Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и химиопрепаратов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и химиопрепаратов"

На правах рукописи

АЛЬ-НАЗВАНИ НАССЕР САЛЕМ

РАЗРАБОТКА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ ПЕПТИДНЫХ ВЕКТОРОВ И ХИ МИОПРЕПАРАТОВ

Специальность 03.00.04.-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2004 г

Работа выполнена на кафедре биологической химии Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Луценко С.В.

кандидат биологических наук, доцент Алейникова ТЛ.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ИткесА.В.

доктор биологических наук Глухов А.И.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт Биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН

ученого совета Д.212.203.13 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-

Маклая, д. 6.

Защита состоится

2004 года в

'часов на заседании

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат фармацевтических наук, доцент

Лагуткина Т.П.

Актуальность темы

Онкологические заболевания являются результатом многостадийного процесса мутаций в ключевых регуляторных генах и эпигенетических изменений, которые приводят к нарушению экспрессии генов. Доминантные онкогены способствуют злокачественным превращениям посредством неконтролируемой клеточной пролиферации, блокирования нормальной дифференциации и подавления апоптоза, в то время как рецессивные опухолесупрессорные гены ингибируют пролиферацию клеток. За последние 20 лет клеточная патология рака получила широкое признание и в настоящее время представляет собой быстро развивающуюся область создания лекарств.

Современная химиотерапия имеет ряд существенных недостатков, к которым относится ограничение терапевтической дозы вследствие токсического побочного действия, оказываемого не только на нормально пролиферирующую клеточную популяцию, но и на отдельные органы. Поэтому в настоящее время развиваются другие подходы для направленной доставки цитотоксических агентов в раковую клетку, в которой они и аккумулируются. Один из таких подходов заключается в использовании пептидных и белковых векторов, имеющих сродство к опухолевым клеткам, для создания на их основе конъюгатов с химиопрепаратами. К таким векторам относятся альфа-фетопротеин (АФП), МАТафпр (моноклональные антитела против рецептора АФП), эпидермальный фактор роста (ЭФР) и его рецепторсвязывающие фрагменты.

АФП вырабатывается эмбриональной тканью, и у взрослого человека этот белок и его рецептор отсутствуют. Однако на поверхности многих типов опухолевых клеток рецепторы АФП присутствуют в большом количестве, что позволяет использовать его для создания конъюгатов с антибиотиками.

Пептидные векторы, ковалентно связанные с подходящими химиопрепаратами, позволят получить эффективное соединение для направленной доставки лекарства в опухолевую клетку. Имеется ряд пептидов из различных источников, обладающих способностью к высоко избирательному накоплению в раковой клетке. Их активация гетеробифункциональными реагентами различной структуры с последующей конденсацией с противоопухолевым соединением приводит к получению целевого соединения. В связи с этим представляется актуальной разработка препаратов, избирательно действующих на опухолевые клетки. Для реализации этой задачи могут б ечисленные

векторы, химически связанные с противоопухолевым антибиотиком доксорубицином (ДР). Для оценки эффективности действия полученных препаратов представляется важным проведение исследований их противоопухолевой активности от vitro и in vivo.

Цель и задачи исследования

Главной целью исследования являлось получение конъюгатов биологически активных пептидов и белков с подходящими химиопрепаратами, обладающими противоопухолевой активностью, для создания эффективных противоопухолевых препаратов направленного действия.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

• Изучение свойств пептидных и белковых векторов с точки зрения сродства к раковой клетке.

• Получение выбранных пептидов и белков из различных биологических источников или химическим синтезом.

• Изучение противоопухолевых и структурных свойств ряда противоопухолевых антибиотиков с оценкой пригодности для синтеза конъюгатов.

• Изучение различных методов синтеза конъюгатов с применением ряда конденсирующих агентов и выбор оптимального метода.

• Синтез ряда конъюгатов и изучение их биологических свойств.

• Изучение противоопухолевой активности полученных препаратов напровленного действия.

Научная новизна и практическая ценность работы

Разработаны высокоэффективные методы выделения, позволяющие получать в сжатые сроки векторные белки (АФП, ЭФР) в близком к гомогенности состоянии и в достаточном для проведения экспериментов количестве. Впервые продемонстрирована возможность использования синтетических аналогов рецепторсвязывающего фрагмента ЭФР в качестве векторных молекул для создания противоопухолевых препаратов направленного действия. Впервые исследована возможность использования для создания препаратов направленного

действия и показана их высокая цитотоксическая противоопухолевая активность in vitro. Впервые продемонстрирована возможность значительного снижения

резистентности опухолевых клеток к доксорубицину при применении препаратов направленного действия, включающих векторный компонент (МАТд.фпр, синтетические аналоги рецепторсвязывающего участка ЭФР) и присоединенный к нему доксорубицин. В модельных экспериментах in vivo впервые продемонстрирован внушительный терапевтический эффект (подавление роста опухолей и значительное увеличение средней продолжительности жизни животных), достигаемый при применении конъюгатов ЭФР и его рецепторсвязывающего фрагмента с доксорубицином.

В целом данная работа демонстрирует роль, которую АФП и ЭФР могут сыграть в качестве векторов для доставки лекарственных средств и подчеркивает необходимость дальнейшего совершенствования систем направленной доставки лекарств.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004; 18th Meeting of the European Association for Cancer Research, Innsbruck, Austria, 2004. Апробация работы состоялась на научно-практической конференции кафедры биологической химии и лаборатории молекулярной биологии и биохимии НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова, г. Москва, 10 сентября 2004 г.

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из трех глав, введения, обзора литературы, описания экспериментальных процедур и материалов, посвященных результатом исследования, обсуждению полученных результатов, а также выводов и списка литературы.

Материалы и методы исследования

Альфа-фетопротеин был очищен из сыворотки пуповинной крови в соответствии с произведенной нами модификацией описанного ранее метода (Severin S. E. et al.,1995). Согласно этому методу крысиные антитела против альфа-фетопротеина человека иммобилизировали на Сефарозе CL-4B, причем степень иммобилизации белка составляла не менее 85% (от исходного). Нерастворимые компоненты удаляли из сыворотки центрифугированием и затем осаждали крупные полимеры с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ). Аффинный носитель уравновешивали ФСБ, содержащим 1% Lubrol PX и после нанесения сыворотки

белок элюировали 0.05М трис-гидрохлоридным буфером (рН 8.0), содержащим 4M мочевины. Полученный элюат наносили на ионообменную колонку (Fractogel TSK DEAE) и элюировали целевой белок 0.05M трис-гидрохлоридным буфером (рН 8.0), содержащим 0.6М КС1 и 0.02% NaNî. На конечной стадии АФП очищали на гель-фильтрационной колонке (Сефакрил S-200HR).

2 мг полученного белка модифицировали 10 мольными эквивалентами СПДП и полученный модифицированный АФП конденсировали с модифицированным СПДП доксорубицином. Конъюгат АФП-Д? очищали на колонке Superose 12HR и определяли концентрацию белка ВСА-методом (Wiechelman К. J. et al., 1988). Для оценки перспективности использования АФОТ в качестве мишени был также получен конъюгат ДP с антителами к АФОТ. В данном случае МАТафпр также модифицировали СПДП и присоединяли к ДP, модифицированный N-гидроксисукцинимидным эфиром S-ацетилтиогликолевой кислоты (САТА).

Для синтеза конъюгатов ЭФP использовали рекомбинантный человеческий ЭФP, полученный из бактерии-продуцента Е. coli, содержащей плазмиду с клонированным геном человеческого ЭФP. Культуру клеток центрифугировали и: собранную бактериальную массу обрабатывали 1М триохлоридным буфером (рН 9.0), содержащим 2 мМ ЭДТА, для разрушения клеточной стенки. После повторного центрифугирования ЭФP выделяли из полученного экстракта обращенно-фазовой хроматографией на сорбенте LiChroPrep RPC-18 ("Merck"), используя в качестве элюента линейный градиент водного раствора ацетонитрила (от 10 до 60%), содержащего 0,1% ТФУ. Идентичность и гомогенность белка подтверждали ДСН-электрофорезом в ПААГ. Кроме того, ЭФP был выделен из подчелюстных желез мыши с использованием модифицированного метода Саважа и Коэна (Savage С. R., Cohen S., 1972). Чистоту полученного ЭФP также подтверждали ДСН-электрофорезом и ОФ ВЭЖХ. С помощью твердофазного пептидного синтеза были синтезированы рецепторсвязывающий фрагмент ЭФP' - ЭФР20.31 (NH2-MYTEALDKYAC-COOH), его модификация ЭФРфр1, отличающаяся заменой Lys на Ser в положении 28, и содержащий также замену Met на Lys в положении

20. Все эти продукты очищались далее на ОФ ВЭЖХ колонке Bondopak Сц (0.78 х 30 см).Получение конъюгатов ЭФP и ЭФРфрго-л проводили с использованием модифицированного метода Hurwitz et al (Hurwitz E., et al., 1975). ЭФP или его фрагмент смешивали с ДP в соотношении 1:8.5 в 0.1М бикарбонатном буфере (рН 8.5), добавляли раствор глутарового альдегида и инкубировали 30 мин. при комнатной температуре. Затем конъюгат очищали на колонке с Sephadex-G25 и

анализировали на спектрофотометре. Кроме того, конъюгаты ДР с ЭФРфрго-31 и его модифицированными формами получали с использованием N-оксисукцинимидного эфира 3-(2-дитиопиридил)пропионовой кислоты (СПДП) по методике, описанной в работе (Severin, S.E. et al., 1996). Конечное соотношение пептид:ДР в конъюгатах составило 1:1.

В работе использовали клетки следующих линий: фибробласты мыши линии N1H ЗТЗ, клетки карциномы молочной железы человека линий MCF-7W и MCF-?^", клетки меланомы мыши линии В16 и эндотелиальные клетки пупочной вены зародыша человека. Фибробласты и опухолевые клетки культивировали в пластиковых флаконах ("Costar") в среде RPMI ("Sigma"), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки ("Sigma"), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере 5% СОз при 37°С. Ростостимулирующую активность пептидов в отношении культуры клеток фибробластов оценивали по включению [5Н]-тимидина в ДНК клеток (Клаус Д., 1990).

Для исследования ЦТА препаратов клетки рассевали по 96-луночным планшетам для микротитрования ("Costar") по 10 тыс. клеток /лунку и добавляли свободный ДР или конъюгаты в исследуемых концентрациях в среде для культивирования клеток. Далее клетки инкубировали в течение 72 ч при 37°С в инкубаторе, после чего определяли жизнеспособность клеток. Для количественной оценки жизнеспособности клеток использовали МТТ-тест (Mosmann Т., 1983). За 2-4 часа до окончания инкубации в каждую лунку планшета добавляли по 50 мкл (1 мг/мл) раствора МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид) в среде для культивирования клеток. Выживаемость опухолевых и эндотелиальных клеток, подвергшихся воздействию ДР и конъюгатов, оценивали в процентах, принимая за 100% выживаемость контрольной культуры. ЦТА свободного ДР и конъюгатов выражали, используя показатель - концентрация препарата,

вызывающая гибель 50% клеток.

