Исследование влияния антиангиогенных агентов и конъюгатов альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста с химиотерапевтическими препаратами на онкогенез

Киселев, Сергей Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование влияния антиангиогенных агентов и конъюгатов альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста с химиотерапевтическими препаратами на онкогенез
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование влияния антиангиогенных агентов и конъюгатов альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста с химиотерапевтическими препаратами на онкогенез"

На правах рукописи

РГВ од

Киселев Сергей Михайлович | 3 ДЕК 2000

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ АНТИАНГИОГЕННЫХ АГЕНТОВ И КОНЪЮГАТОВ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА И ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА С ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМИ ПРЕПАРАТАМИ НА ОНКОГЕНЕЗ

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2000 г.

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте медицинской экологии Комитета здравоохранения Правительства г. Москвы и Государственном научном центре РФ - Институте биофизики.

Научные руководители:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор Северин С.Е.

доктор биологических наук Луценко C.B.

кандидат биологических наук Фельдман Н.Б.

доктор биологических наук, профессор Носкин Л.А.

кандидат биологических наук Есакова Т.В.

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится « 2000 г. на заседании

Диссертационного совета Д.171.02.01. при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН.

Автореферат разослан г. *

УЬь1 Ч - ь ,

Ученый секретарь Диссертационного совета, ' ' /

кандидат биологических наук ¿/^г^^—__^Отраднова В.В.

Актуальность проблемы. Одной из ключевых проблем современной медицинской науки и смежных с ней дисциплин является поиск путей повышения эффективности терапии злокачественных новообразований. Развитие опухолей представляет собой сложный морфогенетический процесс, полностью интегрированный в систему жизнеобеспечения организма. Интенсивные метаболитические потребности опухолевых клеток требуют адекватного снабжения их питательными веществами. Известно, что поддержание роста злокачественных новообразований тесно связано с процессом ангиогенеза, заключающегося в образовании кровеносной сосудистой сети, питающей опухоль. Подавление ангиогенеза приводит к резкому торможению роста опухолей и развития регионарных метастазов. В связи с этим особенно актуальной задачей является разработка методов получения и изучения возможностей терапевтического применения антиангиогенных препаратов, среди которых наиболее перспективным является ангиостатин - мощный эндогенный ингибитор ангиогенеза, образование которого инициируется рядом опухолей. Также важным представляется исследование антиангиогенного потенциала известных, хорошо зарекомендовавших себя в клинической практике препаратов, обладающих широким спектром терапевтического действия (стимуляция иммунной системы, подавление роста опухолей, способность снижать мутагенность химиопрепаратов и т.д.). Одним из таких препаратов может служить интерферон, изучение антиангиогенного и противоопухолевого действия которого в комбинированной терапии, совместно с противоопухолевыми препаратами направленного действия, может привести к значительному увеличению эффективности лечения онкологических заболеваний.

очередь, имеет ряд ограничений, важнейшими из которых являются низкая избирательность их действия и развивающаяся в короткие сроки резистентность опухолевых клеток к лекарственным препаратам. Одним из наиболее перспективных путей повышения терапевтической эффективности химиопрепаратов является их избирательный транспорт в виде конъюгатов с белковыми векторными молекулами. В связи с этим актуальной задачей исследования являлось получение конъюгатов АФП и ЭФР с доксорубицином -препаратом, широко используемым в клинической практике, а также сравнительное изучение противоопухолевой активности полученных конъюгатов. Параллельно решались задачи разработки метода препаративного выделения ангиостатина и изучения актиангиогенной и противоопухолевой активности ангиостатина и интерферона in vitro и in vivo.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение и исследование возможностей применения в области противоопухолевой терапии антиангиогенного препарата ангиостатина, интерферона-a и противоопухолевых препаратов направленного действия (конъюгатов доксорубицина с АФП и ЭФР). Для осуществления этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать модифицированную методику получения ангиостатина из плазмы крови человека, позволяющую выделять белок в препаративных количествах.

2. Оценить цитотоксическую активность препарата in vitro в отношении линий эндотелиальных и опухолевых клеток и исследовать противоопухолевую активность препарата in vivo.

3. Изучить антиангиогенную и противоопухолевую активность интерферона-а in vitro в отношении опухолевых и эндотелиальных клеток человека и мыши.

4. Синтезировать конъюгаты доксорубицина с векторными белками (АФП, ЭФР) и исследовать цитотоксическую активность полученных конъюгатов на культурах опухолевых и эндотелиальных клеток.

5. Изучить возможность снижения резистентности опухолевых клеток к доксорубицину при его применении в составе конъюгатов с АФП и ЭФР.

6. Сравнить химиотерапевтическую эффективность доксорубицина в составе конъюгатов с АФП и ЭФР со свободным препаратом в модельных экспериментах in vivo. Исследовать возможность совместного применения полученньгх конъюгатов и интерферона-a для лечения опухолей В16 у мышей.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработаны модифицированные методики выделения и очистки ангиостатина, а также синтеза и очистки препаратов направленного действия на основе доксорубицина и векторных белков (АФП, ЭФР), позволяющие получать активные и высокоочищенные препараты. Путем протеолитического расщепления получен ряд фрагментов плазминогена, проявляющих выраженную антиангиогенную активность. Наиболее высокая антиангиогенная активность продемонстрирована для ангиостатина, применение которого ¡n vivo позволяет значительно замедлить рост опухолей и увеличить продолжительность жизни экспериментальных животных. Впервые продемонстрирована возможность использования интерферона-a в качестве антиангиогенного препарата при противоопухолевой терапии. Показана терапевтическая эффективность интерферона-a in vivo при лечении мышей с солидными опухолями меланомы В16. Убедительно продемонстрирована значительно более высокая эффективность противоопухолевого действия конъюгатов ДР с АФП и ЭФР по сравнению со свободным антибиотиком в экспериментах на клеточных культурах и in vivo. Показано обращение резистентности опухолевых клеток к ДР при его применении в составе препаратов направленного действия (ДР-АФП и -ЭФР). Впервые продемонстрирована возможность увеличения эффективности противоопухолевого действия препарата АФП-ДР за счет включения в терапевтическую схему интерферона-а.

Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты работы и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на 27й1 meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Kyoto, Japan, 1999; 17th Meeting of the International Academy of Tumour Marker Oncology, Hong Kong, 2000; Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2000; 28"* meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Munich, Germany, 2000. Диссертационная работа апробирована 4 сентября 2000 г. на семинаре МНИИМЭ.

Результаты и их обсуждение

Ключевая роль ангиогенеза в опухолевом росте подтверждается многочисленными исследованиями, проведенными на солидных опухолях животных и человека. Воздействия, подавляющие ангиогенез и не влияющие непосредственно на опухолевые клетки, приводят к торможению роста опухоли или к ее регрессии (Folkman J., 1990). Эксперименты O'Reilly и сотр. по исследованию биологических жидкостей мышей, несущих солидные опухоли слабометастазирующей карциномы Льюис, привели к открытию эндогенного, индуцируемого опухолью ингибитора ангиогенеза - ангиостатина (Ас), подавляющего развитие регионарных метастазов и проявляющего значительный противоопухолевый эффект в отношении ряда злокачественных новообразований - рака прямой кишки, простаты, молочной железы и др. Для дальнейшего изучения ангиангиогенной активности Ас, а также возможности его терапевтического применения, нами была модифицирована ранее описанная методика (O'Reilly M.S., Holmgren L. et.al., 1996), что позволило в течение короткого времени получать белок в препаративных количествах.

Выделение плазминогена из плазмы крови человека

Ас получали путем ферментативного расщепления плазминогена (Пг) плазмы крови человека эластазой. Плазму центрифугировали, фильтровали и разбавляли фосфатно-солевым буфером (ФСБ). Разбавленную плазму наносили на колонку с лизин-сефарозой, уравновешенную тем же буфером.

Аффинный носитель был приготовлен нами на основе сефарозы CL-6B путем ее активации бромцианом с последующей посадкой лизина на активированную смолу согласно методике (Kohn J., Wilchek M., 1982) Емкость

лизин-сефарозы, определенная по количеству связавшегося с ней Пг, составила 0.9 мг белка/мл смолы.

После нанесения плазмы, для удаления балластных белков колонку промывали фосфатным буфером. Согласно методике (O'Reilly M.S., Holmgren L. et.al., 1996) в качестве промывочного буфера использовали 0.3 М фосфатный буфер и отмывку колонки проводили при комнатной температуре, что приводило к существенным потерям белка. Нами было показано, что снижение концентрации фосфатного промывочного буфера до 0.2 М не сказывается на чистоте получаемого Пг, приводит к увеличению его выхода и позволяет проводить все операции по выделению белка при +4°С. Элюирование Пг проводили в изокргтическом режиме раствором 0.2 М s-аминокапроновой

кислоты в ФСБ. Профиль элюции

кДа-

180

360 V, мл.

Рис. I. А. Профиль элгацни Пг с колонки с лизин-сгфзрозой. Элгоент -0 2 М е-амикокапроновая кислота. Б Электрофореграмма выделения Пг из плазмы крови. 1. Плазма крови 2. Проскок плазмы. 3. Пг.

Пг представлен на рис. 1А. Фракции, содержащие Пг, собирали, концентрировали и использовали для идентификации и

характеристики белка. С помощью моноклональных антител к Пг и данных ДСН-элеетрофореза в ПААГ (рис. 1Б) полученный белок был идентифицирован нами как Пг. Как видно на элекгрофореграмме (рис. 1Б, 5), выделенный препарат Пг представляет собой смесь двух полипепгидов с М.м. 88 и 92 кДа, что согласуется с литературными данными (Castellino F.J., et а!., 1981). Представленная методика

характеризуется высоким выходом и позволяет получать до 180 мг Пг из 1 л плазмы. При выделении препаративных количеств

Пг мы столкнулись с проблемой высокого содержания липополисахаридов в элюате с аффинной колонки, что существенно снижало чистоту получаемого препарата. Для устранения липополисахаридов мы использовали экстракцию липидов элюата хлороформом, что привело к значительному увеличению чистоты препарата Пг.

Получение и очистка ангностатина

Протеолиз Пг эластазой проводили в трис-HCI буфере (рН 7.S) при 37° С. Ферментативную реакцию останавливали после полного расщепления Пг. Время завершения ферментативной реакции, определенное с помощью электрофоретического анализа (рис. 2) составило S ч. Продукты ферментативной реакции разделяли на колонке с лизин-сефарозой, уравновешенной фосфатным буфером. По нашим данным, использование ФСБ при проведении хроматографии является более предпочтительным по сравнению с традиционно применяемым трис-HCI буфером (O'Reilly M.S. Holmgren L., et.al.., 1996), поскольку обеспечивает эффективную посадку Ас на аффинный носитель.

