Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и антиангиогенных агентов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и антиангиогенных агентов"
07-2
2293
итшттшттт
На правах рукописи
Фельдман Наталия Борисовна
РАЗРАБОТКА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ ПЕПТИДНЫХ ВЕКТОРОВ И АНТИАНГИОГЕННЫХ АГЕНТОВ
Специальность 03.00.04. - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискание ученой степени доктора биологических наук
МОСКВА 2007
Работа выполнена в Государственном учреждении здравоохранения Московском научно-исследовательском институте медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор
Луценко Сергей Викторович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Берман Альберт Ефимович доктор биологических наук Никитина Зоя Кимовна доктор биологических наук Глухов Александр Иванович
Ведущая организация: Институт биоорганической химии
им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Защита состоится « »__2007 г, в ______ часов на заседании
Диссертационного Совета Д 001.010,01 при ГУ НИИ Биомедицинской химии нм. В.И. Ореховича РАМИ по адресу. 119121, Москва, Погодинская ул., д. 10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ Бномедициисюй химии им, В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, Погодинская ул., д, 10.
Автореферат разослан «_»_2007 г.
Учёный секретарь Диссфтацнонного Совета
кандидат химических наук __ E.A.Kapnona
Актуальность цр^емы,
В настоящее время фундаментальной проблемой практической онкологии является высокая токсичность и пичкая избирательность действия противоопухолевых препаратов известных классов. Применение систем направленного транспорта с использованием монокпональных антител в качестве векторов не оправдало надежд на их высокую терапевтическую активность. Одним из наиболее перспективных путей решения данной проблемы, а также повышения эффективности действия цитотоксических противоопухолевых химиопрепаратов, является разработка способов их направленной доставки в раковую клетку в составе коньюгатов с векторными полипептидами. Избирательность транспорта при этом достигается за счет способности лигаида (вектора) к высокоаффииному связыванию со специфическими рецепторами, экспрессированными только/или преимущественно на клетках-мишенях. Для практического применения подобные векторы должны отвечать ряду требований, к числу которых относятся доступность в препаративных количествах, стабильность, сохранение высокого сродства к рецептору после химической модификации. В полной мере этим требованиям отвечают эпидермопьный фактор роста (ЭФР), аномально высокий уровень экспрессии рецепторов которого отмечается в клетках опухолей эпителиального происхождения, и оикофеталышй белок альфа-фетопротеин (АФП), рецепторы которого экспрессируются практически всеми типами раковых клеток, но отсутствуют на клетках нормальных тканей. Поэтому ЭФР и АФП были использованы нами для создания систем направленного действия, предполагающих наличие специфического рецептора и коаалентно связанных векторного белка и модулятора клеточной активности. Подобные системы могут найти применение в различных областях медицины для мучения возможностей направленного шишшя на физиологические процессы и повышения эффектипносгн действия известных хнмнозерапев-шческих средств при лечении целого ряд» заболеваний, включая онкологические. Сравнительное нсслслоишшс в модельных экспериментах т varo » м vivo уровня противоопухолевой атшиостн полученных систем направленного действия позволяет оценить возможности их применения и области практической онкологии. Изучение динамики накопления и внутриклеточного распределения химиопрепаратов, доставляемых и клетку в состаие систем направленного действия, имеет существенное теоретическое н прикладное значение, поскольку позволяет прояснить механизм их цитотоксического действия и наметить пути повышения его эффективности.
В последние десятилетня значительным достижением п области поиска новых эффективных методов терапии злокачественных новообразований явилось доказательство необходимости процесса ангиогснсзп для роста злокачественных солидных опухолей и создание концепции противоопухолевой терапии, основанной на подавлении ангиогенеза. Ангногенсз - процесс роста капилляров из кровеносных сосудов, а результате которого образуются новые сосудистые сети При этом патологический рост новых сосудов обусловливает прогрессию ряда заболеваний, прежде всего рост и метастазированне злокачественных опухолей. Подавление
аигиогеиеза ведет к торможению опухолевого роста и развития метастазов. Среди известных в настоящее время эндогенных ингибиторов ангиогенеза наиболее перспективными являются белки ангиостатин и эндосгатин, Однако эти полипептидиые ингибиторы ангиогенеза проявляют высокую терапевтическую эффективность преимущественно в высоких дозах (25-100 мг/кг массы тела) и требуют продолжительного курса лечения. В связи с этим особенно актуальной задачей представляется разработка высокотехнологичных методов получения ангиостатина и эндостатина, а также поиск возможностей изменения существующих схем терапии этими полипептидами, в частности, путем применения их липосомных форм.
Следует отметить, что несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы при становлении и развитии антиангиогенной терапии, для полной ремиссии применение только антиаигиогениых препаратов часто является недостаточным. Более эффективным подходом представляется комбинированная противоопухолевая химиотерапия, сочетающая в себе препараты с различными механизмами действия. Терапия аитиангиогемными полипептидами, разрушающая инфильтрирующие опухоль кровеносные сосуды и уничтожающая раковую клетку опосредованно, могла бы успешно сочетаться с применением высокоэффективных противоопухолевых препаратов, проявляющих в малигиизированмых тканях прямое цитотоксическое действие. Очевидно, что комбинированная терапия антиаигиогенными агентами и препаратами направленного действия является наиболее перспективным избирательным и эффективным путем воздействия на злокачественные опухоли.
Исходя из этого, актуальной иепыо данного исследования являлось создание и изучение терапевтического потенциала антиаигиогениш полипептидов и препаратов направленного действия п схемах комбинированной противоопухолевой терапии. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие чяличн:
- получить векторные пептиды, способные к избирательному проникновению в клетки злокачественных опухолей путём рецептаропосредованного эндоцитоза;
- осуществить синтез цитотоксических препаратов направленного действия, включающих противоопухолевые химнопрепараты (фталоцианипы, хлорины, аитрациклииовые антибиотики и растительные алкалоиды) и векторные белки (эпидермальный фактор роста и альфа-фетопротеин человека, а также их рецспторсвязывающие фрагменты);
- исследовать свойства, динамику поступления и внутриклеточного распределения полученных препаратов направленного действия и их противоопухолевую активность в системах in vitro и in vivo;
. - разработать технологичный метод получения рекомбниантиого эндостатина человека;
- получить липосомныс формы эндостатина и ангиостатина человека и изучить их противоопухолевую терапевтическую эффективность in vivo в сравнении с иелипосомными формами;
- исследовать ln vivo терапевтическую эффективность сочетай иого применения антиангиогенных пешипептидов и цитотоксических прспаратон направленного действия.
Основные положения, выносимые на защиту.
• Терапевтическая активность фталоцнанииов, антрациклиновых антибиотиков и растительных алкалоидов может быть значительно увеличена за счет их избирательного рецепторопосредоваииого транспорта в опухолевые клетки в составе препаратов направленного действия на основе АФП и ЭФР.
• Лекарственная резистентность опухолевых клеток к ai гграци клиновым антибиотикам может быть существенно снижена при их применении в составе препаратов направленного действия.
• Пептидные фрагменты ЭФР, ТФРа в АФП могут быть использованы в качестве эффективных векторов для направленной доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам-мишеням. ,
• Рецепторопосредоваиный эндоцитоз является эффективным механизмом избирательной доставки и транспорта в клетку цитотоксических веществ в составе препаратов направленного действия на основе пептидных векторов.
• Сконструированные плазмидные векторы, несущие геи эндостатииа человека, позволяют осуществлять эффективную экспрессию целевого белка в клетках штамма-продуцента. Разработанные методы выделения и ренатурации рекомбинантного эндостатнна позволяют получать биологически активный белок в препаративных количествах
• Сочетяннос применение антиангногенных агентов, способных разрушать опухолевую кровеносную сеть, и препаратов направленного действия, оказывающих прямое цитотокснческое воздействие на раковые клетки, позволяет существенно повысить эффективность противоопухолевой терапии.
Ияу'нш&мши ни ButoM,i
Разработаны оптимальные схемы получения эффективных противоопухолевых препаратов направленного действия, включающих фталоцианины, шггрошшшнонъго антибиотики, растительные алкалоиды и векторные белки (эподерммшкый фактор роста и альфа-фетопротеии человека). Убедительно продемонстрировано, что терапевтическая активность исследуемых препаратов может быть значительно увеличена за счет их избирательного рецепторопосредоваииого транспорт в опухолевые клетки в составе коиыогатов с векторными полипептидами.
Продемонстрирована возможность значительного снижения лекарственной устойчивости опухолевых клеток к антрациклнновым антибиотикам при использовании препаратов направленного действия. Впервые исследована динамика накопления и внутриклеточное распределение антибиотика антрациклннового ряда доксорубнцина, доставляемого в опухолевые клетки в составе препарата направленного
действия, включающего эпидермапьный фактор роста в качестве вектора. Полученные данные проливают свет на механизм цитотоксического действия полученных препаратов направленного действия и позволяют иаметить пути увеличения их противоопухолевой активности.
Впервые получены синтетические пептиды ЭФРмф и ТФРмф, представляющие собой модифицированные рецепторсвязывающие фрагменты соответственно эпидермального фактора роста (ЭФР) и трансформирующего фактора роста а (ТФРа) человека. Показана способность этих пептидов проникать в раковые клетки путам рецепторопосредованного эндоцитоза.
Впервые получены ковалентные коиыогаты пептидов ЭФРмф, ТФРмф и рекомбинантного белка - 3-го домена а-фетопротенна человека (АФПзд) с доксорубицином и продемонстрирована их высокая специфическая цитотоксическая и противоопухолевая активность in vitro и In vivo.
Сконструированы плазмидные векторы Е. coli, позволяющие эффективно осуществлять индуцированный биосинтез рекомбинантного эндостатина человека в клетках штамма-продуцента. Разработан простой и эффективный метод выделения и ренатурации рекомбинантного эндостатина, позволяющий получать биологически активный белок.
Впервые получены липосомные формы ангиостатииа и эндостатина человека и продемонстрировано, что противоопухолевая эффективность данных форм in vivo выше, чем соответствующих нелипосомных форм.
Впервые in vivo продемонстрирована более высокая терапевтическая эффективность комбинированного применения антиангиогешшх полипептидов и цнтотоксических препаратов направленного действия по сравнению с монотерапией каждым из данных терапевтических агентов.
Разработанные противоопухолевые препараты направленного действия, наряду с оптимизированными методами их получения и тестирования, могут быть использованы для дальнейших исследований в области практической онкологии с перспективой перехода в разряд препаратов, проходящих доклинические испытания.
Применение рецепторсвязывающих фрагментов ЭФР, ТФРа н АФП в качестве молекулярных векторов позволяет, наряду с увеличением стабильности и эффективности действия, достичь значительного снижения стоимости препаратов направленного действия.
Полученные штаммы-продуценты эндостатина человека и разработанные методы очистки и ренатурации этого белка могут быть использованы в области промышленной биотехнологии, а полученный рскомбипантный белок - как для научно-исследовательских работ, так и для его применения в области практической медицины.
Обнаружение более высокого терапевтического потенциала in vivo липосомиых форм ангиостатииа и эндостатина по сравнению с их свободными формами делает
возможным развитие этого направления в области создания новых противоопухолевых средств.
Продемонстрированное преимущество комбинированной терапии опухолей с применением двух классов препаратов с различными механизмами противоопухолевого действия, таких как антиангиогенные полипептиды и цитотоксические препараты направленного действия, представляет большой интерес при поиске эффективных схем противоопухолевой терапии. Полученные результаты расширяют понимание вопроса сочетания разных типов аитииеопластических средств при выборе схем лечения онкологических заболеваний и показывают важность продолжения исследований аитиангиогенных полипептидов и цитотоксических химиопрепаратов на основе пептидных векторов, специфические рецепторы которых гиперэкспоннроваиы на мембранах злокачественно перерожденных клеток.
На основе разработанных технологий получения рекомбинаитного эндостатина человека, препаратов направленного действия, включающих цитотоксические агенты и векторные полипептитды, а также липосомиых форм аитиангиогенных агентов оформлено б патентов на изобретение.
Апробация диссертационной работы. Результаты исследований доложены на конференциях: Meeting of the International Society for On «»developmental Biology and Medicine (ISOBM) (1996, IW, 2000, 2001, 2002, 2004); 5th European Winter Oncology Conference, France, 1997; the European Cancer Conference ECCO 9, Hamburg, 1997; Internationa] Conferences Hew Anticancer Agents, Athens, 1997; Vlll конференции «Новые направления биотехнологии» РАИ, Москва, 1997; Meeting of the EACR (1998. 2002, 2004, 2006); 4"1 European Congress of Pharmaceutical Sciences, Milan, 1998; Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2000, 2003, 2004, 2005); 17th Meeting of the International Acadcmy of Tumour Marker Oncology, Hong Kong, 2000; 3rt Central European Conference on Human Tumor Mnrken, Karlovy Vary, 2001; 3"* international symposium on genetic anticancer agents, Amsterdam, 2002, M11' International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, 2003; 37й*Annual Scientific Meeting of European Society for Clinical Investigation (ESC!), Verona, 2003; 9th World Congress on Cancers of the Skin, Sevilla, 2003; Объединенном иммунологическом форуме, Екатеринбург, 2004; международной конференции «Молекулярная медицина и биобсзопасностъ», Москва (2004,2005); the World Conference on Dosing ofAntiinfcctives, Numborg, Germany, 2004, международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Путина, 2005.
Публикации: основные материалы работы наложены в 35 статьях, материалах 35 конференций, б оформленных патентах РФ на изобретение.
Структур» н объем диссертации. Диссертация изложена на 248 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы; введение, обзор литературы,
описание материалов и методов Исследования, результаты и их обсуждение, общие выводы и указатель цитируемой литературы (330 источников). Работа иллюстрирована 67 рисунками и 23 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования
Для реализации поставленных задач были использованы методы исследования:
• химические (синтез, выделение и очистка препаратов направленного действия, твердофазный химический синтез);
• физико-химические (флуориметрия, проточная цитофлуориметрия, флуоресцентная микроскопия, центрифугирование, электрофорез, хроматография);
• биологические (исследование биологической активности препаратов на культурах клеток, исследование противоопухолевой активности на моделях экспериментальных опухолей у животных),
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Задачей первого этапа исследований являлось определение возможностей реализации подхода, рассматривающего рецепторопосредоваиный эндоцитоз в качестве универсального механизма, позволяющего доставлять в клетку-мишень различные эффекторы с помощью физиологических лигаидов и, таким образом, оказывать целенаправленное влияние па внутриклеточные процессы. Для практического выполнения поставленной задачи » качестве модели иами были использованы опухолевые клетки человека и химиопрепараты, широко исследуемые и применяемые в области практической онкологии. В качестве физиологических лигаидов были использованы белки ЭФР и АФП, а также их рецепторсвязывающие фрагменты, наиболее полно отвечающие критериям, предъявляемым к векторным молекулам (стабильность, доступность, высокий уровень рецепторов на клетках-мишенях и др.). Выбор области исследования продиктован большим практическим значением химиотерапии злокачественных новообразований и повышения ее эффективности в медицине.
Получение и исследование цитотокснчсской и противоопухолевой активности препаратов направленного действия на основе АФП и ЭФР In vitro и In vivo
Для исследования возможностей повышения противоопухолевой терапевтической активности фгалоцианинов алюминия (ФЦ(А!)) и кобальта (ФЦ(Со)), аитрациклиновых антибиотиков доксорубицина (ДР) и кармииомиципа (КМ) и растительных алкалоидов винкристина (ВК) и винбластина (ВБ), доставляемых в опухолевые клетки в результате рецепторопосредоваииого эндоцитоза, были
синтезированы их коньюгаты с векторными белками, Коиыогаты ДР, КМ и ВБ с АФП и ЭФР были получены с помощью водорастворимого карбодиимида, коньюгаты ФЦ(А1), ФЦ(Со) и ВК с АФП и ЭФР - путем прямого присоединения цитотоксических препаратов к белку. Молярные соотношения векторный белок: химиопрепарат в коныогатах АФП и ЭФР составляли 1:4 и 1:1 соответственно. Относительно высокое содержание цитотоксических препаратов в препаратах на основе АФП обусловлено более высокой молекулярной массой белка (~70 кДа) по сравнению с ЭФР (6,045 кДа). Увеличение содержания химиопрепарата в препаратах на основе ЭФР может привести к уменьшению аффинности векторной молекулы к рецептору и сказаться на эффективности внутриклеточной интерналгаации.
Цитотокснческая активность препаратов направленного действия на основе АФП и ЭФР
Сравнительное исследование цитотоксической активности (1ДТА) свободных противоопухолевых препаратов и их коныогатов с АФП проводили на клетках Т-клеточной лнмфомы человека линии QOS, обладающих способностью к эффективному связыванию и внутриклеточному накоплению данного белка [Severin 1995J. Опухолевые клетки рака молочной железы человека линии MCF-7 и меланомы мыши линии В16, несущие на поверхности рецепторы ЭФР, использовали в качестве моделей для оценки ЦТА соответствующих препаратов. Результаты исследования ЦТА свободных и входящих в состав препаратов направленного действия на основе АФП и ЭФР противоопухолевых агентов приведены в табл. 1 и 2, соответственно.
Тпблнця I, Цитотоксическям активность химиотеряпеггичееких препаратов и их коньюгятов с АФП » отношении клеток Т-кл«точной лимфомы человек« линии OOS (приведены средние значения 1С« по трем экспериментам для каждого тип» клеток).
Ирепйрят 1С«, мкМ
!$ШМ1ШШШ
ФЦ(А1) 1,46
АФП-ФЩА1) 1,09 1,34
ФЩСо) 12,2
АФП-ФШСо) 2,4 5,08
Аттжшклммтю шгшФнптикк
ДР 0,68
АФП-ДР 0,29 2,34
КМ 1,25
АФП-КМ 0,96 1,30
Растительные алкалоиды
ВБ 0,022
АФП-ВБ 0,0025 8,8
* Показатель соотношения доз (ПСД) представляет собоП отношение значений 1С« в присутствии свободного цитотокснческого препарата и препарата направленного действия.
Таблиц» 2. Цитотоксическяя активность химиотсрапевтичсскнх препаратов и их коныогятов с ЭФР в отношении опухолевых клеток карциномы молочной железы человека линии МСР-7 и меляномы мыши линии В1б (приведены средние значения 1СЯ по трем экспериментам для каждого типа клеток).
Препарат MCF-7 : В16
1С», ЧК.М !.:.:■: cat.... :.■:■; ПСД*
Фталоцианины
ФЦ(А1) ЭФР-ФЩА1) ФЦ(Со) ЭФР-ФЦ(Со) 2,5 0,9 40 0,3 2,78 133,33 6,1 2,5 16,2 12,1 2,44 1,34
Антшншклиновыс антибиотики
ДР 0,65 0,42
ЭФР-ДР км 0,57 0,029 1,14 0,18 0,028 2,33
ЭФР-КМ 0,007 4,14 0,027 1,04
Растительные
алкалоиды ВБ 0,0071 0,034
ЭФР-ВБ 0,0017 4,18 0,00015 226,67
ВК ЭФР-ВК 0,0084 0,002 4,20 0,011 0,0022 5,0
+ Показатель соотношения доз (ПСД) представляет собой отношение значений 1СМ в присутствии свободного цитотокснческого препарата и препарата направленного действия.
ЦТА препаратов, включающих фталоцианины
Следует отметить, что механизм активации фталоциаиинов, используемых для фотодииамической (ФЩА1)) и каталитической, или темповой (ФД(Со)) терапии может быть различным. Для активации ФЦ(А1) облучали клетки светом соответствующей длины волны [Moan 1990]. ФЦ(Со) активировали добавлением в клеточную среду аскорбиновой кислоты без использования источника свез'а [Moan 1990, Van Hillegersberg 1994]. Мольное соотношение ФЦ(Со):аскорбииовая кислота составляло 1:10. Изучение ЦТА фталоциаиинов и включающих их препаратов на основе АФП показало, что активность препаратов направленного действия заметно превышала активность свободных ФЦ, причем наибольшую ЦТА проявлял препарат АФП-ФЦ(Со). Аналогичные результаты получены для препаратов на основе ЭФР, причем препарат, включающий ФЦ(Со), проявлял чрезвычайно высокую ЦТА в отношении клеток карциномы молочной железы линии MCF-7 (табл. 2). Наибольшая эффективность цитотокснческого действия препаратов на основе ЭФР отмечалась также в отношении клеток MCF-7. Представленные данные наглядно иллюстрируют преимущество векторной доставки фталоциаиинов в клетку, позволяющей увеличите цитотоксичиость исследуемых препаратов.
ЦТА препаратов, включающих антрациклиновые антибиотики
Как видно из табл. 1 и 2, ЦТА препарата АФП-ДР в отношении клеток Т-клеточной лимфомы линии QOS превышала активность свободного вещества более чем в 2 раза. ЦТА препарата ЭФР-ДР и свободного антибиотика в отношении клеток линии MCF-7 характеризовались близкими значениями; в то же время препарат ЭФР-ДР в отношении клеток мышиной меланомы линии В1 б проявлял ЦТА в 2 раза большую, чем свободный ДР. Из препаратов, включающих КМ, лишь ЭФР-КМ проявлял ЦТА, существенно превышающую активность свободного антибиотика, в экспериментах с клетками линии MCF-7 (табл. 1,2).
Дополнительное сравнительное исследование ЦТА ДР, КМ и препаратов направленного действия проводили на чувствительных к этим антибиотикам клетках карциномы яичника человека линии SKOV3, поскольку оба вектора эффективно доставляют цитотоксические препараты в клетки данной линии [Severin 1995]. Результаты исследования приведены на рис. 1 и 2 и в табл. 3.
Как видно на рис. 1 и 2, АФП-ДР оказался более эффективным цитотоксическим препаратом (ЦТА препарата АФП-ДР выше активности ДР в 4,14 раза), чем АФП-КМ (ICso коныогата и свободного вещества характеризуются близкими значениями), что может быть обусловлено различиями в чувствительности и механизмах устойчивости клеток к данным антибиотикам. Препарат ЭФР-ДР, напротив, является менее цитотоксичиым, чем ЭФР-КМ: 1С» свободного ДР и его коныогата с ЭФР оказались равными, в то время как активность препарата ЭФР-КМ превышала активность свободного КМ в 3,67 раза.
IWK
|Др|, мкМ
Рис, I. Выживаемость клеток карциномы яичника человек» липни SKOV3 при инкубации со свободным ДР и препаратами АФП-ДР и ЭФР-ДР в течение 72 ч.
1000 |№и|,нМ
Рис, 2. Выживаемость клеток кярцимомм янчнмкл человек» липни SKOV3 при инкубации со свободным КМ н препаратами АФП-КМ и ЭФР-КМ в течение 72 ч.
Таблица 3. Цитотоксичсская активность доксорубнцнна и кармнномициня и их коныогатов с АФП и ЭФР в отношении клею к карциномы яичника человека линии ЯКОУЗ (приведены средние значения 1С9|| по трем экспериментам).
Препарат 1С», им пед*
ДР 1200
АФП-ДР 290 4,14
ЭФР-ДР 1200 1
КМ 110
АФП-КМ 99 1,11
ЭФР-КМ 30 3,67
* Показатель соотношения доз (ПОД) представляет собой отношение значений 1С» в присутствии свободного антибиотика и препарата направленного действия.
Представленные данные свидетельствуют о том, что эффективность цитотоксического действия препаратов направленного действия определяется не только природой цитотоксических агентов и векторных молекул и способом их химической "сшивки", но и правильным выбором наиболее уязвимых к действию препаратов опухолевых клеток-мишеией.
ЦТА препаратов, включающих растительные алкалоиды
ЦТА всех препаратов на основе ВБ и ВК, представленных в табл. Г и 2, превышала активность свободных алкалоидов в отношении клеток исследуемых линий как минимум в 4 раза. При этом превышение активности препаратов на основе ЭФР в отношении клеток линии МСР-7 над активностью свободных ВБ и ВК находилось примерно на одинаковом уровне (в 4,18 и 4,2 раза соответственно). ЦТА препарата АФП-ВБ в отношении клеток линии С|08 превосходила активность свободного ВБ почти в 9 раз. Наибольшей эффективностью цитотоксического действия отличался препарат ЭФР-ВБ, ЦТА которого в отношении клеток линии В16 превышала активность свободного ВБ более чем в 266 раз.
Представленные результаты исследования векторных возможностей ЭФР и АФП наглядно демонстрируют, что оба белка могут быть успешно использованы при создании препаратов направленного действия. При применении подобных препаратов, поступающих в клетки в процессе рецепторопосредовашюго эидоцитоза, их ЦТА в большинстве случаев значительно превышает активность свободных химиопрепаратов, попадающих в клетку в результате диффузии. В зависимости от механизма действия препарата, адресно доставляемого в клетку с помощью векторов, могут быть целенаправленно вызваны эффекты, модулирующие клеточную активность. Таким образом, подход к химиотерапии, предусматривающий использование рецепторопосредовамиого эндоцитоза для транспорта в клетку-мишень препаратов направленного действия, включающих физиологический л и га ид и химиопрепарат, представляется чрезвычайно перспективным.
Исследование противоопухолевой активности фталоциянннов, яитряциклиновых антибиотиков, растительных алкалоидов и включающих их препаратов направленного действия In vivo
Сравнительное исследование противоопухолевой активности свободных и входящих в состав коньюгатов цитотоксических препаратов проводили на моделях перевиваемых солидных опухолей мышей с использованием клеток мышиного лейкоза линии Р38В (мыши DBA/2) и мышиной меланомы В16 (мыши C57BI/6). Нами были использованы разные модели опухолей для изучения векторных возможностей исследуемых белков, поскольку ранее было показано, что АФП эффективно доставляет химиопрепараты в клетки линии Р388 [Severin 1996], а ЭФР в клетки линии В16 [Луценко 1998]. Препараты вводились 1 раз в 4 дня, всего 3 инъекции, начиная со 2 дня после прививки опухоли, в дозах (по химиопрепарату) 0,2 мг/кг в случае ФЦ(Со), ВБ и ВК, и 0,14 мг/кг в случае ДР и КМ. Через 1 ч после каждого введения препаратов ФЦ(Со) животные получали внутримышечно аскорбиновую кислоту в дозе 0,46 мг/кг. Эффективность противоопухолевого действия исследуемых препаратов оценивали по способности к ингибироваигао роста опухолей и увеличению средней продолжительности жизни животных, подвергавшихся терапии, по сравнению с контролем. Результаты исследований приведены в табл. 4 и 5.
Таблица 4. Противоопухолевая активность свободных н »холящих в comí» препаратом направленного действия химнотеряпевтнческих агентов в отношении солидных опухолей мышиного лейкоза линии Р388
Препарат ОРО\ У. СП», дни устк, %
от контроля
контроль 100 18,5±0,3 0
ФЦ(Со) 103 19.1*1,1 3,2
АФП-ФЦ(Со) 70 26,5*0,2 43,2
контроль 100 27.7*0,3 0
ДР 37,3 32.6*1.5 17,6
АФП-ДР 12,4 42,2±16.3 59,6
контроль 100 20,5*0,3 0
КМ 81,2 21,7*0.4 5.9
АФП-КМ 53,4 25,4
контроль 100 7,0*1,5 0
ВБ 32 9,7*1,5 38,6
АФГ1-ВБ 9 13,2*1,6 88,6
* Данные на день начала гнбалн животных в контрольной группе.