Определение противоопухолевой активности препаратов in vivo проводили на мышах линии С57В1/6 с привитыми солидными опухолями меланомы мыши линии В16. Для индукции опухолей мышам вводили подкожно клеточную суспензию (2x105 клеток в 0,1 мл физиологического раствора). ДР и конъюгаты вводились внутривенно один раз в 4 дня, всего три инъекции, начиная с 3-го дня после прививки опухоли. Контрольным животным вводили внутривенно по 0,1 мл физиологического раствора в соответствии со схемой лечения. Объем опухоли вычисляли по формуле где а - короткий, b • длинный диаметр опухоли.

Относительный размер опухоли (ОРО) определяли по формуле: ОРО = ОпЛСхЮО. Увеличение средней продолжительности жизни (УСПЖ) леченых животных по сравнению с контролем определяли по формуле: УСПЖ = (Т/С-1)х100%, где Т-средняя продолжительность жизни (СПЖ) леченных в днях, С- СПЖ для контрольных животных.

Результаты исследований и их обсуждение Выделение а-фетопротеина человека

АФП выделяли из пуповинной крови - доступного и относительно богатого источника АФП (Severin S.E., et al., 1995). На первой стадии из сыворотки осаждали высокомолекулярные биополимеры обработкой полизтиленгликолем. После отделения осадка белок из надосадочной жидкости выделяли с помощью аффинной хроматографии. Для этого использовали колонку, упакованную носителем Sepharose CL-4B с иммобилизованными на нем моноклональными антителами к АФП человека. Для получения иммунносорбента использовали метод активации агарозной матрицы бромидом цианотриэтиламмония в водно-органической среде. После нанесения сыворотки, колонку промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,05% неионного детергента - Lubrol PX. Использование этого поверхностно-активного вещества позволяет эффективно удалять с полисахаридной матрицы неспецифически сорбированные вещества, содержащиеся в исходном материале. После перевода колонки в буфер, содержащий 50 мМ трис-(оксиметил)аминометана (ТРИС), через нее пропускали 4 М раствор мочевины, предварительно деионизованной на ионообменной смоле Serdolite-MB (в виде 10М раствора), приготовленный на том же буферном растворе (рис. 1).

Использование ТРИС для поддержания рН раствора предохраняет белок от модификации цианатом, образующимся в ходе гидролиза мочевины, а также создает необходимые условия для сорбции на ионообменной колонке на следующей стадии очистки. Концентрирование элюата, собираемого с аффинной колонки в соответствии с фотометрическим профилем, осуществляли в непрерывном режиме, путем непосредственного нанесения на анионообменную колонку с Fractogel TSK DEAE, объемом 6 мл. Этот сорбент характеризуется высокой емкостью - 30 мг/мл. Промывка одним объемом 4М мочевины позволяет удалить примесь антител, появляющихся в ходе гидролиза иммобилизата с агарозной матрицы, а также аутоантител присутствующих в исходном материале.

Элюцию белка с анионообменной колонки осуществляли 0,6 М раствором КС1 (рис. 2), после чего полученный раствор непосредственно наносили на колонку для гель-фильтрации (2,6x175 см), упакованную сорбентом SephacIyl S-200, при этом верхнюю часть колонки (-10%) предварительно заполняли буфером, содержащим 0,6М кс1.

Фракции, содержащие гомогенный АФП отбирали в соответствии с фотометрическим профилем элюции при 280 нм (рис. 3) и анализировали методом аналитической высокоэффективной гель-проникающей хроматографии на колонке Superose 12 HR (рис. 4).

Объединенные фракции концентрировали на ультрафильтрационной мембране YM-10 до концентрации АФП 2-4 мг/мл, о чем судили по оптическому поглощению раствора при 280 нм, используя удельный коэффициент оптического поглощения ^ио" =0,53. Полученный раствор АФП фильтровали через микрофильтр с размерами пор 0,22 мкм, замораживали, лиофильно высушивали и до употребления хранили при -70сС. Конечный продукт характеризовали непосредственно после выделения или после перерастворения в дистиллированной воде до исходной концентрации иммунохимически и с помощью электрофореза по методу Laemmli, с градиентной модификацией (рис. 5).

Иммунохимическая активность выделенного АФП составляла не менее 90% по сравнению с образцом белка поставляемого в наборе M-Partigen-a-fetoprotem.

Описанный метод очистки АФП позволяет выделять белок в состоянии, близком к гомогенности (чистота >97%), не содержащий примесей антител и ЧСА (человеческий сывороточный альбумин) - основного белкового компонента в исходном материале. Поскольку АФП и ЧСА имеют много общего в физико-химических и биологических свойствах, примесь последнего может снизить эффективность разрабатываемых конструкций для направленного транспорта. Приведенная схема позволяет существенно увеличить выход белка (50мг/100мл плазмы) выделять до 30 мг АФП за цикл длительностью 48 часов. При этом выход белка ограничивается в основном его содержанием в исходном материале.

Основная трудность в очистке АФП - это получение больших количеств белка в гомогенном состоянии. В большинстве своем известные методы очистки АФП представляют собой многоступенчатые процедуры. На их начальных стадиях используются в основном физико-химические методы, такие как гель-фильтрация, ионообменная хроматография и изоэлектрофокусирование, однако они чрезвычайно утомительны и часто сопровождаются значительными потерями продукта. С учетом этого очистка путем хроматографии на иммуноаффинном сорбенте, лишь после которой следуют ионный обмен и гель-фильтрация, оказывается идеальной альтернативой другим методикам. За счет взаимодействия АФП с антителами только этот белок удерживается на аффинной колонке. Тем не менее, вследствие химического и структурного сходства между АФП и альбумином, последний также захватывается этим сорбентом в небольших количествах. Дkя эл.ции АФП используются очень мягкие условия, не влияющие на иммунохимические свойства

белка. Стадия очистки на ионообменнике необходима для удаления примеси альбумина за счет разницы в значениях р1 двух белков. Финальная стадия необходима для еще большего увеличения гомогенности препарата. Из всех ранее описанных методик выделения человеческого АФП разработанная нами методика, воспроизводится наиболее легко и позволяет получить большое количество чистого продукта, сохранив его иммунохимические свойства.

Выделение ЭФР

Мышиный ЭФР был выделен из подчелюстных желез самцов (которые обычно содержат его в значительном количестве) по модифицированному нами методу Саважа и Коэна (Savage C.R., Cohen S., 1972). В кислой среде ЭФР элюируется с обращенно-фазового сорбента ближе к концу второго объема элюции в виде неоднородного пика. Это происходит вследствие очень малого размера его молекул и довольно высокой их гидрофобности. Данные физико-химические свойства, наряду с хорошей устойчивостью к органическим растворителям, делают возможным очистку ЭФР с помощью обращенно-фазовой хроматографии при высоком давлении. Мы проводили выделение ЭФР с использованием лишь одной хроматографической стадии, что позволило нам сильно сократить время выделения и значительно увеличить выход целевого белка. Гомогенность и идентичность белка были подтверждены электрофорезом в ПААГ по методу Лэммли (Laemmli U.K., 1970) (рис. 6).

Выделение рекомбинантного человеческого ЭФР (рчЭФР)

РчЭФР был очищен из биомассы бактерии-продуцента Е. coli с использованием обращенно-фазовой хроматографии при низком давлении. На первой стадии выделения был получен препарат периплазмы клеток Е. coli. Высокая чистота полученного препарата позволила нам, как и в случае мышиного ЭФР, использовать для получения рчЭФР лишь одну хроматографическую стадию (рис. 7). Гомогенность и чистоту полученного препарата оценивали с помощью ОФ ВЭЖХ (рис. 7).

Конъюгаты АФП и МАТафпр с доксорубицином (ДР)

ДР является удобным модельным объектом для подобных исследований благодаря своим физико-химическим свойствам, а именно: хорошей растворимости в воде, характерному поглощению антрахинонового полуцикла в области 500 нм, и сильной флуоресценции (рис. 8).

Все конъюгаты АФП с ДР были получены с использованием бифункционального реагента СЦДП (М-оксисукцинимидный эфир 3-(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты) для модификации белка. СЦДП был также использован для модификации ДР при получении конъюгатов.

Схема получения

конъюгата ДР с АФП с помощью СПДП к сувв качестве реагента для модификации ДР приведена на рис. 9. При создании спейсера,

связывающего ДР с АФП, используется двойственная природа несимметричной дисульфидной группы в составе реагента: 2-

тиопиридильная группа может выступать как в роли защитной, так и удобной уходящей группы в условиях реакции тиолдисульфидного обмена. Модификацию ДР проводили в водно-ацетонитрильном буферном растворе путем обработки избытком СПДП, что позволило получить продукт реакции с высоким выходом (91%). После выделения с помощью ОФ ВЭЖХ на колонке Ultrashere ODS (0,46 X 15 cm) (рис. 10) полученное соединение было охарактеризовано с помощью масс-спектрометрии-молекулярный ион [М*] = 725,6 и спектрофотометрии в видимом диапазоне в растворе (50% ацетонитрил) - Х^и = 495 нм.

Рис. 9. Схема получения конъюгатов ДР с АФП, ЭФР и его рецепторсвязывающими фрагментами с использованием СПДП в качестве бифункционального сшивающего реагента.

Согласно приведенной на рис. 9 схеме, производное ДР вступает в реакцию тиол-дисульфидного обмена с тиольной группой восстановленного остатка 3-меркаптопропионовой кислоты (3-МПК) на поверхности белка, что приводит к получению конъюгата. Полученный раствор производного ДР после спектрофотометрического определения концентрации ДР непосредственно использовали для получения конъюгата с АФП. Реакцию между тиолированным АФП и производным ДР проводили в атмосфере аргона. О прохождении реакции судили по приросту площади пика АФП при анализе на гель-фильтрационной колонке Supeгose 12 HR (1x30 от!) с детекцией при 495 нм. Конъюгат выделяли на этой же колонке, собирая фракции в соответствии с фотометрическим профилем, приведенным на рис. 10.

В результате проведенных экспериментов был получен конъюгат на основе модифицированного 3-МПК АФП, содержащий 2 молекулы антибиотика, ковалентно связанных с одной молекулой белка. Соотношение компонентов в конечном продукте оценивали на основе результатов фотометрического определения белка с использованием медного (II) комплекса бицинхоншювой кислоты и

спектрофотометрического определения ДР по известным параметрам его поглощения при Хм«, = 495нм.

Конъюгат МАТафпр-ДР также получали с использованием бифункционального реагента СПДП для модификации белка. Для модификации ДР при получении конъюгатов использовали К-гидроксисукцинимидный эфир Б-ацетилтиогликолевой кислоты (САТА) (рис. 11).

Рис. 11. Схема получения коньюгата МАТафпр с ДР, модифицированным CATA.

Исследования ЦТА конъюгатов АФП-ДР и МАТафпР-ДР

Конъюгаты АФП и МАТАФПР С доксорубицином проявляли дозозависимую ЦГА в отношении клеток HeLa, которая превышала активность неконъюгированного антибиотика (ICjo 920 нМ) в 2,8 раза (МАТац^ДР, 327 нМ) и 2,7 раза (АФП-ДР, IC;g 340 нМ) (рис. 12).

100-i.....й-ц.^»^

fr

90

20

10

10

100

1000

[ДР],нМ

Рис. 12. Выживаемость клеток карциномы шейки матки человека линии HeLa после их инкубации с ДР и его конъюгатами с АФП и МАТафпр.

