Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеолитическая и непротеолитическая модификация системы комплемента человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеолитическая и непротеолитическая модификация системы комплемента человека"

#

А V

^ На правах рукописи

%

СОЛОВЦОВА ИРИНА ЛЕОНИДОВНА

ПРОТЕОЛИТМЧЕСКАЯ И НЕПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена на кафедре биохимии (заведующий кафедрой - профессор И.Г.Щербак) Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова (ректор - академик МАН ВШ НАЯицкий).

Научный руководи эль: доктор медицинских наук, профессор И.Г.Щербак

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Е.Е.Дубинина

доктор медицинских наук В.Б.Васильев

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский Государственный университет

Защита состоится в "....." час._1997 года

на заседании диссертационного совета Д 001.23.01 по специальности 03.00.04 биохимия при НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН (Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12)

Автореферат разослан "....."__19Э7 года

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

Л.В.ПУЧКОВА

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ: Комплемент представляет собой многокомпонентную систему белков плазмы крови, играющую важную роль з иммунологической защите организма от чужеродных агентов. Помимо эсновных функций, каковыми считаются лизис чужеродных клеток и микроорганизмов, он выполняет и ряд других. В частности, принимает /частие в солюбилизации иммунных комплексов, регуляции проницаемости сосудистой стенки, процессах гемокоагуляции и клеточного иммунитета. Способность организма противостоять бактериальной, вирусной инфекции, а также противоопухолевый иммунитет в значительной степени зависят от состояния этой системы.

Активация комплемента может происходить посредством классического и альтернативного путей. Оба пути приводят к образованию <омплекснсй конвертазы и формированию мембраноатакующего комплекса и отличаются начальными этапами.

Патологические процессы, связанные с дефектами системы комплемента, фезвычайно многообразны. С улучшением методологии определения активированных компонентов в воспаленной ткани и биологических жидкостях список заболеваний, в патогенез которых вовлочена система <омплемента, растет. В настоящее время к ним отчосят не только системную красную волчанку, ночную пароксизмальную гемоглобинурию, ангионевротическмй отек, гломерулонефрит [Wilson М. et al., 1976; Colden 1 R., 1985], но и инфаркт миокарда, системный склероз, болезнь \льцгеймера , псориаз [Syed Shafi Asghar, 1995] и др. Многие микроорганизмы могут быть не только инициаторами каскада <омплемента, но и способны продуцировать малоспецифичные тротеиназы, действующие на белковые компоненты системы комплемента, приводя к модифицированию ее деятельности. Так, например, патогенные анаэробные микробы Clostridium histolyticum вырабатывают Коллагеназы, соторые при попадании в кровь могут воздействовать на компоненты сомплемента, имеющие в своей структуре коллагеноподобные фрагменты.

В современной комплементологии накоплено много сведений о механизмах взаимодействия белков системы комплемента друг с другом и : внесистемными белковыми и небелковыми молекулами. Однако, эолыиинство этих исследований проводилось на гемолитических системах, эеконструир'ованных из очищенных компонентов комплемента, а следовательно, без , учета тех взаимодействий, которые реально происходят в биологических жидкостях и приводят к функциональным юследствгям. 0

Применение новых методик [Щербак ИГ. и др., 1989; Рюмина Е.В. 1 др., 1:989], позволяющих оценивать состояние комплемента в условиях,

приближенных к физиологическим, дает возможность полунения новых знаний о состоянии системы комплемента и ее регуляции в норме и при патологии, в том числе при воздействии лекарственных препаратов, широко применяемых в клинической практике.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ: Целью работы было исследование регуляции системы комплемента сыворотки крови человека белковыми и небелковыми агентами в норме и при патологии .Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявление функциональных последствий воздействия на систему комплемента сыворотки крови человека коллагеназы микробного происхождения (Clostridium histolyticum).

2. Исследование влияния терапевтических доз гепарина на параметры активности комплемента по классическому и альтернативному путям.

3. Исслег ^еание состояния системы комплемента у больных псориазом и ее модификации под действием е-аминокапроновой кислоты.

