Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и изучение противоопухолевого потенциала антиангиогенных полипептидов и химиопрепаратов направленного действия

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дигтярь, Антон Васильевич

Список сокращений Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Ангиогенез и его роль в опухолевом росте

1.2. Эндогенные ингибиторы апгиогенеза матриксного происхождения 1.2.1. Эндостатин

1.2.2 Эндостатиноподобный фрагмент коллагена XV (EFC-XV)

1.2.3. Аррестен

1.2.4. Тумстатин

1.2.5. Эндорепеллин

1.2.6. Другие ингибиторы ангиогенеза матриксного происхождения

1.3. Эндогенные ингибиторы ангиогенеза нематриксного происхождения

1.3.1. Система плазминогена человека и её роль в прогрессии опухолей

1.3.2. Ангиостатин

1.3.3. Фактор пигментного эпителия (PEDF)

1.3.4. Другие ингибиторы ангиогенеза нематриксного происхождения

1.4. Терапевтический потенциал ингибиторов ангиогенеза

1.5. Направленный транспорт химиопрепаратов в раковые клетки 1.6 Липосомы как системы направленной доставки и контролируемого высвобождения противоопухолевых препаратов

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Получение нативного ангиостатина человека

2.2. Получение рекомбинатного эндостатина человека

2.2.1. Конструирование экспрессионпого вектора эндостатина человека

2.2.2. Выбор штамма-продуцента Escherichia coli

2.2.3. Получение эндостатина путем экспрессии его гена в штамме Е. coli

2.2.4. Выделение эндостатина человека из клеток штамма-продуцента Е. coli

2.3. Получение липосомных форм ангиостатина и эндостатина

2.4. Получение рекомбинантного 3-го домена а-фетопротеина человека

2.5. Выделение эпидермального фактора роста мыши

2.6. Культивирование клеточных линий

2.7. Получение и анализ биологических свойств пептидов -модифицированных аналогов рецепторсвязывающих участков

ЭФР и ТФРа человека

2.7.1. Синтез пептидов

2.7.2. Исследование интернализации пептидов

2.7.3. Изучение динамики интернализации ФИТЦ-мечепых пептидов в опухолевые клетки

2.8. Получение конъюгатов доксорубицина (ДР) с векторными пептидами | :

2.9. Определение цитотоксической активности (ЦТА) препаратов in vitro

2.9.1. Определение ЦТА ангиостатина и эндостатипа в отношении эндотелиальных клеток линий АВАЕ и HUVEC

2.9.2. Определение ЦТА ангиостатина, эндостатина и конъюгатов ДР с векторными пептидами в отношении клеток линий DU145, А431,

MCF-7, НТ1080, SVEC4-10 и фибробластов человека

2.9.3. Определение выживаемости клеток

2.10. Оценка противоопухолевой активности препаратов in vivo

2.10.1. Животные и опухоли

2.10.2. Дозы препаратов и схемы их введения

2.10.3. Объём опухолей

2.10.4. Продолжительность жизни животных

2.11. Статистическая обработка результатов

Глава 3. Результаты и их обсуждение , ¡ .;.

3.1. Выделение и очистка ангиостатина

3.1.1. Выделение плазминогена из плазмы крови человека

3.1.2. Выделение ангиостатина путём ограниченного протеолиза плазминогена

3.2. Получение рекомбинантного эндостатина человека 68 3.2.1. Конструирование экспрессионного вектора и биосинтез рекомбинантного эндостатина человека в клетках штамма-продуцента

E.coli BL21(DE3)

3.2.2. Выделение эндостатина человека из клеток штамма-продуцента Е. coli

3.3. Получение липосомпых форм ангиостатина и эндостатина

3.4. Получение рекомбинаптного 3-го домена а-фетопротеипа человека

3.5. Выделение и очистка эпидермального фактора роста мыши

3.6. Исследование возможности доставки модифицированных рецепторсвязывающих фрагментов ЭФР и ТФРа человека в опухолевые клетки путём рецепторопосредованного эндоцитоза

3.7. Получение конъюгатов ДР с векторными пептидами

3.8. Определение ЦТА препаратов in vitro

3.8.1. Определение ЦТА ангиостатина и эндостатина в отношении эндотелиальных клеток линий HUVEC, АВАЕ и SVEC4

3.8.2. Определение ЦТА ангиостатина и эндостатина в отношении гладкомышечных, соединительнотканных и раковых клеточных линий

3.8.3. Определение ЦТА конъюгат9в,ДР с АФПзд, ЭФР, ЭФРмф и ТФРМф

3.8.4. Микроскопическое исследованиедин^м^ки интернализации и внутриклеточного распределения конъюгата ТФРмф-ДР в раковых клетках

3.9. Исследование противоопухолевой активности полученных препаратов in vivo

3.9.1. Сравнительное исследование прртивоо^холевой активности свободных и липосомных форм ангиостатина и эндостатина на мышах с привитыми солидными опухолями

3.9.2. Исследование противоопухолевой активности конъюгатов ДР с векторными пептидами на мышах с привитыми солидными опухолями

3.9.3 Изучение противоопухолевой активности антиангиогенных препаратов и конъюгатов ДРвекторными пептидами при ихвместном применении in vivo

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и изучение противоопухолевого потенциала антиангиогенных полипептидов и химиопрепаратов направленного действия"

Актуальность проблемы. Одной из важнейших задач, стоящих перед медициной, является разработка новых эффективных методов терапии злокачественных новообразований. В последние десятилетия значительным достижением в этой области является доказательство необходимости процесса ангиогенеза для роста злокачественных солидных опухолей и создание концепции противоопухолевой терапии, основанной па подавлении ангиогенеза [3, 71, 73].

