Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация эритроцитов авидин-биотиновым комплексом: стабильность в сыворотке и взаимодействие с гомологичными ядерными клетками

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Модификация эритроцитов авидин-биотиновым комплексом: стабильность в сыворотке и взаимодействие с гомологичными ядерными клетками"

%

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК Кардиологический научный центр

На правах рукописи

Зальцман Алла Борисовна

МОДИФИКАЦИЯ ЭРИТРОЦИТОВ АВИДИН-БИОТИНОВЫМ КОМПЛЕКСОМ: СТАБИЛЬНОСТЬ В СЫВОРОТКЕ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ГОМОЛОГШНЫМИ ЯДЕРНЫМИ КЛЕТКАМИ

ОЗ. 00. 04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Робота выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Кардиологического научного центра РАМН.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук, ст. н. сотр. В Р. Музькантов

Официальные оппоненты: академик РАЕН, доктор биологических наук, профессор Яралин А. А.

кандидат биологических наук, вед н. сотр. - Сахаров Я й

Ведут в учреждение: Гематологический научный центр РАМН

Защита диссертации состоится "26": ЛЛСС-^А 1993 г. в М часов на заседании специализированного ученого совета К 001. 22.02 в Кардиологическом научном центре РАМН по адресу. 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Кардиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан

декабря 1992 г. Ученый секретарь специализированного совета,

ОВЫЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. В последние годы в ; заливных областях

биологии и медицины все шире используется аюидин-биотиноаый комплекс <АБК> (Wilch«fV<r 1989> . Компонентами комплекса являются:

авидин - гликопротеиду имеющий сильный положительный заряд <pl

*

выие 10) либо его бактериальный аналог, незаряженный белок охрвптаандин и биотин« АБК представляет собой уникальную переиивапиуп еистеку. Высокая аффинность» специфичность и поливалентность взаимодействия авидни-биотин обеспечивает разнообразное применение АБК как in vitro, так и in vivo (Wilchebs 1988)* Основные области применения АБК in vivo это икиуносцинткграфм* (Hnatoniich* 1987) * ускоренный клиренс веществ на крови <9init»yvv 1989) / доставка иммунотохсинов (Philpott* 1900), изучение функционирования клеток CBuzuki/ 1987). Однако, в некоторых работах по применению авидин-биотина а культурах клеток и in Viva указывалось на »«»специфическое взаимодействие авидина, авидиннесуыих обьектов с клетками и тканями организма (Fritz, 19Ö6T BcHechter, 1ЭЭ0 и др.). Это обстоятельство делает необходимым детально« изучение биосовместимости частип и клеток, нс»ди^ииироьаннь*х авилм»- биотипом. Эритроциты, модифицированные комплексом авидин-биотин - хорошая модель для изучения «того вопроса. Теки« аритроииты сами часто выступает как о-Зьект маченияг авидмн-биотином и применяются in vi vo• Имеются интересные перспективы применения «ритроцитов* модифицированных АБК* для клиренса патогеном из организма (Taylor, 1ЭЭ2>,- направленного Tpaitcnopra лекарств (B¡**oUhin, 198Э).

Биосовместимость кодифицированных эритроцитов определяется *>

преуде всего, их стабильностью ь сыворотке,- то &стк устойчивостью в комплементе/ а такхе взаимодействием с клетками и тканями организма/ а частности/ с клетками ретикуло-андотелиальной системы (РЭС). Исследование Биосовместимости аритроцитов/ модифицированных АБК, было начато группой исследователей ИЭК КНЦ при изучении возможности применения таких эритроцитов в направленном транспорте лекарств <5атокЬ1п, 19вЗ). Было обнаружено, что прикрепление ааидина к биотинилироаанныи эритроцитам вызывает им лизис гомологичным комплементом <№игукапЪоу, .

Эти предварительные результаты показали необходимость подробного изучения влияния авиднн-бнотинового комплекса на стабильность эритроцитов в сыворотке и их взаимодействие с гомологичными ядерными клетками. С другой стороны/ само явление индуцируемой авндином трансформации эритроцита а активатор комплемента весьма интересно/ так как представляет собой неизвестный ранее феномен. Кроме того/ комплемент может выть использован для регулируемого "вскрытия" иммуноэритроцитов, используемых а качестве контейнеров для направленной доставки лекарств.

Цель исследования: Изучить влияние модификации паидин-биотинои на усточивость эритроцитов в гомологичной сыворотке и их взаимодействие с гомологичными ядерными клетками.