4. Сравнительная характеристика влияния на систему комплемента антибиотиков различных рядов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Впервые обнаружено угнетение альтернативного пути активации комплемента (АПК) в результате обработки сыворотки крови человека коллагеназой. Получены новые данные о воздействии компонента C1q и продуктов его протеолиза коллагеназой на гемолитические параметры альтернативного пути активации комплемента. Впервые установлен двухфазный характер влияния гепарина на АПК сыворотки крови человека. Выявлена парадоксальная реакция на е-аминокапроновую кислоту комплемента сыворотки крови больных псориазом. Обнаружено, что пенициллиновые антибиотики, в отличие от цефалоспориновых, вызывают модификацию комплемента, выявляемую даже в терапевтических дозах и приводящую к угнетению классического пути активации комплемента (КПК),

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ: Выявленные особенности действия изученных модуляторов комплемента существенно расширяют и углубляют современные представления о регуляции альтернативного и классического путей его активации. Обнаруженные эффекты коллагеназы свидетельствуют о том, что протеопитическое расщепление самих компонентов комплемента мож^т быть источником новых регуляторов этой системы. В соответствии с развиваемой в последние годы оригинальной концепцией порогового принципа рефляции протеоЛитических систем [Щербак И.Г.,1997] пороговые звенья не могуг быть незыблемыми, а являются, как правило, объектами для регуляторных воздействий. Данная работа дает новое экспериментальное подтверждение этой концепции. Результаты исследования показывают относительность понятия "ингибитор

системы комплемента". Так, общеизвестный ингибитор гепарин оказывается активатором каскада при низких (терапевтических) концентрациях.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ: Непосредственное прикладное значение имеют полученные данные о характере воздействия ряда медикаментозных средств на комплемент. Угнетение КПК антибиотиками пенициллинового ряда может быть причиной снижения защитных сил организма, что необходимо учитывать при назначении и проведении антибактериальной терапии. Обнаруженные в работе эффекты е-аминокапроновой кислоты в отношении системы комплемента у больных псориазом целесообразно использовать при патогенетическом обосновании лечения этим препаратом. Микробные, равно как и активированные тканевые коллагеназы могут приводить к угнетению как классического, так и альтернативного путей активации комплемента, что обусловливает необходимость проведения лабораторной оценки состояния системы комплемента у соответствующих групп больных.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ следующие основные положения:

1. Выявлено инактивирующее действие коллагеназы не только на КПК, но и на АПК. Угнет ние АПК происходит, скорее всего, под действием продуктов гидролиза С1д коллагеназой.

2. Обнаружен двухфазный характер ответа комплемента на различные дозы гепарина.

3. Установлено, что направленность действия е-аминокапроновой кислоты на гемолитическую емкость комплемента зависит от исходного состояния системы.

4. Показано, что антибиотики цефалоспоринового ряда не влияют на показатели активности комплемента, а производные пенициллина ингибируют КПК даже в терапевтических концентрациях.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на VI Биохимическом съезде (Санкт-Петербург. 1992), на конференции молодых физиологов и биохимиков России "Биохимические и биофизические механизмы физиологической регуляции" (Санкт-Петербург, 1995), 2 съезде Всероссийского биохимического общества (Москва, 1997).

ВНЕДРЕНИЕ. Разработанные методы внедрены и используются в практике научных исследований и в учебном процессе" на кафедре биохимии Санкт-Пегербургского Государственного медицинского Университета имени акад.И.П.Павлова и могут быть рекомендованы к внедрению в научных учреждениях, занимающихся исследованием системы комплемента (ЦНИИ гематологии и переливания крови (Москва|, Кировский НИИ гематологии и переливания крови МЗ РФ, НИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург)).

б

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена иг /¿2 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзоре литературы, описания материалов и методов исследования, результата исследования и их обсуждения, общего заключения и выводов; включает 13 таблиц, 4 рисунка и список литературы, содержащий 179 источников, е том числе 161 зарубежный.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследований использовали сыворотку кровь здоровых доноров а также больных из клиник СПбГМУ им. акад И.П.Павлова. Для определения состояния классического пути активации комплемента готовили реагент, дефицитный по фактору D алыернативногс пути (RD) методом ионообменной хроматографии [Л.В.Козлов Л. Ф. Со ля ков, 198_j. Для регистрации активности альтернативного путь использовали 5тМ ЭГТА (этиленгликоль-р,р'(аминоэтиловый эфир M.N.M'.NJ' тетрауксусной кислоты тетранатриевую соль), избирательнс хелатирующий ионы кальция, необходимые для КПК. Мишенью дл; действия комплемента служили эритроциты кролика и баран; (сенсибилизированные ' и несенсибилизированные). В инкубационнук смесь, содержащую источник, комплемента и мединаловый буфер (рН=7.2) добавляли стандартное количество эритроцитов (0.72 или 1.8 млн. клеток) Все эксперименты проводили в термостатируемой кювет! спектрофотометра (37°С). Процесс лизиса регистрировали по убь-п оптической плотности при 800 нм. Определяли индукционный период комплементэависимого гемолиза (lag-t),a также скорость лизиса (Мл), ка; тангенс угла наклона кривой гемолиза в месте ее перегиба [Халяпин В.Д, Прокопьев A.A., 1986]. Кроме того, определяли новый показатель разработанный не кафедре биохимии СПбГМУ им.акад. И.П.Павлов; [Щербак И.Г. и др., 1989] - гемолитическую емкость комплемента (ГЕК) отражающий количество функционально активного комплемента.