1.0

два Ангносташн

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ферментативного расщепления Пг эластазой. Пг (I) после 1 ч инкубации с ферментом (2), 2 ч инкубации (3), 4 ч инкубации (4), 5 ч инкубации (5). Электрофорез проводили в 12.5% ПААГ.

0.5

100

200 V, мл.

Рис. 3. Профиль элюции ангностатина с колонки с лизин-сефарозой. Элюат -0.2 М е- аминокапроновая кислота.

Элюирование Ас с колонки проводили 0.2 М раствором е-аминокапроновой кислоты в ФСБ (рис. 3). Анатиз полученного белка с помощью ДСН-

электрофореза

показал, что препарат

А 230

0.5

0.25

Ангиостатен

кДа.

150

300 V, мл.

П ~ (Б)

3 —

Рис 4. А. Гель-фильтрация ангиостатина на колонке с сефакрнлом 3-200. Б. Электрофореграмма препаратов Ас на различных стадиях очистки. 1. Препарат после расщепления Пг эластазой 2 Ас после очистки на лизин-сефарозе 3. Ас после гель-фильтрации (сефакрил 5-200).

Рис 5 Обращеннофазояая ВЭЖХ ангиостатина на колонке с иКгаэрЬеге 005.

Ас представлен двумя мажорными поли-

пептидными полосами, с молекулярными массами 38 и 40 кДа (рис. 4Б), причем степень очистки Ас, достигаемая при хроматографии на лизин-сефарозе, недоста-точна (рис. 4Б, 2). В связи с этим, проводили

дополнительную очистку Ас на колонке с сефакрилом 5-200,

предварительно уравновешенным ФСБ (рис. 4). Анализ чистоты препарата проводили с помощью ОФ ВЭЖХ (рис. 5). После заключительной стадии очистки нами был получен препарат Ас, содержащий два

полипептида с М.м. 38 и 40 кДа (рис. 4Б, 3). Чистота препарата составила >98 % по данным ОФ ВЭЖХ и ДСН-электрофореза. Выход Ас составил 45 мг из 1 л плазмы.

Цитотоксическая активность ангиостатина

Сравнительное исследование цитотоксической активности (ЦТА) Ас проводили на эндотелиальных клетках пупочной вены зародыша человека (НЬ'УБС), эндотелиальных клетках аорты быка (АВАЕ), клетках нормальных фибробластов ЗТЗ, гладкомышечных клетках аорты быка (ЬБМС), опухолевых клетках карциномы молочной железы линии МСР-7"" и меланомы В16. Результаты исследования показали, что Ас проявлял выраженную ЦТА в отношении эндотелиальных клеток (рис. б), причем клетки АВАЕ проявляли заметно более высокую чувствительность к действию Ас чем [ТСУЕС

Для оценки токсического действия Ас на структурные элементы зрелых кровеносных сосудов исследовали ЦТА препарата в отношении гладкомышечных клеток (ЬБМС). Как видно на рис. 7, Ас не оказывал влияния на ЬЭМС в диапазоне действующих в отношении эндотелия концентраций (от 10 до 100 мкг/мл). При концентрациях Ас, превышающих 100 мкг/мл, проявлялся выраженный циготоксический эффект препарата (1С<о= 330 мкг/мл), который, вероятно, не имеет физиологического значения. Исследование ЦТА в отношении опухолевых клеток линии МСГ-7"1 показало, что препарат не проявлял заметной ЦТА в широком диапазоне концентраций (10 до 400 мкг/мл) (рис. 7). Наряду с Ас мы исследовали ЦТА его предшественника - Пг в отношении опухолевых клеток линии В16 и фибробластов ЗТЗ (рис. 8).

При этом в диапазоне концентраций от 10 до 100 мкг/мл цитотоксического эффекта Ас не наблюдалось (рис. 8А). Однако при высоких концентрациях препарат Ас проявля ЦТА в отношении как клеток В16, так и фибробластов ЗТЗ. По-видимому, в

физиологических условиях столь высокие концентрации Ас в интерстициальной жидкости

достигаться не могут, и данный

100 80 60 40-

3 20-

1С,,, мкг/мл АВАЕ 4.4 НЦУЕС 12.7

1 10 100

[Ангиостатин], мкг/мл

Рис. 6. Влияние ангиостатина на выживаемость эндотелиальных клеток АВАЕ и НЦУЕС.

[Ангиостатин], мкг/мл

Рис. 7. Влияние ангиостатина на выживаемость

молочной железы МСР-7 гладкомышечных клеток аорты быка

ьэмс.

клеток карциномы wt

факт ингибирования имеет чисто теоретическое значение.

Исследование ЦТА Пг показало, что белок проявлял ЦТА в отношении клеток В16, чего не наблюдалось в экспериментах с фибробластами ЗТЗ (рис. 8Б). Вероятно, что ЦТА Пг может объясняться его

протеолиткческим расщеплением ферментными системами

опухолевых клеток с образованием активных фрагментов,

обуславливающих токсичность препарата. Следует отметить, что

ЦТА Ас в отношении эндотелиальных клеток значительно превышает его активность в отношении опухолевых клеток (рис. 6 - 8). Таким образом, представленные результаты исследования влияния Ас на различные типы клеток наглядно иллюстрируют специфическую ЦТА препарата в отношении клеток эндотелия.

^ во £

| 60 й

я 40

а 40

А-п-а-, 4

1С(|, мкг/мл

О В16 223

О ЗТЗ 331

[Ангиостатин], мкг/мл

10 100 [Плазминоген], мкг/мл

Рнс. 8. Влияние ангиостатина и плазминогена на выживаемость клеток линий В16 и ЗТЗ.

Изучение активности фрагментов протеолиза плпзминогена сериновымн протеазамн

В настоящее время в ряде работ (O'Reilly M.S. et. al., 1999; Werb Z. et. al., 2000) приводятся убедительные аргументы в пользу того, что индукция образования Ас опухолью опосредована через увеличение активности ферментов, участвующих в частичном протеолизе циркулирующего в крови Пг. Это объясняет торможение роста регионарных метастазов первичной опухолью за счет поддержания определенного уровня ингибиторов ангиогенеза в крови. При исследовании механизмов образования Ас отмечается важная роль матричных металлопротеиназ, тканевых активаторов Пг и других ферментов (Gately S. et. al., 1997). В связи с этим представляло интерес

исследовать антиангиогенную

активность фрагментов Пг, полученных в результате его протеолиза эластазой и другими сериновыми протеазами (а-химотрипсин и пдазмин), высокий уровень экспрессии которых отмечается при ряде онкологических заболеваний. Для этой цели предварительно из плазмы крови человека был выделен Пг (92 кДа) на колонке с лизин-сефарозой. После нанесения плазмы и промывки колонки, Пг

Рис. 9 Электрофореграмма продуктов элюировали градиентом £-

ферментативного расщепления Пг (1)

. .... аминокапроновои кислоты.

а-химотрипсином (2), эластазой (3) и г

штазмином (4).

ЕГротеолнтическое расщепление плпзминогена а-химотрипсином Ферментативную реакцию проводили в трис-НС1 буфере (рН 7,8) в течение 5 ч. О завершении протеолиза судили по данным ДСН-электрофореза. Продукт расщепления представлял собой на электрофореграмме дублет с мажорной (М.м. 48 кДа) и минорной (М.м. 46 кДа) полосами (рис. 9, 2). Препарат был

очищен от компонентов реакционной смеси на лизин-сефарозе с последующей гель-фильтрацией на колонке с сефакрилом S-200.

Протеолитическое расщепление плазминогена плазмином

Расщепление Пг плазмином проводили согласно методике (Shi G.Y., Wu H.L., 1988) в глициновом буфере (рН 10,5) в течение 14 ч. Фрагмент Пг очищали от компонентов реакционной смеси на колонке с лизин-се'фарозой, предварительно уравновешенной фосфатным буфером (рН 8,0) и элюировали градиентом Е-аминокапроновой кислоты. Дополнительную очистку фрагмента Пг проводили с помощью гель-фильтрации на колонке с сефакрилом S-200. Выделенный фрагмент (К1-5) по данным ДСН-электрофореза представлял собой полипептид с М.м. 55 кДа (рис. 9, 4).

Цитотоксическая активность протеолитическнх фрагментов Пг

На рис. 10 представлены кривые ЦТ А. фрагментов Пг (Ac, К1-5, Пеп 46, 48) в отношении эндотелиальных клеток HUVEC. Все три фрагмента проявляли специфическую ЦТА в отношении эндотелиальных клеток в диапазоне концентраций от 1 доЗО мкг/мл. При этом ЦТА Пеп 46, 48 характеризуется 1С!0 равным 23.7 мкг/мл. ЦТА Ас и К1-5-фрагмента оказались более

высокими и характеризовались близкими значениями — 12.7 мкг/мл (Ас) и 15.4 мкг/мл (К 1-5).

Известно, что Пг является предшественником плазмина-

сериновой протеазы, играющей ключевую роль в стимуляции процессов ангиогенеза и опухолевого роста (Reuning U.et al., 1998). Как показано выше, расщепление Пг другими сериновыми протеазами (плазмин, химотр ипсин) приводит к образованию различных по

Продукты протеопша Пг О inaCTaioii (Ас) О плазмнном (К 1-5) Д хнчотрипснном (Пеп 46, 48)

[Протеолитнческин фрагмент], мкг/мл

Рис. 10. Влияние продуктов расщепления плазминогена

сериновыми протеазами на

выживаемость эндотелиальных клеток пупочной вены зародыша человека (Ни\'НС).

Рис. 11. Роль плазминогена а процессах ангногенеза и опухолевого роста.

молекулярной массе протеолитических фрагментов, обладающих специфической антиангиогенной аетивностью. Таким образом, можно предположить существование двух путей реализации регуляторной роли Пг в опухолевом ангиогенезе - стимуляции и подавлении (рис. 11). В зависимости от типа лротеолитического фермента, воздействующего на Пг образуются активные фрагменты белка либо стимулирующие, либо подавляющие процесс опухолевого ангиогенеза.