Противоопухолевая активность препаратов, включающих ФЦ(Со)
Несмотря на то, что препараты как Ф1ЦА1), так и ФЦ(Со) обладали высокой цнтотоксичсской активностью, для экспериментов in vivo мы избрали ФЦ(Со), поскольку данный препарат, в отличие от ФЦ(А1), может быть активирован при введении в клеточную среду и в органы аскорбиновой кислоты в отсутствии источника света [Hovodarova 1996]. Как видно из табл. 4, терапевтическое применение свободного
ФЦ(Со) в указанных дозах не приводило к ингибированшо роста опухолей, в то время как лечение животных препаратом АФП-ФЦ(Со) приводило к значительному замедлению роста опухолей. При этом величина ингибироваиия роста опухолей составляла 30% на день начала гибели контроля. При применении ФЦ(Со) и ЭФР-ФЦ(Со) по такой же схеме ингибирование роста опухолей отмечалось только в случае препарата направленного действия и составляло 44% к дню начала гибели контрольных животных, что свидетельствует о высокой противоопухолевой эффективности препарата ЭФР-ФЦ(Со) (табл. 5).
Таблица 5, Противоопухолевая активность свободных и входящих в состав препаратов направленного действия химиотеряпевтических агентов в отношении солидных опухолей мышиной меляномы линии В16.
Препарат ОРО*, % СПЖ, дни УСПЖ, %
от контроля
контроль 100 35,6+1,0 0
ФЦ(Со) 113 36,2+2,5 1,7
ЭФР-ФЦ(Со) 56 45,9+2,9 28,9
контроль 100 35,9+0,7 0
ДР 58,5 32,6+1,5 -9,0
ЭФР-ДР 29,8 42,8+2,1 20,2
контроль 100 30,9+4,8 0
КМ 88,9 32,5+7,1 5,2
ЭФР-КМ 48,2 39,4+2,1 27,5
контроль 100 36,1+4,0 0
ВБ 77 35,8+2,6 -0,5
ЭФР-ВБ 48 45,4+3,4 27,5
контроль 100 36,1 ±4,0 0
ВК 49,2 36,6+2,3 1,4
ЭФР-ВК 30,7 47,3+2,9 31,0
* - па день начала гибели животных в контрольной группе,
Как видно из табл. 4 и 5, лечение животных как препаратом АФП-ФЦ(Со), так н ЭФР-ФЦ(Со) оказывало также значительный позитивиьгй эффект в отношении УСПЖ животных. Представленные данные свидетельствуют о том, что как АФП, так и ЭФР могут быть успешно использованы для направленного транспорта фталоцишшиов к опухолевым клеткам-мишеням.
Противоопухолевая активность препаратов, включающих ДР и КМ
Для изучения возможностей повышения терапевтической активности ДР и КМ исследовали влияние свободных препаратов и их коныогатов с АФП и ЭФР на развитие опухолей ln vivo. При лечении животных свободным ДР и препаратом АФП-ДР ингибирование роста опухолей наблюдалось в группах, получавших как свободный антибиотик, так и коныогат. При этом направленный препарат оказывал более сильное супрессивное действие в отношении опухолей, чем свободный ДР (табл. 4). Так, к 28 дню эксперимента средний размер опухолей в группе, получавшей АФП-ДР, был в 3 раза меньше, чем в группе, получавшей ДР. Наиболее значительное УСПЖ также
наблюдалось в группе животных, получавших АФП-ДР (табл. 5). Таким образом, терапевтическая активность препарата АФП-ДР была значительно выше, чем активность свободного ДР. В группах животных, получавших ДР и препарат ЭФР-ДР, наблюдалось заметное иигибирование опухолевого роста. При этом относительный размер опухолей у животных, получавших ЭФР-ДР, к 40 дню после прививки опухоли оказался в 1,7 раза меньше, чем у животных, получавших свободный ДР, и в 3,4 раза меньше, чем в контроле (табл. 5). Кроме того, в отличие от свободного ДР, внутривенное введение препарата направленного действия приводило к 20% УСПЖ по сравнению с контролем (табл. 5).
Исследование влияния КМ и препарата АФП-КМ на процесс опухолевого роста показало, что КМ обладал менее выраженным ингибирующим действием по сравнению с направленным препаратом. Так, к 22 дао эксперимента средний размер опухолей у животных, получавших АФП-КМ, оказался меньше примерно в 1,5 раза, чем у животных, получавших свободный КМ, и в 1,9 раза меньше, чем в контрольной группе. Терапевтическое применение препарата АФП-КМ, в отличие от свободного КМ, также приводило к заметному УСПЖ животных (табл. 4).
Сравнительное исследование противоопухолевой активности КМ и ЭФР-КМ показало, что свободный антибиотик оказывал слабое иигибирующее действие в отношении роста опухолей в сравнении с контролем, тогда как иигибирующее действие ЭФР-КМ оказалось значительным - относительный размер опухолей в группе, получавшей ЭФР-КМ, составил лишь 48,2% (табл. 5). Эффект препарата ЭФР-КМ в отношении УСПЖ животных также оказался существенно выше эффекта свободного КМ.
Представленные результаты свидетельствуют о том, что терапевтическая активность ДР и КМ может быть значительно повышена за счет их адресной доставки к опухолевым клеткам-мишеням с помощью АФП и ЭФР. Следует также отметить, что используемые в работе дозы ЭФР, «водимого в составе препаратов направленного действия, не индуцируют ускоренного развитая опухолей и, таким образом, мнтогенная активность ЭФР не является препятствием для его использования и качестве вектора для адресной доставки цитотоксическнх препаратов к опухолевым клеткам-мишеням.
Противоопухолевая активность препаратов, включающих ВБ и ВК
Исследование влияния препарата АФП-ВБ на развитие солидных опухолей линии 1Л210 показало, что как свободное вещество, так и коиыогат в исследуемых дозах оказывали иигибирующее действие на рост опухолей (табл. 4). При этом относительный объем опухолей у животных, получавших АФП-ВБ, к 8 дню эксперимента оказался в 3,6 раза меньше, чем у животных, получавших свободный ВБ, и примерно в 11 раз меньше, чем в контроле. Терапевтическое применение препарата АФП-ВБ приводило к наибольшему УСПЖ животных (88,6%) по сравнению со всеми исследуемыми препаратами на основе АФП и ЭФР (табл. 4).
Исследование влияния ВБ и препарата ЭФР-ВБ в тех же дозах на рост опухолей линии В1б показало, что ЭФР-ВБ обладал более выраженным ингибирующим действием, чем свободный алкалоид (табл. 5). Относительный размер опухолей у животных, получавших ЭФР-ВБ, к 31 дшо эксперимента оказался в 1,6 раза меньше, чем у животных, получавших ВБ, и более чем в 2 раза меньше, чем в контроле. При лечении животных препаратом ЭФР-ВБ УСПЖ животных достигало 27%, тогда как свободный ВБ в используемых дозах практически не оказывал влияния на продолжительность жизни животных (табл. 5). Аналогичным противоопухолевым действием обладал препарат ЭФР-ВК. При его применении относительный размер опухолей у животных к 31 дшо эксперимента оказался в 1,6 раза меньше, чем у животных, получавших свободный ВК в той же дозе, и более чем в 3 раза меньше, чем у контрольных животных (табл. 5). УСПЖ животных при терапии препаратом направленного действия достигало 31%, тогда как применение свободного ВК практически не влияло на продолжительность жизни животных.
Представленные данные позволяют заключить, что АФП и ЭФР могут быть использованы в качестве векторов для адресной доставки противоопухолевых препаратов к клеткам-мишеням. На основе данных белков могут быть созданы противоопухолевые препараты направленного действия с цитотоксическимн веществами различных классов. Противоопухолевая активность препаратов направленного действия на основе векторных белков, включающих фтапоцианины, антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды, значительно превышает активность свободных цитотоксических препаратов. По нашему мнению, применение таких систем для лечения резистентных к химиотерапевтическим препаратам опухолей могло бы значительно повысить эффективность терапии за счет преодоления препаратами направленного действия резистентности опухолевых клеток и снижения терапевтических доз препаратов. Кроме того, многих побочных эффектов, вызываемых химиотерапеитическими препаратами, например высокой кардиотоксичности ДР, можно было бы избежать при применении систем направленного действия за счет адресной доставки цитотоксических препаратов к клеткам-мишеням. Для достижения максимальной терапевтической эффективности разработанных нами препаратов необходимо их дальнейшее совершенствование наряду с подбором наиболее уязвимых к терапии опухолей и поиском оптимальных схем лечебного применения препаратов.
Сравнительное исследование ЦТ А, динамики накоплении н внутриклеточного распределения свободного и входящего в состав препарата направленного действии на основе ЭФР доксорубицина
Резистентность, или множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток к действию ДР является основным препятствием на пути успешного его применения для терапии онкологических заболеваний. Коныогироваиие ДР с векторным белком может значительно увеличить его цптотоксичиость в отношении резистентных клеток, что представляется многообещающим путем преодоления МЛУ.
С точки зрения проявления цитотоксической активности ДР и ее зависимости от резистентности опухолевых клеток важнейшими факторами являются кинетические параметры включения антибиотика в клетку, а также оценка уровня его накопления и внутриклеточной локализации. Интернализация, внутриклеточная транслокация, компартмеитализация и накопление коиыогата ДР с белком, а также освобождение антибиотика внутри клетки в фармакологически активной форме являются важнейшими параметрами, определяющими ЦТА направленного препарата.
ЦТА доксорубицина и включающего его препарата на основе ЭФР в отношении чувствительной и резистентной к штрациклиновьш антибиотикам клеточной линии карциномы молочной железы МСР-7
Результаты сравнительного исследования ЦТА ДР и препарата ЭФР-ДР в отношении опухолевых клеток, чувствительных (МСР-7/\>Л) и резистентных (МСК-7/Ас№) к действию ДР, приведены на рис.3. Препараты проявляли дозозависимую ЦТА в отношении клеток обеих линий, причем препарат ЭФР-ДР проявлял более высокую активность, чем свободный ДР (в случае клеток линии МСР-7/\У1 в 4 раза, а МСР-7/АсМ1 - примерно в 2,2 раза, что, по-видимому, обусловлено различиями в путях поступления и внутриклеточного распределения препаратов). Наиболее высокая ЦТА препарата ЭФР-ДР проявлялась в отношении чувствительных клеток линии МСР-7/ЛЧ (1СяГ45 нМ) (рис. 3 А), В отношении резистентных клеток линии МСГ-7/Ас1гК активность ЭФР-ДР была существенно ниже (1С,мш1,б мМ) (рис. 3 Б), что, очевидно, объясняется действием механизмов, определяющих резистентность.
Рис. 3. Цитотоксичсскяя активность свободного и входящего и состав препарата направленного действия на основе ЭФР ДР в отношении клеток карциномы молочной железы человека линии МСР-7АУ1 (А) и МСК-7Шг1* (Б).
Накопление свободного и входящего в состав препарата направленного действия ДР в чувствительных и резистентных опухолевых клетках
В связи с тем, что уровень ЦТА препаратов направленного действия, так же, как и свободных химиопрепаратов, во многом определяется скоростью и характером поступления препаратов в клетку (пассивная диффузия и рецептор-опосредованный эндоцитоз), их компартментапизацией, а также эффективностью действия механизмов клеточной резистентности, мы провели исследование закономерностей поступления, накопления и внутриклеточного распределения химиопрепаратов на примере ДР путем измерения его собственной флуоресценции в клеточных суспензиях. Отсутствие заметного изменения флуоресценции ДР при его взаимодействии с клеточными органеллами и мембранами и, напротив, гашение флуоресценции при интеркаляции антибиотика в ДНК позволяет производить измерение его накопления в ядре и цитоплазме клеток [Tarasiuk 1989], Приведенные выше факты легли в основу производимых нами исследований.
Перенос ДР в составе препарата направленного действия и в свободном виде в клетки контролировали, используя флуоресцентные свойства этого антибиотика (X возбуждения 473 им, X эмиссии 556 нм). Следует отметить, что концентрация ДР в клеточных суспензиях при проведении эксперимента не должна превышать 6 мМ, поскольку интенсивность флуоресценции возрастает линейно при увеличении концентрации ДР до достижения данной величины, после чего наблюдается гашение флуоресценции за счет стэкинга молекул антибиотика [Tarasiuk 1989]. Клетки инкубировали с препаратом ЭФР-ДР или свободным ДР в течение 2 ч в питательной среде, затем собирали центрифугированием, измеряли флуоресценцию супериатаита, быстро промывали PBS с 0,1% BSA, суспендировали в растворе PBS и измеряли флуоресценцию суспензии клеток, соответствующую количеству ДР в цитоплазме и на мембранах клеток. Затем клетки лизировали, добавляя к суспензии 10% раствор ДСП до его конечной концентрации 0,2%, инкубировали 2 мин при 37 °С и измеряли флуоресценцию лизатов, отражающую общее содержание антибиотика в клетках. Количество аитрациклина, интеркалироваишего в ДНК, в ядрах клеток определяли по разности флуоресценции препаратов в присутствии ДСН и без него. Количество распавшегося ДР определяли по разиости значений флуоресценции препарата в лизатах в начале инкубации и после ее завершения.
Данные по накоплению ДР в клетках линий MCF-7/Wt и MCF-7/AclrR представлены в табл. б. Исследование накопления ДР в клетках показало, что после 2 ч инкубации содержание ДР в чувствительных клетках оказалось в 1,95 раза выше, чем в резистентных. Низкое содержание ДР в резистентных клетках обусловлено внутриклеточной деградацией свободного антибиотика, а также действием механизма, обеспечивающего выведение ДР из клетки [Сергеева 1996]. При инкубации клеточной суспеизии с ЭФР-ДР уровень накопления ДР в чувствительных и резистентных клетках существенно не различался. Очевидно, что при рецептор-опосредованном
эндоцитозе препарата ЭФР-ДР эффективность действия механизма, определяющего резистентность клеток к ДР, заметно снижена.
Таблица 6. Содержание ДР в клетках и среде инкубации по отношению к его исходному количеству в среде через 2 ч инкубации клеток МСР-7ЛУ1 и МС1''-7/Ас1гЯ со свободным и входящим в состав препарата направленного действия антибиотиком.
Клеточная культура Препарат Содержание ДР, %
Клетки Среди Распад
ЬЛСР-ТМТ ДР ЭФР-ДР 29,7 40,1 60,1 52,4 10,2 7.5
ЪЛСГ-УАШ ДР ЭФР-ДР 15,2 36,6 68,5 55,3 16,3 8,1
Следует отметить, что уровень накопления ДР как чувствительными, так и резистентными клетками при его поступлении в составе препарата ЭФР-ДР заметно превышает уровень накопления свободного ДР.
Представленные данные свидетельствуют о том, что рецепторопосредованный эндоцитоз, заложенный в основу препаратов направленного действия в качестве механизма транспорта, является более действенным средством доставки ДР в клетки МСР-7, чем диффузия свободного ДР через клеточную мембрану по градиенту концентрации. Высокий уровень накопления химиопрепарата резистентными клетками, обусловленный действием нахождением последнего в составе препарата направленного действия, может служить объяснением заметного снижения клеточной резистентности.
Ранее было показано, что ДР в клетке может подвергаться деградации [Тлиоп 1991]. Как видно из табл. 6, в процессе инкубации препарата ЭФР-ДР н свободного ДР с клетками линий МСК-7Л\Ч и МСР-7/Ас1гЕ происходит деградация ДР, регистрируемая но снижению флуоресценции, обусловленному образованием («флуоресцирующих продуктов распада ДР, но не его нитеркаляцией и ДИК. Следует отмстить, то ДР, доставляемый в клетку в составе препарате направленного действия на основе ЭФР, подвержен распаду п меньшей степени, чем проникающий п клетку посредством свободной диффузии. Более низкий распад ДР может быть объяснен протектианым действием полипептида, заключающемся в снижении воздействия на него шггоплазматических и околомембраиных ферментов, например трансглутамшшзы [Тпиоп 1991]. Наиболее высокий уровень деградации ДР наблюдался при инкубации клеток со свободным ДР, причем в резистентных клетках уровень распада был выше (16,3%), чем в чувствительных (10,2%) (табл. б), В случае препарата направленного действия ЭФР-ДР существенных различий в уровнях деградации ДР между чувствительными и резистентными клетками не наблюдалось. Низкий уровень внутриклеточной деградации ДР в составе ЭФР-ДР может рассматриваться как преимущество при использовании препарата направленного действия в качестве цитотоксического агента.
Накопление свободного и входящего в состав препарата направленного действия ДР в ядрах чувствительных и резистентных опухолевых клеток
Результаты экспериментов по изучению динамики накопления ДР в ядрах чувствительных (линия МСР-7Л¥0 и резистентных (линия МСР-7/Ас1гК.) клеток при их инкубации с препаратом ЭФР-ДР и свободным ДР приведены на рис. 4. На рис. 4 А видно, что как в случае препарата направленного действия, так и свободного ДР кривые достигают плато в течение 200 мин. При этом наблюдалось примерно 42% гашение первоначальной флуоресценции ДР. ^д, т.е. время, необходимое для достижения полумаксимального уровня гашения флуоресценции, составило 38 мин для препарата ЭФР-ДР и 17 мин для свободного ДР, что отражает значительное различие в скоростях поступления препаратов в ядра клеток (табл. 7). Как видно на рис. 4 Б, кривые гашения флуоресценции при 2-х часовой инкубации резистентных к ДР клеток линии МСР-7/Ас1гК, в отличие от МСР-Т/УЛ, не достигали плато. При этом отмечалось 44% и 32%-ное гашение первоначальной флуоресценции при 2-х часовой инкубации клеток с препаратом ЭФР-ДР и свободным ДР соответственно. 1|д для препарата ЭФР-ДР составило 46 мин, а для свободного ДР - 36 мин (табл. 7). Представленные данные свидетельствуют о более низких скоростях накопления препарата ЭФР-ДР в ядрах чувствительных и резистентных к ДР клеток по сравнению со свободным ДР. Различия в скоростях накопления свободного и входящего в состав препарата направленного действия антибиотика определяются как путем транслокации этих препаратов в клетку, так и особенностями их внутриклеточной компартментализации. Свободные аитрациклины быстро проникают в клетку в результате пассивной диффузии [Така1шЫ 1996]. Аитрациклины, входящие в состав препаратов направленного действия, попадают в клетку в результате рецепторопосрсдоваииого эндоцитоза, протекающего с более низкой скоростью [№Шш(^ат 1983].
t, MIHI t, MIHI
Рис. 4. Тушение флуоресценции ДР при инкубации опухолевых клеток карциномы молочной железы человека линий МСТ-7ЛУ( (А) н МСР-7/А<1 гИ (Б) со свободным и входящим в состав препарата направленного действия на основе ЭФР доксорубицнном.
Примечательно, что процесс накопления ДР в ядрах чувствительных клеток проходит значительно быстрее, чем в резистентных, как при использовании препарата ЭФР-ДР, так и свободного ДР, что может быть обусловлено проявлением механизмов резистентности, препятствующих проникновению химиопрепаратов в клетку [Сергеева 1996]. Одним из факторов, определяющих уровень ЦТА препарата ЭФР-ДР в отношении чувствительных (МСР-7/ШЦ и резистентных (МСР-7/Ас1гЯ) клеток, также может являться скорость поступления препарата в ядра клеток, что справедливо и для свободного ДР.
Таблица 7. Накопление свободного и входящего в состав препарата направленного действия ДР в ядрах чувствительных и резистентных опухолевых клеток.
Препарат/ Лини« клеток ДР ЭФР-ДР
tm*, мин MCF-7/Wt 17,1 ±0,6 38,3*0,8
MCF-7/AdrR 36,0±0,7 4б,2±1,1
С**, мкМ/106 кл MCF-7/Wt 0,538±0,010 0,б1б±0,018
MCF-7/AdrR 0,257±0,012 0,543*0,019
* - время полумаксимального накопления ДР в ядрах опухолевых клеток.
** С - концентрация связанного с ядром ДР, определенная в условиях стационарного
состояния.
Как видно из табл. 7, уровень накопления ДР, входящего в состав препарата ЭФР-ДР, в ядрах клеток MCF-7/Wl и MCF-7/AdrR превышает уровень свободного антибиотика. Уровень накопления свободного ДР в ядрах клеток MCF-7/Wt был заметно выше, чем п МСР-7/AdrR, что может елужить одним из объяснений резистентности клеток к шгштоксическаму действию антибиотика. Урошш накопления ДР, входящего в состав препарата ЭФР-ДР, в ядрах клеток MCF-7/WI и MCF-7/AdrR существенно не различались, т.е. не зависели от чуостпительиости клеток, что может служить объяснением высокой ЦТА антибиотика в отношении резистентных клеток при применении препарата направленного действия.
Для выяснения внутриклеточной локализации ДР, поступающего в клетки путем рецептеропосрсдованного эндоцитозп и диффузии через клеточную мембрану, мы исследовали его накопление в ядре и цитоплазме опухолевых клеток (табл. 8). После 2 ч инкубации клеток со свободным ДР и препаратом ЭФР-ДР антибиотик преимущественно локализовался в ядрах обоих типов клеток. При этом распределение свободного ДР между ядром и цитоплазмой клеток MCF-7/Wt и MCF-7/AdrR существенно различается. Так, соотношение содержания ДР в ядерной и цитоплазматической фракциях клеток MCF-7/Wt и MCF-7/AdrR составило 9,0 и 5,7 соответственно. Таким образом, по сравнению с клетками MCF-7/Wt, относительный уровень свободного ДР в ядрах клеток MCF-7/AdrR снижается, а в цитоплазме возрастает, что, очевидно, вызвано действием механизма клеточной резистентности [Сергеева 1996], препятствующего поступлению антрацнклииов в ядро. В
противоположность свободному антибиотику, соотношение содержания ДР, входящего в состав препарата ЭФР-ДР, в ядерной и цитоплазматической фракциях клеток МСР-У/Ш и МСР-7/Ас1гЯ составило 3,3 и 2,8 соответственно. Таким образом, при поступлении ДР в клетку в составе коиыогата с ЭФР его содержание в ядре (табл. 7), а также уровень его относительного распределения между ядром и цитоплазмой (табл. 8) практически не зависят от чувствительности клеток к антибиотику, что может свидетельствовать о низкой эффективности действия механизма клеточной резистентности в отношении препарата направленного действия. Одним из объяснений этого может служить недоступность связанного с ЭФР и проходящего путь внутриклеточных компартментов ДРдля действия мембранного насоса Р170.
Таблица 8. Распределение ДР мокну ядром и цитоплазмой клеток MCF-7 через 2 ч никубацни со свободным н входящим в состав препарата направленного действия ДР.
Ливия клеток Препарат Содержа! ме ДР, %
ЯДро Цитоплазма
MCF-7/Wt ДР ЭФР-ДР 90 77 10 23
MCF-7/AdrR ДР ЭФР-ДР 85 74 15 26
Таким образом, особая привлекательность использования препаратов направленного действия в качестве терапевтических средств связана с возможностью значительного снижения или полного преодоления множественной лекарственной устойчивости, условием которого является дальнейшее их совершенствование.
Создание и исследование противоопухолевого потенциала препаратов направленного действий на основе рецепторе вязывиюших пептидных фрагментов
афп.эфриТфри
Продолжением вышеописанных исслсдояалий явилась попытка создания и изучения противоопухолевого потенциала препаратов направленного действия на основе рецепторсоязывающих фрагментов АФП и ЭФР Поскольку трансформирующий фактор роста а (ТФРа) является физиологическим лнгандом рецептора ЭФР, рецепторсвязыпаюшлй фрагмент данного белка также использовали в качестве векторного компонента препаратов направленного действия.
Синтез пептидных аналогов рщепторевязывающих фрагментов ЭФР и ТФРа
В настоящем исследовании мы изучали возможность использования рецспторсвязывшощих фрагментов ЭФР и ТФРа в качестве таких векторов. ЭФР и ТФРа являются естественными лигандами рецептора ЭФР [СшкИеПо 2003), а
связывание как ЭФР [Ogiso 2002], так и ТФРа [Garrett 2002] с рецептором детально охарактеризовано. Были исследованы два пептида, полученные методом твердофазного пептидного синтеза, - модифицированный фрагмент ЭФР человека (рецспторсвязывающий участок ЭФР) (ЭФРмф) и модифицировать!й фрагмент ТФРа человека (рецептерсвязываюший участок ТФРа) (ТФРмф). ЭФРмф имел структуру M2N-MYIЕАLDSYАС-СООН и отличался от рецепторсвязываюшего фрагмента ЭФР человека (а.о. 21-31: MYIEALDKYAC) заменой Лизм на Сер. ТФРмф имел структуру HjN-RFLVQEDSPA-COOH и отличался от рецепторсвязываюшего фрагмента ТФРа человека (а.о. 22-31: RFLVQEDKPA) заменой Лнз»на Сер. Такие замены позволяют избежать взаимодействия е-амнногруппы лизина со сшивающим агентом в ходе коныогировапия пептидов. Экранирование лизина в составе пептидов может препятствовать взаимодействию коньюгатов с рецептором ЭФР и их эффективной интернализации.
Получение рекомбииантного 3-го домена а-фетопротеииа человека
Получение рекомбииантного а-фстопротеина связано с существенными трудностями ввиду высокой молекулярной массы белка и наличия в нем многочисленных углеводных компонентов и дисульфидных связей. В значительной мере избежать этих затруднений позволяет использование генно-инженерных конструкций, обеспечивающих продукцию не целого белка, а его биологически активных фрагментов. В кашей работе мы изучали потенциал АФПад, полипептида с мол. массой около 27 кДя, как векторном молекулы для адресной доставки шгготокснческнх средств и м&лигннзированные ткани. Препарат АФПзд был любезно предоставлен сотрудниками НИИ молекулярной медицины ММА им И.М. Сеченова к.б н. Гороховец I I В. и Макаровым В.А. Рекомбинантный АФПад выделяли из биомассы штшп-продуцент» Е, colt BL21(DB3), в которых он накапливался в тельцах включения. АФПзд получали из биомассы штамма-продуцента посредством ультразвуковой дезинтеграции клеток, изолнрошишя телец включения н ренатурации рекомбииантного бедки. Г'ешлурацшо проводили с помощью серии дшишэоп и окисления HS-rpynn препарата кислородом воздуха после предварительной полной денатурации АФПзд в присутствии мочевины и гуанилинхлорида. Окончательную очистку белка осуществляли геяь-фильтрвцианиой хроматографией на сорбенте Superdex 200 10/30, В результате был получен белок с мои. массой около 27 «Да (данные электрофорстичсского и масс-сле ктрального анализа). Выход репвтурированиого АФПзд соотавнл 5 мг/л культуральной среды.
Исследование накопления модифицированных рецепторсвязшакнцих фрагментов ЭФР и ТФРа человека в опухолевых клетках
Для исследования способности синтезированных пептидов к избирательному проникновению в клетки злокачественных опухолей применяли метод проточной цнтофлуорнметрни. В качестве стандарта при исследовании способности
1 „ ■ г4
Рис. 5. Интенсивность флуоресценции клеток ОШ45 после 1 ч инкубации с ЭФР-ФИТЦ, ЭФРм«г-ФИТЦ и ТФРм«~ФИТЦ в концентрации 4 мкМ при 37°С.