Апгиогенез - процесс роста капилляров из кровеносных сосудов, в результате которого образуются новые сосудистые сети. При этом патологический рост новых сосудов обуславливает прогрессию ряда заболеваний, прежде всего рост и > , „ метастазировапие злокачественных опухолей [60]., Подавление ангиогенеза ведёт к торможению опухолевого роста и развития метастазов. Среди 27 известных в настоящее время эндогенных ингибиторов ангиогенеза наиболее перспективными являются белки ангиостатин и эндостатин. Однако эти полипептидные ингибиторы ангиогенеза проявляют высокую терапевтическую эффективность преимущественно в больших дозах

25-100 мг/кг массы тела) и требуют продолжительного курса лечения [36]. В связи с этим

Г>! • ; ;и. кч- 4 особенно актуальной задачей представляется разработка пилотных высокотехнологичных методов получения ангиостатииа и эпдостатипа, а также поиск возможностей изменения существующих схем терапии этими полипептидами, в частности, путём применения их липосомных форм.

Следует отметить, что несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы при становлении и развитии антиангиогенной терапии, для полной ремиссии применение только антиангиогенных препаратов часто является недостаточным. Более эффективным подходом представляется комбинированная противоопухолевая химиотерапия, сочетающая в себе препараты с различными механизмами действия. В основе этого подхода лежит представление о том, что нарушение различных биохимических процессов в опухолевой клетке уменьшает шансы на то, что уцелеют резистентные клоны опухолевых клеток [12]. Терапия антиангиогеииыми полипептидами, разрушающая инфильтрирующие опухоль кровеносные сосуды и уничтожающая раковую клетку опосредованно, могла бы успешно сочетаться с применением высокоэффективных противоопухолевых антибиотиков, проявляющих в малигнизировапных тканях прямое цитотоксическое действие. Однако традиционные препараты этого класса, например,

•ми I -1 смно:- ¡о, . доксорубицин (ДР), обладают токсическими дозозависимыми побочными эффектами, обусловленными отсутствием избирательности действия. Одним из наиболее перспективных путей решения данной проблемы, а также повышения эффективности действия цитотоксических противоопухолевых химиопрепаратов, является разработка способов их направленной доставки в раковую клетку с помощью конъюгирования с векторными полипептидами, имеющими специфические рецепторы на мембранах клеток-мишепей [41, 165]. Очевидно, что комбинированная терапия антиангиогенными агентами и препаратами направленного действия является наиболее перспективным избирательным и эффективным путём воздействия на злокачественные опухоли.

Исходя из этого, актуальной целью данного исследования являлось изучение терапевтического потенциала комбинированной противоопухолевой терапии антиангиогенными полипептидами и препаратами адресного воздействия на клетки злокачественных новообразований. !;¡ ■ '"-¡i- i <. i

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

- разработать технологичный метод получения рекомбипантпого эндостатина человека; получить липосомные формы эндостатина и апгиостатииа человека и изучить их противоопухолевую терапевтическую эффективность in vivo в сравнении с нелипосомными формами; получить векторные пептиды, способные к избирательному проникновению в клетки злокачественных опухолей путём рецепторопосредованного эндоцитоза;

- синтезировать цитотоксические коныогаты выбранных векторов с химиопрепаратами, обладающие адресным воздействием на раковые клетки in vitro и in vivo; исследовать терапевтическую эффективность сочетанного применения антиангиогенных полипептидов и цитотоксических препаратов направленного действия при лечении мышей с привитыми солидными опухолями меланомы В16.

Научная новизна работы. Сконструированы плазмидные векторы Escherichia coli, позволяющие эффективно осуществлять индуцированный биосинтез рекомбинантного эндостатина человека в клетках штамма-продуцента.

Впервые получены липосомные формы ангиостатипа и эпдостатииа человека и ' | |: ,. .-.¡i ' . обнаружено, что противоопухолевая эффективность данных форм in vivo выше, чем соответствующих нелипосомных форм.

Впервые получены синтетические пептиды ЭФРмф и ТФРмф, представляющие собой модифицированные рецепторсвязывающие фрагменты соответственно эпидермального фактора роста (ЭФР) и трансформирующего фактора роста-a (ТФРа) человека. Показана способность этих пептидов проникать в раковые клетки линии DU145 путём рецепторопосредованного эндоцитоза.

Впервые получены ковалентные конъюгаты пептидов ЭФРМф, ТФРМф и рекомбинантного белка - 3-го домена а-фетопротеина человека (АФПзд) с ДР и ■г продемонстрирована их высокоспецифичная цитотоксическая активность (ЦТА) in vitro по отношению к клеткам злокачественных опухолей. Впервые in vivo продемонстрирована более высокая терапевтическая эффективность комбинированного применения антиангиогенных полипептидов и цитотоксических химиопрепаратов направленного действия по сравнению с мопотерапией каждым из этих терапевтических агентов.

Практическая значимость исследования. Обнаружение более высокого терапевтического потенциала in vivo липосомных форм ангиостатипа и эндостатипа по сравнению с их свободными формами делает возможным развитие этого направления в области создания новых противоопухолевых средств.

Полученные химиопрепараты направленного действия на основе ДР (ЭФРМф-ДР, ТФРмф-ДР и АФПзд-ДР), оказывающие выраженное противоопухолевое действие при терапии мышей с опухолями меланомы В16, могут подвергаться дальнейшему изучению па различных модельных объектах in vivo с перспективой перехода в разряд препаратов, проходящих доклинические испытания.-1 ' • : •.•••. • :

Продемонстрированное преимущество комбинированной терапии опухолей, включающей применение антиангиогенных полипептидов и цитотоксических препаратов на основе ДР, то есть двух классов препаратов с различными механизмами противоопухолевого действия, представляет большой интерес в поиске эффективных схем противоопухолевой терапии. Полученные результаты расширяют понимание вопроса

•' •• 'J--;.■'. сочетания разных типов антинеопластйческих средств при выборе схем лечения онкологических заболеваний и показывают важность продолжения исследований антиангиогенных полипептидов и цитотоксических химиопрепаратов на основе пептидных векторов, специфические рецепторы которых гиперэкспонированы на мембранах злокачественно перерождённых клеток.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (апрель 2004 г., Москва), па 18-м конгрессе EACR (июль 2004 г., Инсбрук, Австрия), на I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (октябрь 2004 г., Москва), на I Международной научно-практической конференции «Медбиотек» (март 2005 г., Москва), f на III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (март 2005 г., Москва), на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (июнь 2005 г., Пущино), а также на научных семинарах кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сеченова.