Поскольку наиболее высокую ЦТА в отношении эндотелиальных клеток проявлял Ас, мы исследовали его противоопухолевую активность in vivo

Исследование противоопухолевой активности ангиостатнна ш vivo

Противоопухолевую активность Ас исследовали на модели солидной мышиной меланомы В16. Поскольку особенностью опухоли данного типа является высокая степень васкуяяризации, обусловливающая ее злокачест-

венный фенотип (Erhard et al, 1997), исследование противоопухолевого действия Ас в отношении меланомы В16 представляло особый интерес.

В соответствии со спецификой действия, исследуемый препарат начинали вводить мышам при достижении опухолями размера около 200 мм3, при котором начинается их васкуляризация (Kim В., Sim L., 1998), Следует отметить, что терапевтическое применение Ас не приводило к появлению каких-либо токсических эффектов. Исследование влияния Ас на развитие солидных опухолей В16 показало, что подкожное введение препарата в однократной дозе 20 мг/кг ежедневно в течение 20 дней оказывало заметное ингибирующее действие на рост опухолей (рис, 12). Так, к 22 дню эксперимента размер опухолей у мышей, получавших Ас был более чем в 2 раза меньше, чем в контрольной группе. При этом тенденция к замедленному развитию опухолей сохранялась и после прекращения введения препарата. Кроме того, лечение животных Ас приводило к увеличению продолжительности жизни животных на 21%. Таким образом в результате проведенного эксперимента продемонстрирована значительная противоопухолевая активность Ас в отношении солидной меланомы В16, что является подтверждением важной роли

процесса ангиогенеза в росте и

15 20 25 30 35 Дни после прививки опухоли

Рис. 12. Влияние ангиостатина на рост солидных опухолей меланомы В16 у мышей С57В1/6.

развитии злокачественных

новообразований. По нашему мнению, основными направлениями дальнейшего применения Ас в противоопухолевой терапии

являются поиск оптимальных терапевтических схем его введения в сочетании с лекарственными препаратами, оказывающими

непосредственное токсическое действие на опухолевые клетки.

Исследование антиангиогенной и противоопухолевой активности интерферона-а in vitro

Очевидно, что механизм противоопухолевого действия ряда препаратов может заключаться как в прямом токсическом действии на опухолевые клетки, так и опосредованном, через модификацию функций различных систем организма, играющих важную роль в онкогенезе. Одним из таких препаратов является интерферон-а (ИНФ-а), характеризующийся широким спектром действия (стимуляция противоопухолевого иммунитета, подавление онкогенов, снижение мутагенной активности, противовирусная активность и др.) и успешно применяемый в настоящее время в области терапии ряда онкологических заболеваний. При применении ИНФ-а наблюдается подавление роста, а в некоторых случаях регрессия сильноваскуляризированных опухолей, включая саркому Капоши, легочные гемангиоматозы и гемангиомы (Грачева Л.А., 1996). Учитывая множественность физиологических функций ИНФ-а, можно предположить, что наряду с непосредственным влиянием на опухолевые клетки его антиангиогенное действие является одним из путей подавления роста злокачественных новообразований. Для исследования потенциала антиангиогенного и непосредственно противоопухолевого действия

ИНФ-а мы исследовали его ЦТА в

отношении

эндотелиальных

(НЦУЕС) и опухолевых клеток линий МС7-1, А43] и В16. Как видно на рис. 13, ИНФ-а проявлял дозозависимый ростингибирующий эффект в отношении

эндотелиальных клеток в диапазоне концентраций от 0,1 до 2ООО Е/мл. При этом ИНФ-а проявлял слабовыраженный цитотоксический эффект а отношении конфлюентных эндотелиальных клеток (рис 13)

отношении

0,1 1 10 100 1 000 [Интерферон], Е/мл

Рис. 13. Влияние ИНФ-а

на

выживаемость эндотелиальных клеток пупочной вены зародыша человека (HUVEC).

Супрессивное действие ИНФ-а в отношении пролиферирующего эндотелия оказалось значительно более выраженным (ICso=5,7 Е/мл), что может бьггь прямой причиной подавления роста опухоли in vivo в результате антиангиогенного

действия данного цитокина. Различие в чувствительности к ИНФ-а у конфлюентных и активно делящихся клеток может быть связано как с разницей в индуцибельности олигонуклеотидов в этих клетках (Marti et al., 1981), так и с различным уровнем экспрессии и активации рецепторов к ИНФ-а на их поверхности (Aguet et al., 1981).

Исследование активности препарата в отношении опухолевых клеток показало, что при высоких концентрациях ИНФ-а проявляет дозозависимый цитотоксический эффект. Как видно на рис. 14, препарат обладает более высокой активностью в отношении опухолевых клеток линий MCF-7 по сравнению с А431 и В16. При этом резистентные к антрациклинам клетки (MCF-7AirR) оказались заметно более устойчивыми к действию ИНФ-а по сравнению с чувствительными (MCF-7Wl). Вероятно, что чувствительность клеток к ИНФ-а во многом определяется фенотипическими особенностями клеток и наличием в среде ростовых факторов, конкурентно ингибирующих или блокирующих рецепторы ИНФ-а, что может нивелировать ингибирующий эффект ИНФ-а на уровне внутриклеточных событий, обусловленных активацией рецептора. Также вероятно, что супрессивный дозозависимый эффект ИНФ-а может быть обусловлен стимуляцией дифференцировки этих клеток, т.е. обращением трансформированного фенотипа. Полученные нами данные подтверждают возможность проявления супрессивного действия ИНФ-

«з га

140. 120 100 80 60 40 20

К^.К чл 1Св. Е/мл

□ MCF-7"' 29011 А А-Ш Í8986 О MCF-7"* 110982 V в 1S 960и

100

1000

10000 100000

[Интерферон], Е/мл

Рис 14. Влияние ИНФ-а на выживаемость клеток карциномы молочной железы МСР-7"" и МСР-7А,Ь8, эпидермальной карциномы человека А431 и мышиной меланомы В16.

а в отношении опухолевого роста как через подавление ангиогенеза, так и путем непосредственного воздействия на опухолевые клетки.

Несмотря на достигнутые в последние годы успехи в применении антиангиогенной терапии, необходимо учитывать, что воздействия подобного рода приводят в основном к торможению роста опухолей и лишь в редких случаях к ее полной регрессии. Поскольку применение антиангиогенных препаратов в комбинированной терапии совместно с химиотерапевтическими препаратами, оказывающими непосредственный цитотоксический эффект в отношении опухолевых клеток, представляется весьма перспективным, мы исследовали цитотоксическую и противоопухолевую активность конъюгатов доксорубицина с векторными белками, включая их применение in vivo в сочетании с ИНФ-ос.

Получение и исследование противоопухолевой активности конъюгатов доксорубицина с векторными белками (а-фетопротеинои и эпидермальиым фактором роста)

Большой экспериментальный материал, накопленный в клинической практике при использовании химиопрепаратов, позволяет выявить ряд серьезных недостатков, препятствующих проведению полноценного химиотерапев-тического курса, основными из которых являются низкая избирательность действия применяемых лекарственных средств и развивающаяся в короткие сроки резистентность опухолей к применяемым препаратам.

В связи с этим мы исследовали возможность повышения терапевтической эффективности доксорубицина (ДР) - одного из химиопрепаратов, широко применяемых при лечении целого ряда онкологических заболеваний. Повышение противоопухолевой активности ДР было осуществлено нами за счет направленной доставки цитотоксического агента к опухоли с помощью белковых векторов - а-фетопротеина (АФП) и эпидермального фактора роста (ЭФР) человека. Выбор белковых молекул обусловлен высоким уровнем экспрессии их рецепторов на поверхности различных типов опухолевых клеток, по сравнению с нормальными (Naval J. et. al., 1985, Krotúng R. et. al., 1995). Для достижения поставленной цели мы синтезировали коньюгаты ДР с АФП и ЭФР с использованием глутарового

альдегида в качестве бифункционального «сшивающего» реагента. Связывание белка я цитотоксического агента в коньюгатах осуществлялось посредством образования шиффовых оснований. Данная модель «сшивки» была избрана нами в связи с легкостью гидролиза связи между ДР и соответствующей векторной молекулой при кислых значениях рН (эндосомы, лизосомы), приводящего к освобождению в клетке цитотоксического агента.. Молярные соотношения в конъюгатах АФПДР и ЭФР:ДР составляли 1:2 и 1.1, соответственно.

ЦТА доксорубицина и его каньюгатоа с АФП и ЭФР

Сравнительное исследование эффективности цитотоксического действия ДР, доставляемого в опухолевые клетки ЭФР и АФП, проводили на клетках карциномы молочной железы человека линии MCF-7'Vt. Как видно на рис. 15А и 16А, оба конъюгата проявляли дозозависимую ЦТА в отношении исследуемой клеточной линии, причем ДР в составе конъюгатов с АФП и ЭФР проявлял более высокую ЦТА в отношении опухолевых клеток по сравнению со свободным ДР. Относительное увеличение ЦТА для конъюгатов АФП-ДР и ЭФР-ДР составляло 81% и 80%, соответственно. Представленные данные наглядно иллюстрируют преимущество векторной доставки ДР, поступающего

А Б

и о

я а

са

100 80 60 40 20 О

[АФЩ, нМ

0,5 5 50 500 50 £00

120т

■Д-Д—Д-д—Д»

V4^ \ \

Д-Д

—а—др

ГС„, нМ 175

—О—АФП-ДР 33 —Д—АФП_

[АФП], нМ 5000

1с,, ям а—др 5314 о—афп-др 763

100 1 000 [ДР],нМ

100

1000

10000

1ДР],нМ

Рис 15. Цитотоксическая активность ДР и его конъюгата с АФП в отношении опухолевых клеток карциномы молочной железы человека линий MCF-7Wl (А) и MCF-7" (Б).

10 100

[ЭФР], нМ 1000 100 120

[ЭФР], нМ 10000 100000

1с„, им —□—др 175

—о—эфр-др 35 —л—эфр

р-о^

1с„ям —п—др 5314 —о—эфр-др »2

100 1000 [ДРЬнМ

100

1000

10000 100000 [ДР], НМ

Рис. 16. Цетотоксическая активность ДР и его конъюгата с ЭФР в отношении

опухолевых клеток карциномы молочной железы человека линий МСР-7"' (А) и МСГ-7афя ^

в клетку-мишень в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза конъюгатов ДР-белок, по сравнению с поступлением свободного ДР через плазматическую мембрану путем пассивной диффузии. Полученные результаты свидетельствуют о возможности успешного использования АФП и ЭФР для рецептор-опосредованного транспорта ДР в опухолевые клетки.

