Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование влияния заряженных полимеров и липосом на комплемент-зависимый лизис эритроцитов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование влияния заряженных полимеров и липосом на комплемент-зависимый лизис эритроцитов"

Для служебного пользования Экз. № ^

На правах гр^г^си . ^ д

- з пня гоС'Р

НУРДЕЛЁВ ОЛЕГ ОЛЕГОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЗАРЯЖЕННЫХ ПОЛИМЕГО0 И ЛИПОСОМ НА КОМПЛЕМЕНТ-ЗАВИСИМЫЙ ЛИЗИС ЭРИТРОЦИТОВ

03.00. 23. - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени

кандидата химических наук ^

Г

Москва-2000 __

') Ис .......ДСП

к. - митхт.

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

Официальные оппоненты:

академик РАН, доктор химических наук Мирошников Анатолий Иванович кандидат химических наук, доцент Себякин Юрий Львович

Ведущая организация:

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.

Защита диссертации состоится "А." 2000 года в 15 часов на

заседании Диссертационного совета Д 063.41.01 в Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу: 117571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Академии (119831, Москва, М. Пироговская, 1).

Автореферат разослан уоябм 2000 года.

Учёный секретарь Диссерт ационного Совета кандидат химических наук

ЕмгШб'е, о.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Система комплемента состоит из более чем 30 белков сыворотки крови. Активация СК1 включает в себя стадии инициации (узнавания), амплификации (усиления ответа) и лизиса (мембранной атаки) (М.К. Liszewski et al., 1996). Она играет ключевую роль при нормальном воспалительном ответе, но в определенных условиях активация СК вызывает повреждение тканей и является причиной ряда заболеваний (В.Р. Morgan, 1994), затрагивающих иммунную, сердечнососудистую, нервную и другие системы. К группе острых состояний, связанных с активацией СК, можно отнести респираторный дистрессиндром взрослых, ишемические повреждения (инфаркт миокарда, скелетных мускул, легких), сепсис, ожогов}то болезнь, раневую болезнь, астму, повторный (послеоперационный) стеноз сосудов, синдром множественной органной недостаточности, кровотечения, синдром Гийена-Барре. В группу хронических состояний входят пароксизмальная ночная гемоглоби-нурия, гломерулонефрит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера. отторжение органов при трансплантациях, миастения, рассеянный склероз. Часто активация СК, приводящая к осложнениям, возникает из-за неполной биосовместимости материалов в аппаратах для гемодиализа, искусственного сердца и др.

Цитолитические свойства сыворотки были описаны более века назад (J. Bordet, 1896), по до сих пор на фармацевтическом рынке нет ни одного лекарственного препарата, ингибирующего комплемент. В настоящее время несколько компаний и исследовательских лабораторий занимаются разработкой регуляторов комплемента (М. Pascual andL.E. French, 1995). Молекулярное клонирование и биохимические исследования многих компонентов СК, проведенные в последние 20 лет, позволяют понять механизм активации СК при воспалительных процессах, и открывают путь для разработки лекарств на основе генной инженерии рецепторов и других компонентов СК. Однако, не менее перспективным является поиск и создание значительно более простых и дешевых небелковых ингибиторов СК, возможные способы действия которых значительно разнообразнее, но на сегодняшний день изучены недостаточно. Несколько лет назад в нашей лаборатории было обнаружено, что липосомы, полученные из липидов мозга животных, ингибируют комплемент-зависимый гемолиз. Начиная работу мы полагали, что выявление активного вещества этих липосом, а также проведе-

1 Список сокращений: АА - антигемолитическая активность; СК - система комплемента, физраствор - 0.89% раствор хлорида натрия; CG - церсброзид; CGS - церебро-зидсульфат; Chol - холестерин; еРС - яичный фосфатидилхолин; IC50 - концентрация эффекторов, при которой происходит 50% ингибирование гемолиза; PC - фосфатидилхолин; РЕ - фосфатидилэтаноламин; PS - фосфатидилсерин; SM - сфингомиелин.

ние структурно-функциональных исследований, может привести к получению важных данных о новых структурах, способных ингибировать комплемент и о механизмах регуляции активности комплемента.

Работа выполнена на кафедре биотехнологии МИТХТ в рамках госбюджетной темы №1Ь-22-866 "Разработка методов получения природных и синтетических амфи-фильных веществ и их использование как компонентов лекарственных средств и инструментов моделирования мембранных биологических процессов" и гранта РФФИ №99-04-48793 "Исследование механизма ингибирования комплемент-индуцированиого гемолиза высокомолекулярными заряженными субстанциями (ли-посомами и полимерами)".

Цель н задачи исследования. Первоначально цель работы была определена как исследование ант игсмолитн ческой активности липосомного препарата, полученного из линидов епшшого мозга крупного рогатого скота, для чего предполагалось:

• обнаружить активное вещество в этом ¡грепарате;

• установить взаимосвязь между составом липосом и их активностью.

В результате выполнения этой части исследований была выявлена определяющая роль заряда для проявления антигемолитической активности и, таким образом, стало возможным конкретизировать цель: изучение заряженных субстанций: наночастнц (липосом и жировых эмульсий), полимеров и низкомолекулярных веществ, - как ингибиторов комплемент-зависимого гемолиза. Соответственно, дополнительно были сформулированы следующие задачи:

• выявление особенностей строения полимеров, определяющих их антигемолити-чсскую активность;

• определение возможных молекулярных мишеней для полимеров среди компонентов гемолитической системы;

• исследование взаимосвязи между сгруктурой заряженных низкомолекулярных веществ и их активностью.

Научная новизна работы. Впервые в одной тест-системе исследована АЛ большого числа веществ и определены структурные свойства молекул заряженных веществ, необходимые для проявления ими АЛ. На основе методики разделения стадий активации комплемента было показано, что отрицательно заряженные полимеры взаимодействуют с С1ц (вероятно, с глобулярными головками), а положительно заряженные полимеры - с иммуноглобулинами; и в том и другом случае это приводит к ингибиро-ванию активации комплемента. Исследование гомологических рядов дикарбоновых кислот и а,ш-диаминоалкапов выявило нелинейный характер зависимости антигемо-

литической активности от длины цепи с, по крайней мере, двумя максимумами. Это может быть интерпретировано как наличие на белках-мишенях нескольких сайтов связывания.