• Гл|9 '

Апробация работы состоялась на совместном заседании научно-методической конференции кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сеченова и отдела биохимии Московского НИИ медицинской экологии 28 сентября 2005 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, оформлена 1 заявка на выдачу патента РФ на изобретение.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Дигтярь, Антон Васильевич

Выводы:

1. Сконструирован плазмидный вектор, позволяющий осуществлять эффективную индуцируемую экспрессию гена эндостатина человека в штамме-продуценте Е. coli BL21(DE3). Разработаны эффективные модифицированные методы выделения и ренатурации рекомбинантного эндостатина человека.

2. Получены липосомные формы ангиостатина и эндостатина человека на основе оволецитина и холестерина, проявляющие высокую противоопухолевую активность. В экспериментах по терапии опухолей in vivo показано, что совместное введение липосомных форм ангиостатина или эндостатина и свободного доксорубицина является более эффективным, чем применение этих агентов в режиме монотерапии.

3. Получен конъюгат доксорубицина с рекомбинантным пептидным фрагментом а-фетопротеина человека (3-й домен а-фетопротеина). Установлена специфическая цитотоксическая активность конъюгата в отношении различных опухолевых клеточных линий.

4. Впервые получены синтетические пептиды - модифицированные фрагменты рецепторсвязывающих участков ЭФР и ТФРа человека - и продемонстрирована их способность к поступлению в клетки опухолей эпителиального и мезенхимального гистогенеза путём рецепторопосредованного эндоцитоза.

5. Получены конъюгаты доксорубицина с ЭФР, ЭФРМф и ТФРМф и продемонстрирована их высокая цитотоксическая активность в отношении клеток раковых опухолей человека линий DU145, А431, MCF-7, НТ1080. С помощью флуоресцентной микроскопии продемонстрирована внутриклеточная локализация конъюгатов.

6. В экспериментах ш vivo на мышах с привитыми солидными опухолями продемонстрировано, что терапевтическое применение цитотоксических препаратов направленного действия - конъюгатов АФПзд-ДР, ЭФРмф-ДР и ТФРмф-ДР значительно подавляет опухолевый рост и увеличивает среднюю продолжительность жизни животных.

7. В экспериментах in vivo показано значительное увеличение эффективности противоопухолевого действия антиангиогенных агентов (ангиостатин, эндостатин) и препаратов направленного действия (АФПзд-ДР, ЭФРмф-ДР, ТФРмф-ДР) при их комбинированном применении.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дигтярь, Антон Васильевич, Москва

1. Берёзов Т.Т., Яглова Н.В., Дмитриева Т.Б, Жирков Ю.А., Чехонин В.П. Направленный транспорт лекарственных средств с помощью липосом. // Вест. РАМН (2004), № 5, с. 4247.

2. Завадская Е.С., Захарова Е.С., Кадулин С.Г., Кибардин A.B., Киселёв СЛ., Гиучев Н.В. Получение рекомбинантного эндостатина в молоке трансгенных мышей. // Генетика (2001), т. 37 (9), с. 1207-1212.

3. Киселёв С.М., Луценко C.B., Северин С.Е., Северин Е.С. Ингибиторы опухолевого ангиогенеза. // Биохимия (2003), т. 68 (5), с. 611-631.

4. Крымова Н.И., Эмзина А.Я., Новакович A.C. Большой датско-русский словарь. // М: Живой язык (2004), 798 с.' : ; í • ?w » iч" '';МТГ»Т1 ТУПК!

5. Лазаревич Н.Л. Молекулярные механизмы прогрессии опухолей печени. // Успехибиол. химии (2004), т. 44, с. 365-418.

6. Матвеев Б.П. Химиотерапия гормонорезистентных форм рака предстательной железы. // Практич. онкол. (2001), т. 2 (6), с. 42-49.

7. Парфёнова Е.В., Плеханова О.С., Ткачук В.А. Система активаторов плазминогена в ремоделировании сосудов и ангиогенезе. // Биохимия (2002), т. 67 (1), с. 139-156.

8. Фарм. Хим. (1998), № 3, с. 20-25.

9. Стойка P.C., Панчук P.P., Стойка Б.Р. Сходство и различие эмбриогенеза и канцерогенеза. // Онтогенез (2004), т. 35 (2),1с.'85-90,<>'vit•

10. Хасигов П.З., Подобед О.В., Грачёва Т.С., Сапбиев К.Д., Грачёв C.B., Берёзов Т.Т. Роль металлопротеиназ матрикса и их ингибиторов в процессах опухолевой инвазии и метастазировании. // Биохимия (2003), т. 68 (7), с. 869-876.

11. Химиотерапия злокачественных опухолей. Под ред. H.H. Блохина. // М: Медицина (1977), 320 с.

12. Abe N., Muragaki Yi, Yoshíoka H., Inoue'Hí.iNinomiya ^Identification of a novel collagen chain represented by extensive iritèmjptiorts^nUhe-triplë-heliCal-region. '//• Biochem. Biophys. Res. Commun. (1993), vol. 196, pp. 576-582.

13. Abelev G.I. «-Fetoprotein in association with malignant tumors. // Adv. Cancer Res. (1971), vol. 14, pp. 295-357.

14. Albig A.R., Schiemann W.P. Fibulin-5 antagonizes vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling and angiogenic sprouting by endothelial cells. // DNA Cell. Biol. (2004), vol. 23, pp. 367-379.