Для определения активности отдельных компонент комплемента получали реагенты, дефицитные по соответствующую компонентам, с использованием методов избирательной инактивацт [Козлов Л.В. и др., 1983; Рюмина Е.В. и др., 1992].

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ВЛИЯНИЕ КОЛЛАГЕНАЗЫ НА АКТИВНОСТЬ КОМПЛЕМЕНТА СЫВОРОТКИ

КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Протеолитические ферменты выполняют с организме важные функции, обеспечивая образование и инактивацию биологически активны* веществ белково- пептидной природы. Эти ферменты участвуют и в

деструктивных процессах при заболеваниях различной этиологии. Некоторые патогенные микроорганизмы вырабатывают малоспецифичкы*: коллагеназы, которые, попадая в кровь, оказывают воздействие м холлагеноподобные белки плазмы,

Из числа компонентов комплемента только белки КПК Clq и МБР имеют в своей структуре коллагеноподобные сегменты. Можно было предположить, что при контакте коллагеназы- с сывороткой крови образуется гемолитическая система, избирательно лишенная возможности активации по КПК в условиях ее естественного окружения. Применение такой гемолитической системы в качестве реагента RC1q, дефицитного по C1q, могло бы иметь практическое значение для исследования активности этого субкомпонента. !

Сыворотку здоровых доноров предварительно инкубировали в течение 30 мин при 37°С с коллагеназой Clostridium histolyticum в соотношении 0.5 мг коллагеназы на 1 мл сыворотки. Затем с помощью кинетического метода определяли гемолитическую активность комплемента в отношении эритроцитов кролика и барана.

Результаты определения lag-t, V/i и ГЕК приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Влияние f коллагеназы на показатели гемолитической активности комплемента в отношении зритроцитоа кролика (Э.К.) и барана (Э.Б.) (п=6).

НЧС - нормальная человеческая сыворотка (30 мин инкубации, 37°С); (ПЛ).

КЧС - человеческая сыворотка, инкубированная с коллагеназой в соотношении 0.5мг/1мл (30 мин инкубации, 37°С)

Гемолит.

показатели lag-t, с V/1 ГЕК

Гемолит. (мпн.эр./мин) (млн.эр./мл)

система

Э.К. НЧС 14.0 15.0 40.6 110.7 72,0 - 10,8

КЧС 150.0 ±46.0 4.1 ±0.9 23,4 + 9.0

Э.Б. НЧС 60.0 * 20.0 34.6 - 9.3 57,6 * 5,2

КЧС 0 0 - 0

Из данных таблицы видно, что предварительная инкубация с коллагеназой приводила к значительному г давлению активности комплемента, несмотря на мощный антикоплагеназный потенциал сыворотки. Отсутствие лизиса эритроцитов барана сывороткой, обработанной коллагеназой, свидетельствует о полном блокировании КПК, так как эритроциты барана способны инициировать только этот путь.

Гемолитические характеристики активности комплемента в отношении эритроцитов кролика также претерпевали значительные изменений под воздействием коллагеназы. Можно было бы предположить, что лизис происходил только с участием АПК, но для АПК характерно ускорение процесса при добавлении последующей порции эритроцитов. Под воздействием же сыворотки, обработанной коллагеназой, вторая порция эритроцитов практически не лизировалась. Возникло предположение, что обработка сыворотки коллагеназой приводит к изменениям и в АПК.