1~ ¡рт45 ЩИШ Фиброблисты
синтезированных пептидов к связыванию с рецептором ЭФР на поверхности клеток карциномы предстательной железы использовали ФИТЦ-меченый ЭФР. Известно, что при 4°С наблюдается связывание мембранных
рецепторов с их лигандами на поверхности клеток, но интернализации лиганд-
рецепторных комплексов ие происходит. При 37°С, напротив, после связывания с рецептором происходит
эффективная шггернализация лигандов, поступающих в
клетку
путем
рецепторопосредованного эндоцитоза. В связи с этим для исследования возможных путей поступления пептидов в клетку (рецепторопосредованный эндоцитоз или альтернативное проникновение через плазматическую мембрану) мы провели сравнительное изучение накопления флуоресцентной метки в опухолевых клетках карциномы предстательной железы человека линии ОН 143 и в клетках первичной культуры фибробластов человека при их инкубации с ФИТЦ-мечеными ЭФР и пептидами » различных температурных режимах,
Для обоих исследованных пептидов было показано, то уровень флуоресценции в клетках, инкубировавшихся с ФИТЦ-мечеными пептидами при 37"С, значительно выше, чем в клетках, инкубировавшихся при 4"С Так. при концентрации препарата 1 мкМ интенсивность флуоресценции при 37°С для ЭФРмф-ФИТЦ превышала интенсивность флуоресценции при 4"С на 29,2%, а для ТФРмф-ФИТЦ - на 62.6%. При концентрации 4 мкМ интенсивность флуоресценции при 37"С для ЭФРмф-ФИТЦ превышала интенсивность флуоресценции при 4"С ни 74,8%, для ТФРм*-ФИТЦ - на 185,2%, т.е. почти в 3 раза. Интенсивность флуоресценции клеток, обработанных ФИТЦ-мечеными пептидами в максимальной концентрации (4 мкМ), была значительно выше их аутофлуоресцеиции и сопоставима с уровнем флуоресценции клеток, инкубировавшихся с ЭФР-ФИТЦ (рис, 5). Этот вывод подтверждается флуоресцентной микроскопией клеток линии 011145, инкубировавшихся с ЭФР-ФИТЦ, ЭФРмо-ФИТЦ И ТФРмф-ФИТЦ (данные ие показаны). В то же время интенсивность флуоресценции в фибробластах человека, инкубировавшихся с ФИТЦ-мечеными пептидами в аналогичных концентрациях, была значительно более низкой. Так, после инкубации с ЭФР-ФИТЦ интенсивность флуоресценции фибробластов была более чем в 5 раз
слабее, чем клеток DU14J Интенсивность флуоресценции фнбробластов после инкубации с ЭФРмо-ФИТЦ и ТФРмо-ФИТЦ была ниже интенсивности флуоресценции опухолевых клеток Dl) 145 в 3,1 и 4,3 раза соответственно (рис.5). Полученные результаты свидетельствуют о способности данных пептидов специфически проникать в клетки карциномы предстательной железы человека путем рецепторопосредоваююго экдошпоза.
КоншгированиеДР с векторными пептидами
С целью изучения возможности использования синтезированных пептидов в качестве векторов для направленного транспорта нами были синтезированы коиьюгаты пептидов АФПзд, ЭФРм» и ТФРмф. а также ЭФР, с противоопухолевым антибиотиком антрациклинового ряда доксорубицииом. Коиьюгаты были получены с помощью сшивающего реагента PDPH (3-2(пирндилдитяо)пропионил гидразид). Мольное соотношение ЭФР:ДР, ЭФРмо ДР. ТФРм«:ДР и АФПзд:ДР для всех полученных препаратов составляло 1:1.
Определение ЦТА препаратов направленного действия на основе АФПуд, ЭФР, ЭФРмф и ТФРмф
Полученные препараты исопедовади на наличие специфической ЦТА In vitro на культурах ряда клеток гзокачествсниыч опухолей (карцинома предстательной железы человека DU145, эпндермондлм каршшома человека А431. карцинома молочной железы человека MCF-7 и фнбросаркома человека НТ1080). а также на нераковых клетках, в качестве которых использовали первичную культуру фнбробластов человека н линию мышиных эгшотишошггов SVEC4-I0. Препараты проявляли выраженную дозояшиеимую ЦТА в отношении всех четырех линий опухолевых клеток, фигурировавших в исслсжншнни При этом уровень ЦТА препарвтов ЭФРмф-ДР и ТФРмвг-ДР бш сравним с активностью препарата ЗФР--ДР- Данные о ЦТА всех препаратов на основе векторных пептидов в отношении исследованных клеточных лкннй обобщены в табл. 9,
Таблица 9, ЦТА препаратов mmpawiemm действии к» основе ЭФР, ЭФРмф» ТФРмф и АФПцд м ДР а отношении раковых и нормальных клеток человек» н мышм (приведены средние значения 1См по данным трех нешвнеиммх экспериментов).
Линия клеток 1С» мкМ
дг ЭФР-ДР ">Ф1\иг-Др ТФРМ»-ДР АФИдл-ДР
DU 145 0,065 0.055 0.105 0,090 0,172
A43I 0,027 0,021 0.040 0,023 0,137
MCF-7 0,051 0,057 0,133 0,112 0,114
HT10S0 0,079 0,064 0,258 0,149 0,094
Фиброблясты 0,071 2,29 2,14 2,05 1.14
SVEC4-I0 0,0075 0,133 0,495 0,611 0,234
Наибольшую активность ДР и препараты направленного действия на основе векторных пептидов - лигандов рецептора ЭФР - проявляли по отношению к клеточной линии А431. При этом ЦТА препаратов ЭФР-ДР, ЭФРмф-ДР и ТФРмф-ДР была близка к активности свободного ДР (табл. 9). Следует учитывать, что in vivo свободный ДР легко проникает во все типы раковых и нормальных клеток, что является причиной возникновения побочных эффектов. В противоположность этому, препараты на основе пептидов будут главным образом проникать лишь в опухолевые клетки, гиперэкспрессирующие рецептор ЭФР. Поэтому их цитотоксическое действие на нормальные клетки будет минимальным. Таким образом, несмотря на близкие значения ЦТА препаратов направленного действия и свободного ДР in vitro, преимущества направленных препаратов над ДР при их терапевтическом применении in vivo представляются очевидными.
Исследования ЦТА препаратов в отношении опухолевых клеток линии DU145 (карцинома предстательной железы человека) показали, что активность ЭФР-ДР (ICjo 0,055 мкМ) превышала как активность препаратов ЭФРмф-ДР (ICjo 0,105 мкМ) и ТФРмф-ДР (ICso 0,090 мкМ), гак и активность свободного ДР (ICJ0 0,065 мкМ). Уровень ЦТА препаратов ЭФРмф-ДР и ТФРмф-ДР, напротив, был несколько ниже, чем у свободного ДР.
В отношении клеточной линии MCF-7 (карцинома молочной железы человека) ЦТА препарата ЭФР-ДР (1С» 0,057 мкМ) была близка к активности свободного ДР (1С» 0,051 мкМ). Активность препаратов ЭФРмф-ДР и ТФРМ*-ДР была более чем в два раза ниже (ICso 0,133 и 0,112 мкМ соответственно).
В отношении клеток фнбросаркомы человека линии ИТ 1080 ЦТА препарата ЭФР-ДР была близка к активности свободного ДР, в то время как активность ЭФРмф-ДР и ТФРмф-ДР была ниже активности свободного антибиотика в 3,2 и 1,9 раза, соответственно (табл. 9). Возможно, такой результат говорит о специфическом рецепторном портрете клеток линии НТ1080, которые, не являясь клетками эпителиального гистогенеза, могут иметь особенности в экспонировании и функциональной amюности рецепторов ЭФР.
Для исследования действия препаратов ия нормальные клетки человека в качестве модельных культур использовали первичную культуру фибробластов человека и клетки эндотелия лимфатических сосудов мыши SVEC4-10, имеющие нормальный фенотип, при котором экспонирование рецептора ЭФР па поверхности мембраны минимально [Ciardiello and Tortora 2001],
ЦТА всех исследованных препаратов направленного действия в отношении клеток SVEC4-10 превышала активность в отношении фибробластов. Как видно из табл.9, при изучении ЦТА синтезированных препаратов на основе пептидов на первичной культуре фибробластов человека 1С» не достигалась даже при концентрации 2 мкМ, хотя для свободного ДР 1С» составляла лишь 0,071 мкМ. Таким образом, ЦТА свободного ДР оказалась значительно более высокой, чем активность каждого из коньюгатов. Клетки эндотелия мыши были выбраны нами в качестве
объекта исследования в силу необходимости установить возможное цитотоксическое действие препаратов ЭФРмф-ДР и 'ГФРмф-ДР на стенки сосудов экспериментальных животных, поскольку при исследованиях in vivo такие коиыогироваииые препараты, как и свободный ДР, будут вводиться внутривенно. ЦТА ДР при исследованиях на клетках эндотелия мыши линии SVEC4-10 была очень высокой (ICjo 0,0075 мкМ). ЦТА коньюгированиых форм антибиотика была в 60-80 раз ниже по сравнению со свободным ДР (ICjo препаратов направленного дейстия составляла 0,495 мкМ в случае ЭФРмф-ДР и 0,611 мкМ в случае ТФРмф-ДР). ЦТА препарата ЭФР-ДР по отношению к клеточной линии SVEC4-10 была ниже активности свободного ДР в 17 раз. Очевидно, что свободный ДР легко проникал как в фибробласты, так и в клетки SVEC4-10 путем диффузии и накапливался в них, оказывая мощный цитотоксический эффект. ДР, коньюгированиый с ЭФР и пептидами, в отличие от свободного антибиотика, может проникать лишь в клетки, несущие соответствующие рецепторы. В связи с этим при действии препаратов направленного действия нормальные клетки, в отличие от опухолевых, практически не поражаются или поражаются в незначительной степени, что является подтверждением избирательности цитотоксического действия таких препаратов.
В целом данные по активности препаратов ЭФРмф-ДР и ТФРмф-ДР в отношении раковых клеток различных линий соответствуют общим принципам действия противоопухолевых препаратов направленного действия [Ciardiello and Tortora 2001, Moskaleva 1997]. Несмотря на то, что в большинстве случаев шгготоксическая активность исследуемых препаратов » отношении опухолевых клеток не превышала активист« свободного антибиотика, преимущества препаратов направленного действия над обычными химиопрепаратами должны проявиться in vivo.
Препарат направленного действия ни основе векторного пептида АФПэд также проявлял выраженную дом'шиенмую ЦТА в отношении всех нсследопишшх линий раковых клеток. Как видно из табл. 9, наибольшую активность препарат АФПзд-ДР проявлял в отношении клеточной линии фнбросаркомы человека ИТ 1080 (1С« 0,094 мкМ). Специфичность действия дойного препарата подтверждается *гем, то его ЦТА в отношении нормальных клеток была значительно ниже, чем для раковых (1С.« для фибробластов составляла 1,14 мкМ). В то же время ЦТА препарата п отношении эндотшиальных клеток линии SVEC4-10 (ICjo 0,234 мкМ) был« довольно близка к цитотокеическим концентрациям для клеточных линий злокачественных опухолей. Предположительно такой реауяьтат объясняется тем, что эндотелиоциты продуцируют большие количества мембранных АФП-саяэыаающих белков [Mizejcwski 2001], благодаря чему препарат АФП)д-ДР поступает в клетки линии SVEC4-10 путем рецепторопосрадованиого эндогагтоза.
Как было ранее показано нами, препарат АФП-ДР проявлял высокую ЦТА в отношении клеток MCF-7 (1С« 0,045 мкМ) и SKOV3 (1С» 0,29 мкМ). Результаты по ЦТА препарата АФПзд~ДР в отношении раковых клеток (табл. 9) показывают, что его активность значительно ниже, чем активность АФП-ДР; однако, учитывая
продемонстрированную низкую активность АФПэд-ДР в отношении нормальных клеток, сравнительно с активностью на раковых клетках, можно предполагать терапевтические преимущества АФПэд-ДР над свободным ДР.
Микроскопическое исследование динамики интерналшации и внутриклеточного распределения препарата ТФРмф-ДР в раковых клетках
Нами также была изучена динамика внутриклеточного накопления препаратов направленного действия в опухолевых клетках на примере препарата ТФРмф-ДР. Методом флуоресцентной микроскопии было изучено поступление и внутриклеточное распределение препарата ТФРмф-ДР в клетки линии 01) 145 при инкубации в течение 1, 4 и 24 ч (рис. 6).
I ч
4 ч
24 ч
•х
о
п
X
рч ©
н
"' "Ж'! Ч,*.' $£ '.А 1
■ ■
1 ш
Рис. 6. Микрофотографии клеток карциномы предешелиной железы человека линии 1)1)145 после их инкубации с ДР и препаратом ТФ1>М«-ДР в течение различных промежутков времени. Фазово-контрастняи (А) и флуоресцентная (1>) микроскопия.
Свободный ДР быстро проникал в клетки, и уже через 1 ч инкубации флуоресценция детектировалась преимущественно в ядрах (рис. 6). Напротив, ДР в составе препарата ТФРмф-ДР после I ч инкубации был распределен по всему объёму цитоплазмы. Через 4 ч и особенно через 24 ч инкубации различия во внутриклеточной компартментализации свободного и коньюгнрованного с ТФРмф ДР практически нивелировались (рис. 6). Очевидно, что в процессе инкубации ДР поступает в клетку, накапливается в ядре, где и проявляет свое шгтотоксическое действие. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что коньюгированис ДР с векторным пептидом не препятствует реализации хнмнотерапсвтнчсским компонентом, в данном случае ДР, своего противоопухолевого цитотокснческого действия.
Таким образом, представленные результаты позволяют сделать вывод о том, что пептиды ЭФРмф, ТФРмф и АФПзд обладают высоким векторным потенциалом для доставки цнтотокснчсскнх хнмнопрспаратов в клетки злокачественных опухолей человека эпителиального н мезенхимального гистогенеза. Для дальнейшего изучения противоопухолевого потенциала полученных препаратов проводили испытания на мышах с привитыми опухолями
Исследование противоопухолевое! активности препаратов направленного действия на основе векторных пептидов на мышах с привитыми солидными опухолями
Сравнительное исследование противоопухолевой
3MHI-1
активности ДР н препаратов направленного действия на основе векторных пептидов ЭФРмф-ДР. ТФРмф -ДР и ЛФП1Л-ДР проводили ни мышах с модельными
солидными меланомы
опухолями HU.
Противоопухолевые
Рис. 7. Дшшмнкя рост мрнтт.и солидных опухолей мслпиомм В16 у мышей при терапии ДР и нренирятмн няпрявлеиного действия ни основе векторных пептидов.
20 IS М JS
Дни после прмннякм опухоли
препараты вводили животным внутривенно каждые 4 дня, начиная со 2-го дня после инъекции опухолевых клеток. Всего осуществляли 3 инъекции препаратов.
Применение препаратов
направленного действия на
основе ДР позволяет адресно доставляй, противоопухолевый антибиотик в раковые ткани организма и повысить эффективность терапии. В нашем исследовании это подтверждается значительно большим торможением роста опухолей у мышей, получавших препараты ЭФРмф-ДР, ТФРмф-ДР и АФПзд-ДР по сравнению с мышами, которым вводили раствор свободного ДР (рис. 7, табл. 10). Как видно на рис. 7, все три исследуемых препарата направленного действия проявляли довольно близкую терапевтическую эффективность (торможение роста опухоли по сравнению с контролем во всех трех группах животных сопоставимо (табл. 10)). Наибольшей терапевтической эффективностью обладал препарат ТФРмф-ДР. Препараты также увеличивали СПЖ экспериментальных животных. В табл. 10 представлены результаты по УСПЖ при терапии мышей ДР и препаратами ЭФРМф-ДР, ТФРмф-ДР и АФПзд-ДР. Как видно из таблицы, наибольшее УСПЖ животных вызывал препарат ТФРмф-ДР, что согласуется с данными по торможению опухолевого роста у мышей (рис. 7).
Таблица 10. Эффективность противоопухолевого действии препаратов ЭФРц»-ДР, ТФРмф-ДР и АФПад-ДР и отношении мышиной мслиномм В16 in vivo к сравнении с неконьюгнровяннмм ДР.
Препарат ТРО\ % СПЖ, дни УСПЖ, %
Контроль - 33,4*2,0 -
ДР 32.4 38,5±1,1 15,2
ЭФРмф-ДР 72,0 4 3,6± 1,2 30,6
ТФРмф-ДР 81,1 46,2±1,2 38,4
Коиьюгат ЛФП„ГДР 75,4 45,411,5 35.9
* Данные на 31 день эксперимента
Получение и исследование цитотокснческой иктнпностн ангиангногенных мрепаратон
11оддержанис роста злокачественных новообразований тесно связано с процессом аигногенеза, заключающегося в образовании кровеносной сети, питающей опухоль. При развитии злокачественного процесса сосуды мигрируют к опухоли, а опухоль, и свою очередь, к сосудам. Ингибирование роста сосудов приводит к остановке роста опухоли или ее регрессии. Ангиостатин и эндостатин являются пысоконотентнымн пнтнаигногенпымн препаратами, специфически ннгибнруюшими пролиферацию эндотелия кровеносных сосудов опухоли, препятствуя таким образом сс нормальной оксигснации и питанию. Чрезвычайно важно, что данные препараты действуют па организм без проявления токсических эффектов и развития резистентности. Однако особенности распределения и выведения ангностатнна и эндостатина из организма при их экзогенном введении обусловливают необходимость их применения в высоких терапевтических дозах (от 10 до 100 мг/кг/дснь). Решением данной проблемы могла бы служить направленная доставка препаратов к опухолевым сосудам с помощью липосом. Известно, что лнпосомные препараты способны
накапливаться также в областях, характеризующихся изолированной васкулатурой, таких как опухоли [Drummond 1999]. Поскольку капилляры, образовавшиеся в результате опухолевого неоангиогеиеза, характеризуются наличием в слое эндотелия большого количества пор размером до 800 им, липосомы, размеры которых традиционно не превышают 500 им, при циркуляции в кровотоке будут проникать преимущественно в солидные опухоли [Allen and Cullis 2004], обеспечивая направленный транспорт аитиангиогенного препарат В связи с этим другой целые нашего исследования являлось получение липосомных форм ангиостатина н эндостатина и исследование их протнвопухолевой активности.
Выделение и очистка ангиостатина
Ангиостатин имеет сложную пространственную конформацию и содержит 12 дисульфидиых связей, что крайне затрудняет получение ренатурированного белка в генно-инженерных иродуцет-ах. Для изучения терапевтического потенциала данного белка мы выделяли натмнный ангиостатин из плазмы крови человека. Нами была модифицирована ранее описанная методика [O'Reilly 1996] получения ангиостатина, что позволило получать нативный белок в достаточных для исследований количествах.
Плазминоген выделяли из плазмы крови человека с помощью аффинной хроматографии иа колонке с L-лизнн-сефароэой Фракция плазминогена, собранная с колонки, представляла собой концентрированный раствор высокоочнщенного белка (рис.8, дорожка.?). Для частичного протеолнза плазмниогена использовали элаетазу свиньи; после 12 ч протеолнза реакционную смесь наносили иа колонку с L-лизин-
кДя
•М-
67-
•U-
3020,1 - «м,
12 3 4 Рис. Я. Элсюрофорпрямм»
11J1I1IMIIIIOI CIIII и Hill HOC! Ill IIIIU
человека. I - стандарты молекулярных мисс; 2 - пляши крови человека; .? - плязмииопеи; 4 - ангиостатин.
=w
- «
Прсмн ЭЛЮЦИН, 'I
Рис.9. ПрпфИ.И. )ЛЮП11И Hill IHK Uli IIIIII с
колонки с Sephncryl .4-300. Стрелками оГн) 1НИЧСНЫ ipnilllUM сбор» фрикции ангмостятина.
сефарозой при 4"С. Ангиостатии, посредством присутствующих в его молекуле сайтов связывания с лизином, эффективно сорбировался на колонке. Белок элюировали 0,2 М раствором 6-аминокапроновой кислоты в фосфатно-солевом буфере. Однако чистота препарата на этом этапе была недостаточной, поэтому проводили дополнительную очистку ангиостатина с помощью гель-фильтрационной хроматографии на носителе Sephacryl S-300 (рис. 9).
Как показал электрофорстический анализ конечного продукта (рис. 8, дорожка V), полученный ангиостатин представляет собой смесь двух изоформ белка с мол. массами 38 и 40 кДа (различия относятся к аминокислотной последовательности С-конца, поскольку при действии эластазы на плазминоген протеолиз возможен более чем в одном сайте [Ji 1998]. С использованием данной методики из 1 л плазмы крови человека удается выделить 180-190 мг высокоочищенного плазминогена. Это выход, близкий к максимально возможному, поскольку концентрация плазминогена в плазме крови взрослого человека составляет 180-200 мкг/мл, или 1,5-2 мкМ [Castcllino 1984]. Количество ангиостатина, получаемого ограниченным протеолизом плазминогена, варьирует в зависимости от ряда условий и составляет (после всех стадий очистки) 2-3 мг из 10 мг плазминогена. Таким образом, из 1 л плазмы крови человека получали 35-55 мг гомогенного препарата ангиостатина.
Получение рекомбинантного эндостатина человека
Эндостатия человека содержит две внутримолекулярные днеульфидные связи и имеет относительно простую пространственную конфигурацию. В биологическом материале содержание эндостатина крайне низкое, поэтому разработка препаративных методов получения натпвного эндостатина нецелесообразна. В связи с этим получение эндосгатина для исследования его противоопухолевого потенциала осуществлялось нами с помощью генно-инженерных методов.
В качестве
экспрессионной системы был выбран штамм Е. coli BL21(DE3). В качестве источника гена эндостатина была использована библиотека генов человека. Фрагмент гена коллагена XV111,
соответствующий последовательности, кодирующей эндостатин, был выделен методом
Iliunll Hliid III
Рис. И). Экспрсссноннмй пек"гор,
кодирующий биосинтез рекомбинантного эндостатина человек» и штамме-продуценте Е. coli BL21(DE3).
амплификации. Для осуществления продукции эндостатнна человека в этом штамме была сконструирована плазмидная ДНК, содержащая ген эндостатина человека и названная pBSH-ED15 (рис. 10). Кроме того, была сконструирована плазмидная ДНК, аналогичная pBSH-ED15, но дополнительная включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую шесть N-концевых остатков гистидина (6-His-tag) и слитую с ними последовательность -(Асп)з-Лиз- (сайт расщепления энтерокиназой). Полученный вектор назвали pBSH-ED16 (рис, 10).
На последующем этапе подбирали подходящий штамм-продуцент для экспрессии целевого белка. Уровень экспрессии эндостатина человека определяли в различных штаммах Е. coli, содержащих плазмиду pBSH-ED15. В результате проведенного скрининга штаммов был выбран оптимальный продуцент - штамм Е. coli BL21(DE3), обеспечивающий высокий и стабильный уровень экспрессии целевого белка. Экспрессию гена эндостатнна человека осуществляли в штамме Е. coli, трансфицированном рекомбинантной плазмидой pBSH-ED15 или pBSH-ED16, в культуралыюй среде, сначала в отсутствие индуктора /ас-промотора изопропилтио-/?-D-галактопнранозида (ИПТГ). По достижении мутности среды OD«» 0,4-0,6 добавляли ИПТГ до концентрации 0,1-0,3 мМ и продолжали экспрессию под контролем индуцированного /ас-промотора.
Продукцию белка ожидаемой мол. массы (20 кДа) контролировали с помощью электрофореза в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСП Кик следует из данных, представленных на рис. 11, и клетках Е. coli с плазмндами pBSH-EDIS и pBSH-ED16 наблюдается эффективный биосинтез рекомбннантного эндостатина.
Разрушение клеточных оболочек, дезинтеграцию клеток, выделение цитоплазматических телец включения, начальные этапы очистки и реиатурацию эндостатина проводили для целевых продуктов экспрессии плазмид pBSH-EDIS и pBSH-ED16 одинаковым образом. Окончательная очистка проводилась различными методами, исходя из особенностей структурной организации получаемых белков.
В клетках штаммов-продуцентов с плазмндами pBSH-ED15 и pBSH-EDI6 рекомбннантный эндоетатин
экспрессируется в виде нерастворимых
30-
20,1
14,4 ■
I
l'iic. 11. Элсктрофорсгрнммл
гот.н.шлх лнтягоп клеток Е coll штяммов Н1.21(1)Г..1), трпнеформиро • шшных экспрессионными пскторпми эндоетатин» человек». / -стандарты молекулярных мисс; 2 - штамм, содержащий плазмиду рВМ1-К1)15; 3 - штамм, содсржпншП плазмиду pBSII-KOlii; 4 - штамм, lie несущий плазмид pBSH-EDIS или pBSH-ED16.
Ajeo 5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
Рис. 12.
Эидостатии
i_J
UL.
10
20
30
Время, мин
Профиль элюции
рекомбннянтного эндосгатина человека с колонки Superóse 12.
Эндостятни
40 50
Объём, мл
Рис, 13. Профиль элюции
рекомбинантного эндосгатина с колонки с Ni-NTA-arapoJofl.
телец включения, в которых белок присутствует в денатурированной неактивной форме. Для выделения телец включения из бактериальных клеток был избран подход, основанный на деструкции клеток ультразвуком.
Для увеличения эффективности разрушения клеток в среду вводили детергент натрия дезоксихолат и фермент лизоцим. Затем тельца включения отделяли от клеточного дезиитеграта центрифугированием, и обрабатывали препарат телец включения, находящихся в растворе детергента, ультразвуком с последующим центрифугированием и отделением нерастворившихся фрагментов клеточных структур и прочих примесей от целевого продукта.
Очистку целевого продукта, полученного экспрессией гшазмидиой ДНК pBSH-ED15, осуществляли методом гель-фильтрациоииой хроматографии с помощью системы FPLC на сорбенте Superóse 12 (рис. 12). Уровень продукции эндосгатина человека в штамме Е. coli, трансфицированиом плазмидой pBSH-ED15, составлял около 70 мт/л культуры.
Очистку целевого продукта, полученного экспрессией плазмидной ДНК pBSH-ED16, осуществляли методом катиоиообменной хроматографии на агирозиом носителе (рис. 13). Уровень продукции эндосгатина человека в штамме Е. coli, трансформированном плазмидой pBSH-EDló, составлял около 80 мг/л культуры,
Реиатурацию рекомбинантного эндосгатина проводили с помощью серии диализов. На первых этапах в рекомбинантном белке с помощью дитнотреитола восстанавливали все дисульфидные связи. Затем препарат подвергали медленному окислению под воздействием кислорода воздуха и редокс-пары глутатиоиа. Количество не окислившихся I-IS-rpynn в препаратах очищенного белка определяли, используя реактив Эллмана. Было установлено, что степень ренатурации рекомбинантного эндосгатина составляла более 95 % как для продукта экспрессии плазмиды pBSI-1-ED15, так и продукта экспрессии плазмиды pBSH-ED16.
