Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция и саморегуляция альтернативного пути активации комплемента

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция и саморегуляция альтернативного пути активации комплемента"

и Г !3 л Л » ) 0

На правах рукописи

ГАЛЕБСКАЯ Людвига Вячеславовна

РЕГУЛЯЦИЯ И САМОРЕГУЛЯЦИЯ АЛЬТЕРНАТИВНОГО ПУТИ АКТИВАЦИИ КОМПЛЕМЕНТА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученом степени доктора медицинских наук

Специальность 03.00.04 - биохимия

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена на кафедре биохимии (заведующий кафедрой - профессор И.Г.Щербак) Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им.акад.И.П.Павлова (ректор - академик МАН ВШ Н.А.Яицкий).

Научный консультант: профессор И.Г.Щербак

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАМН, профессор В.С.Гайцхоки

доктор биологических наук, профессор Е.П.Комов

чл.-корр. МАН ВШ, д.м.н., профессор Л.А.Данилова

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский Государственный университет.

Защита состоится в "//" час. и^аУ 1996 года ■на заседании диссертационного совета Д 001.23.01 по специальности 03.00.04 - биохимия при НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова,12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН (Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12)

Автореферат разослан "IV" и^лл_1996 года

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

Л.В.ПУЧКОВА

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы связана с важной ролью системы комплемента в реализации реакций иммунитета. Комплемент осуществляет цитолиз микроорганизмов, клеток, трансформированных вирусами или другими агентами, участвует в солюбилизации иммунных комплексов и в регуляции клеточного иммунитета. В связи с этим устойчивость организма к бактериальной и вирусной инфекции, а также состояние противоопухолевого иммунитета во многом зависят от состояния этой системы. Вместе с тем, комплемент может стать и фактором альтерации собственных клеток организма и таким образом участвовать в патогенезе многих заболеваний.

К настоящему времени достигнуты большие успехи в изучении строения компонентов комплемента и их биохимических свойств. Имеется много сведений о механизмах взаимодействия белков системы друг с другом и с внесистемными белковыми и небелковыми молекулами. Вместе с тем, далеко не все взаимодействия, наблюдаемые при работе с очищенными белками, реально происходят в биологических жидкостях и проявляются на функциональном уровне. Именно этот аспект фундаментальной проблемы регуляции комплемента практически не исследован. Несоответствие между высоким уровнем знаний о строении и свойствах компонентов комплемента и фрагментарными

представлениями о саморегуляции и регуляции системы в целом обусловлено тем, что в комплементологии до настоящего времени используются примитивные функциональные тесты, основанные на регистрации степени комплементзависимого гемолиза. Кроме того, описанные в литературе биохимические подходы к изучению комплемента не включают анализа процесса его активации как мультиферментной системы. Разработка и развитие энзимологических подходов представляются весьма перспективными в плане получения новых знаний об особенностях саморегуляции и регуляции протеолитической системы комплемента и могут дать новую существенную информацию о функционировании механизмов иммунологической защиты. Из двух

путей активации комплемента наименее изучен альтернативный (АПК). В частности, не решены

вопросы о ключевых звеньях и специфических эффекторах процесса, о том, какие из белок-белковых '■ взаимодействий являются существенными для функциональных проявлений. Исследование АПК является актуальным еще и потому, что этот путь является универсальным эффектором, реагирующим на попадание в организм чужеродных объектов (как биологических, так и небиологических), трансформацию собственных клеток и активацию классического пути (КПК) .Вместе с тем, функциональные исследования АПК явно недостаточны. Настоящая работа предполагает восполнить пробел в представлениях о регуляции АПК в условиях, приближенных к физиологическим.

Целью работы явилось выяснение функциональных проявлений регуляции и саморегуляции альтернативного пути активации комплемента человека на основе разработки и применения энзимологических подходов и критериев.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать адекватные методы исследования функционального состояния комплемента и активности отдельных факторов АПК.

2. Исследовать зависимость параметров комлле-ментзависимого гемолиза от концентрации факторов В, О и компонента СЗ в сыворотке крови человека.

3. Изучить характер зависимости показателей функционального состояния комплемента человека от концентрации ионов магния и ряда других катионов.

4. Изучить закономерности процесса истощения комплемента сыворотки крови человека.

5. Выяснить характер функциональных проявлений АПК при комплементзависимом гемолизе по КПК.

6. Исследовать особенности функциональных проявлений воздействия ряда эффекторов на комплемент.

7. Охарактеризовать состояние комплемента при некоторых заболеваниях человека.

Научная новизна проведенных исследований

состоит в следующем:

1) Разработаны новые функциональные методы исследования комплемента, а именно: метод определения гемолитической активности препаратов факторов В п V

(АС СССР N 1532876), метод регистрации активности АПК без применения хелатирующих агентов (АС СССР N 1798695), метод определения гемолитической емкости комплемента (Патент РФ N 1727075) . Создана модель, имитирующая комплементзависимый гемолиз.

2) Установлено, что для развития лизиса эритроцитов по АПК требуется достижение определенных пороговых концентраций факторов В и Б.

3) Впервые описаны явления торможения компле-ментзависимого гемолиза по АПК относительным избытком компонента СЗ и двойной амплификации, осуществляемой тенями лизированных эритроцитов кролика.

4) Разработанный метод определения гемолитической емкости комплемента позволил получить новую информацию об участии АПК в лизисе эритроцитов барана по КПК, а также о преимущественном влиянии эффекторов на КПК или АПК.

Научно-практическое Значение работы. Работа имеет как теоретическое, так и прикладное значение. Исследование концентрационно-функциональных взаимоотношений в АПК и динамики истощения комплемента позволило экспериментально обосновать концепцию порогового принципа саморегуляции комплемента как особого, отличного от других мультиферментных систем, типа саморегуляции комплемента. Эта концепция, очевидно, применима и к другим протеолитическим системам. При создании модели, имитирующей комплементзависимый гемолиз, установлена роль трансмембранных ионных каналов в функциональных проявлениях детергентного повреждения клетки-мишени. Предложена систематизация эффекторов комплемента. Практическую значимость имеет ряд методов, разработанных и примененных в данной работе. Метод определения гемолитической активности факторов В и В может быть использован для стандартизации препаратов этих белков. Применение монометиламина для приготовления реагента, дефицитного по компоненту СЗ, дает более эффективные препараты для регистрации гемолитической активности этого компонента, чем аффинная хроматография. Принципиально новый параметр - гемолитическая емкость комплемента - дает возможность оценки потенциальной мощности системы и перспективен для использования в диагностических целях.