Практическая значимость работы. В результате работы обнаружены субстанции (один класс полимеров и два низкомолекулярных вещества), обладающие высокой антигемолитической активностью, что дает основания для их дальнейшего изучения как потенциальных терапевтических препаратов комплемент-ингибирующего действия. Данные препараты могут применяться как для блокирования активации СК при вызывающих ее острых состояниях (инфаркт миокарда, менингит, септический шок и т.п.), так и для покрытия материалов, используемых в экстракорпоральных устройствах и протезах. Также в ходе работы выявлены некоторые закономерности взаимосвязи "структура-антигемолитическая активность", используя которые можно ускорить поиск веществ с высокой АА. Положения, выносимые на защиту.

1. Любые полимеры, липосомы, эмульсии (и, вероятно, друтие надмолекулярные субстанции), несущие отрицательные или положительные заряды с плотностью, соответствующей расстоянию между зарядами 0.3-1.6 им, обладают свойством ингибнровать комплемент-зависимый гемолиз.

2. Зависимость антигемолитической активности дикарбоновых кислот (С2, СЗ, С4, С5, С6, С7, С8, С9, СЮ и С12) и а.со-диаминоалканов (С2, СЗ, С4, С5, С7 и СЮ) от длины цепи нелинейна и имеет максимумы для СЗ- и С7-дикарбоновых кислот и для С2- и С7-диамииов. Это явление может быть интерпретировано как наличие на белках-мишенях нескольких участков связывания.

3. Проявлению высокой активности веществ с отрицательными зарядами способствует жесткая гидрофобная структура, соединяющая заряженные группы.

4. Взаимодействие отрицательно заряженных полимеров с Clq субкомпонентом комплемента (вероятно, с глобулярными головками), и взаимодействие положительно заряженных полимеров с иммуноглобулинами ингибирует комплемент-зависимый гемолиз.

Публикации. По материалам работы опубликованы: 2 статьи и тезисы 4 докладов на научных конференциях.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на: VI международной конференции "Liposome Research Days Conference" (Jle Амбье, Франция, 1998), IV международной конференции "European Congress of Pharmaceutical Sciences" (Милан, Италия, 1998), V конференции "Новые перспективы в исследовании хитина и хитоза-

на" (Москва, Россия, 1999), международном симпозиуме ''Lipid and Surfactant Dispersed Systems" (Москва, Россия, 1999), школе-конферешщи "Горизонты физико-химической биологии" (Москва, Россия, 2000).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит 2Q рисунков и /Утаблиц. Список литературы включает источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Антигемолитическая активность высокомолекулярных заряженных

субстанций

Ранее было обнаружено, что липосомы, приготовленные из полярных липидеш спинною мозга крупного рогатого скота, предотвращают комплемент-зависимый гемолиз (H.H. Иванова, А. П. Каплун, В.И. Швец, 1985). На основе этой липосомной дисперсии был создан препарат, предназначенный для лечения гемолитической болезни новорожденных. Первой задачей работы было установление активного вещества в названных липосомах и условий проявления им способности иигибировать комплемент зависимый гемолиз.

1.1. Определение активного вещества в липосомах, полученных излинидов спинного мозга крупног о рогатого скота

В работе использовали липиды, выделенные экстракцией растворителями из спинного мозга крупного рогатого скота. Смесь липидов разделяли хроматографией на силикагелс. В результате этого получили фракции следующих веществ: CG, PL, CGS, PC, PS, SM. Полученные вещества идентифицировали, сравнивая с известными образцами, по хроматографической подвижности и с помощью специфических обнаружителей. Структура выделенного CGS была подтверждена ИК-, 'Н-ЯМР- и масс-спсктрами.

Каждую выделенную фракцию проверяли на наличие антигемолитической активности. Для этого 1% дисперсии липосом, содержащие липиды каждой фракции, добавляли к гемолитической системе, состоящей из эритроцитов барана, антител к ним и комплемента морской свинки. В контрольном образце (полный гемолиз) заменяли липосомы таким же объемом физиологического расгвора. Посте инкубирования

всех образцов при 37°С в течение 20-40 мин и разбавления физраствором отделяли интактные и разрушенные эритроциты центрифугированием при 2500g и измеряли в

супсрнатанте концентрацию гемоглобина по оптическому поглощению при 412 нм. Антигемолитическую активность выражали как уменьшение концентрации гемоглобина по сравнению с контролем и рассчитывали по уравнению:

АА =

г Ае-Аьл

\ Ас ;

(уравнение 1)

где Ае - оптическое поглощение при 412 нм в эксперименте.

Ас - оптическое поглощение при 412 нм в контрольном образце при 100% гемолизе.

Аь- оптическое поглощение при 412 нм в контрольном образце липосомной дисперсии.

В качестве характеристики АА при сравнения различных образцов использовали величину 1С50 - концентрацию липидов в липосомной дисперсии или других эффекторов, при которой происходило 50% ингибирование гемолиза. Из всех выделенных липидов только СвЯ обладал выраженной антигемолитической активностью в описанных условиях.

1.2. Исследование влияния состава лнпосом на антигемолнтическуто активность

Взаимодействие СС5 с компонентами гемолитической системы (белками системы комплемента, иммуноглобулинами, эритроцитами) может быть специфическим (комплементарным, подобно взаимодействию лиганд-рецептор), неспецифическим (электростатическим, гидрофобным) или смешанным. В случае специфического взаимодействия важную роль должно играть молекулярное окружение СОБ. Поскольку ССБ нерастворим в воде, то в водном растворе он может существовать в составе надмолекулярных комплексов трех видов: мицелл, липосом или жировых эмульсий. В любом из этих комплексов только полярные головки и непосредственно примыкающие к ним фрагменты гидрофобной части молекулы ССБ могут быть опознаны белками (например, антителами или компонентами системы комплемента). Если в состав мопослоя входят лишь молекулы СвБ, то полярные головки тесно примыкают друг к другу, образуя "гладкую" поверхность. Тесный контакт молекул Св5 с белками в этом случае затруднен и очевидно, что взаимодействие может иметь в основном электростатический характер.

Мы предположили, что для проявления возможных специфических взаимодействий монослой Св8 должен быть разбавлен другими полярными липидами, имеющими менее объемные полярные головки или более короткие гидрофобные "хвосты". Для подтверждения этого мы исследовали АД липосом двойного состава (с еРС, с СО из

спинного мозга крупного рогатого скота и с SM из бычьего головного мозга), тройного состава (с еРС и другими полярными липидами) и жировых эмульсий.