Активность АПК оценивали по скорости лизиса эритроцитов кролика в присутствии ЭГТА-мединалового буфера. Результаты экспериментов приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Влияние коллагеназы на 1 показатели гемолитической активности комплемента по АПК, измеряемые в присутствии 5 мМ ЭГГА (п=6 ), (гг^сг). НЧС - нормально человеческая сыворотка (30 мин инкубации, 37°С);

КЧС - человеческая сыворотка, инкубированная с коллагеназой в соотношении 0.5мг/1 мл (30 мин инкубации, 37°С). _

Гемолитические показатели 1ад-1, с Уы (млн.эр./мин) У2л, (млн.эр./мин) ГЕК (млн.эр./мл)

НЧС 150 ±46 5.4 ± 1.7 14.2±08 81,0 4 14,4

КЧС 713 * 115 2.4 * 0.8 4.6 ± 2.6 54,0 1 10.8

Как видно из таблицы, под действием коллагеназы происходило значительное снижение и скорости лизиса эритроцитов кролика по АПК, и величины ГЕК, тогда как 1ад-период увеличивался почти в 5 раз. Это могло быть следствием замедления сборки конвертазы альтернативного пути под воздействием продуктов гидролиза коллагеназой сывороточных белков, либо результатом взаимодействия этих продуктов с компонентами АПК.

Следует отметить, что скорость лизиса первой порции эритроцитов кролика сывороткой, обработанной коллагеназой, в присутствии ЭГТА, была практически такой же, как и в отсутствие последнего, однако в системе с ЭГТА наблюдался ускоренный лизис второй порции эритроцитов и величина ГЕК была больше почти в 3 раза. Полученные данные можно объяснить тем, что в присутствии ЭГТА происходит инактивация коллагеназы, так как для проявления активности ей необходимы ионы кальция. В отсутствие же ЭГТА, коллагеназа продолжает проявлять свою активность в реакционной смеси и оказывать все больший инактивирующий эффект на АПК. Это предположение подтверждается результатами экспериментов по сыявлению зависимости

степени угнетения АПК от времени инкубации сыворотки крови здоровых доноров с коллагеназой, взятой в соотношении 0.5 мг коллагеназы на 1 мл сыворотки. Инкубация в течение 10 минут не отражалась на активности АПК, 30-ти минут - вызывала угнетение активности на 50%, через 60 мину| сыворотка была инактивирована по АПК полностью.

С целью выяснения механизма действия коллагеназы на АПК к реагентам, дефицитным по компонентам альтернативного пути СЗ и В добавляли в присутствии ЭГТА-мединалового буфера разные количества сыворотки в качестве источников компонентов СЗ и В. Сыворотка была предварительно инкубирована с коллагеназой в соотношении 1мл/1мг а течение 30 минут при 37°С. При этом выявлено отсутствие зависимости степени ингибирования скорости лизиса эритроцитов кролика и ГЕК от количества прибавляемой сыворотки, обработанной коллагеназой. Время инкубации сыворотки с коллагеназой одинаково влияло на степень угнетения Ул по АПК, независимо от того, по какому компоненту был дефицитен реагент (СЗ или В). Инкубация в течение 15 минут приводила к уменьшению Ул на 15%, 30 минут - на 50%.

Из полученных данных следует, что при обработке сыворотки крови человека коллагеназой образуется ингибитор АПК, причем этот ингибитор не взаимодействует непосредственно с компонентами альтернативного пути СЗ или В.

Известно, что избыточные количества интактно! о С1 ч ингибируют гемолиз эритроцитов кролика по АПК НзЬе^оп, е1 а1., 1987], причем ингибирование осуществляется на уровне образования конвертазы АПК ( СЗЬВЬ). Возникало предположение, что продукты гидролиза С1р коллагеназой являются еще болев сильными ингибиторами этого процесса.

Возможность появления ингибь зра АПК в результате гидролиза коллагеназой других коллагеноподобных сывороточных белков маловероятна, так как сывороточные конь, нтрации с лх белков чрезвычайно малы в сравнении с концентрацией С1ц. Ввиду того, что эффект ингибирования АПК был устойчивым и достаточно сильным, источником ингибитора АПК, скорее всего, являлся продукт гидролиза С1д.

С цель» подтверждения этого предположения было исследовано влияние дополнительных количеств С1ч, обработанного коллагеназой, на параметры АПК.

Препарат очищенного С1р, полученного с помощью аффинной хроматографии на 1дв-сефарозе в НИИ ОЧБП, инкубировали с коллагеназой 30 мин при 37°С в соотношении 5:1 в мединаловом буфере (рН=7.4; 2глМ СаС1г). Полнота переваривания С1д коллагеназой была подтверждена данными диск-электрофореза в ПАГ.