- б -

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Энзимологический подход к исследованию функциональных проявлений альтернативного пути активации комплемента открыл возможность выявления механизмов (само)регуляции системы и количественной оценки параметров комплементзависимого гемолиза.

2. В АПК имеются особые, отличные от других мультиферментных систем, принципы саморегуляции:

а)наличие пороговых звеньев, контролирующих грань между естественным обновлением системы (допороговый уровень) и той интенсивностью активации, которая приводит к конечному функциональному эффекту;

б¡феномен двойной амплификации, заключающейся в ускорении комплементзависимого лизиса уже амплифицированного АПК тенями лизированных эритроцитов кролика.

3. Предлагаемый метод определения гемолитической емкости комплемента количественно характеризует потенциальную мощность системы, включая ее резервные функциональные возможности, которые не могут быть оценены другими известными методами.

4. Разработанные методы исследования функционального состояния комплемента могут быть использованы для оценки изменений системы при патологических состояниях человека и для установления механизмов действия на комплемент различных эффекторов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на VI Биохимическом конгрессе (Санкт-Петербург, 1992), на XXVI Съезде польского биохимического общества (Гданьск, 1990), на конференциях: "Система комплемента" (Киров, 1987), "Проблемы клинической энзимологии" (Ужгород, 1989), "Актуальные вопросы клинической диагностики" (Санкт-Петербург, 1993), "Структура и функция протеолити-ческих ферментов" (Москва, 1994).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы в отечественных и зарубежный изданиях.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ КОНЦЕНТРАЦИОННО-ФУНКЦИОНАПЬНЫЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В АПК

Важнейшим проявлением функциональной активности АПК является лизис гетерологичных клеток. Первым критическим звеном в этом процессе является образование конвертазы АПК. В ее формировании принимают участие фактор D (активная протеиназа), фактор В (зимоген) белок СЗ, а также ионы магния. Этих компонентов достаточно для формирования альтернативной конвертазы на поверхности чужеродной клетки, в частности - эритроцита кролика (Fishelson Ъ., Muller-Eberhard H.J., 1982).

С помощью кинетического метода (Халяпин В. Д., Прокопьев A.A., 1986) мы определяли скорость (Vh) и индукционный период (lag-t) комплементзависимого лизиса эритроцитов кролика (ЭК) в инкубационной смеси, содержащей реагент, дефицитный по фактору В, D или компоненту СЗ (соответственно RB, RD или RC3), а также различные количества очищенных препаратов этих белков, вероналовый буфер, содержащий ЭГТА (блокатор КПК), и стандартную взвесь ЭК. Можно видеть, что в опытах с очищенными препаратами фактора В (рис.1) комплемент- зависимый лизис наблюдается только после достижения некоторой "пороговой" концентрации этого фактора. Ее величина составляла в сыворотках разных доноров от 0,6 до 42,0 мкг/мл. При увеличении концентрации фактора В наблюдали ускорение вплоть до

Рис. 1. Зависимость скорости лизиса эритроцитов кролика (Vh) от концентрации фактора В в присутствии реагентов RB1 и RB2.Инкубационная смесь объемом 0,8 мл

•о «e fRl мкт/мп содеРжала °'2

[DJ МКГ/МЛ реаГента, 0,4 мл Мд-ЭГТА-буфера, различные количества фактора В и 0,1 мл стандартной взвеси ЭК (12 млн.клеток/мл).

Величина максимума варьировала в разных сыворотках ИВ в значительной степени и в большинстве случаев была ниже уровня фактора В, характерного для сыворотки крови здорового человека.

Очень похожую картину наблюдали и в аналогичных опытах с очищенным фактором В. Лизис практически не развивался до достижения некоторой пороговой концентрации фактора которая в индивидуальных

сыворотках варьировала от 0,8 до 1,2 мкг/мл. Для исследованной зависимости тоже характерна кинетика насыщения. Насыщающая концентрация фактора В не превышала его нормальный уровень в сыворотке крови. Таким образом, можно считать, что в норме концентрации факторов В и 0 в сыворотке крови не лимитируют скорость комплементзависимого лизиса.

Скорость лизиса ЭК по АПК в экспериментах как с фактором В, так и с фактором Э, зависела от качества реагента (особенностей сыворотки, из которой он был приготовлен). Для раздельной оценки активности фактора и соответствующего реагента была предпринята апроксимация кривых зависимости от концентрации

фактора В или Б к классической зависимости Михаэлиса-Ментен. Это было достигнуто благодаря введению величины, которую можно назвать "пороговая концентрация фактора", или [Ф]п. Зависимость [Ф]п от особенностей реагента свидетельствует о том, что отсутствие лизиса при низких (подпороговых) концентрациях исследуемого фактора обусловлено действием антикомплементарных компонентов реагентов ЯБ или ИВ. Очевидно, совокупный антикомплементарный потенциал может различаться по величине в разных препаратах реагента. Он как раз и может быть охарактеризован величиной [Ф]п. Вычитание из реальной концентрации фактора его пороговой концентрации дает величину эффективной концентрации фактора ([Ф]эфф) -Успешность предпринятой апроксимации подтверждается возможностыою линеаризации, осуществляемой в координатах Лайнуивера-Бэрка (рис. 2).

г

1/Уи

1/Ук «1М

-■1/кА

* ист*»*

Рис. 2. Зависимость скорости лизиса эритроцитов кролика (УИ) от эффективной концентрации фактора Б (в координатах двойных обратных величин). Результаты экспериментов с двумя реагентами - ИОх и

Линеаризация графиков в координатах Лайнуивера-Бэрка получена по результатам экспериментов как с очищенным фактором О, так и с фактором В. Следует отметить, что отрезок, отсекаемый полученной прямой на оси 1/УЪ, отличается у разных реагентов, но одинаков для одного и того же препарата фактора. Вместе с тем, отрезок, отсекаемый прямой на оси 1/[Ф]эфф различен у разных препаратов фактора. Следовательно, величина, аналогичная УтаК в кинетике ферментативного катализа (УЪтах) , характеризует в данном случае реагент, а величина, соответствующая Км (Км!) , - исследуемый фактор. Применительно к комплементзависимому лизису физический смысл этих констант заключается в том, что Км' характеризует эффективность фактора комплемента в процессе гемолиза, а показывает максимально

достижимую скорость гемолиза в данном реагенте в условиях, когда исследуемый компонент комплемента уже не является лимитирующим звеном процесса.

