Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуногенетическое изучение семейства альфа-макроглобулинов американской норки (Mustela vison) и некоторых других видов млекопитающих

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Иммуногенетическое изучение семейства альфа-макроглобулинов американской норки (Mustela vison) и некоторых других видов млекопитающих"

iVb ол , 7 ttff ml

На правах рукописи УДК 575:591.159:599:599.742.4

ЕРМОЛАЕВ ВИКТОР ИВАНОВИЧ

ИМНУНОГЕНЕТНЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СЕМЕЙСТВА АЛШ-МАКР0ГЛ05УЛНН0В АМЕРИКАНСКОЙ НОРКИ (Hustela vison) И НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ ВИДОВ Ш5ЕКОПЙТАЩИХ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

НОВОСИБИРСК - 1:997

Работа выложена в Институте цитологии и генетики Сибирского

отделения РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Е.И. Каракин

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Н.П. Мертвецов

Институт биоорганической химии СО РАН, г. Новосибирск

доктор медицинских наук, профессор В. А. Козлов

Институт клинической иммунологии СО РАШ, г. Новосибирск

Ведущее учреддение:

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва

Защита состоится "Л 1997 г. на заседании дис-

сертационного совета по задите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологиии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " " _ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность текы.

Исследование организации слоаных имыуногенетических систем является традиционным направлением иымуногенетики. Фундаментальные достигения этой науки связаны с изучением представителей именно этого класса генетических систем, иммунологическая Феноменология которых в дальнейшем использовалась в разнообразных теоретических и прикладных разработках.

В начале 70-х годов в лаборатории эволюционной генетики кивотных Института цитологии и генетики СО АН СССР O.K. Барановым были начаты икмуногенетические исследования сывороточных белсов американской норки б целью разработки и создания молекулярно-генетических моделей для изучения эволюции гекоиа этого вида. Была открыта группа аллотипоз - белков, т/муноп-реципитаты которых обладали эстеразноЯ активностью и окрашивались Суданом черным на гиры. Аллотипы были обозначены символами Lpal, Lpm2, Lpo3, Lpmi и Lpn5, а вся их совокупность получила название Lpm-системы (Lipoprotein of Hink). Было установлено, что пять названных аллотипов находятся под контролем одного слогного генетического локуса и обнаружгааэтся в сыворотке крови американских норок, но отсутствуют у других видов куньих (Беляев и др., 1974; Baranov et al., 1976).

На основе этих данных стало ясно, что обнаружена новая иммуногенетическая система, мультигеннсе семейство (Baranov, 1976; Hood. 1976), представлявшая интерес как конкретный объект для дальнейшего изучения.

Цель и задачи исследования.

Учитывая то обстоятельство, что норка не относится к числу традиционных объектов иммуногенетических исследований, необходимо было изучить различные аспекты организации, функционирования, филогенеза и эволюции Lpm-системы, чтобы определить ее взаимоотношения с другими известными иммуногенети-ческими системами сывороточных белков млекопитающих, а также проанализировать возможные причины и механизмы, обусловливающие ашгатипию данного семейства белков. Для достижения поставленной цели необходимо было развить исследования в пяти основных направлениях.

1. Изучение структурах свойств молекул, маркированных аллотипическими детерминантами, важных для определения их

принадлежности к определенному семейству и особенностей, обусловливающих их склонность к аллотипии.

2. Изучение полиморфного потенциала этого семейства у норок, генетического контроля возможных новых аллотипических вариантов, генетической организации соответствующего локуса. его хромосомной локализации.

3. Изучение пространственных и временных особенностей фенотипической экспрессии структурных генов данного семейства в нормальном онтогенезе и при алеутской болезни.

4. Изучение филогенеза изотипических и аллотипических антигенных структур макроглобулинов норки, особенностей их эволюции у видов, находящихся в разной степени родства к американской норке.

5. Изучение полиморфизма и организации гомологичных ло-кусов у некоторых других видов млекопитающих. Выявление общей закономерности проявления аллотипии в изученном семействе макроглобулинов.

Для анализа Lpm-системы был применен иммуногенетический подход, позволяющий использовать уникальные способности иммунной системы для дифференциации отдельных вариантов гомологичных белков, и. соответственно, групп особей (Тихонов, 1967; Петров, 1976; Баранов. 1981).

Научная новизна.

Получены экспериментальные данные, освещающие различные аспекты организации, функционирования, филогенеза и эволюции Lpa-систеыы, являющейся, как установлено в ходе работы, AIM подсемейством семейства альфа-макроглобулинов (AM) млекопитающих. Уникальность базовой модели А1М-системы американской норки предопределила оригинальность результатов почти всех разделов данной диссертационной работы. Из них наиболее важными являются следующие.

Сведения по генетической организации и хромосомному картированию Lpm-AIM локуса норки, который является самым полиморфным, среди изученных, у этого вида и самым полиморфным среди АМ-семейств у млекопитающих.

Данные о структурных характеристиках й1М и й2М макроглобулинов норки, их антигенных взаимоотношениях, сходстве и различиях, послужившие основой для разработки новой номенклатуры генов и белков семейства альфа-макроглобулинов норки.

Данные о фенотипической экспресии AIM и А2М, полученные у одного вида для двух вариантов одновременно, рассмотренные в связи с филогенезом двух подсемейств макроглобулинов млекопитающих.

Данные об организации АМ-семейства свиньи, позволившие вскрыть наличие системы регуляции экспрессии АМ-генов свиньи на примере А2М-гена с наличием полиморфного варианта.

Теоретическое и практическое значение.

Работа освещает новые аспекты генетики, экспрессии и эволюции семейства АМ-генов американской норки, свиньи и других млекопитающих. Развито представление о генетической организации АМ-семейства норки, включающего в свой состав относительно мономорфный и. по-видимому, уникальный ген А2М, и подсемейство полиморфных генов А1М-макроглобулинов. Эти два подсемейства локализуются в пределах одной хромосомы и имеют ряд сходных структурных и фукциональных характеристик, но отличаются по таким вааным генетическим параметрам, как степени полиморфизма и характеру экспрессии в онтогенезе. Ген. начинающий функционирование на ранних стадиях онтогенеза, оказался эволюционно более консервативен, чем гены, интенсивный этап функционирования которых приходится на постнатальный период. Большая лабильность этого вариабельного подсемейства проявляется не только на внутривидовом уровне, но и у близкородственных видов. Такими характеристиками обладают гены, появившиеся в филогенезе позднее, и имеющиеся не во всех таксонах млекопитающих. Высказано предположение, что наибольшее развитие данное подсемейство получило в отряде хищных и в других филогенетически связанных с ними ветвях млекопитающих.

Исследование гомологичной системы у свиньи подтвердило предсказанное сходство в организации АМ-семейств норки и свиньи, и детализировало представление о генетическом контроле антигенов в этом семействе. В консервативном А2М гене выявлено существование не только структурного полиморфизма, но и полиморфизма в системе регуляции экспрессии, создающей видимость рецессивной экспрессии, нехарактерной для иммуногене-тических признаков.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены и представлены: на 16 Международной конференции по группам крови и биохимическо-

uy полиморфизму животных - Ленинград, 1978: на 14 Международной генетическом конгрессе - Москва, 1978; на 5 и 7 Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов" - Москва. 1983, 19Э0; на Международном рабочем совещании по исследованию групп крови и полиморфизма белков свиньи -Стара Затора, Болгария, 1989; на 3 Школе-семинаре по генетике и селекции животных - Новосибирск. 1989; на Всесоюзном семинаре "Организация имыуногенетических исследований в племенном животноводстве" - ВДНХ, Ыоснва, 1989; на Мезздународном симпозиуме "Альфа-2-макроглобулин и родственные белки плазш", Ахен, Герзгания, 1990; на 1 Всесоюзном съезде иммунологов -Сочи, 1989; на 5 Съезде Всесоюзного териологического общества - Москва, 1990; на отчетной сессии ГКНТП "Приоритетные направления генетики" - Москва, 1993; на 1 Мездународном симпозиуме "Молекулярно-генетические маркеры животных" - Киев, 1994; на Кейстоунском симпозиуме "Протеолитические ферменты и их ингибиторы в биологии и медицине", Кейстоун, США, 1998:

Публикации.

Материалы диссертации опубликованы в 52 работах.

Структура и сбъеа работы.

Диссертация оформлена следующим образом: введение, глава с обзором литературы, глава с описанием материала и методов, шесть глав экспериментальных результатов с их обсуждением, глава с общим обсуждением, выводы, список литературы. Общий объем работы 281 страница, 35 рисунков, 30 таблиц.

Фактический материал получен автором самостоятельно и в коллективных исследованиях с соавторами опубликованных работ. Всем им выражаю глубокую и искреннюю благодарность.

Особо признателен безвременно упедиеыу О.К.Баранову, за-лозившему основы данной работы и много сделавшему в формировании моих научных интересов. Выполнение данной работы было бы невозможно без постоянной помощи и поддержки М.А.Савиной и И.Г.Горелова, за что им сердечно благодарен.

Частично работа поддерживалась грантами ГНТП "Приоритетные направления генетики".

РЕЗУЛЬТАТ» СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Генетика Ьрв-систеш норки.

Ранее было установлено, что генетический полиморфизм по аллотипам Ьрш1-Ьрт5 обусловлен аллогруппами: Ьрт1; Ьрт1,2; ЬртЗ,4; Ьрт4; Ьрт2,4,5 и соответствующими сложными аллелями (Баранов и др., 1977). В ходе регулярно проводимых нами серий аллоиммунизаций норок были получены антисыворотки, выявляющие новые аллоантигены. Молекулы с этими антигенными детерминантами обладали той же совокупностью свойств, что и с маркерами 1-5. Новым маркерам были присвоены номера от б до 14. Анализ их генетического контроля был проведен в. несколько этапов. Для пояснения общих принципов низе приводится подробный анализ генетики аллотипов 7 и 8 в совокупности с аллотипами 1-5. С использованием антисывороток к аллотипам 1-5,7 и 8, типиро-ваны образцы сывороток крови норок стада экспериментального хозяйства СО АН СССР. В таблице 1 приведены Ьрт-фенотипы (графа 2) и их встречаемость (графы 3 и 4) в выборке норок из этой популяции. Установлена 21 из 128 фенотипических комбинаций, возможных при свободном сочетании семи маркеров. Это дает основание предположить, что все семь аллотипов контролируются одной аутосомной генетической системой.

С учетом представленных данных сделан вывод о том, что шесть вышеперечисленных аллогрупп, с учетом аллотипов 7 и 8, видоизменяются следующим образом: 1 трансформируется в 1.8; 1,2 - в 1,2,7; 3,4 - в 3,4,8; 2;4,5 - в 2,4,5,7; X - в 8; а 4 разбивается на три варинта - 4; 4,7 и 4,8. Соответственно, число аллелей увеличивается с 6 до 8. Из восьми аллелей мояно сформишвать 36 генотипов. Несоответствие в числе фенотипов (21) и генотипов (36) обусловлено тем, что только 11 фенотипов определяются индивидуальными генотипами (1,2,7,10,13-15, 18-21). Каждый из остальных фенотипов скрывает от двух до четырех генотипов (графа 5), которые не удается дифференцировать без гибридологического анализа. Семь фенотипов (4,5,9,11,12,16,17) обусловлены двумя, фенотип 8 - тремя, а фенотипы 3 и 6 - четырьмя генотипами. Предполагая генетическое равновесие в популяции, по формуле Харди-Вайнберга для 8-аплельной системы, определены генные частоты всех постулированных комплексных аллелей: Ьрш1'8-0.0486; 1,рга1,2'7-0,1166; Ьрш3,4,8-0,2100; Ьрш2 •4'5 •7-0.0390; Ьрш8-0.0943; Ьрш4-0.1280; Ьрш4,7-0,0554; Ьрш •8-0,3182. Суша частот всех аллелей близ-

Таблица 1. Генетический контроль семи аллотипов Ьрт-системы.

Lpm- Число Факти- Ожидаемая

N ческая Lpm- частота:

фенотипы живо- частота генотипы

тных феноти- гено- фено-

пов типов типов

1 2 3 4 5 6 7

1 8 33 0.0089 8/8 0,0089 0,0089

2 4 61 0,0164 4/4 0,0164 0,0164

3 4.8 991 0.2669 4.8/4.8 0,1006 0,2657

4,8/4 0.0812

4,8/4 0,0598

4/8 0,0241

4 4.7 80 0.0215 4,7/4.7 0,0030 0,0172

4.7/4 0,0142

5 4.7,8 154 0,0415 4,7/4,8 0.0351 0.0455

4.7/8 0.0104

6 3.4.8 1006 0.2708 3,4.8/3.4.8 0.0441 0,2707

3.4,8/4.8 0,1332

3,4,8/4 0,0538

3,4.8/8 0,0396

7 3,4,7.8 149 0.0401 3,4,8/4,7 0.0233 0,0233

8 2.4.5,7 57 0.0153 2,4.5.7/2,4,5,7 0,0009 0.0119

2,4,5,7/4,7 0,0033

2,4,5,7/4 0,0077

9 2.4.5.7,8 83 0.0233 2.4.5,7/4,8 0,0190 0.0247

2.4,5.7/8 0,0057

10 2.3.4.5.7.8 58 0.0156 2,4.5,7/3,4.8 0,0126 0,0126

И 1.8 71 0.0191 1,8/1,8 0,0023 0,0115

1,8/8 0,0092

12 1,4.8 133 0,0358 1,8/4,8 0,0308 0,0432

1,8/4 0,0124

13 1.4,7.8 22 0,0059 1,8/4,7 0,0054 0,0054

14 1.3.4.8 36 0.0087 1,8/3,4,8 0,0204 0,0204

15 1.2.7 57 0.0153 1,2,7/1,2,7 0,0136 0.0136

16 1.2.7.8 54 0.0145 1,2,7/1,8 0,0113 0.0333

1,2.7/8 0,0220

17 1.2.4.7 167 0.0450 1.2.7/4.7 0,0130 0,0428

1,2.7/4 0,0298 0.0740

18 1.2.4.7.8 304 0,0818 1,2,7/4,8 0,0740

19 1.2,4.5.7 14 0,0038 1,2,7/2,4.5.7 0,0070 0.0070

20 1.2.4.5,7.8 3 0.0008 1.8/2.4.5,7 0,0030 0.0030

21 1.2.3,4,7.8 182 0.0490 1,2.7/3,4,8 0,0489 0.0489

Всего: 3715 1.0000 1,0000 1,0000

ка к единице. Теоретически ожидаемые частоты генотипов подсчитаны умножением частот соответсвующих аллелей (графа 6). При сравнении фактических частот фенотипов с теоретически ожидаемыми (графы 4 и 7) видно, что они находятся в хорошем

соответствии между собой. Это означает, что высчитанные частоты близки по своим значениям к реальным, а исследуемая популяция норок находится в состоянии близком к равновесному. Очевидно, что вычисленные частоты генотипов дают адекватное представление о количественных пропорциях генотипов в пределах одного фенотипического класса (графы 4 и б). Справедливость нашей генетической гипотезы убедительно подтверждена гибридологическим анализом. Во всех скрещиваниях с достаточным числом особей, наблюдаемые и ожидаемые числености потомков находятся в хорошем соответствии между собой.

Вопрос о том, является ли каждый аллель Ьрт-локуса одним геном, или же набором тесно сцепленных структурных генов, решен путем анализа молекулярного распределения аллотипов. Ранее установлено, что аплотипы 1-5 локализованы, за одним исключением, на разных молекулах. Анализируя все возможные парные сочетания аллотипов 7 и 8 с остальными аплотипами и между собой, удалось установить, что аплотипы 7 и 8 также маркируют отдельные молекулы в сыворотках крови норок различных фенотипов (см. табл. 1 NN 3, 5-12, 14. 16. 18. 19 и 21). Так у норок фенотипа 1-4.7.8 в сыворотке выявлено шесть вариантов молекул. каждая их которых несет индивидуальный номинальный ал-лотип. Отсюда следует, что разные аллотипы являются детерминантами разных полипептидных цепей и, следовательно, должны кодироваться самостоятельными генами. Сопоставив полученные молекулярно-фенотипические данные с генотипом норок, являющихся гетерозиготами Ьрт1,2,7/Ьрт3,4,8. заключили, что в состав первого сложного аллеля входят отдельные структурные гены Ьрт1, Ьрт2 и Ьрт7, а в состав второго - Ьрт3, Ьрт и Ьрт8. Аналогичные результаты получены в отношении остальных аллелей у норок других фенотипов. Совокупность этих результатов позволила сделать вывод, что каждый сложный аллель исследуемого локуса представляет собой блок сцепленных структурных генов -галлотип.

Аналогичный анализ проводился для каждого из семи новых аллотипов, идентифицированных в ходе проводимых исследований, которым были присвоены номера 6,9.10,11.12.13 и 14. Идентификация аллотипов 6,9-12 и соответствующих генов, не привела к увеличению числа выявленных аплогрупп и соответствующих гап-лотипов. Их число осталось по-прежнему равным восьми:

1рт6.8.9.10.12> ь 4.6.8.9.10.11.Г2> ^«.6.7.8.10.11.^ ^3.4.6.8.9.10.1^ ^1.6.8.9.10.1^ ^1.2.6,7.10.1^

Таблица 2. Ьрш-фенотипы в выборке норок, типированной по 14 маркерам.

N 1 1 Ьрш-фенотипы Число норок 1 Частота 1 фенотипов

1 1 4 6 8 9 10 12 14 5 1 0,0156

2 1 4 9 11 12 8 1 0.0250

3 1 4 6 8 9 10 и 12 14 1 1 0,0031

4 1 4 6 8 9 10 11 12 13 14 69 1 0,2156

5 1 4 6 7 9 10 11 12 13 14 6 1 0,0187

6 1 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 10 1 0,0313

7 1 3 4 6 8 9 10 11 14 4 1 0.0125

8 1 3 4 6 8 9 10 11 13 14 17 1 0,0531

9 1 3 4 6 8 9 10 11 12 14 И 1 0,0344

101 3 4 6 8 9 10 и 12 13 14 59 1 0,1844

111 3 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 5 1 0,0156

121 2 4 5 6 7 9 10 и 12 13 14 2 1 0,0063

131 2 4 5 7 9 10 и 12 13 14 5 1 0,0156

141 2 4 5 6 7 8 9 10 и 12 13 14 8 1 0.0250

151 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 4 1 0,0125

161 1 6 8 9 10 и 13 14 7 1 0,0219

171 1 6 8 9 10 и 12 13 14 3 1 0,0094

181 1 4 6 8 9 10 и 12 13 14 13 1 0,0406

191 1 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 1 0.0031

20! 1 3 4 6 8 9 10 и 13 14 4 1 0.0123

211 1 2 6 7 10 11 13 10 1 0,0313

221 1 2 6 7 10 и 13 14 16 1 0,0500

231 1 2 6 7 8 9 10 11 13 14 3 1 0,0094

241 1 2 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 1 0,0031

251 1 2 4 6 7 9 10 и 12 13 1 1 0,0031

261 1 2 4 6 7 9 10 11 12 13 14 16 1 0,0500

271 1 2 4 6 7 8 9 10 и 12 13 14 15 1 0,0469

281 1 2 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 1 1 0,0031

291 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 1 0.0031

301 1 2 3 4 6 7 8 9 10 11 13 14 14 1 0.0438

Всего: 320 1 1,0000

1 1.2,6.7. 10.11, 13 0.06 ♦ При исследовании по-

пуляций зверосовхозов

2 1,2.6,7. 10.11. 13.14 0,07 "Лесной". "Речной". "Че-

репановский" выявлены

3 4,2,5.7,9,10,11,12,13.14 0.04 норки фенотипа, который

не встречался в популя-

4 4. 6.7.9.10.11.12.13.14 0.04 ции экспериментального

хозяйства. Это фенотип

5 4.3.6.8.9.10.11._ 0.07 Ьри 3.4.6.9.10.11.13.14.

Он отличался от извест-

6 4,3,6,8.9.10,11 13,14 0.14 ных с участием маркера

ЬршЗ. тем, что в нем не 7* 4,3.6. 9.10.11, 13,14 0,00 выявлено маркера Ьрш8.

который в популяции экс-

8 4. 6.8,9.10,11.12,13.14 0.26 периментального хозяйст-

ва всегда присутствовал

9 1, 6.8,9,10.11. 13.14 0.05 в паре с ЬртЗ. Этот факт

позволил нам постулиро-

10 4,_9. 11.12_ 0,15 вать наличие одиннадца-

того Ьрт-гаплотипа.

И 6.8.9.10, 12. 14 0,12 Рис. 1. Гаплотипы Ьрт-локуса.;

Ьрт4.9,и,12 и1ршг.<.5.7.».10.-11,1г1 Идентификация маркера 13 позволила подразделить гаплотип Ьрт3•<-б-8-9'10-11 на даа гаплотипаЬрт3-4'6'8'9'10'11 и ЬртзХб-8'9'10-13, а идентификация маркера 14 позволила отличать Ьрт1•2'6-7-10-11-13 от ьрт1.г.бГ?г,1б.11.1з,14<

В таблице 2 представлены результаты анализа норок экспериментального хозяйства по 14 аллотипам. Видно, что число фенотипов увеличилось с 21 до 30. Таким образом, увеличение числа маркеров с 7 до 14 не привело к существенному увеличении числа выявляемых фенотипов. Это разнообразие можно объяснить попарным комбинированием 10 гаплотипов (рис. 1). которые встречаются в исследуемой популяции с различной частотой и обусловливают существование 55 генотипов.

Таким образом, обнаружен обширный аллоантигенный полиморфизм одной сложной иммуногенетической системы. Выявлено 14

дискретных антигенных вариантов молекул, изучен их генетический контроль.

Установлено, что они контролируются не отдельным структурным геном, а целым блоком таких генов, образующих мульти-генное семейство. В его пределах выделено несколько отдельных сублокусов с серией аллельных вариантов в каждом из них.

Установлено 11 гаплоидных комбинаций тесно сцепленных генов. Они передаются из поколения в поколение как ыоногенные признаки, встречаются в популяции с различной частотой и формируют большое разнообразие генотипов и фенотипов.

2. Биохимическое и ишунохиштоеское изучение Ьрв-липопротеина

Одновременно с изучением генетического контроля Ьрт-ал-лотипов исследованы физико-химические свойства молекул, несущих эти аллотипические варианты. Прежде всего, надо было уточнить, к какому именно классу липопротеинов относятся изучаемые аллоантигены. Для этого были приготовлены четыре основных фракции сывороточных липопротеинов норок: ¿К 1.006 г/мл; 1.006-1,063 г/ил: 1.063-1.210 г/мл и (М.210 г/мл. Тестирование этих фракций с помощью аллоантисывороток к Ьрт-ал-лотипам показало, что они присутствуют только во фракции с плотностью большей, чем 1.210 г/мл. В этой же фракции присутствовали все жиронесодержащие сывороточные белки. Поэтому, появилась необходимость привлечения для выделения Ьрт дополнительных приемов фракционирования, основанных на других свойствах молекул. Используя преципитирующие свойства полиэ-тиленгликоля, декстрансульфата, методы гельфильтрации и ионо-г обменной хроматографии, найдены условия, позволяющие получать препараты молекул Ьрт. содержащие все аллотипические варианты. которые бьши в исходной смеси сывороток, гомогенные при иммуноэлектрофорезе. аналитическом ультрацентрифугировании, электрофорезе в градиенте концентрации полиакриламидного геля и диск-электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ).

Установлено, что молекулы Ьрт имеют молекулярный вес около 720000. состоят из 4 идентичных субъединиц с молекулярным весом 180000, содержат в своем составе углеводы, которые, однако, не принимают участия в формировании антигенных детерминант. и очень устойчивы к действию трипсина.

Совокупность данных, полученных в ходе выполнения элект-рофоретических исследований нативных и трасформированных молекул Ьрт, давала достаточные основания для проверки предпо-

ложения о тождественности Lpm А2М. довольно хорошо исследованного гликопротеина плазмы крови млекопитающих, в частности человека. Однако, нами установлено, что в состав фракции альфа-макроглобулинов норки входит минимум два белка, которые отличаются друг от друга по антигенной структуре. Это свойство позволило отделить их друг от друга посредством иммуноаф-финной хроматографии. Полученные нативные белки также различаются. но очень незначительно, по электрофоретической подвижности. В соответствии с общепринятой для AM номенклатурой, белок с большей подвижностью принято называть AIM, а белок с меньшей подвижностью - А2Ы. Оказалось, что все Lpm-аллотипи-ческие детерминанты присутствуют только во фракции AIM. AIM норки не имеет общих антигенных детерминант с А2М человека, для которого антигенным гомологом является норочий А2М. Исследование препарата AIM методом электронной микроскопии показало. что эти молекулы имеют типичную для альфа-макроглобулинов НЖ-Н"-образную форму и размеры.

Все вышеназванные свойства характеризуют Lpm(AIM) норки как типичного представителя семейства AM. Об этом же свидетельствуют данные по частичной аминокислотной последовательности фрагмента из середины полипептидной цепи Lpm норки, любезно определенной для нас проф. L.Sottrup-Jensen. Этот фрагмент (VEVRETVRKYFPXT) из середины цепи частично покрывает область активного центра. Видно, что он отличается наличием четырехчленной вставки (VEVR). значительно нарушающей гомологию с А2М и PZP человека и А2М крысы, но не с AIM и AI13 крысы (табл. 3).

Таблица 3. Сравнение частичной аминокислотной последовательности AiM(Lpm) норки с известными(Sottrup-Jensen et al.,1984. 1989) последовательностями макроглобулинов человека и крысы.

Последовательность 1 1 Позиции

1 AIM (Ьрш) норки 1 VEVRETVRKYFPX Т-716-

А2М человека 1 ETVRKYFPE Т-716-

PZP человека 1 ETVRSYFPET-

А2М крысы 1 ETRRSVFPET-

AIM крысы 1 VE VRET VR-

Ai13 крысы 1 DPVIETIRNYFPET-

Полученные данные о принадлежности Lpm к семейству альфа-макроглобулинов (AM), подсемейству А1Ы. являются основой для введения новой номенклатуры изучаемых белков, что проделано путем простой замены Lpm на AIM. В диссертации используется оба обозначения. Из представленных данных также следует, что семейство AM норки включает в свой состав минимум два подсемейства - полиморфное AIM и ыономорфное А2М. Их сравнительный анализ открывает дополнительные возможности описания семейства в целом. В плане генетической характеризации АМ-се-иейства необходимо было выяснить, локализуются ли AIM и А2М гены в пределах одной хромосомы, или же в разных хромосомах.

3.Изучение хровосотой локализации АЫ-гонов у норки и овцы.

Основываясь на представлениях о существовании групп син-тентных генов у млекопитающих, мы предположили, что у норки АМ-гены находятся в хромосоме 9, которая по составу-локализованных в ней генов (Serov et al.. 1987) похожа на хромосому 12 человека, содержащую ген А2М (Bell et al., 1985; Кап et al.. 1985). Используя наличие полиморфизма у гена пептида-зы-В, локализованного в этой хромосоме (Mullakandov et al.,

1986), мы провели опыт по выявлению ассоциации между отдельными маркерами РЕРВ и Lpm. Выполнено дигибридное анализирующее скрещивание, в котором самки были гомозиготными по Lpm-локусу и гену РЕРВ. а самцы - двойными гетерозиготами. Результаты представлены в таблице 4, где "А" означает информативный аллель РЕРВ3, "В"- информативный гаплотип Lpm-локу-са. а прочерк - отсутствие соответствующих признаков. Видно, что обнаружены все четыре фенотипических класса потомков, ожидаемых в анализирующем скрещивании. Два из них являются основными, включающими в свой состав преобладающее большинство потомков, а два - дополнительными, с небольшим числом особей, что указывают на сцепленное наследование аллотипов макроглобулинов и электрофоретических вариантов пептидазы-В. Частота рекомбинации между Lpm-локусом и геном РЕРВ составляет 0.11±0,03. Таким образом, А1М-локус находится в хромосоме 9 норки, на растоянии 11сМ от гена РЕРВ.

Локализация мономорфного у норки гена А2М выполнена с использованием панели клонов гибридов соматических клеток "норка х китайский хомячок", созданной ранее (Serov et al.,

1987), и фрагмента гена А2М человека, предоставленного американскими коллегами (Bell et al., 1985). Методом геномной

Таблица 4. Наследование полиморфных вариантов РЕРВ и Lpm.

Генотип! Генотип|Фенотипические классы потомков: IЧастота ре-самок I самцов IнерекомбинантныеI рекомбинантные!комбинации

- - I А В I — AB I А - -В| ----- |----- | | |

- - I - - I 49 50 I 7 5 1 0.11+0.03

блотгибридизации установлено наличие видоспецифических фрагментов, присутствие которых совпадало с наличием в клонах хромосомы 9 норки. Следовательно, хромосома 9 норки является единственной, имеющей последовательности, гомологичные гену А2М человека. Таким образом, оба гена АМ-сеыейства норки (А2М и AIM) локализованы в пределах одной хромомосомы и сделан вывод, что семейство в целом является компактным. Позднее показано, что и у овцы семейство занимает вполне предсказуемое (3q26-q35) место (Grafodatsky et al., 1993).

i. Изучение фенотипической экспрессии макроглобулинов норки

Принимая во внимание тот факт, что у норки семейство АН состоит из двух подсемейств. AIM и А2М, представляло интерес выянить, что у них является общим, и в чем они отличаются друг от друга в функциональном отношении. Эта работа начата с исследования пространственных и временных характеристик фенотипической экспрессии соответствующих белков.

Используя моноспецифические кроличьи антисыворотки к й1М и ö2M норки, проанализировали их распределение в тканях стандартным иммуногистохимическим методом Кунса (табл. 5).

В подавляющем большинстве органов норки ölM и 02М выявляются в одних и тех же морфофункциональных образованиях, что свидетельствует о возможной общности их функций. Поскольку наибольшие количества alM и «2М установлены в волокнистых и клеточных элементах соединительной ткани всех исследованных органов, то можно предположить, что они функционируют подобно й2М человека в качестве ингибиторов протеиназ, иммуномодуля-торов, транспортеров различных лигандов и пр. Дифференциальное присутствие й1М и й2М в фолликулах яичника может указывать на их разное участии в функции размножения, а особый, но однотипный характер свечения в гепатоцитах может свидетельст-

Таблица 5. Тканевое распределение й!М и а2М норки.

Структуры, имевдие положительную реакцию на: с(2М норки I й!М норки

Орган

Еелудочно-I Собственная пластинка

кижечный 1 слизистой оболочки

тракт I гелудка и кипечника. I

Подаелу- I Соединительная ткань

дочная I ыеаду ацинусами. эндо-

келеза I телиальше клетки со-

I судов панкреатических

I островков.

I

Собственная пластинка слизистой оболочки кишечника, в аелудке -негативная реакция.

Те ае структуры, что на 02М.

Печень I Часть гепатоцитов. I

I клетки Купфера. I

I I

Легкие I Соединительная ткань, I

I альвеолярные мшсрофаги. I

I I

Почки I Мегканальцевая соеди- I

I нительная ткань, эндэ- I

I телий клубочковых ка- I

I пилляров. I

Яичники I Соединительная ткань

I строш корковой и моз-

I говой части, фоллику-

I лярный эпителий.

!

Те ае структуры, что на «2М.

Те ве структуры, что на «2М.

Те ве структуры, что на «2Н.

Соединительная ткань строш, отдельные клетки фолликулярного эпителия.

Селезенка I Диффузное окрашивание

и лимфа- I лимфоидных узелков,

тические I отдельные крупные кле-

узлы I ки на периферии, сое-I дмнительная ткачь.

Те же структуры, что на 02 М.

вовать о синтезе в этих клетках и а1М, и «2М.

На рис. 2. представлен график изменения концентраций й1М и с(2М в постнатальном онтогенезе. Вид зависимости уровня й1М

от времени позволил выделить три периода, отличавщихся по тенденциям в динамике. На первом из них. охватывающем " поздний пренатальный - ранний постнатальный* период, концентрация й1Н практически не меняется и составляет примерно 10-20% от уровня ззрослых особей (самок-матерей). В течение последующей недели (второй период) происходит резкий подъем уровня, достигающий максимального значения на 20-25 день. На третьем этапе концентрация И1Н начинает уменьшаться. Сначала довольно резко, затем вид кривой приобретает более плавные очертания. По-видимому, интенсивность функционирования й1М семейства генов в эти периоды различается. Максимальной продуктивностью характеризуется второй период.

Рис. 2. Изменение концентраций «1М и й2М макроглобуликов в постнатальном онтогенезе норки.

Изменение концентрации «2М имеет более слоаный вид. Резкий подъем уровня этого белка наблюдается в первый день пост-натальной жизни. У самок перед родами концентрация 02М составляет 2 иг/т, что меньше, чем у эмбрионов, примерно в два раза. В течение последующих 2-3 дней концентрация этого белка падает, достигая локального минимума на 4 день. Затем уровень А2М начинает вновь увеличиваться, достигая максимального зна-

чения у щенков 1,5 месячного возраста. Последующее уменьшение концентрации достигают минимального значения за период наблюдения к 5 месяцам.

Не установлено в данном эксперименте достоверных различий в уровнях й1М и 02М между одновозрастными самцами и самками. Не установлено таковых и между выборками норок разных генотипов по Lpm-локсу. характеризующихся разным набором ап-лотипических маркеров. В стационарном режиме концентрация маркеров Lpml, Lpm2, Lpn4 у норок, гетерозиготных по соответствующим генам, примерно в 2 раза ниже, чем у гомозиготных.

Таким образом, паттерны dlM и с(2М норок имеют совершенно четко выраженное своеобразие в нормальном онтогенезе. Наиболее впечатляющее различие наблюдается в первые дни жизни. Интенсивное функционирование aZU подсемейства начинается, по-видимому, в раннем эмбриональном периоде, что характерно для эволюционно более древних представителей семейства. Активизируется с(1М только после рождения. На основании этого критерия он может быть отнесен к относительно молодым, в филогенетическом смысле, структурам. В ходе онтогенеза происходит довольно плавная замена одного варианта другим. У взрослых особей выявляются вполне определяемые количества й2М, хотя преобладающим становится tflM. Mosho предположить, что позднее вовлечение а1М подсемейства в функционирование ослабляет действие на него естественного отбора, что может способствовать накоплению изменений в соответствующих генах, выявляемых в виде полиморфных вариантов. И наоборот, на подсемейство, обеспечивающее жизнеспособность практически на всем протяжении жизни особи, естественный отбор долаен накладывать ограничения на изменчивость.

5. Филогенетический анализ антигенных структур All! и А2М норки.

Для решения вопроса о том, соблюдается ли на межвидовом уровне большая склонность к изменчивости AIM по отношению к А2М, были выполнены исследования по выявлению аллотипической Lpm и изотипической антигенной изменчивости AIM и А2М у видов. находящихся в разной степени родства с норкой.

Ранее было установлено. что аллотипические маркеры 1-5,7,8 обнаруживаются только у американской норки, и их антигенные структуры не выявляются у других представителей семейства куньих (Баранов. 1977). Этот подход к анализу филоге-

нетического возраста аллотипов оказался эффективным и применялся для всех вновь идентифицированных аллотипов. У американской норки имеется группа из 9 видоспецифических маркеров, в которую, наряду с перечисленными, входят новые аллотипы 12 и 14 (табл. 6). Во вторую группу объединяются аллоантигены 6. 9-11 и 13, присутствующие у всех исследованных видов куньих. Небольшое исключение составляют маркеры 6 и 9 в роде куниц (соболь, куница каменная, куница лесная). В сыворотках этих видов антигенная специфичность 6 слегка изменена, а 11 - едва выявляется. Довольно неожиданно антигены 6,9-11,13 были выявлены у двух видов нерп. Все эти специфичности имели частичную антигенную идентичность по отноиениа к гомологичным антигенам американской норки. У байкальской нерпы все исследованные образцы содержали весь перечень этих антигенов, а у каспийской нерпы у 5 из 20 особей не было обнаружено одновременно антигенов 6 и 10. Отсутствие всех этих антигенов- установлено у лисиц и кошек. Очевидно, что видоспецифические маркеры возникли уже после того, как корка отделилась от других видов семейства куньих. Вероятно, общий предок всех куньих имел полный набор структур, детерминирующих антигены 6,9-11,13. Их имел, по-видимому, и общий предок тюленей и куньих, проживавший более 20 млн. лет назад. Так или иначе, разбиение маркеров на две группы очертилось вполне определенно. Более того, выяснилось, что можно выделить и дополнительные группировки.

Как изменялись в ходе филогенеза другие элементы антигенной структуры, в частности, изотопической? По степени сходства гомологов AIM исследованные виды дифференцировались на следующие группы (табл. 6). Американская корка - вид принятый за начало отсчета. Вторая группа - солонгой. горностай, колонок, степной хорек, лесной хорек, фуро, меявидовые гибриды хорьков, хонорик, европейская норка - сыворотки крови этих видов содержат AIM; очень незначительно отличающийся по антигенной структуре от своего гомолога у американской норки. В классической систематике все эти виды принято включать в один род, в который, в ранге подрода, входит и американская норка. Третья группа - перевязка, у нее различия более существенны, чем у любого из видов второй группы. Четвертая группа -представители рода куниц (лесная и каменная куницы, соболь) -

Таблица 6. Тестирование аллотипов с(1М(Ьрш) в сыворотках близкородственных видов семейства куньих и семейства тюленьих

Частота в (%) антигенных специфичностей Вид Аллоантиген

12 3 4 5 7 8 12 14 6 9 10 11 13

Американская норка 33 30 37 86 7 37 80 77 94 96 92 98 98 91

Свеглый хорек 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

Черный хорек 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

Гибриды хорьков 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

Колонок 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

Итатси 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

Солонгой 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

Горностай 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

Ласка 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 - - -

Европейская норка 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

Перевязка 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

Куница лесная 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1* 1**1* 1

Куница каменная 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1* 1**1* 1

Соболь 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1* 1**1* 1

Вздра речная 0000000001111

Выдра морская 0000000001111

Нерпа байкальская 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1* 1* 1* 1* Нерпа каспийская 000000000 75*1* 75*1*

* неполная иммунологическая идентичность; ** слабая реакция; не тишфовано; 1=100%; 75 - 75%.

наиболее сильно дивергировапи по А1М от американской норки. Пятая - речная и морская выдры, представители этих видов анализировались позднее и не так системно, как вьшеперечислен-

вде. По нашей классификации их правильнее размещать в промежутке мезду второй и третьей группа1«. По аналогичным изменениям структуры А2М эти ее виды удалось разделить только на дзе группы: перевязка и все остальные виды.

Таким образом, антигенная изменчивость куньих значительно сильнее выражена по А2М. неаели по А1Н, что ыокно было бы рассматривать как обычный пример рассогласования эволщии двух систем признаков в одной и той не систематической группе. Однако, особенность модели А1М-А2М состоит в том, что в данном случае могшо говорить об изменим двух филогенетически родственных белгхв, имеющих практически идентичные размеры составляющих их полипептидных цепей. Поэтому, представленные данные указывают, скорее всего, на большую скорость антигенной изменчивости AIM по сравнению с А2М при дизергащии видов семейства куньих.

Чтобы понять, 1сак меняется антигенная структура двух изстипически дифференцированных AM норки в более удаленных таксонах, проанализирована коллекция образцов сывороток 47 видоз млекопитающих, относящихся к 22 семействам 8 отрядов. Одновременное присутствие гошлогов йШ и й2Н у представителей насекомоядных (бурозуб:са, es), грызунов (белка), хищных (собака, медведь), парнокопытных (свинья, корова), непарнокопытных (лозадь) указывает на наличие соответствующих генетических систем у общего предка всех современных отрядов млекопитающих. Это свидетельствует о значительном времени раздельной эволюции двух подсемейств манроглобулинов,. сопоставимом по продолжительности со временем эзолвции млекопитающих как класса. Однако, при такой гипотезе остается непонятным факт отсутствия гомолога а1М у представителей отряда приматов (человек, зеленая мартышка) и отряда рукокрылых (летучая мышь).

Очевидно, что наличие ttlH-подсемейства позволяет предполагать и наличие в нем полиморфных вариантов, как это выявлено в наиболее яркой форме у американской норки. С целью проверки этого предполоаения проведен цикл исследований AM свиньи, у которой öiM-подсемейство показывало достаточное сходство с «IM норки.

6. Ншуногенетическое изучение альфа-махроглобулинов свиньи.

В результате проведенных аплоиммунизаций свиней были получены аллоантисыворотки, выявлящих пять аллотипв макроглобулинов. Им присвоены номера AMI, АМ2, АМЗ, АМ4 и АМ5. С использованием кроличьих антисывороток к двум макроглобулинам норки, AIM и А2М, выяснено, что аллотип AMI локализован на А2М свиньи, а аллотипы 2-5 на AIM. В ходе этих экспериментов, во-первых, обнаружен полиморфизм белка гомологичной AIM норки. во-вторых, у свиньи выявлен аллотип. а следовательно, и полиморфизм второго макроглобулина - А2М. Одновременное существование маркеров для двух подсемейств расширило возможности исследования семейства в целом. С помощью аллоантисыво-роток. выявляющих аллотипы АМ1-АМ5, исследовано более 2 тысяч свиней различных пород (табл. 7. 8).

Для объяснения этих данных мы предположили, что исследуемые признаки принадлежат к одной генетической системе, которую назвали АМ-системой, и наследуются в виде аллогрупп. Все выявляемое разнообразие можно объяснить комбинированием 6 аллогрупп и соответствующих аллелей (рис. 3). Парные комбинации 6 аллелей могут обусловливать в популяциях свиней наличие 21 генотипа и 17 фенотипов. Несоответствие в числе генотипов и фенотипов объясняется тем. что некоторые индивидульные фенотипы могут определяться несколькими генотипами (табл. 7). В исследованных выборках обнаружено только 14 фенотипов, что может объясняться низкой вероятностью появления некоторых из них из-за редкости соответсвующих аллелей (табл. 8). а также другой причиной, вскрытой при изучении наследования АМ2,3.

Справедливость нашей генетической гипотезы подтверждают материалы первого этапа гибридологического анализа (Ермолаев и др.. 1991). включающего И вариантов скрещиваний (изучена 31 семья с 249 потомками). Аллогруппы АМЗ,4. АМ4,5 и AMI,2,3 и соответствующие гаплотипы являются общими, практически, для всех культурных пород (табл. 8). Аллогруппа АМ2.3 очень редко обнаруживается в популяционных выборках. Тем не менее, удалось исследовать ее наследование достаточно детально.

Четыре самки крупной белой породы имели аллогруппу АМ2.3. Они были покрыты хряками светлогорской популяции ми-нисвиней. которые не имели генов AMI и АМ2. От самок и нес-

кольких их дочерей получено 74 потомка. Примерно у половины из них (29 из 74) был аллель АЫ2.3 (табл. 9.4).

Таблица 7. Распределение фенотипических комбинаций и генетический контроль АМ-аллотипов в выборке свиней крупной белой породы (племенной с-х "Большевик". Новосибирская область)

аы Предполагае- Крупная белая порода

N фенотипы мые аК ге- число частота ожидаемая частота

нотипы свиней фенотипа генотипа фенотипа

1 1.2.3.4.5 1.2.3/4.5 11 0.0233 0.0320 0.0320

2 1.2.3.4.5Ь 1.2.3/ЭА45Ь - - 0.0032 0.0032

3 1.2.3.4 1.2.3/3.4 142 0.3014 0.2800

1.2.3/1.3.4 0.0032 0.2833

2.3/1.3.4 0.0001

4 1.2.3 1.2.3/1.2.3 17 0,0361 0.0400 0.0440

1.2.3/2.3 0,0040

5 1.3.4 1.3.4/1.3.4 1 0.0021 0,0001 0.0028

1.3.4/3.4 0,0027

6 1.3.4.5 1.3.4/4.5 - - 0,0003 0.0003

7 1.3.4.5Ь 1.3.4/ЗА45Ь - - 0.0000 0.0000

8 2.3.4 2.3/3.4 5 0.0106 0,0104 0.0104

9 2.3.4.5 2.3/4.5 - - 0.0016' 0.0016

10 2.3.4.5Ь 2.Э/ЗА45Ь - - 0.0001 0,0001

11 2.3 2.3/2.3 - - 0.0001 0.0001

12 3.4 3.4/3.4 226 0.4800 0,4900 0.4900

13 3.4.5 3.4/4.5 66 0.1401 0.1120 0.1120

14 3.4.5Ь 3.4/ЗА45Ь - - 0.0112 0.0112

15 ЗА. 4.5 ЗА45Ь/4.5 - - 0.0013 0.0013

16 ЗА. 4.5Ь ЗА45Ь/ЗА45Ь - - 0.0001 0.0001

17 4.5 4.5/4.5 3 0.0064 0.0064 0.0064

Всего: 471 1,0000 1.0024 1.0024

Таблща 8. Частоты АМ-аллелей в выборках свиней разных пород.

порода: Крупная1Крупная1Иведс- Литов- Кахе- Сва- 1 Кеме-

белая. (белая. 1кий ская тинс- новс-1 ровс-

1 Новоси-1 1ландрас белая. кая кая 1 кая

i бирск 1Грузия 1 Грузия Грузия 1

аллель! 1 п-471 1 п-309 1 1 п-301 1 п-304 п-235 п-1801 1 п-141

3.4 1 0,69 1 1 0.63 1 1 0,73 0.67 0,82 1 0.73 1 0.71

4.5 1 0,08 1 0,16 1 0.16 0,18 0.10 0.07 1 0.09

1.2.3 1 0,18 1 0.15 1 0.15 0.11 0,06 0,10 1 0.21

2.3 1 0,01 1 0.02 1 0.01 0.01 0,00 0,00 1 0,00

1.3.4 1 0.01 1 0.00 1 0.00 0,01 0,01 0,00 1 0.00

3A45b 1 0.00 1 0,01 1 0.02 0,06 0,10 0,10 1 0,00

1__2__А 3 В

2 А 3 В

4 А 3 В

4 А 3 В

4 А 3-5 в

4 а 5 в

5 аллотипов, 6 гаплотипов, 21 генотип, 17 фенотипов

Рис. 3. АМ-гаплотипы свиньи.

Аллотипы АМ2 и АЫ4 ведут себя как признаки, контролируемые аллельныыи генами. Нет животных. у которых отсутствовали бы оба маркера. Очевидно, что аллельные гены АМ2 и АМ4 образуют закрытую подсистему в сложном АМ-локусе. Вторая закрытая подсистема образована аллотипаыи АМЗ и АЫ5. которые ведут себя как аллельные варианты. Аллельного варианта для аллотипа AMI пока не выявлено.

Таблица 9. Наследование аллогрупп АМ1.2.3-АМШ.2.3 у свиней

разных пород.

N 1 Генотипы родителей 1 Число 1 1 семей 1потомков 1 i i i Фенотипы 1 потомков 1 H 1 0

1 1 1.2.3 „ 3.4 i i 1 6 1 i 45 1 3.4 1 15 1 22.5

4.3 3.4 1 1 1 3.4.2 1 13

1 1 1 3,4.2,1 1 17 1 22.5

2 1 2.3 х 3.4 1 5 1 34 1 3.4 1 21 1 17

4,3 3.4 1 1 1 3.4.2 1 8

1 1 1 3.4.2,1 1 5 1 17

3 1 3.4 f 1.2 1 5 1 45 1 3,4 1 28 1 22.5

3.4 3.4 1 1 1 3,4.2 1 18

1 1 1 3.4.2.1 1 1 1 22.5

4 1 3,4 1 11 1 74 1 3.4.2 1 29 1 37

3.4 3.4 1 1 1 3.4 1 45 1 37

H - наблюдаемая. О - ожидаемая численность потомков.

Две гетерозиготные самки AMI, 2.3/АН3.4 крупной белой были покрыты хряками той же породы ыинисвиней. От них получено 27 потомков F1. Ни у одного из них не выявлен маркер AMI. У 9 зафиксировано наличие только маркера АМ2. Одна из таких дочерей была скрещена два раза со своим отцом и дала в двух пометах 17 поросят, шесть из которых имели аллогруппу АМ2.3 и один - аллогруппу AMI,2.3 (табл. 9.3). Таким образом, на достоверном семейном материале, tai впрямую столкнулись с фактом явно не-менделевской передачи признака AMI от матери детям. Это означает, что аллогруппы и гаплотипа АМ2,3 в структурном отношении не существует. Просто есть ситуации, в которых аллель AMI инактивирован, или слабо экспрессирован. В такой состоянии он может передаваться потомкам. Затем этот аллель может активироваться. В виде генного комплекса AMI,2.3 он может передаваться потомству достаточно стабильно. У отдельных потомков одной матери, аллель AMI может инактивироваться и продолжить свое существование в неактивной форме. Материалы скрещиваний скороспелой мясной породы сибирской селекции.

предоставленные С. П. Князевым (табл. 9.1,2) подкрепляют наш наблюдения.

Снижение активности одного из аллелей гена, независимо от его аплельных структурных особенностей, приводит альтернативный аллель к состоянию, близкому к функциональной гаплои-дии. Если частота такого явления составляет 13Е (табл. 8). то это означает, что каждый сотый А2М аллель проходит проверку на функциональную пригодность. Гены, неполноценные в функциональном отношении, выявляются и отметаются не только тогда, когда случайно объединяются в составе редкой гомозиготы, а регулярно и неотвратимо. Очищение генофонда - не дело случая, а жизненная необходимость. Состояние сниженной экспрессии отдельного гена может сохраняться на протяжении нескольких поколений. Рано или поздно такой аллель вернется в свое обычное кодоминантное состояние экспрессии. На фенотипическом уровне это событие будет выглядеть как появление у потомков признака. отсутствовавшего у обоих родителей. Иммуногенетик объяснит появление такого поросенка неправильной записью родителей в племенных книгах. Такие примеры известны. Возможно, что часть таких наблюдений можно объснить тривиально. Но часть моает быть отображением феномена, который обнаружен и исследован в семействе АЫ.

До проведения наших исследований считалось, что аплоан-тигенный полиморфизм сывороточных белков млекопитающих характерен для очень ограниченного их числа, а именно для иммуноглобулинов. липопротеинов и. отчасти, комплемента. Ранние публикации по аплотипам макроглобулинов (Lelcola et al.. 1971; Berne et al., 1972), не давали оснований рассматривать АМ-се-мейство. как особо склонное к аллотипии. У норки самой разнообразной оказалась система макроглобулинов. Это побудило нас провести широкое исследование различных аспектов организации, функционирования и эволюции, результаты которого свидельству-рг, что существуют и другие виды, у которых полиморфизм этого семейства является если и не доминирующим, то вполне весомым. Для некоторых таксонов млекопитающих это является скорее правилом. чем исключением.

В компетенции имыуногенетики находится анализ процессов и явлений, затрагивающих опосредованные взаимоотнриения гено-

ма, как целого, с той его частью, которую можно отнести собственно к иммунной системе. В наиболее яркой форме результаты этих взаимодействий проявляются именно в мультигенньгх семействах иммунной системы (Hood, 1976; Dray, 1979; Adler et al., 1989; Klein, 1986. Фонталин. 1994; Kelchers, 1995). Но существует и ряд других систем, вовлеченных в эти конфликтные процессы. Возможно, что ш исследовали именно такой случай и смогли получить вполне оригинальную информацию. Можно надеяться. что общий прогресс в исследовании семейства макрсгло-булинов, активизировавшийся в последние годы, не обойдет вниманием и полиморфные гены, изучению которых была посвящена эта работа.

ВЕВОДН

Анализ экспериментальных данных показал, что обнаружение Lpm-систеыы американской норки, идентифицированной в ходе выполнения данной работы }сак AIM подсемейство семейства аль-фа-ыакроглобулинов, произошло благодаря наличия двух, ванных свойств. Во-первых, довольно высокой полимсрфности входящих в его состав генов. Во-вторых, высокой аллоантигенности контролируемых этими генами белков. Более подробно эти, и некоторые другие, свойства мояно охарактеризовать следующим образом.

1. С помощью внутривидовой иммунизации и методов иммуно-химической и биохимической идентификации выявлено в общей сложности 14 аллотипов сывороточного AIM макроглобулина американской норки. С использованием идентифицированных маркеров обнаружено больше фенотипическое разнообразие норок, генетически контролируемое одиннадцатью гаплотипаыи, каждый из которых представляет блок тесно сцепленных генов. В пределах этого генного комплекса выделено 3 сублокуса, с серией аллелей в каждом. Эти подсистемы характеризуются примерно одинаковым аллельным разнообразием и вносят вполне сопоставимый друг с другом вклад в создание общего полиморфизма AIM. В результате их совместного учета около 80% норок идентифицированы как гетерозиготы по AIM. что позволяет считать данное семейство, среди изученных у данного вида, самым полиморфным.

2. Разработан метод препаративного выделения альфа-макроглобулинов. маркированных аллотипическими детерминантами. Он включает в себя ступенчатую преципитацию полиэтилеглико-лем, гельфильтрацию. ионообменную, псевдоаффинную и иммуноаф-финную хроматографии. С их применением получен препарат AM. гомогенный при аналитическом ультрацентрифугировании, электрофорезе в градиенте концентраций полиакриламидного геля, диск-электрофорезе и иммуноэлектрофорезе.

3. Вскрыта следующая совокупность свойств исследуемого белка: молекулярная масса, составляющая около 720 ООО дальтон. тетрамерный субъединичный состав (4x180 000), характер взаимодействия с протеиназами и нейраминидазой, "S-H"-образная форма и аминокислотная последовательность из разных частей полипептидной цепи, указывающая на его принадлежность к семейству альфа-макроглобулинов, подсемейству AIM. Показано, что от второй, аплотипически мономорфной формы альфа-макроглобулинов норки, А2М, AIM отличается по общей антигенной структуре и электрофоретической подвижности.

4. Установлено, что у норки ген А2М и подсемейство AIM генов цакроглобулинов находятся в хромосоме 9. возможно, в тесно сцепленном состоянии. Этот факт позволяет считать Alá семейство норки, в целом, компактным. Хромосома 9 норки имеет синтентное сходство в генном составе с хромосомой 3 овцы, в которой также установлено наличие гена А2М, и вне которой присутствия дополнительных AM генов не обнаруживается.

5. AIM и А2М норки имеют сходное тканевое распределение, характеризующееся их совместным проявлением в большинстве изученных морфофункциональных структур, что позволяет предположить сходство их базовых функций. Некоторые различия в экспрессии. в частности в яичнике, по-видимому, отрааают особенности, связанные с их структурно-функциональной специализацией. Об этом же может свидельствовать и дифференциальный характер экспрессии AIM и А2М в нормальном постнатальном онтогенезе. и при некоторых патологических процессах. Более позднее включение в интенсивное функционирование AIM. по сравнению с А2М. дает основание говорить об AIM как об эволюционнно более молодом члене семейства, на который естественный отбор оказывает меньший стабилизирующий эффект, чем на А2М. функци-

онирущий практически на всем протяхениии жизни норок.

6. Изучение филогенеза AIM и А2М путем анализа характера антигенной изменчивости и определение наличия их гомологов у млекопитающих, находящихся в разной степени эволюционной близости к американской норке, позволило выявить большую изменчивость AIM, по сравнению с А2М. Это относится как к анализу группы видов семейства куньих, к которому относится норка, так и к анализу представителей более удаленных таксонов, в которых можно предполагать наличие разных типов организации АМ-семейства. В частности, это относится к человеку, у которого отсутвует AIM. к морской свинке, у которой не обнаружено А2М. к кролику, у которого произошла реверсия между AIM и А2М. и, по-видимому, к некоторым другим видам млекопитающих.

Филогенетичеасий анализ индивидуальных аллоантигенных вариантов, позволил разделить их на две категории. К первой отнесены аллотипы 1, 2, 3. 4, 5, 7, 8. 12. 14. являющиеся ви-доспецифическими для американской норки. Ко второй отнесены аллотипы 6. 9. 10, 11, 13. обнарузенные кроме норки практически у всех исследованных видов куньих, двух видов нерп из отряда ластоногих, а также, в виде отдельного случая для лло-типа 10, у кролика. Наличие таких разновозрастных в филогенетическом отношении структур у одного вида позволяет предполагать наличие факторов, поддерживающих разнообразие по А1М-подсеиейству.

7. Применение разработанного подхода к изучению АМ-се-мейства у свиньи, позволило провести идентификаций пяти маркеров АМ-свиньи и исследовать их генетический контроль. Установлено. что четыре из них являются маркерами AIM макроглобулина свиньи, и только один является маркером А2М. Обнаружение полиморфных маркеров двух подсемейств AM позволило установить следующее. 1. Существование аллогрупп AMI.2.3. объединяющей в своем составе маркеры двух макроглобулинов, прямо указывает на тесное сцепление генов А2М и AIM, контролирующих полиморфизм этих двух белков. 2. Транзитное существование аллогруппы АМ2.3, отличающейся от полной аллогруппы AMI.2.3. ослабленной экспрессией аплеля AMI гена А2М. указывает на существование регуляторных факторов, влияющих на проявление АМ-генов.

8. На основании совокупности собственных и литературных данных развито представление о ыакроглобулинах, как семействе внутривидовых и мегвидовых гомологов разного филогенетического возраста. Они имеет сходство структуры и базовых функций. Вместе с тем. их отдельные члены могут иметь разный паттерн экспрессии в онтогенезе и разную предрасположенность к фиксации изменений. В формирование внутривидового полиморфизма данного семейства вносят вклад как разнообразные тесно сцепленные и аплельные гены, так и регуляторные факторы, модулирующие экспрессию алпельных генов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Баранов O.K., Ермолаев В.И. Нммуноэлектрофоретический анализ сывороточных липопротеинов норки, фракционированных методом препаративного ультрацентрифугирования // Биохимия. 1977. Т. 42. В. 1. С. 60-65.

2. Баранов В. И., Ермолаев В. И. и др. Идентификация Lpm-аллотипов с(2-липопротеинов норок методом препаративного ультрацентрифугирования // Генетика. 1977. Т.13. N 3. С.542-544.

3. Баранов 0. К., Зыкова Т. В.. Ермолаев В. И. Количественное определение аллотипоз Lpol и Lpa2 у норок с 1 и 2 дозами соответствующих генов // Доклады АН СССР. 1977. Т. 236. К 6. С. 1479-1481.

4. Баранов O.K., Савина Ы.А.. Ермолаев В.И. Иммунологический анализ аллозимов эстераз-липопротеинов норок //14 Международный генетический конгресс. М. 1978. Т. 1. С. 110.

5. Yermolaev V.I.. Baranov O.K. Biochemical study of the Individual allotypic molecular variants of very high density lipoprotein (Lpm) in mink // 16 Intern. Conf. on animal blood groups and biochemical polymorphism. Leningrad. 1978. P. 177.

6. Baranov O.K., Yermolaev V.I. Molecular distribution of allotypic determinants Lpm7, Lpm8 of mink very high density (^-lipoproteins // Imaunochem. 1978. V.15. N 9. P. 629-632.

7. Baranov O.K., Yermolaev V.I., Belyaev D.K. Immunoge-netlc study on the polymorphism of serum a2-lipoproteins in sink. 2. Identification of allotypes Lpm7, Lpm8 and genetic control of seven markers of the Lpm system // Biochemical Genetics. 1978. V. 16. N 5/6. P. 399-414.

8. Ермолаев В.И.. Бараков O.K. Биохимическое исследование индивидуальных аллотипических вариантов молекул сывороточного Ьри-липопротеина очень высокой плотности американской норки //16 Международная конференция по группам крови и биохимическому полиморфизму гиеоткых. Л. 1979. Т. 3. С. 238-243.

9. Баранов 0. К.. Зккова Т. В.. Ермолаев В. И. Эффект дозы генов Ьри-систеш аллотипов норок. Количественный анализ партеров Lpml. Lpa2,Lpm4 // Генетика. 1980. Т. 16. Н 5. С. 874-883

10. Бараков O.K.. Савина И.А.. Ермолаев В.И. Новый алло-тнп иммуногенетической систеыы Ьрз-лкпопротемна очень высокой плотности в сыворотке крови норок - Ьрпб // Доклады АН СССР. 1980. Т. 251. N 6. С. 1513-1516.

11. Ермолаев В.И., Бараков O.K. Енделенне и некоторые свойства Ьрт-липопротеида очень высокой плотности сыворотки норки // Биохимия. 1980. Т. 45. В. 7. С. 1203-1214.

12. Ермолаев В.И., Филиппов В.В., Баранов O.K. 0 Богясз-ной связи генетичесюи систем Lpa-лмпопротеша и й2U американской корки // 5 Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизм генетических процессов". М. 1983. С. 68-69.

13. Баранов O.K.. Беляев Д. К., Савина И. А.. Ериолаез В. И. Генетика и эволюция Ьря-скстеж американской норки. Сообщение I. Идентификация и генетический анализ аплотипа Lpa8 // Генетика. 1984. Т. 20. N 1. С. 114-127.

14. Беляев Д.К.. Баранов 0.К.. Ермолаев В.И., Савина H.A. Генетика и эволюция Ьрл-системы норки. Сообщение 2. Взрызообразное возникновение Ьри-аллотнпического полиморфизма у норки как воз1,!огшй результат активации в филогенезе "дрем-лэдих" генов // Генетика. 1984. Т. 20. N 1. С. 128-139.

15. Баранов O.K.. Ермолаев В.И.. Филиппов В.И. и др. Генетика и эволюция Ьрт-снстеш американской норки. Сообщение 3. Идентификация, и филогенетическое исследование аллотипов Ьрп>9 и Lpml0 // Генетика. 1984. Т. 20. N 6. С. 1016-1023.

16. Баранов O.K., Беляев Д.К.. Ермолаев В.И. и др. Генетика и эволюция Lpm-систеш американской норки. Сообщение 4. Генетический контроль эволюционно "консервативных" аллотипов Ьрш9 и LpmlO // Генетика. 1984. Т. 20. N 6. С. 1024-1036.

17. Баранов 0. К.. Беляев Д. К.. Кутявина Т. В.. Савина М.А.. Ермолаев В. И. Генетика, эволюция Lpm-системы норки. Со-

общение 5. Новые алпотипы Lpall и Ьри12 и две категории генов в семействе Lpm // Генетика. 1984. Т. 20. N 7. С. 1190-1204.

18. Беляев Д.К.. Баранов O.K., Брыолаев В.И. и др. Эволюционная генетика ыультигенного семейства Lpm // "Молекулярные механизмы генетических процессов". М. 1985. С. 176-84.

19. Кочлаввили Т.Н.. Баранов O.K.. Брыолаев В.И. Исследование Lpm-систеш- аллотипов норок в связи с алеутской болезнь») // Генетика. 1986. Т. 22. N11. С. 1898-1902.

20. Baranov O.K., Yermolaev V.I. et al. Genetics, evolution. of the Dink Lpm system // 20 International Conference Animal Blood Groups Blochem. Polym. Finland. 1986. P. 92a.

21. Баранов O.K.. Кутявина Т.В.. Ермолаев В.И. и др. Генетика и эволюция Ьри-системы американской норки. Сообщение 6. Идентификация, генетический контроль и филогенез нового аллотипа Lpal3 // Генетика. 1987. Т. 23. N 1. С. 143-156.

22. Кутявина Т. В.. Ермолаев В. И.. Савина К. А.. Баранов O.K. Генетика и эволюция Lpm-систеш норки. Сообщение 7. Новый видоспецифичный аллотип Lpm // Генетика. 1987. Т. 23. N 4. С. 738-750.

23. Ершлаев В. И., Муллакандов М. Р., Серов 0. К.. Баранов O.K. Семейство Lpn-генов находится в 9 хромосоме американской норки // Доклада АН СССР. 1987. Т. 294. N 5. С. 1232-1234.

24. Скрипкина Л.А.. Серова И.А.. Ермолаев В.И. Распределение «2М-глобулина и Ьрт-протеина в органах и тканях норки // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1988. Т. 44. N 2. С. 56-63.

25. Ермолаев В. И.. Муллакандов М. Р.. Мирцхулава Э. Г. и др. Локализация ыультигенного Lpm-локуса в хромосоме 9 американской норки // Генетика. 1988. Т. 24. N 5. С. 922-927.

26. Митичаввнли Р. С., Кочлалвили Т. И.. Мирцхулава Э. Г., Ершлаев В. И. и др. Исследование аллотипов сывороточных белков свиней // Генетика. 1988. Т. 24. N 9. С. 1665-1670.

27. Ермолаев В.И., Шумный Т.В., Мирошниченко С.М. и др. Генетика и эволюция Lpm-систеш. Сообщение 8. Особенности изменений антигенной структуры Ьрт-протеина и с(2-макроглобулина в семействе куньих // Генетика. 1988. Т. 24. N 9. С.1658-1664

28. Шумный Т.В.. Ермолаев В.И., Мирошниченко С.М. и др. Генетическая изменчивость антигенной структуры Ьрт-протеина и

02U у не-куньих млекопитающих // Генетика. 1989. Т. 25. N 3. С. 513-520.

29. Yennolaev V.l., Karaslk G.I.. Khlebodarova Т.Н. et al. Localization of the A2LÍ gene and Lpa gene family on aink chromosome 9 // Theor. Appl. Genet. 1989. V. 78. P. 93-96.

30. SavlnaM.A.. Yermolaev V.l.. Aasted B. et al. Ibbu-nogenetic studies of mink. Comparison of Lpm allotypes of Danish. Siberian aink // Scientifur. 1989. V. 13. N 1. P.51-55.

31. Ермолаев В.И. Кирцхулава Е.Г.. Савина Ы.А.. Кутявина Т.В. и др. Иульткгенные семейства й-макроглобулинов норки и свиньи // 3 Школа-семинар по генетике и селекции тавотных. Известия СОАН СССР. 1989. В. 2. С. 30-31.

32. Митичашили P.C.. Нирцхулава Э.Г.. Ермолаев В..!.. Савина И.А., Баранов O.K. Антигенный полиморфизм сывороточныг белков свиньи: иммунохиыическая и биохимическая идентификация аллотипов // Известия СО АН СССР. 1989. В. 3. С. 40-46.

33. Попова Н. А.. Церцвадзе Д. К.. Кочлашвили Т. И.. Савина М. А.. Фомичева И. И., Скрипкина Л. А.. Ермолаев В. И. и др. Им-мунохиническая и генетическая характеристика крови норок при спонтанном и экспериментальном ннифицировании вирусом алеутской болезни // Сельскохоз. биология. 1989. N 6. С. 67-73.

34. Ермолаев В.И.. Савина H.A. Иммуногенетика Lpm-иак-роглобулина норки и возмокные причины сильного галунного ответа на его антигены // I Съезд иммунологов. Сочи. 1989. С. 36.

35. Ермолаев В. И. Особенности изменений антигенной структуры альфа-макроглобулинов в семействе куньих // 5 Съезд Всесоюзного териологического общества. М. 1990. С. 58-59.

36. Ермолаев В. И.. Иирцхулава Э. Г., Савила 1!. А.. Шгги-чаявьли P.C. и др. Сравнительно-эволюционное исследование нм-муногенетических систем апьфаиакроглобулинов норгси и свиньи // 7 Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизма генетических процессов". М. 1990. С. 77.

37. Ермолаев В.И.. Мирцхулава Э.Г., Митичашвили P.C. и др. О результатах международного сравнительного испытания реагентов к аллотипам сывороточных белков свиньи, проведенного в 1987-1988 гг. // Генетика. 1990. Т. 26. N 5. С. 956-957.

38. Ермолаев В. И.. Мирцхулава 3. Г., Митичаивили Р. С. и др. Идентификация аллотипов ыакроглобулинов. липопротеинов и

иммуноглобулинов сыворотки крови свиньи Л Бюллетень ВНИИ-ГИРЯ. Л., 1990. В. 119. С. 36-40.

39. Yenaolaev V. I.. Mirtchulava Е. G.. Savlna 11.A. et al. Genetics of АЫ-system (Gp) oi allotypes of alpha-macroglobu-lln In pig // Abstract of 22 Intern. Conf. of Animal Genetics. Michigan. USA. 1990. P. 24.

40. Ernolaev V.I.. Savlna M.A.. Mirtchulava E.G.. Serova I.A. Genetics, functioning and evolution of nink. alpha-iaac-roglobulins // 28 Meeting of Intern. Soc. Oncodev. Biol, and Med. Suzdal. USSR. 1990. P. 46.

41. Yenaolaev V.I.. Mlrtchulava E.G.. Savlna Ы.A. et al. Icaunogenetics of talnk and pig alpha-nacroglobulins // Hop-pe-Seyler-s Z. Biol. Chem. 1991. V. 372. P. 135-136.

42. Ертпаев В.И.. Иирцхулава 3.Г., Савина М.А., Мити-чагшили Р. С. и др. 0 гомологии Lpm системы аллотипов американской норки и Gp-систеыы аллотипов домакней свиньи // Гене-тшса. 1891. Т. 27. N 2. С. 304-315.

43. Скобельцина Л.U.. Ермолаев В.И.. Скрипкина U.А.. Ро-иаз;енко А. Г. Разделение и очистка Ьрш и 0ZU ыакроглобулинов сыворотки норки // Биохимия. 1991. Т. 56. В. 9. С. 1688-1700.

44. Yernolaev V.I.. Mlrtchulava E.G.. Savlna Ы.A.. Gore-lov I.G. et al. A comparative study of the hoaologus Lpa-sys-tea allotypes of alpha-oacroglobulins in mink and Gp-system allotypes of alpha-cacrog1obu1in in pig // J. Animal Breed. Genet. 1992. V. 109. N 2. P. 42-50.

45. Yenaolaev V.I.. Savlna II.A. Genetics of alpha-mac-roglobulins in pig. oink. rat and human // 23 Intern. Conf. on Animal Genetics. Beme. Ssitzerland. 1992. P. 22.

46. Ермолаев В. И.. Савина Ы. А.. Митичадвили Р. С. и др. Иммуногенетичеадае системы сывороточных белков свиньи и их возыоаюе использование в селекции // Сб. "Селекция сельскохозяйственных животных на устойчивость к заболеваниям". Москва-Сумы. 1992. С. 75-76.

47. Graphodatsky A.S., Biltueva L.S.. Fillppov V.A.. Ereolna V.R., Lushnlkova Т.P.. Shumny T.V.. Ermolaev V.I. Localization of ESD and A2M genes to Sheep chromosome 3 by in situ hybridization // Cytogenetics and Cell Genetics. 1993. V. 62. U 2-3. P. 156-158.

48. Yermolaev V.I.. SavinaM.A. Relationship bettween the Hustelidae and Phocldae families: an lmmimogenetic aspect // 2 European Congress of Mammology. England. 1995. P. 65.

49. Ermolaev V.I., Popova N.A.. Bovkun L.M. et al. Shift concentrations of two mink serum alpha-macroglobullns under artificial infection with Aleutian Desease Virus (ADV) // 4 Veterinary Immunology Symposium. Davis, USA. 1995. P. 235.

50. Ermolaev V.I. SavinaM.A., Gorelov I.G. et al. Low expression of certain serum protein alloantigens of specific and nonspecific systems of immunity in pig // 46 Annual meeting of the European association for animal production. Czech. Republic. 1995. P. 293.

51. Ermolaev V.I.. Savina M.A., Gorelov I.G. Species-specific features of the expression of the allotypes of pig macroglobulins // Keystone Symposia on Protease Inhibitors in Biology and Medicine. USA. 1996. P. 24.

52. Ермолаев В.И., Савина M.А.. Горелов И.Г., Митичашви-ли Р.С. и др. Полиморфные системы альфа-макроглобулинов норки, нерпы и свиньи // 2 Международная конференция "Молекуляр-но-генетические маркеры животных". Киев. 1996. С. 51-52.

Подписано к печати 04.02.1997 Формат бумаги 60x90 1/16. Печ.л. 2. Уч.-зд.л. 1.7 Тираж 110 экз. Заказ 5.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, проспект академика М.А.Лаврентьева, 10