На рис. 14 представлены данные электрофоретического анализа конечного препарата эндосгатина в 15% ПААГ в присутствии 0,1% ДСН. Как видно из представленных данных, оба препарата представляют собой практически гомогенные белки (чистота более 99 %) с мол. массой ~ 20 кДа, соответствующей массе иативиого эндостатина человека. Благодаря наличию в рекомбинантном эндостатине, кодируемом вектором pBSH-ED16, сайта протеолиза энтерокиназой, последовательность б-His может быть отщеплена от целевого белка после его очистки на Ni-NTA-агарозе, что уменьшит антигенные свойства рекомбинантного препарата.
Исследование ЦТА ангиостатина и эндостатина In vitro
Антиангиогенные полипептиды - аигиостатин и эндостатин - являются специфическими ингибиторами пролиферации эндотелиоцитов, в которых они вызывают апоптоз [Dhanabal 1999, Veitonmiiki 2004]. Для подтверждения биологической активности получаемых ангиостатина и эвдостатина мы инкубировали растворы этих белков е эндотелиальными клетками различных линий. Полученные результаты представлены на рис. 15.
Как видно на рис. 15 А, нативный ангиостатин человека оказывал дозозависимое цитотоксическое действие на все три типа исследовавшихся эидотелиальиых клеток. Наибольшую ЦТА ангиостатин проявлял в отношении клеток аорты быка линии АВАБ (ICjo 0,071 мкМ). На рис. 15 Б представлены результаты по ЦТА рекомбинантного эндостатина человека, проявляемой белком в отношении эндотепиальиых клеток. Наибольший цитотоксический эффект эндостатин оказывал в отношении линии эндотелиоцитов пупочной вены человека HUVEC (ICjo 0,017 мкМ). Близкую ЦТА эндостатин проявлял в отношении клеточной линии АВАЕ (ICjo 0,025 мкМ), В отношении клеток линии SVEC4-10 ЦТА эндостатина (lCsti - 0,064 мкМ) была
Рис, 15. ЦТА ангиостатина (А) н эндостатин« (Б) в отношении эндотслипльных клеток линий IIUVEC, АВАЕ и SVEC4-10.
значительно выше, чем у ангиостатина, что, вероятно, объясняется различиями в мембранных рецепторах и индуцируемых внутриклеточных сигнальных путях двух антиангиогенных полипептидов. Таким образом, оба белка проявляют выраженную антиангиогенную активность в отношении различных линий эндотелиальных клеток, что характеризует их в качестве эффективных антиангиогенных агентов.
Для подтверждения специфичности действия ангиостатина и эндостатина человека мы инкубировали растворы этих белков с нормальными клетками -гладкомышечными клетками аорты быка линии bSMC и фибробластами человека, а также с клетками злокачественных опухолей эпителиального гистогенеза линий DU 145 и MCF-7. Полученные результаты представлены на рис. 16 и 17.
1СМ, мкМ —V—bSMC 7,5
—О—Фиброблнсты 11,9
1СМ, мкМ —V—bSMC 9,9
—О—Фнбро&шсгы 8,4
0.1
Концентрации, мкМ
0.1
> . ю
Концентрации, мкМ
Рис, 16, ЦТА ангкоститина (А) и эндостатина (Б) в отношении бычьих гладкомышсчиых клеток линии bSMC и фнбробластов человека,
Как следует из данных, представленных на рис, 16, и аигиостатин, и эидостатии, проявляли цитотоксическое действие на гладкомышечные клетки и фибробласты только в очень высоких (> 5 мкМ) концентрациях. В тех дозах, в которых эти ингибиторы опухолевого ангиогенеза применяются в экспериментальной терапии (< 1 мкМ), они никак не влияли на жизнедеятельность нормальных клеток. По-видимому, цитотоксический эффект очень высоких доз антиангиогенных полипептндов объясняется меспецифическим (например, увеличение осмотического давления среды) подавлением жизнедеятельности нормальных клеток и не имеет физиологического значения.
Подобный эффект наблюдали при действии ангиостатина и эндостатина на раковые клетки человека - карциномы линий 011145 и МСГ-7: В дозах менее 1 мкМ оба белка никак не влияли на пролиферацию данных клеточных линий; цитотоксическое действие проявлялось только в дозах более 7 мкМ (рис, 17). По-
видимому, в таких дозах ЦТА препарата практически полностью обусловлена неспецифическим подавлением жизнеспособности клеток в культуре.
А
Б
о
"1 .......ib
Концентрация, мкМ
о
—о— ош45 14,« —л—mcf-7
в.:
0.1
1 10 Концентрация, мкМ
Рис. 17. ЦТА ангиостатиня (А) и эидостятина (Б) в отношении раковых клеток человека линиИ DU145 и MCF-7.
Таким образом, представленные данные свидетельствуют о высокой специфичности действия полученных ангиостатииа и э идо стати на человека по отношению к эндотелию сосудов. Можно предполагать, что при введении данных ингибиторов ангигеиеза в организм животных или человека они будут оказывать влияние только на эндотелиоциты опухолевых сосудов, подавляя пролиферацию клеток злокачественных опухолей не прямо, а опосредованно.
Получение линосомных форм яигиосгятиня и эидостятина н исследование их противоопухолевой активности In vivo
Для получения липосомных форм ангиостатина и эидостатина применяли мет-од экструзии. Липосомы получали ультразвуковой обработкой дисперсии яичный фосфатидилхолнн-холесггерин-белок с последующим многократным продявлнвапием через ядерный полнкарбонатный фильтр о диаметром пор 100 им, В результате размер полученных липосом был строго фиксированным и составлял 100 нм. Такой размер позволяет лнпосомным микровезикулам относительно свободно проходить через стенки кровеносных капилляров и накапливаться в тканях, где инкапсулированный терапевтический агент высвобождается. Поскольку капилляры, образовавшиеся в результате опухолевого неоангиогенеза, характеризуются наличием в слое эндотелия большого количества пор размером до 800 им, липосомы при циркуляции в кровотоке будут проникать преимущественно в солидные опухоли [Drummond 1999, Allen 2004, Vasir 2005], обеспечивая направленный транспорт аитиаигоогенных полипептидов.
Липосомы, получаеиные в данной работе, отличались следующими характеристиками: суммарное содержание липидов (фосфатидилхолина и холестерина)
в липосомных формах аигиостатина и эндостатина было одинаковым и составляло 25 мг/мл суспензии, содержание аигиостатина в соответствующих липосомах -5,2 мг/мл, содержание эндостатина в соответствующих липосомах - 3,4 мг/мл,
Сравнительное исследование противоопухолевой активности ангиостатина и эндостатина и их липосомных форм проводили на мышах с модельными солидными опухолями меланомы В16. Препараты ингибиторов аигиогеиеза вводили животным
внутривенно один раз в два дня, начиная с 10-го дня после прививки опухолевых клеток. Применение
липосомных форм
полипептидных препаратов позволяет увеличить время их полужизни в. организме и повысить терапевтическую эффективность. В нашем исследовании это подтверждается значительно большим подавлением роста опухолей у мышей, получавших липосомные формы аигиостатина (ТРО 67,0%) и эндостатина (ТРО 70,8%) по сравнению с мышами, которым вводили водные растворы белков (ТРО 26,1% и 34,6% соответственно) (рис. 18). Как видно из табл. И, применение липосомных препаратов приводило и к существенному УСПЖ эксперимеиз-апьных животных. Терапия лнпосомиой формой аигиостатина приводила к двукратному УСПЖ по сравнению с терапией нелипосомным препаратом, а аналогичный показатель для липосомного эндостатина составил 1,9 раза.
Таблица П. Эффективность противоопухолевого действия липосомных форм аигиостатина н эндостатина в отношении мышиной меланомы В1б ln vivo в сравнении с нелиносомными формами.
Препарат OPOV% СПЖ, дни УСПЖ, %
Контроль 100 29,1 ±2,9 -
Нелипосомиые Ангиостятин 73,9 35,1±2,7 20,6
Эндостатин 65,4 3б,3±3,0 24,7
Липосомные Аигиостатин 33,0 41,3±3,3 41,9
Эндостатин 29,2 42,9±2,9 47,4
* Данные на 31-й день эксперимента
15 20 25 30 35 Дни после прививки опухоли
Рис. 18. Влияние липосомных и нелипосомных форм ангиостатина и эндостатина на рост опухолей меланомы В16 у мышей.
Нами также изучался противоопухолевый эффект липосомных форм аигиостатииа и эидостатииа при их комбинированном применении с ДР. Исследование показало, что введение обоих препаратов в режиме сочетанной терапии с антибиотиком приводило к значительному подавлению роста опухолей (на 70,5% при терапии липосомным ангиостатином и на 72,6% при терапии лишсомным эндостатином) и увеличению СПЖ животных (50,9% и 55,0%, соответственно). При этом значения показателей ТРО и УСПЖ превышали таковые от терапии только липосомными препаратами (табл. 11 и 12). Таким образом, введение в терапевтическую схему ДР позволяет существенно повысить эффективность терапии липосомными антиангиогенными препаратами.
Таблица 12. Эффективность противоопухолевого действия липосомных форм я н ги о стати на и эидостатииа в отношении мышиной меляномы В1б ln vivo при их сочетанием применении с ДР.
Препарат ОРО\ % СПЖ, дни УСПЖ, %
Контроль 100 29,1 ±2,9 _
ДР, 2 мг/кг Липосомный ангиостатин 29,5 43,92±2,б 50,9
Липосомный эндостатин 274 45,12±3,1 55,0
* Данные на 31-Я день эксперимента
Изучение возможностей совместного применения антиангногсниых препаратов и препаратов направленного действия на основе ДР и векторных пептидов для терапии опухолей
Завершающей частью нашего исследования являлось выяснение возможных преимуществ комбинированной противоопухолевой терапии аитипигиогешшми полипептидами и цитотоксическими препаратами направленного действия на основе ДР, Согласно современным представлениям о химиотерапии опухолей, наибольшую эффективность лечения может обеспечить комбинированная химиотерапия препаратами с различным механизмом действия. В основе этого подхода лежит представление о том, что нарушение различных биохимических процессов в опухолевой клетке уменьшает шансы на то, что уцелеют резистентные клопы опухолевых клеток. Терапия антиангиогенными полипептидами, разрушающая инфнльтрующие опухоль кровеносные сосуды и уничтожающая роковую клетку опосредованно, могла бы успешно сочетаться с применением высокоэффективных противоопухолевых антибиотиков, проявляющих в малигинзнрованных тканях прямое цитотоксическое действие. Продемонстрированное м vivo увеличение терапевтической эффективности ДР в составе препаратов направленного действия на основе ЭФРмф, ТФРмф и АФПзд по сравнению со свободным ДР позволило нам использовать эти препараты в схемах комбинированной терапии.
Исследование проводили на мышах с привитыми опухолями мышиной меланомы В16. При сочетании применения липосомной формы аигиостатииа с препаратами направленного действия ЭФРмф-ДР, ТФРмф~ДР и АФПзд-ДР
наблюдалось выраженное увеличение терапевтической эффективности всех исследуемых препаратов (рис. 19, табл. 13).
Рис. 19, Торможение опухолевого роста при комбинированной терапии экспериментальных животных липосомиой формой ангиостатина и препаратами направленного действия на основе ДР (данные на 31 день эксперимента).
Как показано на рис. 19, при сочетании терапии препаратами ЭФРмф-ДР, ТФРмф-ДР и АФПзд-ДР с введением липосомного ангиостатина во всех случаях отмечалось более выраженное торможение опухолевого роста, чем при ионотерапии препаратами направленного действия. Комбинированная терапия препаратами направленного действия приводила также к увеличению СПЖ экспериментальных животных по сравнению с мототерапией (табл. 13). В случае сочетшшого применения ЭФРмч>~ДР, ТФРмф-ДР и ЛФПзд-ДР и липосомиой формы ангиостатина наблюдали достоверное УСПЖ, что свидетельтаует о высокой терапевтической эффективности такой терапии,
Таблица 13. Увеличение средней продолжительности жизни мышей с привитыми опухолями прн комбинированной терапии липосомиой формой аигносгатина и препаратами направленного действия на основе ДР.
Препарат Монотсрапны Комбинированная тщмшиа
СПЖ, дни УСПЖ, % СГШ, дни УСПЖ, %
Контроль 33,4*2,0 - 33,4*2,0 ~
ЭФРмф-ДР 43,6*1,2 30,6 49,0*1,4 46,7
ТФРмф-ДР 46,2*1,2 38,4 51,1*1,0 53,0
АФП)д~ДР 45,4*1,5 35,9 49,7*1,2 48,8
Похожие результаты наблюдались при комбинированной терапии мышей с меланомой В16 липосомной формой эндостатина и препаратами направленного действия на основе ДР и векторных пептидов (рис. 20 и табл. 14).
Рис.20. Торможение опухолевого роста при комбинированной терапии экспериментальных животных липосомной формой зндосгашна и препаратами направленного действия на основе ДР (данные на 31-Й день эксперимента).
На рис.20 представлены графические данные по торможению опухолевого роста при комбинированном применении препаратов направленного действия ЭФРмф-ДР, ТФРмф-ДР и АФПзд-ДР и липосомного эндостатина. Как видно из приведенных данных, в случае сочетанной терапии наблюдалось выраженное увеличение терапевтической эффективности по сравнению с мототерапией только препаратами направленного действия.
Таблица 14. Увеличение средней продолжительности жизни мышей с привитыми опухолями при комбинированной терапии липосомной формой эндостатина и препаратами направленного действия на основе ДР.
Препарат Ионотерапии Комбнниропиннпн терапии
ОТЖдйм УОШ. % СИХСднн УС11Ж, %
Контроль 33,4*2,0 _ 33,4*2,0
ЭФРм*-ДР 43,6*1,2 30,6 48,3*1,6 44,6
ТФРмф-ДР 46,2*1,2 38,4 49,8*1,3 49,1
АФПш-ДР 45,4*1,5 35,9 49,6*1,4 48,5
Комбинированная терапия также приводила к увеличению СПЖ экспериментальных животных по сравнению с монотерапией (табл. 14). Как следует из представленных данных, терапевтический потенциал эндостатина довольно
значительно увеличивается при сочетанном его применении с препаратами ЭФРмф-ДР, ТФРмф-ДР и АФП3д-ДР.
Представленные результаты свидетельствуют о высоком потенциале комбинированной антиангиогенно-цитотоксической противоопухолевой терапии. Как показали исследования, наибольшего терапевтического эффекта и увеличения продолжительности жизни у экспериментальных животных удается добиться при сочетанном применении препаратов направленного действия на основе ДР (ЭФРмф-ДР, ТФРмф-ДР и АФПзд-ДР) и антиангиогенных полипептидов -ангиостатина и эндостатина.
ВЫВОДЫ
1. Путем химического синтеза получены препараты направленного действия, включающие химиопрепараты (фталоцианины, хлорины, антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды) и векторные белки (ЭФР и АФП), проявляющие цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека, превышающую активность соответствующих химиопрепаратов.
2. Показано преимущественное накопление антрациклинового антибиотика доксорубицина в основных мишенях его цитотоксического действия - ядрах опухолевых клеток - при использовании его в составе препарата направленного действия на основе ЭФР. Обнаружено, что при поступлении доксорубицина в опухолевые клетки в составе коиыогата с ЭФР уровень его содержания в клетках и ядрах, а также распределение между ядром и цитоплазмой практически не зависят от чувствительности клеток к антибиотику. Динамика и уровень накопления свободного доксорубицина определяется уровнем резистентности опухолевых клеток.
3. Продемонстрировано значительное снижение резистентности опухолевых клеток к доксорубицину in vitro при его применении в составе препарата направленного действия на основе ЭФР.
4. Показано, что при поступлении доксорубицина как в чувствительные, так и резистентные к этому антибиотику опухолевые клетки в составе препарата направленного действия уровень его внутриклеточной деградации заметно снижается.
5. В экспериментах in vivo на мышах с привитыми солидными опухолями мелаиомы В16 продемонстрировано, что терапевтическое применение систем направленного действия, включающих фталоцианины, антрациклииы и растительные алкалоиды, приводит к значительному ингнбироваиию опухолевого роста и увеличению продолжительности жизни животных. Применение свободных препаратов в тех же дозах практически не оказывает влияния на эти параметры.
6. Доказана возможность практического использования рецепторопосредоваиного эидоцитоза в качестве эффективного механизма селективного концентрирования и
транспорта в клетку модуляторов клеточной активности и цитотоксических веществ, осуществляемого с помощью ЭФР и АФП.
7. Впервые получены синтетические пептиды - модифицированные фрагменты рецепторсвязывающих участков ЭФР и ТФРа человека - и продемонстрирована их способность к поступлению в клетки опухолей эпителиального и мезеихималыюго гистогенеза путем рецепторопосредованного эндоцитоза.
8. Получены коньюгаты доксорубицина с ЭФР, ЭФРмф и ТФРщф и продемонстрирована их высокая цитотоксическая активность в отношении клеток раковых опухолей человека линий различных линий. С помощью флуоресцентной микроскопии продемонстрирована внутриклеточная локализация коныогатов.
9. Получен коньюгат доксорубицина с рекомбинантным пептидным фрагментом а-фетопротеина человека (3-й домен а-фетопротеина). Установлена специфическая цитотоксическая активность полученного препарата в отношении различных опухолевых клеточных линий.
10. В экспериментах от vivo на мышах с привитыми солидными опухолями продемонстрировано, что терапевтическое применение цитотоксических препаратов направленного действия АФПзд-ДР, ЭФРмф-ДР и ТФРмф-ДР значительно подавляет развитие опухолей и увеличивает среднюю продолжительность жизни животных.
И. Сконструирован плазмидиый вектор, позволяющий осуществлять эффективную индуцируемую экспрессию геиа эидостатина человека в штамме-продуценте Б. coli. Разработаны эффективные модифицированные методы выделения и ренатурацни рекомбинантиого эидостатина человека.
12. Получены липосомные формы ангиосгатина и эидостатина человека на основе фосфатидилхолина и холестерина, проявляющие высокую противоопухолевую активность.
13. В экспериментах по терапии опухолей in vivo показано, что совместное а ведение лнпосомных форм аигиоетатииа или эидостатина и свободного доксорубицина является более эффективным, чем применение этих агентов в режиме монотерапин.
14. В экспериментах in vivo показано значительное увеличение эффективности противоопухолевого действия аитиангиогеииых агентов (ангиостатин, эндостатин) и препаратов направленного действия (АФПзд-ДР, ЭФРмф-ДР, ТФРмф-ДР) при их комбинированном применении.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
1, Severin S., Feldman N.. Finakova О., Seviuky A., Myaghkikh I, Luzhkov Yu., Kalukov V., Nakachian R,, Severin E. Antitumoral effect of alpha-fatoprotein conjugates in vivo. // Abstracts of XXIV meeting of the International Society for Oneodevelopmental Biology and Medicine, California, USA. - 1996. - P.I21.
2. Severin S.E., Moskaleva E.Yu., Posypanova O.A., Koromyslova I.A., Shmyrev 1.1., Krivonos A.V., Myagkikh I.V., Feldman N.B., Finakova G.V., Katukov V.Yu., Luzhkov Yu.M.,
Nakachian R., Andreani J., Severin E.S. In vivo antitumor activity of cytoxic drugs conjugated with human a-fetoprotein. // Tumor Targeting. - 1996. - Vol. 2. - P. 299-306.
3. Moskaleva E.Yu., Feldman N.B., Finakova G.V., Shmyrev I.I., Posipanova G.A., Rodina A.V., Nakachian R., Katukov V.Yu. Targeted delivery of antitumor drugs based on oncofetal protein alpha-fetoprotein. // Abstracts of 5"' European Winter Oncology Conference, France. -1997. - P. 59.
4. Posypanova G.A., Sotnichenko A.I., Shmyrev I.I., Moskaleva E.Yu., Feldman N.B., Finakova G.V., Katukov V.Yu., Luzhkov Yu.M., Severin E.S., Nakachian R., Andreani J. Targeted delivery of experamicine A1 by using oncofetal protein a-fetoprotein. // Abstracts of the European cancer conference ECCO 9, Hamburg. - 1997,- P.389.
5. Lutsenko S.V., Finakova G.V., Feldman N.B., Gumanov S.G., Korzhenevsky D.A., Gukasova N.V. and Severin S.E. The increase in selectivity of antitumor action of vinblastine and vincristine by targeted delivery of their EGF-conjugates to tumor cells. // Abstracts of the International Conference New Anticancer Agents, Athens, Greece, - 1997. - P. 56.
6. Луценко C.B., Гукасова H.B., Посыпанова Г.А., Гуманов С.Г., Фельдман Н.Б., Москалева Е.Ю., Северин Е.С., Северин С.Е., Скрябин К.Г. ЭФР как вектор для направленной доставки доксорубицина (ДР) к клеткам опухолевых линий, резистентных к ДР. // Материалы VIII конференции «Новые направления биотехиологии» РАН, Москва, Россия. - 1997. - С. 35.
7. Луценко С.В., Гуманов С.Г., Фельдман Н.Б., Поеыпанова Г.А., Москалева Е.Ю., Северин С.Е., Северин Е.С., Скрябин К.Г. Накопление и внутриклеточная локализация доксорубицина (ДР) при его направленном транспорте к опухолевым клеткам с помощью эпидермального фактора роста (ЭФР). // Материалы VU1 конференции «Новые направления биотехнологии» РАН, Москва, Россия, - 1997, - С. 48.
8. Lutsenko S.V., Gukasova N.V., Gumanov S.G., Posypanova O.A., Korzhenevsky D.A., Feldman N,В. and Severin S.E. Study of the cytotoxic activity of the epidermal growth factor-doxorubicin conjugate against human tumor cell cultures. // Abstracts of the 15е' meeting European association for cancer research (EACR XV), Stockholm, Sweden. - 1998. - P. 72.
9. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Gukasova N.V., Posypanova G.A., Gumanov S.G., K.G.Skryabin, Severin S.E. Toxicity of epidermal growth factor corrugate with doxonibicin against antibiotics-resistant tumor cell cultures. // Absiracls of thr Fourth European congress of pharmaceutical sciences, Milan, Italy. - 1998. - P. 56.
10. Луценко C.B., Финакова Г.В., Фельдман Н.Б., Гуманов С.Г., Родина А.В., Посыпанова Г'.А,, Гукасова Н.В., Корженепский Д.А., Катуков В.Ю., Северин С.Е., Скрябин К.Г., Кирпичников М.П. Рецепторопосрадопанный токсический эффект коныогата эпидермального фактора роста с доксорубицином в отношении опухолевых клеток. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 1998. - № 1,- С. 21-25,
П. Луценко С.В., Фельдман И,Б., Финакова Г.В., Гуманов С.Г., Гукасона И,В., Корженевский Д А., Бобрускин А.И., Гельперина С.Э., Посыпанова Г.А., Катуков В.Ю., Северин С.Е., Скрябин К.Г., Кирпичников М.П., Калия О.Л., Ворожцов Г.Н. Направленная доставка к клеткам - мишеням и цитотоксическая противоопухолевая активность окта-4,5-карбокснфталоцианииа (терафтап). // Вопросы биологической, медицииской и фармацевтической химии. - 1998. - Ku 1.-С. 34-37.
12. Луценко С.В., Фельдман Н.Б., Посыпанова Г.А., Северин С.Е., Скрябин К.Г,, Лую.янец Е.А., Ворожцов Г.И., Северин ЕС, Изучение цнтотокснческой противоопухолевой активности коныогатов фталоциаиинов с эпидермпльным фактором роста (ЭФР). // Российский химический журнал (журнал Российского химического общества им. Д.И. Менделеева).- 1998.-Т. XUI.- № 5. - С. 101-104.
13. Фельдман Н.Б., Луценко С.В., Финакова Г.В., Шмырев И.И., Посыпанова Г.А., Скрябин К.Г., Северин С.Е. Повышение противоопухолевой активности доксорубицина за счет его адресной доставки к клеткам-мишеням с помощью белковых векторов. // Вопросы биологической, медицииской и фармацевтической химии. - 1999. - №1. - С. 44-48,
14. Луценко С.В., Фельдман Н.Б., Финакова Г.В., Посыпано bei Г.А., Бобрускин А.И., Гельнерина С.Э., Скрябин К.Г., Калия О.Л., Ворожцов Г.Н., Северин С.Е. Направленный транспорт ФЦ(Со) к опухолевым клеткам-мишеням с помощью альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 1999. - №1. - С. 40-44.
15. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Finakova G.V., Posypanova O.A., Severin S.E., Skryabin K.G., Kirpichnikov M.P., Lukyanets E.A., Vorozhtsov G.N. Targeting phthalocyanines to tumor cells using epidermal growth factor conjugates. // Tumor biology. - 1999. - Vol. 20 (4). - P. 218-224.
16. Северин C.E., Посыпанова Г.А., Сотниченко А.И., Москалева Е.Ю., Фельдман Н.Б., Григорьев М.И., Северин Е.С., Петров Р.В. Противоопухолевая активность ковалентного коныогата ендшшового антибиотика эсперамицина AI с сс-фегопротеином человека. II Доклады Академии наук (биохимия, биофизика, молекулярная биология). - 1999. - Т. 366. - №4. - С. 561-564.
17. Sotnichenko A.I., Severin S.E., Posypanova G.A., Feldman N.B., Grigor'ev МЛ., Severin ES., Petrov R.V. Water-soluble 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin complex with human a-fetoprotein: properties, toxicity in vivo and antitumor activity in vitro. // FEBS Letters. -1999.-Vol. 450.-P. 49-51.
18. Lutsenko S.V., Gukasova N.V., Kiselev S M., Severine M.E., Feldman N.B., Severin S.E. The cytotoxic effect of the alpha-fetoprotein- doxorubicin conjugate on human embrionic umbilical vein endothelial cells and tumor cells MCF-7. It Abstracts of 27Ul meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Kyoto, Japan - 1999. -P. 35.
19. Жаров В.П., Коваленко H.A., Фельдман Н.Б., Ермилов С.А., Астахов Д.В., Луценко С.В., Северин С.Е., Северин Е.С. Изучение влияния фотоиммунизации на рост опухоли (в экспериментах на животных). И Материалы Российской научно-технической конференции "Медико-технические технологии на страже здоровья", Россия, Геленджик. - 1999.-С, 144-145.
20. Петров Р.В., Сотниченко А.И., Посыпанова Г.А., Москалева ЕЛО., Фельдман Н.Б., Григорьев М.И., Северин Е.С, Северин С.Е. Разработка конструкций для направленной доставки противолейкемических средств с помощью а-фетопротенна человека. II Новости науки и техники, серия "Медицина" (Аллергия, астма и клиническая иммунология). - 1999. - С. 10-11.
21. Lutsenko S.V., Oukasova N.V., Kiselev S.V., Severine M.E., Feldman N.B., Severin S.E. The cytotoxic effect of the alpha-fetoprotein-doxorubicin conjugate on human embrionic umbilical vein endothelial cells and tumor cells MCF-7. II Tumor Biology. - 1999. - Vol. 20 (S2). - P. 67.
22. Lutienko S.V., Feldman N.B., Finakova O.V., Oukasova N.V., Petukhov S P., Posypanova O.A., Skryabin K.O., Severin S.E. Study of antitumor activity of alpha-fetoprotein and epidermal growth factor conjugates in vitro and in vivo. // Tumor Biology. - 2000. - Vol 21 (6).-P. 367-374,
23. Туманов С.Г., Гукасова H.B., Родина A.B., Фельдман H.H., Луценко СВ., Северин С.Е. Цитотоксическая активность, накопление и внутриклеточное распределение доксорубицинп и его коныогата с эпидерм альным фактором роста в чувствительных н резистентных к доксорубнцнну опухолевых клетках. // Вопросы биологической, медицинской н фармацевтической химии. - 2000. - Ш. - С. 17-22.