В аналогичных экспериментах с очищенным препаратом компонента СЗ зависимость скорости лизиса ЭК от концентрации СЗ оказалась совершенно иной (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость скорости лизиса ЭК (УЬ) от концентрации компонента СЗ. Инкубационная смесь объемом 0,8 мл содержала 0,1 мл ИСЗ-МНА, Мд-УББ-

буфер и различные

0,4 1,2 2,0 2,6 3,6 [СЗ] мг/мл количества

компонента СЗ. При низких его концентрациях выявлялся практически линейный участок. Затем следовало плато и - далее -участок явного снижения скорости лизиса с последующим возрастанием, которое завершается новым снижением.

Обращает на себя внимание, что начальный линейный участок экстраполируется к точке пересечения координат. Следовательно, в отличие от факторов В и Б, для компонента СЗ отсутствует "порог концентрации".

Степень наибольшего снижения скорости гемолиза в области угнетения гемолитической активности относительным избытком СЗ рассчитывали относительно первого пика. Она составляла в разных сыворотках от 16% до 44%. Концентрации СЗ, вызывающие уменьшение скорости, также были различными в разных сыворотках и варьировали в диапазоне от 1 до 3 мг/мл. Таким образом, в ряде сывороток "ингибирующая" концентрация СЗ находилась в пределах физиологической нормы.

"Волнообразный" характер зависимости скорости комплементзависимого лизиса ЭК от концентрации СЗ наблюдали как в опытах с КСЗ, приготовленным путем обработки сыворотки монометиламином (ЯСЗ-ММА), так и с ИСЗ, полученным методом аффинной хроматографии (ИСЗ-афф).

Вместе с тем, максимальный подъём VII в экспериментах с ЯСЗ-ММА был почти в два раза выше, чем в опытах с ИСЗ-афф. Обработка ИСЗ-афф. монометиламином также приводила к повышению VII. Принципиально эти реагенты ИСЗ различаются тем, что при аффинной хроматографии из сыворотки крови избирательно удаляется только

УЬ млн. Э К/мин

10

компонент СЗ, а при обработке ММА инактивации повергаются еще и компонент С4 и альфа-2-макроглобулин, т.е. все белки, имеющие внутреннюю тиоэфирную связь. Вполне очевидно, что различия в эффективности реагентов обусловлены инактивацией альфа-2-макроглобулина. Это согласуется с данными литературы об ингибировании нативным очищенным альфа-2-макроглобулином гемолитической активности сыворотки крови, дефицитной по этому эдогенному протеиназному ингибитору (Bellot В. а1,, 1991).

Выявленные различия в свойствах реагентов ИСЗ имеют и непосредственное прикладное значение. Больший диапазон изменений УИ в зависимости от концентрации СЗ при использовании ЯСЗ-ММА. делает применение этого реагента более предпочтительным, чем использование реагента КСЗ-афф. для определения гемолитической активности компонента СЗ. Кроме того, йСЗ-ММА в сочетании с очищенным компонентом СЗ позволил нам регистрировать АПК без применения ЭГТА, и, таким образом, исследовать влияние на этот путь двухвалентных катионов.

Зависимость скорости лизиса ЭК по АПК от концентрации ионов магния и других двухвалентных катионов представлена на рис. 4.

7,5

10,0 12,5 15,0 17,5

концентрация катиона мМ

Рис. 4. Зависимость скорости лизиса эритроцитов кролика (УЬ) по АПК от концентрации двухвалентных катионов.

Инкубационная смесь объемом 0,8 мл содержала 0,2 мл ИСЗ-ММА, 0,1 мл СЗ (2 мг/мл), УВБ и различные количества 20 мМ растворов

хлоридов магния, кобальта, никеля или железа.

Обращает на себя внимание то, что максимальная скорость гемолиза достигается при концентрациях магния, превышающих его нормальный уровень в сыворотке крови (1 мМ) . Следовательно, регистрируемая обычно динамика гемолиза по АПК существенно зависит от концентрации магния в биологической жидкости. Поэтому при определении активности АПК концентрацию магния следует поддерживать на таком уровне (не ниже 5 мМ) , чтобы колебания его концентрации при переходе от одной биопробы к другой не вносили существенного вклада в величину показателя комплемента. Из данных рис. 4 видно также, что ионы никеля, кобальта и железа могут заменять катион магния в АПК. При этом наилучшие характеристики в качества кофактора АПК получены для кобальта: эффективность в низких концентрациях, широкий диапазон активирующего влияния, отсутствие снижения эффекта даже б относительно высоких дозах. Кроме того, известно, что кобальт обладает гораздо более низкой общей токсичностью для человека, чем никель, применяемый для изучения свойств конвертазы. Все это позволяет рекомендовать Со2+ в качестве стабилизирующего фактора в модельных опытах по изучению АПК, . а , возможно, и для коррекции комплемента у человека.

Концентрационная зависимость 1ад-периода существенно различалась у исследованных компонентов АПК. Данные, приведенные в табл. 1, представляют результаты определения lag-t и Vh при различных концентрациях фактора В и фактора D.

Табл.1. Зависимость 1ад-периода камплемент-зависимога лизиса эритроцитов кролика от количества факторов Б и D.

Фактор D В

Количество фактора (мл) 0,01 0,02 0,04 0,06 0,005 0,007 0,01 0,02 0,1

Vh (млн ЭК за 1 мин) 2,9 5,0 5,9 6,6 1,9 3,1 4,9 8,8 8,6

lag-t (с) 300 240 180 45 420 360 270 170 180

Обращает на себя внимание тот факт, что по мере увеличения концентрации фактора В lag-t уменьшается только до тех пор, пока увеличивается Vh, а с увеличением концентрации фактора D lag-период продолжает уменьшаться и после практического достижения максимальной скорости. Значит, если концентрация фактора В не слишком низка, lag-t не зависит от его концентрации, а вариации в концентрации фактора D должны проявляться не столько в изменении скорости лизиса, сколько в изменении lag-t периода. Следовательно, концентрацию фактора D следует считать параметром, лимитирующим продолжительность lag-t.

Зависимость lag-t от концентрации компонента СЗ по своему характеру напоминет результаты, полученные в аналогичных экспериментах с фактором В. Это сходство заключалось в быстром уменьшении lag-t при очень небольшом приросте компонента СЗ в инкубационной смеси и в сохранении его уровня во всем остальном исследованном диапазоне концентраций. Это свидетельствует о том, что lag-t гемолиза при концентрациях СЗ, близких к физиологическим, не определяется уровнем СЗ, а обусловлен свойствами реагента (содержанием в нем фактора D).

ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ ЕМКОСТЬ КОМПЛЕМЕНТА - НОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ

Попадание в кровь инициатора комплемента приводит к активации системы и, как следствие, к истощению компонентов комплемента. Нами было обнаружено, что после завершения процесса активации комплемента одной порцией инициатора (зимозан, ЭК, эритроциты барана) остается достаточное количество функционально активного комплемента для запуска системы последующими порциями инициатора. Это явление и бьшо использовано для разработки метода определения так называемой гемолитической емкости комплемента, или, сокращенно, ГЕК.

Сущность метода определения ГЕК сыворотки крови или других биологических жидкостей (плазма крови, транссудат, экссудат) заключается в регистрации гемолиза добавляемых последовательно равных порций ЭК

или барана ОБ) вплоть до полного истощения комплемента, проявляющегося в полном прекращении лизиса добавляемых клеток. Величину ГЕК нагляднее всего выражать количеством эритроцитов, полностью

лизированных под действием 1 мл биологической жидкости.

Величина ГЕК в значительной степени зависела от количества эритроцитов в порции: чем более концентрированной была эритроцитарная взвесь, тем большим было общее количество эритроцитов, лизированных единицей объёма сыворотки.

Гемолитическая емкость комплемента, однако, мало зависела от температуры (20° или 37°С) и степени сенсибилизации эритроцитов, как это видно из результатов экспериментов, представленных в табл. 2 и 3. Для сравнения здесь также приведены значения 1ад^ и \/Ъ, которые отличаются высокой чувствительностью к этим факторам.

Табл.2. Показатели состояния комплемента сыворотки

крови человека при изменении температуры (п=5, величина порций Ж -1.6 млн.кл.).

Температура 1ад-с УЬ ГЕК

(град. С) (с) (млн.кл./мин) (млн.кл./мл)

37 29+11 24,7 ± 6,2 66 + 14

20 118+56 6.6 + 4,2 68 + 13

Таблица 3. Показатели состояния комплемента сыворотки крови человека, дефицитной по фактору Ъ, при изменении степени сенсибилизации эритроцитов барана (п=9, величина порций эритроцитов -1,8 млн.кл.)

Показатель состояния комплемента Эритроциты барана

с енс иб илиз ир ован- НЫЕ несенсибилизиро-ванные

1ад-с (с) УЬ (млн. кл./иин! ГЕК(млн.кл./мл) 76 + 29 24,2 + 4,8 70+15 148 +31 18,4 ± 3,9 73+20

В табл. 4 представлены данные по определению ГЕК в нормальной человеческой сыворотке при частичном истощении ее различными дозами зимозана.

Табл.4. Показатели состояния комплемента

индивидуальной донорской сыворотки при истощении комплемента разными дозами зимозана (время инкубации сыворотки с зимозаном - 30 мин, доза сенсибилизированных эритроцитов барана - 0,72 млн.пл.).

Концентрация lag-t Vh ГЕК

зшозаш (мг/мл) (с) (млн.кл./мин) (млн.кл./мл)

0 30 10,1 132

1 30 10,4 81

2 35 10,4 71

3 35 10,4 66

5 55 8,6 57

20 90 6,3 36

Результаты показывают, что уменьшение количества функциональные активных компонентов комплемента в результате его частичного истощения до определенной степени не проявляется в изменении Vh и lag-t, но приводит к значительному дозозависимому снижению ГЕК. На основании изложенных фактов можно сделать вывод о том, что ГЕК в наибольшей степени, по сравнении с другими известными показателями, отражает количество функционально активного комплемента в биологической жидкости, его потенциальную мощность. Метод определения ГЕК характеризуется достаточной воспроизводимостью. Коэффициент вариации,

рассчитанный из 8 определений составил 5,2%. При хранении сыворотки при 4°С стабильные значения ГЕК сохранялись в течение 3 суток.

Значения ГЕК сыворотки были определены у пациентов, страдающих различными заболеваниями. Выраженные изменения этого показателя были обнаружены при лейкозах, миеломной болезни и острой пневмонии.

ПРОЯВЛЕНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ МЕХАНИЗМОВ В ДИНАМИКЕ ИСТОЩЕНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

Скорость комплементзависимого лизиса

последовательно добавляемых в сыворотку крови порций эритроцитов изменяется в ходе поэтапного истощения комплемента. Динамика изменений скорости гемолиза отличается в системах с ЭК и ЭБ, а также в зависимости от присутствия ЭГТА. Очевидно, характер этих изменений отражает механизмы саморегуляции и взаимодействия путей активации системы.

Типичная кривая истощения комплемента сыворотки крови человека последовательно добавляемыми порциями эритроцитов барана представлена на рисунке 5.

3

2,25 1,5 0,75 0

-0,75 -1,5

Ш VII

количество порций ЭБ

Рис. 5. Динамика истощения комплемента сыворотки крови человека эритроцитами барана (величина отдельной порции ЭБ -0,72млн.клеток)

Обращает на себя внимание двуфазность процесса: в первой фазе истощение происходило медленно, во второй - быстро. В отличие от эритроцитов кролика, которые инициируют как АПК, так и КПК, ЭБ выступают в качестве пускового агента только КПК. Поэтому в присутствии ЭГТА сыворотка крови человека их не лизирует. Этот давно установленный факт стал основой широко распространенного мнения о том, что регистрация лизиса ЭБ дает информацию о состоянии только КПК. Сомнительность такой трактовки видна хотя бы уже из того, что в ходе активации комплемента по классическому пути происходит образование фрагмента СЗЬ,

способного инициировать альтернативный путь, который подкрепляет (амплифицирует) каскад комплемента.

Для выявления функциональных проявлений амплификации исследовали динамику истощения комплемента нормальной сыворотки человека (НСЧ) и реагента ЯЭ, т.е. сыворотки, лишенной фактора Б альтернативного пути. Как в цельной сыворотке, так и в скорость лизиса

вначале плавно снижалась с каждой порцией ЭБ, а на каком-то этапе начинала резко падать. Фазы динамики истощения комплемента могут быть охарактеризованы константами к! и к2, которые рассчитываются как тангенсы углов ах и а2, т.е. углов наклона линейных участков графика зависимости натурального логарифма \/Ъ от количества порций лизированных эритроцитов (рис. 5). Комплемент сыворотки и реагента ИО истощали как сенсибилизированными, так и несенсибилизированными ЭБ. Результаты представлены в табл. 5. Видно, что и в реагенте ЯО, и в нормальной сыворотке процесс истощения комплемента протекал в две фазы. Первая фаза -медленная, вторая - быстрая. Этот факт свидетельствует о том, что двуфазность процесса присуща самому КПК, а не обусловлена "вмешательством" АПК. Таблица 5. Константы медленной (к,) и быстрой (к^ фаз истощения комплемента сыворотки крови человека эритроцитами барана (величина отдельной порции - 0.72 млн.ЗБ).