Было обнаружено, что АА CGS при разбавлении его CG увеличивается (табл. 1). АА смесей CGS с PC была в несколько раз выше, чем активность чистого CGS. Разбавление CGS сфингомиелином практически не сказывалось на активности.

Таблица 1. АА образцов СО8 из спинного мозга крупного рогатого скота и двойных смесей ССБ с еРС, с СО из спинного мозга крупного рогатого скота и с ЯМ из бычьего головного мозга. Массовое соотношение С05/(полярный липид) 3:1.

№ Состав ICso, (MKT CGS/мл)

1 С08(обшая фракция) 75±7

2 СОБ (фракция с нормальн. жирнокислотпыми остатками) 106±13

3 ССБ/еРС 8±0.5

4 СОБ/СО (общие фракции) 60±7

5 С05(общая фракция)/СО (фракция с нормальными жир-нокислотньши остатками) 104±11

6 СвБ/БМ 70±10

Полученные результаты подтверждают предположение о возрастании АА с увеличением различия в объеме полярной "головки" или длине гидрофобного "хвоега" липидов, составляющих липосомы (табл. 1, смеси 1, 2, 4, 5). Особо наглядно это проявляется при сравнении смесей С08 с еРС и с БМ. И еРС, и ЯМ имеют сходные полярные головки, тогда как гидрофобная часть БМ, близкая к таковой СОБ, значительно длиннее гидрофобной части еРС. В результате, в композиции СОБ/'еРС, где оба компонента в отличие от композиции СйБ/БМ различаются но длине гидрофобного фрагмента, полярные головки Сйв, по-видимому, лучше экспонированы над бислосм и более доегупны для взаимодействующих с ними белков.

При изучении АА СвБ в липосомах тройного состава СОБ/РС/нолярный липид с соотношением компонентов 4/3/3 (моль/моль/моль) в качестве третьего компонента использовали наиболее обычные типы полярных липидов: Сй спинного мозга быка, РЕ, РБ и БМ (из головного мозга быка). Полученные результаты сравнивали с двойной композицией СйБ/еРС с молярным соотношением компонентов 4/6, которая не является оптимальной, что давало возможность фиксировать как положительный, так и отрицательный эффекты (рис. 1). Из исследованных нами полярных липидов РЕ, Р8 и БМ снижали АА композиций. В противоположность этому АА композиции ССБ/РС/Св оказалась выше, чем у эталонной. Таким образом, исходя из наблюдаемых закономерностей, можно сделать вывод, что замена часги еРС на другие фосфо-

липиды с более длинными жирно-кислотными остатками приводит к уменьшению активности смешанных липосом вне зависимости от структуры полярной головки. Исключение составляет СО, не понижающий АА в двойных композициях (табл. 1).

100

1

^ 40

,о 60

20

80

0

О

0,05

0,1

0,15

0,2

Общая концентрация липидов, мг/мл

Рис. 1. АА липосом из тройных композиций С05/еРС/(полярный липид) в молярном соотношении 4/3/3 при различных концентрациях липосом. Полярный липид: 1 - еРС; 2 - РЕ из головного мозга крупного рогатого скота; 3 - РЭ из того же источника; 4 - БМ из того же источника; 5 - Сй из бычьего спинного мозга, фракция с нормальными жирными кислотами; 6 - СО из бычьего спинного мозга (общая фракция).

Весьма интересные результаты были получены при исследовании зависимости АА от содержания СО§ в липосомах. Были проведены две серии экспериментов с ли-посомными композициями СОБ/еРС с различным соотношением компонентов, что позволило установить оптимальную концентрацию СОБ. В первой серии экспериментов исследовали образцы, в которых суммарная концентрация липидов оставалась постоянной (рис. 2). При этом концентрации Свв были различны для каждой композиции. Для сопоставимости значений АА, полученные активности были приведены к одинаковой концентрации СС5. Во второй серии экспериментов были использованы липосомы, в которых концентрация СвБ была постоянна (рис. 3), что позволило непосредственно сравнивать получаемые данные.

0.26 0.35 0.45 0.55 0.6G 0.76 0.88

CGS/(CGS+PC), по массе

Рис. 2. Зависимость АА липосом из смеси CGS и еРС от массовой доли CGS при постоянной общей концентрации липидов. АА приведена к равной концентрации CGS и нормирована по максимальному значению. Сверху указаны соответствующие мольные доли CGS. Приведены средние значения из трех экспериментов. Концентрация липидов: 1 - 0.02 мг/мл; 2 - 0.06 мг/мл; 3 - 0.005 мг/мл.

Следует заметить, что в первой серии экспериментов наблюдали два максимума АА. Во второй - имело место смещение максимума активности при уменьшении концентрации CGS (от 8.5/1 при концентрации CGS 0.02 мг/мл до 5.5/1 при концентрации CGS 0.005 мг/мл).

CGS/(CGS+PC), по массе

Рис. 3. Зависимость АА липосом из смеси CGS и еРС, от доли CGS при постоянной концентрации CGS. Приведены средние значения из трех экспериментов. Концентрация CGS: 1 -0.02 мг/мл; 2 -0.01 мг/мл; 3 - 0.005 мг/мл.

д

Рис. 4. Возможные объяснения изменения АЛ липосом из смеси CGS и еРС в зависимости от массовой доли CGS. Белок-мишень (Р) содержит несколько мест связывания отрицательно заряженных полярных головок CGS. Экспонирование полярных головок CGS в бислоях, состоящих из смеси CGS и еРС, лучше, чем в бислое, содержащем только CGS, вследствие меньшей длины гидрофобных хвостов у еРС и большего объема полярных головок CGS.

а - Липосомы состоят лишь из CGS. Невозможен плотный контакт белка с молекулами CGS.

б - Липосомы состава CGS/ePC 9/1. Бислой в виде геля, расстояние между молекулами CGS соответствует сайту связывания белка-мишени, поэтому возможен плотный контакт белка с несколькими молекулами CGS. в - Липосомы состава CGS/ePC от 7/3 до 9/1. Бислой в виде геля; расстояние не соответствует сайту связывания белка-мишени, из-за большей вязкости бислоя невозможно оптимальное связывание белка с несколькими молекулами CGS. г - Липосомы состава CGS/ePC от 7/3 до 5/5. Жидкокристаллический бислой, среднее расстояние не соответствует сайту связывания белка-мишени, но диффузия молекул CGS позволяет подстраиваться для такого взаимодействия: возможен плотный контакт белка с несколькими молекулами CGS. д - Альтернативное объяснение. Белок-мишень содержит несколько пар положительно заряженных групп с различными расстояниями между ними.