Важнейшей проблемой химиотерапии злокачественных новообразований является развивающаяся в короткие сроки резистентность опухолевых клеток к лекарственному воздействию. Данный феномен известен как множественная лекарственная устойчивость (МЛУ). Для изучения возможности преодоления МЛУ посредством векторной доставки к опухолевым клеткам хкмиопрепаратов нами было проведено сравнительное исследование ЦТА свободного и конъюгированного с АФП и ЭФР ДР на резистентных к антрациклинам клетках линии МСР-Т^'3. Как видно на рис. 15Б, !6Б, использование конъюгатов АФП-ДР и ЭФР-ДР приводит к значительному повышению чувствительности клеток к антибиотику. Так, ЦТА конъюгатов АФП-ДР и ЭФР-ДР превышает активность свободного ДР в 7 и 6 раз, соответственно. Вероятно, что в отличие от диффузии свободного ДР при рецептор-опосредованном внутриклеточном транспорте АФП-ДР выброс ДР из клетки, обусловленный действием АТР-зависимого насоса Р170, ограничен, что

может служить объяснением повышенной чувствительности резистентных клеток к конъюгату. Представленные данные позволяют рассматривать конъюгаты ДР с АФП и ЭФР в качестве перспективных противоопухолевых химиотерапевтических средств, позволяющих в значительной мере решать проблемы, связанные с МЛУ.

Цитотоксическая активность конъюгатов АФП-ДР и ЭФР-ДР в отношении эндотелиальных клеток

Известно, что прогрессия опухолей тесно связана со степенью их васкуляризации. Ключевую роль в данном процессе играет активация эндотелиальных клеток кровеносных капилляров, близлежащих к опухолевым клеткам. При этом опухоль секретирует факторы роста, активирующие соответствующие рецепторы на поверхности эндотелиальных клеток. Данный факт наводит на мысль о возможной доле антиангиогенного действия коныогата ЭФР-ДР в проявлении его противоопухолевого эффекта ir\ vivo. С этой точки зрения представлялось интересным провести сравнительное исследование ЦТА конъюгатов (ЭФР-ДР и АФП-ДР) со свободным ДР в отношении эндотелиальных клеток.

Для постановки эксперимента мы использовали пролиферирующий эндотелий (HUYEC). В качестве контроля, моделирующего выстилку кровеносных сосудов, использовали конфлюекгные зндотедиальные клетки. Результаты исследования ЦТА свободного ДР и конъюгатов в отношении конфлюектного и пролиферирующего эндотелия приведены на рис. 17 и в табл. 1. Как видно на рис. 17, ЦТА конъюгатов ДР как с АФП, так и с ЭФР в отношении конфлюентного эндотелия существенно превышала ЦТА свободного ДР Так, ЦТА АФП-ДР и ЭФР-ДР превышала активность свободного ДР более чем п 10 и 8 раз, соответственно (табл. 1). Все исследуемые препараты также проявляли дозозависимую ЦТА в отношении пролкферирующих эндотелиальных клеток, причем ЦТА ДР в составе коньюгатов значительно превышала активность свободного антибиотика (рис. 17). Так, ЦТА АФП-ДР, оцениваемая по показателю ICS0, превышала активность свободного ДР более чем в 14 раз (в случае конъюгата ЭФР-ДР наблюдалось 34-кратное превышение ЦТА в сравнении со свободным

i л PS

ДР

■»нлогмин

w □ Н^.ПИМNT ныА м

~ "р оя и^е р ир уким мй

[ДР|, мкМ

1Е-5 tE-4 1Е-3 0,01 O.t

_ [ДР|.мкМ

ЭФР-ДР

\\ Y

•нтдагыий «он+лимктный "0™>р»«фрнру*п«11

1E-4 1E-3 0,01 0.1 1

[ДР1,мкМ

Рис. 17. Цитотоксическая активность ДР и его конъюгатов с АФП и ЭФР в отношении эндогелиальных клеток HUVEC.

ДР) (табл. 1). Необходимо отметить, что ЦТА ДР и его конъюгатов с АФП и ЭФР была заметно выше в отношении пролиферирующего эндотелия по сравнению с конфлюентным (табл. 1). Так, ЦТА в отношении пролиферирующего эндотелия ДР, АФП-ДР и ЭФР-ДР была выше в 2, 2,8, 8,2 раза, соответственно, по сравнению с конфлюентным эндотелием. Таким образом, конфлюентный эндотелий является менее уязвимым к цитотоксическому действию противоопухолевых агентов в сравнении с про-лиферирутощим, что позволяет рассматривать конъюгаты в качестве не только противоопухолевых, но и антиангио-генных агентов. Представленные данные позволяют говорить о возможности избирательного токсического действия исследуемых конъюгатов в отношении пролиферируюших эндогелиальных клеток, что может являтся дополнительным механизмом противоопухолевого действия конъюгатов in vivo, опосредованного через ингибирование опухолевого

ангиогенеза и нарушение

кровоснабжения опухоли.

Таблица 1. Цитотоксическая активность доксорубицина и его конъюгатов с АФП и ЭФР в отношении эндогелиальных клеток _ _

Эндотелиальные клетки (HUVEC) 1С{(,,нМ

ДР АФП-ДР ЭФР-ДР

пролиферирующие 171 12 5

конфлюентные 336 33 41

Противоопухолевая активность ДР и его конъюгатов с АФП и ЭФР in vivo

Противоопухолевую активность конъюгатов АФП-ДР и ЭФР-ДР in vivo исследовали на традиционно используемой для тестирования химиопрепаратов модели мышиной меланомы В16, предварительно определив ЦТА АФП-ДР, ЭФР-ДР и ДР in vitro (рис. IS). Несмотря на различие в путях поступления в клетку свободного ДР (неспецифично, путем свободной диффузии) и конъюгатов (специфично, в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза), ЦТА конъюгатов и свободного ДР для клеток меланомы В16 значительно не отличались (рис. 18). В связи с этим с нашей точки зрения представлялось интересным сравнить терапевтическую эффективность препаратов in vivo. Несмотря на отсутствие существенных различий ЦТА конъюгатов и свободного ДР в опытах in vitro на клетках мышиной меланомы В16, использование конъюгатов in vivo вполне оправдано в связи с преимуществом адресной доставки антибиотика как к опухолевым, так и к пролиферирующим эндотелиальным клеткам, опосредующим стимуляцию васкуляризации опухолей.

На рис 19 приведена динамика роста опухолей у мышей, получавших внутривенно ДР и его коньюгат с ЭФР по соответствующей схеме в дозах 0.2 мг/кг по доксорубицину. Терапевтическое применение свободного ДР в

[АФП],нМ

50 500 1

[ЭФРЬ нМ

0,5

100 1000

100 10ОО 1

10 1 00 1000

[ДР], НМ

[ДР],нМ

Рис. 18. Цитотоксическая активность ДР и его конъюгатов с АФП (А) и ЭФР (Б) в отношении опухолевых клеток мышиной меланомы линии В16.

60005000

4 4000

'-3-к1>1П"р<>.1Ь

-О-ДР —Л—ЭФР-ДР

10 15 20 25 30 35 Дни после прививки опухоли

Рис. 19. Противоопухолевое действие ДР и его конъюгата с ЭФР в отношении солидных опухолей В16 у мышей С57В1/6.

указанных дозах не приводило к ингибированию роста опухолей, а, наоборот, даже стимулировало опухолевый рост. Лечение животных конъюгатом ЭФР-ДР приводило к значительному замедлению роста опухолей. Относительный объем опухолей у мышей, получавших конъюгат ЭФР-ДР, составлял 39% к моменту начала гибели контрольных животных. Кроме того, в отличие от свободного ДР, внутривенное введение ЭФР-ДР приводило к 46% УСПЖ по сравнению с контролем. При применении ДР и конъюгата АФП-ДР по такой же схеме ингибирование роста опухолей отмечалось только в случае конъюгата, причем относительный объем опухолей составлял лишь 34% к дню начала гибели контрольных животных (рис. 20). УСПЖ составило 48,5% по сравнению с контролем. Таким образом, коньюгаты ДР с ЭФР и АФП можно рассматривать в качестве перспективных средств лечения злокачественных меланом и, вероятно, других типов опухолей.

Исследование противоопухолевой активности конъюгата АФП с ДР и интерферона-ос in vivo

Как было показано выше в экспериментах in vitro, ИНФ-а и конъюгат АФП с ДР наряду с цитотоксической противоопухолевой активностью проявляют выраженную антиангиогенную активность. В связи с этим представляло интерес наряду с индивидуальным противоопухолевым действием ИНФ-а и АФП-ДР исследовать возможность их комбинированного воздействия на высоковаскуляризированные солидные опухоли меланомыВ16.

ИНФ-а вводили внутримышечно в течение 10 дней, начиная с 3 дня после прививки опухоли, в дозах 10s Е/кг веса. ДР и его конъюгат

с АФП вводили, как описано выше. Результаты влияния ИНФ-а, вводимого как индивидуально, так и в сочетании с ДР и конъюгатом АФП-ДР, на рост опухолей у мышей представлены на рис. 20. Применение только ИНФ-а приводило к заметному

терапевтическому эффекту - объем опухоли у леченных животных, был - в 2 раза меньше, чем у контрольных к моменту начала их гибели, а УСПЖ составляло 31%. Включение ИНФ-а в терапевтическую схему сопровождалось выраженным усилением

противоопухолевого действия

препаратов ДР и АФП-ДР. Так, в отличие от свободного ДР, не оказывавшего ингибирующего влияния на рост опухолей и УСПЖ, комбинированное его введение с ИНФ-а приводило к 25%-ному ингибированию роста опухолей и 27%-ному увеличению СПЖ животных. Объем опухолей у мышей, подвергнутых сочетанной терапии ИНФ-а и АФП-ДР, был в 1,4 раза меньше, чем у мышей, получавших только конъюгат, а УСПЖ составляло 56,2% (при применении только АФП-ДР - 48,5%). Полученные iv vitro и in vivo результаты позволяют предположить, что такой эффект ИНФ-а обусловлен проявлением как прямого цитотоксического действия на опухолевые клетки, так и опосредованного через ингибирование процесса васкуляризации опухоли. Вероятно также, что наряду со стимуляцией факторов специфического противоопухолевого иммунитета основу полученных эффектов могут составлять: антимутагенное действие интерферона, снижающее вероятность образования резистентных к химиотерапии опухолевых клеток (Засухина Г.Д., 1983); модификация ИНФ внутриклеточного метаболизма и клеточной поверхности, приводящая к обращению трансформированного фенотипа (Mannering et al., 1980); активация ИНФ лизосомальных гидролаз, участвующих в деструкции опухоли (Padovan et al., 1981).