Источник комплемента Инициатор комплемента Ч к2 11

НСЧ ЭБ несенсибияи- 0,16±0,08 1,31±0,61 27

зированные _ и _ 0,30+0,04 1,3б±0,33 5

НСЧ ЭБ сенсибили- 0,08+0,03 1,56+0,42 7

1У> зированные _ я _ 0,09+0,03 1,96+0,16 4

Обнаружено также, что сенсибилизация ЭБ приводила к существенному (приблизительно в 2 раза) уменьшению кг. Значит, сенсибилизация способствует сохранению скорости комплементзависимого лизиса при частичном истощении комплемента. При сравнении динамики истощения комплемента сыворотки и ЙБ обращает на себя

внимание более значительный уровень ki (примерно в 2 раза) в RD, но только при использовании несенси-билизированных эритроцитов. Таким образом, наши эксперименты показали, что АПК, подобно сенсибилизации эритроцитов, способствует поддержанию Vh на высоком уровне. В тест-системе с сенсибилизированными эритроцитами концентрация антиэритроцитарного иммуноглобулина очень высока и не соответствует его естественному уровню в сыворотке крови. Вероятно, in vivo главным фактором, поддерживающим достаточно высокую скорость комплементзависимого лизиса чужеродных клеток в ходе истощения комплемента является именно амплификация по АПК.

Изменения скорости лизиса в процессе истощения комплемента эритроцитами кролика (рис. 6) существенно отличались от динамики истощения сыворотки эритроцитами барана: между первой (быстрой) и заключительной (тоже быстрой) фазами наблюдалась

величин скорости

Рис. 6. Динамика истощения комплемента сыворотки крови человека эритроцитами кролика (величина отдельной порции ЭК - 0,72 млн. клеток).

Особенно необычно выглядит график зависимости 1п(\Т1) от количества порций ЭК в присутствии ЭГТА, т.е. "чисто" по альтернативному пути (рис. 7). Необычность динамики истощения сыворотки в этих условиях заключается в том, что после лизиса первой порции ЭК вместо ожидаемого снижения скорости наблюдалось выраженное ускорение лизиса второй и нескольких последующих порций ЭК, вслед за чем уже наступало быстрое падение УЬ.

область относительно стабильных лизиса.

3

1п\Л

Рис. 7. Динамика истощения комплемента сыворотки крови человека ЭК б присутствии 10 мМ ЭГТА (величина отдельной порции ЭК - 0,72 млн. клеток).

Количество 8 порций ЭК

2

Лизис второй и последующих порций ЭК протекает в присутствии продуктов лизиса эритроцитов. Это дало основание для предположения о том, что эффект ускорения гемолиза обусловлен продуктами лизиса ЭК. Для проверки этого предположения исследовали влияние осмотического лизата кроличьих эритроцитов на лизис ЭК по альтернативному пути и - для сравнения - на лизис ЭК по классическому пути, а именно, в системе ЯИ. Было обнаружено умеренное и дозозависимое угнетение КПК и очень значительное (в 2-4 раза) ускорение лизиса по АПК.

В целом зависимость скорости лизиса ЭК по АПК от концентрации лизата имела сложный храктер (рис. 8). VII млн.ЭК/мин

Рис. 8. Зависимость скорости лизиса эритроцитов кролика (\Лг) по АПК от количества осмотического лизата ЭК.

количество лизата (мл)

0,1 0,2

Компонент лизата, ускоряющий лизис ЭК, оказался чувствительным к нагреванию, процедуре замораживания-оттаивания, что указывает на его белковую природу. При центрифугировании лизата ЭК при 8000 об/мин ускоряющая способность в отношении АПК и способность тормозить КПК была обнаружена в осадке и сохранялась при отмывании осадка вероналовым буфером. Следовательно, активным действующим началом лизата являются тени ЭК.

АПК постоянно функционирует в условиях амплификации. Обнаруженное нами ускорение

комплементзависимого гемолиза по АПК тенями ЭК можно рассматривать как двойную амплификацию, т.е. ускорение уже ускоренного амплификационной

конвертазой гемолиза под действием теней лизированных клеток, появляющихся в процессе функционирования комплемента.

Ускорение комплементзависимого лизиса ЭК по АПК можно объяснить, исходя из известных данных о возможности инициирования АПК тенями лизированных эритроцитов кролика (Chaw Y.M. et al., 1977). По-видимому, каскад реакций активации комплемента происходит на тенях, а образующийся в жидкой фазе С5Ьб внедряется в интактную клетку, обеспечивая тем самым ее реактивный лизис. Сама клетка также является пусковым агентом АПК. Продукция увеличенного количества комплексов мембранной атаки может быть решающим фактором ускорения гемолиза, т.к. величина повреждения комплементом эритроцита резко

увеличивается при переходе от мономерного МАК к димеру, тримеру или тетрамеру (Zalman L.S., MullerEberhard H.J., 1990). То, что активирующий эффект теней эритроцитов связан с их способностью инициировать АПК, показано нами в экспериментах с обработанными тромбином ЭК (1 мг/мл стандартной взвеси). Такое воздействие существенно ускоряло лизис клеток по АПК (7,8 против 6,3 млн. ЭК/мин), а тени эритроцитов, предварительно обработанных тромбином, в большей степени ускоряли гемолиз, чем контрольные (в 2,1 по сравнению с 1,5 раза). Результаты этих экспериментов подтверждают, что эффект теней связан именно с их способностью инициировать АПК.

Известно, что критическим моментом реактивного лизиса является внедрение в клетку комплекса С5Ьб (Tshopp J. et al., 198Б), который, если он не внедрится сразу после формирования в мембрану-мишень, подвергается инактивации фактром S. При исследовании влияния лизата на комплементзависимый гемолиз нами было установлено, что прединкубация лизата с сывороткой крови предотвращала ускорение лизиса добавляемых эритроцитов, а добавление второй порции ЭК через 15 минут, а не сразу после завершения лизиса первой порции, приводило к исчезновению ускоряющего эфекта лизированных клеток. Все эти факты подтверждают предположение о том, что тени ЭК ускоряют комплементзависимый гемолиз по АПК по механизму реактивного лизиса.