Для объяснения наблюдаемого явления мы предложили гипотезу, согласно которой белок-мишень взаимодействует сразу с несколькими молекулами CGS (рис. 4). При разбавлении CGS еРС от массовой доли 1 (рис. 4, а) до 0.9 происходит повышение активности за счет облегчения доступности отдельных молекул CGS для взаимодействия с мишенью (рис. 4, б). При дальнейшем уменьшении доли CGS наступает снижение активности вследствие неоитимального расстояния между молекулами CGS, а в первой серии экспериментов и за счет понижения концентрации CGS (рис. 4, в). Следующее повышение активности, возможно, связано с уменьшением вязкости бислоя при значительных долях еРС. имеющего температуру фазового перехода (-5-15°С)

более низкую, чем у CGS бычьего мозга (52-59°С). Температуру фазового перехода композиций CGS/cPC, находящуюся между этими значениями, мы оцепили при помощи линейной интерполяции для смеси CGS/cPC с массовой долей 0.7 (соответствует мольной доле О.бб), с которой начинается второе повышение активности, как (-10+55.5)*0.66=35°С. Эта вычисленная температура близка к температуре, при которой проводился эксперимент. Таким образом, есть вероятность, что композиции с массовой долей CGS 0.7 и ниже в условиях определения АЛ находятся в жидкокристаллическом состоянии. В жидкокристаллическом бислое даже при неоптимальном среднем расстоянии между отдельными молекулами CGS возможна "подстройка'' под сайт связывания белка-мишени в результате быстрой диффузии молекул CGS (рис. 4, г). В пользу этого предположения говорит тот факт, что липосомы, составленные из ненасыщенных липидов являются существенно более эффективными активаторами комплемента по сравнению с липосомами, состоящими из насыщенных липидов (A. Chonn, et al. 1992). Возможно также и иное объяснение, связанное с наличием нескольких альтернативных вариантов связывания с белком-мишенью, имеющим различные расстояния между сайтами связывания (рис. 4, д).

Сопоставляя данные описанных экспериментов и геометрические размеры ли-пидных молекул, мы оценили оптимальное расстояние между несущими заряд сульфатными группами как 0.92-1.6 нм (меньшее значение соответствует расстоянию между центрами контактирующих молекул, большее - расстоянию между центрами молекул, имеющих двух общих соседей при гексагональной упаковке в монослое).

Представляется очевидным, что проявление АА зависит только от состава и структуры поверхностного монослоя липосом. Исходя из этого можно предположить, что, если на поверхности частиц присутствует CGS с определенной поверхностной концентрацией, то эффект должен проявляться вне зависимости от того, что находится под поверхностным монослоем. Это предположение было проверено сравнением АА липосомной дисперсии и жировой эмульсии. Жировые эмульсии гоговили из раствора липидов препарата для внутривенного введения INTRALIPOS (состав: соевое мас-ло/СЬо1/соевый PC с сосгношением 100/22/12 по массе) и CGS в концентрации, равной половине концентрации липидов в липосомной дисперсии. Как и ожидалось, дисперсии липосом и частиц жировой эмульсии с равной поверхностной концентрацией экспонированного во внешний водный слой CGS, обладали одинаковой АА.

Ингибирование гемолиза липосомами и частицами жировых эмульсий может происходить по следующим причинам: 1) взаимодействие с антителами и их'инакти-вация; 2) сорбция липосом на эритроцитах с возможной защитой мембраны эритроци-

тов против действия комплемента; 3) взаимодействие с компонентами комплемента, приводящее к понижению концентрации активных белков комплемента. Для определения молекулярной мишени среди названных компонентов гемолитической системы была проведена следующая серия экспериментов, в которой сравнивали АА одной и той же композиции липосом состава CGS/ePC (6/4 по массе) в трех вариантах. В первом случае к эритроцитам, предварительно инкубированным с липосомами в течение

30 мин при 20°С, добавляли антитела и комплемент; во втором - к эритроцитам последовательно прибавляли антитела, предварительно инкубированные с липосомами в тех же условиях, и комплемент; и в третьем - к эритроцитам и антителам добавляли предварительно инкубированный с липосомами комплемент. Наибольший эффект наблюдался в последнем случае. Эти результаты свидетельствуют о том, что липосо-мы, содержащие CGS, вероятней всего, инактивируют белки комплемента (либо блокируя их действие, либо приводя к активации комплемента и расходованию компонентов комплемента).

Таблица 2. АА липосомных композиций состава еРС/заряженный липид.

Состав липосом 1С50, (мкг/мл)

BetS/ePc >1000

CholS/ePC 325

ОДН/еРС 300

ГДЭА /еРС 110

Чтобы проверить наше предположение о ключевом значении заряда для проявления ингибиругощей активности мы протестировали ряд липосомных композиций еРС/анионный липид (холестерин сульфат, 28-сульфат бетулина) и ряд композиций еРС/катионный липид (1,2-диоктадецилоксипропил-З-пиридиний бромид (ОДП). 1,2-дигексадсцилокси-3-(2-триметиламиноэтил)метилендиоксипропан бромид

(ГДЭА)). Оказалось, что не только отрицательно заряженные липосомы. но и липо-сомы, несущие положительные заряд, ингибируют комплемент-зависимый лизис эритроцитов (табл. 2).

' Катионные липиды синтезированы в лаборатории проф. Серебренниковой Г.А.

1.3. Влияние положительно и отрицательно заряженных полимеров на компле-

меит-зависнмый гемолиз

С целью получения решающих доказательств о том, что лишь наличие заряженных групп, находящихся на определенном расстоянии, достаточно, чтобы субстанция проявляла ЛА, мы обратили внимание на полимеры. В литературе описан ряд заряженных полимеров, таких как гепарин, декстрансульфат, полилизин и др., обладающих способностью влиять на систему комплемента. Полимеры предоставляют дополнительные возможности для структурно-функциональных исследований но сравнению с липосомами. Для различных полимеров расстояния между зарядами, гидрофобность и гибкость молекул могут варьировать в широких пределах. Мы поставили перед собой задачу обнаружить те особенности молекулы эффектора, которые определяют степень его активности, для чего перешли к тестированию полимеров, содержащих кислотные или основные группы, в ионной форме (далее коротко - заряженные полимеры).