24. Савицкий A.A., Гукасова Н.В., Туманов С.Г., Фельдман И,Б., Лукьянец Е.А., Миронов А.Ф., Якубовская Р.И., Луценко С.В., Северин С.Е. Цитотоксическое действие коньюгатов альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста с фотогемом, хлоринами н фталоцианинами. // Биохимия. - 2000. - Т. 65 (6). - С. 859-864,
25. Фельдман Н.Б., Киселев С.М., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Луценко С.В., Северин С.Е. Противоопухолевая активность коныогата а-фетопротеина с доксорубицииом in vitro и in vivo. II Биохимия. - 2000. - Т. 65 (8). - С. 1140-1145.
26. Сотниченко А.И., Заболотнев Д.В., Фельдман Н.Б., Северин С.Е., Северин Е.С., Петров Р. В. Разработка конструкций для направленной доставки противоопухолевых препаратов с помощью а-фетопротеина человека. И Материалы докладов III съезда иммунологов и аллергологов СНГ, Дагомыс, Россия. - 2000. - С. 16.
27. Луценко С.В., Фельдман Н.Б., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Киселев С.М., Северин С.Е. Повышение терапевтической эффективности доксорубицина при его адресном транспорте к опухоли-мишени с помощью альфа-фетопротеина. // Биомедицинские технологии. - 2000, - № 13. - С. 27-31.
28. Savitsky А.А., Gukasova N.V., Gumanov S.G., Feldman N.B., Luk'yanets E.A., Mironov A.F., Yakubovskaya R.I., Lutsenko S.V., Severin S.E. Cytotoxic action of conjugates of a-fetoprotein and epidermal growth factor with photoheme, chlorines, and phthalocyanines. // Biochemistry (Moscow). - 2000, - Vol, 65 (6). - P, 732-736.
29. Feldman N.B., Kiselev S.M., Gukasova N.V., Posypanova G.A,, Lutsenko S.V., Severin S.E. Antitumor activity of a-fetoprotein conjugate with doxorubicin in vitro and in vivo. // Biochemistry (Moscow). - 2000. - Vol. 65 (8). - P. 967-971.
30. Луценко C.B., Киселев C.M., Гукасова H.B., Посыпанова Г.А., Фельдман Н.Б., Северин С.Е. Эпидермальный фактор роста и его рецептор-связывающий фрагмент как векторы для направленной доставки доксорубицина в опухолевые клетки. // Биомедицииские технологии, - 2000, - № 13. - С. 23-27.
31. Сотниченко А.И., Заболотнев Д.В., Фельдман Н.Б., Северин С.Е., Северин Е.С., Петров Р.В. Разработка конструкции для направленной доставки противоопухолевых препаратов с помощью а-фетопротеина человека. // Материалы отчетной конференции по Межведомственной научно-технической программе «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего», Москва, Россия. - Аллергология и иммунология. - 2000. - Т. 1. - Ж). - С. 106.
32. Фельдман Н.Б., Киселев С.М., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Хомяков Ю.Н., Луценко С.В., Северин С.Е. Цитотоксическая и противоопухолевая активность конмогата а-фетопротеина с доксорубицином. II Материалы VII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, Россия. - 2000. - С. 556.
33. Туманов С.Г., Родииа А.В., Фельдман 11.13., Луценко С.В., Северин С.Е. Цитотоксическая активность, накопление и внутриклеточное распределение доксорубицина и его коныогата с эпидермальным фактором роста. // Материалы VII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2000, с. 401.
34. Луценко С.В., Фельдман Н.Б., Гукасова Н.В., Посыпанова Г,А., Киселев С.М., Северии С,И. Использование белковых векторов для направленного транспорта доксорубицина п опухолевые клетки-мишени. // Материалы VII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, Россия. - 2000. - С. 518.
35. Kiselev S.M., Gukasova N.V., Feldman N.B., Lutsenko S.V., Severin S.E. The use of protein vector a-fetoprotein (AFP) for targeted delivery of doxorubicin (DR) to endothelial end cancerous human cells. II Abstracts of 17"' Meeting of the International Academy of Tumour Marker Oncology, I-long Kong. - Journal of Tumor Marker Oncology. - 2000. - Vol. 15(1). - P. 37.
36. Луценко C.B., Фельдман И.Б., Туманов С,Г., Родииа А.В., Северин С.Е. Цитотоксическая активность, накопление и внутриклеточное распределение антрациклиновых антибиотиков и их коныогато» с ЭФР в чувствительных и резистентных клетках MCF-7. Н Биохимия. - 2000. - Т. 65 (11). - С. IS38-1545.
37. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Gumanov S.G., Gukasova N.V., Severin S.E. Overcoming of vincristine resistance by conjugation with epidermal growth factor. // Abstracts of 28"' meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Munich, Germany. - 2000. - P. 136.
38. Kiselev S.M., Gukasova N.V., Feldman N.B., Lutsenko S.V., Severin S.E. Cytotoxic activity of the conjugate of the epidermal growth factor with doxorubicin against human cells, II Abstracts of 28"' meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Munich, Germany. - 2000. - P. 137.
39. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Gumanov S G., Rodina A.V., Severin S.E. Cytotoxic activity, accumulation, and intracellular distribution of anthrocycline antibiotics and their conjugates with the epidermal growth factor in sensitive and resistant MCF-7 cells. // Biochemistry (Moscow). - 2000. - Vol. 65 (U). - P. 1299-1304.
40. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Туманов С.Г., Родина A.B., Северин С.Е. Цмтотоксическая активность, накопление и внутриклеточное распределение коньюгата карминомнцина с эпидермальным фактором роста. // Биологические мембраны. - 2001. -Т. 18. - Лг 2. - С. 125-130.
41. Feldman N.B., Lutsenko S.V., Belousova Yu.V., Voronin M.V., Severin S.E. Cytotoxic activity of conjugates of the doxorubicin with EOF and its receptor-binding fragment. // Abstract of 3 Central European Conference on Human Tumor Markers (CECHTUMA), Karlovy Vary, Czech Republic. - Biomarkers and Environment. - 2001. - Vol. 4 (1,2). - P. 50.
42. Сотииченко А.И., Северин C.E., Фельдман Н.Б., Заболотнев Д.В., Северин Е.С., Петров Р.В. Изучение противоопухолевой активности водорастворимого комплекса 2,3,7,8-тетрахлордибензо-^диоксина (ТХДЦ) с а-фетопротеином человека in vivo. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - 2001. ~ №1. - С. 8-11.
43. Луценко С.В., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Ажаев A.B., Ажаева Е.В., Фельдман Н.Б., Северин С.Е. Увеличение цитотоксической активности доксорубниина при его транспорте в опухолевые клетки с помощью белковых векторов. // Российский онкологический журнал. - 2001. - №3. - С. 33-37.
44. Feldman N.B., Lutsenko S.V., Severin S.E. The epidermal growth factor is a promising vehicle for drug delivery to tumor cells. // Abstracts of 18"' International conference on human tumor markers, Riga, Latvia. - 2001. - P. 75.
45. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Kiselev S.M., Severin S.E. Antiangiogenic and antitumor effects of AFP and EOF conjugates with doxorubicin. // Abstracts of 18"' International conference on human tumor markers, Riga, Latvia. - 2001. - P. 82,
46. Lutsenko S.V., Feldman NB, Gukasova N.V., Severin S.E. The epidermal growth factor is a promising vehicle for drug delivery to tumor cells. // Abstracts of Asian-Pacific conference of tumor biology (APCTB 2001), Beijing, China. - 2001. - P. 23,
47. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Kiselev S.M., Severin S.E. Combined therapy of solid murine melanoma B16 tumors with the AFP-DR eoiyugate and ongiostann. // Abstracts of 29* meeting of the ISOBM, Barcelona, Spain-2001-P. 155.
48. Луценко C.B,, Фельдман H.B., Гумпио» С,Г., Северин С.Е. Молекулярные механизмы противоопухолевой активности антибиотиков, антрацнклнпоаого ряда I/ Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии - 2001, - Н«2. - С 3-9
49. Severin S.E,, Feldman N.B,, Lutsenko S.V. Cytotoxic and antitumor activities of doxorubicin conjugates with the epidermal growth factor and its receptor-binding fragment, // Abstracts of З" international symposium on genetic anticancer agents, Amsterdam, The Netherlands, -2002. - P. 130.
50. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Glukhov А.1., Severin S.E. Cytotoxic activity of doxorubicin conjugated with the epidermal growth factor. Abstracts of 17* International Symposium of the European Association for Cancer Research, Granada, Spain. - 2002. - P, 154.
51. Sladkova L.V., Moskaleva E.Yu., Posypanova O.A., Feldman N.B., Severin S.E, Induction or a poptos is and regulation of BCL-2 and BCL XL expression in various human tumor В-cell lines. // Abstracts of 17* International Symposium of the European Association for Cancer Research, Granada, Spain. - 2002. - P. 90.
52. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Severin S.E. Cytotoxic and antitumor activities of doxorubicin conjugates with the epidermal growth factor and its receptor-binding fragment. U Journal of Drug Targeting.- 2002,-Vol. 10(7).- P. 567-571.
53. Lutsenko S.V., Kiselev S.M., Feldman N.B., Zabolotnev D.V., Severin S.E. Modified forms of the EGF receptor-binding fragment as an efficient vehicle for targeted drug delivery to tumor cells. // Abstracts of 30"1 meeting of the ISOBM, Boston, USA. - 2002. ~ P. 68.
54. Фельдман Н.Б., Посыпанова ГЛ., Гельперина С.Э., Скидан И.Н., Хомяков Ю.Н., Луценко С.В., Северин С.Е, Адресная доставка биологически активных соединений в опухолевые клетки с помощью белковых и пептидных векторов, // Вестник НИИ молекулярной медицины. - 2002. - №2. - С. 38-54.
55. Луценко С.В., Захарова И.В., Кузина Н.В., Фельдман Н.Б., Северин С.Е, Комбинированная терапия опухолей с применением коньюгата альфа-фетопротеииа с доксорубицином и ангиостатина, II Материалы X Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, Россия. - 2003. - С. 629.
56. Луценко С.В., Заболотнев Д.В., Фаттахова Г.В., Фельдман Н.Б., Северин С.Е. Противоопухолевые препараты направленного действия на основе пептидных векторов. Н Материалы X Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, Россия, - 2003. - С. 628-629.
57. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Severin S.E. Influence of a type of a chemical bond on cytotoxic and antitumor activities of EGF-doxorubicin conjugates. // Abstracts of the 14"' International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, France. - 2003. - P. 62.
58. Feldman N„ Lutsenko S„ Severin S. The use of the alpha-fetoprotein-doxorubicin conjugate and angiostatin in combined therapy of tumors. // 37"'Annual Scientific Meeting of European Society for Clinical Investigation (ESCI), Verona, Italy. - 2003. - P. 17.
59. Луценко C.B., Заболотнев Д.В., Фельдман И.Б., Северин С.Е., Катлинский А.В., Северин Е.С., Пальцев М.А. Новые подходы к противоопухолевой терапии: применение препаратов направленного действия и антиангиогенных агентов. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, - 2003, - №2. - С. 19-24.
60. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Severin S.E. Antitumor activity of doxorubicin conjugates with the epidermal growth factor and its receptor-binding fragment against murine melanoma. // Abstracts of 9th World Congress on Cancers of the Skin, Sevilla (Spain). - 2003. - P. 45.
61. Feldman N.B., Lutsenko S.V., Severin S.E. Therapy of solid murine melanoma B16 tumors with the AFP-DR conjugate and angiostatin. // Abstracts of 9th World Congress on Cancers of the Skin, Sevilla (Spain), 2003. - P. 46.
62. Луценко C.B., Гукасова H.B., Фельдман Н.Б., Северии С.Е. Особенности создания лекарственных средств на основе белковых и пептидных векторов. II Вестник НИИ молекулярной медицины, - 2003. - Ш. - С. 45-57.
63. Фельдман Н.Б., Аль-Назваии Н„ Дигтярь А.В., Захарова И.В., Киселев С.М., Луценко С.В., Северин С.Е, Избирательна* доставка химиопреппратов в опухолевые клетки с помощью пептидных векторов. II Материалы XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, Россия, - 2004, - С, 378-379.
64. Луценко С.В., Аль-Иазваии И., Захарова И.В., Фельдман Н.Б., Макаров В.А., Северин С.Е. Рецептор а-фетопротеина - мишень для векторной доставки антибиотиков в опухолевые клетки. // Материалы XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, Россия. - 2004. - С. 232,
65. Аль-Названи В., Фельдман Н.Б., Дигтярь А.В., Макаров В.А., Гороховец Н.В., Фаттахова Г.В., Захарова И.В., Киселев С.М., Луценко С.В., Северин С.Е. Сравнительное исследование возможностей использования белковых векторов н составе противоопухолевых препаратов, // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2004. - №3. - С, 6-10.
66. Москалева Е.Ю., Ницветов М.Б., Фельдман Н.Б., Кулаков В.И., Сологуб В.К., Коромыслова И.А., Караулов А.В., Северин С.Е,, Северин B.C. Рецептор АФП в опухолях - иммунохимическое выявление и исследование фармакокннстики АФП, меченного иодом-125. // Материалы Объединенного иммунологического форума, Екатеринбург, Россия. - 2004. - Russian J. Immunol. - Vol. 3(1). - P. 91.
67. Lutsenko S„ Feldman N., Severin S. The cytotoxic activity of doxorubicin conjugates targeted to the EOF reccptor. II Abstracts of Зг"1 meeting of the ISOBM, Helsinki, Finland. - 2004. -P. 91.
68. Feldman N.B., Al-Nazwani N., Gorokhovetz N.V., Makarov V.A., Zakhnrova I.V., Digtyar A.V., Lutsenko S.V., Severin S.E. Doxorubicin conjugates targeted to the EOF receptor. II
Abstracts of IS"1 Meeting of the European Association for Cancer Research, Innsbruck, Austria.-2004.-P. 31.
69. Луценко C.B., Киселев C.M., Аль-Названи H„ Дигтярь A.B., Фельдман Н.Б., Северин С.Е. Получение протеолитических фрагментов плазминогсна, проявляющих антиаигиогениую активность. H Материалы 1-й международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, Россия. - 2004. - С. 115-116.
70. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Severin S.E. The use of modified forms of the EGF receptor binding fragment for targeted drug delivery to cancer cells. // Abstracts of the World Conference on Dosing of Antiinfectives, Nürnberg, Germany. - 2004. - P. A126.
71. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Северин С.Е. Перспективы противоопухолевой антиангиогеиной терапии. // Молекулярная медицина. - 2004. - №4. - С. 13-24.
72. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Северин С.Е, Молекулярные механизмы межклеточной коммуникации. // Введение в молекулярную медицину / Под ред. М.А.Папьцева. - М. -ОАО «Издательство «Медицина». - 2004. - С. 338-413.
73. Луценко C.B., Киселев С.М., Фельдман Н.Б., Северин С.Е. Молекулярные механизмы ангиогенеза в физиологических и патологических процессах. // Введение в молекулярную медицину / Под ред. М.А.Пальцева, - М. - ОАО «Издательство «Медицина». - 2004. - С. 446-496.
74. Луценко C.B., Аль-Названи Н,, Фельдман Н.Б., Катлинский A.B., Северии С.Е., Северин Е.С., Пальцев М.А. Противоопухолевые препараты направленного действия на основе пептидных векторов. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2005. - №1. - С. 13-18.
75. Луценко C.B., Каплун А.П., Красильниковя В.В., Дигтярь A.B., Захарова И.В., Фельдман Н.Б., Швец В,И,, Северин С.Е. Липосомная формя аигиостатина и ее применение для лечения онкологических заболеваний. // Материалы XII Российского национального конгресса «Человек и Лекарство», Москва, Россия. - 2005. - С. 678.
76. Дигтярь A.B., Посыпанова Г.А., Попова О.И, Макаров В.А., Фельдман И.Б., Луценко С,В., Швец В.И. Исследование возможности применения пептидных векторов для адресной доставки биологически активных соединений в опухолевые клетки эпителиального происхождения. II Материалы XII Российского национального конгресса «Человек и Лекарст во», Москва, Россия. - 2005. - С. 658.
77. Дигтярь A.B., Киселев СМ., Луценко Е.В., Захарова И.В., Фельдман 11В., Луценко C.B., Северии С.Е. Лига иды рецептора эпидерм алыюго фактора poeta в составе противоопухолевых препаратов направленного действия. II Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущине, Россия. » 2005. -С. 5-8.
78. Дигтярь A.B., Луценко ЕВ,, Фельдман U li,, Киселе» СМ., Грмцкова И,А., Луценко СВ., Северин С.Е. Антиангногенная терапия с использованием нанотехналогнП // Материалы II Международной конференции «Молекулярная Медицина н Биобезопасность», Москва, Россия. - 2005. - С, 119-120.
79. Киселев С.М., Дштярь A.B., Луценко Е.В„ Фельдман Ш>„ Луценко C.B., Северин С.Е. Новые противоопухолевые биопрепараты, сочетающие цитотоксические и а нтиангио генные свойства. II Материалы II Международной конференции «Молекулярная Медицина и Б небезопасность», Москва, Россия. - 2005. - С. 155.
80. Дигтярь A.B., Киселёв СМ., Макаров В.А., Луценко Е.В., Попова 0,1-1., Фельдман М Б., Посыпанова Г.А., Луценко C.B., Северин С.Е. Фрагменты рецепторсвязмвающи.ч участков ЭФР и ТФР-а человека - эффективные векторы для создания противоопухолевых препаратов с избирательным действием. II Вестник НИИ молекулярной медицины M MA им. ИМ Сеченова. - 2005. - К»5.-С. 51-61.
81. Дигтярь A.B., Луценко Е В., Киселев С.М., Фельдман Н.Б, Луценко C.B., Северии С.Е. Повышение терапевтической эффективности аигиостатина путем коныогнровання с противоопухолеаым антибиотиком, // Материалы заочной международной конференции «Приоритеты фармацевтической науки и практики», - 2006. - С. 343-345.
82. Калинина Е.С., Позднякова Н.В., Корженевский Д.А., Фельдман Н.Б., Луценко С.В., Швец В.И. Выделение и изучение биологических свойств рскомбинантного человеческого эндостатина. // Вестник МИТХТ, - 2006. - №1. - С. 23-26.
83. Lutsenko S.V., Feldman N.B., PozdnyakovaN.V., Digtyar A.V., Lutsenko E.V., Kaplun A.P., Severin S.E., Shvets V.l. Inhibition of melanoma B16 growth in mice by liposomal forms of angiostatin and endostatin. // Abstracts of 19th Meeting of the European Association for Cancer Research, Budapest, Hungary. - 2006. - P. 176.
84. Feldman N.B., Digtyar A.V., Lutsenko S.V., Severin S.E. New EGF- and TGFa-derived small peptide carriers for targeted delivery of antitumor drugs to human prostate carcinoma cells. // Abstracts of 19th Meeting of the European Association for Cancer Research, Budapest, Hungary. - 2006. - P. 75.
85. Фельдман Н.Б., Позднякова H.B., Николаенко T.B., Дигтярь A.B., Кривошеева О.С., Луценко Е.В., Грицкова И.А., Луценко С,В., Северин С.Е., Швец В.И. Полимерные мицеллы на основе поли-Ы-винилпирролидона как эффективные средства доставки противоопухолевых антиангиогенных препаратов. // Молекулярная медицина. - 2006. -№4. - С. 33-37.
Патенты, оформленные по материалам диссертации
86. Лужков Ю.М., Москалева ЕЛО,, Накашьян Р., Посыпанова Г.А., Родина A.B., Северин С.Е., Фельдман Н.Б., Фииакова Г.В., Шмырев И.И. Коньюгаты биологически активных веществ с альфа-фетопротеином, обладающие избирательным действием по отношению к раковым опухолям, способ их получения (варианты) и фармацевтическая композиция на их основе. Патент РФ №2071351 от 23.07.1996.
87. Киселев С.М., Луценко C.B., Северин Е.С., Северин С.Е., Фельдман Н.Б. Полипептид, являющийся аналогом рецепторсвязывающего фрагмента эпидермального фактора роста с 21 по 31 аминокислоту, его коныогат с доксорубицином и фармацевтическая ком позиция на его основе. Патент РФ №2196604 от 21.12.2001.
88. Гороховец Н.В., Дигтярь A.B., Корженевский Д.А., Луценко Е.В., Луценко C.B., Макаров В.А., Позднякова Н.В., Северин Е.С., Северин С.Е., Соловьев А.И., Фельдман Н.Б. Препарат человеческого эндостатина и способ его получения. Патент РФ №2278688 от 2.12.2004.
89. Захарова И.В., Киселев С.М., Луценко Е.В., Луценко C.B., Макаров В.А., Северин B.C., Северин С.Е., Фельдман Н.Б. Векторный полипептид - аналог фрагмента трансформирующего фактора роста альфа (ТФРа), его противоопухолевый коныогат н фармацевтическая композиция на основе коньюгата. Патент РФ №2277930 от 2.12.2004.
90. Быков В.А., Безруков Д.А., Дигтярь A.B., Каплун А.П., Красилышкова В.В., Луценко Е.В., Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Швец В.И. Ингибитор апгиогенеза, аптиангногенная фармацевтическая композиция на его основе и способ лечения злокачественных новообразований. Потеет РФ №2287341 от 1.03,2005.
91. Гороховец И.В., Дигтярь A.B., Луценко Е.В., Луценко C.B., Макаров В.А., Посыпанова Г.А., Северин Е.С., Северин С.Е., Фельдман Н.Б. Противоопухолевый пептидный препарат на основе фрагмента альфа-фетопротеипа, его коныогат, фармацевтическая композиция и способ лечения гормоизависимых опухолей. Патент РФ №2285537 от 5.04.2005.
Принято к исполнению 21/03/2007 Исполнено 22/03/2007
Заказ №211 Тираж: 100 эка
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 >ууу\у,aWQreferat.ro
2007120429
2007120429
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Фельдман, Наталия Борисовна
Введение.
Список сокращений.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Химиотерапия онкологических заболеваний и препятствия на пути ее эффективного применения.
1.1.1. Концепции лекарственной устойчивости опухолей.
1.1.2. Устойчивость опухолей различных классов к химиотерапии.
1.1.3. Основные классы противоопухолевых веществ, их структура и механизмы цитотоксического действия.
1.1.4. Показания к применению и методы введения химиопрепаратов.
1.1.5. Факторы, препятствующие эффективному проведению химиотерапии.
1.1.6. Влияние множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток на эффективность действия химиопрепаратов.
1.1.7. Гены и белки, участвующие в проявлении феномена МЛУ.
1.1.8. Диагностика МЛУ.
1.1.9. Накопление и внутриклеточное распределение химиотерапевтических препаратов в резистентных клетках.
1.1.10. Значение МЛУ для лечения онкологических заболеваний.
1.2. Стратегии создания систем для направленной доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам.
1.2.1. Преимущества и недостатки использования СНД.
1.2.2. Ковалентное связывание.
1.2.3. Нековалентное связывание.
1.2.4. Критические параметры для использования СНД.
1.2.5. Внутриклеточный транспорт химиопрепарата, ковалентно связанного с вектором.
1.3. Опухолевый ангиогенез как мишень для терапии.
1.3.1. Роль ангиогенеза в процессах опухолевого роста.
1.3.2. Механизм каскадной передачи регуляторных сигналов в эндотелиальных клетках.
1.3.2.1. Роль рецепторов клеточной поверхности эндотелиоцитов в передаче митогенных сигналов.
1.3.2.2. Механизмы передачи сигналов выживания эндотелиальных клеток.
1.3.2.3. Механизм проведения регуляторных сигналов, вызывающих миграцию эндотелиальных клеток.
1.3.2.4. Передача сигналов деградации внеклеточного матрикса.
1.3.2.5. Передача сигналов регуляции дифференцировки и морфогенеза.
1.3.3. Достижения и перспективы антиангиогенной терапии.
1.3.3.1. Ингибиторы матриксных металлопротеиназ.
1.3.3.2. Препараты, подавляющие пролиферацию эндотелиальных клеток.
1.3.3.3. Антисмысловые последовательности, кодирующие VEGF.
1.3.3.4. Ингибиторы рецепторных тирозинкиназ.
1.3.3.5. Препараты, влияющие на выживание эндотелиальных клеток.
1.3.3.6. Препараты, блокирующие интегрины.
1.3.3.7. Ингибиторы рецептора эпидермального фактора роста
EGFR).
1.3.3.8. Ингибиторы Са2+-каналов.
1.3.3.9. Ингибиторы циклооксигеназы-2 (СОХ-2).
1.3.3.10. Талидомид.
1.3.3.11. Интерферон-а.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Выделение и очистка ЭФР.
2.2. Выделение и очистка АФП.
2.2.1. Иммобилизация моноклональных антител на сефарозе.
2.2.2. Фракционирование полиэтиленгликолем.
2.2.3. Аффинная хроматография.
2.2.4. Ионообменная хроматография.
2.2.5. Гель-проникающая хроматография.
2.2.6. Электрофорез в полиакриламццном геле.
2.3. Получение рекомбинантного 3-го домена а-фетопротеина человека.
2.4. Синтез пептидов - модифицированных фрагментов ЭФР и ТФРа.
2.5. Получение коньюгатов.
2.5.1. Коньюгаты ФЦ(А1), ФЦ(Со) и ВК с АФП и ЭФР.
2.5.2. Коньюгаты ДР, КМ и ВБ с АФП и ЭФР.
2.5.3. Коньюгаты ДР с векторными пептидами.
2.6. Получение нативного ангиостатина.
2.7. Получение рекомбинантного эндостатина человека.
2.7.1. Конструирование экспрессионного вектора, кодирующего биосинтез рекомбинантного эндостатина человека.
2.7.2. Выбор штамма-продуцента Е. coli.
2.7.3. Получение эндостатина путем экспрессии его гена в штамме
E.coli.
2.7.4. Выделение эндостатина человека из клеток штамма-продуцента E.coli.
2.7.5. Очистка эндостатина человека, не содержащего 6-His.
2.7.6. Очистка эндостатина человека, включающего дополнительную последовательность б-His и сайт расщепления энтерокиназой.
2.8. Получение липосомных форм ангиостатина и эндостатина.
2.9. Культивирование клеток.
2.10. Исследование интернализации пептидов.
2.11. Изучение динамики интернализации ФИТЦ-меченых пептидов в опухолевые клетки.
2.12. Определение цитотоксической активности препаратов in vitro.
2.12.1. ЦТА фталоцианинов и их коньюгатов с векторными белками.
2.12.2. ЦТА ангиостатина, эндостатина, антрациклиновых антибиотиков и растительных алкалоидов и их коньюгатов с векторными пептидами в отношении клеток линий QOS, SKOV3, DU145, А431, MCF-7, В16, НТ1080, АВАЕ, SVEC4-10 и фибробластов человека.
2.12.3. ЦТА ангиостатина и эндостатана в отношении эндотелиальных клеток HUVEC.
2.12.4. Оценка жизнеспособности клеток.