Как известно, одним из основных механизмов развития лекарственной резистентности опухолевых клеток является резкое снижение внутриклеточной концентрации препаратов за счет их выведения го клетки с помощью специальных транспортных белков (Stavrovskaya А. А., 2000). Поскольку механизмы проникновения в клетку и особенности компартментализации свободных и связанных с полимерными носителями химиопрепаратов различны (Dillman R.O. et al., 1988, Rogers К. E. et al., 1983), конъюгаты векторных белков с антибиотиком могут оказаться в гораздо меньшей степени подверженными действию мембранных «насосов», отвечающих за выброс антибиотика из клетки. В связи с этим представляло интерес проведение сравнительного исследования цитотоксической активности полученных препаратов в отношении чувствительной и резистентной к действию ДР популяций линии опухолевых клеток MCF-7.

Конъюгаты АФП-ДР и МАТафпр-ДР оказались в 5,3 и 3,6 раза, соответственно, токсичнее свободного ДР (табл. 1). По-видимому, различия ЦТА исследованных конъюгатов в отношении клеток HeLa и связаны с тем, что

эффективность реализации их цитотоксического действия in vitro в значительной мере определяется количеством рецепторов векторного белка на поверхности опухолевых клеток, различиями в сродстве вектора к его рецептору, а также скоростью рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Ранее авторами (Ницветов М.Б. и др., 2001) было показано, что моноклональные антитела к АФП-узнающему сайту рецептора АФП клона 2В8 отличаются более высоким сродством к рецептору, чем сам лиганд. Особенно это различие в сродстве к рецептору заметно для клеток MCF-7, на поверхности которых было обнаружено по 3 различных по Kd сайта связывания с АФП и МАТ: среднее значение Kd составляло 1,5'10'7 М в случае МАТафпр И З'Ю^ M B случае АФП.

Несмотря на более низкое средство АФП к рецептору АФП по сравнению с МАТ, в наших экспериментах конъюгат АФП-ДР оказывался более токсичным в отношении клеток MCF-7, чем МАТафпр—ДР. По-видимому, данный факт может объясняться тем, что хотя оба конъюгата способны эффективно узнаваться рецептором АФП, проникновение их в клетку может обеспечиваться разными механизмами, а последующая компартментализация также может происходить различными путями, что приводит к различной реализации цитотоксической активности доксорубицина.

Нами было также проведено сравнительное исследование ЦТА препаратов в отношении резистентных к ДР опухолевых клеток отличающихся

высоким уровнем экспрессии транспортного белка Р170 (Pgp) (Lemieux P. and Page M., 1994).

Таблица 1. Цитотоксичсская активность конъюгатов ДР с АФП и МАТафпр в отношении чувствительных (MCF-7Wl) и резистентных (MCF-7AdlR) клеток карциномы молочной железы человека линии MCF-7

Препарат ICso, нМ

MCF-Г' MCF-7**K

ДР 175 5314

АФП-ДР 33 763

МАТАфпр-ДР 48 2125

Использование МАТафпр В качестве вектора повышало активность ДР в 2,5 раза по сравнению со свободным антибиотиком (табл. 1). Наиболее высокую цитотоксическую активность проявлял препарат АФП-ДР: значение Ю50 для антибиотика в составе конъюгата превышало таковое для неконъюгированного ДР в 7 раз (табл. 1).

Полученные результаты позволяют предположить, что конъюгаты, в отличие от свободного ДР, вероятнее всего, поступают в клетку путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, и в процессе их компартментализации антибиотик в меньшей степени подвержен действию мембранного транспортного белка Р170, обеспечивающего выведение свободного ДР из клетки. Очевидно, что представленные в работе препараты вследствие высокой избирательности и эффективности действия в отношении опухолевых клеток, в том числе и резистентных к химиопрепаратам, имеют большой клинический потенциал.

Получение конъюгатов ДР -ЭФР и ДР-ЭФРфргол

Дня синтеза конъюгатов ЭФР-ДР и ЭФРфрго-31-ДР использовались высокоочищенные препараты ЭФР и ЭФРфр2о-31. Конъюгаты ЭФР-ДР и ЭФРфрго-зр ДР были синтезированы с использованием глутарового альдегида в качестве бифункционального сшивающего агента с мольным соотношением компонентов 1:1 в обоих конъюгатах (рис. 13).

Рис. 13. Схема синтеза конъюгатов ДР с ЭФР и ЭФРфр2о.з1 с использованием глутарового альдегида.

Определение митогенной активности ЭФР и ЭФРфргол

Исследование митогенной активности ЭФР и ЭФРфрго-31 показало, что хотя стимулирующий эффект был несколько ниже, чем эффект ЭФР,

полученный результат свидетельствует о выраженной биологической активности пептида, заключающейся в способности связываться с соответствующим рецептором и вызывать биологический ответ в виде пролиферации клетки (рис. 14).

Ан + Н,к-др-►

ПЕПТИД-1ЧН2 + у

Х>Ш2-СН2-СН2-С

ПЕПТПД-Н=С-ОТ2-Ш2-СН2-<>№- ДР

концентрация, нМ

Рис. 14. Влияние ЭФР и ЭФРфргм! на пролиферацию фибробластов мыши линии NIH ЗТЗ. Цитотоксическая активность конъюгатов ЭФР-ДР и ЭФРфркмгДР

ЦГА конъюгатов исследовали в отношении чувствительных (линия MCF-7wt) и резистентных к ДР (линия MCF-?"448) опухолевых клеток, характеризующихся высоким уровнем экспрессии рецепторов ЭФР (Lemieux P. and Page M, 1994). Как видно из табл. 2, ЦТА конъюгатов ЭФР-ДР и ЭФРфрю-31-ДР в отношении как чувствительных, так и резистентных клеток MCF-7 превышала активность свободного ДР. Как известно, одним из основных механизмов развития лекарственной резистентности опухолевых клеток является резкое снижение внутриклеточной концентрации препаратов за счет их выведения из клетки с помощью специальных транспортных белков, важнейшим из которых является Р170 (Stavrovskaya А. А., 2000).

Согласно представленным результатам, оба конъюгата успешно снижали резистентность опухолевых клеток линии отличающихся повышенной

экспрессией белка Р170. Сходные результаты были получены в ряде работ с использованием конъюгатов ДР с различными векторными белками (трансферрин, альфа-фетопротеин, моноклональные антитела) в отношении линий опухолевых клеток, резистентных к ДР. Механизм цитотоксического действия конъюгатов пока до конца не изучен. Вероятно, полученные результаты объясняются тем, что конъюгаты, в отличие от свободного ДР, поступают в клетку путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, и в процессе компартментализации конъюгата

антибиотик в меньшей степени подвержен действию мембранного транспортного белка Р170, обеспечивающего выведение свободного ДР из клетки.

Таблица 2. Цитотоксическая активность доксорубицина и его конъюгатов с ЭФР и ЭФРфр» л, полученных с помощью глутарового альдегида, в отношении культур опухолевых в эндотелиальных клеток

Линия клеток 1С50, нМ

ДР ЭФР-ДР ЭФРфргмгДР

МСЕ-7т 170 22 2.5

МСТ-7Аагк 12 500 700 500

НиУЕС (покоящиеся) 336 41 бб

НЦУЕС (пролиферирующие) 171 5 7

В16 35 18 1.5

Проведенные ранее исследования по накоплению конъюгата ЭФР-ДР в опухолевых клетках показали, что при поступлении ДР, находящегося в составе конъюгата, в клетки МСР-7АЛгК уровень его накопления повышается, а уровень внутриклеточной деградации значительно снижается, что, вероятно, повышает эффективность цитотоксического действия антибиотика (Ь^епко 8. V. й а1., 2000).

Цитотоксическая активность конъюгатов в отношении эндотелиальных клеток (HUVEC)

Конъюгаты оказались весьма эффективными в отношении пролиферирующего эндотелия, характерного для опухолевой кровеносной сети. Оба конъюгата проявили более высокую ЦТА в сравнении со свободным антибиотиком. Пролиферирующий эндотелий оказался заметно более чувствительным к действию конъюгатов в сравнении с конфлюэнтным эндотелием (табл. 2), что, по-видимому, обусловлено различиями в уровнях экспрессии рецепторов ЭФР и скоростях рецептор-опосредованного эндоцитоза для активно делящихся и покоящихся эндотелиальных клеток.

Поскольку эндотелий капилляров опухоли характеризуется высоким уровнем пролиферации и экспрессии рецепторов ряда факторов роста (Maciag Т., 1990), также

вполне вероятна его повышенная уязвимость к действию цитотоксических конъюгатов. Комплексное воздействие конъюгатов, направленное как на подавление опухолевого ангиогенеза, так и на повреждение опухолевых клеток, представляется перспективным подходом для проведения успешной химиотерапии злокачественных новообразований.

Получение конъюгатов рецепторсвязывающего фрагмента ЭФР и его модифицированных форм с помощью сшивающего

реагента СПДП

Существенным недостатком конъюгатов противоопухолевых препаратов с векторными молекулами, полученных с помощью глутарового альдегида, является их структурная неоднородность, обусловленная особенностями химической структуры глутарового альдегида. Препараты, используемые в области практической онкологии с точки зрения синтеза и химического состава должны отвечать более строгим требованиям: процедура получения конъюгатов должна отличаться простотой, эффективностью и высоким уровнем воспроизводимости, а лекарственный препарат - высокой степенью чистоты, стабильностью и определенностью химического состава и структуры.

Для получения более эффективных противоопухолевых препаратов направленного действия нами были синтезированы еще два рецепторсвязывающих фрагмента ЭФР и для получения конъюгатов использован сшивающий реагент со стабильной и однородной химической структурой - СПДП (рис. 9).

Оба фрагмента (ЭФРфр1 и ЭФРфр2) представляют собой модифицированные формы природного рецепторсвязывающего фрагмента эпидермального фактора роста ЭФРфрго-31- ЭФРфр1 отличался от исходного фрагмента заменой Lys на Ser в 28 положении. ЭФРфр2 содержал следующие замены: Met на Lys в 20 положении и Lys на Ser в 28 положении. Serîs является одной из ключевых аминокислот, участвующих в формировании рецепторсвязывающего центра в мышином ЭФР, а

- в человеческом. При получении конъюгатов возможно

взаимодействие -аминогруппы со сшивающим агентом, которое впоследствии может препятствовать связыванию конъюгата с рецептором. Для того, чтобы избежать этого затруднения, мы заменили Lys28 в активном центре рецепторсвязывающего фрагмента на Ser. Замена Metjo на Lys ЗФРф]^ л а произведена нами для создания возможностей более эффективного конъюгирования

N-концевой аминокислоты фрагмента с ДР. Оба модифицированных фрагмента проявляли биологическую активность в тесте на стимуляцию пролиферации фибробластов NTH3T3 in vitro, близкую к активности ЭФРфрго-зь

Цитотоксическая активность ДР и его конъюгатов с ЭФР-пептидами в отношении клеток карциномы человека HeLa

Для направленной доставки ДР в опухолевые клетки были синтезированы его конъюгаты с ЭФРфрзо-з], ЭФРфр1 и ЭФРфр2 с помощью бифункционального сшивающего реагента СПДП. Молярное соотношение пептид:ДР в каждом из полученных конъюгатов составило 1:1. Все конъюгаты проявляли цитотоксическую активность in vitro в отношении культуры опухолевых клеток линии HeLa, превышающую активность свободного ДР в 2-4 раза (рис. 15).