60 0 0-

40 0 0

о 2000

о vá

—О—контроль -о—ДР

—А—да + ИНФ-а —О—АФП-ДР —V—АФП-ДР +ИНФ-0 —Н—ИНФ-а

10 15 20 25 30 35 Дни после прививки опухоли

Рис. 20. Противоопухолевое действие ИНФ-а, ДР и конъюгата АФП-ДР в отношении солидных опухолей В16 у мышей С57В1/6.

Полученные результаты наглядно иллюстрируют возможность увеличения эффективности противоопухолевого действия конъюгата АФП-ДР при включении ИНФ-а в терапевтическую схему.

Выводы

1. Разработана модифицированная методика получения и очистки ангиостатина человека, позволяющая получать высокоочищенный белок в препаративных количествах.

2. Продемонстрирована специфическая цитотоксическая активность ангиостатина в отношении эндотелиальных клеток. В экспериментах in vivo на мышах с привитыми опухолями меланомы В16 показано, что терапевтическое применение ангиостатина приводит к значительному ингибированию опухолевого роста и увеличению средней продолжительности жизни животных.

3. Обнаружена антиангиогенная активность различных фрагментов плазминогена, полученных путем протеолитического расщепления белка сериновыми протеазами.

4. Показана цитотоксическая активность интерферона-a в отношении эндотелиальных и опухолевых клеток человека. При этом установлено, что пролиферирующий эндотелий значительно более чувствителен к действию ИНФ-а, чем конфлюекгный, Показана терапевтическая эффективность ИНФ-а in vivo при лечении мышей с солидными опухолями меланомы В16.

5. На основе разработанных схем синтезированы конъюгаты доксорубицина с векторными белками - АФП и ЭФР и продемонстрирована их высокая противоопухолевая активность in vitro и in vivo. Показано, что применение доксорубицина в составе конъюгатов с векторными белками (АФП, ЭФР) позволяет значительно снизить резистентность опухолевых клеток к антибиотику.

6. Впервые продемонстрирована цитотоксическая активность конъюгатов АФП- и ЭФР-ДР в отношении эндотелиальных клеток человека, причем активность конъюгатов в отношении пролиферирующего эндотелия значительно превышала их активность в отношении конфлюентного.

7. Показано, что применение конъюгатов АФП и ЭФР с ДР для лечения солидных опухолей меланомы В16 у мышей приводит к значительному ингибированию опухолевого роста и увеличению продолжительности жизни животных. Показана возможность увеличения эффективности противоопухолевого действия препарата АФП-ДР за счегт включения в терапевтическую схему ИНФ-а.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. S.V.Lutsenko, N.V. Gukasova, S.V. Kiseiev, M.E. Severina, N.B. Feldman, S E. Severin. The cytotoxic effect of the alpha-fetoprotein- doxorubicin conjugate on human embnonic umbilical vein endothelial cells and tumor cells MCF-7. Abstracts of 27л meeting of the ISOBM, Kyoto, Japan, 1999, p. 35.

2. Kiseiev S.M., Gukasova N.V, Feldman N.B., Lutsenko S V., Severin S.E. The use of protein vector a-fetoprotein (AFP) for targeted delivery of doxorubicin (DR) to endothelial and cancerous human cells. Abstracts of П01 Meeting of the International Academy of Tumour Marker Oncology, Hong Kong, 2000, p. 37.

3 Фельдман Н.Б., Киселев C.M., Гукасова H.B., Посыпанова Г.А., Хомяков Ю Н,, Луценко С.В., Северин С.Е. Цитотоксическая и противоопухолевая активность конъюгата а-фетопротеина с доксорубицином. Тезисы докладов Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2000, с. 556.

4. Луценко С.В , Фельдман Н.Б., Гукасова Н.В., Посыпанова ПА., Киселев С.М., Северин С Е. Использование белковых векторов для направленного транспорта доксорубицяна в опухолевые клетки-мишени. Тезисы докладов Российского национального конгресса «Человек и лекарства», Москва, 2000, с. 518.

5. Луценко СВ., Фельдман Н.Б , Гукасова НВ, Посыпанова Г.А., Киселев СМ., Северин С Е. Повышение терапевтической эффективности доксорубииина при его адресном транспорте к опухоли-мишени с помощью альфа-фетопротеина. Биомедицинские технологии, 2000, №13, с. 27-31.

6. Луценко С.В., Киселев С.М., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Фельдман Н.Б, Северин С.Е. Эпидермальный фактор роста и его рецептор-связывающий фрагмент как векторы для направленной доставки доксорубицина в опухолевые клетки. Биомедицинские технологии, 2000, №13, с. 23-27.

7. Н.Б. Фельдман, С.М. Киселев, Н.В. Гукасова, ГА. Посыпанова, С.В. Луценко, С.Е.Северин. Противоопухолевая активность конъюгата а-фетопротеина с доксорубицином in vitro и in vivo. Биохимия, 2000, в печати.

8. S.M. Kiseiev, N.V. Gukasova, N.B Feldman, S.V. Lutsenko, S.E. Severin. Cytotoxic activity of the conjugate of the epidermal growth factor with doxorubicin against human cells. Abstracts of 28th meeting of the ISOBM, Munich, Germany. Tumor Biology, 2000, V. 21(1), p. 137.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Киселев, Сергей Михайлович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физиологический ангиогенез

1.2. Роль ангиогенеза в развитии злокачественных новообразований

1.3. Морфологические особенности опухолевого ангиогенеза

1.4. Генетическая детерминация опухолевого ангиогенеза

1.5. Основные медиаторы опухолевого ангиогенеза 1В

1.5.1. \TEGF (фактор роста эндотелия сосудов)

1.5.2. Ангиопоэтины

1.5.3. Основной фактор роста фибробластов (ЬБОБ)

1.5.4. Окись азота (N0)

1.6. Ингибиторы опухолевого ангиогенеза.

1.7. Перспективы антиангиогенного и антиваскулярного воздействия в 30 противоопухолевой терапии.

1.7.1. Антиангиогенная терапия

1.7.1.1. Ингибиторы ангиогенных факторов роста

1.7.1.2. Ингибиторы протеолитических ферментов ВКМ, опосредующих 33 процесс ангиогенеза.

1.7.1.3. Ингибиторы клеточно-матриксных взаимодействий

1.7.1.4. Ингибиторы пролиферации эндотелиальных клеток

1.7.2. Антиваскулярная терапия

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 46 2.1. Получение ангиостатина 46 2.1.1 Приготовление аффинной смолы для выделения плазминогена

2.1.2. Выделение плазминогена.'

2.1.3. Протеолиз плазминогена эластазой.

2.1 АВыделение и очистка ангиостатина

2.2 Получение и очистка фрагментов плазминогена, полученных 48 протеолизом сериновыми протеазами

2.2.1 46, 48 кДа протеолитический фрагмент плазминогена

2.2.2. 55 кДа протеолитический фрагмент плазминогена (К1-5)

2.2.3. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле.

2.2.4. Иммуноблоттинг

2.3. Выделение и очистка АФП.

2.4. Выделение и очистка ЭФР

2.5. Получение конъюгатов

2.5.1. Получение конъюгата Др с АФП.

2.5.2. Получение конъюгата Др с ЭФР

2.6. Культивирование клеток

2.7. Определение цитотоксической активности препаратов in vitro

2.7.1. Определение ЦТА ангиостатина в отношении эндотелиальных 52 клеток АВАЕ

2.7.2. Определение ЦТА ангиостатина, протеолитических фрагментов плазминогена и конъюгатов доксорубицина с АФП и ЭФР в отношении эндотелиальных клеток HUVEC.

2.7.3. Определение ЦТА плазминогена, ангиостатина и конъюгатов 53 доксорубицина с АФП и ЭФР в отношении клеток ЗТЗ, bSMC, MCF-7,

А431, В

2.7.4. Оценка жизнеспособности клеток

2.8. Определение противоопухолевой активности препаратов in vivo

2.8.1. Животные и опухоли

2.8.2. Дозы препаратов и схемы их введения

2.8.2.1. Ангиостатин

2.8.2.2. Интерферон-ос

2.8.2.3. Доксорубицин и его конъюгаты с АФП и ЭФР

2.8.2.4. Контрольные животные

2.8.2.5. Объем опухолей

2.8.2.6. Продолжительность жизни животных

2.9. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 56 3.1. Получение и очистка ангиостатина

3.1.1. Выделение плазминогена из плазмы крови человека

3.1.2. Получение и очистка ангиостатина 58 3.2.Определение цитотоксической активности ангиостатина

3.3. Изучение активности фрагментов протеолиза плазминогена 64 сериновыми протеазами

3.3.1. Протеолитическое расщепление плазминогена а-химотрипсином

3.3.2. Протеолитическое расщепление плазминогена плазмином

3.3.3. Цитотоксическая активность протеолитических фрагментов Пг

3.4. Исследование противоопухолевой активности ангиостатина in vivo

3.5. Исследование антиангиогенной и противоопухолевой активности 69 интерферона-a in vitro

3.6. Получение и исследование противоопухолевой активности 72 конъюгатов доксорубицина с векторными белками (а-фетопротеином и эпидермальным фактором роста)

3.5.1. ЦТА доксорубицина и его коньюгатов с АФП и ЭФР

3.5.2. Цитотоксическая активность конъюгатов АФП-ДР и ЭФР-ДР в 75 отношении эндотелиальных клеток

3.5.3. Противоопухолевая активность ДР и его конъюгатов с АФП и ЭФР 77 in vivo

3.5.4. Исследование противоопухолевой активности конъюгата АФП с ДР 81 и интерферона-a in vivo

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование влияния антиангиогенных агентов и конъюгатов альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста с химиотерапевтическими препаратами на онкогенез"

Одной из ключевых проблем современной медицинской науки и смежных с ней дисциплин является поиск путей повышен™ эффективности терапии злокачественных новообразований. Развитие опухолей представляет собой сложный морфогенетический процесс, полностью интегрированный в систему жизнеобеспечения организма. Интенсивные метаболитические потребности опухолевых клеток требуют адекватного снабжения их питательными веществами. Известно, что поддержание роста злокачественных новообразований тесно связано с процессом ангиогенеза, заключающегося в образовании кровеносной сосудистой сети, питающей опухоль. Подавление ангиогенеза приводит к резкому торможению роста опухолей и развития регионарных метастазов. В связи с этим особенно актуальной задачей является разработка методов получения и изучения возможностей терапевтического применения антиангиогенных препаратов, среди которых наиболее перспективным является ангиостатин - мощный эндогенный ингибитор ангиогенеза, образование которого инициируется рядом опухолей. Также важным представляется исследование антиангиогенного потенциала известных, хорошо зарекомендовавших себя в клинической практике препаратов, обладающих широким спектром терапевтического действия (стимуляция иммунной системы, подавление роста опухолей, способность снижать мутагенность химиопрепаратов и т.д.). Одним из таких препаратов может служить интерферон, изучение антиангиогенного и противоопухолевого действия которого в комбинированной терапии, совместно с противоопухолевыми препаратами направленного действия, может привести к значительному увеличению эффективности лечения онкологических заболеваний.