2.13. Исследование накопления и внутриклеточного распределения свободного и входящего в состав коньюгата с ЭФР доксорубицина.
2.14. Исследование противоопухолевой активности препаратов in vivo.
2.14.1. Животные и опухоли.
2.14.2. Дозы препаратов и схемы их введения.
2.14.3. Объем опухолей.
2.14.4. Продолжительность жизни животных.
2.15. Статистическая обработка результатов.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Выделение и очистка эпидермального фактора роста мыши.
3.2. Выделение а-фетопротеина человека.
3.2.1. Аффинная хроматография.
3.2.2. Ионообменная хроматография.
3.2.3. Гель-проникающая хроматография.
3.3. Получение и исследование цитотоксической и противоопухолевой активности препаратов направленного действия на основе АФП и ЭФР in vitro и in vivo.
3.3.1. Цитотоксическая активность препаратов направленного действия на основе АФП и ЭФР in vitro.
3.3.2. Исследование противоопухолевой активности фталоцианинов, антрациклиновых антибиотиков, растительных алкалоидов и включающих их препаратов направленного действия in vivo.
3.4. Сравнительное исследование ЦТА, динамики накопления и внутриклеточного распределения свободного и входящего в состав препарата направленного действия на основе ЭФР доксорубицина.
3.4.1. ЦТА ДР и включающего его препарата на основе ЭФР в отношении чувствительной и резистентной к антрациклиновым антибиотикам клеточной линии карциномы молочной железы MCF-7.
3.4.2. Накопление свободного и входящего в состав препарата направленного действия ДР в чувствительных и резистентных опухолевых клетках.
3.4.3. Накопление свободного и входящего в состав препарата направленного действия ДР в ядрах чувствительных и резистентных опухолевых клеток.
3.5. Создание и исследование противоопухолевого потенциала препаратов направленного действия на основе рецепторсвязывающих пептидных фрагментов АФП, ЭФР и ТФРа.
3.5.1. Получение рекомбинантного 3-го домена а-фетопротеина человека.
3.5.2. Синтез пептидных аналогов рецепторсвязывающих фрагментов ЭФР и ТФРа.
3.5.3. Исследование накопления модифицированных рецепторсвязывающих фрагментов ЭФР и ТФРа человека в опухолевых клетках.
3.5.4. Микроскопические исследования динамики интернализации и внутриклеточного распределения ЭФР и пептидов ЭФРмф и ТФРмф в клетках карциномы предстательной железы человека DU145.
3.5.5. Коньюгирование ДР с векторными пептидами.
3.5.6. Микроскопическое исследование динамики интернализации и внутриклеточного распределения препарата ТФРмф-ДР в раковых клетках. 1^
3.5.7. Исследование ЦТА препаратов направленного действия на основе АФПзд, ЭФР, ЭФРмф и ТФРМф.
3.5.8. Исследование противоопухолевой активности препаратов на основе векторнымх пептидов на мышах с привитыми солидными опухолями.
3.6. Получение и исследование цитотоксической активности антиангиогенных препаратов.
3.6.1. Выделение и очистка ангиостатина.
3.6.2. Получение рекомбинантного эндостатина человека.
3.6.3. Исследование ЦТА ангиостатина и эндостатина in vitro.
3.6.4. Получение липосомных форм ангиостатина и эндостатина.
3.6.5. Сравнительное исследование противоопухолевой активности свободных и липосомных форм ангиостатина и эндостатина на мышах с привитыми солидными опухолями.
3.7. Изучение возможностей совместного применения антиангиогенных препаратов и препаратов направленного действия на основе ДР и векторных пептидов для терапии опухолей.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и антиангиогенных агентов"
Актуальность проблемы
В настоящее время фундаментальной проблемой практической онкологии является высокая токсичность и низкая избирательность действия противоопухолевых препаратов известных классов. Применение систем направленного транспорта с использованием моноклональных антител в качестве векторов не оправдало надежд на их высокую терапевтическую активность. Одним из наиболее перспективных путей решения данной проблемы, а также повышения эффективности действия цитотоксических противоопухолевых химиопрепаратов, является разработка способов их направленной доставки в раковую клетку в составе коньюгатов с векторными полипептидами. Избирательность транспорта при этом достигается за счет способности лиганда (вектора) к высокоаффинному связыванию со специфическими рецепторами, экспрессированными только/или преимущественно на клетках-мишенях. Для практического применения подобные векторы должны отвечать ряду требований, к числу которых относятся доступность в препаративных количествах, стабильность, сохранение высокого сродства к рецептору после химической модификации. В полной мере этим требованиям отвечают эпидермальный фактор роста (ЭФР), аномально высокий уровень экспрессии рецепторов которого отмечается в клетках опухолей эпителиального происхождения, и онкофетальный белок альфа-фетопротеин (АФП), рецепторы которого экспрессируются практически всеми типами раковых клеток, но отсутствуют на клетках нормальных тканей. Поэтому ЭФР и АФП были использованы нами для создания систем направленного действия, предполагающих наличие специфического рецептора и ковалентно связанных векторного белка и модулятора клеточной активности. Подобные системы могут найти применение в различных областях медицины для изучения возможностей направленного влияния на физиологические процессы и повышения эффективности действия известных химиотерапевтических средств при лечении целого ряда заболеваний, включая онкологические. Сравнительное исследование в модельных экспериментах in vitro и in vivo уровня противоопухолевой активности полученных систем направленного действия позволяет оценить возможности их применения в области практической онкологии. Изучение динамики накопления и внутриклеточного распределения химиопрепаратов, доставляемых в клетку в составе систем направленного действия, имеет существенное теоретическое и прикладное значение, поскольку позволяет прояснить механизм их цитотоксического действия и наметить пути повышения его эффективности.
В последние десятилетия значительным достижением в области поиска новых эффективных методов терапии злокачественных новообразований явилось доказательство необходимости процесса ангиогенеза для роста злокачественных солидных опухолей и создание концепции противоопухолевой терапии, основанной на подавлении ангиогенеза. Ангиогенез - процесс роста капилляров из кровеносных сосудов, в результате которого образуются новые сосудистые сети. При этом патологический рост новых сосудов обусловливает прогрессию ряда заболеваний, прежде всего рост и метастазирование злокачественных опухолей. Подавление ангиогенеза ведёт к торможению опухолевого роста и развития метастазов. Среди известных в настоящее время эндогенных ингибиторов ангиогенеза наиболее перспективными являются белки ангиостатин и эндостатин. Однако эти полипептидные ингибиторы ангиогенеза проявляют высокую терапевтическую эффективность преимущественно в высоких дозах (25-100 мг/кг массы тела) и требуют продолжительного курса лечения. В связи с этим особенно актуальной задачей представляется разработка высокотехнологичных методов получения ангиостатина и эндостатина, а также поиск возможностей изменения существующих схем терапии этими полипептидами, в частности, путём применения их липосомных форм.
Следует отметить, что несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы при становлении и развитии антиангиогенной терапии, для полной ремиссии применение только антиангиогенных препаратов часто является недостаточным. Более эффективным подходом представляется комбинированная противоопухолевая химиотерапия, сочетающая в себе препараты с различными механизмами действия. Терапия антиангиогенными полипептидами, разрушающая инфильтрирующие опухоль кровеносные сосуды и уничтожающая раковую клетку опосредованно, могла бы успешно сочетаться с применением высокоэффективных противоопухолевых препаратов, проявляющих в малигнизированных тканях прямое цитотоксическое действие. Очевидно, что комбинированная терапия антиангиогенными агентами и препаратами направленного действия является наиболее перспективным избирательным и эффективным путём воздействия на злокачественные опухоли.
Исходя из этого, актуальной целью данного исследования являлось создание и изучение терапевтического потенциала антиангиогенных полипептидов и препаратов направленного действия в схемах комбинированной противоопухолевой терапии.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
- получить векторные пептиды, способные к избирательному проникновению в клетки злокачественных опухолей путём рецепторопосредованного эндоцитоза;
- осуществить синтез цитотоксических препаратов направленного действия, включающих противоопухолевые химиопрепараты (фталоцианины, хлорины, антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды) и векторные белки (эпидермальный фактор роста и альфа-фетопротеин человека, а также их рецепторсвязывающие фрагменты);
- исследовать свойства, динамику поступления и внутриклеточного распределения полученных препаратов направленного действия и их противоопухолевую активность в системах in vitro и in vivo;
- разработать технологичный метод получения рекомбинантного эндостатина человека;
- получить липосомные формы эндостатина и ангиостатина человека и изучить их противоопухолевую терапевтическую эффективность in vivo в сравнении с нелипосомными формами;
- исследовать in vivo терапевтическую эффективность сочетанного применения антиангиогенных полипептидов и цитотоксических препаратов направленного действия.
Научная новизна работы
Разработаны оптимальные схемы получения эффективных противоопухолевых препаратов направленного действия, включающих фталоцианины, хлорины, антрациклиновые антибиотики, растительные алкалоиды и векторные белки (эпидермальный фактор роста и альфа-фетопротеин человека). Убедительно продемонстрировано, что терапевтическая активность исследуемых препаратов может быть значительно увеличена за счет их избирательного рецепторопосредованного транспорта в опухолевые клетки в составе коньюгатов с векторными полипептидами.
Продемонстрирована возможность значительного снижения лекарственной устойчивости опухолевых клеток к антрациклиновым антибиотикам при использовании препаратов направленного действия. Впервые исследована динамика накопления и внутриклеточное распределение антибиотика антрациклинового ряда доксорубицина, доставляемого в опухолевые клетки в составе препарата направленного действия, включающего эпидермальный фактор роста в качестве вектора. Полученные данные проливают свет на механизм цитотоксического действия полученных препаратов направленного действия и позволяют наметить пути увеличения их противоопухолевой активности.
Впервые получены синтетические пептиды ЭФРмф и ТФРмф, представляющие собой модифицированные рецепторсвязывающие фрагменты соответственно эпидермального фактора роста (ЭФР) и трансформирующего фактора роста а (ТФРа) человека. Показана способность этих пептидов проникать в раковые клетки путём рецепторопосредованного эндоцитоза.
Впервые получены ковалентные коньюгаты пептидов ЭФРмф, ТФРмф и рекомбинантного белка - 3-го домена а-фетопротеина человека (АФПзд) с доксорубицином и продемонстрирована их высокая специфическая цитотоксическая и противоопухолевая активность in vitro и in vivo.
Сконструированы плазмидные векторы Е. coli, позволяющие эффективно осуществлять индуцированный биосинтез рекомбинантного эндостатина человека в клетках штамма-продуцента. Разработан простой и эффективный метод выделения и ренатурации рекомбинантного эндостатина, позволяющий получать биологически активный белок.
Впервые получены липосомные формы ангиостатина и эндостатина человека и продемонстрировано, что противоопухолевая эффективность данных форм in vivo выше, чем соответствующих нелипосомных форм.
Впервые in vivo продемонстрирована более высокая терапевтическая эффективность комбинированного применения антиангиогенных полипептидов и цитотоксических препаратов направленного действия по сравнению с монотералией каждым из данных терапевтических агентов.
Практическая значимость исследования
Разработанные противоопухолевые препараты направленного действия, наряду с оптимизированными методами их получения и тестирования, могут быть использованы для дальнейших исследований в области практической онкологии с перспективой перехода в разряд препаратов, проходящих доклинические испытания.
Применение рецепторсвязывающих фрагментов ЭФР, ТФРа и АФП в качестве молекулярных векторов позволяет, наряду с увеличением стабильности и эффективности действия, достичь значительного снижения стоимости препаратов направленного действия.
Полученные штаммы-продуценты эндостатина человека и разработанные методы очистки и ренатурации этого белка могут быть использованы в области промышленной биотехнологии, а полученный рекомбинантный белок - как для научно-исследовательских работ, так и для его применения в области практической медицины.
Обнаружение более высокого терапевтического потенциала in vivo липосомных форм ангиостатина и эндостатина по сравнению с их свободными формами делает возможным развитие этого направления в области создания новых противоопухолевых средств.
Продемонстрированное преимущество комбинированной терапии опухолей с применением двух классов препаратов с различными механизмами противоопухолевого действия, таких как антиангиогенные полипептиды и цитотоксические препараты направленного действия, представляет большой интерес при поиске эффективных схем противоопухолевой терапии. Полученные результаты расширяют понимание вопроса сочетания разных типов антинеопластических средств при выборе схем лечения онкологических заболеваний и показывают важность продолжения исследований антиангиогенных полипептидов и цитотоксических химиопрепаратов на основе пептидных векторов, специфические рецепторы которых гиперэкспонированы на мембранах злокачественно перерождённых клеток.
На основе разработанных технологий получения рекомбинантного эндостатина человека, препаратов направленного действия, включающих цитотоксические агенты и векторные полипептитды, а также липосомных форм антиангиогенных агентов оформлено 6 патентов на изобретение.
Апробация диссертационной работы
Результаты исследований доложены на конференциях: Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM) (1996, 1999, 2000, 2001, 2002, 2004); 5th European Winter Oncology Conference, France, 1997; the European Cancer Conference ECCO 9, Hamburg, 1997; International Conferences New Anticancer Agents, Athens, 1997; VIII конференции «Новые направления биотехнологии» РАН, Москва, 1997; Meeting of the EACR (1998, 2002, 2004, 2006); 4th European Congress of Pharmaceutical Sciences, Milan, 1998; Российской научно-технической конференции "Медико-технические технологии на страже здоровья", 1999, Геленджик, Россия; III съезде иммунологов и аллергологов СНГ, Дагомыс, 2000; Российском национального конгресса «Человек и лекарство» (2000, 2003, 2004, 2005); 17th Meeting of the International Academy of Tumour Marker Oncology, Hong Kong, 2000; 3rd Central European Conference on Human Tumor Markers, Karlovy Vary, 2001; 18th International conference on human tumor markers, Riga, 2001; Abstracts of Asian-Pacific conference of tumor biology, Beijing, 2001; 3rd international symposium on genetic anticancer agents, Amsterdam, 2002; 14th International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, 2003; 37thAnnual Scientific Meeting of European Society for Clinical Investigation (ESCI), Verona, 2003; 9th World Congress on Cancers of the Skin, Sevilla, 2003; Объединенном иммунологическом форуме, Екатеринбург, 2004; международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва (2004, 2005); the World Conference on Dosing of Antiinfectives, Nurnberg, Germany, 2004; международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2005.
Список сокращений
IC50 - inhibiting concentration, молярная концентрация вещества, вызывающая гибель 50% клеток МТТ - 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид АФП - альфа-фетопротеин
АФПзд - пептидный фрагмент (3-й домен) а-фетопротеина человека
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВБ - винбластин
ВК - винкристин
ДМСО - диметидсульфоксид
ДР - доксорубицин
ДСН - додецилсульфат натрия
ИПТГ - изопропилтио-Р-О-галактопиранозид
КМ - карминомицин
МЛУ - множественная лекарственная устойчивость ОРО - относительный размер опухоли
ОУ ЦТА - относительное увеличение цитотоксической активности ОФ ВЭЖХ - обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография ПААГ - полиакриламидный гель ПСД - показатель соотношения доз ПЭГ - полиэтиленгликоль СНД - система направленного действия
СПЖ - средняя продолжительность жизни экспериментальных животных
ТРО - торможение роста опухоли
ТФРа, TGFa - трансформирующий фактор роста
ТФРмф - модифицированный рецепторсвязывающий фрагмент трансформирующего фактора роста УСПЖ - увеличение средней продолжительности жизни экспериментальных животных
ФДТ - фотодинамическая терапия
ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ФЦ(А1) - фталоцианин алюминия
ФЦ(Со) - фталоцианин кобальта
ЦТА - цитотоксическая активность
ЧСА - человеческий сывороточный альбумин
ЭДК - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид
ЭДТА - этилендиамин тетраацетат
ЭФР, EGF - эпидермальный фактор роста
ЭФРмф - модифицированный рецепторсвязывающий фрагмент эпидермального фактора роста
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Фельдман, Наталия Борисовна
выводы
1. Путем химического синтеза получены препараты направленного действия, включающие химиопрепарата (фталоцианины, хлорины, антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды) и векторные белки (ЭФР и АФП), проявляющие цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека, превышающую активность соответствующих химиопрепаратов.
2. Продемонстрировано преимущественное накопление антрациклинового антибиотика доксорубицина в основных мишенях его цитотоксического действия - ядрах опухолевых клеток - при использовании его в составе препарата направленного действия на основе ЭФР. Показано, что при поступлении доксорубицина в опухолевые клетки в составе коньюгата с ЭФР уровень его содержания в клетках и ядрах, а также распределение между ядром и цитоплазмой практически не зависят от чувствительности клеток к антибиотику. Динамика и уровень накопления свободного доксорубицина определяется уровнем резистентности опухолевых клеток.
3. Продемонстрировано значительное снижение резистентности опухолевых клеток к доксорубицину in vitro при его применении в составе препарата направленного действия на основе ЭФР.
4. Показано, что при поступлении доксорубицина как в чувствительные, так и резистентные к этому антибиотику опухолевые клетки в составе препарата направленного действия уровень его внутриклеточной деградации заметно снижается.
5. В экспериментах in vivo на мышах с привитыми солидными опухолями меланомы В16 продемонстрировано, что терапевтическое применение систем направленного действия, включающих фталоцианины, антрациклины и растительные алкалоиды, приводит к значительному ингибированию опухолевого роста и увеличению продолжительности жизни животных. Применение свободных препаратов в тех же дозах практически не оказывает влияния на эти параметры.
6. Доказана возможность практического использования рецепторопосредованного эндоцитоза в качестве эффективного механизма селективного концентрирования и транспорта в клетку модуляторов клеточной активности и цитотоксических веществ, осуществляемого с помощью ЭФР и АФП.
7. Впервые получены синтетические пептиды - модифицированные фрагменты рецепторсвязывающих участков ЭФР и ТФРа человека - и продемонстрирована их способность к поступлению в клетки опухолей эпителиального и мезенхимального гистогенеза путём рецепторопосредованного эндоцитоза.
8. Получены коньюгаты доксорубицина с ЭФР, ЭФРмф и ТФРМф и продемонстрирована их высокая цитотоксическая активность в отношении клеток раковых опухолей человека различных линий. С помощью флуоресцентной микроскопии продемонстрирована внутриклеточная локализация коньюгатов.
9. Получен коньюгат доксорубицина с рекомбинантным пептидным фрагментом а-фетопротеина человека (3-й домен а-фетопротеина). Установлена специфическая цитотоксическая активность полученного препарата в отношении различных опухолевых клеточных линий.
10. В экспериментах in vivo на мышах с привитыми солидными опухолями продемонстрировано, что терапевтическое применение цитотоксических препаратов направленного действия АФПзд-ДР, ЭФРмф-ДР и ТФРмф-ДР значительно подавляет развитие опухолей и увеличивает среднюю продолжительность жизни животных.
11. Сконструирован плазмидный вектор, позволяющий осуществлять эффективную индуцируемую экспрессию гена эндостатина человека в штамме-продуценте Е. coli BL21(DE3). Разработаны эффективные модифицированные методы выделения и ренатурации рекомбинантного эндостатина человека.
12. Получены липосомные формы ангиостатина и эндостатина человека на основе фосфатидилхолина и холестерина, проявляющие высокую противоопухолевую активность.
13. В экспериментах по терапии опухолей in vivo показано, что совместное введение липосомных форм ангиостатина или эндостатина и свободного доксорубицина является более эффективным, чем применение этих агентов в режиме монотерапии.
14. В экспериментах in vivo продемонстрировано значительное увеличение эффективности противоопухолевого действия антиангиогенных агентов (ангиостатин, эндостатин) и препаратов направленного действия (АФПзд-ДР, ЭФРмф-ДР, ТФРмф-ДР) при их комбинированном применении.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Фельдман, Наталия Борисовна, Москва
1. Abedi Н. and Zachary I. Vascular endothelial growth factor stimulates tyrosine phosphorylation and recruitment to new focal adhesions of focal adhesion kinase and paxillin in endothelial cells // J. Biol. Chem., 1997, v. 272, p. 15442-15451.
2. Aboud-Pirak E., Hurwitz E., Bellot F. et al. Inhibition of human tumor growth in nude mice by a conjugate doxorubicin with monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v. 86, p. 3778-3781.
3. Allen T.M. Long-circulating (sterically stabilized) liposomes for targeted drug delivery // TiPS, 1994, v. 15, p. 215-202.
4. Allen T.M. and Cullis P.R. Drug delivery systems: entering the mainstream // Science, 2004, v. 303(5665), p. 1818-1822.
5. Alt F.W., Kellems R.E., Bertino J.R. and Schimke R.T. Selective multiplication of dihydrofolate reductase genes in methotrexate-resistant variants of cultured murine cells // J. Biol. Chem., 1978, v. 253, p. 1357-1370.
6. Attwell S., Roskelley C. and Dedhar S. The integrin-linked kinase (ILK) suppresses anoikis // Oncogene, 2000, v. 19, p. 3811-3815.
7. Auerbach W. and Auerbach R. Angiogenesis inhibition: a review // Pharmacol. Ther., 1994, v. 63, p. 265-311.
8. Baselga J. and Averbuch S.D. ZD1839 ('Iressa') as an anticancer agent // Drugs, 2000, v. 60(1), p. 33-40.
9. Batra J.K., Jinno Y., Chaudhary V.K. et al. Antitumor activity in mice of an immunotoxin made with anti-transferrin receptor and a recombinant form of pseudomonas exotoxin//Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v. 86, p. 8545-8549.
10. Bayless K.J. and Davis G.E. The Cdc42 and Racl GTPases are required for capillary lumen formation in three-dimensional extracellular matrices // J. Cell Sci., 2002, v. 115, p. 1123-1136.
11. Beck W.T., Danks M.K., Wolverton J.S. et al. Drug resistance associated with altered DNA topoisomerase II // Adv. Enzyme Regul., 1993, v. 33, p. 113-127.
12. Benefield J., Petruzzelli G.J., Fowler S. et al. Regulation of the steps of angiogenesis by human head and neck squamous cell carcinomas // Invasion Metastasis, 1996, v. 16, p. 291-301.
13. Biedler J.L. and Spengler B.A. Metaphase chromosome anomaly association with drug resistance and specific cell products // Science, 1976, v. 191, p. 185-187.
14. Birchmeier C., Birchmeier W., Gherardi E. and Vande Woude G.F. Met, metastasis, motility and more // Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2003, v. 4, p. 915-925.
15. Blagosklonny M.V. Hypoxia-inducible factor: Achilles' heel of antiangiogenic cancer therapy (review) // Int. J. Oncol., 2001, v. 19, p. 257-262.
16. Blezinger P., Wang J., Gondo M., Quezada A, Mehrens D, French M, Singhal A, Sullivan S, Rolland A, Ralston R, Min W (1999) Nature Biotechnol. 17: 343-348.
17. Boehm Т., Folkman J., Browder T. and O'Reilly M.S. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance // Nature, 1997, v. 390, p. 404-407.
18. Boesch D., Gaveriaux C., Jachez B. et al. In vivo circumvention of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance of tumor cells with SDZ PSC 833 // Cancer Res., 1991, v. 51, p. 4226-4233.
19. Bomsel M. and Mostov K. Sorting of plasma membrane proteins in epithelial cells //Curr. Opin. Cell Biol., 1991, v. 3, p. 647-653.
20. Borst P. Genetic mechanisms of drug resistance // Rev. Oncol., 1991, v. 4, p. 87105.
21. Bosmann H.B. Mechanism of cellular drug resistance // Nature, 1971, v. 233, p. 566-569.
22. Bouck N., Stellmach V. and Hsu S.C. How tumors become angiogenic // Adv. Cancer Res., 1996, v. 69, p. 135-174.
23. Brakenhielm E., Cao R. and Cao Y. Suppression of angiogenesis, tumor growth and wound healing by resveratrol, a natural compound in red wine and grapes // FASEB J., 2001, v. 15, p. 1798-1800.
24. Brooks P.C., Stromblad S., Klemke R. et al. Antiintegrin alpha v beta 3 blocks human breast cancer growth and angiogenesis in human skin // J. Clin. Invest., 1995, v. 96, p. 1815-1822.
25. Brown P.D. Clinical studies with matrix metalloproteinase inhibitors // Apmis, 1999, v. 107, p. 174-180.
26. Brown P.D. Matrix metalloproteinase inhibitors // Breast Cancer Res. Treat., 1998, v. 52, p. 125-136.
27. Broxterman H.J., Schuurhuis G.J., Lankelma J. et al. Towards functional screening for multidrug resistant cells in human malignancies // In: Mihich E., ed.
28. Pezcoller Found Symposium, v. 1. Drug Resistance: Mechanisms and Reversal. Roma: John Libbey CIC, 1990, p. 309-319.
29. Camenisch G., Pisabarro M.T., Sherman D. et al. ANGPTL3 stimulates endothelial cell adhesion and migration via integrin alpha v beta 3 and induces blood vessel formation in vivo // J. Biol. Chem., 2002, v. 277, p. 17281-17290.
30. Cao R., Wu H.L., Veitonmaki N. et al. Suppression of angiogenesis and tumor growth by the inhibitor К1-5 generated by plasmin-mediated proteolysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999a, v. 96, p. 5728-5733.
31. Cao Y., Cao R. and Veitonmaki N. Kringle structures and antiangiogenesis // Curr. Med. Chem. Anti-Cancer Agents, 2002, v. 2, p. 667-681.
32. Cao Y., Chen A., An S.S.A. et al. Kringle 5 of plasminogen is a novel inhibitor of endothelial cell growth. // J. Biol. Chem., 1997, v. 272 (36), p. 22924-22928.
33. Cao Y.H. Therapeutic potentials of angiostatin in the treatment of cancer // Haematologica, 1999b, v. 84, p. 643-650.
34. Carmeliet P., Lampugnani M.G., Moons L. et al. Targeted deficiency or cytosolic truncation of the VE-cadherin gene in mice impairs VEGF-mediated endothelial survival and angiogenesis // Cell, 1999, v. 98, p. 147-157.
35. Carter S.K. Some thoughts on resistance to cancer chemotherapy // Cancer Treat. Rev., 1984, v. 11 (S),p. 3-7.
36. Castellino F.J. Biochemistry of human plasminogen // Semin. Thromb. Hemost., 1984, v. 10, p. 18-23.
37. Chan H.S.L., Haddad G., Thorner P.S. et al. P-glycoprotein expression as a predictor of the outcome of therapy for neuroblastoma // N. Engl. J. Med., 1991, v. 325, p. 1608-1614.
38. Chan H.S.L., Thorner P.S., Haddad G. and Ling V. Immunohistochemical detection of P-glycoprotein: prognostic correlation in soft tissue sarcoma of childhood//J. Clin. Oncol., 1990, v. 8, p. 689-704.
39. Chen A.Y., Yu C., Potmesil M. et al. Camptothecin overcomes MDRl-mediated resistance in human KB carcinoma cells. // Cancer Res., 1991, v. 51, p. 60396044.
40. Chen C., Chin J.E., Ueda K. et al. Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the MDRI (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells // Cell, 1986, v. 47, p. 381-389.
41. Chen Y.-N., Mickley L.A., Schwartz A.M. et al. Characterization of adriamycin-resistant human breast cancer cells which display overexpression of a novel resistance-related membrane protein // J. Biol. Chem., 1990, v. 265, p. 1007310080.