АА определяли in vitro в общей гемолитической системе состава: 200 мкл бараньих эритроцитов, 200 мкл кроличьих антител, 200 мкл физраствора, 200 мкл раствора исследуемого вещества, 200 Mien комплемента морской, свинки в разведении, обеспечивающем лизис 70-80% эритроцитов в течение 20 мин при 37°С. Все тестируемые полимеры растворяли п физрастворе при рН 7. В контрольной системе исследуемое вещество заменяли физраствором. Для учета спонтанного лизиса эритроцитов во время инкубации к 200 мкл эритроцитов добавляли 800 мкл физраствора. В контрольном образце со 100% лизисом к 200 мкл эритроцитов добавляли 800 мкл дистиллированной воды. Все образцы инкубировали 20 мин при 37°С, разбавляли в 4 раза физраствором и нслизированные эритроциты осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 3000g. Оптическую плотность супернатанта измеряли при 412 нм и АА вычисляли по формуле:

АА =

r Ае- Acs - Асел

\

Ас - Асе

х100% (уравнение 2),

где Ае - оптическое поглощение при 412 нм в эксперименте,

Ас - оптическое поглощение при 412 нм в контроле системы при 70-80% гемолизе, среднее арифметическое из трех измерений, Асб - оптическое поглощение при 412 нм в контроле испытуемого образца

(только для окрашенных или светорассеивающих образцов). Аск - оптическое поглощение при 412 нм в контроле на спонтанный лизис эритроцитов.

Ни один из незаряженных полимеров не проявил активность. Среди протестиро-

J

ванных отрицательно заряженных веществ наиболее активными оказались следующие сульфо-полимеры: сополимер 4,4'-диаминобифенил-2,2'-дисульфокислоты и изофта-левой кислоты (ПАСК), сополимер 4,4'-диаминодифениламин-2-сульфокислоты, 4,4'-диаминобифенил-2,2'-дисульфокислоты и изофталевой кислоты (ПАСК/ПАСА), сополимер 4,4'-диаминостильбен-2,2'-дисульфокислоты, 4,4'-диаминобифенил-2,2'-дисульфокислоты и изофтатевой кислоты (ПАСК/ПАСЭ), сополимер 4,4'-диаминостильбен-2,2'-диеульфокислоты и изофталевой кислоты (ПАСЭ) (табл. 3). Главной отличительной особенностью структуры этих полимеров является жесткий ароматический скелет. Также наблюдался рост АА с увеличением молекулярной массы вещества. Отрицательно заряженные карбокси-полимеры показали в среднем вдвое меньшую активность при большей молекулярной массе.

Среди положительно заряженных полимеров наибольшую активность проявили полиэтиленимин и полиэтилвинилпиридиний бромид (ПЭВ1Т). Хитозаны, у которых расстояние между аминогруппами наибольшее среди проверенных полимеров, оказались наименее активными. В этом случае также наблюдалось увеличение активности с ростом молекулярной массы вещества.

Таким образом, исследования полимеров показали, что АА возрастает при увеличении длины полимера, при увеличении плоттгости заряда, а кроме того, положительное влияние оказывает присутствие жесткого гидрофобного скелета.

Таблица 3. АА ряда положительно и отрицательно заряженных полимеров.

Вещество Молекулярная масса, кДа Расстояние между заряженными атомами, им 1С?(>, мкг/мл 1С30, мМ элементарного звена

Отрицательно заряженные полимеры

Хитозансульфат1 200 0.68-1.72 37 0.1030

Декстрап сульфат 10 1.18-1.27 9.85 0.0372

ПАСЭ2 1.8-2.0 0.73-1.43 1.16 0.0043

ПАСК/ПАСА2 20-30 0.66-1.14 1.03 0.0034

Полиакриловая к-та 50-200 0.58 0.93 0.0129

Полиметакриловая к-та 200 0.55-0.63 0.89 0.0103

Поливинил сульфат 170 0.65-0.76 0.7 0.0043

ПАСК2 2 0.68-1.57 1.06 0.0041

ПАСК2 3 0.68-1.57 1.19 0.0046

ПАСК2 10 0.68-1.57 0.75 0.0029

ПАСК2 20 0.68-1.57 0.56 0.0022

ПАСК2 24 0.68-1.57 0.59 0.0023

ПАСК2 18-25 0.68-1.57 0.65 0.0025

ПАСК/ПАСЭ2 20-30 0.66-1.05 0.65 0.0025

Положительно заряженные полимеры

Хитозан1 8 0.37-0.68 200 1.0074

Хитозан1 23 0.37-0.68 25 0.1259

ПЭВП3 275 0.75-0.94 2.38 0.0111

ПЭВП3 1750 0.75-0.94 0.85 0.0040

Полилизин 70-150 0.41-0.54 0.7 0.0031

Полиэтиленимин 50 0.37 0.47 0.0109

1 - Синтезированы с.н.с., к.х.н. Ю.А. Федотовым, А/О Полимерсинтез, г. Владимир

2 - Получены в лаборатории д.х.н. В.П. Варламова, центр "Биоинженерия" РАН

3 - Получены в лаборатории проф. В.А. Изумрудова, MIT им. М.В. Ломоносова

2. Исследование механизма мотивирования гемолиза заряженными

субстанциями

2.1. Молекулярные мишени для заряженных полимеров

Для определения молекулярной мишени в качестве эффекторов были выбраны положительно заряженный нолиэтиленимин и отрицательно заряженная полиметак-рнловая кислота. Исследовалась первая стадия активации СК - образование комплекса между сенсибилизированными эритроцитами (RBC-IgG) и первым субкомпонентом первого компонента комплемента Clq (RBC-IgG—Clq). Были проведены три серии экспериментов, в которых эффекторы добавлялись таким образом, чтобы они могли взаимодействовать: либо одновременно и с RBC-IgG и с Clq (серия 1), либо только с RBC-IgG (серия 2), либо с комплексом RBC-IgG—Clq (серия 3). Все эксперименты проводили в веронал-мединаловом буфере рН7.4, в присутствии ионов Са2\ Mg*+ (VBS2+). В качестве источника Clq и комплемента использовали человеческую сыворотку в заранее подобранных разведениях. Использовавшийся реагент Rlq является человеческой сывороткой, истощенной по Clq,

В серии 1 эритроциты, сенсибилизированные кроличьимиантителами, сыворотку человека и полимеры инкубировали 15 мин при 30°С. В таких условиях может происходить образование комплекса IgG-Clq, однако дальнейшей активации каскада комплемента не наблюдалось. Отделенные центрифугированием эритроциты ресуспенди-ровали в VBS2+, добавляли реагент Rlq, инкубировали 30 мин при 37°С, центрифугировали и измеряли оптическую плотность супернатанта при 412 нм.