15. Allen T.M., Cullis P.R. Drug delivery systems: entering the mainstream. // Science (2004), vol. 303, pp. 1818-1822.

16. Altrogge L.M., Monard D. An assay for high-sensitivity detection of thrombin activity and determination of proteases activating or inactivating protease-activated receptors. // Anal. Biochem. (2000), vol. 277 (1), pp. 33-45.

17. Arangoa M.A., Duzgunes N., Tros de Ilarduya C. Increased receptor-mediated gene delivery to the liver by protamine-enhanced-asialofetuin-lipoplexes.// Gene Ther. (2003), vol. 10 (1), pp.5.14. sii. ,:;it)n v. .il; >ihi• i^iUiiii limit»; .

18. Arras M., Mollnau H., Strasser R., Wenz R., Ito W.D., Schaper J., Schaper W. The delivery of angiogenic factors to the heart by microsphere therapy. // Nat. Biotechnol. (1998), vol. 16 (2), pp. 159-162.

19. Auricchio A., Behling K.C., Maguire A.M., O'Connor E.M., Bennett J., Wilson J.M., Tolentino M.J. Inhibition of retinal neovascularization by intraocular viral-mediated delivery of anti-angiogenic agents. // Mol. Ther. (2002), vol. 6 (4), pp. 490-494.

20. Bangham A.D., Home R.W. Negative staining of phospholipids and their structured modification by surface agents as observed in the electron microscope // J. Mol. Biol. (1964), vol. 8, pp. 660-668. . 'Itr W.D;. Schaue: .'. Scl.:;. V.

21. Boehm T., Folkman J., Browder T., O'Reilly M.S. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. //Nathre ^1997); Vol.' 390, pp. 404-407.

22. Boehm T., O'Reilly M.S., Keough K., Shiloach J., Shapiro R., Folkman J. Zinc-binding of endostatin is essential for its antiangiogenic activity. // Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998), vol. 252 (1), pp. 190-194.

23. Bouck N. PEDF: anti-angiogenic guardian of ocular function. // Trends Mol. Med. (2002), vol. 8, pp. 330-334.

24. Bouma B.N., Meijers J.C. Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI, plasma procarboxypeptidase B, procarboxypeptidase R, procarboxypeptidase U) // J. Thromb. Haemost. (2003), vol. 1 (7), pp. 1566-1574.

25. Brooks P.C., Stromblad S., Klemke R., Visscher D., Sarkar F.H., Cheresh D.A. Anti-integrin alpha v beta 3 blocks human breast cancer growth and angiogenesis in human skin // J. Clin. Invest. (1995), vol. 96 (4), pp. 1815-1822.

26. Brouty-Boye D., Zetter B.R.Inhibition of cen motility'by-interferonV// Science (1980), vol. 208, pp. 516-518. . .

27. Brunner G., Nguyen H., Gabrilove J., Rifkin D.B., Wilson E.L. Basic fibroblast growth factor expression in human bone marrow and peripheral blood cells. // Blood (1993), vol. 81, pp. 631-638.

28. Byzova T.V., Goldman C.K., Pampori N., Thomas K.A., Bett A., Shattil S.J., Plow E.F. A mechanism for modulation of cellular responses to VEGE:1 activation of the integrins. // Mol. Cell (2000), vol. 6 (4),pp. 851-860.- j ! ^.!! procarUi^pepiK-.u :

29. Camphausen K., Moses M.A., Beecken W.D., Khan M.K., Folkman J., O'Reilly M.S. Radiation therapy to a primary tumor accelerates metastatic growth in mice. // Cancer Res. (2001), vol.61 (5), pp. 2207-2211.

30. Cao Y., Cao R., Veitonmaki N. Kringle structures and antiangiogenesis // Curr. Med. Chem. Anti-Cancer Agents (2002),'vol.2;pp.'667-681,<: i.uy i»y imai. -.<■

31. Cao Y., Chen A., An S.S.A., Ji R.-W., <Davidson D., Cao Y., Llinas M. Kringle 5 of plasminogen is a novel inhibitor of endothelial cell growth. // J; Biol. Chem. (1997), vol. 272 (36), pp. 22924-22928.

32. Carmeliet P., Jain R.K. Angiogenesis in cancer and other diseases. // Nature (2000), vol. 407, pp. 249-257.

33. Castellino FJ. Biochemistry of human plasminogen /ASemin. Thromb. Hemost. (1984), vol. 10, pp. 18-23. i

34. Chadderton N.S., Stringer S.E. Interaction of platelet factor 4 with fibroblast growth factor 2 is stabilized by heparan sulphate. // Int. J. Biochem. Cell Biol. (2003), vol. 35, pp. 1052-1055.

35. Chen H., Herndon M.E., Lawler J. The cell biology of thrombospondin-1. // Matrix Biol. (2000), vol. 19, pp. 597-614.

36. Ciardiello F. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors as anticancer agents // Drugs (2000), vol. 60 (suppl.vl), pp. 25-32.:.' i >aviciM>ii D. Cr.o \ . : .: '

37. Ciardiello F., Tortorai G. A novel approach' in the'treatment of :cancer: targeting the epidermal growth factor receptor // Clin. Cancer Res. (2001), vol. 7, pp. 2958-2970.

38. Collen D. Ham-Wasserman lecture: role of the plasminogen system in fibrin-homeostasis and tissue remodeling // Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program) (2001), pp. 1-9.

39. Collen D. The plasminogen (fibrinolytic) system // Thromb. Haemost. (1999), vol. 82, pp. 259-270.

40. Conti S., Polonelli L., Frazzi R., Artusi M., Bettini R., Cocconi D., Colombo P. Controlled delivery of biotechnological products. // CuitJ Pharm. Biotechnol. (2000), vol. 1 (4), pp. 313323. ■: :;!••}!'' Г "TW. \;i'lT.'.\, So' ■

41. Cozzolino F., Torcia M., Aldinucci D., Ziehe M., Almerigogna F., Bani D., Stern D.M. Interleukin 1 is an autocrine regulator of human endothelial cell growth. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1990), vol. 87 (17), pp. 6487-6491.

42. Crum R., Szabo S., Folkman J. A new class of steroids inhibits angiogenesis in the presence of heparin or a heparin fragment. // Science (1985), vol. 230, pp. 1375-1378.

43. D'Amato R.J., Loughnan M.S., Flynn E., Folkman J. Thalidomide is an inhibitor of angiogenesis. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1994), .vol. 91,'ppJ 4082-4085.

44. Dano K., Behrendt N., Hoyer-Hansen G., Johnsen M., Lund L.R., Ploug M., Romer J. Plasminogen activation and cancer. // Thromb. Haemost. (2005), vol. 93, pp. 676-681.

45. Dhanabal M., Volk R., Ramchandran R., Simons M., Sukhatme V.P. Cloning, expression, and in vitro activity of human endostatin. // Biochem. Biophys. Res. Commun. (1999), vol. 258, pp. 345-352.

46. Duffy M.J. The urokinase plasminogen activator system: role in malignancy // Curr. Pharm. Des. (2004), vol. 10, pp. pp. 39-49.

47. Engelse M.A., Hanemaaijer R., Koolwijk P., van Hinsbergh V.W. The fibrinolytic system and matrix metalloproteinases in angiogenesis and tumor progression // Semin. Thrombos. Hemostas. (2004), vol. 30 (1), pp. 71-82. 'm •f>. ;. ih

48. Ezzell C. Starving tumors of their lifeblood. // Sci. Am. (1998), vol. 279, pp. 33-34.

49. Falcone D.J., Khan K.M., Layne T., .Fernandes iLuiMacrophage formation of angiostatin during inflammation. A byproduct of the activation of plasminogen. // J. Biol. Chem. (1998), vol. 273, pp. 31480-31485.

50. Fang K. A toxin conjugate containing transforming growth factor-alpha and ricin A specifically inhibits growth of A431 human epidermoid cancer cells // Proc. Natl. Sci. Counc. Repub. China B (1998), vol. 22, pp. 76-82., c- . :moi : .

51. Felbor U., Dreier L., Bryant R.A., Ploegh H.L., Olsen B.R., Mothes W. Secreted cathepsin L generates endostatin from collagen XVIII. // EMBO J. (2000), vol. 19, pp. 1187-1194.

52. Fernandez A., Udagawa T., Schwesinger C., Beecken W., Achilles-Gerte E., McDonnell T., D'Amato R. Angiogenic potential of prostate carcinoma cells overexpressing bcl-2. // J. Natl. Cancer Inst. (2001), vol. 93 (3), pp. 208-213.

53. Ferreras M., Felbor U;, Lenhard T., Olsen B.R., Delaisse J. Generation and degradation of human endostatin proteins by various proteinases."// FEBS;Lett.(2000), vol. 486, pp. 247-251.

54. Folkman J. Angiogenesis in cancer,.vascular, rheumatoid and other disease. // Nat. Med. (1995), vol. l,pp. 27-31. . K. .'i-.vuh ¡-¡.UOKson 1;.R. .\n .

55. Folkman J. Angiogenesis inhibitors. // Cancer Biol. Ther. (2003), vol. 2 (4, suppl. 1), pp. S127-S133.

56. Folkman J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. // Ann. Surg. (1972), vol. 175 (3), pp. 409-416.

57. Folkman J. Endogenous angiogenesis inhibitors. // APMIS (2004), vol. 112, pp. 496-507.

58. Folkman J. Fundamental concepts of the angiogenic process. // Curr. Mol. Med. (2003), vol. 3, pp. 643-651.

59. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. // N. Engl. J. Med. (1971), vol. 285,pp. 1182-1186.

60. Folkman J., Kalluri R. Cancer without disease. //Nature (2004), vol. 427, p. 787.

61. Franklin W.A., Veve R., Hirsch F.R., Helfrich B.A., Bunn P.A. Jr. Epidermal growth factor receptor family in lung cancer and premalignancy // Semin. Oncol. (2002), vol. 29 (1, suppl. 4), pp. 3-14.

62. Fukai N., Eklund L., Marneros A.G., Oh S.P., Keene D.R., Tamarkin L., Niemela M., lives M., Li E., Pihlajaniemi T., Olsen B.R. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. // EMBO J. (2002), vol. 21 (7), pp. 1535-1544.

63. Fukao H., Ueshima S., Okada K., Matsuo O. The role of the pericellular fibrinolytic system in angiogenesis // Jpn. J. Physiol. (1997), vol. 47, pp. 161-171.

64. Gettins P.G., Simonovic M., Volz K. Pigment epithelium-derived factor (PEDF), a serpin with potent anti-angiogenic and neurite outgrowth-promoting properties. // Biol. Chem. (2002), vol. 383 (11), pp. 1677-1682.

65. Gospodarowicz D. Purification of a fibroblast growth factor from bovine pituitary. // J. Biol. Chem. (1975), vol. 250 (7), pp. 2515-2520.

66. Heidtmann H.H., Nettelbeck D.M., Mingels A., Jager R., Welker H.G., Kontermann R.E. Generation of angiostatin-like fragments from plasminogen by prostate-specific antigen. // Br. J. Cancer (1999), vol. 81, pp. 1269-1273.

67. Herbst R.S. Review of epidermal growth factor-receptor biology // int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. (2004), vol. 59 (suppl. 2), pp. 21-26.

68. Hohenester E., Sasaki T., Olsen B.R., Timpl R. Crystal structure of the angiogenesis inhibitor endostatin at 1.5 A resolution. 11EMBO J. (1998), vol. 17, pp. 1656-1664.

69. Iruela-Arispe M.L., Luque A., Lee N. Thrombospondin modules and angiogenesis. // Int. J. Biochem. Cell Biol. (2004), vol. 36, pp. 1070-1078.