42. Cheng N., Brantley D.M., Liu H. et al. Blockade of EphA receptor tyrosine kinase activation inhibits vascular endothelial cell growth factor-induced angiogenesis // Mol. Cancer Res., 2002, v. 1, p. 2-11.
43. Cheng S.Y., Huang H.J., Nagane M. et al. Suppression of glioblastoma angiogenicity and tumorigenicity by inhibition of endogenous expression of vascular endothelial growth factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, p. 8502-8507.
44. Chudy D., Zikzkovsky V.A. A simple and rapid method for the isolation of human alpha-fetoprotein from human cord serum // Neoplasia, 1987, v. 34, p. 491-496.
45. Ciardiello F. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors as anticancer agents // Drugs, 2000, v. 60 (suppl. 1), p. 25-32.
46. Ciardiello F. and Tortora G. A novel approach in the treatment of cancer: targeting the epidermal growth factor receptor // Clin. Cancer Res., 2001, v. 7, p. 29582970.
47. Clark W.H.Jr., Elder D.E., Guerry D. et al. Model predicting survival in stage I melanoma based on tumor progression // J. Natl. Cancer Inst., 1989, v. 81, p. 1893-904.
48. Colavitti R., Pani G., Bedogni B. et al. Reactive oxygen species as downstream mediators of angiogenic signaling by vascular endothelial growth factor receptor-2/KDR // J Biol. Chem., 2002, v. 277, p. 3101-3108.
49. Cole S.P.C., Bhardwaj G., Gerlach J.H. et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line // Science, 1992, v. 258, p. 1650-1654.
50. Connolly J.O., Soga N., Quo X.L. et al. Rac is essential in the transformation of endothelial cells by polyoma middle T // Cell Adhes. Commun., 2000, v. 7, p. 409-422.
51. Cordon-Cardo C., O'Brien J.P., Casals D. et al. Multidrug-resistance (P-glycoprotein) is expressed by endothelial cells at blood-brain barrier sites // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v. 86, p. 695-698.
52. Cormier E.M. and Jordan V.C. Contrasting ability of antiestrogens to inhibit MCF-7 growth stimulated by estradiol or epidermal growth factor II Eur. J. Cancer. Clin. Oncol., 1989, v. 25, p. 57-63.
53. Curiel D.T., Agarwal S., Wagner E. and Gotten M. Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, v. 88, p. 8850-8854.
54. D'Amato R.J., Lougman M.S., Flynn E. and Folkman J. Thalidomide is an inhibitor of angiogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, v. 91, p. 4082-4085.
55. Daniell M.D. and Hill J.S. A history of photodynamic therapy // Australian and New Zealand Journal of Surgery, 1991, v. 61, p. 340-348.
56. Demant E.J.F., Sehested M. and Jensen P.B. A model for computer simulation of P-glycoprotein and transmembrane pH-mediated anthracycline transport in multidrug-resistant tumor cells // Biochim. Biophys. Acta., 1990, v. 1055, p. 117125.
57. Denis L.J. and Verweij J. Matrix metalloproteinase inhibitors: present achievements and future prospects // Invest. New Drugs, 1997, v. 15, p. 175-185.
58. Deregibus M.C., Buttiglieri S., Russo S. et al. CD40-dependent activation of phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway mediates endothelial cell survival and in vitro angiogenesis Hi. Biol. Chem., 2003, v. 278, p. 18008-18014.
59. Dhanabal M., Ramchandran R., Volk R. et al. Endostatin: Yeast production, mutants, and antitumor effect in renal cell carcinoma // Cancer Res., 1999a, v. 59, p. 189-197.
60. Dhanabal M., Ramchandran R., Waterman M.J. et al. Endostatin induces endothelial cell apoptosis//J. Biol. Chem., 1999b, v. 274, p. 11721-11726.
61. Dhanabal M., Volk R., Ramchandran R. et al. Cloning, expression, and in vitro activity of human endostatin. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999c, v. 258, p. 345-352.
62. Dixelius J., Cross M., Matsumoto T. et al. Endostatin regulates endothelial cell adhesion and cytoskeletal organization // Cancer Res., 2002, v. 62, p. 1944-1947.
63. Dong Z., Kumar R., Yang X. and Fidler I.G. Macrophage-derived metalloelastase is responsible for the generation of angiostatin in Lewis lung carcinoma // Cell, 1997, v. 88, p. 801-810.
64. Donnini S. and Ziche M. Constitutive and inducible nitric oxide synthase: role in angiogenesis // Antioxid. Redox Signal, 2002, v. 4, p. 817-823.
65. Drummond D.C., Meyer O., Hong K. et al. Optimising liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors // Pharmacol. Rev., 1999, v. 51, p. 691743.
66. Dumler I., Kopmann A., Weis A. et al. Urokinase activates the Jak/Stat signal transduction pathway in human vascular endothelial cells // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 1999, v. 19, p. 290-297.
67. Dunn W.A. and Hubbard A.L. Receptor-mediated endocytosis of epidermal growth factor by hepatocytes in the perfused rat liver: Ligand and receptor dynamics. //J. Cell. Biol., 1984, v. 98,p. 2148-2159.
68. Eliceiri B.P. and Cheresh D.A. The role of alphav integrins during angiogenesis: insights into potential mechanisms of action and clinical development // J. Clin. Invest., 1999, v. 103, p. 1227-1230.
69. Eliceiri B.P., Paul R., Schwartzberg P.L. et al. Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability // Mol. Cell, 1999, v. 4, p. 915-924.
70. Eriksson K., Magnusson P., Dixelius J. et al. Angiostatin and endostatin inhibit endothelial cell migration in response to FGF and VEGF without interfering with specific intracellular signal transduction pathways // FEBS Lett., 2003, v. 536, p. 19-24.
71. Ezekowitz R.A., Mulliken J.B. and Folkman J. Interferon alfa-2a therapy for life-threatening hemangiomas of infancy // N. Engl. J. Med., 1992, v. 326, p. 1456— 1463.
72. Falardeau P., Champagne P., Poyet P. et al. Neovastat a naturally occurring multifunctional antiangiogenic drug in phase III clinical trials // Semin. Oncol., 2001, v. 28, p. 620-625.
73. Falcone D.J., Khan K.M., Layne T. and Fernandes L. Macrophage formation of angiostatin during inflammation. A byproduct of the activation of plasminogen // J. Biol. Chem., 1998, v. 273(47), p. 31480-31485.
74. Fallowfield M.E. and Cook M.G. The vascularity of primary cutaneous melanoma // J. Pathol., 1991, v. 164(3), p. 241-244.
75. Fearon E.R., and Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis // Cell, 1990, v. 61, p. 759-767.
76. Felbor U., Dreier L., Bryant R.A. et al. Secreted cathepsin L generates endostatin from collagen XVIII // EMBO J., 2000, v. 19(6), p. 1187-1194.
77. Ferreras M., Felbor U., Lenhard T. et al. Generation and degradation of human endostatin proteins by various proteinases // FEBS Lett., 2000, v. 486, p. 247-251.
78. Fisher E.A. In: affinity chromatography and related techniques. Gribnau T.C.J. Visser J., Nivard R.J.F. (Eds) Elsevier, Amesterdam, 1982, poster A15.
79. FitzGerald D.J., Willingham M.C., Cardarelli C.O. et al. A monoclonal antibody-Pseudomonas toxin conjugate that specifically killes multidrug-resistant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, v. 84, p. 4288-4292.
80. Folkman J. and Ingber D.E. Heparin: Chemical and Biological Properties. Clinical Applications (Lane, Lindahl, eds.) // Boca Raton, Florida, CRC Press, 1989, p. 317-333.
81. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other desease // Nature Med., 1995, v. 1, p. 27-31.
82. Folkman J. Antiangiogenesis. In: Biologic Therapy of Cancer. DeVita V.T. Jr., Hellman S., Rosenberg S.A., eds. Philadelphia: Lippincott//1991, p. 743-753.
83. Folkman J. Antiangiogenesis: new concept for therapy of solid tumours // Ann. Surg., 1972, v. 175, p.409-416.
84. Folkman J. Successful treatment of an angiogenic disease // N. Engl. J. Med., 1989, v. 320, p. 1211-1212.
85. Folkman J. The intestine as an organ culture. In: Carcinoma of the Colon and Antecedent Epithelium. Burdette W.J., editor. Springfield, Illinois: CC Thomas // 1970, p. 113-127.
86. Folkman J. The vascularization of tumors // Sci. Am., 1976, v. 234, p. 58-73.
87. Folkman J., Cole P. and Zimmerman S. Tumor behavior in isolated perfused organs: in vitro growth and metastases of biopsy material in rabbit thyroid and canine intestinal segment // Ann. Surg., 1966, v. 164, p. 491-502.
88. Folkman J., Haudenschild C.C. and Zetter B.R. Long-term culture of capillary endothelial cells //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, v. 76, p. 5217-5221.
89. Folkman J., Long D.M. and Becker F.F. Growth and metastasis of tumor in organ culture //. Cancer, 1963, v. 16, p. 453-467.
90. Folkman J., Merler E., Abemathy C. and Williams G. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis // J. Exp. Med., 1971, v. 133, p. 275-288.
91. Ford J.M. and Hait W.N. Pharmacology of drugs that alter multidrug resistance in cancer//Pharmacol Rev., 1990, v. 42, p. 155-199.
92. Fraumeni J.F.Jr., Devesa S.S., Hoover R.N. and Kinlen L.J. Epidemiology of cancer // In: DeVita V.T. Jr., Hellman S., Rosenberg S.A., eds. Cancer. Principles and Practice of Oncology. Vol 1. 4th ed. Philadelphia: Lippincott 1993, p. 150181.
93. French A.R., Sudlow G.P., Wiley H.S. and Lauffenburger D.A. Postendocytic trafficking of epidermal growth factor-receptor complexes is mediated through saturalble and specific endosomal interactions // J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 15749-15755.
94. Gately S. and Kerbel R. Therapeutic potential of selective cycIooxygenase-2 inhibitors in the management of tumor angiogenesis // Prog. Exp. Tumor Res., 2003, v. 37, p. 179-192.
95. Gately S., Twardowski P., Stack M.S. et al. The mechanism of cancer-mediated conversion of plasminogen to the angiogenesis inhibitor angiostatin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 10868-10872.
96. Gerber H.P., Dixit V. and Ferrara N. Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and Al in vascular endothelial cells //J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p. 13313-13316.
97. Gigli M., Rasoanaivo T.W.D., Millot J.-M. et al. Correlation between growth inhibition and intranuclear doxorubicin and 4'-deoxy-4'-iododoxorabicin quantitated in living K562 cells by microspectrofluorometry // Cancer Res., 1989, v. 49, p. 560-564.
98. Gille J., Swerlick R.A. and Caughman S.W. Transforming growth factor alpha-induced transcriptional activation of the vascular permeability factor
99. VPF/VEGF) gene requires AP2-dependent DNA binding and transactivation // EMBO J., 1997, v. 16, p. 750-759.
100. Gimbrone M.A.Jr., Cotran R.S. and Folkman J. Endothelial regeneration and turnover. Studies with human endothelial cell cultures // Series Haematol, 1973, v. 6, p. 453-455.
101. Gingras D., Renaud A., Mousseau N. et al. Matrix proteinase inhibition by AE-941 a multifunctional antiangiogenic compound // Anticancer Res., 2001, v. 21, p. 145-155.
102. Goasguen J.E., Dossot J.-M. and Fardel O. Expression of the multidrug resistance-associated P-glycoprotein (P-170) in 59 cases of de novo acute lymphoblastic leukemia; prognostic implications // Blood, 1993, v. 81, p. 23942398.
103. Goldie J.H. and Coldman A.J. A mathematical model for relating the drug sensitivity of tumors to their spontaneous mutation rate // Cancer Treat. Rep. 1979, v. 63, p. 1727-1733.
104. Goldie J.H. and Coldman A.J. The genetic origin of drug resistance in neoplasms: implications for systemic therapy // Cancer Res, 1984, v. 44, p. 36433653.
105. Goldman C.K., Kim J., Wong W.L. et al. Epidermal growth factor stimulates vascular endothelial growth factor production by human malignant glioma cells: a model of glioblastoma multiforme pathophysiology // Mol. Biol. Cell, 1993, v. 4, p. 121-133.
106. Goldstein L.J., Galski H., Fojo A. et al. Expression of a multidrug resistance gene in human cancers // JNCI, 1989, v. 81, p. 116-124.
107. Gottesman M.M. How cancer cells evade chemotherapy: sixteenth Richard and Hinda Rosenthal Foundation award lecture // Cancer Res., 1993, v. 53, p. 747754.
108. Grant C.E., Valdimarsson G., Hipfner D.R. et al. Overexpression of multidrug resistance-associated protein (MRP) increases resistance to natural product drugs // Cancer Res., 1994, v. 54, p. 357-361.
109. Griscelli F., Li H., Bennaceur-Griscelli A. et al. Angiostatin gene transfer: inhibition of tumor growth in vivo by blockage of endothelial cell proliferation associated with a mitosis arrest // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, v. 95, p. 6367-6372.
110. Grogan T.M., Spier C.M., Salmon S.E. et al. P-glycoprotein expression in human plasma cell myeloma: correlation with prior chemotherapy // Blood, 1993, v. 81, p. 490-495.
111. Gudkov A.V., Zeinick C.R., Kazarov A.R. et al. Isolation of genetic suppressor elements, inducing resistance to topoisomerase II-interactive cytotoxic drugs, from human topoisomerase II cDNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v. 90, p. 3231-3235.
112. Gullino P.M. Angiogenesis and oncogenesis // J. Natl. Cancer Inst. 1978, v. 61, p. 639-643.
113. Hanahan D. and Weinberg R. A. The hallmarks of cancer // Cell, 2000, v. 100, p. 57-70.
114. Harris A.L. DNA repair and resistance to chemotherapy // Cancer Surv., 1985, v. 4, p. 601-624.
115. He H., Venema V.J., Gu X. et al. Vascular endothelial growth factor signals endothelial cell production of nitric oxide and prostacyclin through flk-l/KDR activation of c-Src // J. Biol. Chem., 1999, v. 274, p. 25130-25135.
116. Heidtmann H.H., Nettelbeck D.M., Mingels A. et al. Generation of angiostatin-like fragments from plasminogen by prostate-specific antigen // Br. J. Cancer, 1999, v. 81(8), p. 1269-1273.
117. Hindenburg A.A., Gervasoni J.E. Jr., Krishna S. et al. Intracellular distribution and pharmacokinetics of daunorubicin in anthracycline-sensitive and -resistant HL-60 cells // Cancer Res., 1989, v. 49, p. 4607-4614.
118. Hobson B. and Denekamp J. Endothelial proliferation in tumors and normal tissues: continuous labeling studies // Br. J. Cancer, 1984, v. 49, p. 405-413.
119. Hohenester E., Sasaki Т., Olsen B.R. and Timpl R. Crystal structure of the angiogenesis inhibitor endostatin at 1.5 A resolution // EMBO J., 1998, v. 17, p. 1656-1664.
120. Homolya L., Hollo Z., Germann U.A. et al. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein // J. Biol. Chem., 1993, v. 268, p. 21493-21496.
121. Horio M., Pastan I., Gottesman M.M. and Handler J.S. Transepithelial transport of vinblastine by kidney-derived cell lines. Application of new kinetic model to estimate in situ Km of the pump // Biochim. Biophys. Acta., 1990, v. 1027, p. 116-122.
122. Houghton J.A., Williams L.G., Dodge R.K. et al. Relationship between binding affinity, retention and sensitivity of human rhabdomyosarcoma xenografts to vinca alkaloids // Biochem. Pharmacol., 1987, v. 36, p. 81-88.
123. Im S.A., Gomez-Manzano C., Fueyo J. et al. Antiangiogenesis treatment for gliomas: transfer of antisense-vascular endothelial growth factor inhibits tumor growth in vivo // Cancer Res., 1999, v. 59, p. 895-900.
124. Jackie S., Runquist E.A., Miranda-Brady S. and Havel R.J. Trafficking of the epidermal growth factor receptor and transferrin in three hepatocytic endosomal fractions //Biol. Chem., 1991, v. 266, p. 1396-1402.
125. Jackson D.V., Sethi V.S., Spurr C.L. et al. Pharmacokinetics of vincristine infusion // Cancer Treat. Rep. 1981, v. 65, p. 1043-1048.
126. Jaffe E.A., Nachman R.L., Becker C.G. and Minick C.R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins: identification by morphologic and immunologic criteria // J. Clin. Invest., 1972, v. 52, p. 2745-2756.
127. Jendraschak E. and Sage E.H. Regulation of angiogenesis by SPARC and angiostatin: Implications for tumor cell biology // Semin. Cancer Biol., 1996, v. 7, p. 139-146.
128. Ji W.R., Castellino F.J., Chang Y. et al. Characterization of kringle domains of angiostatin as antagonists of endothelial cell migration, an important process in angiogenesis. // FASEB J., 1998, v. 12, p. 1731-1738.
129. Jones N., Iljin K., Dumont D.J. and Alitalo K. Tie receptors: new modulators of angiogenic and lymphangiogenic responses // Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2001, v. 2, p. 257-267.
130. Juliano R.L. and Ling V. A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants // Biochim. Biophys. Acta., 1976, v. 455, p. 152-162.
131. Kamesaki S., Kamesaki H., Jorgensen T.J. et al. Bcl-2 protein inhibits etoposide-induced apoptosis through its effects on events subsequent to topoisomerase II-induced DNA strand breaks and their repair // Cancer Res., 1993, v. 53, p. 4251-4256.
132. Kanda S., Mochizuki Y, Suematsu T. et al. Sonic hedgehog induces capillary morphogenesis by endothelial cells through phosphoinositide 3-kinase // J. Biol. Chem., 2003, v. 278, p. 8244-8249.
133. Kato Y., Sato H., Ichikawa M. et al. Existence of two pathways for the endocytosis of epidermal growth factor by rat liver: phenylarsine oxide-sensitive and -insensitive pathways // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1992, v. 89(18), p. 85078511.
134. Kawasaki T. and Ashwell G. Carbohydrate structure of glycopeptides isolated from an hepatic membrane-binding protein specific for asialoglycoproteins // J. Biol. Chem., 1976a, v. 251, p. 5292-5299.
135. Kawasaki T. and Ashwell G. Chemical and physical properties of a hepatic membrane protein that specifically binds asialoglycoproteins // J. Biol. Chem., 1976b, v. 251, p. 1296-1302.
136. Kerbel R. and Folkman J. Clinical translation of angiogenesis inhibitors // Nat. Rev. Cancer, 2002, v. 2, p. 727.
137. Kessel D. Photodynamic therapy and neoplastic disease // Oncology Res., 1992, v. 4, p. 219-225.
138. Klagsbrun M., Knighton D. and Folkman J. Tumor angiogenesis activity in cell grown in tissue culture // Cancer Res., 1976, v. 36, p. 110-114.
139. Klint P., Kanda S., Kloog Y. and Claesson-Welsh L. Contribution of Src and Ras pathways in FGF2 induced endothelial cell differentiation // Oncogene, 1999, v. 18, p. 3354-3364.
140. Kohn E.C., Felder C.C., Jacobs W. et al. Structure-function analysis of signal and growth inhibition by carboxyamido-triazole CAI // Cancer Res., 1994, v. 54, p. 935-942.
141. Kohn J. and Wilchek M. A new approach (cyano-transfer) for cyanogen bromide activation of Sepharose at neutral pH, which yields activated resins, free of interfering nitrogen derivatives // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1982, v. 107(3), p. 878-884.
142. Korsmeyer S.J. bcl-2 initiates a new category of oncogenes: regulators of cell death // Blood, 1992, v. 80, p. 879-886.
143. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head bacteriophage T4 // Nature, 1970, v. 227, p. 681-685.
144. Laird A.D., Vajkoczy P., Shawver L.K. et al. SU6668 is a potent antiangiogenic and antitumor agent that induces regression of established tumors // Cancer Res., 2000, v. 60, p. 4152^160.
145. Lampidis T.J., Castello C., Del Giglio A. et al. Relevance of the chemical charge of rhodamine dyes to multiple drug resistance // Biochem. Pharmacol., 1989, v. 38, p. 4267-4271.
146. Lankelma J., Mulder H.S., van Mourik F. et al. Cellular daunomycin fluorescence in multidrug resistant 2780AD cells and its relation to cellular drug localization//Biochim. Biophys. Acta., 1991, v. 1093, p. 147-152.
147. Lanzetti; L., Rybin V., Malabarba M.G. et al. The Eps8 protein coordinates EGF receptor signalling through Ras and trafficking through Rab5 // Nature, 2000, v. 408, p. 374-377.
148. Lawrence T. W. and Zou J. X. Fractionation of rat a-fetoprotein by high performance liquid chromatography // J. Chromatography, 1985a, v. 341, p. 452456.
149. Lawrence T. W. and Zou J. X. Simple purification procedure for rat a-fetoprotein by a combination of Cibacron blue gel affinity chromatography and ion-exchange high performance liquid chromatography // J. Chromatography, 1985b, v. 338, p. 410-416.
150. Lee M.J, Van-Brooklyn J.R., Thangada S. et al. Sphingosine-1-phosphate as a ligand for the G protein-coupled receptor EDG1 // Science, 1998, v. 279, p. 15521555.
151. Linn S.C., Giaccone G., van Kalken C.K. and Pinedo H.M. P-glycoprotein mediated multidrug resistance and its clinical relevance in cancer treatment // Forum, 1992, v. 2, p. 642-657.
152. Linn S.C., van Kalken C.K., van Tellingen 0. et al. A clinical and pharmacological study of multidrug resistance reversal with vinblastine and bepridil // J. Clin. Oncol., 1994, v. 12, p. 812-819.
153. Liu K.X., Kato Y., Terasaki T. et al. Contribution of parenchymal and non-parenchymal liver cells to the clearance of hepatocyte growth factor from the circulation in rats // Pharm. Res., 1995, v. 12(11), p. 1737-1740.
154. Liu L.F., Rowe T.C., Yang L. et al. Cleavage of DNA by mammalian DNA topoisomerase II//J. Biol. Chem., 1983, v. 258(24), p. 15365-70.
155. Lokeshwar B.L., Houston-Clark H.L., Selzer M.G. et al. Potential application of a chemically modified non-antimicrobial tetracycline (CMT-3) against metastatic prostate cancer// Adv. Dent. Res., 1998, v. 12, p. 97-102.
156. Lowe S.W., Ruley H.E., Jacks T. and Housman D.E. p53 dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents // Cell, 1993, v. 74, p. 957-967.
157. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr AX. and Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem., 1951, v. 193, p. 265275.
158. Lucas R., Holmgren L., Garcia I. et al. Multiple forms of angiostatin induce apoptosis in endothelial cells // Blood, 1998, v. 92, p. 4730-4741.
159. Ma C.-H., Zhang Y., Wang X.-Y. et al. Human endostatin gene transfer, either naked or with liposome, has the same inhibitory effect on growth of mouse liver tumor cells in vivo // World J. Gastroenterol., 2004, v. 10 (19), p. 2874-2877.
160. Maekawa H., Oike Y, Kanda S. et al. Ephrin-B2 induces migration of endothelial cells through the phosphatidylinositol-3 kinase pathway and promotes angiogenesis in adult vasculature // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 2003, v. 23, p. 2008-2014.
161. Mane J.-P., Faussat-Suberville A.-M., Zhou D. and Zittoun R. Daunorubicin uptake by leukemic cells: correlations with treatment outcome and MDRI expression// Leukemia, 1993, v. 7, p. 825-831.
162. Mane J.-P., Zittoun R. and Sikic B.I. Multidrug resistance (MDRI) gene expression in adult acute leukemias: correlations with treatment outcome and in vitro drug sensitivity // Blood, 1991, v. 78, p. 586-592.
163. Maruyama K, Takizawa Т., Yuda T. et al. Targetability of novel immunoliposomes modified with amphipathic poly(ethyleneglycol)s conjugated at their distal terminals to monoclonal antibodies // Biochem. Biophys. Acta., 1995, v. 1234, p. 74-80.
164. McVie J.G. Drug disposition and pharmacology // In; Fox BW, Fox M, eds. Antitumor Drug Resistance. Berlin: Springer-Verlag, 1984, p. 39-66.
165. Meijer D.K and Molema G. Targeting of drugs to the liver // Semin. Liver Dis., 1995, v. 15, p. 202-256.
166. Mesri E.A., Kreitman R.J., Fu Y. et al. Heparin-binding transforming growth factor a-pseudomonas exotoxin A // J. Biol. Chem., 1993, v. 268, p. 4853-4862.
167. Miosge N., Sasaki T. and Timpl R. Angiogenesis inhibitor endostatin is a distinct component of elastic fibers in vessel walls // FASEB J., 1999, v. 13, p. 1743-1750.
168. Mizejewski GJ. Alpha-fetoprotein structure and function: relevance to isoforms, epitopes, and conformational variants // Exp. Biol. Med., 2001, v. 226 (5), p. 377-408.
169. Moan J. Properties for optimal photodynamic therapy sensitizers // J. Photochem. Photobiol., 1990, v. 5, p. 521-524.
170. Moscow J.A., Fairchild C.R., Madden M.J. et al. Expression of anionic glutathione-S-transferase and P-glycoprotein genes in human tissues and tumors // Cancer Res., 1989, v. 49, p. 1422-1428.
171. Moser T.L., Stack M.S., Asplin J. et al. Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, v. 96, p. 2811-2816.
172. Moskaleva E.Y., Posypanova G.A., Shmyrev I.I. et al. AFP-mediated targeting: A new strategy to overcome multidrug resistance of tumor cells in vitro. // Cell Biol. Int., 1997, v. 21, p. 793-799.
173. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Meth., 1983, v. 65 (1-2), p. 55-63.
174. Myers C., Charboneau A. and Boudreau N. Homeobox B3 promotes capillary morphogenesis and angiogenesis // J. Cell Biol., 2000, v. 148, p. 343-351.
175. Myers C.E. and Chabner B.A. Anthracyclines // In: Chabner B.A. and Collins J.M., eds. Cancer chemotherapy: principles and practice. J.B. Lippincott Company, Philadelphia, 1990, p. 356-381.
176. Myers S.A. and Wolowacz R.G. Tetracycline-based MMP inhibitors can prevent fibroblast-mediated collagen gel contraction in vitro // Adv. Dent. Res., 1998, v. 12, p. 86-93.
177. Naglich J.G., Jure-Kunkel M., Gupta E. et al. Inhibition of angiogenesis and metastasis in two murine models by the matrix metalloproteinase inhibitor BMS-275291 // Cancer Res., 2001, v. 61, p. 8480-8485.
178. Nelson R.L., Dyke R.W. and Root M.A. Comparative pharmacokinetics of vindesine, vincristine and vinblastine in patients with cancer // Cancer Treat. Rev., 1980, v. 7, p. 17-24.
179. Neyfakh A.A. Use of fluorescent dyes as molecular probes for the study of multidrug resistance//Exp. Cell Res., 1988, v. 174, p. 168-176.
180. Noonan K.E., Beck C., Hoizmayer T.A. et al. Quantitative analysis of MDR1 (multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, v. 87, p. 7160-7164.
181. Nor J.E. and Polverini P.J. Role of endothelial cell survival and death signals in angiogenesis // Angiogenesis, 2000, v. 3, p. 101-116.