Несмотря на достигнутые в последние годы успехи в применении антиангиогенных агентов в области онкологии, необходимо отметить, что хотя их действие приводит к эффективному торможению роста опухолей, после прекращения терапии происходит быстрое возобновление опухолевого роста. В связи с этим особую актуальность при лечении онкологических заболеваний приобретает комплексная терапия, основанная как на прямом цитотоксическом воздействии на опухолевую клетку, так и опосредованном через систему кровоснабжения опухоли. Однако, применение химиопрепаратов, в свою очередь, имеет ряд ограничений, важнейшими из которых являются низкая избирательность их действия и развивающаяся в короткие сроки резистентность опухолевых клеток к лекарственным препаратам. Одним из наиболее перспективных путей повышения терапевтической эффективности химиопрепаратов является их избирательный транспорт в виде конъюгатов с белковыми векторными молекулами. В связи с этим актуальной задачей исследования являлось получение конъюгатов АФП и ЭФР с доксорубицином -препаратом, широко используемым в клинической практике, а также сравнительное изучение противоопухолевой активности полученных конъюгатов. Параллельно решались задачи разработки метода препаративного выделения ангиостатина и изучения антиангиогенной и противоопухолевой активности ангиостатина и интерферона in vitro и in vivo.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Широкий круг исследований, проведенных в последние годы, показал, что противоопухолевый эффект лекарственных препаратов может быть обусловлен как прямым токсическим действием на опухолевые клетки, так и опосредован через модификацию функций различных систем организма. Очевидно, что мишень химиотерапевтического воздействия должна удовлетворять, по крайней мере, двум принципам. Во-первых, она должна играть ключевую роль в жизнедеятельности опухолевой клетки или всей опухоли. Во-вторых, биохимический процесс в опухолевой клетке, на которую направлено воздействие должен отличаться от соответствующих процессов, протекающих в нормальных клетках. Именно в соответствии с этими принципами в настоящем обзоре рассматривается ангиогенез как мишень противоопухолевых воздействий.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Киселев, Сергей Михайлович

ВЫВОДЫ

4. Показана цитотоксическая активность интерферона-a в отношении эндотелиальных и опухолевых клеток человека. При этом установлено, что пролиферирующий эндотелий значительно более чувствителен к действию ИНФ-а, чем конфлюентный. Показана терапевтическая эффективность ИНФ-а in vivo при лечении мышей с солидными опухолями меланомы В16.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Киселев, Сергей Михайлович, Москва

1. Evans Н.М. On the development of the aortae, cardinal and umbilical veins, and the other blood vessels of vertebrate embryos from capillaries Anat.Rec 1909, 3, 498518.

2. Афанасьев Ю.А., Юрина H.А. Гистология M.: Медицина, Москва, 1999.

3. Risau W., Sariola H., Zerwes H., Sasse J.,Ekblom P.,Kemler R., Doetschman T. Vasculogenesis and angiogenesis in embryonic-stem-cell-derived embryoid bodies. Development. 1988, 102, 471-478.

4. Pepper M.S., Mandriota S.J.,Vassalli J.D., Orci L., Montesano R. Angiogenesis-regulating Cytokines: Activities and Interactions. Current Topics in Microbiology and Immunology. 1996, 213, 31-65.

5. Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Med. 2000, 6, 389-395.

6. Risau W. Mechanisms of angigenesis. Nature. 1997, 386, 671-674

7. Moses M.A., Klagsbrun M. Molecular angiogenesis. Chemistry&Biology 1999, 6, R217-R224.

8. Gimbrone M.A., Leapman S.,Cotran R.S., Folkman J. Tumour dormancy in vivo by prevention of neovascularisation. J.Exp.Med. 1972, 73, 461-473.

9. Folkman J. Antiangiogenesis: new concept for therapy of solid tumours. Ann. Surg. 1972, 409-416.

10. Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J.Natl.Cancer Inst. 1990, 82,4-6.

11. Brem S.S., Jensen H.M., Gullino P.M. Angiogenesis as a marker of preneoplastic lesions of the human breast. Cancer(Philad.) 1978, 41, 239-244.

12. Hanahan D., Folkman J. Patterns and Emerging Mechanisms of the Angiogenic Switch during Tumorigenesis. Cell. 1996, 86, 353-364.

13. Folkman J., Watson K., Ingber D.,Hanahan D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 1989, 339, 58-61.

14. Guidi A. J., Fischer L., Harris J.R., Schnitt S.J. Microvessel density and distribution in ductal carcinoma in situ of the breast. J.Natl.Cancer Inst. 1994, 86, 614619.

15. Vaupel P.,Kallinowski F.,OkuniefF P.Blood flow, oxygen and nutrient supply, and metabolic microenviroment of human tumours: a review. Cancer Res. 1989, 49, 64496465.

16. Sutherland R.M. Cell and enviroment interactions in tumour microregions: the multicell spheroid model. Science 1988,240, 177-183.

17. Nederman T., Twentyman P. Spheroids for studies of drug effects. In Spheroid in cancer research: methods and perspectives New York: Springer-Verlags, 1984, 84 -102.

18. Schweiki D., Neeman M., Itin A., Keshet E. Induction of vascular endotelial growth of factor expression by hypoxia and by glucose deficiency in multicell spheroids: implications for tumour angiogenesis. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995, 92, 768-772.

19. Denekamp J., Hobson B. Endotelial cell proliferation in experimental tumours. Br.J.Cancer 1982, 46, 711-720.

20. Dewhirst M.W., Tso C.Y., Oliver R., Gustafson C.S., Secomb T.W., Gross J.F. Morfologic and Hemodynamyc comparison of tumor and healing normal tissue microvasculature. Int. J.Radiation Oncology Biol. Phys. 1989, 17, 91-99.

21. Jain R.K. Determinants of tumor blood flow: a review. Cancer Res. 1988, 48, 2641-2658.

22. Denekamp J. Endotelial cell proliferation as a novel approach to targeting tumor therapy. Brit.J.Cancer 1982, 45, 136-139.

23. Dameron K.M., Volpert O.V., Tainsky M.A. Control of angiogenesis in fibroblast byp53 regulation of thrombospondin-1. Science 1994 265 1582-1584

24. Rastinejad F., Polverini P.J., Regulation of the activity of a new inhibitor of angiogenesis by a cancer suppressor gene. Cell 1989, 56,345-355.

25. Ponton A.,Coulombe B.,Skup D. Decreased expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in metastatic tumor cells leading to increased levels of collagenase activity. Cancer.Res 1991, 51, 2138-2143.

26. Mitsuhashi R., Bayko L., Shirasawa S., Kerbel R. Mutant Ras upregulates VEGFWPF expression: implications for induction and inhibition of tumor angiogenesis. Cancer.Res 1995, 55, 4575- 4580.

27. Inglesias T., Lianos S.,Munoz A. Induction of ptaleted-derived growth factor B\c-sis by the v-erbA oncogene in glial cells. Oncogene 1995, 10, 1103-1110.

28. Thomas K. Transforming potential of fibroblast growth factor genes. TIBS 1988, 13,327-328

29. Rastinejad F.,Bouck N. Oncogenes and tumour suppressor genes in the regulation of angiogenesis. Tumour angiogenesis 1997,9,101-111.

30. Mukhopadhyay D.,Tsiokas L., Foster D. Hypoxic induction of human vascular endotelial growth factor expression through c-src activation. Nature, 1995,375, 577579.

31. Vandenbunder B.,Wernert N. L'oncogene c-ets-1 participe-t-il a la regulation de 1'angiogenese tumorale. Bull.Cancer 1993, 80, 38-49.

32. Kaszubska W.,Hai T. Cyclic AMP-independent ATF family members interact with NF-kappa B and function in the activation of the E-selectin promoter in response to cytokines. Moll.Cell.Biol. 1993, 13, 7180-7190.

33. Bobik A., Agrotis A, and Little P.J. Vascular-derived growth factors: potential role in the development of the tumour vasculature. Tumour angiogenesis ,1997,15,170-184.

34. Dvorak H.F., Senger D.R. Fibrin as a component of the tumor stroma: Origins and biological significans. Cancer Metastasis Rev. 1983, 2, 41-73.

35. Connolly D.T.,Heuvelman D.M.,Nelson R., Feder J. Tumor vascular permeability factor stimulates endotelial cell growth and angiogenesis. J. Clin Invest. 1989, 84, 1470-1478.

36. Ferrara N., Davis-Smyth T. The Biology of Vascular Endotelial Growth Factor. Endocrine Rev. 1997, 18, 4-25.

37. Achen M.G., Stacker S.A. The vascular endotelial growth factor family; proteins which guide the development of the vasculature. Int. J.Exp.Path. 1998, 79, 255-265.

38. Dvorak H.F., Nagy J.A.,Feng D., Dvorak A.M. Vascular Permeability FactorYVascular endotelial Growth Factor and the significance of microvascular Hyperpermeability in Angiogenesis. Berlin: Springer-Verlags, 1999, 237, 98-130.

39. Nicosia R.F. What is the role of Vascular Endotelial Growth factor -related molecules in tumor angiogenesis? American Journal of Pathology 1998, 1, 11-15.

40. Davis S.,Yancopoulos G.D. The Angiopoetins: Yin and Yang in angiogenesis Berlin: Springer-Verlags, 1999, 237, 174-184.

41. Davis S., Gale N.W. Ligand for the EPH-related receptor tyrosine kinase that require membrane attachment or clustering for activity. Science 1994, 266, 816-819.

42. Maisonpierre P.C.,Suri C., Jones P.F., Yancopoulos G.D. Angiopoetin-2, a natural antogonist for Tie-2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science 1997,277,5560.