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЭФФЕКТОРОВ НА

КОМПЛЕМЕНТ

Выявление эффекторов комплемента до сих пор осуществляют по их воздействию на СН50 и АР50. Изменение этих величин односторонне характеризует эффектор и не дает никакой информации о механизме его действия. Разработанный нами метод определения динамики истощения комплемента позволяет

регистрировать несколько параметров, а по характеру влияния эффекторов на эти параметры получать определенное представление о типе его взаимодействия с комплементом. Это было показано нами, в частности, в экспериментах с веществами, механизм воздействия которых на комплемент уже известен.

Гепарин является наиболее изученным эффектором комплемента. Известно, что он обладает способностью препятствовать образованию комплекса Cl, что проявляется в ингибировании КПК (Maillet F. et al., 1988). Кроме того, гепарин препятствует взаимодействию фактора В с СЗЬ при формировании конвертазы АПК. Нами было исследовано влияние терапевтических концентраций гепарина (1-5 ед/мл) на динамику истощения комплемента донорских сывороток эритроцитами кролика и барана. Показано, что наиболее

чувствительным к действию гепарина является этап формирования и функционирования комплекса С1 классического пути. Взаимодействие гепарина с белками, формирующими комплекс С1, приводило к замедлению комплементзависимого гемолиза ЭБ и к увеличению емкости комплемента, т. е. способствовало более "экономному" расходованию его компонентов. Величина кц характеризующая первую фазу истощения комплемента эритроцитами барана и отражающая вклад амплификации, т.е. АПК, в процесс лизиса, существенно не изменялась в присутствии гепарина и составляла 107 1 12% от контрольного уровня (для концентрации гепарина, равной 5 ед/мл). Это указывает на сохранность АПК, при существенном торможении КПК, и подтверждается данными по исследованию действия гепарина на лизис ЭК. Гепарин (в исследованных концентрациях) не влиял на скорость лизиса по АПК и гемолитическую емкость комплемента в отношении ЭК.

Обнаруженный факт более значительных изменений со стороны показателей КПК и сохранности АПК в присутствии гепарина следует иметь в виду при оценке статуса комплемента у гепаринизированных больных и в гепариновой плазме крови.

Другой ингибитор комплемента, Э-аргинин, вызывал снижение скорости лизиса ЭБ при реципрокном повышении гемолитической емкости (г=-0,94). Такое влияние на лизис ЭБ можно считать гепариноподобным и трактовать как воздействие на функцию активированного С1. Вместе с тем, во влиянии В-аргинина на лизис несенсибилизированных ЭБ прослеживается как воздействие на С1 (снижение \ГЬ с увеличением ГЕК) , так и ингибирующее влияние на АПК, что проявляется в увеличении на 10-30% величины кх, т.е. константы первой фазы истощения сыворотки.

Влияние Б-аргинина на лизис ЭК заключалось в существенном снижении ГЕК в отношении ЭК, что и является отражением его существенного влияния на АПК.

Хотя гепарин и Б-аргинин влияют на одни и те же процессы каскада комплемента, полученные результаты свидетельствуют о том, что гепарин преимущественно воздействует на комплекс С1, а Б-аргинин - на конвертазу АПК. Таким образом, анализируя динамику

лизиса гетерологичных клеток, можно судить о том, на

каком этапе многоступенчатого процесса активации

комплемента оказывают свое действие те или иные эффекторы.

ИМИТАЦИЯ КОМПЛЕМЕНТЗАВИСИМОГО ГЕМОЛИЗА

При исследовании влияния эффекторов на гемолитическую активность комплемента возникает вопрос о том, не является ли их действие неспецифическим, т.е. направленным на мембрану клетки-мишени, а не на белки комплемента. Для оценки возможных эффектов такого рода нами была разработана специальная модель гемолиза. При создании модели использованы представления о каналообразующем и детергентоподобном действии комплекса мембранной атаки комплемента.

Гемолиз ЭК и ЭБ осуществляли природным детергентом •. сапонином. Полиеновый антибиотик нистатин, образующий трансмембранные каналы, сам по себе в концентрациях 10-65 мкг/мл не вызывал лизиса клеток. Вместе с тем, добавление его в инкубационную среду, содержащую сапонин, приводило к значительному (в 1,2 - 2 раза) ускорению гемолиза. Зависимость скорости гемолиза от концентрации нистатина имела сложный характер (рис. 9).

10 20 30 40 50 60

Рис. 9. Зависимость между концентрацией нистатиина в инкубационной среде и скоростью сапонинового лизиса

а) эритроцитов барана,

б) эритроцитов кролика. Инкубационная смесь объемом 0,8 мл содержала 0,1 мл ЯВ, эритроциты (0,6 млн. клеток/мл), сапонин в концентрации 375 мкг/мл.

Очевидно, это обусловлено тем, что нистатиновые каналы формируются из полуканалов, а функционально активными являются полные каналы. Здесь наблюдается аналогия с характером ускорения лизиса по АПК под действием теней лизированных эритроцитов» Подобно нистатиновым каналам, каналы, образованные МАК, являются катионными и обладают селективностью в отношении ионов калия. Наши результаты позволяют предположить, что в системе комплемента основным повреждением является детергентоподобная

дезорганизация липидных участков мембраны, а сформированные каналы лишь ускоряют процесс лизиса клеток-мишеней.

Исследованные эффекторы комплемента (гепарин и Б-аргинин) оказались также и эффекторами сапониново-нистатинового гемолиза. Однако, их влияние на этот процесс оказалось разным. Гепарин вызывал ускорение детергентного гемолиза. Вероятно, резкт:е колебания величины эффекта гепарина в отношении УЬ (особенно в экспериментах с ЭК, более чувствительными к действию сапонина) связаны с разнонаправленностью действия эффектора, включая его влияние на свойства мембраны. Б-аргинин оказывал действие только на сапониново-нистатиновый лизис, что может быть проявлением торможения образования или функционирования ионного канала. Можно предположить, что часть тормозящего влияния Б-аргинина на комплементзависимый гемолиз обусловлено его мембранопротекторным действием.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Протеолитические системы крови, одной из которых является система комплемента, существенным образом отличаются от других мультиферментных систем. Во-первых, протеолитические системы функционируют по принципу каскадности, заключающемуся в усилении первоначального слабого сигнала (например,

неферментативного гидролиза СЗ в альтернативном пути активации комплемента). Во-вторых, протеолитические системы по сути своей являются саморазрушающимися. В системе комплемента одна часть компонентов каскада расщепляется протеолитически, другая - инактивируется

путем комплексообразования. При этом наблюдается инактивация белков системы как компонентами каскада, так и внекаскадными звеньями (белковые регуляторы).