70. Jaye M., Howk R., Burgess W., Ricca G.A., Chiu I.M., Ravera M.W., O'Brien S.J., Modi W.S., Maciag T., Drohan W.N. Human endothelial cell growth factor: cloning, nucleotide sequence, and chromosome localization. // Science (1986), vol. 233, pp. 541-545.

71. Keller K.M., Keller J.M., Kuhn K. The C-terminus of type I collagen is a major binding site for heparin. // Biochim. Biophys. Acta (1986), vol. 882, pp."l-5.

72. Kim Y.M., Hwang S., Pyun B.J., 'Kiml TiY.'/iLee, S.T.'jiGhö Y.S., Kwon Y.G. Endostatin blocks vascular endothelial growth factor-mediated signaling via direct interaction with KDR/Flk-1. //J. Biol. Chem. (2002), vol. 277 (31), pp. 27872-27879.

73. Kimura M., Andersen T.T., Fenton J.W. 2nd, Bahou W.F., Aviv A. Plasmin-platelet interaction involves cleavage of functional thrombin receptor// Am. J. Physiol. (1996), vol. 271 (1 Pt l),pp. C54-C60. . v•'•■' v V'V-:.

74. Koch A.E. Angiogenesis as a target in rheumatoid arthritis. // Ann. Rheum. Dis. (2003), vol. 62 (suppl II), pp. ii60-ii67.

75. Kondapaka S.B., Fridman R., Reddy K.B. Epidermal growth factor and amphiregulin up-regulate matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in human breast cancer cells // Int. J. Cancer (1997), vol. 70,pp. 722-726. ■ — .,.„.:.,„.v f:u»r >„,

76. Kranenburg O., Bouma B„ Kroon-Batenburg L.M.J., Reijerkerk A., Wu Y.-P., Voest E.E., Gebbink M.F.B.G. Tissue-type plasminogen activator is a multiligand cross-/? structure receptor. // Curr. Biol. (2002), vol. 12, pp. 1833-1839.

77. Lay A.J., Jiang X.M., Kisker O., Flynn E., Underwood A., Condron R., Hogg P.J. Phosphoglycerate kinase acts in tumour angiogenesis as a disulphide reductase. // Nature (2000), vol. 408, pp. 869-873. 1' «.»n-iJisU-nmiry L.M.J. R.-,;.-.

78. Lee T.H., Rhim T., Kim S.S. Prothrombin kringle-2! domain has a growth inhibitory activity against basic fibroblast growth factor-stimulated capillary endothelial cells. // J. Biol. Chem. (1998), vol. 273, pp. 28805-28812.

79. Leung D.W., Cachianes G., Kuang W.J., Goeddel D.V., Ferrara N. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. // Science (1989), vol. 246, pp. 1306-1309.

80. Lingen M.W., Polverini P.J., <Boück(~'N.Pji;»Retinoic acid and interferon a act synergistically as antiangiogenic and antitumor agents against human head and neck squamous cell carcinoma. // Cancer Res. (1998), vol. 58, pp. 5551-5558.

81. Ma Z., Qin H., Benveniste E.N. Transcriptional suppression of matrix metalloproteinase-9 gene expression by IFN-g and IFN-h: critical role of STAT-la. // J. Immunol. (2001), vol. 167, pp. 5150-5159.

82. MacLachlan T.K., Dhanabal M. Insights into differential endostatin activity. // Cancer Biol. Ther. (2004), vol. 3 (11), pp. 1167-1168. .* .

83. Madri J.A. Extracellular ■matrixMmbdulationiiof-ivascùlar cell behaviour. // Transpl. Immunol. (1997), vol. 5, pp. 179-183. '

84. Maeshima Y., Colorado P.C., Kalluri R. Two RGD-independent ovft integrin binding sites on tumstatin regulate distinct anti-tumor properties. // J. Biol. Chem. (2000), vol. 275, pp. 23745-23750.

85. Magnusson S., Sottrup-Jensen L., Petersen'TjE1. >'Claeys 'H. In: Prothrombin and related coagulation factors (Eds:1 Hémker H.C. and Veltkamp J). // Universitaire Pers., Leiden, The Netherlands (1975), pp. 25-46.

86. Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein structure and function: relevance to isoforms, epitopes, and conformational variants. // Exp. Biol. Med. (2001), vol. 226 (5), pp. 377-408.

87. Mongiat M., Sweeney S.M., San Antonio J.D., Fu J., Iozzo R.V. Endorepellin, a novel inhibitor of angiogenesis derived from the^Gjterminusof perlecân. // J. Biol. Chem. (2003), vol. 278, pp. 4238-4249. "'« . .•• ' '/•:;!. t " ^

88. Moro R., Tamaoki T., Wegmann T.G., Longnecker B.M., Laderoute M.P. Monoclonal antibodies directed against a widespread oncofetal antigen: the alpha-fetoprotein receptor. // Tumor Biol. (1993), vol. 14, pp. 116-130.

89. Moser T.L., M.S. Stack, M-L. Wahl, S.V. JPizzo. The mechanism of action of angiostatin: can you teach an old dog new tricks? // Thromb. Haemost. (2002), vol. 87, pp. 394^01.

90. Moser T.L., Stack M.S., Asplin I., Enghild J.J., Hojrup P., Everitt L., Hubchak S., Schnaper H.W., Pizzo S.V. Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), vol. 96 (6), pp. 2811-2816.

91. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. // J. Immunol. Methods (1983), vol. 65 (1-2), pp. 55-63.

92. Murphy G., Stanton H., Cowell S., Butler G., Knauper V., Atkinson S., Gavrilovic J. Mechanisms for pro matrix metalloproteinase'activation //LAPMIS (1999), vol. 107, pp. 38-44.

93. Nyberg P., Xie L., Kalluri R. Endogenous inhibitors of angiogenesis. // Cancer Res. (2005), vol. 65 (10), pp. 3967-79.