43. Basilico C.,Moscatelli D. The FGF family of growth factors and oncogenes. Adv.Cancer.Res. 1992, 59, 115-165.

44. Bikfalvi A.,Klein S.,Pintucci G. The role of proteases in angiogenesis. Tumor angiogenesis, 1997,11, 116-122.

45. Florkiewicz R.Z. Multiple forms of bFGF: differential nuclear and cell surface localization . Growth factors 1991, 4, 265-275.

46. Burrus L.M., Zuber M.E., Lueddecke M.E. Identification of a cystein-rich receptor for fibroblast growth factors.Mol.Cell.Biol. 1992, 12, 5600-5609.

47. Ignaro L.J. Endotelium-derived nitric oxide: actions and properties. FASEB J. 1989,3,31-36.

48. Ziche M., Morbidelli L., Masini E. Nitric oxide mediates angiogenesis in vivo and endotelial cell growth and migration in vitro promoted by substance. J.Clin.Invest. 1994, 94, 2036-2044.

49. Fukumura D., Jain R.K. Role of nitric oxide in angiogenesis and microcirculation of tumors. Cancer and Metastasis Reviews 1998, 17, 77-89.

50. Lewis C.E., Balkwill F.R. The complex molecular network regulating tumour angiogenesis: the importance of context. Tumor angiogenesis 1997, 10, 110-114.

51. Moore B.B., Keane M.P.,Addison C.L.,Arenberg D.A. CXC chemokine modulation of angiogenesis: the importance of balance between angiogenic and angiostatic members of the family. J.Inv.Med. 1998, 46, 114-120.

52. Rollins B.G., et.al. Chemokines. Blood 1997, 90, 909-928.

53. Parangi S.,O'Reilly M.S., Christofori G.,Antiangiogenic therapy of transgenic mice impairs de novo tumor growth. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 1996, 93, 2002-2007.

54. Brouty-Boye D., Zetter B.R., Inhibition of cell motility by interferon. Science 1980,208,516-518.

55. Ricketts R.R., Hatley R.M., Corden B.J. Interferon a-2a for the treatment of complex hemangiomas of infancy and childhood. Ann Surg. 1994, 219, 605-614.

56. Gupta S.K., Hassel Т., Singh J.P. A potent inhibitor of endotelial cell proliferation is generated by proteolytic cleavage of the chemokine platelet factor -4. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 1995, 92, 7799-7803.

57. BouckN., Stellmach V., Hsu S. How tumors become angiogenic.Adv.Cancer.Res. 1996, 23, 345-349.

58. Dameron K.M., Volpert O.V.,Tainsky M.A., Bouck N. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1. Science 1994, 265, 1582-1584.

59. Tolmsa S.S., et.al. неопубликованные данные.

60. Van Meir E.G., Polverini P.J. Release of an inhibitor of angiogenesis upon induction of wild type p53 expression in glioblastoma cells. Nature Genet. 1994, 8, 171-176.

61. Dawson D.W., Tolsma.S.S., Volpert O.V., Bouck N.P. Retinoblastoma gene expression alters angiogenic phenotype. Proc. Am. Soc. Cancer. Res. 1995, 63, 88.

62. Iliopoulos O,, Levy A., Goldberg M. Negative regulation of hypoxia-inducible genes by the von Hippel-Lindau protein. Proc.Natl.Acad. Sci.USA 1996, 93, 1059510599.

63. Bagavandoss P., Wilks J.E., Specific inhibition of endotelial cell proliferation by thrombospondin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990, 170, 867-872.

64. Bartow C.F., Priebe C.J., Mulliken J.B. Spastic diplegia as a complication of interferon a-2a treatment of hemangiomas ofintancy. J. Pediatry 1998, 132, 527-530

65. Larsen N.S. Clinical applications of interferon у in cancer treatment. J.Natl.Cancer.Inst. 1993, 85, 1628-1630.

66. Ny T.,Sawdey Т., Lawrence D. PAI-1, PAI-2 regulatory functions of tumor angiogenesis. Proc.Natl.Acad. Sci.USA 1986, 83, 6776-6780.

67. Fan T-P.D. Platelet- factor- 4. Trends Pharmacol. Sci.1994,15,33-36.

68. O'Reilly M.S., Holmgren L.,Shing Y.,Cao Y., Folkman J. Angiostatin- a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell. 1994, 79, 315-328.

69. O'Reilly M.S.,Boehm T.,Shing Y., Folkman J. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell. 1997, 88, 277-285.

70. Pike S.E., Yao L., Jones K.D.,Tosato G. Vasostatin, a calreticulin fragment, inhibits angiogenesis and suppresses tumor growth. J.Exp.Med. 1998, 188, 2349-2356.

71. Clapp C., Martial J.A.,Guzman R.C. The 16 kDa N-terminal fragment of human prolactin is a potent inhibitor of angiogenesis. Endocrinol. 1993, 133, 1292-1299.

72. Homandberg G.A., Williams J.E., Grand D., Schumacher B., Eisenstein R. Heparin-binding fragments of fibronectin are potent inhibitors of endotelial cell growth. Am. J. Pathol. 1985, 120, 327-332.

73. Adams G.E., Fowler J.F., Wardman P. Hypoxic cell sensitizers in radiobiology and radiotherapy (Proceedings of 8th L.H. Gray Conference). Brit. J. Cancer, 1978, 37, Supplement III.

74. Szabo S., Sandor Z., The diagnostic and prognostic value of tumor angiogenesis. Eur.J.Surgery 1998, 164, 99-103.

75. Denekamp J. Angiogenesis, neovascular proliferation and vascular pathophysiology as targets for cancer therapy. The British Journal of Radiology 1993, 66, 181-196.

76. Kendall R.L., Wang G., Thomas K.A. Identification of a natural soluble form of a vascular endotelium growth factor Flt-1 and its heterodimerisation with KDR. Biochem. Biophy. Res. Comm. 1996, 226, 324-328.

77. Cheng S.Y., Huang S., Nagane M. Suppression of glioblastoma angiogenicity and tumorgenicity by inhibition of endogenous expression of vascular endotelial growth factor. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 8502-8507.

78. Saleh M., Stacker S.A., Wilks A.F. Inhibition of growth of C6 glioma cells in vivo by expression of antisense vascular endotelial growth factor sequence. Cancer.Res. 1996,56, 393-401.

79. Claffey P.C.,Senger D., Spiegelman B.M. Structural requirements for dimerisation, glycosylation , secretion, and biological function of VPFWEGF. Biochim. Biophys. Acta 1995, 1246, 1-9.

80. Kerbel R.S. Tumor angiogenesis: past, present, and the near future. Cancerogenesis 2000,123,505-515

81. Hayashi K„ Madri J.A., Yurchenco P.D. J.Cell.Biol. 1992, 119, 945-959.

82. Gourley M., Williamson J.S., Angiogenesis: New targets for the development of anticancer chemotherapy. Current Pharmaceutical Design 2000, 6, 417-439

83. Kleiner D.E., Stetlerstevenson W.G. Matrix Metalloproteinases and Metastasis. Cancer chemotherapy and pharmacology 1999, 43, S42-S51.

84. Mignatti P., Rifkin D.B. Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion. Physiol. Rev. 1993, 73, 161-195.

85. Werb Z., Thiennu H., Julie L. Matrix-degrading proteases and angiogenesis during development and tumor formation. APMIS 1999, 107, 11-18.

86. Declerk Y.A., Laug W.E. Plasminogen activators and their inhibitors: cooperation between matrix metalloproteinases and the plasminogen activator-plasmin system in tumor progression. Enzyme Protein 1996, 49, 72-84.

87. Montgomery A.M.P., Mueller B.M., Reisfeld R. A., Declerck Y. A. Effect of tissue inhibitor of the matrix metalloproteinase-2 expression on the growth and spontaneous metastasis of a human melanoma cell line. Cancer Res. 1994, 54, 5467-5473 .

88. Jonson M.D., Kim H.R., Chesler L. Inhibition of angiogenesis by tissue inhibitor of metalloproteinase. J. Cell. Physiol. 1994, 160, 194-202.

89. Hagmann W.K., Lark M.W.,Becker J.W. Ann.Rep.Med.Chem. 1996, 31, 231240.

90. Eliceiri B.P.,Cheresh D.A. The role of av integrins during angiogenesis. Molecular Medicine 1998, 4, 741-750.

91. Brooks P.C., Montgomery A.M., Rosenfeld. Integrin avb3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels. Cell 1994, 79, 1157-1164.

92. Brooks P.C., Clark R.A.F., Cheresh D.A. Requirement of vascular integrin avP3 for angiogenesis. Science 1994, 264, 569-571.

93. Ruegg C. Evidence for the involvement of endotelial cell integrin av(33 in the disruption of the tumor vasculature induced by TNF and IFN-y. Nature Med. 1998, 4, 408-414.

94. Scwarz M.A. Signaling by integrins: implications for tumorigenesis. Cancer Res. 1993, 53, 1503-1506.

95. Folkman J. Adressing blood vessels. Nature biotechnology 1999, 34, 505.

96. Gutheil J.C., et.al. Phase I study of Vitaxin, an anti-angiogenic humanized monoclonal antibody to vascular integrin avp3. Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.( in the press)

97. Laflamme S.E., AuerK.L. Integrin signaling. Cancer Biology 1996, 7, 111101. Ingber D., Fujita T., Kishimoto S. Synthetic analogues of fiimagillin that inhibit angiogenesis and suppress tumour growth. Nature 1990, 348, 555-557.

98. Abe J.I., Zhou W., Takuwa N., Taguchi J.I., Kurokawa K. Cancer Res. 1994, 54, 3407-3412.

99. Ingber D., In Cancer Therapeutics: Experimental and Clinical Agents; Teicher B.A.,Ed.; Teicher B. A., Ed.; Humana Press: Totowa, NJ, 1997, 283-335.

100. Folkman J. Angiogenesis inhibitors generated by tumors. Mol.Med. 19995, 1, 120-122.

101. Cao Y., Ji R.W.,Davidson D., Schaller J., Folkman J. Kringle domains of human angiostatin. J.Biol. Chem. 1996, 271,29461-29467.

102. Gately S.M.,Twardowsky P.,Stack M.S. Humane prostate carcinoma cells express enzymatic activity that converts human plasminogen to the angiogenesis inhibitor, angiostatin. Cancer Res. 1996, 56, 4887-4890.