182. Novodarova G.N., Belkov V.M., Volpin M.E. and Shaharova Z.A. The activation of dioxygen and homogeneous catalytic oxidation // 6th Intern. Symposium, Noordwijkerhout 1996, p. 215-216.
183. O'Reilly M.S., Boehm Т., Shing Y. et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth // Cell, 1997, v. 88 (2), p. 277-285.
184. O'Reilly M.S., Holmgren L., Chen C. and Folkman J. Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice // Nature medicine, 1996, v. 2, p. 689-692.
185. O'Reilly M.S., Holmgren L., Shing Y. et al. Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma // Cell, 1994, v. 79, p. 315-328.
186. Ogiso H., Ishitani R., Nureki O. et al. Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains // Cell, 2002, v. 110, p. 775-787.
187. Owellen R.J., Hartke C.A. and Hains F.O. Pharmacokinetics and metabolism of vinblastine in humans // Cancer Res., 1977a, v. 37, p. 2597-2602.
188. Owellen R.J., Root M.A. and Hains F.O. Pharmacokinetis of vindesine and vincristine in humans // Cancer Res., 1977b, v. 37, p. 2603-2607.
189. Ozols R.F. and Young R.C. Chemotherapy of ovarian cancer // Semin. Oncol., 1984, v. 11, p. 251-263.
190. Pardridge W.M. Advances in cell biology of blood-brain barrier transport // Semin. Cell Biol., 1991, v. 2(6), p. 419-426.
191. Parenti A., Morbidelli L., Cui X.L. et al. Nitric oxide is an upstream signal of vascular endothelial growth factor-induced extracellular signal-regulated kinasel/2 activation in postcapillary endothelium // J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p. 42204226.
192. Park J.H., Lee J.M. and Chung I.S. Production of recombinant endostatin from stably transformed Drosophila melanogaster S2 cells // Biotechnol. Lett., 1999, v. 21, p. 729-733.
193. Patterson B.C. and Sang Q.A. Angiostatin-converting enzyme activities of human matrilysin (MMP-7) and gelatinase B/type IV collagenase (MMP-9) // J. Biol. Chem., 1997, v. 272, p. 28823-28825.
194. Pearson J.W., Fogler W.E., Volker K. et al. Reversal of drug resistance in a human colon cancer xenograft expressing MDR1 complementary DNA by in vivoadministration of MRK-16 monoclonal antibody // J. Natl. Cancer Inst., 1991,v. 83, p. 1386-1391.
195. Pepper M.S., Vassalli J.D., Wilks J.W. et al. Modulation of bovine microvascular endothelial cell proteolytic properties by inhibitors of angiogenesis // J. Cell Biochem., 1994, v. 55, p. 419-434.
196. Perales J.C., Ferkol Т., Beegen H. et al. Gene transfer in vivo: Sustained expression and regulation of genes introduced into the liver by receptor-targeted uptake // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994a, v. 91, p. 4086-4090.
197. Perales J.C., Ferkol Т., Molas M. and Hanson R.W. An evaluation of receptor-mediated gene transfer using synthetic DNA-ligand complexes // Eur. J. Biochem., 1994b, v. 226, p. 255-266.
198. Peterson R.H.F. and Biedler J.L. Plasma membrane proteins and glycoproteins from Chinese hamster cells sensitive and resistant to actinomycin D // J. Supramol. Struct., 1978, v. 9, p. 289-298.
199. Pileri S.A., Sabattini E., Falini B. et al. Immunohistochemical detection of the multidrug transport protein P170 in human normal tissues and malignant lymphomas // Histopathology, 1991, v. 19, p. 131-140.
200. Pirker R., Wallner J., Geissler K. et al. MDR1 gene expression and treatment outcome in acute myeloid leukemia // J. Natl. Cancer Inst., 1991, v. 83, p. 708712.
201. Piwnica-Worms D., Chiu M.L., Kronauge J.F. et al. Functional imaging of multidrug-resistant P-glycoprotein with an organotechnetium complex // Cancer Res., 1993, v. 53, p. 977-984.
202. Pola R., Ling L.E., Silver M. et al. The morphogen Sonic hedgehog is an indirect angiogenic agent upregulating two families of angiogenic growth factors // Nat. Med., 2001, v. 7, p. 706-711.
203. Prigent S.A., Lemoine N.R. The type 1 (EGFR-related) family of growth factor receptors and there ligands // Progress Growth Factor Res., 1992, v. 4, p. 124.
204. Redlitz A., Daum G. and Sage E.H. Angiostatin diminishes activation of the mitogen-activated protein kinases ERK-1 and ERK-2 in human dermal microvascular endothelial cells // J. Vase. Res., 1999, v. 36, p. 28-34.
205. Riordan J.R., Deuchars K., Kartner N. et al. Amplification of P-glycoprotein genes in multidrug-resistant mammalian cell lines // Nature, 1985, v. 316, p. 817819.
206. Robaye В., Mosselmans R., Fiers W. et al. Tumor necrosis factor induces apoptosis (programmed cell death) in normal endothelial cells in vitro // Am. J. Pathol., 1991, v. 138, p. 447-153.
207. Rudek M.A., Figg W.D., Dyer V. et al. Phase I clinical trial of oral COL-3 a matrix metalloproteinase inhibitor in patients with refractory metastatic cancer // J. Clin. Oncol., 2001, v. 19, p. 584-592.
208. Ruegg C. and Mariotti A. Vascular integrins: pleiotropic adhesion and signaling molecules in vascular homeostasis and angiogenesis // Cell. Mol. Life Sci., 2003, v. 60, p. 1135-1157.
209. Rutenfranz I., Bauer A. and Kirchner H. Pharmacokinetic study of liposome-encapsulated human interferon-gamma after intravenous and intramuscular injection in mice // J. Interferon Res., 1990, v. 10 (3), p. 337-341.
210. Sacco M.G., Caniatti M., Cato E.M. et al. Liposome-delivered angiostatin strongly inhibits tumor growth and metastatization in a transgenic model of spontaneous breast cancer // Cancer Res., 2000, v. 60, p. 2660-2665.
211. Saha D., Datta P.K., Sheng H. et al. Synergistic induction of cyclooxygenase-2 by transforming growth factor-beta 1 and epidermal growth factor inhibits apoptosis in epithelial cells // Neoplasia, 1999, v. 1, p. 508-517.
212. Salomon D.S., Brandt R., Ciardiello F. and Normanno N. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies // Crit. Rev. Oncol. Hematol., 1995, v. 19, p. 183-232.
213. Sanfilippo O., Ronchi E., de Marco C. et al. Expression of P-glycoprotein in breast cancer tissue and in vitro resistance to doxorubicin arid vincristine // Eur. J. Cancer, 1991, v. 27, p. 155-158.
214. Sanyal G., Marquis-Omer D., Gress J.O. and Middaugh C.R. A transforming growth factor-a-Pseudomonas exotoxin hybrid protein undergoes pH-dependent conformational changes conducive to membrane interaction // Biochemistry, 1993, v. 32, p. 3488-3497.
215. Sasaki Т., Larsson H., Kreuger J. et al. Structural basis and potential role of heparin/heparan sulfate binding to the angiogenesis inhibitor endostatin // EMBO J., 1999, v. 18, p. 6240-6248.
216. Savage C.R. and Cohen S. Proliferation of corneal epithelium induced by epidermal growth factor 11 Exp. Eye Res., 1973, v. 15, p. 361-366.
217. Sawamura Т., Kawasato S., Shiozaki Y. et al. Decrease of a hepatic binding protein specific for asialoglycoproteins with accumulation of serum asialoglycoproteins in galactosamine-treated rats // Gastroenterology, 1981, v. 81, p. 527-533.
218. Scheper R.J., Broxterman H.J., Scheffer G.L. et al. Overexpression of a Mr 110,000 vesicular protein in non-P-glycoprotein mediated multidrug resistance // Cancer Res., 1993, v. 53, p. 1475-1479.
219. Schmidt A., Addicks K. and Bloch W. Opposite effects of endostatin on different endothelial cells // Cancer Biol. Ther., 2004, v. 3 (11), p. 1162-1166.
220. Schuurhuis G.J., Broxterman H.J., Cervantes A. et al. Quantitative determination of factors contributing to doxorubicin resistance in multidrug-resistant cells // J. Natl. Cancer Inst., 1989, v. 81, p. 1887-1892.
221. Schuurhuis G.J., Broxterman H.J., Ossenkoppele G.J. et al. Functional detection of MDR phenotype in acute myeloid leukemia. Correlation with clinical response//Exp. Hematol., 1993a, v. 21, p. 1079.
222. Seabra M.C. Membrane association and targeting of prenylated Ras-like GTPases // Cell Signal, 1998, v. 10, p. 167-172.
223. Seetharam L., Gotoh N., Maru Y. et al. A unique signal transduction from FLT tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor VEGF // Oncogene, 1995, v. 10, p. 135-147.
224. Seftor R.E., Seftor E.A., De Larco J.E. et al. Chemically modified tetracyclines inhibit human melanoma cell invasion and metastasis // Clin. Exp. Metastasis, 1998, v. 16, p. 217-225.
225. Severin S.E., Moskaleva E.Yu., Shmyrev I.I. et al. Alpha fetoprotein mediated targeting of anti-cancer drugs to tumor cells in vitro // Biochem. Mol. Biol. Int., 1995, v. 37(2), p. 385-392.
226. Seymour L.W., Ulbrich K., Wedge S.R. et al. N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide copolymers targeted to the hepatocyte galactose receptor: pharmacokynetics in DBA2 mice // Br. J. Cancer, 1991, v. 63, p. 859-899.
227. Shalinsky D.R., Brekken J., Zou H. et al. Broad antitumor and antiangiogenic activities of AG3340 a potent and selective MMP inhibitor undergoing advanced oncology clinical trials // Ann. N.-Y. Acad. Sci., 1999, v. 878, p. 236-270.
228. Shapiro J.Т., Leng M. and Felsenfeld G. Deoxyribonucleic acid-polylysine complexes. Structure and nucleotide specificity // Biochemistry, 1969, v. 8, p. 3219-3132.
229. Shepard S.R., Boucher R., Johnston J. et al. Large-Scale Purification of Recombinant Human Angiostatin // Protein Expression and Purification, 2000, v. 20, p. 216-227.
230. Shimizu A. and Kawashima S. Kinetic study of internalization and degradation of 1311-labeled follicle-stimulating hormone in mouse Sertoli cells and its relevance to other systems // J. Biol. Chem., 1989, v. 264, p. 13632-13638.
231. Shinoda H., Inaba M. and Tsuruo T. In vivo circumvention of vincristine resistance in mice with P388 leukemia using a novel compound, AHC-52 // Cancer Res., 1989, v. 49, p. 1722-1726.
232. Sikic B.I. Modulation of multidrug resistance: at the threshold // J. Clin. Oncol, 1993, v. 11, p. 1629-1635.
233. Sim B.K., Fogler W.E., Zhou X.H. et al. Zinc ligand-disrupted recombinant human endostatin: potent inhibition of tumor growth, safety and pharmacokinetic profile // Angiogenesis, 1999, v. 3 (1), p. 41 -51.
234. Sim B.K.L. Angiostatin and endostatin: endothelial cell-specific endogenous inhibitors of angiogenesis and tumor growth // Angiogenesis, 1998, v. 2, p. 37-48.
235. Sim B.K.L., MacDonald N.J. and Gubish E.R. Angiostatin and endostatin: endogenous inhibitors of tumor growth // Cancer and Metastasis Rev., 2000, v. 19, p. 181-190.
236. Singhal S., Mehta J., Desikan R. et al. Antitumor activity of thalidomide in refractory multiple myeloma//N. Engl. J. Med., 1999, v. 341, p. 1565-1571.
237. Sinicrope F.A., Dudeja P.K., Bissonnette B.M. et al. Modulation of P-glycoprotein-mediated drug transport by alterations in lipid fluidity of rat liver canalicular membrane vesicles // J. Biol. Chem., 1992, v. 267, p. 24995-25002.
238. Skobe M., Rockwell P., Goldstein N. et al. Halting angiogenesis suppresses carcinoma cell invasion//Nature Med., 1997, v. 3, p. 1222-1227.
239. Soengas M.S., Capodieci P., Polsky D. et al. Inactivation of the apoptosis effector Apaf-1 in malignant melanoma // Nature, 2001, v. 409, p. 207-211.
240. Soff G.A. Angiostatin and angiostatin-related proteins // Cancer and Metastasis Rev., 2000, v. 19, p. 97-107.
241. Speth P.A.J., Linssen P.C.M., Boezeman J.B.M. et al. Leukemic cell and plasma daunomycin concentrations after bolus injection and 72 h infusion // Cancer Chemother. Pharmacol., 1987, v. 20, p. 311-315.
242. Spikes J.D. and Jori G. Photodynamic therapy of tumors and others disease using porphyrins // Lasers Med. Sci., 1986, v. 2, p. 3-15.
243. Spoelstra E.C., Westerhoff H.V., Dekker H. and Lankelma J. Kinetics of daunorubicin transport by P-glycoprotein of intact cancer cells // Eur. J. Biochem., 1992, v. 207, p. 567-579.
244. Spoelstra E.C., WesterhoffH.V., Pinedo H.M. et al. The multidrug resistance reverser verapamil interferes with cellular P-glycoprotein-mediated pumping of daunorubicin as a non-competing substrate // Eur. J. Biochem., 1994, v. 221, p. 363-373.
245. Sporn M.B. and Roberts A.B. Autocrine secretion: ten years later // Ann. Intern. Med., 1992, v. 117, p. 408^114.
246. Stack M.S., Gately S., Bafetti L.M. et al. Angiostatin inhibits endothelial and melanoma cellular invasion by blocking matrix-enhanced plasminogen activation // Biochem. J., 1999, v. 340, p. 77-84.
247. Stretch J.R., Gatter K.C., Ralfkiaer E. et al. Expression of mutant p53 in melanoma// Cancer Res., 1991, v. 51, p. 5976-5979.
248. Strom T.B., Anderson P.L., Rubin-Kelley V.E. et al. Immunotoxins and cytokine toxin fusion proteins II Ann. NY Acad. Sci., 1991, v. 636, p. 233-250.
249. Stromblad S., Becker J.C., Yebra M. et al. Suppression of p53 activity and p21WAFl/CIPl expression by vascular cell integrin alphaVbeta5 during angiogenesis // J. Clin. Invest., 1996, v. 98, p. 426-133.
250. Sundberg C., Ljungstrom M., Lindmark G. et al. Microvascular pericytes express platelet-derived growth factor-beta receptors in human healing wounds and colorectal adenocarcinoma // Am. J. Pathol., 1993, v. 143, p. 1377-1388.
251. Takahashi N., Asakura T. and Ohkawa K. Pharmacokinetic analysis of protein-conjugated doxorubicin (DXR) and its degraded adducts in DXR-sensitive and-resistant rat hepatoma cells // Anti-Cancer Drugs, 1996, v. 7, p. 687-696.
252. Takahashi Т., Yamaguchi Т., Kitamura K. et al. Clinical application of monoclonal antibody-drug conjugates for immunotargeting chemotherapy of colorectal carcinoma // Cancer, 1988, v. 61, p. 881-888.
253. Tanaka Т., Cao Y., Folkman J. and Fine H.A. Viral vector-targeted antiangiogenic gene therapy utilizing an angiostatin complementary DNA // Cancer Res., 1998, v. 58, p. 3362-3369.
254. Tarasiuk J., Frezard F., Gamier-Suillerot A. et al. Antracycline incorporation in human lymphocytes. Kinetics of uptake and nuclear concentration // Biochim. Biophys. Acta., 1989, v. 1013, p. 109-117.
255. Tarnai I. and Safa A.R. Competitive interaction of cyclosporins with the vinca alkaloid-binding site of P-glycoprotein in multidrug-resistant cells // J. Biol. Chem., 1990, v. 265, p. 16509-16513.
256. Tarui Т., Miles L.A. and Takada Y. Specific interaction of angiostatin with integral alpha(v)beta(3) in endothelial cells // J. Biol. Chem., 2001, v. 276, p. 39562-39568.
257. Taylor S. and Folkman J. Protamine is an inhibitor of angiogenesis // Nature, 1982, v. 297, p. 307-312.
258. Tepler I., Schwartz G., Parker K. et al. Phase I trial of an interleukin-2 fusion toxin (DAB486IL-2) in hematologic malignancies: Complete response in a patient with Hodgkin's disease refractory to chemotherapy // Cancer, 1994, v. 73, p. 12761285.
259. Thomas D.A. and Kantarjian H.M. Current role of thalidomide in cancer treatment // Curr. Opin. Oncol., 2000, v. 12, p. 564-573.
260. Torchilin V.P., Klibanov A.L., Huang L. et al. Targeted accumulation of polyethylene glycol-coated immunoliposomes in infarcted rabbit myocardium // FASEB J., 1992, v. 6, p. 2716-2719.
261. Tortora G., Melisil D. and Ciardiello F. Angiogenesis: A Target for Cancer Therapy // Curr. Pharm. Design, 2004, v. 10, p. 11-26.
262. Tran J., Rak J., Sheehan C. et al. Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular endothelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, v. 264, p. 781-788.
263. Tritton T.R. and Yee G. The anticancer agent adriamycin can be actively cytotoxic without entering cells // Science, 1982, v. 217, p. 248-250.
264. Tritton T.R. Cell surface actions of adriamycin // Pharmacol. Ther., 1991, v. 49(3), p. 293-309.
265. Tsuda S., Ohtsuru A., Yamashita S. et al. Role of c-Fyn in FGF2-mediated tube-like structure formation by murine brain capillary endothelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, v. 290, p. 1354-1360.
266. Tsujii M., Kawano S., Tsuji S. et al. Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells // Cell 1998, v. 93, p. 705-716.
267. Tsuruo Т., Hamada H., Sato S. et al. Inhibition of multidrug-resistant human tumor growth in athymic mice by anti-P-glycoprotein monoclonal antibodies. // Jpn. J. Cancer Res., 1989, v. 80, p. 627-631.
268. Tsuruo Т., Iida H., Tsukagoshi S. et al. Increased accumulation of vincristine and adriamycin in drug-resistant P388 tumor cells following incubation with calcium antagonists and calmodulin inhibitors // Cancer Res., 1982, v. 42, p. 47304733.
269. Tsuruo Т., Iida H., Tsukagoshi S. et al. Overcoming of vincristine resistance in P388 leukemia in vivo and in vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblastine by verapamil // Cancer Res., 1981, v. 41, p. 1967-1972.
270. Twentyman P.R., Fox N.E., White D.J.G. Cyclosporin A and its analogues as modifiers of adriamycin and vincristine resistance in a multi-drug resistant human lung cancer cell line // Br. J. Cancer, 1987, v. 56, p. 55-57.
271. Uchida S., Watanabe G., Shimada Y. et al. The suppression of small GTPase rho signal transduction pathway inhibits angiogenesis in vitro and in vivo // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, v. 269, p. 633-640.
272. Urbich C., Dernbach E., Reissner A. et al. Shear stress-induced endothelial cell migration involves integrin signaling via the fibronectin receptor subunits alpha(5) and beta(l) // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 2002, v. 22, p. 69-75.
273. Valdembri D., Serini G., Vacca A. et al. In vivo activation of JAK2/STAT-3 pathway during angiogenesis induced by GM-CSF // FASEB J., 2002, v. 16, p. 225-227.
274. Van Wetering S., Van-Buul J.D., Quik S. et al. Reactive oxygen species mediate Rac-induced loss of cell-cell adhesion in primary human endothelial cells //J. Cell Sci., 2002, v. 115, p. 1837-1846.
275. Vasir J.K., Reddy M.K., Labhasetwar V.D. Nanosystems in drug targeting: opportunities and challenges // Curr. Nanoscience, 2005, v. 1, p. 47-64.
276. Veitonmaki N., Cao R., Wu L.-H. et al. Endothelial cell surface ATP synthase-triggered caspase-apoptotic pathway is essential for К1-5-induced antiangiogenesis // Cancer Res., 2004, v. 64, p. 3679-3686.
277. Verelle P., Meissonnier F., Fonck Y. et al. Clinical relevance of immunohistochemical detection of multidrug resistance of P-glycoprotein in breast carcinoma // J. Natl. Cancer Inst., 1991, v. 83, p. 111-116.
278. Versantvoort C.H.M., Broxterman H.J., Pinedo H.M. et al. Energy-dependent processes involved in reduced drug accumulation in multidrug-resistant human lung cancer cell lines without P-glycoprotein expression // Cancer Res., 1992, v. 52, p. 17-23.
279. Versantvoort C.H.M., Schuurhuis G.J., Pinedo H.M. et al. Genistein modulates the decreased drug accumulation in non-P-glycoprotein mediated multidrug resistant tumour cells // Br. J. Cancer., 1993, v. 68, p. 939-946.
280. Volm M., Mattern J. and Koomagi R. Angiostatin expression in non-small cell lung cancer //Clin. Cancer. Res., 2000, v. 6, p. 3236-3240.
281. Wajih N. and Sane D.C. Angiostatin selectively inhibits signaling by hepatocyte growth factor hi endothelial and smooth muscle cells // Blood, 2003, v. 101, p. 1857-1863.
282. Wang H. and Keiser J.A. Hepatocyte growth factor enhances MMP activity in human endothelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, v. 272, p. 900-905.
283. Wen W., Moses M.A., Wiederschain D. et al. The generation of endostatin is mediated by elastase // Cancer Res., 1999, v. 59, p. 6052-6056.
284. Westphal J.R., Hullenaar R.V., Geurts-Moespot A. et al. Angiostatin generation by human tumor cell lines: involvement of plasminogen activators // Int. J. Cancer, 2000, v. 86, p. 760-767.
285. Wickstrom S.A., Alitalo K. and Keski-Oja I. Endostatin associates with integrin alpha5betal and caveolin-1, and activates Src via a tyrosyl phosphatase-dependent pathway in human endothelial cells // Cancer Res., 2002, v. 62, p. 5580-5589.
286. Wiechelman K. J., Braun R. D.and Fitzpatrick J. D. Investigation of the Bicinchoninic acid protein assay: Identification of the groups responsible for color formation // Analytical Biochem., 1988, v. 175, p. 231-237.
287. Willingham M.C., Haigler H.T., Fitzgerald D.J. et al. The morphologic pathway of binding and internalization of epidermal growth factor in cultured cells //Exp. Cell Res., 1983, v. 146, p. 163-175.
288. Wilson J.M., Grossman M., Wu C.H. et al. Hepatocyte-directed gene transfer in vivo leads to transient improvement of hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor-deficient rabbits // J. Biol. Chem., 1992, v. 267, p. 963-967.
289. Wojtowicz-Praga S.M., Dickson R.B. and Hawkins M.J. Matrix metalloproteinase inhibitors // Invest. New Drugs, 1997, v. 15, p. 61-75.
290. Wu C. and Dedhar S. Integrin-linked kinase (ILK) and its interactors: a new paradigm for the coupling of extracellular matrix to actin cytoskeleton and signaling complexes //J. Cell Biol., 2001, v. 155, p. 505-510.
291. Wu C.H. and Wu G.Y. Receptor-mediated delivery of foreign genes to hepatocytes // Adv. Drug Delivery Rev., 1998a, v. 29(3), p. 243-248.
292. Wu C.H. and Wu G.Y. Targeted inhibition of hepatitis С virus-directed gene expression in human hepatoma cell lines // Gastroenterology, 1998b, v. 114(6), p. 1304-12.
293. Wu C.H., Wilson J.M. and Wu G.Y. Targeting genes: Delivery and persistent expression of a foreign gene driven by mammalian regulatory elements in vivo // J. Biol. Chem., 1989, v. 264, p. 16985-16987.
294. Wu G.Y., and Wu C.H. Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo // J Biol. Chem., 1988, v. 263, p. 14621-14624.
295. Wu J., Fu W., Luo J., Zhang T. Expression and purification of human endostatin from Hansenula polymorpha A16 // Protein Expr. Purif., 2005, v. 42(1), p. 12-19.
296. Xu H.M., Zhang G.Y., Ji X.D. et al. Expression of soluble, biologically active recombinant human endostatin in Escherichia coli 11 Protein Expr. Purif., 2005, v. 41(2), p. 252-258.
297. Yabkowitz R., Meyer S., BlackT. et al. Inflammatory cytokines and vascular endothelial growth factor stimulate the release of soluble tie receptor from human endothelial cells via metalloprotease activation // Blood, 1999, v. 93, p. 19691979.
298. Yoshikawa T. and Pardridge W.M. Biotin delivery to brain with a covalent conjugate of avidin and a monoclonal antibody to the transferrin receptor // J. Pharmacol. Exp. Ther., 1992, v. 263, p. 897-903.
299. You W.-K., So S.-H., Lee H. et al. Purification and characterization of recombinant murine endostatin in E. coli // Experim. Mol. Med., 1999, v. 31 (4), p. 197-202.
300. Zhong J., Eliceiri В., Stupack D. et al. Neovascularization of ischemic tissues by gene delivery of the extracellular matrix protein Del-1 // J Clin. Invest., 2003, v. 112, p. 30-41.
301. Zimrin A.B., Pepper M.S., McMahon G.A. et al. An antisense oligonucleotide to the notch ligand jagged enhances fibroblast growth factor-induced angiogenesis in vitro // J. Biol. Chem., 1996, v. 271, p. 32499-32502.
302. Zucker S., Cao J. and Chen W.T. Critical appraisal of the use of matrix metalloproteinase inhibitors in cancer treatment // Oncogene, 2000, v. 19, p. 6642-6650.
303. Богуш Т.А., Шубина И.Ж., Смирнова Г.Б. и др. Прижизненная количественная оценка внутриклеточного распределения доксорубицина в опухолевых клетках // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,1995, №11, с. 518-521.
304. Завадская Е.С., Захарова Е.С., Кадулин С.Г. и др. Получение рекомбинантного эндостатина в молоке трансгенных мышей // Генетика, 2001, т. 37(9), с. 1207-1212.
305. Луценко С.В., Финакова Г.В., Фельдман Н.Б. и др. Рецепторопосредованный токсический эффект коньюгата эпидермального фактора роста с доксорубицином в отношении опухолевых клеток // Вопросы биол., мед. и фарм. химии, 1998, № 1, с. 21-25.
306. Сергеева Н.С., Стороженко И.В., Маршутина Н.В. Множественная лекарственная устойчивость как один из возможных механизмов клинической химиорезистентности опухолей человека // Рос. онкол. журнал,1996, №3, с. 51-55.
307. Стойка Р.С., Панчук P.P., Стойка Б.Р. Сходство и различие эмбриогенеза и канцерогенеза // Онтогенез, 2004, т. 35 (2), с. 85-90.
-
Фельдман, Наталия Борисовна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2007
-
ВАК 03.00.04
- Разработка наносомных препаратов на основе флаволигнанов и антиангиогенных белков
- Получение и изучение противоопухолевого потенциала антиангиогенных полипептидов и химиопрепаратов направленного действия
- Роль PEDF в образовании фибриллярных внеклеточных структур при миопии
- Использование белковых и пептидных векторов для избирательной доставки противоопухолевых препаратов и терапевтических олигонуклеотидов в опухолевые клетки
- Исследование влияния антиангиогенных агентов и конъюгатов альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста с химиотерапевтическими препаратами на онкогенез