Результаты исследования влияния возрастающих количеств гидролизованного С1ч и интактного С1ц на Ул эритроцитов кролика по АПК представлены на рисунке 1.

[С1р],мг/мл сыв.

Рис.1. Влияние избыточных количеств интактного С1р ( о ) и С1ч, гидролизованного коллагеназой ( а), на скорость лизиса эритроцитов кролика по АПК.

Пороговая концентрация, при которой С1ч не вызывал угнетения АПК сыворотки, колебалась от 0.5 до 0.8мг/мл и совпадала с величиной порога для гидролизованного С1ч. Наличие порога возможно объяснить содержанием в сыворотке внекаскадных белков, обладающих достаточно высоким сродством к Концентрации от 1.1 до 2 мг/мл оказались достаточными для 50%-ного ингибирования, а концентрация 5мг/мл вызывала полное ингибирование АПК. Из рисунка видно, что в надпороговых концентрациях гидролизованный С1й оказывал значительно больший ингибирующий эффект на АПК. Следовательно, гидролиз С1д коллагеназой приводит к образованию ингибитора АПК, еще более сильного, чем сам интактный С1 д. Пг^дположительно, действующим началом в отношении АПК явлготся фрагменты глобулярных "головок" С1ч, образующихся в результате его гидролиза коллагеназой.

ВЛИЯНИЕ ГЕПАРИНА НА АКТИВНОСТЬ СЫВОРОТОЧНОГО КОМПЛЕМЕНТА.

Гепарин является одним из наиболее изученных эффекторов комплемента. Однако, не все возможные механизмы влияния этого антикоагулянта на комплемент являются существенными и реально имеют

место в сыворотке крови. С целью установления стадий активации комплемента, наиболее чувствительных к воздействию гепарина, было исследовано его влияние на показате 1и состояния комплемента сыворотки крови человека. Результаты определения влияния гепарина на гемолитические характеристики АПК представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Показатели активности АПК сыворотки крови человека (в % к контролю, п=5) *р<0.001. ___■

Концентрация lag-период V лизиса ГЕК

гепарина (гт^ст) (т1^) (гг^ст)

(ед/мл)

0.25 75 ± 7 149 1 8 100*5

0.5 100*5 114 4 5 100 4 7

1.0 108 4 5 98 1 10 100 4 9

5.0 134 * 22* 96 4 12 98 4 1С

Из данных таблицы видно, что наименьшая из исследованных концентраций (0.25 ед/мл) не только не оказывала ожидаемого ингибирующего воздействия на АПК, но и вызывала отчетливое ускорение комплементзависимого гемолиза с реципрокным снижением lag-t. Имеются данные о том, что снижение lag-периодэ по АПК в наибольшей степени зависит от активности фактора D [Л.В.Гапебская,. 1996]. По-видимому, активирующий эффект гепарина обусловлен его взаимодействием с фактором D. Наше предположение об активации фактора D малой дозой гепарина впоследствии было подтверждено и доказано [Keil L.B. et al.. 1995]. В диапазоне концентраций гепарина от 0.5 до 1 ед/мл наблюдались пишь незначительные изменения величин lag-периода и скорости лизиса, вероятно, вследствие того, что ускоряющие и замедляющие механизмы действия гепарина на АПК уравновешивали друг друга. Значительное увеличение 1ад-периода под действием максимальной терапевтической дозы гепарина (5 ед/мл) могло являться проявлением замедления сборки конвертазы альтернативного пути. Вместе с тем увеличение 1ад-периода -в данных условиях, видимо, не достигало того критического уровня, превышение которого способно повлиять на снижение скорости лизиса.

Эритроциты барана являются инициаторами только классического .пути активации комплемента. Однако, в ходе его активации происходит "подключение" альтернативного пути, то есть наблюдается явление амплификации. Результаты исследования влияния гепарина на параметры комплементзависимого лизиса несенсибилизированных и предварительно сенсибилизированных эритроцитов барана представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Влияние гепарина на показатели активации комплемента сыворотки крови человека в отношении эритроцитов барана (в % к контролю, п = 7) *р< 0.001_____

Концентра- Сенсиби-

ция лизация lag-период V лизиса ГЕК

гепарина .зитро- (01*0) (т*а) (т*я)

(ер/мл) цитов

0.5 - 100 1 5 101 * 31 100*16

1.0 - 109*15 88* 11* 123* 19*

2.5 - 119*23 71 * 15* 141 * 23*

5.0 - 134*33 55 * 12* 161 * 24*

5.0 + 128*36 54*7* 134* 10*

Как видно из данных таблицы 4, гепарин оказывал выраженное . дозоэависимоэ угнетение лизиса эритроцитов барана. Влияние гепарина существенно но зависело от степени сенсибилизации эритроцитов и проявлялось в умен! :^ении скорости лизиса при реципрокном повышении гемолитической емкости. На первый взгляд, минимальные дозы гепарина не влияли на скорость лизиса эритроцитов барана. Но на самом деле отсутствие такого эффекта является кажущимся, так как увеличение скорости лизиса в некоторых индивидуальных сыворотках в присутствии 0.5 ед/мл гепарина наблюдалось отчетливо. На рисунке 2 показана различная реакция КПК на малую дозу гепарина (0.5 ед/мл) на примере двух индивидуальных сывороток.

Концентрация гепарина (ед/клл)

Рисунок 2. Зависимость скорости лизиса эритроцитов барана от концентрации гепарина для двух индивидуальных сывороток.

Таким образом, наиболее значительные и зависимые от дозы (1 ед/мл и выше) изменения, связанные с присутствием гепарина, наблюдались со стороны компле иентзависимого лизиса эритроцитов барана, то есть инициаторов классического пути. В КПК звеньями, чувствительными к ингибирующему действию гепарина, могли быть процессы формирования и функционирования С1 и/или сборка амплификационной конвертазы. Для выяснения наиболее чувствительного звена было изучено воздействие гепарина на реагент ВО, то есть сыворотку, дефицитную по компоненту альтернативного пути - фактору О. Результаты одного из ряда аналогичных опытов представлены на рисунке 3.

ГЕК (в %)

Рисунок 3. Зависимость скорости лизиса эритроцитов барана и гемолитической емкости реагента РТО от концентрации гепарина.

В препарате ЙО, в котором невозможна амплификация из-за отсутствия компонента альтернативного пути, гепарин, точно так же, как. и б интактной сыворотке, вызывал дозозависимое снижение скорости лизиса и увеличение гемолитической емкости. Необходимо отметить, что увеличение скорости лизиса эритроцитов барана в присутствии малых доз гепарина но наблюдалось ни в одном из исследованных препаратов ИО. Этот факг явился еш,е одним подтверждением роли АПК в процессе

усиления активации сывороточного комплемента низкими концентрациями ; Опарина.

ИССЛЕДОВАНИЯ МОДИФИКАЦИИ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА ПРИ ПСОРИАЗЕ

Поданным литературы, система комплемента играет важную роль в механизме повреждения клеток кожи при ncopMa3e[Takematsu et al., 1990]. В связи с эIим представляло интерес исследовать состояние системы комплемента у больных псориазом, а также оценить влияние на ее активность с-аминокапроновой кислоты, как эффектора комплемента.

В сыворотке крови больных псориазом и здоровых доноров определяли показатели состояния системы комплемента: скорость комплементзависимого лизиса эритроцитов барана, гемолитическую емкость и индукционный период.

Результаты экспериментов показали, что у больных псориазом скорость лизис? эритроцитов барана существенно выше, чем у здоровых доноров. Это может указывать на ускорение процессов сборки и функционирования L; и/или конвертазы КПК. Можно предположить, что обнаруженное нами увеличение активности КПК связано с преобладанием у больных псориазом гемолитически более эффективной формы С4 (С4В), характерной для этого заболевания [Torii Н. el al., 1992 и Nakagava Н., et al., 1991]. Гемолитическая емкость в сыворотке больных, напротив, была снижена почти на 30%, по сравнению с нормой., хотя по данным литературы [Rosenberg E.W. et al., 1990] в плазме крови больных псориазом, уровни компонентов комплемента, определяемые иммунологическими методами, соответствуют норме или даже превосходят ее. Снижение ГЕК. которая характеризует количество функционалчю активного комплемента, может быть следствием блокирования комплемента какими-либо компонентами плазмы. Мы предположили, что возможной причиной снижения ГЕК является наблюдающееся у больных псориазом повышение сывороточного уровня аг-макроглобулина (аг-ГИ) [Toruniova В., 1 32). Дпя проверки этого предположения были проведены эксперименты с аг-М,