103. Falcone D.J., Faisal Khan K.M., Layne T., Fernandes L. Macrophage formation of angiostatin during inflammation. J.Biol. Chem. 1998, 273, 31480-31485.

104. Rivas M.J.G., Arii S., Furutani M.,Imamura M. Expression of human macrophage metalloelastase gene in hepatocellular carcinoma: correlation with angiostatin generation and its clinical significance. Hepatology 1998, 28, 986-993.

105. O'Reilly M.S., Stetlerstevenson W.G., Folkman J., Moses M. Regulation of Angiostatin Production by Matrix Metalloproteinase-2 in a Model of Concomitant Resistance. J. Biol. Chem. 1999,274, 41,29568-29571.

106. Gately S., Twardowski P., Stack M.S.,et.al. The mechanism of cancer-mediated conversion of plasminogen to the angiogenesis inhibitor angiostatin. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997, 94, 10868-10872.

107. Lucas B.R., Holmgren I., Sim B.K.L., Pepper M.S. Multiple forms of angiostatin induce apoptosis in endotelial cells. Blood 1998, 12, 4730-4741.

108. Ji W.R., Castellino F.J., Chang J., Deford M.E, et.al. Characterization of kringle domains of angiostatin as antogonists of endotelial cell migration, an important process in angiogenesis. FASEB.J. 1998, 12, 1731-1738.

109. Sim B.K.L. AngiostatinTM and EndostatinTM:endothelial cell-specific endogenous inhibitorsof angiogenesis and tumor growth. Angiogenesis 1998, 2, 37-48.

110. Moser T.L., Stack M.S., Asplin J. et.al., Angiostatin binds ATP syntase on the surface of human endotelial cells. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999, 96, 2811-2816.

111. Claesson-Welsh L., Welch M., Folkman J. Angiostatin induces endotelial cell apoptosis and activation of focal adhesion kinase independently of the integrin-binding motifRGD. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998, 95, 5579-5583.

112. Gately S Bafetti LM et al Stack MS. Angiostatin inhibits endothelial and melanoma cellular invasion by blocking matrix-enhanced plasminogen activation. Biochem. J 1999,340,77-84.

113. Kirsh M., Strasser J., Allende R., et.al. Angiostatin supresses malignant glioma growth in vivo. Cancer Res. 1998, 58, 4654-4659.

114. Lannutti B.J.,Gately S.T., et.al. Human angiostatin inhibits murine hemangioendothelioma tumor growth in vivo. Cancer Res. 1997, 57, 5277-5280.

115. Holmgren L.,0'Reilli M.S., Folkman J. Dormancy of micrometastases: balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression. Nature Med. 1995, 1, 149-153.

116. Wu Z., O'Reilly M.S.,Folkman J., Shink Y. Suppression of tumor growth with recombinant murine angiostatin. Biochem. Biophy. Res. Commun. 1997, 236, 651654.

117. Sim B.K.L., O'Reilly M.S.,Liang H.,et.al. A recombinant human angiostatin protein inhibits experimental primary and metastatic cancer. Cancer Res. 1997, 57,1329-1334.

118. O'Reilly M.S., Holmgren L., Chen C., Folkman J. Angiostatin induced and sustains dormancy of human primary tumors in mice. Nature Med. 1996, 2, 689-692.

119. Blezinger P., Wang J.J., et.al. Inhibition of tumor growth and tumor metastases by intramuscular administrtion of the endostatin gene. Nature Biotecnology 1999, 17, 343-348.

120. O'Reilly M.S.,Boehm T.,Shing Y., Folkman J. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell. 1997, 88, 277-285.

121. Boehm T., Folkman J., Browder T.,O'Reilly M.S. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. Nature 1997, 390, 404407.

122. Meneses P.I., Abrey L.E.,Hajjar K.A.,et.al. Simplified production of a recombinant human angiostatin derivative that suppresses intracerebral glial tumor growth. Clinical Cancer Res. 1999, 5, 3689-3694.

123. Dhanabal M.,Ramchandran R.,et.al. Endostatin yeast production, mutants, and antitumor effect in renal cell carcinoma. Cancer Res. 1999, 59, 189-197.

124. Nguyen J.T., Wu P., Clouse M.E., et.al. Adenoassociated virus mediated delivery of antiangiogenic factors as an antitumor strategy. Cancer Res. 1998, 58, 5673-5677.

125. Cao Y.H. Therapeutic Potentials of Angiostatin in the Treatment of Cancer. Haematologia 1999,84,643-650.

126. Hill S.A., Williamse K.B., Denekamp J. Vascular collapse after flavone acetic acid: a possible mechanism of its anti-tumour actions. Europ.J.Clin.Oncol. 1989, 25, 1419-1424.

127. Browder R.,Butterfield C.E., et.al. Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drug-resistant cancer. Cancer Res. In press.

128. Baguley B.C.,Holdaway K.M.,Thomsen L.L., et.al. Inhibition of growth of colon 38 adenocarcinoma by vinblastine and colchicine: evidence for vascular mechanism. Eur. J. Cancer 1991, 27, 482-487.

129. Klauber N., Parangi S., Flynn E., Hamel E., D'Amato R.J. Cancer Res. 1997, 57, 81-86.

130. Bibby M.C., Double J.A., et.al. Reduction of tumor blood flow by flavone acetic acid: a possible component for therapy. J.Natl.Cancer Inst. 1989, 81, 216-220.

131. Kalinowski F., Schaefer C., Tyler G. In vivo targets of recombinant tumor necrosis factor- a: blood flow, oxygen consumption and growth of isotransplanted rat tumours. Br.J.Cancer 1989, 60, 555-560.

132. Teicher В. A., Ara G.,Buxton D., et.al. Optimal scheduling of interleukin 12 and chemotherapy in the Murine bladder carcinoma and B16 melanoma. Clinical Cancer Res. 1997, 3, 1661-1667.

133. Huang X.,Molema G., et.al. Tumor infraction in mice by antibody-directed targeting of tissue factor to tumor vasculature. Science 1997, 24, 547-550.

134. Fan T.P., Jaggar R.,Bicknell R. Controlling the vasculature:angiogenesis, anti-angiogenesis and vascular targeting of gene therapy. Trends Pharmacol. Sci. 1995, 16, 57-66.

135. Ellis L.M., Walker R.A., Gasparini G. Is Determination of angiogenic activity in human tumors clinically useful? Eur.J.Cancer 1998, 34, 609-618.

136. Ушморов А.Г., Александров В.А. Ангиогенез как мишень для противоопухолевых воздействий. Вопросы Онкологии 1989,:263-269.

137. Hahnfeldt P.,Panigrahy D.,Folkman J. Tumor development under angiogenic signaling: a dynamical theory of tumor growth, treatmrnt response and postvascular dormancy. Cancer Res. 1999, 59, 4770-4775.

138. Teicher B.A., Holden S.A., Ara G. Potentiation of cytotoxic cancer therapy by TNP-470 alone and with other anti-angiogenic agents. Int. J. Cancer 1994, 57, 920925.

139. Pluda J.M. Tumor-Associated Angiogenesis: mechanisms, clinical implications, and therapeutic strategies. Seminars in Oncology 1997, 24, 203-218.

140. Thompson W.D., William W.L., Maragoudakis M. The clinical manipulation of angiogenesis: pathology, side-effects, surprises, and opportunities with novel human therapy. J. Pathol. 1999, 187, 503-510.

141. Kohn J., Wilchek M., FEBS Lett. 1983, 154, 209-210.

142. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L.,Randall R.J., Protein measurement with the Folin phenol reagent. J.Biol.Chem. 1951, 193, 265-75.

143. Shi G.Y.,Wu H.L. Isolation and characterization of microplasminogen. J.Biol.Chem. 1988, 263, 17071-17075.

144. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T-4. Nature 1970, 227, 680-685.

145. Towbin H, Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1979, 76, 4350-4354.

146. Severin S.E., Moskaleva E.Yu., Posypanova G.A., et al. In vivo antitumor activity of cytotoxic drugs conjugated with human oc-fetoprotein. Tumor targeting.-1996, 2, 299-306.

147. Savage C.R., Cohen J. Epidermal growth factor and a new derivative: rapid isolation procedures and biological and chemical characterisation. J. Biol. Chem., 1972, 247, 7609-7611.

148. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. J. Immunol. Meth. 1983, 65, 55-63.

149. Deutsch D.G., Mertz E.T. Plasminogen: purification from human plasma by affinity chromatography. Science 1970, 170, 1095-1096.

150. Castellino F.L. Chem.Rev. 1981, 81, 431-446.

151. Reunung U., Magdolen V.,Wilhelm O., et.al. Multifunctional potential of the plasminogen activation system in tumor invasion and metastasis(Review). Int.J.Oncol. 1998, 13, 893-906.

152. Williams L., Wilkins F. Death to endotelial cells, death to melanoma? Melanoma Research 1999, 9, 2-3.

153. Грачева JI.А. Цитокины в онкогематологии. М:.Москва, 1996

154. Carson W.E. Interferon -a- induced activation of signal transducer and activator of transcription proteins in malignant melanoma. Clin.Cancer Res. 1998, 4, 2219-2228.

155. Волкова M.A. Основные представления об интерферонах. Гематол. и трансфузиол. 1999, 44, 32-36.

156. Naval J., Villacampa M.J., Goguel A.F., Uriel J: Cell-type specific receptors for alpha-fetoprotein in a mouse T-lymphoma cell line. Proc Natl Acad Sci USA 1985; 82, 3301-3305.

157. Ottensmeier C., Swanson L., Strobel Т., Druker В., Niloff J., Cannistra S.A. Abcence of constitutive EGF receptor activation in ovarian cancer cell lines // British J. Cancer.- 1996,- 74,-P. 446-452.

158. Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Биохимия 2000,65,112-126.

159. Von Stamm U., Brocker E.B.,et.al. Effects of interferon-a(IFN-a) on the antigenic phenotype of melanoma metastases. Melanoma Res. 1993, 3, 173-180.97

160. Salmon S.E.,Durie B.G.,Young L.,et.al. Effects of cloned human leukocyte interferons in the human tumor stem cell assay. J.Clin. Oncol. 1983, 1, 217-225.

161. Osanto S., Jansen R., et.al. In vivo effects of combination treatment with recombinant interferon y and a in metastatic melanoma. Int.J. Cancer 1989, 43, 10011006.

Информация о работе

Киселев, Сергей Михайлович
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование влияния антиангиогенных агентов и конъюгатов альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста с химиотерапевтическими препаратами на онкогенез - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы