Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетика легких цепей иммуноглобулинов американской норки

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетика легких цепей иммуноглобулинов американской норки"

<<0 _ # Я4

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт цитологии и генетики

на правах рукописи УДК 575.1599.7414

ВОЛКОВА Ольга Юрьевна

ГЕНЕТИКА ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ АМЕРИКАНСКОЙ НОРКИ

ГЕНЕТИКА - 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1993

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель -

, Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор [О.К.Баранов]

доктор биологических наук Е.И.Каракин,

Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

кандидат биологических наук С.П.Князев,

Новосибирский государственный аграрный университет, г. Новосибирск

Ведущее учреждение - Институт общей генетики РАН

им. Н.И.Вавилова, г.Москва

Зашла диссертации состоится " 3 - (М^^юй^ 1993 г. на -(¿УрМ&е,И* заседании специализированного совета по защитетдассертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д - 002.11.01) при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

л

Автореферат разослан " ^ " 1993г.

Ученый секретарь

специализированного совета __

доктор биологических наук --А.Д.Груздев

и

Актуальность исследования. Генетические системы аллоантигенов, т.е. антигенов по которым отличаются гомологичные белки особей одного вида, описаны у человека, лабораторных и сельскохозяйственных животных. Высокая специфичность имуногенетических маркеров обуславливает их широкое использование при решении как фундаментальных, так и прикладных вопросов в различных областях современной биологии, медицины, животноводства и ветеринарии. Из большого числа иммуногенетических систем групп крови, тканевой совместимости, сывороточных белков по степени изученности несомненно выделяется надсемейство генов иммунологических рецепторов, частью которого налается мультигенное семейство иммуноглобулинов (ИГ).

Семейство генов ИГ несет генетическую информацию для обеспечения у позвоночных функции гуморального иммунитета, т.е. синтеза множества антител. Характерными чертами этого семейства являются представленность в нескольких хромосомах, разнообразие форм генов, кодирующих разные цепи и их отдельные элементы, уникальные перестройки генов в ходе онтогенеза и иммунного ответа, избирательность экспрессии комбинаций индивидуальных генов в синтезирующих ИГ клетках - В-лимфоцитах. Эти свойства делают мультигенное семейство ИГ весьма интересной моделью для изучение различных аспектов эеолюции генома эукариот: молекулярных механизмов эволюции, коэволюции структурных и регуляторных генов, возникновения генов с новыми функциями и др. Решение этих проблем во многом зависит от таксономического расширения сферы исследований, т.е. вовлечения в нее видов животных, удаленных от традиционных объектов иммуногенетики.

С середины 70-х годов з лаборатории эволюционной генетики и затем в лаборатории иммуногенетики ИЦиГ СО РАН у американской норки изучается система аллотипов иммуноглобулинов. К на чаду настоящей работы было обнаружено восемь аллотипов ИГ, установлена цепьевая локализация семи из них. Шесть аллотипов Н2, НЗ, Н4, Н6, Н7, Н8 принадлежат.у -тяжелым цепям, один (LIA) - принадлежит легкие цепям. Особое значение имеетто, что в противоречие с классической схемой наследования аллотипов ИГ изученных видов в виде сцепленных или аллельных признаков для аллотипов у-цепей ИГ норки длительное время не могли обнаружить ни тесного сцепления, ни ал-лелизма. Эта ситуация послужила отправным моментом для исследований, в результате которых было установлено, что Су -аллотипы норки имеют ряд видовых особенностей, отличающих их фенотипическую экспрессию и генетику. В частности, при изучении аллотипов НЗ, Н4, Н6 и Н8 было показано, что количественное проявление этих признаков может существенно различаться как по уровню, так и по стабильности экспрессии. Обнаруженные видовые особенности генетического контроля Су-аллотипов норки послужили

стимулом к изучению новых полиморфных систем ИГ этого вида и выяснению вопроса о том, распространяются ли эти особенности на другие аллотипы, прежде всего, принадлежащие другому типу субъединиц молекулы IgG -легким (L) цепям. Кроме того, присутствие некоторых аллотипов у части особей в минорных концентрациях приводит к ложноотрицательным результатам тестирования этих норок в стандартно используемой двойной имму-нодиффузии. Это требовало разработки новых высокочувствительных методов массового тестирования норок.

Цель и задачи исследования. Данная работа имела две основные цели: а) изучение новой аллотипической системы L-цепей норки, б) разработка новых чувствительных методов массового тестирования аллотипов ИГ.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Идентифицировать аллотипы L-цепей ИГ норки.

2. Изучить генетический контроль аллотипов L-цепей.

3. Исследовать филогенез новых аллотипов.

4. Разработать новые методы иммуноферментного анализа для массового тестирования аллотипов.

В рамках решения основных задач имелось также в виду развитие частной генетики американской норки, пополнение числа генетических маркеров этого вида.

Научная новизна. Выявлены и идентифицированы три новых аллотипа L3 L4 и L5, являющихся маркерами Я—цепей ИГ. Установлено, что ранее обнаруженный аллотип легких цепей LIA представляет собой совокупность двух аллотипов, обозначенных L1 и L2. Установлено, что аллотипы L1-L5 находятся под контролем одного сложного Я —локуса. Полиморфизм Я -цепей в популяции поддерживается благодаря существованию четырех гаплотипов L1'2,3,

L4L3HL(->.

Установлено, что аллоантигены L1 и L2 представлены у всех без исключения исследованных видов семейства куницеобразных, a L3, L4 и L5 являются видоспецифичными для американской норки.

Разработано два варианта иммуноферментного спот-анализа, позволяющего проводить массовые тестирования норок с высокой чувствительностью.

Теоретическое и практическое значение. Проведенные исследования, в результате которых выявлен аллотипический полиморфизм Я -легких цепей, установлен его генетический контроль, а также проведен сравнительный анализ этого полиморфизма в семействе куницеобразных, вносят вклад в частную генетику американской норки и других исследованных видов семейства, расширяют наши представления об эволюции и функционировании одного из наиболее сложных мультигенных семейств генома эукариот. Совокуп-

ность результатов настоящего исследования показывает, что обнаруженные ранее особенности фенотипической экспрессии и генетического контроль ал-лотипов норки характерны только для Су -аллотипов этого вида, тогда как генетика аллотипов локусаА -легких цепей норки соответствует классическим схемам функционирования локусов ИГ млекопитающих.

Открытие у американской норки новых аллотипов А -цепей и возросший в связи с этим уровень выявляемого IgG-полиморфизма позволяют существенно повысить возможность использования маркеров A-цепей для генетико-се-лекционной работы с норкой.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5-й Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987), на V съезде ВОГиС (Москва, 1987), на III школе-семинаре по генетике и селекции животных (Новосибирск, 1989).

Структура и объем работы. Рукопись диссертации включает: введение, обзор литературы (глава 1), описание материала и методов (глава 2), изложение собственных экспериментальных результатов (главы 3 и 4), обсуждение результатов (глава 5), выводы и список литературы. Общий объем диссертации 146 страниц, включая 13 таблиц и 22 рисунка

Глава 1. Обзор литературы Обзор литературы состоит из шести разделов. В первом разделе описаны структура и функции иммуноглобулинов, во втором - структурные особенности легких цепей иммуноглобулинов. Третий раздел посвящен аллотипиче-скому полиморфизму L-цепей иммуноглобулинов и методам идентификации аллотипов ИГ, четвертый - молекулярной генетике L-цепей иммуноглобулинов. В пятом разделе рассматриваются проблемы эволюции генов L-цепей ИГ. В шестом - кратко описаны полученные в лаборатории иммуногенетики ИЦиГ СО АН СССР результаты изучения генетического контроля аллотипов ИГ американской норки и поставлены задачи исследования.

Глава 2. Материал и методы Основным зоологическим объектом исследования была американская норка (Mustela vison), разводимая в Экспериментальном хозяйстве СО АН СССР. Исследовали также норок из популяций зверосовхоза "Подгород-ненский" (Приморский край) и звероферм Дании, сыворотки которых были любезно предоставлены проф. Астедом (В. Aasted, Королевский ветеринарный и сельскохозяйственный университет, Копенгаген, Дания). В работе использовали также сыворотки крови других представителей семейства куницеобраз-ных (Mustelidae): европейской норки (Lutreola lutreola), колонка (Kolonocus sibirica), горностая (Mustela erminea), куницы каменной (Martes foina), куницы лесной (Martes martes), черного хорька (Putorius putorius), светлого хорька

(Putorius eveismani), гибридов хорьков, разводимых на Экспериментальной базе Биологического института СО АН СССР. Сыворотки крови соболей (Martes zibellina) получали от животных Бийского зверосовхоза "Лесной". Взятие крови, получение сывороток и их хранение осуществляли в соответствии с общепринятыми рекомендациями.

Аллоантисыворотки, а также гетероантисыворотки получали соответственно внутривидовой и межвидовой иммунизацией по схемам, разработанным в лаборатории.

В работе использовали методы препаративной биохимии (афинную хроматографию и гель-фильтрацию) и следующие аналитичесие методы: двойную иммунодиффузию, иммуноферментный анализ на микроплатах и нитроцеллюлозе.

Результаты исследований и их обсуждение (главы 3, 4 и 5)

Определение аллотипов ИГ норки с помощью иммуноферментного метода. использующего в качестве носителя нитррцеллюлозные мембраны.

Проведение популяционно-генетических исследований аллотипов ИГ требует тестирования большого количества индивидуальных образцов сывороток норок. Традиционно тестирование аллотипов ИГ в сыворотке крови в лаборатории осуществляли методом двойной иммунодиффузии. Однако, было обнаружено, что некоторые Су -аллотипы норки (НЗ и Н4) у части особей присутствуют в минорных концентрациях, которые не определяются двойной иммунодиффузией. В связи с этим для популяционных исследований необходимо было разработать адекватный высокочувствительный метод определения аллотипов. Существующие схемы иммуноферментного анализа аллотипов на микроплатах не соответствовали требованиям массовых тестирований в силу большой трудоемкости, невозможности использования в аллотипических системах стандартных меченых гетероантител и необ- ■ ходимости получения конъюгатов фермента с каждым аллотипом. Поэтому использовали иммуноферментный анализ, в котором в качестве твердой фазы, или носителя, применяется нитроцеллюлоза (спот-анализ).

Для отработки иммуноферментного определения аллотипов ИГ норки выбрали два варианта спот-анализа. В качестве твердой фазы в этих вариантах используется нитроцеллюлозный носитель в форме листа, разлинованного в виде сетки. Исследуемые образцы сывороток крови наносят микрокаплями по 0,5-1 мкл в квадраты сетки. Затем в обоих вариантах спот-анализа блокируются оставшиеся свободными на нитроцеллюлозе центры связывания. Далее схемы двух вариантов принципиально различаются.

Первый вариант спот-анализа (спот-1) основан на бивалентности молекулы антитела (^О, имеющей два активных центра для связывания антигена. Благодаря этому свойству аллотипические антитела выступают в качестве мостика, связывающего сорбированный на нитроцеллюлозе аллоантиген с меченым пероксидазой имеющим все аллотипы норки . Таким образом, после нанесения антигена и блокировки в спот-1 проводят инкубацию с антителами, содержащимися в антисыворотке, и коньюгатом ^С-пероксидаза (1 стадия). В результате, в тех точках, где нанесен образец, имеющий аллотип, образуется комплекс - аллотип-аллоантитело-^С-пероксидаза. Этот комплекс выявляется в субстратном растворе пероксидазы как окрашенное пятно.

Второй вариант снот-анализа (спот-2) основан на применении авидин-биотиновой системы, принцип которой заключается в том, лист нитроцеллюлозы с сорбированными антигенами инкубируется с мечеными биотином алло-антителами (1 стадия), которые можно обнаружить по взаимодействию с авидином, конъюгированным с пероксидазой (2 стадия).

В качестве модельной системы для отработки двух выбранных нами схем спот-анализа использовали пять аллотипов ИГ норки. Один из этих аллотипов, 1Л, маркирует Ь-цепи, остальные, НЗ, Н4, Н6 и Н8, принадлежат у-тяжелим цепям. Аллотипы/ цепей, кроме того, подразделяются на две группы по характеру сывороточной экспрессии. Количество НЗ и Н4 у разных особей варьируют в пределах трех порядков величины, присутствуя у некоторых норок в минорных концентрациях (10-200 мкг/мл), не определяемых в двойной иммунодиффузии. -Экспрессия аллотипов Н6 и Н8 характеризуется отсутствием минорного уровня.

При разработке двух вариантов спот-анализа были подобраны оптимальные концентрации реагентов. В спот-1 оптимальное разведение для алло-антисыворотки составляет 1:250, оптимальная концентрация конъюгата пероксидаза - 2 мкг/мл. В спот-2 оптимальная концентрация биотинилированных антител против разных аллотипов варьировала от 10 до 20 мг/мкл, конъюгата авидин-пероксидаза составляла 2 мкг/мл. В процессе подбора оптимальных условий анализа было обнаружено, что в спот-1 определяются только аллотипы, локализованные на Рс-фрагменте молекулы (НЗ, Н6 и Н8). Аллотипы и Н4 этот вариант спот анализа не выявляет. По-видимому, это связано с локализацией Ы и Н4 на участках молекулы 1^0, конформациоцно недоступных антиген-связывающему сайту антитела-мостика,ассоциированного с конъгатом ^в-пероксидаза. В авидин-биотино-вой модификации, спот-2, выявляются все пять аллотипов .

При определении пределов чувствительности спот-анализа обнаружено, что чувствительность разрабатываемых методов была ниже в 5-20 раз при

кг

1 "1 ап ■3 и г- .-ч в .J/'icJ л

J 44

1 1

9 .1 а • ±1

Рис.1 .Тестирование НЗ в одной и той выборке норок с помощью спот-2.

А - тестировали цельные сыворотки крови, Б - разбавленные в 10 раз Na-карбонатным буфером, тестировании аллотипов в образцах цельных сывороток крови по сравнению с чувствительностью спот-анализа аллотипов в разведенных Na-карбо-натяым буфером сыворотках (рис.1). С учетом необходимости разведения исследуемых сывороточных образцов предел чувствительности спот-1 для аллотипов НЗ, Нб и Н8 составляет 2,5 мкг/мл. Предел чувствительности спот-2 для аллотипа НЗ составляет 500 нг/мл, для аллотипа Н4 - 10 мкг/мл, для аллотипов Н6 и Н8 - 250 нг/мл, для аллотипа LI - 1 мкг/мл.

Д ля оценки достоверности обоих вариантов спот-анализа аллотипов ИГ в сравнении с двойной иммунодиффузией (ДИД) проводили независимое тестирование этими методами одних и тех же норочьих сывороток. Результаты тестирования разными методами аналогичны для аллотипов Н6, Н8 (исследовали выборку численностью 492 особи) и LI (исследовали 50 особей) и отличаются для аллотипа НЗ. Спот-анализ аллотипа НЗ выявляет в выборке из 50 норок 44 особи, имеющие аллотип, тогда как ДИД выявляет только 28 положительных норок. Обнаруженные расхождения обусловлены тем, что спот-анализ выявляет НЗ и в номинальной и в минорной концентрациях, а меиее чувствительная ДИД не улавливает НЗ в сыворотках с минорной экспрессией этого аллотипа.

Таким образом, разработанные методы спот-анализа могут быть использованы для популяционных исследований аллотипов ИГ норки.По сравнению с другими методами, используемыми для тестирования аллотипов (ДИД и ELISA) спот-анализ имеет ряд существенных преимуществ. Объем исследуемых сывороточных образцов минимален, нанесение образца осуществляют микрокаплями по 0,5-1 мкл. При этом возможно нанесение большого количества проб на небольшой по размерам носитель. Одновременная обработка нескольких носителей позволяет в течение 2-3,5 ч проводить одновременное тестирование нескольких аллотипов в тысячах образцов. Листы нитроцеллю-

-б-

лозы с нанесенными сывороточными образцами после высушивания можно

хранить в течение нескольких недель при 4°С до удобного для анализа времени. Массовые тестирования аллотигтов с помощью спот-анализа проводятся в 10-30 раз быстрее, чем в ДИД, при этом для анализа требуется на порядок меньший объем исследуемой сыворотки и (в спот-1) на два порядка меньший объем аллоантисыворотки. А тестирование аллотипов с помощью ELISA зачастую длится месяц и более, причем объем исследуемых образцов доходит до нескольких мл.

Выбор того или другого варианта спот-анализа для работы определяется задачами и требованиями конкретного исследования. Преимуществами одностадийного енот-1 является быстрота выполнения (2 часа по сравнению с 3,5 в двухстадийном спот-2) и использование неочищенных аллоантисывороток и, следовательно, отсутствие трудоемких предварительных процедур по очистке аллоантител. Преимуществами спот-2 являются более высокая чувствительность и возможность тестирования всех аллотипов ИГ норки, тогда как в спот-1 определяюся только те аллотипы, которые локализованы на участках молекулы IgG, конформационно доступных для антигенсвязывающих сайтов меченых антител.

Таким образом, была решена задача разработки новых методов спот-анализа для тестирования аллотипов ИГ норки, обладающих высокой специфичностью и высокой чувствительностью и позволяющих проводить надежное определение аллотипов в сывороточных образцах. Разработанные методы могут быть использованы для определения аллотипов у других видоз животных. Отсутствие литературных сведений о применении спот-анализа для идентификации аллотипов позволяет считать разработанный метод первым примером использования спот-анализа в изучении аллотипов.

Идентификация новых аллотипов L-цепей иммуноглобулинов норки.

В результате проведенных аллонммунизаций норок полупепо-три новых аллоантисыворотки N 115", N 1161 и N ilS3, причем две последних являлись диспецифическими. Испытания новых аншсывороток на панели разнообразных норочьих сывороток показали, что антисыворотки N 115 и N 1161 выявляют новые аллотипы ,L3 и L4.L5, соответственно, популяционное распределение которых не совпадает ни с одним из ранее установленных порочьте аллотипов IgG, а также аллотипов Lpm- и Ld-систем. Полиморфизм, выявляемый антисывороткой N 1183, полностью совпадает с полиморфизмом по ранее установленному аллотипу L-цепей -LI А, однако, новая антисыворотка N 1183 выявляет не одну, а две аллотипические специфичности, обозначенные LI и L2. Принадлежность новых аллотипов к системе маркеров IgG была показана по наличию реакции новых антисывороток с препаратом IgG, содержащем соот-

ветсвующие аллотипы и отсутствию реакции с другими сывороточными белками.

Выяснение принадлежности аллотипов Ll, L2 и L3 к одному из двух видов полипептидных цепей IgG (легким или у -тяжелым) проводили с помощью тестирования испытуемых аллоантисывороток с препаратами L- и у -тяжелых цепей ИГ норки . Для локализации .маркеров L4 и L5 на цепях использовали гибридные молекулы IgG, в связи с тем, что эти маркеры выявляются только на цельных молекулах IgG с четвертичной структурой. Полученные результаты свидетельствуют о том, иследуемые аллотипы принадлежат L-цепям, а также о том, что антигенная структура аллотипов L4 и L5 конформационно зависима.

Таким образом, обнаруженные аллотипы норки принадлежат L-цепям ИГ. Как известно, эти цепи подразделяются у млекопитающих на два типа - к и А. Принадлежность идентифицированных нами аллотипов А -типу была показана при анализе к- и А -иммуноглобулинов норки, выделенных с помощью моноклональных антител.

С помощью попарного сравнения антисывороток к разным L-аллотипам в реакции ДИД с сыворотками крови норок, имеющими все аллотипы L-цепей, был проведен анализ молекулярного распределения аллотипических детерминант на молекулах IgG, основанный на классическом тесте иммунологической идентичности-неидентичности. Полученные данные о молекулярном распределении аллотипов L-цепей норки позволяют заключить, что аллотипические детерминанты этих маркеров находятся на разных молекулах IgG. Это означает, что Ll, L2, L3, L4 и L5 маркируют разные полипептидные цепи, и, следовательно, кодируются разными структурными генами. Что касается иммунохимических взаимоотношений новых аллотипов L-цепей с ранее установленным LIA, то оказалось, что LIA представляет собой совокупность двух аллотипов L1 и L2, локализованных на разных молекулах.

Генетический анализ аллотипов L-иепей ИГ норки.

С помощью aHTH-Ll,L2, анти-1_3 и aHTH-L4,L5 исследовали более 1370 норок новосибирской популяции и более 400 норок дальневосточной поп-уляциии. В табл.1 приведены частоты фенотипических комбинаций L-ал-лотипов, встречающихся в этих выборках. В новосибирской популяции выявлено пять фенотипических классов по генетическим маркерам L-цепей, в дальневосточной, кроме того, еще два фенотипа. Из 32 теоретические возможных при свободном комбинировании пяти антигенных маркеров установлено лишь 7. Такое ограничение в фенотипическом разнообразии указывает на избирательность в сочетании индивидуальных антигенных маркеров в L-фенотипах. Действительно, в исследованных популяциях аллотипы обнаруже-

Таблица 1

Распределение аллотипов Ь-цепей в двух популяциях норок

Фенотипы Предполагаемые Частоты фенотипов

генотипы нозосибирская дальневос.

ЮП\'ЛЯЦИЯ популяция

0.010 (0.010) 0.003 (0.003)

1Л,1Л,ЬЗ Ь1,2,3/Ь1,2,3 0.174 (ОЛЯ7) 0.119 (0.157)

т 1,2,3 /т 3

Ь4,Ь5 0.418 (0.419) 0.408 (0.407)

Ь4'5/!»

и 0.000 (0.002) 0.014 (0.014)

и,Ь4,Ь5 Ь3/Ь4'5 0.010 (0.010) 0.092 (0.085)

Ы,2,3,4,5 0.388 (0.372) 0.353 (0.334)

1Л,1.2,1Л,Ь4 Ь1,2,3/Ь4,- 0.000 (0.000) 0.011 (0.000)

В скобках - ожидаемые частоты фенотипов

ны в виде фиксированных комбинаций Ы,Ь2,13; Ь4,Ь5; ЬЗ и Ь(-).

Существование таких комбинаций, называемых аллогруппами, обусловлено,

как правило, сцеплением соответствующих генов аллотипов. При проведении

2

анализа данных аллотипирования с помощью критерия X и гипергеометрического критерия была подтверждена не только очевидная взаимосвязь маркеров Ь-цепей, входящих в состав одной аллогрулпы, но и показана статистическая связь аллотипов из разных групп.

Характер популяционного распределения и наличие статистической взаимосвязи между всеми пятью аллотипами Ь-цепей позволяет считать, что они принадлежат к единой иммуногенетической системе, контролируемой аллелями одного локуса. Все выявляемое разнообразие фенотипов можно объяснить комбинированием аллогрупп, детерминированных набором аллелей, представляющим собой Ь3, Ь1'2'3, Ь4'5 где последний аллель, вероятно, кодирует пока неидентифицированный аллотип(ы). Сложные аллели Ь1,2,3 и М,5 являются гаплотипами, или гаплоидными наборами тесно сцепленных генов, кодирующими аллогруппы Ы,Ь2,ЬЗ и Ь4,Ь5. Таким образом, сегрегацией четырех аллелей можно объяснить существование почти всего

полиморфизма по Ь-аллотипам. Частоты аллелей вычисляли, применяя закон Харди-Вайнберга для локуса с четырьмя аллелями. В новосибирской и дальневосточной популяциях частота аллеля Ь(-) составила 0,1010 и 0.0583, соответственно. Пользуясь этими величинами вычисляли частоты трех остальных аллелей: 13 - 0,0092,1Л,2,3 - 0,3361, Ь4,5 - 0,5537 в новосибирской и ЬЗ -0,0725,1Л,2,3 -0,2865, М,5 - 0,5827 в дальневосточной популяции. На основании приведенных частот аллелей высчитаны ожидаемые фенотипические частоты обнаруженных аллогрупп (табл. 1). При сравнении фактических частот фенотипов с теоретически ожидаемыми, видно, что они находятся в хорошем соответствии между собой. Это означает, что высчитанные частоты аллелей близки к реальным, а исследуемые популяции норок находятся в состоянии, близком к равновесному.

Справедливость предложенной генетической гипотезы подтверждают и материалы гибридологического анализа аллотипов Ь-цепей. В табл.2 и 3 показано наследование аллогрупп ЫДЛДЗ и Ь4,Ь5. Эти аллогруппы наследуются как моногенные признаки, не расщепляясь у потомков, среди которых отсутствуют норки рекомбкнантных фенотипов. Ожидаемое число потомков в табл.2-3 высчитано, исходя из гипотезы, что аллогруппы наследуются как моногенные доминантные признаки (серологически гомозиготы +/+ и гете-розиготы +/- по генам аллотипов неразличимы). Во всех типах скрещиваний по аллотппам Ь-цепей наблюдаемое число потомков разных фенотипических классов в Р1 достоверно соответствует их теоретически ожидаемой численности. Не обнаружено отклонений от менделевского наследования аллотипов Ь-цепей ИГ норки. Эти данные свидетельствуют о тесном сцеплении аллотипов 1Л и Ь2 и 13, наследуемых в составе одной аллогруппы, и о тесном сцеплении аллотипов Ь4 и Ь5, составляющих аллогруппу Ы,Ь5.

Данные скрещиваний с учетом наследования всех пяти аллотипов Ь- цепей норки позволили составить обширные родословные, включающие до 5 поколений норок из 48 семей с 270 потомками. Фрагмент родословных по ал-лотипам 1>цепей представлен на рис.2. Проведенный анализ родословных доказал предполагаемый аллелизм гаплотипов, кодирующих Ь-аллогруппы.

Итак, по данным иммунохимической идентификации пять выявленных аллотипов ИГ норки 1Л -Ь5 принадлежат Я -легким цепям, во всей вероятности, их С-области. Анализ молекулярного распределения показал, что 1Л-Ь5 кодируются разными структурными генами. Дальнейшие исследования Я -аллотипов были посвящены решению закономерно возникающего вопроса о взаимоотношениях между генами аллотипов Я -цепей. В результате проведенного популяционно-генетического анализа оказалось, что выявленные нами аллотипы Ы, Ь2, ЬЗ, 1А и Ь5 наследуются в виде определенных, строго

Таблица 4

Наследование аллогруппы L1.L2.L3

Число потомков

Тип Число ---------------------------

скрещивания семей Ll+L2+L3+ Ll-L2-L3- Всего X2

набл. ожид. набл. ожид.

Ы+!.2+ЬЗ+ х 17 73 69.0 11 15.0 84 1.30

Ll+L2+LЗ+xLl-L2-LЗ- 28 72 69.3 48 50.7 120 0.25 Ll-L2-LЗ-xLl-L2-LЗ- 24 0 0 113 113.0 ИЗ О

Таблица 5

Наследование аллогруппы Ь4,Ь5

Число потомков

Тип Число -------------------------------------------—

скрещивания семей L4+L5+ 1А-15- Ь4-Ь5+ Всего X2

н. о. я. о.

х Ь4+1_5+ 127 594 589,93 31 38,07 0 0,00 0 0,00 625 1,40 и+Ь5+х1А-Ь5- 52 199 195,08 60 63,92 0 0,00 0 0,00 259 0,32 14-15- х Ы-ЬЛ- 5 0 0,00 29 29,00 0 0,00 О 0,00 29 0,006

н. - наблюдаемое, о. - ожидаемое

фиксированных аллогрупп L1,L2,LЗ•, М,Ь5; L3 и L(-)1 которые передаются из поколения в поколение как аллельные моногенные признаки. Аллогруппы кодируются наборами тесно сцепленных генов аллотипов (гаплотипами) -

^2и45л3 „г".

норки фенотипа L1.L2.L3.LAL5

- норки фенотипа Ll.L2.L3

- норки фенотипа Ы,Ь5

" идентифицированные аллотипы отсутствуют

Рис. 2. фрагменты родословных с аллотипами Ь-цепей ИГ норки.

Согласно полученным данным А -локус норки является сложным и включает в свой состав несколько генов. На наш взгляд, наиболее соответствующей предложенной генетической модели является гипотетическая организация А -локуса из трех генов, показанная на рис.3. Первый ген контролирует аллотип 1Л, его аллельную альтернативу - аллотип 1А и предполагаемый третий аллель-

ный вариант, который на схеме обозначен символом "х". По второму гену

2 5

аллотипический полиморфизм определяется аллелями Ь , Ь и "у", а по треть-

■а

ему гену - двумя аллелями I. и "г". Продукты предполагаемых аллельных вариантов, обозначенных символами "х", "у" и "г", возможно, еще не идентифицированы. Кроме того, возможны ситуации, когда отсутствие ал-лотипов может быть связано с делецией соответствующих генов в Л-локусе. Так или иначе, гомозиготы по аллелям "х", "у" и "г" тестируютя как отрицательные по аллотипам А -цепей, поэтому, гаплотип, составленный этими генами, обозначен нами По этой же причине гаплотипы, составленные генами и "х","у",Ь3, обозначаются как Ь4,5 и Ь3.

В настоящее время с помощью блот-гибридизацииСА-зонда с ДНК норки в нашей лаборатории показано, что у этого вида имеется 5-6 СЛ -генов. Кроме того, установлено, что из двух клонированных СА -генов один является псевдогеном. Таким образом, наша модель А-локуса из минимум трех генов вполне согласуется с данными молекулярно-генетических исследований этого локуса у норки.

I1'-------- ь2 ь3

Гаплотип , 1,2,3

ь4 ь5 г Ь4,5

X У ь3 I3

У ъ ь<->

Рис.3. Гипотетическая модель организации А-локуса норки.

Сложность А-локуса сильно варьирует у высших позвоночных. Среди, изученных млекопитающих простейшая организация А-локуса обнаружена у

крысы - один УА и три С А гена. Промежуточное положение по степени сложности А —локуса занимает мышь и кролик: у инбредных мышей этот локус содержит три УА и четыре СА гена, у кролика - пять УА и шесть С А генов. Человек имеет наиболее сложный локус с 70 V А генами и шестью СА генами. Если при сравнении А -локусов принимать во внимание только С-гены, то мышь, кролик и человек различаются незначительно. Норка по числу СА -генов че отличается существенно от упомянутых видов, занимая, видимо, средний по степени сложности уровень организации А -локуса среди исследованных млекопитающих. Тем не менее, хорошо выраженный полиморфизм А-генов выделяет этот вид в ряду изученных млекопитающих.

Филогенетический анализ аллотипов Ь-цепей норки'.

При тестировании аллотипов 1Л и 1,2 в сыворотках кушщеобразных оказалось, что антигенные специфичности этих аллотипов имеются во всех исследованных индивидуальных сывороточных образцах хорьков, колонков, куницы лесной, куницы каменной, соболя и европейской норки в чдентичпой американской норке форме. Не было обнаружено среди исследованных представителей семейства куницеобразных особей, имеющих либо Ы, либо Ь2.

Результаты тестирования сывороток представителей разных видов семейства куньих с помощью анти-ЬЗ и анти-М,Ь5 полностью отрицательны: ни очной особи, имеющей антигенные специфичности аллотипов ЬЗ, 1А и Ь5 не

обнаружено. Не найдены и частично иммунологически сходные с этими ад-лотипами антигенные детерминанты, которые могли бы давать перекрестную реакцию в геле агара. Антигенные специфичности аллотипов 13, 1А и Ь5 не встречаются также у животных, принадлежащих другим семействам отряда хищных и другим орядам млекопитающих. Таким образом, аллотипы 13,14 и Ь5 видоспецифичны для американской норки, их следовало бы называть эво-люционно новыми. Аллотипы 1Л и Ь2 можно считать филогенетически более древними.

Поскольку гены аллотипов Ы и Ь2 мономорфно экспрессированы у исследованных близкородственных американской норке видов семейства куницеобразных, можно предположить, что эти гены были когда-то мономор-фны и в геноме американской норки в самом начале дивергенции этого вида. Затем, в процессе видовой эволюции американской норки, возник полиморфизм А -цепей в виде, во-первых, наличия у части особей "минус"-вариантов по аллотипам И и Ь2 и, во-вторых, появления новых аллотипов 13,

Обобщая данные филогенетического исследования и гипотетические представления об организации А-локуса, можно предположить схемы возможного эволюционирования А -локуса и становления А-аллотипического

1 1

полиморфизма. Имея в качестве предковых два гена Ь и , дальнейшая эволюция А -генов проходила, видимо, путем дупликации, в результате которой появился третий ген. Затем мутационные события привели к возникновению полиморфизма по каждому из генов. Возможно, что "потеря" генов ь' и I? у норки по сравнению с другими куницеобразными обусловлена их де-лецией, тем более, что эволюция СА-локуса путем сокращения числа генов и их амплификации характерна для млекопитающих. Окончательный выбор предполагаемых путей эволюционирования А-локуса можно будет сделать только при детальном изучении организации на уровне ДНК и проведении сравнительного анализа генов этого локуса у положительных и отрицательных по Ь-аллотипам норок.

Таким образом, обнаруженные нами аллотипы А -цепей норки пополнили собой число антигенных факторов ИГ этого вида. До сих пор у норки было выявлено 6 аллотипов у-тяжелых цепей и лишь один аллотиг Ь-цепей. Первоначальный анализ популяционного распределения и наследования С у-аллотипов показал, что поведение этих аллотипов не укладывается в классические схемы наследования аллотипов ИГ изученных видов. Проведенный в лаборатории значительный объем исследований для выяснения причин этого явления обнаружил ряд особенностей фенотипического проявления и генетики Су -аллотипов, характерных для этого вида. В частности, при

изучении аллотипов НЗ, Н4, Нб и Н8 было показано, что количественное---------

проявление этих признаков может существенно различаться как по уровню, так и по стабильности экспрессии. Для аллотипов НЗ и Н4 характерна широкая вариабельность экспрессии с наличием минорных концентраций, для аллотипа Н6 - своебразный вид регуляции экспрессии.

В отличие от Су -аллотшпов при исследовании сывороточной экспрессии с помощью ИФА показано отсутствие минорных концентраций для аллотипов L1 и 1.2, а проведенный популяционно-генешческий и гибридологический анализ обнаружил четкие генетические взаимоотношения этих маркеров в виде существования аллсльных гаплотпов. Таким образом, результаты наших исследований показывают, что такие черты, как минорная экспрессия, трудности с установлением сцепления характерны только для локуса Н-цепей ИГ норки, тогда как локус А-легхих цепей, состоящий как минимум из трех полиморфных генов, функционирует по классической схеме локусов ИГ млекопитающих.

ВЫВОДЫ

1. С помощью внутривидовой иммунизации у американской норки выявлено три новых сывороточных аллотипа L3, L4 и L5. Показано, что эта ал-лотипы принадлежат легким цепям иммуноглобулинов норки. Антигенная структура аллотипов L4 и L5 конформационно зависима и выявляется тольхо на нативных молекулах IgG.

2. Установлено, что ранее обнаруженный аллотип легких цепей LIA представляет собой совокупность двух аллотипов - L1 и L2, антигенные детерминанты которых локализованы на разных молекулах.

3. С помощью популяционно-гибридологического анализа установлено, чтоаллотипы L1 -L5 находятся под генетическим контролем одного Л—локуса, который состоит из как минимум трех тесно сцепленных функциональных генов.

4. Наследование аллотипов L-цепей осуществляется в виде аллогрупп L1,L2,L3, L4,L5, L3 и L(-), передающихся из поколения в поколение как аллельные моногенные признаки. Парные генотипические комбинации аллелей, кодирующих аллогруппы L-аллотипов, обуславливают существование в популяциях иорокЮгенотипов и 6 фенотипов.

.5. Проведенный филогенетический анализ показал, что возникновение полиморфизма А-цепей в виде аллотипов L1-L5 произошло в период самостоятельной эволюции американской норки как вида и обусловлено, во-первых, появлением у норки "минус"-вариантов по антигенам L1 и L2. гены которых

6. Разработаны два варианта иммуноферментного слот-анализа ал-лотипов иммуноглобулинов, которые обладают высокой специфичностью и чувствительностью, требуют минимальных затрат реагентов и, в то же врема, благодаря простоте выполнения дозволяют проводить обширные поп-уляционные исследования по нескольким маркерам одновременно в значительно более короткие сроки, чем использующиеся в мировой практике методы.

СПИСОК ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Баранов O.K., Беляев Д.К., Волкова О.Ю., Фомичева И.И., Таранин А.В. Иммуногенетика иммуноглобулинов американской норки. Сообщение IV. Идентификация и генетический контроль аллотипа LIB легких цепей // Генетика. - 1984. - Т. 20. - N 5. - С. 826-834.

2. Волкова О.Ю., Фомичева И.И., Белоусов Е.С., Таранин А.В., Баранов O.K. Иммуногенетическое исследование легких (L) цепей иммуноглобулинов норки // Труды V Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки". Тбилиси. 1987. - Т.2. - С.795-797.

3. Волкова О.Ю. Генетический полиморфизм легких цепей иммуноглобулинов американской норки // Тезисы докладов V съезда ВОГиС. Москва. 1987.-Т. III.-

4. Volkova O.Yu., Fomicheva I.I., Taranin A.V., Baranov O.K., Belyaev D.K. Genetic polymorphism of IgG in the mink. IV. Identification and genetic control of L3 allotype of the light chains // Expl. Clin. Immunogenet. - 1987. - V. 4. - N . - p. 81-88.

5. Peremislov V.V., Taranin A.V., Mechetina L.V., Fomicheva 1.1., Baranov O.K. Analysis of the isotypic and allotypic structure of the A -chains of immunoglobulin in the amrican mink by means of monoclonal antibodies // XXIV Intern, symp. on biol. antibodies, Chehosl., 1987. Abstr.

6. Najakshin A.M., Belousov E.S., Bogachev S.S., Fomicheva I.I., Taranin A.V., Baranov O.K. Mink immunoglobulin A—light chains: allotypes and genes // XVI Intern. Congr. of genetics, Toronto, Canada, 1988, Abstr.

7. Volkova O.Yu., Fomicheva 1.1., Taranin A. V., Belousov E.S., Baranov O.K. Genetic polymorphism of IgG in the mink. V. Two new genetic markers of the lambda light chains of mink immunoglobulins, L4 and L5II Expl. Clin. Immunogenet. -1989. - V. 6. - N 4. - p.258-268.