 7, p. 519-538.

186. Szoca F, Papahadjopoulos D. Comparative properties and metod of preraration of liposomes // Annu. Rev. Biophys. and Bioeng, 1980. Vol. 9, p. 467508.

187. Szoka F, Papahadjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation // Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1978. Vol. 75. P. 4194-4198.

188. Taneva S.G, Keough K.M.W. Dinamic surface properties of pulmonary surfactant protein SP-B and SP-C and their mixtures with dipalmitoilphosphatidilcholine//Biochemistry. 1994. Vol. 33. P. 14660-14670.

189. Taylor K.M.G, Taylor G, Kellaway W. The stability of liposomes to nebulization //nt. J. Pharmaceut. 1990.Vol.58. P. 57-61.

190. Taylor K.M.G, Farr S.J. Liposomes for drug delivery to the respiratory tract//DrugDev. Ind. Pharm. 1993. Vol. 19. P. 123-142.

191. Thomas D.A, Myers M.A, Wichert B.' et al. Acute effects of liposome aerosol inhalation on pulmonary-function in liposome aerosol inhalation on pulmonary-function in healthy-human volunteers // Chest, 1991. Vol. 99, №5, p. 1268-1270.

192. Thomsen L.L, Ching L.M.// Cancer Res. 1991. Vol.51. P.77-82.

193. Tseng W.C, Purvis N.B, Haselton F.R, Giorgio T.D. Cationic liposomrs delivery of plasmid to endotelial cells measured by quantitative flow-cytometry //Biotechnology and bioenjineering. 1996. Vol.50. № 5. P. 548-554.

194. Tsuzuki A, Kuroki Y, Akino, T. Pulmonary surfactant protein A-mediated uptake of phosphatidylcholine by alveolar type-II cells //Am. J. Physiol. 1993. Vol. 265. P. L193-L199.

195. Vidgren M., Waldrep J.C., Arppe J. et al. A study of 99m-technetium-labelled beclomethasone dipropionate dilauroylphosphatidylcholine liposome aerosol in normal volunteers // Int. J. of Pharm. 1995. Vol. 115. P. 209-216.

196. Waldrep J.C., Keyhani K.M.S., Black M.B.S. et al. Operating characteristics of 18 different continuous-flow jet nebulizers with beclomethasone dipropionate liposome aerosol // Chest, 1994. Vol. 105, p. 106-110.

197. Waldrep J.C., Schrerer P.W., Hess G.D. et al. Nebulized glucocorticoidds in liposomes: aerosol characteristic and human dose estimates // J. of aerosol medicine. 1994. Vol. 7, №2. P. 135-145.

198. Walther F.D., Davidcu R., Supnet M.C. et. al. Uptake of antioxidants in surfactant liposomes by cultured alveolar type-II cells is enhanced by surfactant protein A//Am. J. Physiol. 1993. Vol. 265. №4. P. L330-L339.

199. Wang Z., Gurel O., Baatz J.E., Notter R.H. Acylation of pulmonary surfactant protein-C is required for its optimal surface active interactions with phospholipids // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271, P. 19104-19109.

200. Weaver T.E., Whitsett J.A. Funetion and regulation of expression of pulmonary surfactant-associated proteins //Biochem. J. 1991. Vol. 273, P. 249-264.

201. Weaver T.E., Hall C.L., Kachel D.L. et. al. Assesment of in-vivo attachment/phagocytosis by alveolar macrophages //J. Immunol. 1996. Vol. 193, №2. P. 149-156.

202. Weis W.I. Drickamer K. Trimeric structure of a C-type mannose-binding protein// Structure. 1994. Vol. 2. P. 1227-1240.

203. Weissbach S., Neuendank A., Pettersson M. et.al. Surfactant protein A modulates release of reactive oxygen species from alveolar macrorfages //Am. J. Physiol. 1994. Vol. 267. № 11. p. L660-L666.

204. Williams M.D., Wright J.K., Perry D. et. al. Attachment of surfactant protein A liposomes to alveolar macrophages is likely mediated by collagen-like domain //Clin. Res. 1994. Vol. 42. № 2. P. A189-A199.

205. Winder N.C., von Fellenberg R. Mast cells in normal and pathological specimens of the equine lung // Zentralbl Veterinarmed A. 1990. Vol. 37. №9. P. 641-650.

206. Windon H., Burgess C., Siebers R. et al The pulmonary and extrapulmonary effects of inhaled beta-agonists in astmatic patients // Clin. Pharmacol. Ther., 1990. Vol. 48, p. 296-301.

207. Wright J.R., Youmans D.C. Pulmonary surfactant protein A stimulates chemotaxis of alveolar macrophages // Am. J. Physiol. 1993. Vol. 264. № 8. P. L338-L344.

208. Yoshimura T.,Kaneuchi T.,Miura T. Kinetic analysis of the fluorescence reaction of histamine with orthophthalaldehyde.// Analyt. Biochem. 1987., Vol 164., P.132-137.