Задачи исследования:

1.Изучение механизма лихие* ааидиннесучих эритроцитов комплементом.

2. Поиск нелитических способов прикрепления авидика к мембране аритроцитов.

3. Изучение взаимодействия ввияиииесуних эритроцитов с гомологнч-

кымк ядерными клеткани и помок способов его регуляции* 4., Изучение возможности регулируемого лизиса биотинилированным «ритроцитов при их взвимодействии с ©еидннозой мишенью. Научная новизна и практическая ценностк работы:

Изучен неизвестный ранее механизм трансформации нормального эритроцита в активатор комплемента. Обнаружен феномен адгезии авндиннесушкх эритроцитов к гомологичным ядерным клеткам и выяснен ее мекекнзм. Предложены варианты иммобилизации а еж дина на мембран«»- не выэгываедхе активации комплемента« Предложены пути отмены неепеиифкчеекого свяэьагшкя а&идинкесу^их эритроцитов с гомологичными ядерными клетками. Предложен новыя подход к решению задачи регулируемого лизиса иммуноэритроцитоа после саязыаани* ик с миценыо. получены стабильные в сыворотке иммуноеритроциты/ аффинные к мишени/ которые лизируются после введения аполитически активных антител. Получены кииенъ-чувствительные эритроциты: стабильные в сыворотке биотинилмрованны* эритроциты лизиру»тся комплементом после связывания с авидчновоя мииеныо • Апробация работы. Диссертация апробирована на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН (Москва, 1992>. Материалы работы были доложены иа 4-ой Европейской конференции по комплементу (Лейден, Нидерланды, 1992)/ на 6-ой Международной конференции Международного обществе по воспалению <Вайт-Хеаеи/ США/ 1992>• Материалы диссертации изложены в Э публикациях.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из разделов: Введение» Литературный обзор. Материалы и методы/ Результаты м обсуждение^ Выводы и Список литературы. Общий обьем работы

3

составляет tí)b страниц машинописного тексте, включая 31 рисунок н 1S таблиц« а теки* список цитируемой литературы/ вклпчаюмнй называний.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. А&ндин выделяли ил куриных яиц как описано (Oreen» 1970). Активность юьияиив определяли спектрофотометрическим титрованием биотипом (Oreen, 1S70), Сенсибилизированные кроличьими гемолитическими антителами »ритроииты варана готовили по методике (Muíyl<antciVí 1933). Для присоединения авидкна ермтроцкты • модифицировали следуюыиии способами:

1> Стандартное биотимилнрование N-гндроксисукиннимидныин ефирами биотина ÍMuíykantov» 198£>.

2) Встраивание биотиммл-липида в мембрану еритроцитов (Музыкантов/

1391)■

3) Обработка таннимом по стандартное методике (Bouden, 1931).

*> Виотиннлмрование риииив по стандартной методике (Samokhin/ 19ЭЭ). и' прикрепление бнотинил-риимна к галактозным остаткам мембраны эритроцитов.

Добавление ввндина (стрептавидмна) к модифицированным арнтроиитвм проводили по описанной ранее методике (Музыкантов, 1991>. Для количественного определения связывания авидмна с поверхностьв эритроцитов ааидмн метили 1231 прн помомн реактива Волтоиа-Хантера в соответствии с рекомендациями фирмы.

Фиброблаеты человека <6-1* пассах и) и* кокк предплечья моровых добровольцев были предоставлены И.В.Фуки. Для експерииеита мспольэоа&лм кокфлиентнув момослойнуа культуру в планиетах "Muí-tiне11 <2* лунки). Клетки на сосудистой стенки человека были

4

предоставлены В .А »Романовым• Для работы использовали конфлюентные монослойные культуры 2-4 пвссах9Й » стандарт]*»** планшетах (24 лунки). Клетки из печени крыс были предоставлены А.&.Бочаровын. В работе использовали свехевыд«леммы« клетки.

Связывание авидиннесумих эритроцитов с культивируемыми клетками проводили а иультуральных планшетах. 10 мкл 10*. суспензии эритроцитов вносили а лунки» содержание монослоя клеток а ЗЗО мкл вероналового буферного раствора СВБР). Поел« часовой инкубации на холоду»- несвяэввмиеся еритроциты отмывали буфером» после лилиеа дистиллированной водой определяли количество адгезиро&анных аритроцитов по поглощению гемоглобина на 405 ни в аликвотах лнватов. При исследовании влияния агентов на адгезию аритроцитов, их вносили а инкубационную среду перед внесением аритроцитов.