иммобилизированным на сефарозе (CL-4B).Сыворотку крови здоровых доноров пропускали в циклическом режиме через г-элонку, заполненную иммобилизированным аг-М в течение 5-30 минут. В качестве контроля использовали колонку, наполненную сефароэой (CL-4B) В контрольных и опытных пробах определяли величину ГЕК. Во всех проведенных экспериментах (п=5) выявлено значительное (на 40-70% ( снижение ГЕК, что указывает на связывание аг-макроглобулином • комплементных белков. Эти данные позволяют предпоожить блокирвание, части белкоз комплемента избытком аг-М у больных псориазом.

Важным элементом патогенеза псориаза является поражение клеток кожи комплексами мембранной атаки комплемента. Поэтому ингибиторы комплемента могут обладать лечебным действием при обострениях псориатического процесса. Нами было исследовано влияние одного из ингибиторов, е-аминокапроновой кислоты (е-АКК), на показатели активности комплемента. Результаты экспериментов представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Показатели активности комплемента в отношении эритроцитов барана (в % к контролю) здоровых доноров (НЧС) и больных псориазом (ПЧС) в присутствии 0.38 ммоль/мл е-АКК (т*ст, п=8). _

1асИ V,, ГЕК

НЧС 150 * 15 73*23 74*10

ПЧС 115*10 84*19 120 * 16

Из данных таблицы видно, что е-АКК вызывала увеличение 1ад-периода и уменьшение скорости комплеменгзависимого гемолиза как у здоровых доноров, так и у больных псориазом. . Это указывает на первоочередное воздействие е-АКК на КПК и позволяет обосновать терапевтическое действие препарата, как средства, защищающего собственные клетки ст повреждения комплементом. Вместе с тем, необходимо отметить парадоксальную реакцию на е-АКК со стороны ГЕК здоровых доноров и больных псориазом. В то время, как в донорских сыворотках наблюдалось выраженное уменьшение ГЕК под действием е-АКК, в большинстве сывороток больных псориазом ГЕК увеличивалась. Объяснить этот феномен на данном этапе не представляется возможным, необходимы дальнейшие исследования.

ВЛИЯНИЕ АНТИБИОТИКОВ НА КОМПЛЕМЕНТ

В настоящее время антибиотики широко применяются в клинической практике для борьбы с инфекционными агентами. Поскольку комплемент является важнейшим эндогенным антимикробным фактором, терапия антибиотиками не должна отражаться на его статусе. В качества объектов исследований были выбраны полусинтетические пенициллины • производные 6-аминопенициллановой кислоты - ампициллин и бензилпенициллин (калиесэя соло), а также антибиотик из группы цефалоспоринов - цефазолин (натриевая соль), являющийся производным 7-аминоцофа^оспорановой кислоты.

Результаты исследований влияния антибиотиков на гемолитические показатели сывороточного комплементе, знорсвых доноров представлены в таблице 6.

Как видно из таблицы, цефазолин практически не оказывал воздействия на активность сывороточного комплемента. Даже доза цефазолина, превышающая в 20 раз его среднюю терапевтическую концентрацию, не вызывала изменений гемолитических характеристик комплемента. Вместе с тем, производные пенициллина уже в терапевтических дозах вызывали изменение показателей активности комплемента сыворотки крови в отношении эритроцитов барана. Их действие проявляло J в реципрокном изменении показателей активности сывороточного комплемента в отношении эритроцитов барана, а именно в увеличении 1ад-периода сопровождающемся уменьшением скорости гемолиза и ГЕК. Такие изменения характерны для нарушения функционирования комплекса С1 КПК.

. Таблица 6.

Влияние антибиотиков на показатели гемолитической активности комплемента в отношении эритроцитов барана и эритроцитов кролика (в % к контролю, т±ст). п=5, концентрация антибиотиков в инкубационной

Название антибиотика "»ритроциты барана Эритроциты кролика

1асИ Уп ГЕК 1асИ Ул ГЕК

Ампициллин 132*10 62*8 85*6 100*10 86*10 97*4

Бензилпе-нициллина калиевая соль 116*8 _ 86*10 89*11 100*10 84*6 92*5

Цефазолина натриевая соль 99*5 115*10 100*0 100*10 99*2 100*0

При сравнении изменений гемолитических показателей комплемента под действием ампициллина в це оной сыворотке и в РЮ (где возможен только КПК), обращало на себя внимание более выраженное уменьшение скорости шзисз эритроцитов барана и ГЕК в препаратах РЮ. В то время как в сыворотке скорость гемолиза уменьшалась в среднем на 18% (как видно из данных таблицы), в ЯР скорость гемолиза уменьшалась на 40-48%. ГЕК в цельной сыворотке был снижен на 15%, а в ЯР на 3337%. Таким образом, очевидно, что ампициллин действует только на КПК.

Наблюдаемое в наших экспериментах уменьшение величины ГЕК (в отношении эритроцитов барана) под действием пенициллиновых ''антибиотиков на^рдит на мысль о их возможном взаимодействии не только

с С1, но и другими компонентами КПК. Обнаруженный нами факт ингибирования комплемента антибиотиками пенициллинового ряда имеет большое практическ1 з значение, т к. применение этих препаратов может привести к ослаблению защитных сил организма. Отсутствие влияния на активность комплемента цефалоспориновых антибиотиков выявляет еще одно их преимущество перед производными пенициллина.

ВЫВОДЫ

1. Обработка сыворотки крови человека коллагеназой приводит к значительному ингибированию альтернативного пути активации комплемента. Показано, что этот эффект осуществляется продуктами протеолиза С^-компонента классического пути комплемента.

2. Ингибирующее действие компонента С1р и продуктов его протеолиза коллагеназой в отношении альтернативного пути активации комплемента проявляется только при превышении определенного концентрационного порога. Несмотря на одинаковую величину порога, продукты коллагьназного переваривания С1ц являются значительно более мощными ингибиторами альтернативного пути, чем интактный С1д,

3. Наряду с известным ингибирующим эффектом гепарина в отношении комплемента, впервые выявлена активация альтернативного пути в присутствии малых доз гепарина (0.25-0.5 ед/мл), обусловленная, вероятно, его взаимодействием с фактором й.

4. Гемолитическая емкость комплемента, отражающая полный потенциал системы, отчетливо возрастает под действием терапевтических концентраций гепарина, что свидетельствует об "экономном" расходовании компонентов комплемента.

Я В сыворотке крови больных псориазом обнаружена . повышенная активность классического пути комплемента. е-Аминокапроновая кислота оказывает парадоксальное действие на комплемент больных псориазом, вызывая не уменьшение, а увеличение гемолитической емкости комплемента.

6. Производные пенициллина даже в терапевтических дозах вызывают угнетение классического пути активации комплемента, в то время как цефалоспориновые антибиотики не оказывают влияния на гемолитические характеристики комплемента сыворотки крови человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Галебская Л.В., Щербак Л.Д., Герус А.И., Рюмина Е-В., Соловцова И.Л. Новые показатели состояния комплемента при обследовании больных бронхиальной астмой. - в сб. науч. тр. I ЛМИ

им.акад.И.П.Павлова: Актуальные проблемы пульмонологии (ред. -Г.Б.Федосеев)//Спб.: 1991, С. 37-40.

2. Галебская Л.В., Герус А.И., Рюмина Е.В., Соловцова И.Л., Сологуб Г.Н., Щербак И.Г. Адаптационные изменения со стороны комплемента у гематологических больных,- в сб. науч. тр. СПб,'Л И им.акад И.П.Павлова: Системные аспекты патологии // СПб.: 1991, С. 1213.

3. Галебская Л.В., Бельтюков П.П., Рюмина Е.В., Соловцова И.Л., Щербак И.Г. Концентрационно-функциональные взаимоотношения в альтернативном пути комплемента человека// Биохимия. 1993. Т.58. N 11. С. 1796-1800.

4. Галебская Л.В., Щербак И.Г., Соловцова И.Л. Способ определения реактивного лизиса. Заявка N 95110352/14 от 14.07.95. Положительное решение от 17.03.97.

5. Соловцова И.Л., Соловьев А.В. Двойственность воздействия гепарина на комплемент. Тезисы доклада. Конференция молодых физиологов и биохимиков России "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций" // Спб.: 1995, с.172.

6. Галебская Л.В., Соловцова И.Л., Рюмина Е.В., Щербак И.Г. Функциональные проявления воздействия гепарина на комплемент человека // Вопросы мед. химии. 1997, т.43. N 1.