Особенности протеолитических систем определяют и необычность их регуляции и саморегуляции. Так, в наших экспериментах применение энзимологических подходов к альтернативному пути активации комплемента как к мультиферментной системе позволило выявить особые механизмы его (само)регуляции. Обнаружено, что для "срабатывания" системы, проявляющегося в явлении иммунного гемолиза, требуется достижение определенных "пороговых" концентраций факторов В и D. Поскольку в интактной сыворотке крови также требуется преодоление некоторого концентрационного порога для проявления функциональной активности комплемента, обнаруженное явление можно рассматривать как особый "пороговый" механизм контроля. "Порог", очевидно, является динамической величиной, отражающей соотношение мощности каскада комплемента и противодействующей ему системы внекаскадной регуляции. In vivo каскад АПК осуществляется постоянно "на холостом ходу" без каких-либо функциональных последствий. Они могут возникнуть как при усилении каскада (попадание в кровь инициатора АПК), так и при ослаблении защитных механизмов (например, при пароксизмальной ночной гемоглобинурии).

В подавляющем большинстве мультиферменгных систем скорость образования конечного продукта определяется активностью ключевого фермента и регулируется по типу отрицательной обратной связи. Поиски аналогичного ключевого фермента как в АПК, так и в КПК не увенчались успехом (Nilson et al. 1992). По нашим данным, Vh. по АПК зависит от активности разных компонентов. Особенно необычной оказалась зависимость Vh от концентрации компонента СЗ, которая носила волнообразный характер. Благодаря такому характеру зависимости, наблюдаемому в пределах физиологического диапазона концентраций СЗ, снижение концентрации компонента (например, в результате его расходования) может привести даже к повышению скорости комплементзависимого гемолиза. Все это свидетельствует о своеобразии саморегуляции

комплемента. Своеобразие регуляции АПК проявляется и в обнаруженном нами явлении двойной амплификации, а именно - в ускорении комплементзависимого гемолиза под действием теней лизированных эритроцитов кролика. Показано, что это явление тесно связано со свойством мембран ЭК выступать в качестве инициаторов АПК. Очевидным является воздействие теней на степень повреждения мембраны клеток-мишеней. Интересно, что характер зависимости ускорения лизиса ЭК от концентрации теней (рисунок 8) принципиально не отличается от характера влияния нистатина на сапониновый гемолиз (рисунок 9) . Вероятно, сам процесс формированирования трансмембранного канала является регуляторным механизмом цитолиза.

Для исследования функциональных проявлений различного рода воздействий на комплемент требуются адекватные методы. Переход от определения активности комплемента по измерению степени комплементзависимого гемолиза (СН50, АР50, z) к кинетическим методам, составившим одно из важнейших направлений проведенных нами исследований, существенно повысил нформативность результатов регистрации иммунного лизиса. Так, существовало мнение о том, что фактор D является ключевым звеном в АПК (Pasqual М. et al.,1989). В наших же кинетических экспериментах было показано, что фактор D только в низких концентрациях (искусственное лимитирование) влияет на скорость лизиса, а в концентрациях, близких к физиологическим и выше, не влияет на скорость, но уменьшает lag-период. В еще большей степени увеличилась информативность метода регистрации иммуного гемолиза при разработке нами способа определения гемолитической емкости комплемента. Величина ГЕК значительно изменялась при уменьшении в биологической жидкости компонентов комплемента. Кроме того, сама динамика истощения комплемента малыми порциями клеток-инициаторов давала дополнительную информацию о состоянии системы, в частности о взаимоотношении путей активации комплемента.

- Полученные в работе данные позволяют осуществить пересмотр таких понятий как ингибитор и активатор (не в смысле "инициатор", а как положительный эффектор)

комплемента. Если в обычных мультиферментных системах эти понятия однозначны: ингибитор вызывает снижение скорости процесса, активатор - его ускорение, то в системе комплемента эффекторы могут проявлять себя по-разному. Так, исследованные нами гепарин и Б-аргинин в литературе рассматриваются как ингибиторы комплемента. Однако, оба эти вещества вызывая увеличение ГЕК/ЭБ, тем самым обеспечивают более высокую скорость лизиса конечных порций клеток (активирующее действие). Вероятно, эффекторы комплемента следует классифицировать по совокупности их влияния на параметры его активности и подразделять на вещества гепариноподобного, Б-аргининоподобного действия и т.п. Но для этого потребуется исследование эффектов самых разнообразных веществ и, прежде всего, специфических эндогенных ингибиторов процесса.

3. ВЫВОДЫ

1.Применение энзимологических подходов к исследованию функционирования системы комплемента открыло возможность характеристики протеолитических звеньев этой системы константами типа Км и \гтах.

2. Экспериментально установлена необходимость достижения определенных "пороговых" концентраций факторов В и Б для реализации процесса активации комплемента по альтернативному пути в форме иммунного гемолиза.

3. Установлено, что зависимость скорости комплементзависимого лизиса эритроцитов кролика по альтернативному пути от содержания компонента СЗ имеет волнообразный характер, объясняющий феномен ингибирования процесса в диапазоне физиологических концентраций бёлка.

4. Показано, что содержание фактора Б в сыворотке крови лимитирует величину 1ад-периода, но не скорость гемолиза.

5. С помощью разработанного метода регистрации скорости гемолиза по альтернативному пути активации комплемента без применения хелатирующих агентов выявлена возможность замены естественного кофактора конвертазы АПК, иона магния, катионами железа (2+) и

кобальта (2+); кобальт при этом был эффективнее в более низких концентрациях, чем магний и в более широком диапазоне, чем никель (2+), применяемый для стабилизации конвертазы.

6. Разработан принципиально новый параметр оценки состояния комплемента биологических жидкостей, отражающий количество потенциально активного комплемента, - гемолитическая емкость комплемента (ГЕК).

7. Показано, что гемолитическая емкость источника комплемента, определяемая по отношению к эритроцитам барана, снижается при уменьшении концентрации начальных компонентов классического пути и практически не зависит от степени сенсибилизации эритроцитов и температуры (20° или 37° С) .

8. Показано, что гемолитическая емкость источника комплемента, определяемая по отношению к эритроцитам кролика, отражает общее количество потенциально активных компонентов АПК и является характеристикой этого пути, независимой от применения хелатирукяцих агентов.

9. Обнаружены значительные изменения величины гемолитической емкости комплемента при некоторых патологических процессах, что может быть использовано в практической медицине.