В серии 2 эксперимент проводили при тех же условиях, но вначале инкубировали только эритроциты, сенсибилизированные кроличьими антителами, и полимеры в исследуемых концентрациях. После центрифугирования эритроциты ресуспендирова-

ли в УВ82\ добавляли сыворотку и инкубировали 15 мин при 30°С. После второго центрифугирования эритроциты ресусиендировали, добавляли реагент инкуби-ровачи 15 мин при 30°С, центрифугировали и измеряли оптическую плотность супер-натанта.

В серии 3 эксперимент проводили по схеме второго метода, но меняли последовательность добавления исследуемых полимеров и сыворотки: на первом этапе к системе добавляли сыворотку, а после первого центрифугирования - исследуемые полимеры.

Таблица 4. Константы ингибирования (мкг/мл) в трех сериях экспериментов.

Вещество Серия 1 Серия 2 Серия 3

Полиэтиленимин 50±16 64±9 Нет ингибирования

Полиметакриловая кислота 26.5+3 Нет ингибирования Нет ингибирования

Таблица 5. Ожидаемые эффекты в случае связывания с вероятными мишенями.

Предполагаемые события Серия 1 Серия 2 Серия 3

Связывание с антителами + + -

Связывание с С1я в области глобулярной головки + - -

Связывание с коллагенонодобной частью СЦ + - +

+ Наблюдение ингибирования гемолиза исследуемым эффектором - Отсутствие ингибирования, лизис эритроцитов

При добавлении сыворотки к иммунному комплексу (сенсибилизированные эритроциты) в указанных условиях С^ присоединяется к Сц2-доменам иммуноглобулинов на эритроцитах, но дальнейшей активации не происходит. Последующее цен-триф)т иронапис удаляет все несвязавшиеся компоненты комплемента. Однако, если затем добавить к отмытым эритроцитам Шц и инкубировать при 37°С, остальные компоненты комплемента, находящиеся в ЯЦ, завершат активацию, что приведет к лизису эритроцитов. При добавлении к иммунному комплексу эффекторов, предотвращающих связывание на иммунном комплексе С1я, он удаляется при центрифугировании. Результаты, приведенные в табл. 4, показывают, что как положительно, так и отрицательно заряженные полимеры ннгибируют связывание С1ч с сенсибилизированными эритроцитами (серия 1), и это может происходить вследствие взаимодействия эффекторов либо с С1ц, либо с его "партнером" - иммуноглобулином. В серии 2 ингибировамие наблюдалось только положительно заряжешшм полимером, что свидетельствует о его взаимодействии с иммуноглобулинами. Следовательно, отрицательно заряженные полимеры взаимодействуют с СЦ. В серии 3 эффееторы добавля-

ли после формирования комплекса RBC-IgG—Clq. Отсутствие ингибирования указывает на то, что исследуемые полимеры не взаимодействуют с коллагеноподобной частью Clq, связанного в комплекс RBC-IgG—Clq.

Таким образом, было обнаружено, что положительно заряженный полиэтилени-мин и отрицательно заряженная полиметакриловая кислота имеют различные молекулярные мишени при ингибировании комплемент-зависимого гемолиза in vitro. Положительно заряженный полиэтиленимин взаимодействует с антителами (по-видимому, в области Сн2 домена), тем самым, препятствуя связыванию Clq с иммуноглобулинами и дальнейшей активации классического пути. Отрицательно заряженная полиметакриловая кислота взаимодействует с молекулой Clq и, возможно, блокирует сайты связывания на глобулярной головке Clq (табл. 5).

2.2. Зависимость активности низкомолекулярных эффекторов от структуры

молекул

Большинство исследованных нами заряженных полимеров очень активно инги-бировали комплемент-зависимый гемолиз. При этом их значения IC50 были достаточно близки. Однако весьма трудно предсказать, какие конформациопные изменения претерпевают макромолекулы при взаимодействии с белками, и какие заряженные атомы участвуют во взаимодействии. Также следует заметить, что структурное разнообразие доступных полимеров ограничено. По этой причине, а также с целью исключить возможность активации системы комплемента, которая часто приписывается таким полимерам, как тейхоевые кислоты, для изучения взаимосвязи "структура-свойства" мы синтезировали ряд низкомолекулярных эффекторов, различающихся по количеству заряженных групп, длине цепи, жесткости и гидрофобности спейсера между ними: 1,2-этандисульфокислоту, 1,5-дисульфо-З-оксанентановую кислоту, 1,4-бутиндисульфат, моно- и ди- сульфаты бисфенола А, моносульфат бстулиновой кислоты, дисульфат бетулина, моно-, ди,- трисульфаты холевой кислоты (рис. 6). Строение веществ подтверждалось с помощью 'Н-ЯМР-спектрометрии, а индивидуальность с помощью ТСХ, элементного анализа.

АА всех синтезированных и ряда коммерчески доступных веществ, переведенных в солевую форму, была определена в общей гемолитической системе, используемой для полимеров (табл. б). Наибольшую АА, приближающеюся к активности полимеров, проявили жесткие структуры с гидрофобным спейсером - дисульфаты бисфенола и бетулина (рис. 6). Расстояние между заряженными атомами у них составляет 1.3 - 1.4 нм. Моносульфаты описанных веществ проявили несравненно более низкую АА. Исходные бетулин, бетулиновая кислота и бисфенол А были неактивны.

Jf o o

_ CH3 _

CH3

a

CH,

njV* Uríj

Рис. 6. Синтезированные отрицательно заряженные эффекторы: а - моносульфат бисфенола А; б - дисульфат бисфенола А; в - моносульфат бетулиновой кислоты; г -дисульфат бетулина; д - moho-, ди- и трисульфаты холевой кислоты, где Ri, R2, R3 -сульфогруппы, либо Н; и протестированные положительно заряженные миорелаксан-ты: е - квалидил ; ж - диплацин ; з -ардуан.