Тестирование агглютинационной активности авидина и стрептааиднна проводили по < Музыкантов,- 1990>. Тестирование гемолитической активности комплемента проводили как описано ранее <Мигу1<а*гЬо^ 1985> . Осмотическую резистентность аритроцитов определяли по унифицированному методу (Идельсон, 1979). Теки аритроцитов для электрофореза получали добавлением на холоду к осадку эритроцитов 5иМ КН2РО4. После инкубации на холоду» тени аритроцитов отмывали центрифугированием а 5мМ КН4. нв тыс,

об/мин. На всех стадиях к суспензии теней еритроцитоа добавляли ингибитор протеаа РМБР. 5Е>!3-полмакриламидный, градиентный гель-електрофорез теней эритроцитов проводили по МеЬаг . и ОъЬогп <1Э69>, используя буферную систему (.аемгнпН <1970). "*6лоттинг на нитроцеллюлозу проводили в соответствии с СегаИот и Ра1.ас<е <1983>. Проявление биотинилированмыч компонентов проводили с помоиь» стрептавидин-фосфатазм.

Для сорбции авидина на пластиковую поверхность вносили 5 мкг авидина & ВБР в луики планшетов и инкубировали на холоду 1& ч, После отмывки дистиллированной водой/ вносили раствор бычьего сывороточного альбумина в физиологическом солевой растворе <ФСР)/ 'инкубировали 1 ч/ отмывали водой. Поверхностную плотность сорбированного авплииа определяли по -авидиНу определяя радиоактивность/ связанную в лунках.

Связывание бртотннилированных эритроцитов с пластиком определяли после часовой инкубации внесенных в ВБР, добавленный в лунки« 23 мкл 1-^-ной суспензии эритроцитов. Несвязавмнеся эритроциты удаляли отмывкой ФСР. Оставшиеся аритроциты лизировалм водой/ их количество определяли по - оптической плотности гемоглобина в алнкаотах лизатов на 405 им.

Лизис комплементом аритроцитов/ связанных с авиднновой мишень» определяли после внесения сыворотки в лунки до нужного разведения в ВБР м инкубации 1 ч при 37° С. Степень лизиса определяли по оптической плотности гемоглобина в супернатантах ив 403 мм. 100* лкзис определяли по лизису аритроцитов в воде. Зв ноль лизиса принимали оптическую плотность в лунках/ не содержащих сыворотки.

РЕЗУЯЪТЛТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Изучение лизиса ааиднннесуыкх аритроцитов комплементом.

Прикрепление авндина к мембране аритроцитов/ биотинилироввнных М-гидроксисукйинимидныи ефиром биотина вызывает лизис гомологичной сывороткой аритроцитов илекопитавких разных видов: человека/ барана/ кролика/ крысы <не показано). Это свидетельствует об универсальном характере индуцированной ввидином трансформации нормального эритроците в активатор

•6

комплемента.

Для выяснения роли положительного заряда аанднна а активации комплемента, мы изумили способность стрептавидиннесуынх эритроцитов индуцировать лиане. Стрептавндиннесу«и© эритроциты г также как и авиднниесуцие, активируют комплемент и эффективно лиэнруются в гомологичной сыворотке <рис.1). Таким образом, активация комплемента но связана с зарядом азидмна.

При поливалентном взаимодействии с биотннилированноя мембрэноп эритроцита аш1дин "перешивает" компоненты мембраны. Стрептавидин также имеет 4 бнотиневяэывающих центра и способен к поливалентному взаимодействию, что подтверждается высоким титром агглютинации биотинилированных эритроцитов в присутствии стрептавиднна« Уменьшение степени Сиотинилирования эритроцитов* снижающее вероятность поливалентного взаимодействия авндина с мембраной г приводит к уменьшению лизиса Ске показано) • Таким образом, вероятно«- что определяющим фактором в активации комплемента является "перешивка" ¡авидннои биотинилироеанных компонентов мембраны. Вместе с тем, такая перешивке не только не снижает, но даже повышает стабильность эритроцитов в гипотонических солевых растворах. В 0,Л * растворе лизис зритроиитоа, биотини-

лированнык коротким Вз.-Афирои бнотина или длинным, имеющим ? А^-спейсер, Й2" эфиром биотнна (ВхЯБС и В^ЯЕС, соответственно) и несу «их шайена биоткннлироаанных эритроцитов них*, мех иагмоныя <рис,2>. Значит✓ модификация авидин-биотином, не сннасая осмотической резистентности «ригрокитов^ снижает их стабильность в комплементе, т,е., специфическое взаимодействие ааидина Сстрептавндина) с биогинилироаанными компонентами мембраны трансформирует нормальный эритроцит в активатор комплемента.