Наиболее высокую ЦТА проявлял конъюгат ЭФРфр1-ДР, вероятно, вследствие отсутствия экранирующего действия доксорубицина, связанного с этим фрагментом только по ^концевой аминокислоте. Таким образом, произведенные аминокислотные замены во фрагменте не только не приводят к потере его

рецепторсвязывающих свойств, но и являются причиной увеличения цитотоксической активности конъюгатов. Все фрагменты могут быть использованы для направленной доставки доксорубшщна и, вероятно, других противоопухолевых химиопрепаратов в опухолевые клетки.

ЦТА ДР и коньюгатов в отношении клеток меланомы линии В16 in vitro

Исследование противоопухолевой активности конъюгатов in vivo проводили на модели перевиваемой солидной меланомы В16, традиционно используемой для тестирования химиопрепаратов. Предварительно исследовали ЦТА свободного ДР и конъюгатов в отношении клеток меланомы линии В16 in vitro. Как видно из табл. 2, ЦТА конъюгатов ЭФР-ДР и ЭФРфрго-згДР превышала активность свободного антибиотика.

Исследование противоопухолевой активности препаратов in vivo

Исследование противоопухолевой активности препаратов in vivo в отношении солидной мышиной меланомы В16 показало, что применение свободного ДР не оказывало заметного терапевтического эффекта (табл. 3). Так, хотя введение свободного антибиотика и приводило первоначально (12-21 день) к некоторому ингибированию опухолевого роста, в дальнейшем у животных наблюдалось заметное прогрессирование роста опухолей, достигавших в период с 24 по 34 день эксперимента 162,7% от размера опухолей у контрольных животных.

Таблица 3. Эффективность противоопухолевого действия ДР и его конъюгатов с ЭФР и ЭФРфргол при внутривенном введении мышам линии С57В1/6 с привитыми солидными опухолями меланомы В16

Группа животных ОРО, % от контроля СПЖ, дни УСПЖ, %

12-21 день 24-34 день

Контроль 100 100 31,4+7,8 -

ДР 66,3+30,8 162,7+40,2 23,6+4,0 -24,8

ЭФР-ДР 18,8+7,4 41,4+6,5 45,8+6,8 46,0

ЭФРФР20-31-ДР 37,3+18,6 41,9+4,0 46,6+5,7 48,5

В отличие от свободного ДР, введение конъюгатов ЭФР-ДР и ЭФРфрго-31-ДР приводило к значительному торможению развития опухолей в течение всего периода наблюдения: так, к окончанию эксперимента ОРО составлял 41,4% и 41,9%, соответственно. Кроме того, применение конъюгатов приводило к 45,8%-ному (ЭФР-ДР) и 46%-ному (ЭФРфрго-31-ДР) увеличению средней продолжительности жизни экспериментальных животных, чего не наблюдалось в случае свободного ДР. При

терапевтическом применении смесей ДР с векторными молекулами в эквивалентных конъюгатам дозах их действие в отношении роста опухолей и СПЖ существенно не отличалось от действия свободного ДР (данные не приведены).

Высокая противоопухолевая активность конъюгатов может быть связана как с избирательностью их действия в отношении клеток-мишеней (опухолевых и эндотелиалъных клеток сосудов опухоли), обусловленной векторным транспортом химиопрепарата, так и с низкой скоростью выведения препаратов из организма животного.

Выводы

1. Разработаны модифицированные методы выделения а-фетопротеина из сыворотки пуповинной крови и эпидермального фактора роста из подчелюстных желез мыши и штамма-продуцента Е. coli (человеческий ЭФР), позволившие получать высокоочищенные белки в нативном состоянии.

2. Продемонстрировано, что in vitro ЭФР и его рецепторсвязывающий фрагмент характеризуются близкими уровнями пролиферативной активности.

3. Получены синтетические аналоги рецепторсвязывающего фрагмента ЭФР

и показана их способность к связыванию с рецептором ЭФР. Целевые аминокислотные замены, произведенные в рецепторсвязываюшем участке ЭФР, не привели к потере биологической активности пептидов и позволили упростить процедуру синтеза их конъюгатов с ДР и увеличить эффективность действия конъюгатов.

4. Путем химического синтеза получены конъюгаты ЭФР и его рецепторсвязывающих фрагментов, АФП и МАТаопт с ДР, проявляющие цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека, значительно превышающую активность свободного ДР.

5. Продемонстрировано значительное снижение резистентности опухолевых клеток к ДР при использовании конъюгатов ЭФР и ЭФРфр, АФП, и МАТашпр с ДР.

6. В модельных экспериментах in vivo убедительно продемонстрировано, что терапевтическое применение конъюгатов ДР как с ЭФР, так и с приводит к заметному подавлению опухолевого роста и значительному увеличению средней продолжительности жизни животных по сравнению с

контролем. Применение свободного ДР не приводило к детектируемому терапевтическому эффекту.

7. Продемонстрировано, что АФП, МФТафпг, ЭФР и его рецепторсвязывающие фрагменты могут быть успешно использованы для избирательной доставки ДР в опухолевые клетки. Применение всех полученных препаратов позволяет значительно снизить резистентность опухолевых клеток к ДР.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Фельдман Н.Б., Аль-Названи Н., Дигтярь А.В., Захарова И.В., Луценко СВ., Северин СЕ. Избирательная доставка химиопрепаратов в опухолевые клетки с помощью пептидных векторов. Тезисы докладов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2004, с. 378-379.

2. Луценко СВ., Аль-Названи Н., Захарова И.В., Фельдман Н.Б., Макаров В.А., Северин С.Е. Рецептор -фетопротеина - мишень для векторной доставки антибиотиков в опухолевые клетки. Тезисы докладов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2004, с. 232.

3. Аль-Названи Н., Фельдман Н.Б., Дигтярь А.В., Макаров В.А., Гороховец Н.В., Фаттахова Г.В., Захарова И.В., Луценко С.В., Северин С.Е. Сравнительное исследование возможностей использования белковых векторов в составе противоопухолевых препаратов. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2004, №3, в печати.

4. Луценко С.В., Аль-Названи Н., Фельдман Н.Б., Катлинский А.В., Северин С.Е., Северин Е.С, Пальцев М.А. Противоопухолевые препараты направленного действия на основе пептидных векторов. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2005, №1, в печати.

5. Feldman N.B., Al-Nazwani N., Gorokhovetz N.V., Makarov V.A., Zakharova I.V., Digtyar A.V., Lutsenko S.V., Severin S.E. Doxorubicin conjugates targeted to the EGF receptor. Abstracts of 18th Meeting of the European Association for Cancer Research, Innsbruck, Austria, 2004, p.31.

6. Луценко СВ., Аль-Названи Н., Дигтярь А.В., Фельдман Н.Б., Северин СЕ. Получение протеолитических фрагментов плазминогена, проявляющих антиангиогенную активность. Тезисы 1-й международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 26-28 октября 2004, в печати.

Аль-Названи Нассер Салем (Оман)

Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и химиопрепаратов.

Конъюгаты АФП и МАТафпр С доксорубицином были получены с использованием СПДП в качестве сшивающего агента. В экспериментах in vitro на культурах клеток линий MCF-7 и HeLa конъюгаты проявили цитотоксическую активность, превышающую активность неконъюгированного доксорубицина.

Конъюгаты ЭФР и его рецепторсвязывающего фрагмента (ЭФРфр), полученные с использованием глутарового альдегида в качестве хросс-реагента, проявляли высокую цитотоксическую активность в отношении опухолевых и пролиферирующих эндотелиальных клеток. ЭФРфр проявлял выраженную митогенную активность в отношении фибробластов мыши линии что

подтверждает его связывание с рецептором ЭФР. Были получены две модифицированные формы ЭФРфр с заменой LyS2j на Ser (ЭФРфр1) и LyS28 на Ser и Met2o на Lys (ЭФРфр2). Оба фрагмента проявляли выраженную митогенную активность в отношении фибробластов мыши линии NIH3T3 и значительную цитотоксическую активность в отношении клеточной линии карциномы HeLa.

В экспериментах in vivo на модели солидной мышиной меланомы В16 показано значительное ингибирование роста опухолей и увеличение продолжительности жизни животных, получавших конъюгаты ЭФР-ДР и ЭФРфр-ДР, по сравнению с контролем и свободным доксорубицином.

Продемонстрировано, что все исследованные препараты могут быть успешно использованы для направленной доставки доксорубицина к опухолевым клеткам. Применение препаратов также значительно снижает резистентность опухолевых клеток к доксорубицину.

Al-Nazwani Nasser Salem (Oman)

Development of targeted antitumor preparations based on peptide vectors and cytotoxic agents.

Conjugates of AFP and MATafpr with doxorubicin were produced using SPDP as a linking reagent. Upon in vitro assays with MCF-7 and HeLa tumor cell lines, conjugates proved more effective in killing tumor cells in comparison to unconjugated doxorubicin.

Conjugates of EGF and EGF receptor binding fragment produced with

glutaraldehyde cross-linker displayed high cytotoxicity against tumor and proliferating endothelial cell lines. Moreover, revealed pronounced mitogenic activity with mice

fibroblasts NIH3T3 cell lines confirming hs binding to the EGFR. Two modified forms of EGFrbf were produced with substituting amino acid LyS28 to Ser (frl) and with substituting Lys28 to Ser and Met2o to Lys (fr2). Both fragments displayed considerable mitogenic activity with mice fibroblasts NIH3T3 and were significantly cytotoxic to carcinoma cell line HeLa.

In vivo experiments with model mice solid melanoma tumors В16 demonstrated significant decrease in tumor size and increased life span for mice treated with the conjugates EGF-DR and when compared with controls and those treated with

free doxorubicin.

Demonstrated, that all studied preparations can be successfully used to selectively deliver doxorubicin to tumor cells. Using these preparations considerably helped to reduce tumor cells resistance to doxorubicin.

Принято к исполнению 14/09/2004 Исполнено 15/09/2004

Заказ № 316 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

«s 172 61

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Аль-Названи Нассер Салем

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Свойства опухолевой ткани, делающие осуществимой терапию конъюгированными препаратами.

1.1.1. Антигены, ассоциируемые с опухолями.

1.1.2. Интернализация.

1.1.3. Особенности опухолевых кровеносных сосудов и проникновение лекарства через них.

1.1.4. Особенности опухолевого метаболизма.

1.2. Стратегии получения биоконъюгатов для направленной доставки и выбора сшивающего агента.

1.2.1. Функциональные группы белков.

1.2.2. Реагенты для модификации белков.

1.3. Бифункциональные реагенты.

1.3.1. САТА.

1.3.2. СПДП.

1.4. Иммуноконъюгаты на основе моноклональных антител.

1.4.1. Конъюгирование лекарственных средств с МАТ.

1.4.2. Мишени для антител.

1.4.3. Факторы, влияющие на эффективность конъюгатов противораковых препаратов с антителами.

1.4.4. Доставка антрациклинов с помощью МАТ.

1.4.5. Ограничения эффективности конъюгатов лекарственных средств с антителами.

1.5. Альфа-фетопротеин.

1.5.1. Функции.

1.5.2. Структура.

1.5.3. АФП как вектор для направленной доставки противораковых средств.

1.5.4. Регуляция экспрессии АФП.

1.5.5. Генетическое разнообразие АФП.

1.5.6. Антигенные разновидности.

1.5.7. Рецептор АФП.

1.6. Рецептор эпидермального фактора роста как мишень для лекарственных средств направленного действия.

1.6.1. Эпидермальный фактор роста (ЭФР).

1.6.2. Структура ЭФР.

1.6.3. Потенциал использования ЭФР в лечении рака.

1.6.4. Синтез конъюгатов ЭФР.

1.6.5. Рецептор ЭФР.

1.6.6. Структура рецептора эпидермального фактора роста.

1.6.7. Передача сигнала с помощью РЭФР.

1.6.8. Усиление внутриклеточного сигнала РЭФР.

1.6.9. Мутантные формы РЭФР.

1.6.10. РЭФР и рак.

1.7. Подходы, основанные на применении липосом.

1.8. Декстраны.

1.9. Использование человеческого сывороточного альбумина в качестве носителя

1.10. Опухолевый ангиогенез в качестве мишени для терапии.

1.10.1. Механизмы, способствующие ангиогенезу.

1.10.2. Основной ФРФ.

1.10. 3. Протеолитические ферменты.

1.10.4. Клетки, ответственные за воспалительную реакцию.

1.10.5. Роль интегринов в ангиогенезе.

1.10.6. Ингибиторы ангиогенеза.

1.10.7. Антиангиогенная терапия рака.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Использованные оборудование и материалы.

2.2. Выделение и очистка АФП.

2.2.1. Иммобилизация моноклональных антител на сефарозе.

2.2.2. Фракционирование полиэтиленгликолем.

2.2.3. Аффинная хроматография.

2.2.4. Ионообменная хроматография.

2.2.5. Гель-проникающая хроматография.

2.2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.3. Выделение и очистка ЭФР.

2.3.1. Выделение рекомбинантного человеческого ЭФР (рч ЭФР).

2.3.2. Выделение мышиного ЭФР.

2.3.3.Синтез и очистка ЭФРфр и его модифицированных форм.

2.4. Получение конъюгатов ДР с АФП.

2.4.1. Модификация ДР с помощью Ы-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионата. (СПДГТ).

2.4.2. Модификация АФП с помощью СПДП.

2.4.3. Получение конъюгатов ДР с АФП с помощью СПДП.

2.5. Получение конъюгатов ДР с ЭФР и ЭФРфрго-з1.

2.6. Получение конъюгатов ДР с ЭФРфрго-зь ЭФРфр 1 и ЭФРфр2.

2.7. Получение конъюгатов ДР с МАТдфпр.

2.7.1. Активация доксорубицина с помощью N-гидроксисукцинимидного эфира S-ацетилтиогликолевой кислоты (SATА).

2.7.2. Синтез конъюгата моноклонального антитела с доксорубицином.

2.8. Исследование биологической и специфической противоопухолевой активности препаратов in vitro.

2.8.1. Культивирование клеток.

2.8.2. Митогенная активность ЭФР, ЭФРфрго-зь ЭФРфр 1 и ЭФРфр2.

2.8.3. Определение цитотоксической активности (ЦТА) конъюгатов in vitro.

2.8.4. Оценка жизнеспособности клеток.

2.9. Определение противоопухолевой активности препаратов in vivo.

2.9.1. Животные и опухоли.

2.9.2. Дозы препаратов и их введение.

2.9.3. Объем опухолей.

2.9.4. Продолжительность жизни животных.

2.9.5. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение а-фетопротеина человека.

3.1.1. Аффинная хроматография.

3.1.2. Ионообменная хроматография.

3.1.3. Гель-проникающая хроматография.

3.2. Выделение ЭФР.

3.2.1. Выделение ЭФР из подчелюстных желез мыши.

3.2.3. Выделение рекомбинантного человеческого ЭФР (рчЭФР).

3.3. Синтез конъюгатов векторных белков с доксорубицином.

3.3.1. Конъюгаты АФП и МАТдфпр с доксорубицином (ДР).

3.3.2. Получение конъюгата ДР с МАТдфпр.

3.4. Исследования ЦТА конъюгатов АФП-ДР и МАТдфпр-ДР.

3.5. Получение конъюгатов ДР -ЭФР и ДР-ЭФРфр2о-з1.

3.6. Определение митогенной активности ЭФР и ЭФРфр20-31.

3.7. Цитотоксическая активность конъюгатов ЭФР-ДР и ЭФРфрю-згДР.

3.8. Цитотоксическая активность конъюгатов в отношении эндотелиальных клеток (HUVEC).

3.9. Получение конъюгатов рецепторсвязывающего фрагмента ЭФР и его модифицированных форм (ЭФРфр 1, ЭФРфр2) с помощью сшивающего реагента СПДП.

3.10. Цитотоксическая активность ДР и его конъюгатов с ЭФР-пептидами в отношении клеток карциномы человека HeLa.

3.11. ЦТА ДР и конъюгатов в отношении клеток меланомы линии В16 in vitro.

3.12. Исследование противоопухолевой активности препаратов in vivo.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и химиопрепаратов"

Направленную доставку нередко подразделяют на активную и пассивную, причем пассивная предполагает накопление лекарства вследствие действия физико-химических или фармакологических факторов, тогда как активная направленная доставка обусловлена специфическим взаимодействием между системой доставки и компонентами клеток или тканей. Терапия рака с помощью направленной доставки лекарственных средств осуществляется преимущественно применением цитотоксических препаратов, которые убивают клетки, вместо того, чтобы оказывать постепенное фармакологическое действие за счет биологического ответа. Большинство этих препаратов было разработано на основании того факта, что раковые клетки делятся быстрее, нежели нормальные. В целом это действительно так, однако проблема состоит в том, что разница их активностей по отношению к опухолевой и нормальной тканям настолько мала, что между концентрацией, вызывающей гибель всех опухолевых клеток и концентрацией, ведущей к серьезным повреждениям нормальной ткани остается лишь небольшое «окно». Очевидно, что возможность более эффективной доставки препарата к его мишени и сопутствующее уменьшение количества препарата, поступающего в нормальные ткани, привели бы к сокращению числа опасных для жизни побочных эффектов и значительному прогрессу терапии рака.

Открытие опухолевых антигенов заставило возлагать на эти идеи большие надежды и стимулировало проведение большого числа разнообразных опытов по направленной доставке. Однако вскоре стало ясно, что в большинстве своем предложенные мишени относились к опухолеассоциированным антигенам, различие в экспрессии которых опухолевой и нормальной тканями носит лишь количественный характер. На данном этапе возник вопрос о том, может ли такая разница в экспрессии антигена иметь терапевтическое применение. Чтобы ответить на него необходимо, в первую очередь, определить характерные различия между нормальными и раковыми клетками, которые могут быть использованы. Молекула клеточной поверхности, распознаваемая векторным агентом может быть опухолеспецифическим антигеном, например гликопротеином или онкобелком, рецептором фактора роста или гормона роста. В идеальном случае такая молекула на клеточной поверхности должна обладать следующими свойствами: (А) уникальная молекула, экспрессируемая только в ткани опухоли, (Б) отсутствие экспрессии в нормальных тканях, (В) высокая аффинность связывания с векторной молекулой, (Г) однородность экспрессии на всех клетках ткани-мишени, (Д) экспрессия в опухолях всех больных с одинаковым типом рака, (Е) не выделяется в сыворотку больных. Главной предпосылкой подхода, основанного на направленной доставке лекарственных средств, является то, что конъюгирование лекарства с молекулой, специфично связывающейся с опухолью, приводит его в неактивное состояние до тех пор, пока оно не достигнет своей мишени. Оказавшись в опухоли, конъюгированный препарат связывается с поверхностью опухолевых клеток и в дальнейшем интернализуется и отщепляется от молекулы-носителя. Таким образом, конъюгированные препараты можно рассматривать как опухолеактивируемые пролекарства (ОАПЛ).

В то время как наиболее распространенные пролекарства превращаются в лекарственную форму за счет таких механизмов, как химический или ферментативный гидролиз, восстановление активности ОАПЛ должно целиком зависеть от антигенов или рецепторов, которые специфичны для поверхности опухолевых клеток. Как правило, подобные лекарственные средства разрабатывались для преодоления физиологических барьеров, таких как быстрый метаболизм или выведение из циркуляции. Обычные пролекарства разрабатываются в предположении того, что улучшение фармакокинетических свойств исходного лекарства приведет к увеличению его уровня в циркуляции и через это - к большей активности за счет улучшения его накопления в опухоли. При терапии ОАПЛ специфическое сродство опухолеассоциированного антигена или рецептора к векторной составляющей конъюгата ведет, вдобавок, к большему поглощению и накоплению ОАПЛ в опухоли, против которой оно направлено и, таким образом, к увеличенной селективности. За этим следует высвобождение активного лекарства, следствием которого является его высокая местная концентрация в области мишени. В идеальном случае конъюгаты стабильны в кровотоке, поэтому активное лекарство не высвобождается вовне опухоли. Конъюгаты также не должны связываться с тканями, не являющимися их мишенью и, следовательно, должны быть нетоксичны при применении in vivo.

В ранних испытаниях конъюгированных препаратов широко использовались моноклональные антитела, однако различными методами, например иммунофлуоресцентным, было показано, что большинство антител связывается с опухолеассоциированными антигенами, которые лишь преимущественно, но не исключительно, экспрессируются на поверхности опухолевых клеток. В большинстве случаев антитела также связываются, хотя и в меньшей степени, с нормальными тканями. Применение же небольших фрагментов антител показало, что они обладают большей скоростью клиренса и неспособны транспортировать достаточное количество активного лекарства.

В качестве векторных агентов наиболее привлекательны другие молекулы, такие как эпидермальный фактор роста (ЭФР), обладающий малым размером, высоким сродством к рецептору и быстро интернализирующийся после связывания с рецептором. Вдобавок ЭФР не обладает иммуногенностью по отношению к организму-хозяину. Альфа-фетопротеин (АФП) является онкофетальным белком, который широко используется в качестве векторной молекулы, поскольку его рецептор избирательно экспрессируется в различных типах опухолей. Ряд других векторных агентов с небольшой молекулярной массой, включая трансформирующий фактор роста (ТФР-а) и лактоферрин, также связывается преимущественно с опухолевыми мишенями.

Подчеркнутые выше проблемы можно преодолеть путем тщательного исследования характеристик процесса конъюгации, которые ведут к улучшению доставки и избирательности конъюгированного препарата. Оно включает выбор вектора, природы связи между фармакологическим агентом и вектором и улучшение понимания механизмов высвобождения лекарства внутри клетки.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Главной целью исследования являлось получение конъюгатов биологически активных пептидов и белков с подходящими химиопрепаратами, обладающими противоопухолевой активностью, для создания эффективных противоопухолевых препаратов направленного действия.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

• Изучение свойств пептидных и белковых векторов с точки зрения сродства к раковой клетке.

• Получение выбранных пептидов и белков из различных биологических источников или химическим синтезом.

• Изучение противоопухолевых и структурных свойств ряда противоопухолевых антибиотиков с оценкой пригодности для синтеза конъюгатов.

• Изучение различных методов синтеза конъюгатов с применением ряда конденсирующих агентов и выбор оптимального метода.

• Синтез ряда конъюгатов и изучение их биологических свойств.