94. O'Mahony C.A., Seidel A., Albo D., Chang H., Tuszynski G.P., Berger D.H. Angiostatin generation by human pancreatic cancer. // J. Surg. Res. (1998), vol. 77, pp. 55-58.

95. O'Reilly M.S., Boehm TV, Shing Y.1; Fukm N., Vasibi? GJ,1 Lane W.S., Flynn E., Birkhead J.R., Olsen B.R. Folkman J. Endostatin:1 aft endogdno\ii-'inhibitor of angiogenesis and tumor growth. // Cell (1997), vol. 88 (2), pp. 277-285.

96. O'Reilly M.S., Folkman J. Methods of inhibiting angiogenesis with endostatin protein. // US Patent # 6 630 448 B2 (Oct. 7,2003).

97. O'Reilly M.S., Holmgren L., Chen C., Folkman J. Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice // Nat Med. (1996),•• vol. 2 (6), pp. 689-692.

98. Ogiso H., Ishitani R., Nureki O., Fukai S., Yamanaka M., Kim J.H., Saito K., Sakamoto

99. A., Inoue M., Shirouzu M., Yokoyama S. Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains // Cell (2002), vol. 110, pp. 775-787.

100. Olsen B.R. From the editor's desk. // Matrix Biol. (2002), vol. 21, pp. 309-310.

101. Olsen B.R., Ninomiya Y. Multiplexins. In: Extracellular matrix, anchor, and adhesion proteins. (Eds. Kreis T. and Vale R.) // Oxford University Press (1999), pp. 399-401.

102. Pepper M.S., Vassalli ■ J.D.y"Wilk&".J:W.,' Schweigerer>L., Orci L., Montesano R. Modulation of bovine microvascular eridotheliall)»cellSprbteolytic properties by inhibitors of angiogenesis. // J. Cell Biochem. (1994), vol. 55, pp.'419-434.

103. Pirie-Shepherd S.R., Stevens R.D., Andon N.L., Enghild J.J., Pizzo S.V. Evidence for a novel O-linked sialylated trisaccharide on Ser-248 of human plasminogen 2. // J. Biol. Chem. (1997), vol. 272, pp. 7408-7411.

104. Ramchandran R., Dhanabal M., Volk-R'.yAVatermari<MJ.,-SegalM., Lu H., Knebelmann

105. B., Sukhatme V.P. Antiangiogenic• activity^of restinfsNClO1 'domain of human collagen XV: comparison to endostatin. // Biochem. Biophys; Res. Commun. (1999), vol. 255, pp. 735-739.

106. Rastinejad F., Polverini P.J., Bouck N.P. Regulation of the activity of a new inhibitor of angiogenesis by a cancer suppressor gene. // Cell (1989), vol. 56 (3), pp. 345-355.

107. Refino A., Schmitt D., Pater C. A carboxypeptidase inhibitor markedly improves the potency of t-PA in vivo II Fibrinolysis (1998), vol. 12 (supplt:-l), p. 29, abstract # 80.

108. Rosell-Novel A., Montaner J., Álvarez-Sabín J. Implicación de la angiogénesis en la isquemia cerebral humana. // Rev. Neurol. (2004), vol. 38, pp. 1076-1082.

109. Rutenfranz I., Bauer A., Kirchner H. Pharmacokinetic study of liposome-encapsulated human interferon-gamma after intravenous and intramuscular injection in mice. // J. Interferon Res. (1990), vol. 10 (3), pp. 337-341.

110. Salomon D.S., Brandt R., Ciardiello F., Normanno N. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies // Crit. Rev. Oncol. Hematol. (1995), vol. 19, pp. 183-232.

111. Sasaki T., Fukai N., Mann K., Gohring W., Olscn B.R., Timpl R. Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin.//EMBO J. (1998), vol.¡17,:ppr4249-4256^s >

112. Satchi-Fainaro R;,-Puder- Mi,''Daviesr J.W'.y iTrárí^H>T.J Sampson :D.Ai,;' Greene A.K., Corfas G., Folkman J. Targeting angiogenesis with a conjugate of HPMA copolymer and TNP-470. //Nat. Med. (2004), vol. 10 (3), pp. 255-261.

113. Savage C.R., Cohen J. Epidermal growth factor and a new derivative: rapid isolation procedures and biological and chemical characterization // J. Biol. Chem. (1972), vol. 247, pp. 7609-7611. r:.iV: :

114. Schmidt A., Addicks K., Bloch W. Opposite effects of endostatin on different endothelial cells.//Cancer Biol. Ther. (2004), vol. 3 (11),^pl-1162-116'6'.!

115. Schmidt A., Wenzel D.; Ferring1I:; 'KazeimMS.,'Sasaki'í.,-Hesch'eler Jl,Timpl R., Addicks K., Fleischmann B.K., Bloch W. Influence of endostatin on embryonic vásculo- and angiogenesis. // Dev. Dyn. (2004), vol. 230 (3), pp. 468-480.

116. Senger D.R., Galli S.J., Dvorak A.M., Peruzzi C.A., Harvey V.S., Dvorak H.F. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. // Science (1983), vol. 219, pp. 983-985.i V. <>!in^on |\< Riik'-ii >isc >

117. Shichiri M., Hirata Y. Antiangiogenesis signals by endostatin. // FASEB J. (2001), vol. 15, pp. 1044-1053. ,

118. Shing Y., Folkman J., Sullivan R., Butterfield 'C., Murray J.; Klagsbrun M. Heparin affinity: purification of a tumor-derived capillary endothelial cell growth factor. // Science (1984), vol. 223, pp. 1296-1298.

119. Sidky Y.A., Borden E.C. Inhibition of angiogenesis by interferons: effects on tumor- and lymphocyte-induced vascular responses. //Cancer'Res. (1987),'Vol.'47 (19), pp. 5155-5161.