Удачными объектами для изучения влияния длины спейсера на АА явились ди-карбоновые кислоты (табл. 6). Несколько максимумов АА (рис. 7), соответствующих расстоянию между зарядами 0.44, 0.89 и 1.14 нм, интерпретируется нами как следствие наличия ряда сайтов связывания на белкс-мишени. Введение полярных групп в полиметиленовую цепь резко уменьшает активность (например, янтарная и винная кислоты). Следует также отметить, что величина проявляемой АА также зависит от природы заряженной группы. Так, вещества, имеющие в своей структуре сульфогруп-

пы, оказались более активными, чем вещества с карбоксильными группами. Диамины проявили значительно меньшую активность, чем дикарбоновые кислоты, за исключением этилендиамина (расстояние между зарядами 0.38 нм близко к таковому у наиболее активной дикарбоновой кислоты). Протестированные четвертичные амины: ква-лидил, диплацин и ардуан (медицинские препараты группы миорелаксантов), показали умеренную активность.

Таблица 6. АА ряда положительно и отрицательно заряженных веществ.

Вещество Расстояние между заряженными атомами, нм 1С50, мМ

Сульфокислоты и сульфоэфиры

1,2-Этандисульфокислота 0.65 4.70

1,4-Бутиндисульфат 1.04 1.21

1,5-Дисульфо-З-оксапентановая кислота 0.98 2.70

4,5-Дигцдрокси-1,3-бензолдисульфокислота 0.76 0.83

1,5-Нафталиндисулфокислота 0.77 1.19

2-Нафтол-3,6-дисульфоки слота 0.74 1.01

Бисфенол А дисульфат 1.29 0.014

Бисфенол А моносульфат — 0.94

Бисфенол А — неактивен

Бетулиновая кислота — неактивен

Моносульфат бетулиновой кислоты 1.41 0.22

Дисульфат бетулина 1.45 0.015

Холевая кислота — 0.62

Моносульфат холевой кислоты 0.89-1.71 0.26

Дисульфат холевой кислоты 0.66-1.71 0.09

Трисульфат холевой кислоты 0.89-1.71 0.13

Дикарбоновые кислоты

Щавелевая кислота 0.36 1.87

Малоновая кислота 0.44 0.42

Янтарная кислота 0.51 1.54

Глутаровая кислота 0.66 2.30

Адипиновая кислота 0.71 1.45

Пимелиновая кислота 0.89 0.50

Субериновая кислота 0.94 1.05

Азелаиновая кислота 1.14 0.69

Себациновая кислота 1.17 25% при 4.9

Декандикарбоновая кислота 1.41 2.13

Трансакконитовая кислота 0.45-0.59 2.87

Винная кислота 0.57 4.23

Диамины

1,2-Диаминоэтан 0.38 0.63

1,3-Диаминопропан 0.49 4.62

1,4-Диаминобутан (путресцин) 0.59 5.84

1,5-Диаминопентан (кадаверин) 0.75 5.94

1,6-Диаминогексап 0.87 6.35

1,7-Диаминогептан 1.00 4.31

1,10-Диаминодекан 1.39 _А

Квалидил 0.90 3.18

Диплацин 1.22 2.55

Ардуан 1.48 >1.05

* - вещество индуцирует гемолиз

В цепях А, В и С молекулы Clq имеется несколько последовательностей, обогащенных положительно заряженными аминокислотами (цепь Л: 16-26, 78-92, 158163 и 197-201; цепь В: 81-92, 158-165; цепь С: 86-90, 156-160). Причем, сайты 16-26 и 78-92 находятся в коллагенподобном участке (последний находится непосредственно в месте перехода в глобулярную структуру). Известно, что ДНК модулирует активность комплемента, взаимодействуя с Clq. Участки взаимодействия были идентифицированы как: 14-26 и/или 76-92 цепи А (Н. Jiang et al, 1992). Геометрические параметры коллагеноподобныч цепей: расстояние между соседними аминокислотными остатками 0.3 нм, между каждой третьей аминокислотой - 1.2 нм, диаметр цепи 1.5 им (то есть расстояние между остатками, расположенных в разных цепях, в одном сечении -0.37 нм). Расстояние же между отрицательными зарядами в наиболее активных синтезированных нами эффекторах составляет: 1.36 нм для биссульфат бисфенола А и 1.4 нм для биссульфата бетулина. Для дикарбоновых кислот это расстояние: 0.44 нм для малоновой кислоты и 0.89 для пимелиновая кислоты. Таким образом, геометрические параметры наиболее активных молекул находятся в хорошем соответствии с параметрами возможной мишеней для них.

■♦— Дикарбоновые

кислоты С—Диамины

-1-1 i-1 i i-1 i-1-

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Количество атомов углерода в цепи

Рис. 7. Зависимость АА дикарбоновых кислот и диаминов от длины алифатического спейсера между зарядами.

Чтобы выявить количественную взаимосвязь "структура-АА" для гомологического ряда дикарбоновых кислот с длиной цепи от 2 до 9 атомов углерода, был проведен линейный регрессионный анализ (уравнение 3):

Act, = In

1

/С„

< А * + В * (Х2), +... + У * (Х'п), + D

(уравнение 3),

где АА для /-ой дикарбоновой кислоты числено выражена через Act,=log(WC5o);

Х1...Хп- переменные (дескрипторы), описывающие структурные и физико-

химические свойства рассматриваемых кислот; A,B,...Y, D - коэффициенты и свободный член регрессионного уравнения.

Выявление регрессии состояло в определении значений коэффициентов А,В,

...Y,D, при которых, вычисленные по регрессионному уравнению 4 значения Act,0

отличались от экспериментальных значений 1п(1ЛС5о), в наименьшей степени.

Act'' = Act, - V = А * (XI), + В * (Х2), +... + Y * (Хп), + D (уравнение 4),

где V - случайная перемеш1ая, включающая влияние неучтенных факторов -переменных, случайных помех и ошибок измерений.