• Изучение противоопухолевой активности полученных препаратов напровленного действия.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Аль-Названи Нассер Салем

выводы

1. Разработаны модифицированные методы выделения а-фетопротеина из сыворотки пуповинной крови и эпидермального фактора роста из подчелюстных желез мыши и штамма-продуцента Е. coli (человеческий ЭФР), позволившие получать высокоочищенные белки в нативном состоянии.

2. Продемонстрировано, что in vitro ЭФР и его рецепторсвязывающий фрагмент характеризуются близкими уровнями пролиферативной активности.

3. Получены синтетические аналоги рецепторсвязывающего фрагмента ЭФР (ЭФРфр 1 и ЭФРфр2) и показана их способность к связыванию с рецептором ЭФР. Целевые аминокислотные замены, произведенные в рецепторсвязывающем участке ЭФР, не привели к потере биологической активности пептидов и позволили упростить процедуру синтеза их конъюгатов с ДР и увеличить эффективность действия конъюгатов.

4. Путем химического синтеза получены конъюгаты ЭФР и его рецепторсвязывающих фрагментов, АФП и МАТАФПр с ДР, проявляющие цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека, значительно превышающую активность свободного ДР.

5. Продемонстрировано значительное снижение резистентности опухолевых клеток к ДР при использовании конъюгатов ЭФР и ЭФРфр, АФП, и МАТдфпр с ДР.

6. В модельных экспериментах in vivo убедительно продемонстрировано, что терапевтическое применение конъюгатов ДР как с ЭФР, так и с ЭФРфр приводит к заметному подавлению опухолевого роста и значительному увеличению средней продолжительности жизни животных по сравнению с контролем. Применение свободного ДР не приводило к детектируемому терапевтическому эффекту.

7. Продемонстрировано, что АФП, МФТафпр, ЭФР и его рецепторсвязывающие фрагменты могут быть успешно использованы для избирательной доставки ДР в опухолевые клетки. Применение всех полученных препаратов позволяет значительно снизить резистентность опухолевых клеток к ДР.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аль-Названи Нассер Салем, Москва

1. Hanahan, D., Weiberger, R.A. the hallmarks of cance. Cell, 2000,100, 57-70.

2. Bolten, B.M. and Georgeo, T. trends in development cycles. Nat. Rev. Drug Discovery, 2002, 1, 335-336.

3. Multhof, G., Botzler, C., Jennen, L., Ellwart, J.,and Issels, R. shock protein 22 on tumor cells-a recognition structure for natural killer cells. J.Immunol, 1997, 158, 4341-4350.

4. Jain, R.K. Whitaker lecture: delivery of molecules, particles, and cells to solid tumors. Ann Biomed Eng, 1996, 24, 457-473.

5. Folkman, J. fighting cancer by attacking its blood supply. Sci Am, 1996, 275,150154.

6. Olson, T.A, Mohanraj, D., Roy, S., and Ramakrishnan. Targeting the tumor vasculature: inhibition of tumor growth by a vascular endothelial growth factor-toxin conjugate. Intj Cancer, 1997, 73, 865-870.

7. Yamagata, M. and Tannock, I. F. the chronic administration of drugs that inhibit the regulation of intracellular pH: in vitro and antitumor effects. Br J Cancer, 1996, 73, 1328-1334.

8. Tannok, I., Lee, C., Thaker, J., and Houghton, P. pH-dependent activity of the diarylsulfonyluria N-(5-indanylsulfonyl)-N'-(4-chlorofenyl)-urea. Cell pharmacol, 1995,2, 193-198.

9. De Lange, R.J., and Huang, T.S. Egg white avidin 3. sequence of the 78-residue middle cyanogens bromide peptide. Complete amino acid sequences of the protein subunit. J. Biol. Chem, 1971,246, 698.

10. Fasman, G. D., Ed. Practical handbook of biochemistry and molecular biology, p 13, CRS press, Boca Raton, FL, 1989.

11. Korn, A. H., Feairheller, S. H., and Filachione, E. M. Glutaraldehyde: nature of the reagent. J. Mol. Biol. 1972, 66, 525.

12. Riordan, J. F., and Vallee, B. L. Diazonium salts as specific reagents and probes of protein configuration. Methods Enzymol, 1972,25, 251.

13. Renthal, R., Cothran, M., Dawson, N, and Harris, G. J. Fluorescent labeling of bacteriorhodopsin: implication for helix connection. Biochim. Biophys. Acta 1987, 897,384.

14. Bragg, P. D., and Hou, C. subunit composition, function and special arrangements in the Ca2+ and Mg2+-activated adenosine triphosphatases of Echerichia coli and Salmonella typhimurium. Arch. Biochem. Biophys. 1975, 167, 311.

15. Lomants, A. L., and Fairbanks, G. Chemical probes of cleavable protein cross-linking reagent 35S.dithiobis(succinimidyl propionate). J. Mol. Biol. 1976, 102,243.

16. Kosower, N. S. Bimane fluorescent labels: labeling of normal human red cells under physiological conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979, 76, 3382.

17. Gundlach, H. C., Moore, S., and Stein, W. H. The reaction of iodoacetate with methionine. J. Biol. Chem. 1959,234, 1761.

18. Julian, R. A new reagent which may be used to introduce sulfhydryl groups into proteins, and its use in the preparation of conjugates for immunoassays. Bioconjugate Chem. 1990,1,222.

19. Duncan, R. J. S., Weston, P. D. and Wrigglesworth, R. A new reagent which may be used to introduce -SH group at 5'OH terminus of oligonucleotide. Nucleotides & nucleotides. 1992,11(5), 1003-1007.

20. Trail, A. P. and Bianchi, A. B. Monoclonal antibody drug conjugates in the treatment of camcer. Current Openion in Immunology, 1999, 11, 584-588.

21. Sievers, E. L., Appelbaum, F. R.,Spielberger, R. Т., Forman, S. J., Flowers, D., Smith

22. F. O., Shannon-Dorcy, K.,Berger, M. S., Bernstien, I. D. selective ablation of acute myeloid leukemia using antibody-targeting chemotherapy: a phase 1 study of an anti-CD33 calicheamicin immunoconjugate. Blood, 1999, 93, 3678-3684.

23. Saleh, M. N., LoBuglio, A. F., Trail, P. A. Immunoconjugate therapy of solid tumors: studies with BR96-doxorubicin. In Monoclonal-Antibody Based Therapy of Cancer. Edited by Grossbard M. New York: Marcel Dekker, 1998 397-416.

24. Firestone, R. A., Willner, D., Hofstead, S. J., King, H. D., Kaneko, Т., Braslawsky,

25. G.R., Greenfield, R. S., Trail, P. A., Lasch, S. J., Henderson, A. J., Casazza, A. M., Hellstrom, К. E., Hollstrom, I. Synthesis and antitumor activity of the immunoconjugate BR96-Dox. J. Control. Releasae, 1996, 39,251-259.

26. Go Saito, Joel A. Swanson, Kyung-Dall Lee. Drug delivery strategy utilizing conjugation via reversible disulfide linkages: role and site of cellular reducing activities. Advanced Drug Delivery Reviews, 2003, 55,199-215.

27. Stan, A. C., Rdu, D. L., Casares, S., Bona, C. A., Brumeanu, T, -D. Antineoplastic efficacy of doxorubicin enzymatically assembled on galactose residues of amonoclonal antibody specific for the carcinoembryonic antigen. Cancer Res, 1999, 59,115-121.

28. Hashida, S., Imagawa, M., Inoue, S., Ruan, К. -H, Ishikawa, E. More useful maleimide compounds for the conjugation of Fab' to forseradish peroxidase through thiol groups in the hinge. J. Appl. Biochem. 6, 1984, 56-63.

29. Wahl, A. F., Donaldson, K. L., Mixan, B. J., Trial, P. A., Siegal, С. B. selective tumor sensitization to taxans with the mAb-drug conjugate cBR96-doxorubicin, Int. J. Cancer 93,2001,590-600.

30. Hamman, P. R., Hinman, L. M., Beyer, C. F., Lindh, D., Upeslacis, J., Flowers, D. A., Bernstein, I. an anti-CD33 antibody-calicheamicin conjugate for treatment of acute myeloid leukemia. Choice of linker. Bioconjug. Chem. 13,2002,40-46.

31. Duncan, R., Gac-Briton, S., Keane, R., Musila, R., Sat, N. Y., Satchi, R., Searle, F. Polymer-drug conjugates, PDEPT and PELT: basic principles for design and transfer from the laboratory to clinic. J. Controlled Release, 74,2001, 135-146.

32. Daussin, F. Boschetti, E., Delmotte, F., Monsigny, M. p- Benzylthiocarbamoyl-aspartyl-daunorubicin-substituted polytrisacryl. A new dug acid labile arm-carrier conjugate. Eur. J. Biochem, 176, 1988, 625-628.

33. Zwick, E, Bange, J., Ullrich, A. Receptor tyrosine kinases as targets for anticancer drugs. Trends Mol Med, 2002, 8, 17-23.

34. Hicklin, D. J., Witte, L., Zhu, Z., Liao, F., Wu, Y., Li, Y., Bohlen, P., Monoclonal antibody strategies to block angiogenesis. Drug Discovery Today, 2001,6, 517-528.

35. Anna Bagnato and Francessca Spinella. Emerging role of endothelin 1 in tumor angiogenesis. Trends in Endocrinology and Metabolism. 2002,14:1.

36. Plate, K. From angiogenesis to lymphangiogenesis. Nat Med 2001, 7: 151-152.

37. Trikha, M., Yan, L. and Nakada, M. T. Monoclonal antibodies as therapeutics in oncology. Current Openion in Biotechnology, 2002, 13, 609-614.

38. Sedlacek, H. H., Seemann, G., Hoffmann, D., Czech, J., Lorenz, P., Kolar, C., Boslet, K. antibodies as carriers of cytotoxicity. Huber, H., Queiber (Eds.), contrib. Oncology, Karger, Basel, 43,1992, 75-82.

39. Trial, P. A., Willner D., Hellstrom, К. E. Site-directed delivery of anthracyclines for cancer therapy. Drug Dev Res, 1995, 34, 196-209.

40. Trail, P. A., Wilnwr, D., Lasch, S. J, Henderson, A. J., Hofstead, S. J., Casazza, A. M., Firestone, R. A., Hellstrom, I., Hellstrom, К. E. Cure of xenografted human carcinomas by BR96-doxorubicin immunoconjugates. Science, 1993, 261, 212-215.

41. Shih, L. В., Goldenberg, D. M., Xuan H. Lu, H., Sharkey, R. M., Hall, Т. C. Anthracycline immunoconjugates prepared by a site specific linkage via an amino-dextran intermediate carrier. Cancer Res, 1991,51,4192-4198.

42. Yang, F., Luna, V. J., McAnelly, R. D., Neberhaus, К. H., Cupples, R. I., Bowman, В. H., Evolutionary and structural relationship among the group specific component, albumin and alpha-fetoprotein. Nucleic Acids Res, 1985, 13, 8007-8017.

43. Deutsch, H. F. Chemistry and biology of a-fetoprotein. Adv. Cancer Res. 1991, 56, 253-312.

44. Seppala, M., Ruoslahti, E. Alpha fetoprotein: physiology and pathology during pregnancy and application to antenatal diagnosis. J. Perin. Med, 1973, 1,104-113.