120. Standker L., Schrader M., Kanse S.M., Jurgens'M.,4 Forssmanri W.G., Preissner K.T. Isolation and characterization of the circulating form of human endostatin. // FEBS Lett. (1997), vol. 420, pp. 129-133.

121. Sudhakar A., Sugimoto H., Yang C., Lively J., Zeisberg M., Kalluri R. Human tumstatin and human endostatin exhibit distinct antiangiogenic activities mediated by a,(3i and oc$01 integrins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003), vol. 100, pp. 4766-4771.

122. Syrovets T., Tippler B., Rieks M., Simmet T. Plasmin is a potent and specific chemoattractant for human peripheral monocytes acting via a cyclic guanosine monophosphate-dependent pathway // Blood (1997), vol. 89, pp. 4574^1583.

123. Talts J.F., Andac Z., Gohring W., Brancaccio A., Timpl R. Binding of the G domains of laminin and ai chains and perlecan to heparin, sulfatides, a-dystroglycan and several extracellular matrix proteins. // EMBO J. (1999), vol. 18, pp. 863-870.

124. Tarui T., Majumdar M., Miles L.A., Ruf W., Takada Y. Plasmin-induced migration of endothelial cells. A potential target for the anti-angiogenic action of angiostatin // J. Biol. Chem. (2002), vol. 277 (37), pp. 33564-33570.

125. Tarui T., Miles L.A., Takada Y. Specific interaction of angiostatin with integrin avP3 in endothelial cells. // J. Biol. Chem. (2001), vol. 276 (43), pp. 39562-39568.

126. Thomas D.A., Kantaijian H.M. Current role of thalidomide in cancer treatment. // Curr. Opin. Oncol. (2000), vol. 12, pp.-564-573.'M ■ '1 •. 1 ••

127. Tombran-Tink J.,• Barnstable C.J.\ Osteoblasts andi'osteoclasts express PEDF, VEGF-A isoforms, and VEGF receptors: possible mediators^of angiogenesis and matrix remodeling in the bone. // Biochem. Biophys. Res. Commun. (2004), vol. 316, pp. 573-579.

128. Torres J.M., Carracq N., Uriel J. Membrane proteins from lymphoblastoid cells showing cross-affinity for alpha-fetoprotein and albumin. Isolation and characterization. // Biochim. Biophys. Acta (1992), vol. 1159, pp. 60-66.

129. Travis J., Salvesen G.S. Human plasma proteinase^ inhibitors //Annu. Rev. Biochem. (1983), vol. 52, pp. 655-709. . ■ - . : : . . - . .

130. Troyanovsky B., Levchenko T., Mansson G., Matvijenko O., Holmgren L. Angiomotin: an angiostatin binding protein that regulates endothelial cell migration and tube formation. // J. Cell. Biol. (2001), vol. 152, pp. 1247-1254.

131. Vasir J.K., Reddy M.K., Labhasetwar V.D. Nanosystems in drug targeting: opportunities and challenges.//Curr. Nanoscience (2005),-vol. 1, pp. 47-64:^------

132. Wary K.K., Mariotti A., Zurzolo C., Giancotti F.G. A requirement for caveolin-1 and associated kinase Fyn in integrin signaling and anchorage-dependent ccll growth. // Cell (1998), vol. 94, pp. 625-634.

133. Wen W., Moses M.A., Wiederschain D., Arbiser J.L., Folkman J. The generation of endostatin is mediated by elastase. // Cancer Res. (1999), vol. 59, pp. 6052-6056.

134. White C.W., Sondheimer H.M., Crouch E.C.< , Wilson H., Fan L.L. Treatment of pulmonary hemangiomatosis with recombinant interferon alfa-2a. // N. Engl. J. Med. (1989), vol. 320(18), pp. 1197-1200.

135. Wickstrom S.A., Alitalo K., Keski-Oja J. An endostatin-derived peptide interacts with integrins and regulates actin cytoskeleton and migration of endothelial cells. // J. Biol. Chem. (2004), vol. 279 (19), pp. 20178-20185.

136. Wickstrom S.A., Alitalo K., Keski-Oja J.'Endostatiri associates with integrin c^jSi and caveolin-1, and activates Src via a tyrosyl phosphatase-dependent pathway in human endothelial cells. // Cancer Res. (2002), vol. 62, pp. 5580-5589.

137. Yeh C.H., Peng H.C., Huang T.F. Cytokines modulate'integrin alpha(v)beta(3)-mediated human endothelial cell adhesion and calcium signaling. // Exp. Cell Res. (1999), vol. 251 (1), pp. 57-66.

138. Yin G., Liu W., An P., Li P., Ding I., Planelles V., Schwarz E.M., Min W. Endostatin gene transfer inhibits joint angiogenesis and pannus formation in inflammatory arthritis. // Mol. Ther. (2002), vol. 5, pp. 547-554. : . .

139. You W.-K., So S;-H;, Lee H., Park S.'-Y., Yoori Mi-R.," Chang S.-I.,'Kim H.-K., Joe Y.-A., Hong Y.-K., Chung S.-I. Purification and characterization of recombinant murine endostatin in E. coli. II Experim. Mol. Med. (1999), vol. 31 (4), pp. 197-202.

140. Yuan F., Dellian M., Fukumuia'D.','Leuriig M^Berk D.,'Torchiliri V., Jain R. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. // Cancer Res. (1995), vol. 55, pp. 3752-3756.

141. Yurchenco P.D., O'Rear J.J. Basal lamina assembly. // Curr. Opin. Cell Biol. (1994), vol. 6, pp. 674-681.

142. Zatterstrom U.K., Felbor U., Fukai N. Olsen B.R. Collagen XVIII/endostatin structure and functional role in angiogenesis. // Cell. Struct. Funct. (2000), vol. 25, pp. 97-101.

143. Ziehe M., Donnini S., Morbidelli L. Development of new drugs in angiogenesis. // Curr. Drug Targets (2004), vol. 5, pp. 389-406.