РАЗВЕДЕНИЕ СЫВОРОТКИ

Рис. I. Лизис гомологичным комплементом авидин- и стрептавидин-несущих биотинилированных эритроцитов человека. Д. биотиншшрованные эритроциты; О авидиннесущие эритроцитц ф стрептавиданнесущие эритроцита

1 — ноглибные эритроциты

2 — Сиотшилированные В,ОБи эритроцигты

3 - биотшилиробанныв ВгОЗД эритроциты

4 — сбивиннесущио эрипроциты

Рис. 2. Лизис модифицированных эритроцитов в гипотоническом (0,4%) растворе КаС1.

При обработке эритроцитов сукиинимидными эфирвми биотина био-тинилируится аминогруппы мембранных белков, пс "«току последуиыее прикрепление авидина происходит к биотинилироваиным белковым компонентак мембраны* Среди мембранных белков есть белки регуляторы комплемента: CR1 - мембранный рецептор СЗа, лооыиаюцнй сродство СЗв к сывороточным ингибиторам^ DAF - прямо имгибируищий СЗв-компонент и инактиваторы терминальных компонентов комплемента - HRP" И MIRL <Pangburn/ 19S6). Мы предположили^ что переыивка белков-регуляторов комплемента н и* перераспределение в мембрвме отменяет рестрикцию комплемента и приводит к лизису ааидиннесуыих эритроцитов. Электрофорез теней биотинилироаанных эритроцитов и •лектроблоттинг на нитроцеллюлозу с проявлением стрептавмдин-фосфатвзой показал/ что среди белков»- преимущественно биотини-лируюцихс* N-гидрокснсукцикммидным эфиром биотина/ есть белкиt молекулярные веса которых, соответствуют молекулярным весам белков-регуляторов комплемента - CR1, DñF, HRP <240,70,20 кД соответственно) (фотогр.1).

Известно , что активация комплемента может проходить либо по классическому пути, за счет взаимодействия Clо-компонента комплемента с комплексами антиген-антителолибо по альтернативному пути, за счет прямого взаимодействия С3в~ компоненте комплемента с поверхностью активатора; Ранее было показано, что ааияиннесуци« биотинилкро&анные эритроциты активируют комплемент по альтернативному пути, т.е., отменяют

о

гомологичную рестрикцию альтернативного пути комплементе (Музыкантов, 1990). Однако/ мембранные белки-регуляторы комплемента контролируют активацию как альтернативного/ так и классического

Фотография 1. Электрофорез и злектроблоттинг теней нативных и биотиннлирооанных эритроцитов•

340

' -У *

■ «

3020-

А В

1 - ЭЛЕКТРОФОРЕЗ А - BRBC

В - нативкыв эритроциты

А

2 - ЭЛЕКТРОЕЛОТГИНГ А - ВЛВС

В - матианые эритроциты

пути коиллашита <АПК и КПК) «Schenermark, 1986) • В связи с этим, мы предположили, что прикрепление авидина повлияет и на рестрикцию КПК. Сенсибилизация еритроиитов варана гемолитическими антителами вызывает активацию гетеролох-нчного комплемента по КПК и »х лизис в гетерологмчной сыворотке (сыворотке морское свинки). В гомологичной сыаоротке такие сенсм&илиаироаанные «ритроциты не лизирумтся (рис.З.А), так как гомологичный комплемент находится под эффективным контролем мембранных ингибиторов: CRI, DflP, MIRL,

в

разбеОение сыЙоротки морскоа сЙи-ка (а)

О - биотинилироЭанныв эритроциты Ф - авиЭиннэсущиа биотинилирсЛсяные эритроциты

Рис.3. Устойчивость к лизису сенсибилизированных гемолитическими антителам! эритроцитов барана А - в гетерологичной и в гомологичной сьворотке. В - в гомологичной сыворотке, влияние авидина.

HRF. В гомологичной сыворотке отсутствует также лизис биотини-лированных эритроцитов, сенсибилизированных гемолитическими антителам». Однако прикрепление ааидина к биотинилироваиныи зритроиитам барана/ сенсибилизированным гемолитическими

антителами/ вызывает ик лизис в гомологичной сыворотке по классическому пути, т.е., прикрепление авидина/ вызывает отмену гомологичной рестрикции КПК С рис.3, В). Поверхностная плотность анилина при «том была ниже той, которая вызывает антитело-независимый лизис эритроцитеа по АПК.