В результате построения ряда моделей и оценки их адекватности нами были

выбраны следующие значимые структурные переменные: расстояние между гидро-

ксильными клслородами (R), расстояние между карбонильными кислородами (R2),

расстояние между карбонильными и гидроксильными кислородами (R3), логарифм

коэффициента распределения (logP), константа диссоциации (рКа). В табл. 7 приведе-

ны исходные физико-химические константы молекул, рассчитанные при помощи программ ACD 2.70 и HyperChem Pro 5.1, а также значения Act0, полученные при реше-

нии методом наименьших квадратов уравнения 4, принимающего вид: Лс(°= 1л|

Таблица 7. Исходные физико-химические константы молекул дикарбоновых кислот

|- F = -0.91 * Л +2.54* Л2 - 2.01* ЛЗ +1.53* log Р-0.69 */)А'а-2.90 ^равнение 5)

Длина к е п it К (ОН-ОП), А R2 (0-0),А R3 (О-ОН), А logP рКа ln(l/IC5o) Act0

2 3.57 3.58 2.80 -1.190 1.68 -5.65 -5.67

3 2.36 4.83 4.04 -0.650 3.22 -4.17 4.12

4 4.87 6.09 5.05 -0.590 4.55 -5.95 -6.08

5 4.74 7.37 6.29 -1.040 4.63 -6.04 -5.97

6 6.89 8.59 7.47 0.080 4.69 -5.72 -5.51

7 7.22 9.84 8.71 0.270 4.73 -4.65 -4.89

8 9.15 11.09 9.92 0.800 4.76 -5.19 -5.12

9 11.51 13.59 12.40 1.330 4.77 -5.08 -5.09

Для полученног о регрессионного уравнения 5 дисперсия составляет 99.39%, ошибка (остаточная дисперсия) - 0.36%. Хорошее совпадение экспериментальных и вычисленных значений АА видно также и на рис. 8.

__Длина иепи

1п(1/1С5о) Act"

Act

Рис. 8. Зависимость экспериментальной (ln(l/ICso)) и вычисленной по уравнению 5 (Act0) АА дикарбоновых кислот от длины углеродной цепи.

Найденные коэффициенты регрессионного уравнения 5 показывают, что существует положительная корреляция АЛ с logP (+1.53) и отрицательная корреляция АА с рКа (-0.69); другими словами, АА увеличивается с возрастанием гидрофобности дикарбоновых кислот и с увеличением силы кислотной группы.

выводы

1. Обнаружено, что высокомолекулярные субстанции (липосомы, частицы жировых эмульсий, полимеры), несущие отрицательные заряды, с расстояниями между зарядами в интервале 0.3+1.6 нм, обладают антигемолитической активностью.

2. Показано, что высокомолекулярные субстанции: липосомы, полимеры, содержащие первичные, вторичные амины или четвертичные аммониевые группы, также ингибируют комплемент-зависимый гемолиз.

3. Для ряда дикарбоновых кислот выявлено периодическое изменение антигемолитической активности. Максимумы антигемолитической активности соответствовали расстоянию между зарядами, 0.44, 0.89 и 1.14 нм. Этот результат интерпретирован нами как наличие на белке-мишени нескольких сайтов связывания, вероятно, в виде ряда положительно заряженных аминокислот.

4. В ряду а,со-диаминов с цепью из 2, 3, 4, 5, 7 и 10 атомов углерода, наибольшую антигемолитическую активность проявили этилендиамин и гептаметилендиамин (с длиной цепи 0.38 и 1.01 нм), причем активность диаминов ниже, чем активность дикарбоновых кислот.

5. Синтезированы несколько серий низкомолекулярных веществ, молекулы которых несут отрицательно заряженные группы и определена их антигемолитическая активность. Установлено, что наибольшую активность проявляют соединения с жесткой гидрофобной структурой и расстоянием между заряженными группами в интервале 1.1-1.2 нм. Также как и для полимеров, вещества с сульфогруппами более активны, чем вещества с карбоксильными группами.

6. С помощью метода разделения стадий активации системы комплемента показано, что молекулярной мишенью для отрицательно заряженных полимеров является Clq, вероятно глобулярные головки, а для положительно заряженных — иммуноглобулин, вероятно Сн2-домен.

7. Проведенные исследования показали, что существует довольно большая группа разнородных по химической структуре веществ, способных ингибировать комплемент-зависимый гемолиз. Найденные в работе закономерности взаимосвязи "структура-антигемолитическая активность", дают инструмент для ускорения поиска веществ с более высокой активностью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. О.О. Burdelev, А.Р. Kaplun, N.N. Ivanova, M.A. Maslov, G.A. Serebrennikova, V.l. Shvets. Charged Liposomes and Polymers Inhibit Haemolysis. // J. Liposome Res. -1998. V. 8, P. 46-47.

2. O.O. Burdelev, A.P. Kaplun, N.N. Ivanova, M.A. Maslov, G.A. Serebrennikova, V.l. Shvets. Inhibition of Complement-Dependent Haemolysis by Charged Liposomes and Polymers. 4th European Congress of Pharmaceutical Sciences, 11-13 September 1998, Milan, Italy. // Abstracts. P. 63.

3. А.П. Каплун, 0.0. Бурделев, Ю.Э. Андия-Правдивый. Модулирование активности комплемента заряженными субстанциями // Материалы 5 конференции "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана", Москва, 1999, С. 146-148.

4. О.О. Burdelev, А.Р. Kaplun, L.V. Kozlov. S.V. Lysakova. V.I. Shvets. Possible targets for binding of charged polymers and liposomes in antibodies activation of complement. Symposium on Lipid and Surfactant Dispersed Systems. 26-28 September 1999, Moscow, Russia. // Proceedings. 1'. 265-266.

5. A.I1. Каплун, 0.0. Бурделев, H.H. Иванова, Ю.М. Краснопольский, В.И. Швец. Ингибирование комплемент-зависимого гемолиза липосомами, содержащими це-реброзидсульфат. // Биоорган, химия. -2000. - Т. 26, №1. - С. 68-77.

6. Андия-Правдивый Ю.Э., Бурделев О.О., Цветкова Т.Н., Буреева С.В., Каплун А.Г1. Подходы к направленному конструированию ингибиторов активации комплемента // Материалы школы-конференции "Горизонты физико-химической биологии", Пуншно. 28.05-02.06.2000, Т. 1, С. 76.

Подписано в печать -С£. "^¿'¿Формат 60*90/16 Бумага офсетная Печать офсетная Уч. изд. л. 1,5 Тираж 80 экз. Заказ № 165.

ИПЦ МИТХТ им М.В. Ломоносова Пр. Вернадского-86