45. Brock, D. J., Srimgeour, J. В., Nelson, M. M. Ameniotic fluid alpha fetoprotein measurements in the early prenatal diagnosis of central nervous system disorders. Clin. Genet. 1975,7,163-169.

46. Seppala, M. Fetal pathophysiology of human alpha fetoprotein. Ann. New York Acad. Sci. 1975,259, 59-73.

47. Ruoslahti, E. Alpha fetoprotein in cancer and fetal development. Adv. Cancer. Res, 1979,29, 275-3467.

48. Hisa, J. C., Er, J. S., Tan, С. Т., Ester, Т., Rouslahti, E. a-Fetoprotein binding specificity for arachidonate, bilirubin, docosahexaenoate and palmitate. A spin label study. J. Biol. Chem. 1980,255,4224-4227.

49. Ruoslahti, E., Ester, Т., Seppala, M. Binding of bilirubin by bovine and human alpha-fetoprotein. Biochim. Biophys. Acta. 1979, 578, 511-519.

50. Aoyagi, Y., Ikenaka, Т., Ichida, F. Copper2+-binding ability of human alpha fetoprotein. Cancer Res. 1978, 38, 3483-3486.

51. Torres, J. M., Laborda, J., Naval. J., Darracq, N., Calvo, M., Mishal, Z., Uriel, J. Expression of alpha-fetoprotein receptors by human T-lymphocytes during blastic transformation. Mol. Immunol. 1989,26, 851-857.

52. Morinaga Т., Sakai M., Weggman G., Tamaoki T. Primary structure of human alpha fetoprotein and mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983, 80,4604-4608.

53. Mizejewski G. I, Alpha-fetoprotein as a biologic response modifier. Relevance to domain and subdomain structure. Proc. Soc. Exp Biol Med, 1997, 215, 333-362.

54. Torres J., M., Carracq N., Uriel J. Membrane proteins from lymphoblastoid cells showing cross-affinity for alpha-fetoprotein and albumin. Isolation and characterization. Biochem Biophs Acta, 1992, 1159, 60-66.

55. Suzuki Y., Zeng CQY., Alpert E. Isolation and characterization of specific alpha-fetoprotein receptor on human monocytes. J. Clin Invest. 1992,90, 1530-1536.

56. Flynn G. C., Chappel T. G., Rothman J. E. Peptide binding and release by protein assembly. Science. 1989,245,385-390.

57. Torres J. M., Anel A., Uriel J. AFP-mediated uptake of fatty acids by human T-lymphocytes. J Cell Physiol, 1992, 150,456-462.

58. Feldman N. В., Kiselev S. M., Gukasova N. V., Posypanova G. A., Lutsenko S. V., Severin S. E. Antitumor activity of AFP conjugate with Doxorubicin in vitro and in vivo. Biochemistry (Moscow), 2000, 65, 8,1140-1145.

59. Gibbs P. M. P., Zielinski R., Boyd C., Dugaiczyk A. Structure, Polymorphism and Novel repeated DNA Elements revealed by a complete sequence of the human alpha-fetoprotein gene. Biochemistry, 1987,26, 1332-1343.

60. Matsumura M., Shiratori Y., Niwa Y., Tanaka Т., Ogura K. Presence of alpha fetoprotein mRNA in blood correlates with outcome in patients with hepatocellular carcinoma. J. Hepatol, 1999,31, 332-339.

61. Ido A., Ishikawa H., Wakata K., Eguchi K. Gene therapy for hepatoma cells using a retrovirus vector carrying herpes simplex virus thymidine kinase gene under the control of the AFP gene promoter. Cancer Res, 1995, 53, 3105-3109.

62. Wang X. W., Xie H. Growth inhibition of human liver cancer cells by alpha fetoprotein antisense strategy. In vitro Cell Dev Biol-Animal, 1999, 35, 3064-3067.

63. Wan N. J. Y., Jimenez-Molina J. J., Chou J. Y. Fetal and variant AFPs are encoded by mRNAs that differ in sequence at the 5' end. Biochemistry, 1988,27, 7269-7276.

64. Rouslahti E., Engvall E. Immunological crossreaction between AFP and albumin. Proc Natl Acad Sci USA. 1976, 73, 4641-4644.

65. Pekkala-Flagan A., Roulahti E. Unfolded transferring polypeptide chain is immunologically cross-reactive with similar derivatives of serum albumin and AFP. J Immunol, 1982,128, 1163-1167.

66. Villavampa M. J., Moro R., Naval J. Faillt-Cripin C., Lampreave F., Uriel J. Alpha fetoprotein receptors in a human breast cancer cell line. Biochem Biophys Res Commun, 1984, 122, 1322-1327.

67. Salomon D. S., Brandt R., Ciardiello F., Normanno N. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit Rev Oncol Hematol, 1995, 19, 183-232.

68. Brabender J., Danenberg K. D., Metzger R. Epidermal growth factor receptor and HER-2-neu mRNA expression in non-small cell lung cancer is correlated with survival. Clin Cancer Res, 2001, 7, 1850-1855.

69. Tsutsi S., Ohno S., Murakami S., Hatchitanda Y., Oda S. Prognostic value of EGFR and its relationship to the estrogen receptor status in patients with breast cancer. Breast Cancer Res Treat, 2002,1029, 7167-7175.

70. Liberman T. A., Razon N., Bartal A. D., Yarden Y., Schlessinger J., Sorq H. Expression of epidermal growth factor receptors in human brain tumors. Cancer Res, 1984,44, 753-760.

71. Filmus J., Pollak M. N., Caileau R., Buik R. N. MDA-468; a human breast cancer cell line with a high number of epidermal growth factor receptors, has an amplified EGF receptor gene and is growth inhibited by EGF. Biochem. Biophys. 1985, 128, 898905.

72. Bigner S. H., Humphrey P. A., Wong A. J., Vogelstein В., Mark J., Friedman H. S., Bigner D. D. Characterisation of the EGF receptor in human glioma cell lines and xenografts. Cancer Res, 1990, 50, 8017-8022.

73. Klijn J. G., Berns P. M., Schmitz P. I., Foeken J. A. the clinical significance of epidermal growth factor receptor in human breast cancer: a review on 5232 patients. EndocrRev, 1992,13,3-17.

74. Mendelson J. Growth Factor Receptors as targets for antitumor therapy with monoclonal antibodies. Prog. Allergy, 1988,45, 147-160.

75. Carpenter G. Receptor for epidermal growth factor and other polypeptide mitogens. Ann. Rev. Biochem, 1989, 56, 881-914.

76. Westphal M., Magnusson A., Heldin С. H. Growth factor biology and oncogene activation in human malignant glioma. Neuro Clinics, 1995, 3, 785-799.

77. Mendelsohn J. Epidermal growth factor receptor inhibition by a monoclonal antibody as anticancer therapy. Clin. Cancer Res, 1997, 3, 2703-2707.

78. Pawlikowska T. R. В., Hooker G., Myers M., Epenetos A. A. Treatment of tumor with radiolabeled antibodies. Cli. Oncol, 1986, 5, 93-107.

79. Prigent S. A., Lemoine N. R. The typr 1 (EGFR-related) family of growth factor receptors and their ligands. Progress in Growth Factor Research, 1992,4, 1-24.

80. Savage C. R., Chetterjee V. K., Gregory H., Bloom S. R. Epidermal growth factor in blood. Regulatory Peptides, 1986,16, 199-20.

81. Savage C. R. Jr., Hash J. H., Cohen S. Epidermal growth factor. J of Biological Chemistry, 1973,247 (22), 7669-7672.

82. Zaman G.J., Flens M. J., VanLeusden M. R. The human multidrug resistance-associated protein MRP is a plasma membrane drug-efflux pump. Proc Natl Acad Sci USA. 1994,91,8822-8826

83. Cowley O., Smith J. A., Gusterson B. The amount of EGF receptors is elevated in squamous cell carcinoma cancer cells. Cancer Cells, 1984, 1, 5-10.

84. Ciardiello F. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors as anticancer agents. Drugs, 2000, 60 (suppl. 1), 25-32.

85. Cardiello F., Tortora G. A novel approach in the treatment of cancer: targeting the epidermal growth factor receptor. Clin Cance Res, 2001, 7, 2958-2970.

86. Sartor C.I. Biological modifiers as potential radiosensitisors: targeting the epidermal growth factor receptor family. Semin Oncol, 2000, 27, 15-20.

87. Woodburn J. R. The epidermal growth factor and its inhibition in cancer therapy. Pharmacol Ther, 1999, 82, 241-250.

88. Mayers EL. V., Waterfield M. D. Biosynthesis of the epidermal growth factor receptor in A431 cells. J.EMBO. 1984, 3, 531-537.

89. Weber W., Gill G. N., Dpiess J. Production of an epidermal growth factor receptor-related protein. Science 1984,224,294-297.

90. Boulougouris P., Elder J. B. Epidermal growth factor receptor and transformations. Surg Today, 2002, 32, 667-671.

91. Hunter Т., Cooper J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell, 1984,24, 741-52.

92. Downward J., Yarden Y., Mayes E. Close similarity of epidermal growth factor and v-erb oncogene protein sequence. Nature, 1984, 307, 521-527.

93. Cohen B. D., Green J. M., Foy L., Fell H. P. HER4-mediated biological and biochemical properties in NIH 3T3 cells. Evidence for HER1-HER4 heterodimers. J. Biol-Chem, 1996,271,4813-4818.

94. Heldin С. H., Ostman A. Ligand induced dimerisation of growth factor: variations on the theme. Cytokine-Growth-Factor-Rev, 1996, 7, 3-10.

95. Earp H. S., Dawson T. L., Li X., Yu H. Heterodimerisation and functional interactions between EGF receptor family members: a new signaling paradigmwith implications for breast cancer research. Breast Cancer Res Treat, 1995, 35, 115-32.

96. Moscatello D. K., Holgado-Madruga M., Emlet D. R., Montegomry R. В., Wong A. J. Constitutive activation of phosphotidylinositol 3-kinase by naturally occurring mutant epidermal growth factor receptor. J Biol Chem, 1998, 273,200-206.

97. Normanno N., Ciardiello F. EGF-related peptides in the pathophysiology of the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 1997,2, 143-151.

98. Tateishi M., Ishida Т., Mitsudomi Т., Kaneko S., Sugimachi K. Immunohistochemical evidence of autocrine growth factors in adenocarcinoma of the human lung. Cancer Res, 1990, 50, 7077-7080.

99. Modjtahedi H., Dean C. The receptor for EGF and its ligands: expression, prognostic value and target for therapy in cancer. Int J Oncol, 1994,4,277-296.

100. Moscatello D. K., Holgado-Madruga M., Godwin A. K., Ramirez G., Gunn G., Zoltic P. W., Biegel J. A., Hayes R. L., Wong A. J. Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors. Cancer Res, 1995,55,5536-5539.

101. Nicholson R. I., Gee J. M. W., Harper M. E. EGFR and cancer prognosis. Eur J Cancer, 2001,37 (supl.4), S9-15.

102. Magne N., Pivot X., Bensadoun R. J. The relationship of epidermal growth factor receptor levels to the prognosis of unresectable pharyngeal cancer patients treated bychemo-radiotherapy. Eur J Cancer, 2001, 37, 2169-2177.

103. Drummond D. C., Meyer O., Hong K., Kirpotin D. В., Papahadjopoulos D. Optimising liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors. Pharmacol. Rev, 1999, 51, 691-743.

104. Matsumura Y., Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and th eantitumor agent samncs. Cancer Res, 1986,46, 6387-6392.

105. Senior I. H. Fate and behaviour of liposomes in vivo: a review of factors. Crit. Ret: ther. Drug Carrier Syst. 1998, 3, 123-193.

106. Trubetskoy, V. S., Torchilin V. P. use of polyoxyethylene-lipid conjugates as long circulating cariers for delivery of therapeutic and diagnostic agents. Adv. Drug Deliv, Ret, 1995, 16,311-320.

107. Yuan E, F, et al. Microvascular permeability and interstitial penetration of sterically stabilized (stealth) liposomes in a human xenograft. Cancer Res. 1994, 54, 3352-3356.

108. Gabizon A. A. Pegylated liposomal doxorubicin: metamorphosis of an old drug into a new form of chemotherapy. Cancer Invest, 2001, 19, 424-436.

109. Torchilin V. P., Lukyanov A. N. Peptide and protein drug delivery to and into tumors: challenges and solutions. Drug Discovery Today, 2003, 8 (6), 259-266.

110. Reza Mehvar. Dextrans for targeted and sustained delivery of therapeutic and imaging agents. J. Control Release, 2000, 69, 1-25.

111. Zhu Z. Kralovec J. Ghose T. Mammen M. Inhibition of Epstein-Barr-virus-transformed human chronic, lymphcytic leukemic В cells with monoclonal antibody-adriamycin (doxorubicin) conjugates. Cancer Immunol. Immunother. 1994, 40, 257267.

112. Marcia Barinaga. Peptide-guided cancer drugs show promise in mice. Science, 1998,279,323-324.

113. Akiyama S. K., Olden K., Yamada К. M. Fibronectin and intigrins in invasion and metastasis. Cancer Metastasis Rev, 1995, 14,173-189.

114. Varner J. A., Cheresh D. A. Integrins and cancer. Curr Opin Cell Biol, 1996, 8, 724-730.

115. Jiang W. G., Mansel R. E. Progress in anti-invasion and anti-metastasis research and treatment. Int J Oncol, 1996, 9, 1013-1028.

116. Garnett M. С.,Baldwin R. W. An improved synthesis of a methotrexate-albumin-791T/36 monoclonal antibody conjugate cytotoxic to human osteogenic sarcoma cell lines. Cancer Res, 1986,46,2407-2412.

117. Garnett M. C., Embleton M. J., Jacobs E., Baldwin R. W. Preparatio and properties of a drug-carrier conjugate showing selective antibody-directed cytotoxicity in vitro. Int J Cancer, 1983, 31, 661-670.

118. Garnett M. C., Embleton M. J., Jacobc E., Baldwin R. W. Studies on the mechanism of action of an antibody-targeted drug-carrier conjugate. Anti-Cancer Drug Design, 1985, 1, 3-12.

119. Affleck K., Embleton M. J. Monoclonal antibody targeting of methotrexate (MTX) against MTX-resistant tumor cell lines. Br J Cancer, 1992, 65, 838-844.

120. Stehl G., Sinn H., Wunder A., Schrenk H. H., Schutt S., Maier-Borst W., Heene D. L. The loading rate determines tumor targeting properties of methotrexate-albumin conjugates in rates. Anti-Cancer Drugs, 1997, 8, 677-685.

121. Pimm M. V., Clegg J. A., Caten J. E., Ballantyne K. D., Perkins A. C., Garnett M. C., Baldwin R. W. Biosdistribution of methotrexate-antibody conjugates and complexes: experimental and clinical studies. Cancer Treatment Rev. 1987, 14, 411-420.

122. Endo N. Kato Y., Takeda Y., Saito M., Umemoto N. Kishida К., Нага T. In vitro cytotoxicity of a human serum albumin-mediated conjugate of methotrexate with anti-MM46 monoclonal antibody. Cancer Res, 1987,47, 1076-1080.

123. Hen T. F. G., Garnett M. C., Chhabra S. R., Bycrofy B. W., Baldwin R. W. Synthesis of 2'-deoxyuridine derivatives and evaluation in antibody-targeting studies.J MedChem, 1993, 36, 1570-1579.

124. Fitzpatric J. J., Garnett M. C. Design, synthesis and in vitro testing of methotrexate carrier conjugates linked via oligopeptide spacers. Anticancer Drug Des 1995, 10, 19.

125. Cross M. J., Claesson-Welsh L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signaling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trend in Pharmacological Sciences, 2001, 22, 201-207.

126. Folkman J. Angiogenesis and apoptosis. Seminar in Cancer Biology, 2003, 13, 159-167.

127. Jones N., Iljin K., Dumont D. J., Alitalo K. The receptors new modulators of angiogenic and lymphangiogenic responses. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001, 2, 2572567.

128. Connoly D., Heuvelman D., Nelson R., Olander J., Eppley B.,Delfino J. Tumor vascular permeability factor stimulates endothelial cell growth and angiogenesis. J Clin Invest, 1989, 54, 1470-1478.

129. Plate K., Breier G., Weich H., Risau W.Vascular endothelial growth factor is a potential tumor angiogenesis factor in human gliomas in vivo. Nature, 1992, 359, 845-848.

130. Cornali E., Zietz C., Benelli R., Weninger W., Masiello I., Breier G. Vascular endothelial growth factor regulates angiogenesis and vascular permeability in Kaposi sarcomoa. Am J Path, 1996, 149, 185101869.

131. Yoshiji H., Gomez D., Shibuya M., Thorgirsson U. Expression of vascular endothelial growth factor, its receptor and other angiogenic factors in human breast cancer. Cancer Res, 1996, 56, 2013-2016.

132. Neufeld G., Cohen T, Gengrinovitch S., Poltorak Z. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. FASEB J, 1999, 13, 9-22.

133. Cross M., Cleasson-Welsh L. FGF and VRGF function in angiogenesis signaling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trends Pharmacol Sci, 2001,22, 201-207.

134. Shweiki D., Itin A., Soffer D., Kechet E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature, 1992, 350, 843-845.

135. Westermarck J., Kahari V. Regulation of matrix metalloproteinase expression in tumor inivasion. FASEB J, 1999, 13, 781-792.

136. Sternlicht M., Werb Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behaviour. Ann Rev Cell Dev Biol, 2001,17,463-516.

137. Meade-Tollein L., Way D., Witte M. Expression of multiple metalloproteinase and urokinse type plasminogen activator in cultured Kaposi sarcoma cell. Acta Histochem, 1999,101, 305-326.

138. Di Carlo E., Forni G., Lollini P., Colombo M. P., Modesti P. The intriguing role of polymorphnuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood 2001, 97, 339-345.

139. Parkin D., Pisani P., Ferlay J. Global cancer statistics. CA Cancer J, Clin, 1999, 49, 33-64.

140. Plow E. F., Haas T. A., Zhang I., Loftus J., Smith J. W. Ligand binding of integrins. J Biol Chem, 2000, 275,21785.

141. Augustin H. G. Antiangiogenic tumor therapy: will it work?. Tips, 1998, 19, 216222.

142. O'reily M., Воет Т., Shing Y., Fukai N., Vaios G., Lane W. Endostatin an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell, 1997, 88, 277-285.

143. O'Reilly M., Holmgren L., Shing Y., Chen C., Rosenthal R., Moses M. Angiostatin a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastasis by a Lewis lung carcinoma. Cell, 1994, 79, 315-328.

144. Cao Y., Veitonmaki N., Keough K., Chen H., Lee L., Zurakowski D. Elevated levels of urine angiostatin and plasminogen/plasmin in cancer patients. Int J Mol Med, 2000, 5, 547-551.

145. Gutterman J. U., Cytokine therapeutics: lessons from interferon alpha. Proc Nal Acad Sci USA, 1994, 91, 1198-205.

146. Wiechelman K. J., Braun R. D., Fitzpatrick J. D. Investigation of the Bicinchoninic acid protein assay: Identification of the groups responsible for color formation. Analytical Biochemistiy, 1988, 175, 231-237.

147. Fisher E. A. In: affinity chromatography and related techniques. Gribnau Т. C. J. Visser J., Nivard R. J. F. (Eds) Elsevier, Amesterdam, 1982, poster A15.

148. Laemmli U. K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature, 1970,227, 681-685.

149. Savage C. R., Cohen S. Epidermal growth factor and a new derivative: rapid isolation procedure and chemical characterization. J Biol Chem, 1972, 247, 76097611.

150. Marglin A., Merrifield R. B. Chemical synthesis of peptides and proteins. Annu Rev Biochem. 1970,39, 841-866.

151. Hurwitz E., Levy R., Mavon R., Wilchek M., Arnon R., Sela M. The covalent binding of daunomycin and adriamycin to antibodies with retention of both drug and antibody activities. Cancer Res. 1975, 35, 1175-1181.

152. Клаус Д. Лимфоциты и методы, 1990 М., с. 292-293.

153. Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. J. Immunol. Meth., 1983,65, 55-63.

154. Lawrence T. W., Zou J. X. Fractionation of rat a-fetoprotein by high performance liquid chromatography. J. Chromatography, 1985, 341,452-456.

155. Lawrence Т. W., Zou J. X. Simple purification procedure for rat a-fetoprotein by а combination of Cibacron blue gel affinity chromatography and ion-exchange high performance liquid chromatography. J. Chromatography, 1985, 338,410-416.

156. Chudy D., Zikzkovsky V. A. A simple and rapid method for the isolation of human alpha-fetoprotein from human cord serum. Neoplasia, 1987, 34,491-496.

157. Strop P., Zikzkovcky V., Kocakova J., Havranova M., Mikes F. Conformational transitions of human alpha 1 fetoprotein and serum albumin at acid and alkaline pH. Int. J. Biochem, 1984, 16, 805.

158. Stavrovskaya A. A. Cellular mechanisms of multidrug resistance of tumor cells. Biochemistry (Moscow), 2000, 65, 112-126.

159. Dillman R. O., Jonson D. E., Shawler D. L., Koziol J. A. Superiority of an acid-label Daynorubicin-monoclonal antibody conjugate compared to free drug. Canser Res., 1988,48, 6097-6102.

160. Rogers К. E., Carr В. I., Tokes Z. A. Cell surface-mediated cytotoxicity of polymer-bond adriamycin against drug-resistant hepatocytes. Cancer Res., 1983, 43(6), 27412748.

161. Shih L. В., Goldenberg D.M., Xuan H. Internalization of an intact doxorubicin immunoconjugate. Cancer Immunol. Immunother., 1994, 38, 92-98.

162. Lemieux P. Page М. Sensitivity of multidrug-resistant MCF-7 cells to a transferrin-doxorubicin conjugate. Anticancer Research, 1994, 14, 397-403.

163. Fitzpatrick, S. L., La Chance, M. P. Schultz, G. S. Characterization of epidermal growth factor receptor and action on human breast cancer cells in culture. Cancer Res. 1984,44, 3442-3447.

164. Hatano, Т., Ohkawa, K. Matsuda, M. Cytotoxic effect of the protein-doxorubicin conjugates on the multidrug-resistant human myelogenous leukaemia cell line, K562, in vitro. Tumor Biol. 1993,14,288-294.

165. Maciag, Т. Molecular and cellular mechanisms of angiogenesis. Important Adv. Oncol. 1990, 85-98.