Полученные результаты подтверждает высказанную ранее гипотезу о роли поливалентного взаимодействия ааидина с биотииилироаанныни компонентами мембраны в том числе / белками-регуляторами комплемента в активации комплемента и показывает, что авидин/ прикрепленный к биотинилированнык белкам мембраны отменяет гомологичную рестрикция как АПК/ так м КПК.

Влияние способа прикрепления ааидина на активации гомологичного комплемента авидиннесуними эритроцитами.

Иы научили устойчивость к лизису комплементом эритроцитов, авидин к которым прикреплен не через сукцинимидные ефиры биотина. Оказалось, что прикрепление авидина к липидам мембраны через фосфатидилэтаноламин-биотин не вызывает лизиса комплементом. Значит,- авидик сам по себе не является активатором комплемента. Индуцируемый им лизис, очевидно/ зависит от того, с какими именно компонентами мембраны взаимодействует авидин. Это отличает аамднн от известных активаторов комплемента (антител/ фактора яда кобры и др.) и позволяет предполагать возможность различных вариантов иммобилизации авидина на мембране/ не вызывавших

12

активации комплемента и лизис:а эритроцитов. Действительно, только прикрепление авидина к аминогруппам мембраны индуцирует лизис комплементом, а прикрепление через биотинил-липид, таннин, биотинил-рицин не вызывает лизиса комплементом (табл.1).

Таблица 1. Индукция лизиса авидиннесуцими эритроцитами.

Перешивающий агент Якорь Лиэис

Короткий эфир биотина аминогруппы аффективен

Длинный эфир биотина аминогруппы очен)» аффективен

Биотинил-липид липиды не аффективен

Таннин 1 не аффективен

Бнотинил-рииин галактоха не аффективен

Мы показали, что к резистентным к комплементу, авидиннесущим . таниизировамнын эритроцитам можно прикрепить бнотинилироаанные антител^, обеспечивамиие связывание иимуноэритроцитов с инменыо. Вместе с тем, шти иммуноэритроциты могут быть лиэированы комплементом при добавлении гемолитически активных антител, например, антител против авидина, что дает возможность регулируемого лизиса иммуноэритроцитов в комплементе. Таким образом, получены стабильные в сыворотке, аффинные к мишени авидиннесуине эритроциты, которые могут быть лизмрованы введением гемолитических антител. Такие нммуноеритроциты могут быть предложены для использования а направленном транспорте лекдрста в' организме* В то ее время^ приведенные результаты показали важную роль способа иммобилизации «видима а активации комплемента и явились е«е одним аргументом в пользу высказанного предположения о роли поливалентного специфического взаимодействия авндииа с

Ьиотинилировянныки мембранными белками/ в ток числе регуляторами комплемента в индукции лизиса авндиннесуних бнотнни лированных эритроцитов.

Взаимодействие авиднннесуних аритроиитов с гомологичным) ядерными клетками.

При изучении взаимодействия авидиинесучих аритроиитов с гомологичными ядерными клетками.- больную часть экспериментов мь проводили на фибробластах кожи человека а культуре, любезно предоставленной Фуки И.В. СИЭК). Фибробласты по современной классификации относятся к РЭС, является удобной,- мкроко применяемой моделью ядерных клеток.

Авиднннесуыие бнотинилированные аритроциты связываются с фибробластанн человека. Нативные и бнотинилированные аритроциты с фибробластами не взаимодействуют (рис.4>. Бнотинилированные аритроциты/ несучме стрептавидин/ не взаимодействуют с Фибробластами. Адгезия/ как и лизис / зависит от поверхностной плотности аандина на мембрана еритроцита: снижение поверхностной плотности них* 100 тысяч молекул на еритроцит вызывает резкое падение связывания с фибробластами. Однако/ в отличие от лизиса комплементом/ адгезия авидиннесучих аритроиитов к гомологичным клеткам не зависит от способа прикрепления авиднна к мембране. Прикрепление авидинв через короткий и длинный «фирм биотина/ СиотиниллмгшЯ/ через таннин и биогинил-рицин обеспечивает связывание аритроиитов с фибробластами (не показано} •

Хелаторы/ мвнноаа - основная структурная единица углеводной части аандина, температура инкубации не влияют на связывание с клетками. Не влг чет на связывание свободный биотин а среде инкубации/ что свидетельствует о "неспеиифическом" характера

Рис. 4.

1.5

1.0

0.5

щ £

Рис. 4. Адгезия авидиннесущих эритроцитов человека к гомологичным фибробластам в культуре клеток. I - нативные эритроциты, 2 - биотинилированные эритроциты, •з - авидиннесущие биотинилированные эритроциты, 4 - стрептавидиннесущие эритроциты.

Приведены значения среднего и стандартной ошибки среднего, п=с! (в столбцах 1,2 и 4 ошибка среднего не показана из-за несоотвествия масштабу).

Рис. 5. Адгезия авидиннесуших эритроцитов человека с гомологичные! ядерными клетками в культуре. I - фибробласты, 2 - гладкомышечные клет]

3 - эндотелий из пупочной вены,

4 _ --------

клетки из аорты,

.дотелип из легочной артерии. Левые столбцы - инкубация эритроцитов с клеткам происходила в отсутствии гепарина, правые столбцы - в среде присутствовал геп.фнн (С I .'.т/мл). Приведены значения среднего■ и стандартной ошибки среднего. г,=3.

связывания. Полиэлектролиты в сред» инкубации (в той числа га-парнн) полностью ккгнбкровалн связывание,- причем мы показали/ что если влияние полианионоа объясняется их взаимодействием с положительно заряженный авидином н отмены связывания за счет нейтрализации заряда авидина,- то влияние поликатионов нохиа объяснить их конкурентный (по отношению к авидину) взаимодействием с отрицательно заряженным гликокаликсом.

Лвидиннесушн» еритроииты человека взаимодействуют и с другими кле-ткаии человека в культуре! гладкомышечными клетками, эндотелием пупочной вены, эндотелием легочной артерии <рис.5>. Гепарин в среде инкубации отменяет адгезию во всех случаях. Интересно, что гепарин <и некоторые другие полиэлектролиты) также угнетают - лизис авидиннесумих биотинилированных эритроцитов конплеиентои (не показано). Однако имеющиеся литературные данные и наши собственные результаты -дают основания считать ✓ что угнетение лизиса в этом случае связано с прямым . ннгибирующнх действием гепарина на комплемент.

Ны сравнили адсеаивность авидиннесумих эритроцитов крысы к различным типам клеток печени крысы. Было обнаружено * что в отличие от купФероцитоа н гепатоиктоа с которьсни

взаимодействовали авидиннесуиие эритроциты,- к ендотелиальным клеткам печени крысы такие эритроциты не прилипали (не показано). Это сильно отличает этот тнп клеток от остальных изученных.

Сравнивая два явления* обусловленные наличием ааидина на мембране эритроцитов и алиявмие на биосовместимость таких эритроаитоь/ иы свели их характеристики в итоговую таблицу (табл.2). Из -аблицы следует« что хотя и лизис комплементом

ввидиннесущих биотинилированных эритроцитов и их адгезия К ГОМОЛОГИЧНЫМ ядерным клеткам обусловлены наличием авидина на мембране, механизиы этих процессов различны.

Таблица 2. Лизис ааиднннесучих эритроцитов комплементом и их взаимодействие с гомологичными ядерными клетками.

Лизис

Адгезия

Активность авидина

Активность стрептавидина

Зависимость от двухвалентных ионов

Зависимость от температуры

Зависимость от способа прикрепления ааидкна

Ингибнровами* Полиэлектролитами

Предполагаемый механизм

Активен

Зависит

Зависит

Зависит/ требуется поливалентное прикрепление к белкам

Ингибируется• за счет взаимодействия полиелектролитов с комплементом

Реорганизация и инактивация мембранных регуляторов комплемента за счет поливалентного связывания авидина

Активен

Не активен

Не зависит

Не зависит

Не зависит

Ингибируетсяла счет взаимодействия полиэле"Ктро-литов с авидином

Взаимодействие положительно заряженной молекулы авидина с отрицательно заряженными компонентами поверхности клеткн

Мимень-чувствительные иммуноеритроцнты: связывание

биотинилированных ермтроцитов а авидиновой мимень» и их лизис гомологичным комплементом.

Способность авидмннесумих еритроиитов активировать гомологичный комплемент и лиэироваться а нормальной сыворотке может быть

использован« в качестве нового подход« для создания эритроцитов, аффинных к мимени и способных высвобождать свое содержимое при контакте с ней. Для этой цели можно сначала вводить комплекс -биотниилнроввнное внтитело-авидин и, после его фиксации в зоне доставки, вводить стабильные в кровотоке биотинилмрованные эритроциты. Можно предполагать, что биотнннлированные эритроциты будут связываться с покрытой авидином миненью и, возможно, лмзироваться комплементом за счет взаимодействия с авидином. На рмс.6 показано, что биотинилмрованные Вх~ н В2~эфирами бмотина эритроциты (В^РШС и ВгЧВС) аффективно и специфично взаимодействуют с авидином, но не с альбумином. Кативмые эритроциты с авидиновой подложкой не связываются. При

разрежении авидинового покрытия связывание биотинилнроаанных эритроцитов уменьшается, причем более значительно для В^ЯВС, чем для В2&ВС <рис.7). Связывание свободного авидина биотини-лироаанными эритроцитами в суспензии практически одинаково для В^ЯВС и В2^ВС на всем интервале концентраций добавленного авидина (не показано)• Это свидетельствует о сумественных стерических ограничениях в случае связывания биотииилироваииых эритроцитов с иммобилизованным авидином. Поэтому, При снижении поверхностной плотности авидина следовр длинного эфира биотина обеспечивает болькее число контактов биотинилированной мембраны аритроцита с авидиновой подложкой-мишенью. Несмотря на значительные

стерические затруднения, биотинилированные эритроциты, стабильные в гомологичной сыворотке, лизировалнсь - комплементом после закрепления на авидиновой мишени. Эффективность лизиса Вг"ВС суыественно выше, чем ВхЯВС (СИ 30 различается вдвое). В^ЯВС

ВНЕСЕННЫЕ ЭРИТРОЦИТЫ 106/лунку

Рис. 6. Связывание биотинилированных эритроцитов с авидиновой мишенью. ' Кружки - ЗВ1, квадраты - ЭВ2, треугольники - немодифицированные эритроциты Закрытые символы - на пластик сорбирован авидин, открытые символы - на пластик сорбирован альбумин (э мкг авидина инкубировали в лунке в ЗФР в течение ночи на холоду).

Рис. 7. Связывание биотинилированных эритроцитов ЭВ1 (квадраты) и ЭВ2 (кружки) с пластиковыми поддонами, на которых был сорбирован авидин (указаны концентрации авидина, внесеного в лунки для сорбции).

лизмровались только на 50-60 Я, ' тогда как ВгЯВС лизировались практически полностью <рне.8). Сравнение лизиса B2RBC при ьзаиио действии с авидином в растворе и иммобилизованным на пластике авидином показывает,- что лизис в растворе идет эффективнее (рис.9) . Это еще раз свидетельствует о значительных пространственных затруднениях при взаимодействии Виотинн-лированных эритроцитов с авидином* иммобилизованным на поверхности. Изученная зависимость связывания Вг^ВС с авидиновой поверхность* и их лизиса комплементом от поверхностной плотности авиднна показала, что для эффективного лиэнса требуется больнее число контактов биотинилированной мембраны эритроцита с авидиновой поверхностью* чем для связывания. Интервал поверхностной плотности авидина для эффективного связывания эритроцитов с поверхность» - 0*7-2*0-10*2 молекул/си2* в то время как критическая поверхностная плотность авидина для лизиса не ниже* чем 1-2-1012 молекул/си^. Описанная модель показывает принци-

пиальную - возможность использования нового подхода для создания мишень-чувствительных контейнеров в направленном транспорте лекарств в организм*.

В отдельной серии экспериментов мы изучили доступность фибриногена* сонкмобилкзованного с авидином на пластиковой подложке* для радиоактивиомеченных антител в растворе. Оказалось* что связывание В2^ВС с такой подложкой приводит к уменьшению связывания антител (И.в. около 180 кД) . Это свидетельствует о недоступности мембраны биотннилироввнных эритроцитов в участке ее контакта с иммобилизованным авидином для компонентов комплемента (М.в. СЭ-компонента комплемента - 180 кД>. Полученный результат выявляет - противоречие между фактом лизиса биотинилированных

1/1280 1/320 1/50 1/20 1/5

РАЗВЕДЕНИЕ СЫВОРОТКИ

Рис.8. Лизис биотинилированных эритроцитов ЭВ1 (квадраты) и ЭВ2 (кружен) гомологичным комплементом. Перед внесением комплемента (пулированная сыворотка человека) биотинилированные эритроциты были прединкубированы с пластиком, покрытым авидином (закрытые символы), или с пластиком, покрытым альбумином (открытые символы).

РАЗВЕДЕНИЕ СЫВОРОТКИ

Рис. 9. Лизис гомологичным комплементом ЗВ2 после контакта с авидином. Авидин добавлен в суспензию (квадраты) или сорбирован на пластик (кружки). Показан фоновый лизис ЭВ2 в отсутствие авидина I треугольники)

эритроцитов на авндиновой подложке н неспособность» белков комплемента взаимодействовать именно с тем участком мембраны/ на котором должна происходить активация комплемента. Возможно/ механизмы лизиса комплементом биотикилированных аритроцитов при взаимодействии с авидином в суспензии и при их связывании с авидиновой подложкой различны/ однако/ в настоящее время мы ие имеем достаточных данных для доказательных/ в не спекулятивных рассуждений по данному вопросу. Хотя атот вопрос и выходит за рамки поставленных нани задач/ на нам взгляд/ дальнеймее изучение этого механизма весьма интересно и может ствть предметом самостоятельного исследования/ поскольку важно не только в отно-мении описанной системы/ но и в связи с резистентностью ядерных/ в частности/ опухолевых/ клеток к комплементу.

ВЫВОДЫ. '

1. Лвидин/ прикрепленный к биотииилироввнным белкам мембраны еритроцита,- отменяет гомологичную рестрикцию как альтернативного/ так и классического пути комплемента у различных изученных видов млекопитающих. Критическая поверхностная плотность авиднна для отмены рестрикции классического пути существенно ниже/ чем для отмены рестрикции альтернативного пути.

2. Причина снижения устойчивости в комплементе модифицированных авндин-биогином аритроцитов не в изменении стабильности мембраны/ вызванном модификацией/ ев специфическом взаимодействии авидина с биотинилироввнными компонентами мембраны/ в том числе белками-регуляторами комплемента (СЯ1, ВЙР, НЯР).

3. Положительный заряд авидина не играет роли в активации

22

гомологичного комплемента авидиннесумиин эритроцитами. Инду-

иировпиныя авидинок кокплвмвнтзависикый лизис эритроцитов зависит

«

от способа иммобилизации ааидина на мембране эритроцита. Прикрепление авидкна< к мембране эритроцитов через танник, биотинил-липид? биотинил-рицин не вызывает активации кокплекента и может быть предложено для получения стабильных в сыворотке иииуновритроцитов.

4. Лвияиннесумие эритроцита неслецифнчески связываются с гомологичными ядерными клетками. Причиной адгевии авидиннесумих эритроцитов к гомологичным ядерным клеткам является положительный заряд ааидина. Снижение поверхностной плотности ааидина, замена ааидина на стрептааидин ^ введение полианионовt а том числе гепарина/ отменяет неспецифическое связывание авндиннесуикх эритроцитов с гомологичными клетками.

5. Л) Получены стабильные в сыворотке авндмннесуйие иммуноаритро-циты, аффинные к мишени. Такие иммуноэритроциты могут быть аскрыты а зоне миыфнн после введения гемолитических антител.

В) Получены мимень-чувст&нтельные эритроциты. Показано» что стабильные а сыворотке бнотииилированиые эритроциты. аффинны к авмднноаоа мииени и лизируются комплементом после связывания с ней.

Список работ по теме диссертации.

1. V, Muzykantov, M.Smtrnov, fi. Zelfcxman, D.BamoKhtn. Activation of gomologous complement by membrane-bound avidin depends on the mode of the avidin attachment to «eotiram. Immunobiology, 1вй, 4/5, p. 440-4AS (Abstr. Ath Europsan Workahop on the Complement, May 1ЭЭ2, Leiden, The Netherlands).

2. V. Muiykantov, M.Srtiirnov, Д. Zaltiman. 1392. fWidin attachment

to tu otini lated erythrocyte» eliminates homologous restriction of the both classical and alternative pathway of the comple/ftent. Abatr. 6th International Conference of International Inf lammet Ion fismociat ion, SeDtember 1992, White Haven, РЙ, USA, o. IS. 3. V. Muxykantov, M.Smirriov, fl. Zaltzman, Q. Bamokhin. 19Э2. Tannin-mediated attachment of avidin provides complement-resistant immunoeryt rocytes which can be lysed in the presence of complement activator. Anal. Blochen., v. 208, 1Э93, in press, *. В.Музыкантов, А.Зальцман,7 И.Луки, К.Смирнов, Г.Самохин, О.Романов. Взаимодействие авидиннесуцих еритроцитов с

гомологичными ядерными клетками*. Биолог, мембраны, т. 10, N 3-4, 1993, в печати.

S. В.Музыкантов, И.Смирнов, А.Зальцман, Г.Самохин. Опосредованное таннином > прикрепление авидина к эритроцитам не вызывает их лизис комплементом. Биохимия. В печати.