10. Разработанный метод определения гемолитической емкости комплемента позволил выявить две фазы истощения сыворотки крови человека дискретными порциями эритроцитов барана; показано, что вкладом АПК в активацию КПК эритроцитами барана является замедление процесса снижения, скорости лизиса в первой фазе истощения, что способствует ее сохранению на уровне, близком к начальному.

11. При исследовании динамики истощения комплемента сыворотки крови эритроцитами кролика обнаружено явление двойной амплификации,заключающееся в ускорении уже амплифицированного комплемент-зависимого гемолиза по АПК под действием теней лизированных клеток. Установлено, что фактор лизата

эритроцитов кролика, ускоряющий комплементзависимый гемолиз по АПК, имеет белковую природу и действует по механизму реактивного лизиса.

12. На модели, имитирующей комплементзависимый лизис эритроцитов, показана роль трансмембранных ионных каналов в качестве факторов ускорения процесса гемолиза, обусловленного детергентом.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Галебская J1.B., Бельтюков П.П. Использование хлорида никеля в исследовании системы комплемента. Деп. ВИНИТИ N 4416-В87, 1987, 74-82.

2. Галебская J1.B., Бельтюков П.П., Рюмина Е.В. Влияние аргинина и его производных на активность протеиназ альтернативного пути комплемента человека. Деп. ВИНИТИ N 2648-В88, 1988, 33-54.

3. Галебская Л.В., Бельтюков П.П., Щербак И.Г. Гепарин как модулятор процессов активации комплемента по альтернативному пути. В сб."Биохимия - медицине. Молекулярные механизмы формирования патологических процессов". Тезисы докл. 1988, Л., 36.

4. Щербак И.Г., Галебская Л.В., Бельтюков П.П. Способ определения гемолитической активности протеолитических компонентов альтернативного пути комплемента. АС N 1532876, 1989.

5. Бельтюков П.П., Галебская Л.В. Изменение активности фактора D альтернативного пути активации комплемента под влиянием производных аргинина и лизина. В сб. "Система комплемента". Тезисы докл. 1988, М., 24-25.

6. Щербак И.Г., Галебская Л.В., Бельтюков П.П. Определения гемолитической активности протеолитических компонентов альтернативного пути комплемента. В сб. "Изобретательство и рационализация в медицине и медицинской промышленности". 1989, Л., 148.

7. Shcherbak I.G., Bogolubova G.M., Serchan Valid, Galebskaya L.V. , Rumina E.V. Nove dañe dotyczace wlascivosci alfa-2-macroglobuliny jako inhibitora proteaz. In: XXVI Zjazd Polskego Tovarystwa Biochemicznego. 1990, Gdansk, 256.

8. Рюмина Е.В., Галебская Л.В., Щербак И.Г. Лизат эритроцитов кролика как модулятор активности комплемента сыворотки крови человека. Деп. ВИНИТИ N 5868-В90, 1990, 1-7.

9. Галебская Л.В., Щербак И.Г., Бельтюков П.П., Рюмина Е.В., Строение и свойства протеиназ системы комплемента. Укр. биохим. журнал, 1990, N6, 3-15.

10. Рюмина Е.В., Галебская Л.В., Щербак И. Г. Влияние плазмина на комплемент сыворотки крови человека. Вопр. мед. химии, 1991, 37, N1, 52-53.

11. Галебская Л.В., Рюмина Е.В., Бельтюков П.П., Щербак И.Г., Власова Т.В., Богомаз Т.А. Влияние двухвалентных катионов на активность комплемента сыворотки крови человека. Иммунология, 1991, N3, 4547.

12. Галебская Л.В., Герус А. И., Рюмина Е.В., Соловцова И.Л., Салогуб Г.Н., Щербак И. Г. Адаптационные изменения со стороны комплемента у гематологических больных. В сб. "Системные аспекты патологии". 1991, СПб, 12-14.

13. Галебская Л.В., Щербак Л.Д., Герус А.И., Рюмина Е.В., Соловцова И.Л. Новые показатели состояния комплемента при обследовании больных бронхиальной астмой. Сб. "Актуальные вопросы пульмонологии", 1991, СПб, 37-40.

14. Щербак И.Г., Галебская Л.В., Рюмина Е.В. Способ определения активности комплемента. Патент РФ N 1727075, 1992.

15. Бельтюков П.П., Богомаз Т.А., Галебская Л. В., Рюмина Е.В., Сачков A.B., Щербак И. Г. Воздействие карбогала на систему комплемента в модельных условиях и в эксперименте на животных. Гемагол. и трансфузиол., 1992, 37, N7/8, 27-28.

16. Щербак И.Г., Галебская Л.В., Рюмина Е.В. Способ определения активности комплемента по альтернативному пути. АС N 1798695, 1993.

17. Галебская Л.В., Бельтюков П.П., Рюмина Е.В., Соловцова И.Л., Щербак И. Г. Концентрационно-функциональные взаимоотношения в альтернативном пути комплемента человека. Биохимия, 1993, 58, N11, 17961800.

18. Щербак И.Г., Галебская Л.В. Регуляция каскадных протеолитических систем. В сб. "Структура и функция протеолитических ферментов", 1994, М., 26.

19. Troitzkaya V.B., Aganezov S.A., Shcherbak I.G., Galebskaya L.V., Baykova N.V., Marnychenko

G.V. , Knetzov F.L., The protective effect of subcutaneus injection of boiled pancriatic juice on acute necrotizing pancreatitis in dogs. Int. Med. Revs., 1995, 1, N 1, 5-8.

20.Galebskaya L.V., Shcherbak I.G., Tarasova J.V. , Imitation of complement dependnt hemolysis, based on lechy-patch and douqhnut hyptheses. J.Biochem. Organization, 1995, 2, N 2, 1-7.

21. Аганезов С.А., Шербак И.Г., Галебская JI.B., Соловцова И.Л., Рюмина Е.В., Троицкая В.В., Байкова

H.В., Активность системы комплемента сыворотки крови у собак лри лечении острого деструктивного панкреатита прокипяченным поджелудочным соком / / Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 1995, N 3, с.18-21.

22. Лебедев Л.В., Гусинский А.В., Смирнов А.Д., Шарова О.Л., Галебская Л.В., Сокуренко Г.Ю., Савинов Л.Ю., Виноградов Л.Г., Гордеев Н.А., Дмитриевская И.О., Способ изготовления сосудистого трансплантанта. Патент РФ N 1351586, 1995.

23. Галебская Л.В., Щербак И.Г., Бельтюков П.П., Дорофейков В.В., Структура и свойства внеклеточных белковых регуляторов протеолитической фазы активации системы комплемента. Биохимия, 1995, 60, N 5, 668-677.